Разработка методов и средств обеспечения микробиологической безопасности объектов ветеринарного надзора

Артемов, Артем Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Разработка методов и средств обеспечения микробиологической безопасности объектов ветеринарного надзора
ВАК РФ 06.02.05, Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов и средств обеспечения микробиологической безопасности объектов ветеринарного надзора"

На правах рукописи

Лг*

Артемов Артем Валерьевич

Разработка методов и средств обеспечения микробиологической безопасности объектов ветеринарного надзора

06.02.05 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДПР 2012

Москва-2012

005020164

Работа выполнена в отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии). Научный руководители:

доктор биологических наук, профессор Светличкин Вячеслав Владимирович,

доктор биологических наук Ярков Сергей Петрович

Официальные оппоненты:

Бутко Михаил Павлович

заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор. ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии, заведующий лабораторией ветсанитарии на госгранице, транспорте и мясоперерабатывающих предприятиях

Хоменец Николай Геннадиевич

кандидат биологических наук, ГОУ ВПО РУДН, старший преподаватель кафедры физиологии, ветеринарной морфологии и ветсанэкспёртизы

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Московский государственный университет пищевых производств (ФГБОУ ВПО МГУ ПП)

Защита состоится «/У» ^Ч 2012 г. в ^часов на заседании диссертационного совета Д. 006.008.01. при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии) по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии) по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5.

Автореферат разослан « п »_(23___2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ^^

кандидат биологических наук Х^^ЙО Крутько Н.С.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Среди различных аспектов обеспечения безопасности объектов ветеринарного надзора значительная роль принадлежит контролю микробных контаминации и биоцидной обработке этих контаминаций.

Разработка и совершенствование методов и средств указанных элементов безопасности связаны с достижениями различных сопряженных наук, в том числе с молекулярной биологией, иммунологией, нанотехнологией и ее разделом бионанотехнологией.

В современном представлении нанотехнология - это наука и технология коллоидных систем, это коллоидная химия, коллоидная физика, молекулярная биология, микроэлектроника. Функционирование систем нанотехнологии отличается от функционирования истинных растворов и расплавов и от объектов макромира благодаря высокоразвитой поверхности. Такие эффекты начинают проявляться, когда размер частиц лежит в диапазоне 1 - 100 нанометров.

Бионанотехнология является разделом нанотехнологии, который занимается изучением и воздействием объектов нанодиапазона на биологические организмы или их использованием для развития наномедицины (в том числе и ветеринарной наномедицины), занимающаяся созданием препаратов и диагностических систем на основе наночастиц (иммунохроматографических тестов, дот-анализов, световых и электронномикроскопических исследований). Методы исследования бионанотехнологии связаны с манипулированием отдельными атомами и молекулами (ДНК, белков). Таким образом, такие методы, как ПЦР-анализ, анализ нуклеотадных последовательностей нуклеиновых кислот, ДНК-иммуномикрочиповая технология, метод иммунохроматографии с использованием наночастиц коллоидного золота можно отнести к современному направлению в науке - бионанотехнологии.

Определенные перспективы бионанотехнологии связаны с обеспечением здоровья животных и безопасности объектов ветеринарного контроля. Широко применяемые в настоящее время антибиотики, в том числе и при откорме животных, способствуют распространению устойчивых штаммов бактерий. Остаточные количества антибиотиков накапливаются в тканях животных и в дальнейшем, попадая с пищей к человеку, оказывают негативное влияние на его здоровье. Используемые в ветеринарии дезинфектанты на основе различных химических соединений могут также отрицательно влиять на здоровье животных, человека и на окружающую среду. В связи с этим актуальным является поиск новых экологичных биоцидных средств. Новые бактерицидные средства создаются на основе использования наночастиц. Так, например, показано применение наночастиц серебра при очистке воды и воздуха, или при дезинфекции одежды и спецпокрытий. Бионанотехнология имеет весьма значительные перспективы в ветеринарии (Смирнов А.М. и др., 2011). Наносеребро использовалось при создании лекарственных средств для животных (Уша Б.В. и др., 2011). Получены экспериментальные электронно-микроскопические данные по изучению механизма действия наносеребра на бактериальные клетки (Власов A.A., 2010). Иммунохроматографические элементы применялись при ветеринарно-санитарном контроле производства мясных консервов (Горобчук Е.А., 2010).

Дальнейшее изучение возможности применения достижений бионанотехнологии в ветеринарии, создание новых методов и средств обеспечения и контроля безопасности объектов ветеринарного надзора, их адаптация к конкретным объектам весьма актуально для науки и практики.

Цель исследования

Цель настоящей работы - разработка методов и средств для обеспечения микробиологической безопасности некоторых объектов ветеринарного надзора.

Задачи исследования

1. Изучить возможность отечественного экспериментального препарата кластерного серебра «Серебряный щит» для применения его в качестве биоцидного средства в ветеринарии.

2. Разработать тест-систему индикации сальмонелл различных серогрупп с помощью иммунохроматографических индикаторных элементов (ИИХЭ) с наночастицами коллоидного золота, определить чувствительность и специфичность тест-системы.

3. Разработать методику и тест-систему индикации возбудителей бактериальных инфекций на основе ШДР и биочипов, определить чувствительность и специфичность метода и тест-системы.

4. Разработать методические рекомендации по применению индикаторных иммунохроматографических элементов для выявления возбудителей инфекционных заболеваний в объектах ветеринарного надзора.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Биоцидные характеристики отечественного экспериментального препарата «Серебряный щит».

2. Тест-система индикации сальмонелл различных серогрупп с помощью иммунохроматографических индикаторных элементов (ИИХЭ) с наночастицами коллоидного золота.

3. Тест-система и методика индикации возбудителей бактериальных инфекций на основе ГЩР и биочипов.

