Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧЕРНОЙ НОЖКИ (ERWINIA CAROTOVORA (JONES) BERGEY ET AL.) И КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ (CLAVIBACTER NIICHIGANENSIS SUBSP. SEPEDONICUS (SPIECK. ET KOTTH.) SKAPTASSON ET BURK.) КАРТОФЕЛЯ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧЕРНОЙ НОЖКИ (ERWINIA CAROTOVORA (JONES) BERGEY ET AL.) И КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ (CLAVIBACTER NIICHIGANENSIS SUBSP. SEPEDONICUS (SPIECK. ET KOTTH.) SKAPTASSON ET BURK.) КАРТОФЕЛЯ"



На правах рукописи

Белов Григорий Леонидович

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧЕРНОЙ НОЖКИ (Erwinia carotovora

(Jones) Bergey et al.) И КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieck. et Kotth.) Skaptasson et Burk.) КАРТОФЕЛЯ

Специальность 06.01.11 — защита растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 2003

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института картофельного хозяйства им А Г Лорха

Научный руководитель кандидат биологических наук,

старшин научный сотрудник Варицев Ю. А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Джалилов ф. С., кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Игнатов А. Н.

Ведущее учреждение: Центральный научно-исследовательский институт

агрохимического обслуживания сельского хозяйства (ЦИНАО)

Защита состоится «1ХУ» ц йжа 2003 года в часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 0при Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева по адресу 12"550, г Москва, ул Тимирязевская, д 39, корпус 10

С диссертацией можно ознакомиться в Цен- . >й научной библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им К \ Ги> ! рязева

Автореферат разослан

2003 г

Ученый секретар-

диссертационного совета, профессор Исаичев В В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

• и , -

Актуальность темы. При производстве и размножении оздоровленного семенного материала картофеля в современных условиях необходимо его многократное тестирование на наличие скрытой зараженности возбудителями бактериальных, фитоплазменных, вирусных и вироидных заболеваний. Рыночные отношения в сфере производства и торговли семенным материалом картофеля обязывают производителей и распространителей предоставлять полную информацию о качестве продаваемых семян.

По существующему, явно устаревшему стандарту (ГОСТ 29267-91), на каждую репродукцию семенного материала картофеля должен выдаваться сертификат установленного образца. Этот сертификат содержит сведения о соответствии зараженности этого материала возбудителями заболеваний в явной и скрытой формах нормативным допускам. Для обнаружения бактериальных возбудителей^ по этому стандарту предлагается использовать "сэндвич" - вариант иммунофермент-ного анализа. Применение этого метода в схемах контроля качества семенного картофеля позволяет в определенной степени выявлять в тестируемом материале скрытую зараженность наиболее вредоносных бактериальных заболеваний - черной ножки (возбудитель Еглчша сагйоуога) и кольцевой гнили (возбудитель ОауЛайег пиЫ^апепв!» эиЬзр. Береёошсиз).

Однако иммуноферментный анализ в том виде, в котором он предлагается ГОСТ 29267-91, к сожалению, не в силах охватить все разнообразие серотипов возбудителей черной ножки и не обладает достаточной чувствительностью при тестировании немукоидных и промежуточных штаммов возбудителя кольцевой гнили картофеля.

В силу названных причин в условиях формирования отечественного рынка сортового семенного картофеля, освоения новой системы сертификации оригинального и элитного семенного материала возникает необходимость усовершенствования существующих для этих целей и разработки новых, более чувствительных и менее зависимых от серологических свойств штаммов возбудителей бактериозов методов диагностики.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было разработка и усовершенствование диагностических тест-систем на основе иммуноферментного анализа (ИФА), непрямого варианта иммунофлуоресцентной микроскопии (НИФМ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления скрытой зараженности возбудителей черной ножки и кольцевой гнили картофеля.

В задачи исследований входило:

1. Изолировать штаммы Етулша сагоКзуога и СкуЛайег пмсЫ^пего^з эиЬзр. Берескннсиэ в чистую культуру, изучить их морфолого-биохимические свойства.

2. Получить мпттпи н поттиттгтпумгшрв лнте£ь1"срртки к возбудителям черной ножки и кольцевой I дили картю^мля.^^-^д

3 Изучить серологические свойства выделенных возбудителей бактериозов картофеля с помощью набора диагностических тест-систем, полученных на основе моно- и полиштаммовых антисывороток

4 Оптимизировать технологический регламент выявления скрытой зараженности Е carotovora и С michiganensis subsp sepedonicus методами ИФА и НИФМ

5 Провести оценку сравнительной эффективности иммунологических методов диагностики возбудителей черной ножки и кольцевой гнили на растительном материале

6 Разработать и испытать набор праймеров, технологический регламент пробоподготовки и проведения анализа на основе ПЦР для диагностики возбудителя кольцевой гнили

7 Оценить относительную эффективность ИФА, НИФМ и ПЦР при тестировании скрытой зараженности С michiganensis subsp sepedomcus в растениях in vitro

Научная новизна работы. С помощью 9 диагностических тест-систем ИФА, полученных на основе антисывороток к отдельным штаммам Е carotovora subsp atroseptica, выявлено 8 штаммов, являющихся серотипами этой разновидности, четыре из которых известны в литературе как представители I, XVIII, XX и ХХП серогрупп Е carotovora subsp atroseptica Смесь из пяти моноштаммовых антисывороток впервые использована для приготовления полиштаммовых диагностических тест-систем ИФА и НИФМ, позволяющих надежно диагностировать, по крайней мере, 8 серогрупп этого патогена