Научная новизна

Проведенными опытами изучено бактерицидное,

бактериостатическое действие отечественного экспериментального препарата кластерного серебра «Серебряный щит» на грамположительные и грамотрицательные бактерии (Staphylococcus aureus, Esherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis), a также дезинфицирующее действие препарата в отношении золотистого

стафилококка и кишечной палочки, искусственно нанесенных на различные материалы (керамическая, кафельная плитки, резина).

На основе проведенных исследований разработана тест-система индикации сальмонелл серогрупп (А, В, С, D, Е) с помощью иммунохроматографических индикаторных элементов (ИИХЭ) с наночастицами коллоидного золота. Определены чувствительность (1x107 м.к./мл) и специфичность тест-системы, позволяющая проводить дифференциацию между микроорганизмами различных серогрупп при наличии сопутствующей микрофлоры (шигеллы, эшерихии).

На основе проведенных исследований разработаны тест-система и модифицированная методика на основе ПЦР и ДНК-чипов для индикации возбудителей бактериальных инфекций (Salmonella typhimurium, Escherichia coli. Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus). Определена чувствительность методики (102 - 103 клеток в пробе) и специфичность (возможность проведения анализа без предварительного обогащения и при наличии сопутствующей микрофлоры).

Экспериментально обоснована возможность применения препарата кластерного серебра «Серебряный щит» и разработанных тест-систем по индикации патогенной микрофлоры для обеспечения ветсринарно-санитарной безопасности предприятий мясоперерабатывающей промышленности (хладокомбинатов, цехов), а также хранящегося мяса.

Практическая ценность

На основании результатов исследований разработаны:

- Методические рекомендации по применению индикаторных иммунохроматографических элементов для выявления возбудителей инфекционных заболеваний в объектах ветеринарного надзора, утвержденные Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 30.09.2009 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 работ, 4 из них - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены:

- на Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания», МГУПБ (2009 г.);

- на заседании Ученого совета ГНУ ВНИИВСГЭ (2011 г.);

- на расширенном совещании сотрудников лабораторий ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии (2011 г.).

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 8 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 156 источников (51 отечественных, 105 зарубежных) и приложения.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Исследования проводили в период с 2008 г. по 2012 г.

Работа выполнена в отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии. Часть экспериментальных исследований была проведена с использованием материально-технической базы ГНЦ ФГУП ГосНИИ БП.

В работе использовались препараты наносеребра с размерами частиц 7 - 10 нм (производства «Фрактал-М» Россия), иммунохроматографические индикаторные элементы на сальмонеллы, система для выделения ДНК «БШсо». В опытах были использованы музейные штаммы культур ГНУ

ВНИИВСГЭ. При разработке иммунохроматографической тест-системы использовались инактивированные нагреванием бактериальные культуры сальмонелл различных серологических типов: S. paratyphi А 225, S. typhimurium, S. heidelberg 1150, S. cholerasuis 595, S. newport, S. typhi 33, S. enteritidis 17, S. anatum 161 из коллекции Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток, а также культуры S. paratyphi В yava 04 №4839, S. paratyphi В 4219, S. typhimurium 04 № 4836 из коллекции ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора. Для контроля специфичности теста использовали суспензии микробных клеток шигелл в буфере анализа для хроматографии: Sh. sonnei, Sh. dysenteriae 214662, Sh. flexneri 3a 1289, Sh. flexneri 2a 1270, Sh. flexneri la 8516, Sh. flexneri 6, Sh. newcastle 8655, Sh. flexneri 5x("> 199, Sh. flexneri 4a 1032 (Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток), микробные клетки кишечной пальчки coli штамм WATCC 9637 (Sigma, кат. № ЕС-9637) в концентрации 1 х 107 м.к./мл, а также холерную вакцину ФС 42-3676-98 производства ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов).

Амплификацию проводили на термоциклире «Mastercycler epgradient S eppendorf realpleax2», праймеры, дезоксинуклеозидтрифосфаты и ДНК-полимераза фирмы «Интрелабсервис» (Россия). Для методов бактериологического анализа использовали хромогенные питательные среды «RidaCount» (Германия).

Статистическая обработка результатов проводилась по Стьюденту.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Изучение биоцидных свойств препаратов кластерного серебра «Серебряный щит»

Целью первого этапа наших исследований было изучение биоцидных свойств препарата наносеребра отечественного производства (кластерное серебро «Фрактал-М»). Бактерицидную активность препарата определяли методом диффузии в агар.

Для определения бактерицидной активности препарата использовали следующие тест-культуры: Staphylococcus aureus, Esherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis.

Выбор перечисленных микроорганизмов был продиктован теми обстоятельствами, что в качестве тест-культуры для бактерий рекомендована Esherichia coli, для вирусов - Staphylococcus aureus. Кроме того, безусловный интерес представляла оценка бактерицидной активности препарата в отношении протея и синегнойной палочки, так как они часто присутствуют на объектах окружающей среды и представляют потенциальную угрозу для макроорганизмов. Также актуальным является выбор экологически безопасных дезинфицирующих средств в отношении сальмонелл, так как продовольственное сырье, особенно мясо птицы, нередко содержит эти бактерии.

Культуры микроорганизмов выращивали на скошенном мясо-пептонном агаре при 37 °С в течение 24 часов. Готовили серийные разведения культур в физиологическом растворе до 106 м.к./мл. По 1 мл каждой культуры смешивали с 10 - 12 мл расплавленного и остуженного до 45 °С мясо-пептонного агара и выливали в чашку Петри (глубинный посев). В лунки агара вносили испытуемые растворы, содержащие различные концентрации серебра. Учет производили по зоне задержки роста культуры, спустя 24 часа инкубирования посевов при 37 °С. Опыты проводились в пяти повторностях.

Препарат «Серебряный щит» в более низких концентрациях (5-10 мг/л) оказывал бактериостатическое действие, и при более высоких концентрациях (20 - 40 мг/л) - бактерицидное действие в отношении грамположительной и грамотрицательной микрофлоры (Staphylococcus aureus, Esherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis).

Дезинфицирующие свойства препарата определяли в опытах с искусственно контаминированными бактериями золотистого стафилококка

и кишечной палочки тест-объектами из различного материала. Тест-объекты представляли собой стерильные пластины размером 10 х 10 см2 из дерева, керамической плитки, кафельной плитки и резины. Суточные культуры перечисленных выше микроорганизмов в концентрации 106 м.к./мл наносили в количестве 1 мл на указанные поверхности и подсушивали при комнатной температуре в стерильных условиях. После полного высыхания на поверхность искусственно контаминированных тест-объектов наносили по 5 мл препарат «Серебряный щит», что составляет расход при влажной дезинфекции 0,5 л/м2. Время воздействия составило 3 часа. По окончании экспозиции производили смыв стерильными ватными тампонами с каждого тест-объекта в стерильный физиологический раствор с последующим десятикратным разведением материала для прекращения действия препарата кластерного серебра, т. е. нейтрализации. Контролем при этом служили смывы с искусственно контаминированных тест-объектов, обработанных водой. Затем производили высев опытного и контрольного материала в мясо-пептонный бульон, посевы инкубировали в течение 5 суток при 37 °С, просматривая посевы каждые сутки. В таблицах 1 и 2 представлены данные по дезинфицирующей активности препаратов кластерного серебра.

Таблица 1

Дезинфицирующая активность в отношении золотистого стафилококка

препарата «Серебряный щит», содержащего кластерное серебро в _______ концентрации 40 мг/л _____

Тест-объекты Результаты бактериологического анализа (наличие роста в мясо-пептонном бульоне)

Время на блюдения

24 часа 48 часов 72 часа 5 суток

Дерево - + + +

Кафельная плитка - - - -

Керамическая плитка - - - Снижена интенсивное -ть роста

Резина - - - Снижена интенсивное -ть роста

Таблица 2

Дезинфицирующая активность в отношении Esherichia coli препарата «Серебряный щит», содержащего кластерное серебро в концентрации

40 мг/л

Тест-объекты Результаты бактериологического анализа (наличие роста в мясо-пептонном бульоне)

Впсмя наблю пения

24 часа 48 часов 72 часа 5 суток

Дерево - + + +

Керамическая плитка - - - -

Кафельная плитка - — — _

Резина - - - Снижена интенсивное -ть роста

Примечание: в смывах с контрольных тест-объектов, обработанных водой, рост в мясо-пептонном бульоне наблюдали через 24 часа.

Как видно из представленных данных, препарат «Серебряный щит», содержащий кластерное серебро в концентрации 40 мг/л, в течение 3-часового воздействия обеззараживал тест-объекты из различного рода плитки и резины, искусственно контаминированные бактериями золотистого стафилококка и кишечной палочки. На деревянных поверхностях обеззараживание не было достигнуто.

Таким образом, кластерное серебро обладает дезинфицирующим действием, которое наиболее выражено проявляется на гладких поверхностях и не проявляется на шероховатых.

Ингибирование роста Staphylococcus aureus, рекомендованного в качестве модельной тест-культуры для вирусов, свидетельствует о возможности применения кластерного серебра в качестве биоцида дли возбудителей вирусной природы.

В ранее проведенных электронно-микроскопических исследованиях было также показано пролонгированное бактериостатическое действие растворов кластерного серебра (Власов А.А., 2010).

Для изучения возможности использования средств и методов на основе нанобиотехнологии для обеспечения безопасности объектов ветеринарного надзора создавали модельную систему, включающую две холодильные камеры, одну из которых обрабатывали наносеребром путем опрыскивания препаратом в концентрации 50 мг/мл. Холодильники предварительно дезинфицировали средством «Саносил Супер 25» согласно инструкции.

Эффективность обработки камер определяли с помощью тест-культур. Как видно из данных, представленных в таблице 3, повторная с интервалом обработка холодильных камер обеспечивала санитарную пригодность их для хранения продукции в течение 12 месяцев. Наличие микрофлоры, превышающей допустимые нормативы, не наблюдалось.

Кроме того, при хранении мяса после двукратной обработки камер наносеребром, возбудителей инфекций обнаружено не было.

Таблица 3

Наличие микроорганизмов в холодильных камерах

Микробио- Интервал определения после дезобработки

логические 0 месяцев 6 месяцев 12 месяцев

показатели без с без с без примене- с

примене примене приме- примене- ния примене

ния -нием нения нием наносеребра -нием

нано- нано- нано- нано- нано-

серебра серебра серебра серебра серебра

КОЕ/г 0 0 200-250 100-150 3,50+0,16-105 100-150

Сальмонеллы - - - - - -

Эшерихии - - - - + -

Таким образом, препарат кластерного серебра обладал дезинфицирующей активностью на различных поверхностях. Кластерное серебро оказывало бактерицидное, бактериостатическое влияние на

различные микроорганизмы. Показано дезинфицирующее действие препарата на различных объектах (керамическая, кафельная плитки, а также резина). Препарат на основе наносеребра может использоваться в качестве биоцидного средства для грамположительных и грамотрицательных бактерий. Он представляется наиболее экологичным и имеет перспективу использования в ветеринарной практике при разработке дезинфектантов и ветеринарных препаратов.