Антигеноактивный штамм возбудителя кольцевой гнили картофеля Cms 134 может быть рекомендован для производства высокоактивных антисывороток для использования в ИФА и НИФМ

Впервые в отечественной практике оптимизирован и использован для практической диагностики Е carotovora subsp atroseptica и С michiganensis subsp sepedomcus в растениях картофеля метод НИФМ

Впервые в отечественной практике разработана методика выявления возбудителя кольцевой гнили картофеля с помощью полимеразной цепной реакции Показана ее высокая эффективность при тестировании С michiganensis subsp sepedomcus в растениях картофеля in vitro

Предложено дифференцированное применение комплекса иммунологических и биотехнологических методов диагностики возбудителей бактериозов в схемах оздоровления, контроля качества и сертификации семян картофеля

Практическая ценность работы Разработаны и усовершенствованы методы диагностики возбудителей черной ножки и кольцевой гнили картофеля методами ИФА, НИФМ и ПЦР, позволяющие достоверно выявлять скрытую инфекцию возбудителей бактериозов на различных стадиях инфекционного процесса Эти методы диагностики могут быть использованы научными учреждениями, за-

нимающимися получением предбазисного семенного материала картофеля, хозяйствами по первичному и элитному семеноводству картофеля, испытательными лабораториями в системе сертификации семян картофеля.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены в учебном семинаре: «Методы выявления и диагностики бурой бактериальной гнили и других карантинных болезней картофеля» (ВНИИКР, п. Быково, 2000 г.); в международной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г. Саранск, 2001 г.).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликованы 2 печатные работы.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов испытаний и их обсуждения, выводов и списка литературы (250 наименований, в том числе 151 иностранных). Работа включает 22 таблицы, 8 рисунков и 7 приложений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение возбудителей бактериозов в чистую культуру. Для выделения бактерий использовали метод последовательных разведений (Бельтюкова К.И., 1968). Были отобраны образцы клубней картофеля с симптомами бактериозов из ОПХ «Корепево», Егорьевской опытной станции (Московская область), ОПХ «Ударник» (Чувашия).

Оценивали патогенность у штаммов Е. carotovora по методу Ю.И. Шнейдера (1965) и у штаммов С. michigar.ensis subsp. sepedonicus по методу В.И. Янович (1971). Морфолого-биохимические свойства изучали по работам Н.А. Красильни-кова (1949); К.Ф. Бельпоковой (1968); В.П. Израильского (1968); М.Н. Капустина (1968); А.М. Лазарева (1989) и др.

Получение антисывороток, специфических иммуноглобулинов и конъ-югатов иммуноглобулинов с пероксидазой хрена.

Для получения иммунных сывороток к штаммам Е. carotovora использовали 24-часовую, а к штаммам С. michiganensis subsp. sepedonicus 72-часовую культуру бактерий, выращенных на косяке картофельного агара. Смыв проводили фосфат-но-солевым буфером (0,01М фосфатный буфер, 0,15 М NaCl, рН 7,2 - 7,4). Бактериальные клетки подвергали трехкратному центрифугированию (8 тыс. об/мин, 20 мин), ресуспендируя осадок в новых порциях буфера. Суспензию бактерий (концентрация 10' кл./мл) фиксировали диализом в течение ночи против 2 %-ного глютаральдегида по Алан и Келман (1577) с последующей отмывкой трехкратным центрифугированием, как описано выше. Концентрацию бактерий определяли спектрофотометрически, используя коэффициент А«»=0,1 соответствующий концентрации 2 х 108 клеток/мл.

Схема иммунизации. Иммунизацию кроликов проводили по схеме, состоящей из пяти для Е сагоюуога и семи для С тісІїщапепзіБ БиЬэр Берегіопісиз внутримышечных инъекций в мышцу обеих чадних ног в повышающихся дозах от 108 до 109 клеток с неполным адъювантом Фрейндас недельными интервалами

Кровь собирали через 7-12 дней после последней инъекции Посіє отделения клеточных компонентов крови сыворотку консервировали мертио пятом натрия (0,2 мг/мл) и хранили при температуре 4-8 0 С

Нз полученных антисывороток выделяли иммуноглобулиновую фракцию (^О методом аффинной хромотографии на белок А-агарозе (ЯаЛпаїп Бахе-а, 1984) Полученные антитела частично конъюгировали пероксидазои хрена методом перйодатного окисления (Макапе, Кау/аш, 1974)

Методы диагностики возбудителей бактериозов.

«Сэндвич» — вариант иммуноферментного анализа

Анализ проводили согласно инструкции к диагностическим наборам ИФА на Е сагогоуога виЬзр ашэзерма и С гшс1іі£апепзі5 зиіьр зересіотсиь производства ВНИИ картофечьного хозяйства со следующими модификациями в отдельных вариантах опытов

1 Использовали пробно-конъюгатный буфер с двукратной концентрацией буферных «лей (КН^РОл, ї\тагНРОі\12НгО) Сок растений (из тастьев, черешков ллстьея, стебчсй) смешивали в соотношении 1 I с концентрированным пробно-конъюгатным буфером или подвергали низкоскоростному (1000 об/мин, 10 мин) и высокоскоростному (10000 обмин, 10 мин) центрифигурованиго, после чего осадок бактерий ресуспендировали в 100-200 мкл пробно-конъюгатного буфера обычной концентрации