2.2.2 Разработка тест-системы индикации сальмонелл различных серогрупн на основе ИИХЭ с наночастицами коллоидного золота

Культуральный метод выявления сальмонелл, безусловно, надежен и дает однозначные результаты, но и достаточно длителен - его постановка занимает до 72 часов. Весьма привлекательными являются экспресс-методы выявления микроорганизмов, в том числе основанные на иммунохимических реакциях, такие как иммуноферментный анализ, латекс-агглютинация. Однако разнообразие антигенной структуры бактерий сальмонеллезной группы, т. е. существование различных серологических типов, делает идентификацию сальмонелл с помощью иммунохимических тестов непростой задачей.

Целью следующего этапа работы явилось изучение аналитических возможностей отечественного иммунохроматографического теста для выявления сальмонелл серогрупп А, В. С, Б, Е. В задачи исследования входили определение чувствительности, наличия перекрестных реакций с другими микроорганизмами кишечной группы.

Для определения порога детекции использовали инактивированные нагреванием бактериальные культуры сальмонелл различных серологических типов.

Для контроля специфичности анализа использовали суспензии клеток шигелл в буфере анализа для хроматографии.

Иммунохроматографию проводили при комнатной температуре. Наносили различные концентрации клеток микроорганизмов,

суспендированных в буфере для проведения иммунохроматографического анализа в отверстие для внесения образца теста. Время анализа составило 20 мин. Регистрацию результатов проводили как визуально, наблюдая образование окрашенных зон в зависимости от концентрации клеток микроорганизмов, так и с помощью видеоцифрового анализатора «Рефлеком» (Россия), который позволял измерять окрашенность зон иммунохроматограммы в условных единицах. Положительным результатом, после нанесения образца, считали появление в аналитической зоне различимой глазом окрашенной полосы вишнево-красного цвета, что соответствовало показаниям прибора «Рефлеком» не менее (0,9 ± 0,2) усл.ед., а также появление окрашенной полосы в контрольной зоне. Среднеквадратическое отклонение показаний прибора рефлектометра при 95% доверительной вероятности не превышало 0,2 усл. ед. При нанесении отрицательного контроля, или гетерологичных микроорганизмов, на поверхности аналитической мембраны индикаторного элемента появлялась одна окрашенная полоса в контрольной зоне. Измерения для каждой концентрации микробных клеток и отрицательных контролей проводили пятикратно, вычисляли среднее арифметическое показаний прибора.

Иммунохроматографический тест для выявления сальмонелл представляет собой пластиковую оправу с двумя отверстиями (рисунок 1). Одно из отверстий служит для нанесения анализируемого образца, другое для наблюдения результатов анализа. Внутри оправы помещена сборка из нескольких пористых мембран с высушенными иммунокомпонентами. На одной из мембран были нанесены конъюгаты наночастиц коллоидного золота с поликлональными антителами к сальмонеллам. В аналитическую зону теста наносили поликлональные антитела к сальмонеллам в виде узкой линии. Жидкая проба, содержащая сальмонеллы, в буфере анализа растворяет иммунокомпоненты в мембранах и взаимодействует с ними на аналитической мембране. В результате этого взаимодействия, на аналитической мембране образуются окрашенные полосы,

свидетельствующие о наличии сальмонелл. Наночастицы коллоидного золота и их конъюгаты с антителами имеют яркую выраженную вишнево-красную окраску и являются прекрасным маркером, хорошо видимым глазом. Иногда для регистрации результатов анализа применяют приборы -рефлектометры.

О 1x105 5x105 1x106 5x106 м.к./мл

Рисунок 1. Внешний вид теста после проведения

иммунохроматографического анализа клеток Salmonella typhimurium взятых в различных концентрациях. Стрелками указаны: 1 - отверстие для внесения образца, 2 - аналитическая зона, 3 - контрольная зона.

Для удобства нами была предложена шкала оценки интенсивности окраски аналитической и контрольной зон геста при визуальном наблюдении оператором: отрицательный результат анализа (-) - в образце отсутствуют клетки сальмонелл, либо они присутствуют в концентрации ниже чувствительности теста; положительный результат анализа (+■) - в образце присутствуют клетки сальмонелл - слегка заметная окрашенная линия в аналитической зоне; (++) - хорошо заметная окрашенная линия в аналитической зоне; (+++) - интенсивная окрашенная линия в аналитической зоне. Для создания иммунохроматографического теста нами

были применены кроличьи и козьи «пансальмонеллезные» антитела, содержащие специфические иммуноглобулины к антигенным рецепторам соматического О-антигена клеток сальмонелл различных серогрупп. Результаты, полученные с помощью теста для выявления сальмонелл, различных серогрупп приведены в таблице 4. Чувствительность теста по отношению к сальмонеллам различных серогрупп значительно отличается. Так, наиболее чувствительным тест был для культуры Salmonella typhimurium (lxlO5 м.к./мл) - серогруппа В, а наименее чувствительным -1х107м.к./мл для Salmonella anatum 161 серогруппа Е.

Визуальная оценка результатов иммунохроматографического анализа, в целом, коррелировала с показаниями видеоцифрового рефлектометра -«Рефлеком». Применение рефлектометрической регистрации не увеличило чувствительности обнаружения сальмонелл, по сравнению с визуальным наблюдением результата оператором. Тем не менее, рефлектометрия позволяет уменьшить такие факторы субъективности при оценке результата человеком, как освещенность рабочего места, усталость оператора или индивидуальные особенности восприятия цветов и насыщенности линий иммунохроматограммы.

Специфичность иммунохроматографического теста по отношению к некоторым другим микроорганизмам кишечной группы показана в таблице 5. Как следует из экспериментальных данных шигеллы и эшерихии в концентрации 1x107 м.к./мл не приводили к появлению окраски аналитической зоны иммунохроматографического теста. Холерная вакцина, содержащая холероген-анатоксин и соматический О-антиген возбудителя холеры, также не дает перекрестных реакций с разработанным нами иммунохроматографическим тестом для выявления сальмонелл.

Таблица 4

Выявление клеток сальмонелл иммунохроматографическим методом

Серогруппа Наименование микроорганизма Чувствительность, м.к./мл Интенсивность окрашивания зон теста, определенная рефлектометрически, усл. ед.

Аналитическая зона Контрольная зона

А Salmonella paratyphi А 225 5x106 1,3 15,3

В Salmonella paratyphi В yava 04 №4839 1x10s 1,3 14,2

Salmonella paratyphi В 4219 5xl0h 1,2 13,0

Salmonella typhimurium 04 №4836 1x10' 1Д 12,7

Salmonella typhimurium 1x10s 1,0 13,5

Salmonella heidelberg 1150 lxlO5 1,0 12,1

С Salmonella choleraesuis 595 5xl06 1,0 14,9

С Salmonella newport IxlO7 1,0 13,8

D Salmonella typhi 33 1x10' 0,8 14,1

D Salmonella enteritidis 17 1х10ь 0,8 12,4

Е Salmonella anatum 161 1x10' 0,7 13,0

Таблица 5

Результаты оценки специфичности иммунохроматографического

теста

Наименование микроорганизма Интенсивность окрашивания зон теста

Визуальная оценка Рефлектометрические измерения, усл. ед.

Аналитическая зона Контрольная зона Аналитическая зона Контрольная зона

Отрицательный контроль 0 +3 0 11,8

Sh. sonnei 0 +3 0,4 11,3

Sh. dysenteriae 214662 0 +3 0 13,5

Sh. flexneri la 8516 0 +3 0 10,9

Sh. flexneri 2a 1270 0 +3 0,4 10,7

Sh. flexneri 3a 1289 0 +3 0,4 11,8

Sh. flexneri 4a 1032 0 +3 0,4 12,9

Sh. flexneri 5xw 199 0 +3 0,4 12,4

Sh. flexneri 6 0 +3 0 11,7

E. coli штамм W ATCC 9637 0 +3 0 12,5

Вакцина холерная, 1,0 мкг/мл 0 +3 0 12,7

В результате проведенных исследований разработан чувствительный и специфичный иммунохроматографический тест для выявления сальмонелл серогрупп А, В, С, D, Е. Его чувствительность не уступает тесту Singlepath®-Salmonella производства фирмы Merck. Исключительная простота постановки анализа с помощью иммунохроматографических тестов позволяет использовать их в лабораториях с низкой технической оснащенностью. Прямой анализ экстракта гомогенатов пищевых продуктов методом иммунохроматографии возможен только при чрезвычайно высоком

уровне контаминации продуктов или сырья сальмонеллами, что является редким случаем. Длительность такой схемы анализа, включая пробоподготовку, не превышает 1,0 ч. Пробоподготовка предусматривает гомогенизирование продукта, экстракцию клеток буфером анализа, фильтрацию или центрифугирование в мягких условиях, а затем последующее нанесение фильтрата или супернатанта на иммунохроматографический тест (рисунок 2),

Гомогенизирование образца

Экстракция бактерий

Удаление дербиса фильтрацией или центрифугированием

I I

Осадок фильтрат или супернатант

иихэ

Рисунок 2. Схема проведения иммунохроматографического анализа Предварительное обогащение контаминированных сальмонеллами серогруппы В образцов сырья и продуктов питания в хлористо-магниевой среде в течение 17 - 18 ч. при температуре 37 °С и последующий иммунохроматографический анализ позволяет выявить до 102 - 103 м.к./мл сальмонелл находившихся в исходных образцах. Другая схема обогащения при анализе проб сырья и продуктов содержащих сальмонеллы предусматривает применение вначале неселективных сред (забуференная пептонная вода, +37 °С, 21 ч), затем селективных - среда Раппопорта-Василиадиса, (+41 °С, 21 ч) микробиологических сред для роста сальмонелл до конечной концентрации 106 - 107 м.к./мл с последующим иммунохроматографическим анализом. Применение схем обогащения позволяет существенно сократить время выявления сальмонелл даже при

невысокой микробной контаминации, а также повысить надежность анализа за счет включения иммунохимической стадии идентификации сальмонелл.

2.2.3 Разработка методики и тест-системы индикации возбудителей бактериальных инфекций на основе биочипов

Для определения возбудителей инфекций на основе биочипов нами разработана модифицированная методика, включающая амплификацию исследуемых ДНК с последующей ДНК-гибридизацией на чипах.

Исследуемые образцы гомогенизировали, элюировали микроорганизмы и подращивали в течение 6 часов в жидких питательных средах. Из аликвоты выделяли и очищали ДНК с помощью детергента «Silico». Полученную ДНК амплифицировали с неспецифическими гексануклеотидными праймерами и дезоксинуклеозидтрифосфатами, меченными биотином. Ампликоны гибридизовали с иммобилизованными на нитроцеллюлозных чипах со специфичными ДНК-зондами. ДНК-зонды получали предварительно в реакции амплификации с использованием специфичных праймеров: Staphylococcus aureus: Sa442-1 (5'-AAT СТТ TGT CGG TAC ACG ATA TTC TTC ACG-3'), позиция с 5 по 34; Sa442-2 (5'-CGT GAG ATT TGA G AT AAT АСА ACA-31), позиция с 83 по 112; Stn гена основного токсина Salmonella typhimurium; fimA структурного гена Escherichia coli. ДНК-зонды на другие бактерии получали в реакции амплификации с использованием коммерческих тест-систем. После проведения гибридизации добавляли конъюгат стрептавединфосфатазу, субстрат и краситель Результаты определяли по окрашиванию точек с гибридными молекулами.