2 Из столонной част» дезинфицированных 96 % спиртом клубней выреза ли сегменты ткани (1x1 см), которые измельчали стери-іьньш скальпетем К измельченной ткани добавляли фосф.гпго-со тевой буфер в соотношении 1 10 и фильтровали через ватный фильтр Поел с 60 минут го отстаивания кадосадоч-ную жидкость подвергали центрифигурованию при 10000 об'мин в течение 10 мин Осадок ресусгекдировали в 100 мкл пробно-конъюгатного буфера и наносили в лунки микроплат

Непрямой вариант иммунофлуоресцентной микроскопии проводили согласно инструкции по применению диагностических флуоресцирующих антикро-.вдчьих иммуноглобулинов предприятия по производству бактерийных препара тов НИИ эпидемиочогии и микробиолої ии им Н Ф Гамалеи

Экстракты из листьев и клубней готовили, так же как и для ИФА точько вместо пробно-конъюгатного использовали 0,01 VI фосфатный буфер рН " 4, содержа шии 0,15 М МаСі Дтя григочовления жстракгов из черешков ллстьев, стеолел и гробирочных растений брали оксю О 5-1 г ткани и измельчали острой бритвой в стерильных чашках Петри, после чего добавляли в измельченную ткзнь рчннпе ^отчество фосфаггно-^олевого буфера и использовали экстраю для анализа

Полимеразная цепная реакция. Для постановки ПЦР были подобраны прай-меры на основе известной последовательности гена, кодирующего 16 S РНК генома С. michiganensis subsp. sepedonicus.

Составы праймеров: F 5' - cgctctccccaccagactc - 3'

R 5* - agggcacgacggacgcaac - 3'.

Для амплификации фрагмента генома этого возбудителя выделяли геномную ДНК по схеме: выделение бактериальных клеток экстрагирующим буфером с защитными добавками, их осаждение, лизис бактерий при кипячении в 0,25 N растворе NaOH, нейтрализацию избытка щёлочи 0,25 N НС1 и доведение рН до 8 с помощью 0,5 М трис-HCl буфера. Затем отделение не разрушенных бактериальных клеток центрифугированием, очистка ДНК депротеинизацией фенолом, фенол-хлороформом и хлороформом, осаждение ДНК 96 % этанолом, центрифугирование и конечное растворение ДНК в 20-30 мкл дистиллированной воды.

ПЦР проводили в термоциклере «Терцик» («ДНК-технологии», Россия). Реакционная смесь объёмом 25 мкл содержала: 5 мкл исследуемого образца, 0,1 мкл Taq ДНК-полимеразы (5 ед/мкл, «Fermentas», Литва), 2,5 мкл 10 х буфера («Fermmtas»), 2,5 мкл 25 нМ HgCb, 0,25 мкл 20 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, по 1,25 нМ каждого из четырёх дезоксинуклеотидтрифосфатов и 10 нМ каждого из двух олигонуклеотидов.

Протокол амплификации включал: 1 цикл в течение 2 мин для денатурации ДНК при 94 °С, 30 циклов по 1 мин при 94 °С для денатурации цепей ДНК, 1 мин. при 55 °С для отжига праймеров с матрицей и 2 мин при 72 °С для синтеза комплиментарных цепей ДНК и завершающего синтеза в течение 4 мин при 72 °С. Опыты по амплификации повторялись не менее трёх раз.

Для разделения продуктов амплификации использовали горизонтальный электрофорез в 1 % агарозном геле («Chemopol», Чехия). Для визуализации ДНК в геле объёмом 50 мл добавляли 3 мкл (20 мг/мл) бромистого этидия. Гели фотографировали в_ ультрафиолетовом свете с длиной волны 310 нМ, а затем сканировали негативы с помощью «Astra 12205» («UMAX Data System», США).

В качестве контроля использовали метод капельной агглютинации, описанной в литературе М.С. Дуниным (1961); К.Ф. Герасимовой (1974); А.М. Лазаревым (1981; 1984; 1985; 1999) и др.

Полевой опыт. Для усовершенствования технологического регламента проведения методов диагностики был заложен опыт с искусственно заражёнными клубнями. Использовали сорта относительно устойчивые к черной ножке: Бронницкий, к кольцевой гнили: Удача и относительно неустойчивые - Невский и Жуковский ранний соответственно. В столонную часть клубня вводили суспензию бактерий в количестве 0,1 мл в концентрации 100 млн кл/мл. Использовали штаммы Е. carotovora subsp. atroseptica - Еса 19, Еса 161; Е. carotovora subsp. caro-tovora - Ecc 10, Ecc 13; C. michiganensis subsp. sepedonicus - Cms 134, Cms 148. Общее количество клубней 20 шт. Повторность двукратная.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Выделение в чистую культуру возбудителей бактериозов картофеля и изучение их морфологических, культуральных и биохимических свойств.

Было отобрано более 40 образцов клубней картофеля с симптомами бактериозов Из них выделили 206 изолятов ¡зозбудитеаел черной ножки и кольцевой гнили После теста на гтатогешшстъ отобрали около 50 сильнопатогенных изолята Изучение их морфотогических, культуральных и биохимических свойств позволили отнести 5 изолятов к одной из разновидностей возбудителя черной ножки - Е caro'ovora subsp carotovora, 14 к другой разновидности Е carotovora subsp atroseptica, 22 - к возбудителю кольцевой гнили Д,ш контроля при изучении тгих свойств исгользсвали штаммы черной ножки 34 и кольцевой гнили 6020, 6320, 7757 из коллекции ВНИИКХ

2. Изучение серологических свойств выделенных штаммов.