Как видно из данных, представленных в таблице 6, реакция гибридизации наблюдалась только в гомологичных системах (меченные ампликоны и ДНК-зонд одного и того же микроорганизма).

Таблица 6

Результаты идентификации микроорганизмов с применением биочипов

Исследуемые микроорганизмы Результаты окрашивания биочипов с гибридными молекулами

Е. coli Salmonella typhimurium Yersinia enterocolitica

E. coli ++++ - -

Salmonella typhimurium - ++++ -

Yersinia enterocolitica - - ++++

Вас. subtilis - - -

E. coli + Yersinia enterocolitica (1:1) -Н-++ - +-H-+

Salmonella typhimurium + E. coli (1:1) ++++ ++++ -

E. coli + Yersinia enterocolitica + Salmonella typhimurium (1:1:1) ++++ +-НЧ- ++++

Примечание: Mil- - максимальная степень окрашивания гибридных молекул - - отсутствие окрашивания гибридных молекул

Перекрестных реакций не наблюдалось. Кроме того, бактерии определялись в смеси с другими микроорганизмами, что указывало на высокую специфичность реакции.

Таким образом, разработанная модифицированная методика позволяла с высокой специфичностью выявлять микроорганизмы различных видов и проводить анализ в течение 17—18 часов.

В процессе исследований была разработана тест-система для индикации возбудителей инфекций с помощью биочипов. Она включала:

1. система для выделения и очистки ДНК с детергентом «Silico»; 2. иммобилизованные в виде точек на мембранном биочипе ДНК-зонды на следующие бактерии: Salmonella typhimurium, Escherichia coli. Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica,

Staphylococcus aureus; 3. гексануклеотидные ираймеры, меченные биотином; 4. дезоксинуклеозидтрифосфаты, меченные биотином; 5. «холодные» дезоксинуклеозидтрифосфаты; 6. термостабильная ДНК-полимераза; 7. буфер для амплификации; 8. центрифужная микроколонка для очистки меченных ампликонов от не включившегося биотина;9. буфер для гибридизации; 10. конъюгат стрептавидинфосфатаза; 11. краситель тетразолий синий.

ВЫВОДЫ

1. Установлено бактерицидное, бактериостатическое действие отечественного препарата кластерного серебра «Серебряный щит» на грамположительные и грамотрицательные бактерии в концентрациях 10 — 40 и 5 мг/мл соответственно.

2. Дезинфицирующий эффект препарата «Серебряный щит» на тест -микроорганизмы, нанесенный на различные поверхности материалов (керамическая, кафельная плитки, резина) достигался при воздействии в течение 3 часов в концентрации 40 мг/мл.

3. Разработанная тест-система на основе иммунохроматографических индикаторных элементов (ИИХЭ) с наночастицами коллоидного золота позволяет проводить дифференциальную индикацию сальмонелл различных серогрупп (А, В, С, D, Е) при наличии сопутствующей микрофлоры (шигеллы, эшерихии) в течение 1,0 ч с чувствительностью 107 м.к./мл., и с предварительным обогащением на селективных питательных средах с чувствительностью 102 - 103 м.к./мл. в течение 24 ч.

4. Разработанные тест-системы и методика на основе ДНК-биочипов позволяет проводить индикацшо возбудителей инфекций с чувствительностью 102-103 м.к./мл без предварительного обогащения и при наличии сопутствующей микрофлоры.

5. Разработанные методы и средства на основе бионанотехнологии могут быть использованы для обеспечения микробиологической

безопасности объектов ветеринарного надзора (мясоперерабатывающих предприятий).

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании результатов исследований разработаны:

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Артемов А. В. Определение бактерицидной активности препаратов кластерного серебра «Серебряный щит» // Материалы международной научной конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания», МГУПБ 2009, С. 258.

2. Смирнов А.М, Светличкин В.В., Кононенко А.Б., Бритова C.B., Артемов A.B., Голубев В.Н. Ветеринарно-санитарные аспекты использования наносеребра // «Ветеринария и кормление», 2011, № 3, С. 18-19.

3. Артемов А ¿В. Биоцидные свойства кластерного серебра и перспективы его использования в ветеринарии // «Ветеринарная патология», 2011, №3, С. 115-118.

4. Шиленко И.В., Ярков С.П., Артемов A.B., Кононенко А.Б., Смирнов А.М. Отечественный иммунохроматографический тест для выявления сальмонелл различных серогрупп//«Ветеринария и кормление», 2011, №4, С. 12-13.

5. Смирнов А.М., Уша Б.В., Светличкин В.В., Ярков С.П., Концевова A.A., Артемов A.B., Ярова O.A. Применение средств и методов на основе нанобиотехнологии в ветеринарии // «Ветеринария», 2012, № 2, С. 53 - 54.

Подписано в печать Я /■ 06. (А ?. Усл. печ. л. 1,0, тираж 80 экз, заказ /V ГНУ ВНИИВСГЭ 123022, Москва, Звенигородское ш., д.5.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Артемов, Артем Валерьевич, Москва

6112-3/892

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологи

На правах рукописи

Артемов Артем Валерьевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ И СРЕДСТВ ОБЕСПЕЧЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ОБЪЕКТОВ ВЕТЕРИНАРНОГО НАДЗОРА

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Светличкин В.В., доктор биологических наук Ярков С.П.