К 9 штаммам Е carotivora subsp atrobeptica (Fea 6, Eca 32, Eca 34, Eca 161, Eca 170, Eca 3380, Eca 3390, Eca 3404, Eca 3406) и к 2 штаммам С m ch'gane"sis subsp sepedomcus (Crrs 134, Cms 6020) были получены моноштаммовые антисыворотки Огределение гомотошчных и гетерологичных обратных титров ангисы-вороток в негрямом варианте ИФА (F-FL1SA), показало, -по гетерологичные татры антисывороток ко всем штаммам возбудителя черной ножки могут отличаться от гомологичных на несколько порядков, что указывает на высокую серолм иче-скую неоднородность этих штаммов В ~о же время обратные титры гомо 'ОГИЧ-ных антисывороток к штаммам возбудителя кольцевой гнили отличаются oí гете-рологичных всего на несколько двукратных разведении, что доказывает их серологическую однородность Низкие титры со всеми штаммами показали поли-штаммовые антисыворотки, полученные иммунизацией смесью штаммов черной ножки и кольцевой гнили

На основе моноштаммовых и полинггаммовых антисывороток были получены специфические антитела и конъюгаты антител с пероксидазои чрена (тест-системы ИФА) С их помощью были поставлены перекрестные реакции нгтаммов Е carotovora subsp atroseptica в das-ELISA варианте ИФА Полученные результаты по спектру реакции 'штамм-система ИФА' позволили дифференцировать серогруппы этой разновидности черной ножки (табл 1)

Данные таблицы показывают, чю гест-системы ИФА значительно отличаются по нггаммовои специфичности Так системы, полученные на основе штаммов сса 6, Еса 161, Еса 170 и Еса '4 иб^лдали способностью выявлять с достаточно высокой чувствительностью гораздо Сильнее число л.там\"ов, ie*í с истечь', полученные на основе штаммов Еса 32, Ьса 4380, Еса 3390, Еса 3404 и Еса 3406

Таблица 1

Чувствительность das-ELISA варианта ИФА при тестировании штаммов Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Еса)

Тест-система das-ELISA варианта ИФА

Штамм Еса Еса Еса Еса Еса Еса Еса Еса Еса Еса

Еса 6 32 34 161 170 3380 3390 3404 3406 5Х

6 5+ - 4+ 5+ 4+ -н + + - 5+

17 4+ + 3+ + -ь - + + - +

32 - 5+ 4+ 5+ - - - - - 3+

34 5+ - 5+ 5+ 4+ - - - - 4+

90 + - 5+ 5+ 2+ - - - - 4+

161 5+ - 5+ 5+ 5+ 2+ ± ± - 5+

170 4+ - 4+ 5+ 5+ - - - - 4+

3380 + ± 2+ 2+ + 4+ ± ± - 4+

3390 + - ± 2+ + - 5+ 5+ - 5+

3404 - - ± ± + ± 5+ 5+ - 4+

3406 - - + 5+ + + 2+ - 2+

5128 3+ - 4+ 5+ 2+ - + - - 3+

Шкала чувствительности:

5+ - очень высокая чувствительность теста (< 103 кл/мл); 4+ - высокая чувствительность теста (< Ю4 кл/мл); 3+ - довольно высокая чувствительность теста (< 10s кл/мл); 2+ - средняя чувствительность теста (< 106 хл/мл); + - низкая чувствительность теста (< 107 кл/мл); — очень низкая чувствительность теста (> 107 кл/мл).

Полученные результаты позволяют предположить, что все представленные тест-системы ИФА получены на основе штаммов, относящихся к разным серогруппам Е. carotovora subsp. atroseptica. На основании полученных данных можно заключить, что полиштаммовая тест-система ИФА, полученная из смеси моноштаммо-вых антисывороток к штаммам Еса 6, Еса 161 (или Еса 34), Еса 170, Еса 3380 и Еса 3390 (или Еса 3404) позволит диагностировать не менее 8 серотипов этой разновидности черной ножки. Испытание этой полиштаммовой тест-системы (система ИФА Еса 5Х) показало, что такая диагностическая тест-система достаточно эффективно выявляет большинство из испытанных штаммов Е. carotovora subsp. atroseptica.

Анализ чувствительности выявления штаммов кольцевой гнили диагностическими тест-системами ИФА, полученными на основе антисывороток к штаммам С. michiganensis subsp. sepedonicus 134 и 6020 и смеси штаммов этого возбудителя (Crnsmix) показал, что наиболее эффективна тест-система ИФА на основе штамма Cms 134. Эта тест-система позволяет охватить практически все изучаемые штаммы этого возбудителя с чувствительностью 105-106 кл/мл.

В другой серии опытов с чистыми культурами бактерий изучали диагностические возможности антисывороток и иммуноглобулинов (IgG), выделенных из них, методом непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии

Результаты проведенных исследований показали преимущественное реагирование штаммов различных серогрупп Ь carotovora subsp atroseptica с гомологичными акгисыворотками Наиболее широким спектром реагирования со штаммами, представляющими различные серогруппы этого возбудитетч, обладала по-лиштаммовая антисыворотка Еса 5Х (табт 2) Из данных табчицы можно заключить, что оптимальное разведение для этой антисыворотки 1 100, а оптимальная концентрация иммуноглобулинов, вылеченных из этой аптисыворотки - 40 мкг/мл При этих рабочих разведениях антисыворотки и иммуноглобулинов не наблюдалось положитечьных реакции, как в контротях иммунологической сче цифичности, так и с другими патогенными и непатогенными для картофеля бактериями

Аналогичные исследования с постановкой перекрестных реакции тремя антисыворотками и иммуноглобулинами, полученными из них (Cms 134 Ctis 6020

Табчица 2

Серологическая специфичность почипггаммовой антисыворотки Еса

в тестах НИФМ

Штаммы бактерий

Разведение антись-воротки | Концентрация IgO и кг/мл I ' ' ~' ГЗиJ I 20 I 40 SO

1 50

1 100

Еса 6

Еса 34

_ 1-"са_161_ Сса 170 Еса 3380

4-г 4+

Еса 3390

Еса 3404 Еса 3406

Е chrvsanthemi 3065

Е rhaphontici 572 Есс 13

2+ 3+

Е herbicola 7780

Ps fluoresces 213

Ag tumefacens S62S Cms 204

4-

4+ I 4+ 4+_

~3+ , 4-3+ 4-

Принятая в таблицах 2 и ' шкала (4' ) - ярко выраженное свечение ореола вокруг клеток, (3+) - менее яркое свечение орео"2 клеток, (2-1-) - разномерное окрашивание всей микробной клетки, (*) - 1абая флуоресценция клепок, (-) отсутствие свечения клеток

Таблица 3

Серотогическая специфичность антисыворотки к штамму С michiganensis subsp '-cpedomcus 134 в тестах НЙФМ

Разведение антисыворотки Концентрация IuG, мкг/мл

Штаммы оакгерии 1 50 I 1 100 1 200 20 40 ' 1 80

Cms ь2 4+ 4+ 2+ 2*- 4+ i 4f

Cms 134 4+ 2+ 2- 4<- 1 4+

Cms 144 2-r 2*- + 2+ \ 3+

Cns 204 4i- 4*- 3f I. 4+

Cms 557 4^ 1 2~ -) 4<- 4<-

Cms 5351 4»- ► 2i- «+- i 4-1-

Cms 6020 4+ 1 4<- 2<- 3+ 4-t- 4

Cms 6320 4+ 1 J+ -t- 4+- 1 4»

С michiganensis subsp mi- 2* chicancnsis 182 i I - - - 1 t +

С michiganensis subsp Iisidiosum 7775 + _ _

Ps faorescens 213 - - - +

Ag tumefaciens 8628 - - - - -

Eca 161 i - , _

Нее 13

I

и Сшв,, со штаммами С писЬщапепх^ БиЬэр зереаотсиь показали, что, как и для тест-системы ПФА наиболее активна антисыворотка к штамму этого возбудителе СГП8 134 Оптимальная концентрация имм>ног'об>1инов, тл ученных из этой сыворотки -40 мкг/мл, а рабочее разведение 1 100 (табт 3) Специфичность антисыворотки подтверждена в тестах с использованием бактериальных и растительных антигенов

3. Изучение методов диагностики возбудигелеи бакзериозов картофеля.

3.1. Результаты тестирования листьев и черешков нижнего яруса в фазы бутонизации и цветения.

Исследования го изучению эффективности методов выявления скрытой зараженности возбудителями черной ножки и кольцевой гнили картофеля проводили методами кагельной агпютинации и das-ET ISA вариантом ИФА в 2000-2002 гг, в 2001-2002 г к ним добавили четоч НИФМ, в 2000 г пробные резучьтаты почучили методом ПЦР

Анали1ировзли материал, выращенный в полевых опытах с искусственным »аракением к.'\ 51 ей г:го''енними urav"?."i' Foi0v„:inre.r,Lr черной ножки и ко*"ь-[.lboh гниги к л рте фе л я

В фазу бутонизации методом ИФА выявлялось довольно низкое количество зараженных растений в первый год после инокуляции. Среднее их количество в зависимости от сорта составляло 30-40 % на вариантах с растениями, зараженными черной ножкой, и 20-30 % - с кольцевой гнилью. Метод НИФМ уже в эту фазу показал довольно высокие результаты: 65-75 % зараженных растений с черной ножкой и 60-70 % с кольцевой гнилью по результатам тестирования листьев. При тестировании черешков выявлялось на 10 % зараженных растений меньше обоими методами.

В фазу цветения методом ИФА выявлялось в два раза больше заражённых растений с первичной инфекцией, чем в фазу бутонизации: до 60-80 % по листьям и до 50-75 % по черешкам на вариантах с черной ножкой и до 50-60 % по листьям и до 40 % по черешкам на вариантах с кольцевой гнилью (табл. 4). Методом НИФМ выявлялось на 10-20 % зараженных растений больше как по листьям, так и по черешкам. Небольшой процент заражённых растений выявляет и метод капельной агглютинации. Пробные тесты методом ПЦР показали единичные зараженные растения на образцах сорта Удача.

Таблица 4.

Зараженность растений картофеля возбудителями бактериозов в первый год после инокуляции в фазу цветения, (%)

Методы диагностики

Варианты опыта ИФА НИФМ % совпадений.

+ результатов

лист черешок лист черешок лист черешок

Невский контроль 8,3 7,3 0 0 0 0

Невский - Еса19 66,3 61,7 85,2 . 78,5 84,0 78,0

Невский - Еса 161 21,5 17,7 77,0 75,0 73,0 70,0

Невский -Есс 10 71,7 70,3 84,2 73,5 81,0 75,0

Невский - Есс 13 60,5 52,9 74,0 73,0 72,0 69,0

Бронницкий контроль 12,2 7,0 0 0 0 0

Бронницкий - Еса 19 31,1 28,0 79,4 73,6 71,0 66,0

Бронницкий — Еса 161 49,0 46,3 84,5 77,5 79,0 73,0

Бронницкий — Есс 10 40,1 37,3 78 69,5 70,0 63,0

Бронницкий — Есс 13 57,5 45,0 87,9 76,5 80,0 74,0

Удача контроль 21,7 19,3 17,5 15,0 • 15,0 12,0

Удача-Cms 134 54,4 43,0 82,0 71,5 75,0 70,0

Удача - Cms 148 42,1 33,7 76,5 68,0 69,0 64,0

Жуковский ран. контр. 10,7 6,30 0 0 0 0

Жуковский ран. - Cms 134 • 47,0 39,0 78,0 68,0 64,0 61,0

Жуковский ран. - Cms 148 73,3 67,0 90,5 85,5 89,0 81,0

В фазу цветения протестировали также растения с вторичной инфекцией (второй год посте инокуляции клубней) Показано, что результаты тестирования методами ИФА и НИФМ практически совпадают, поэтому метод ИФА, как более производительный и дешевый экономически, выгоднее использовать для выявления вторичной инфекции Е carotovora subsp atrosepüca и С michiganensis subsp sepedonicus При первичнои инфекции эффективнее исго 1ьзовать при тестировании листьев нижнего яруса метод НКФМ, гак как этот метод более чувствителен и выявляет большее количество растений, зараженных возбудителями черной ножки и кольцевой гнили картофеля

Известно, что методы ИФА и НИФМ отличаются по чувствительности Также известно, что концентрация бактериальных клеток в растениях постоянно изменяется и зависит от сортовых особенностей растений картофеля, штамма возбудителя и условий окружающей среды Поэтому для повышения достоверности результатов мы рассчитывали зараженность возбудителями бактериозов по совпадению положительных результатов, что отражает наличие зараженности по результатам обоих методов диагностики В фазу цветения методами ИФА и НИФМ она составила на вариантах с черной ножкой 75-85 % и на вариантах с кольцевой гнилью 6 >-7 5 °о

3,2. Результаты тестирования стеблей различных ярусов методами ИФА н НИФМ перед уборкой j рожая.

Ч различных частях стеблей картофеля перед уборкой урожая изучили сравнительна.ю эффективность методов ИФА и НИФМ (табл 5) Приведены данные по оптической плотности экстрактов и количеству флуоресцирующих клеток, определенные этими методами на вариантах с героичной инфекцией Как видно из таблицы, между оптической плотностью продуктов реакций (экстинкций) полученных при анализе сока тестируемых растении методом ИФА и количеством бактериальных клеток, выявляемых методом НИФМ, имеется явная прямая коррелятивная связь Повышение экстинкциТ в реакциях ИФА наблюдалось и увеличение количества флуоресцирующих бактериальных клеток от верхней части стебля к нижней части

Результаты тестирования нижнего яру са стеблей оказались практически идентичными результатам тестирования -истьев нижнего яруса в фазу цветения го всем методам При тестировании растений с котьцевой гнилыо результаты бы-"и выше до 75-85 °о зараженных рзстений в зависимости от сорта методом ИФА и практически 100 % методом НИФМ Метод капельной агглютинации только в нижнем ярусе показал единичные положительные результаты В отличие от метода ИОА метод НИФМ выявлял довольно высокий процент зараженных рас~ений и з среднем чр\се - торгдга 65-"* °о

Таблица 5

Сравнительная эффективность методов ИФА и НИФМ при выявлении возбудителей бактериозов в стеблях картофеля перед уборкой урожая

Методы диагностики

ИФА (o.e. х 10"J) 1 НИФМ (фл. кл/поле зрения)

Варианты Часть стебля

верхняя средняя нижняя верхняя средняя нижняя

Невский контроль 90 100 130 0 0 1,2

Невский Еса19 130 210 400 1,0 8,3 10,1

Невский Еса 161 160 180 270 1,7 3.2 3.5

Невский Есс 10 90 175 190 0 2,0 2,4

Невский Есс 13 70 160 240 0 2.3 2,7

Бронницкий контр. 45 60 60 0 0 0

Бронницк. Еса 19 95 ПО 150 0 1,2 1.8

Бронницк. Еса 161 180 230 410 2,0 5,1 11,2

Бронницк. Есс 10 50 120 200 0 2,4 4,2

Бронницк. Есс 13 140 275 350 1,0 5,7 9.2

Р = *+3£ 100 110 120 - - -

Нида контроль 75 90 170 0 0 2,0

Нида Cms 134 150 175 200 1,0 2,4 3,2

Нида Cms 148 170 260 450 2,4 5,7 12,0

Удача контроль 55 50 110 0 0 1,0

Удача Cms 134 140 270 390 2,4 7,1 9,7

Удача Cms 148 і 120 210 290 1,0 3,9 8,4

Р = х+3£ 1 90 95 100 - -

Зараженность по совпадению положительных результатов методами ИФА и НИФМ составляла в вариантах с заражением растений штаммами возбудителя черной ножки в нижнем ярусе 75-85 %, в среднем ярусе 60-70 % и в верхнем ярусе 25-35 % и в вариантах с кольцевой гнилью 65-75 %, 55-65 %, 20-30 % соответственно.

33. Результаты тестирования клубней на зараженность Е. carotovora subsp. atroseptica и С. michiganensis subsp. sepedonicus.

Результаты тестирования клубней картофеля по описанной выше методике показали, что как при первичной (табл. 6), так и при вторичной инфекции наиболее заражёнными были клубни от растений тех вариантов, которые были наиболее зараженными в течение вегетации. При этом сохранилась различия между результатами тестирования обоими методами. Разница между методами ИФА и НИФМ составляет 10-20 % при первичной инфекции, а при тестировании вторичной инфекции разницы практически нет. Поэтому, как сказано было выше,

Таблица 6

Зараженность клубней картофеля возбудителями бактериозов в первый год после инокуляции, (% зараженных клонов)

1 1 Методы диагностики

^ Варианты опыта ИФЛ. НИФМ % совпадении +- результатов

1 Невским (контроль} 12 0 0 і 0

Невский - Еса 19 64,5 76,7 1 7* 0

Невским - Ьса 161 6* 6 , 64 0

Невский - Ьсс 10 62 5 74 5 1 73 0

Невскии - Есс ¡3 51,7 62.9 , 60 0

Бронницкий (контроль) 0 0 1 0

Бронницкии Еса 19 647 76 3 73 0

Бронницким — Еса 161 75,2 84,7 S1.0

1 Ьоонницкии— Fee 10 66 0 79,0 "4,0

' Бронницкии - Есс Р 76 0 86,0 83 0

! Удача ( контроль) 100 12,0 і 10 0

"V дача Cms Р4 62 0 84,0 ' 69,0

V дача - Cms 148 32 5 49,0 І 47.0

Жуковский раннии (контроль) 0 0 1 0 H

1 Жуковскии ранний — Cms Р4 54,2 76 4 71,0

Хуковскии ранниа - Cms 148 77.5 90 0 82 0

вторичную инфекцию наиболее эффективно и целесообразно тестировать методом ИФА, а первичную - методом НИФМ

Зараженность по совпадению положительных результатов методами ИС><\ и НІІФМ составляет на вариантах с черной ножкой в зависимости от сорта 65-75 '« и на вариантах с кольцевой гнилью 60-70 °Ь

4. Сравнительная эффективность методов диагностики возбудителя кольцевой гнили картофеля на примере растений in vitro.

Данные по сравнительной эффективности методов иммуноферменгного анализа, иммуьофлуоресцентной микроскопии и полимеразнои цепной реакции гри тестировании оздоровленных растений m vitro на іараженность возбудителем кольцевой гнили картофеля приведены в таблице 4 (показаны только положительные результаты)

Методом иммуноферментного анализа не было выявлено ни одного растс ния из 40 сортообразцов, зараженного С michiumenbis bubsp sepedón cus, что объясняемся не очень чысокой чувствительностью і римененного вар.<а"та ИФ \

Таблица 7

Сравнительная оценка методов диагностики С. michiganensis subsp. sepedonicus

в растениях in vitro

Сорт Линия Методы диагностики

ИФА НИФМ ПЦР

1 2 3 4 5

Жуковский ранний 22 - + -

Жуковский ранний 11 - + -

Удача 11 - + -

Луговской 41 - - +

Луговской 17Б-32 - - +

Витал Б-1 - + +

Велокс 1 Б-1 - + 4-

Супериор Б-10 - + +

Прайса 5 - + +

Симбирянин 1-20 - + +

Десница 1-32 - - +

Красноярский ранний 1 - - +

Осень 62 - + +

Вестник 9 - + +

Брянский ранний 1 - + +

Загадка 104 - + +

Зов 10 - - +

Олимп Б-17 - - +

Адретта 15А-3 - + -

Петербургский 62 - + +

Скороплодный 22 - + •Г

Раменский Б-100 1 +

(+) положительная реакция; (-) отрицательная реакция

при тестировании этого возбудителя, составляющей по нашим данным 105-106 кл/мл.

Методом непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии выявлено 15 зараженных сортолиний или 37,5 % из числа тестированных. Методом полимераз-ной цепной реакции удалось выявить 18 инфицированных сортолиний (рис. 1) или 45 % от проверенных. При этом зараженность сортолиний С. гтсЪ^апегшз эиЬвр. эерес^тсиз по совпадению положительных результатов НИФМ и ПЦР составила 50 %.

1 2 М 3 4 5 б 7

Рис 1 Электрофореграмма ампликонов, полученных в результате ПЦР-диагностики С raichiganensis subsp sepedonicus в картофеле Анализировалась ДНК, выделенная из следующих источников

1 - здоровый картофель,

2 - картофель, инфицированный С nuchiganensis subsp sepedonicus, 3-6 - анализируемый картофель,

7 - штамм Cms 6020, М - 100 b DNA Ladder (СибЭнзим)

ВЫВОДЫ

1 Выделено 206 изолятов из 40 образцов клубней с признаками кольцевой гнили и черной ножки У 50 патогенных изолята изучены физиочого-биохимические свойства Эти результаты позволили идентифицировать 5 изолятов, как Е carotovora subsp carotovora, 14 изолятов, как Е carotovora subsp atrosep-tica и 22 изолята, как С nuchiganensis subsp sepedonicus

2 К 9 штаммам Е carotovora subsp atroseptica и 2 штаммам С michiganensis subsp sepedonicus получены моноштаммовые антисыворотки, а также к смеси коллекционных штаммов этих возбудителей - полиштаммовые антисыворотки Показано, что 5 для Е carotovora subsp atroseptica и 7 для С michiganensis subsp sepedonicus внутримышечных инъекций с недельным интервалом обеспечивает получение антисывороток с высокими гомологичными титрами

3 На основе полученных антисывороток созданы диагностические тест-системы ИФА Изучение серологических свойств штаммов Е carotovora subsp atroseptica с помощью этих тест-систем ИФА позволило предложить для практического использования полиштаммовлгсо тест-систему ИФА на основе моноштам-мовых антисывороток к штаммам 6, 161, 170, 3380 и 3390 Испытание такой системы ИФА показало, что она позволяет выявлять не менее 8 серотипов этой разновидности Е carotovora с чувствительностью ЮМо4 кл/мл

4 Аналогичные испытания трех тест-систем ИФА к штаммам С michiganensis subsp sepedonicus позвотяют предложить моношгаммовую тест-систему

ИФА на основе антисыворотки к штамму этого возбудителя 134 с чувствительностью 105-106 кл/мл.