Москва - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................. 4

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР..................................................... 9

1.1. Аспекты обеспечения безопасности объектов ветеринарного

I '

надзора..........................................................................................................9

1.2. Контроль безопасности на основе методов ДНК- и иммунодиагностики.............................................................................................18

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................................................41

2.1. Материалы исследований................. ....................... 41

2.2. Методы исследований.................................................... 41

2.2.1. Методы бактериологического анализа сырья, мясной продукции и помещений хладокомбината......................................................... 41

2.2.2. Методика определения бактерицидной и бактериостатической активности препаратов кластерного серебра..................................... 46

2.2.3. Методика определения дезинфицирующей активности препаратов кластерного серебра................................................................... 46

2.2.4. Методика определения бактерий на основе иммунохроматографии 47

2.2.5. Методика определения возбудителей инфекций на основе ГТЦР

и биочипов............................................................................... 49

2.2.6. Получение ДНК-зондов с помощью ПЦР................................. 51

2.2.7. Амплификация ДНК методом рассеянной затравки с гексануклеотидными праймерами.................................................. 52

2.2.8. ДНК-гибридизация на биочипах............................................. 52

2.2.9. Статистическая обработка результатов.................................... 57

2.3. Результаты исследований............................................. 57

2.3.1. Изучение биоцидных свойств препаратов кластерного серебра «Серебряный щит»..................................................................... 57

2.3.2. Разработка тест-системы индикации сальмонелл

различных серогрупп на основе ИИХЭ с наночастицами коллоидного

золота........................................................................................64

2.3.3. Разработка методики и тест-системы индикации вобудителей

бактериальных инфекций на основе ПЦР и биочипов ...............................................72

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..............................................................................................78

I I

4. ВЫВОДЫ..............................................................................91

5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ............................................................92

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................. ................93

7. ПРИЛОЖЕНИЕ...............................................................................................110

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Среди различных аспектов обеспечения безопасности объектов ветеринарного надзора значительная роль принадлежит контролю

микробных контаминаций и биоцидной обработке этих объектов.

В современном представлении нанотехнология - это наука и технология коллоидных систем, коллоидная химия, коллоидная физика, молекулярная биология, микроэлектроника. Функционирование систем нанотехнологии отличается от функционирования истинных растворов и расплавов и от объектов макромира благодаря высокоразвитой поверхности. Такие эффекты начинают проявляться, когда размер частиц лежит в диапазоне 1-100 нанометров.

Бионанотехнология является разделом нанотехнологии, который занимается изучением и воздействием объектов нанодиапазона на биологические организмы или их использованием для развития наномедицины (в том числе и ветеринарной наномедицины), в частности, созданием препаратов и диагностических систем на основе наночастиц (иммунохроматографических тестов, дот-анализов, световых и электронно-микроскопических исследований). Методы исследования бионанотехнологии связаны с манипулированием отдельными атомами и молекулами (ДНК, белков). Таким образом, такие методы, как ПЦР-анализ, анализ нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот, ДНК-иммуномикрочиповая технология, метод иммунохроматографии с использованием наночастиц коллоидного золота можно отнести к современному направлению в науке - бионанотехнологии.

Определенные перспективы бионанотехнологии связаны с обеспечением здоровья животных и безопасности объектов ветеринарного контроля. Широко применяемые в настоящее время антибиотики, в том числе и при откорме животных, способствуют распространению устойчивых штаммов бактерий. Остаточные количества антибиотиков накапливаются в тканях животных и в дальнейшем, попадая с пищей к человеку, оказывают негативное влияние на его здоровье. Используемые в ветеринарии дезинфектанты на основе различных химических соединений могут также отрицательно влиять на здоровье животных, человека и окружающую среду. В связи с этим актуальным является поиск новых экологичных биоцидных средств. Новые бактерицидные средства создаются на основе использования наночастиц. Так, например, показано применение наночастиц серебра при очистке воды и воздуха, или при дезинфекции одежды и спецпокрытий. Бионанотехнология имеет весьма значительные перспективы в ветеринарии (Смирнов A.M. и др., 2011). Наносеребро использовалось при создании лекарственных средств для животных (Уша Б.В. и др., 2011). Получены экспериментальные электронно-микроскопические данные по изучению механизма действия наносеребра на бактериальные клетки (Павлова И.Б. и др. 2010). Иммунохроматографические элементы применялись при ветеринарно-санитарном контроле производства мясных консервов (Горобчук Е.А., 2010).

Цель исследования

Задачи исследования

3. Разработать методику и тест-систему индикации возбудителей бактериальных инфекций на основе ПЦР и биочипов, определить чувствительность и специфичность методики и тест-системы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Биоцидные характеристики отечественного экспериментального препарата «Серебряный щит» на основе кластерного серебра.

3. Тест-система и методика индикации возбудителей бактериальных инфекций на основе ПЦР и биочипов.

Научная новизна

Проведенными опытами изучено бактериостатическое, бактерицидное действие отечественного экспериментального препарата кластерного серебра «Серебряный щит» на грамположительные и грамотрицатёльные бактерии (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis), а также дезинфицирующее действие препарата в отношении золотистого стафилококка и кишечной палочки, искусственно нанесенных на

поверхности различных материалов (керамическая, кафельная плитки, резина).

' ' 7

наночастицами коллоидного золота. Определены чувствительность (1x10 м.к./мл) и специфичность тест-системы, позволяющая проводить индикацию сальмонелл различных серогрупп при наличии сопутствующей микрофлоры (шигеллы, эшерихии).

2 3

coli, Yersinia enterocolitica). Определена чувствительность методики (10 - 10 клеток в пробе) и специфичность (возможность проведения анализа без предварительного обогащения и при наличии сопутствующей микрофлоры).

Экспериментально обоснована возможность применения препарата кластерного серебра «Серебряный щит» и разработанных тест-систем по индикации патогенной микрофлоры для обеспечения ветеринарно-санитарной безопасности предприятий мясоперерабатывающей промышленности.

Практическая ценность

На основании результатов исследований разработаны:

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 работ, 4 из них - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены:

- на заседании Ученого совета ГНУ ВНИИВСГЭ (2011 г.);

- на расширенном совещании сотрудников лабораторий ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии (2011 г.).