5. Усовершенствован технологический регламент проведения "сэндвич"-варианта ИФА, отличающийся от используемого ранее следующим:

а) в состав пробно-конъюгатного буфера введены вещества, уменьшающие фон (поливинилпирилидон, мертиолят натрия);

б) растительный сок наносится на плату в соотношении с буфером 1:1 при двукратном увеличении концентрации PBS или подвергается низкоскоростному и высокоскоростному центрифугированию.

в) отмывка от избытка непрореагировавших реагентов после первого и второго этапа проводится два раза дистиллированной водой и два раза PBS с твином и после третьего этапа четыре раза тем же буфером и два раза водой.

6. Разработана диагностическая тест-система на основе НИФМ. Подобраны:

а) оптимальное разведение сока растений (1:10)

б) разведения антисывороток и иммуноглобулинов с наиболее широким спектром штаммоспецифичности (1:100 и 40 мкг/мл для полиштаммовой антисыворотки Еса 5Х и такие же разведения и концентрации для антисыворотки и иммуноглобулинов к штамму С. michiganensis subsp. sepedonicus 134);

б) испытаны и подобраны оптимальные условия проведения анализа (концентрации реагентов, блокирующих неспецифические реакции веществ, время инкубации, режимы промывок).

7. Методом ИФА успешно выявляются E.carotovora и С. michiganensis subsp. sepedonicus в листьях и стеблях нижнего яруса с фазы цветения и в клубнях после вегетации. Однако этот метод довольно существенно уступает по числу выявляемых зараженных растений при первичной инфекции методу НИФМ. За счет низкой себестоимости и высокой производительности метод ИФА эффективнее применять для выявления этих возбудителей на второй и последующие годы после заражения бактериальной инфекцией.

8. Методом НИФМ возможно выявление С. michiganensis subsp. sepedonicus и E.carotovora в концентрации 10J-104 кл/мл. При первичной инфекции этот метод эффективнее использовать при тестировании листьев и стеблей нижнего яруса в фазу бутонизации (до 85 % зараженных растений) и в клубнях после вегетации.

9. Подобраны составы праймеров, отработаны методика пробоподготовки и схема проведения анализа для выявления С. michiganensis subsp. sepedonicus на основе ПЦР. Чувствительность этого метода составляет 102-103 кл/мл.

10. Анализ 40 сортолиний растений картофеля in vitro на латентную зараженность С. michiganensis subsp. sepedonicus методом ИФА не было выявлено ни одного зараженного растения. Методом НИФМ выявлено 15 зараженных растений или 37,5 % из числа тестируемых. Методом ПЦР выявлено 18 или 45 % зараженных сортолиний. При этом зараженность сортолиний по совпадению положительных результатов составила 50 %.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Учитывая диагностические возможности, технологические особенности е материально-временные $атраты (стоимость тестирования одного образца методом ГТЦР составляет 35 руб , иммунологическими 3-4 руб ) для диагностики возбудителей бактериозов картофеля, можно рекомендовать

1 Использовать метод ПЦР для оценки скрытой зараженности кольцевой гнилью при введении сортообразцов картофеля в кучьтуру in vitro, а также при контроле зараженности коллекции оздоровленных сортолиний

2 Проводить массовое тестирование на зараженность F carotovora и С michiganensis subsp sepedomcus семенного материала картофеля методом НИФМ целесообразно, как для оценки коллекции оздоровленных сортообразцов в культуре in vitro, гак и в схемах котроля качества при производстве оздоровленного исходного материала (питомники выращивания чини-клубней, I полевой репродукции из мини-клубней, супер-суперэпиты)

3 Сэндвич - вариант иммуноферментного анализа, позволяющий надежно выявлять вторичную инфекцию Е carotovora и С michiganensis subsp sepedomcus, эффективно испозьзовать для диагностики скрытой зараженности бактериозами при производстве базисного и репродукционного семенного материала картофеля

Список научных работ опубликованных по теме диссертации:

1 Белов Г Л Изоляция и идентификация возбудителей бактериальных болезней картофеля для создания к ним диагностических сывороток // Вопросы картофелеводства научные труды - М ВНИИКХ, 2001 - с 330-336

2 Варицев IO А , Белов Г Л , Усков А И , Варицева Г П Разработка диагностических тест-систем на основе ИФА, ИФМ, ПЦР для выявления скрытой зараженности картофеля возбудителя кольцевой гнили (Clavibacter michiganensis subsp sepedonicum) // Биотехнология на рубеже двух тысяче гетий материалы международной конференции - Саранск, 2001 -с 35-37

3 Варицев Ю А , Белов Г Л , Усков А И, Варицева Г П , Завриев С К , Ар-шава Н В , Зайцев В В Методические указания по диагностике возбудителей черной ножки Erwmia carotovora (Jones) Bergey et al) и кольцевой гнили картофеля Clavbacter michiganensis subsp sepedomcus) (Spieck et Kotth) Skaptasson et Burk ) методами иммуноферментного анализа, иммунофлуоресцентной микроскопии и полимеразной цепной реакции // ВНИИ картофельного хозяйства, 2003 - 33 с

1,0 п л Зак 204 Тираж 100 экз

AHO «Издательство МСХА» 127550 Москва ут Тимирязевская, 44