Структура и объем работы

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Аспекты обеспечения безопасности объектов ветеринарного надзора

В соответствии с Федеральным законом «О техническом регулировании» - «безопасность - состояние, при котором отсутствует

I I

недопустимый риск, связанный с причинением вреда жизни или здоровью граждан, имуществу физических или юридических лиц, государственному или муниципальному имуществу, окружающей среде, жизни или здоровью животных и растений». Это определение соответствует общепринятой международной терминологии (ИСО/МЭК 2, п. 2.5) (2, 18).

В современных условиях обеспечение безопасности различных объектов основано на системе технического регулирования, включающей Федеральные законы, технические регламенты, формы, критерии и методы подтверждения соответствия, государственный контроль и надзор (4, 6, 10, 17,47).

Обеспечение безопасности объектов ветеринарного надзора базируется на таких мероприятиях как дезинфекция, дезинсекция и дератизация.

Эффективная дезинфекция позволяет предотвратить загрязнение сырья и продукции патогенными возбудителями, снижает степень риска производства, продлевает сроки хранения.

Для санитарной обработки предприятий известен щирокий спектр традиционных и новых химических средств (гидроксиды, кислоты, альдегиды, хлорсодержащие и др.) (34).

Однако многие применяемые в ветеринарии дезинфектанты на основе различных химических соединений могут отрицательно влиять на здоровье животных, человека и на окружающую среду и малопригодны для дезинфекции объектов, имеющих контакт с пищевыми продуктами.

Использование в ветеринарии биоцидов, содержащих антибиотики, способствует распространению устойчивых штаммов бактерий. Остаточные

количества антибиотиков накапливаются в тканях животных и в дальнейшем, попадая с пищей к человеку, оказывают негативное влияние на его здоровье.

Обеспечение норм безопасности сырья и продукции животного происхождения, а также безопасности производства пищевой продукции делает актуальным поиск экологически безопасных биоцидов, не наносящих

I I

вреда животным, человеку и окружающей среде.

В последнее время на мировом рынке широкое применение находят специализированные биоциды на основе наносеребра. Годовой прирост этих продуктов в Европе составляет более чем 20%, в США - 25% и почти 15% в Китае.

Прогнозируется рост спроса на биоциды на серебряной основе для

Г* и V

перерабатывающих предприятии пищевои промышленности и в медицине.

Коммерческие биоциды, как правило, состоят из одного или нескольких активных химических веществ в сочетании с жидкой, тестообразной или твердой подложкой. Материалы с адсорбированными на них частицами серебра проявляют высокую антимикробную активность и могут быть использованы для защиты широкого ассортимента пищевых продуктов.

Так, например, польская нанотехнологическая компания «Ыапосо», разработала новый биоцид «Мапо$Иуег», в котором сочетаются бактерицидные свойства серебра с широкими возможностями нанотехнологии. Полимеры на основе «№посо» используются в пищевой промышленности для производства упаковочных материалов.

Применение упаковочной пленки, содержащей частицы серебра, продлевает срок хранения мяса на несколько дней. Нано-партикулярное серебро включается в материал пленки и равномерно распределяется по поверхности упаковки.

Связывание ионов серебра с пленкой защищает продукты питания от контаминации серебром.

Разработаны антимикробные препараты на основе серебра для медицинских устройств,

Американская компания «Agion» выпускает продукцию для упаковки медицинских товаров. Компания из Великобритании «Addmaster» предлагает

свою линию «Biomaster», предназначенную для пищевых продуктов и

i i предметов гигиены.

Серебро завоевало сильные позиции и на японском рынке. В Японии ионы серебра наносятся на неорганическую подложку на основе цеолитов или алюмосиликатов.

В холодильниках «Samsung» серии RL используется технология «Silver Nano» (собственная разработка «Samsung»). С помощью наночастиц серебра предотвращается размножение микроорганизмов на стенках холодильной и морозильной камер. Оно уничтожает до 99,9% бактерий и предотвращает появление посторонних запахов в камерах.

Таким образом, обзор данных литературных источников этого раздела показывает, что наносеребро имеет определенные перспективы для обеспечения безопасности объектов ветеринарного надзора и может быть использовано при получение экологичных биоцидных средств (42, 43).

Другим важным аспектом обеспечения безопасности объектов ветеринарного надзора является контроль микробных контаминаций.

Микробиологический критерий имеет принципиальное значение как для сырья и пищевой продукции, животноводческих и перерабатывающих производств, так и в целом для окружающей среды. (7, 142, 72, 61, 64).

Микробные контаминации регламентированы СанПиН и техническими регламентами (2, 12).

Микробиологический контроль мясного сырья проводят на содержание мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ).

С целью контроля санитарного состояния производства и предотвращения выпуска недоброкачественной продукции проводят

микробиологические исследования смывов с технологического оборудования, инвентаря, тары, рук работающего персонала и контроль воздуха (19).

При плановом исследовании проводят определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, наличия БГКП, на мясоперерабатывающих предприятиях - бактерий рода Proteus.

В смывах с технологического оборудования, мелкого инвентаря, рук работников не должны содержаться БГКП.

Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов не должно превышать 1x103 КОЕ/см2.

Превышение допустимого КМАФАнМ и наличие БГКП свидетельствует о неудовлетворительном состоянии производства. В этом случае проводят внеплановую санитарную обработку (мойку и дезинфекцию), и по окончании санитарной обработки проводят повторное микробиологическое исследование.

Информация о работе

Артемов, Артем Валерьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 06.02.05

Диссертация

Разработка методов и средств обеспечения микробиологической безопасности объектов ветеринарного надзора - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы