Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка метода учета мутаций в гипервариабельных районах ДНК для целей генетического мониторинга

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка метода учета мутаций в гипервариабельных районах ДНК для целей генетического мониторинга"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

РГ6 ОД

На арака к рукоаяси

3 УДК (571.147 ♦ 5ПЛМУ5ЛЛ

Моляка Юрий Константинович

РАЗРАБОТКА МЕТОДА УЧЕТА МУТАЦИЙ В ГИПЕРВАРИАБЕЛЬНЫХ РАЙОНАХ ДНК ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание уменой степени кандидата медицински* наук

Москва 1994 г.

Работа выполнена на кафедре медицинской генетики Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова

Научный руководитель:

Действительный член РАМН, профессор Н.П. БОЧКОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.А.СПИЦМН кандидат биологических наук М.И. ПРОСНЯК

Ведущее учреждение: МГУ мм М.И.Ломоносова, кафедра генетики и селекции.

Защита состоится . ......1994 г. в часов

на заседании Специализированного совета (Д.001.16.01) Мелико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-

генетического научного центра РАМН .

Автореферат разослан • 1994

Ученый секретарь Спецма л и э и рова н н о го Совета доктор биологических наук, профессор

Л.Ф. Курило

Общая характеристика работы

Оценка гепетических эффектов у человека в связи с загрязнением окрухапцей среди оказалась неимоверно трудной и пока еще нерешенной задачей» Универсальный характер радиационного в химического мутагенеза (индукция всех типов мутаций у всех видов животных, растение, микроорганизмов) не вызывает сомнений в правильности экстраполяции основных закономерностей индуцированного мутагенеза на человека. Однако количественные характеристики мутагенеза специфичны для каждого вида с К тому хе, в реальных условиях среды обитания человека и индивид» и популяции подвергаются комплексному воздействию огромного числа потенциально мутагенных факторов. Поэтому, для оценки интенсивности мутационного процесса в популяциях человека наиболее надежным подходом является" применение прямых методов учета генетических эффектов у потомства или мониторинг.

Многочисленные популяционные исследования мутационного процесса у человека при фенотипическом (учет сторожевых фенотипов), цитогенетическом (диагностика хромосомных болезней) и биохимическом (учет белковых вариаций) подходах не дали еще убедительных прямых доказательств индуцированного мутационного процесса в популяциях человека под влиянием радиации и химических веществ. В основном это можно объяснить отсутствием адекватных методов, позволяющих регистрировать изменение частот мутантов в популяциях при использовании выборок реальной, а не гипотетической величины. Поэтому, разработка новых более эффективных методов мониторинга является актуальной задачей.

Пель исследования -

разработать метод учета мутаций на уровне ДНК, пригодный для прямой регистрации различий мутационных част:г в популяциях.

Для достижения данной цели били поставлены следуйте задачи:

1) На основании анализа литературных данных выбрать молекулярно-генетический метод, наиболее подходящий для прямого определения частоты мутаций на уровне ДНК у человека.

2) Адаптировать выбранный метод применительно к задачам генетического мониторинга популяций путем максимального упрощения всех этапов исследования и увеличения производительности без ухудшения разрешающей способности метода и надежности получаемых результатов.

3) Разработать систему контроля достоверности получаемых результатов.

4) Оценить специфичность метода по отношению к регистрируемым мутациям и воспроизводимость получаемых результатов..

5) Определить частоту мутаций предложенным методом и на основании полученных результатов оценить размеры выборок, необходимых для регистрации двукратного и 50%-го повышения частоты мутаций.

Научная ровизни

В выборке из 113 семей определена спонтанная частота мутаций .в гипервариабельных районах ДНК (ГВР), выявляемых новым мультилокусным юшисателлитным зондом Ие<34. Определены размеры выборок, необходимых для регистрации двукратного (113 семей) и 50£-го (304 семьи) повышения частоты мутаций, а также, затраты рабочего времени для проведения этих исследований. На основании семейного анализа и сравнения ДНК профилей 75 пар неродственных индивидов определены основные характеристики ДНК профилей (среднее число полос в ДНК профиле и коэффициент совпадения полос в ДНК профилях неродственных индивидов), выявляемых мультилокусным зондом 1Ы4. Показан менделевский характер

передачи Red4 фрагментов; большинство локусов Red4 находятся в гетерозиготном состоянии, представлены на фингерпринте единственным гомологом и передаются независимо друг от друга. Выявлено сходство характеристик данного полиморфного маркера с известными полиморфными маркерами 33.6 и 33.15. Научно-практическое значение

Предложен эффективный и надежный метод регистрации мутаций в ГВР генома человека, выявляемых мультилокусным минисателлитным зондом Red4, пригодный для использования в системе генетического мониторинга. Сходство характеристик данного полиморфного маркера с известными . полиморфными маркерами 33.6 и 33.15 допускает совместное использование трех перечисленных зондов, что позволит сократить размеры выборок минимум в 2 раза. Разработана база данных для хранения и обработки исходных, промежуточных данных н конечных результатов. Кроме основного назначения, представленные S работе данные могут быть полезными для исследователей, работающих в области популяционной генетики, медико-генетического консультирования, в клеточной биологии, в онкологии и в судебной медицине. Положения, выносимые на защиту

1. Предложен метод регистрации мутаций в ГВР ДНК, пригодный для целей генетического мониторинга, определен спонтанный уровень мутаций в локусах, выявляемых новым минисателлитным зондом Red4, размеры выборок, необходимые для регистрации оОЯ-го и двукратного повышения частоты мутаций, а также затраты времени для выполнения этих исследования.

2. Определены основные характеристики фингерпринтов, выявляемых новым минисателлитным маркером Red4, и показано их сходство с характеристиками известных минисателлитных маркеров 33.6 и 33.15. Показан меиделекский характер передачи Red4

фрагментов; большинство яокусов 1Ы4 находятся в гетерозиготном состоянии, представлены на фннгерпринте единственным гомологом и передастся независимо друг от друга.

3. Разработана программа базы данных с использованием Несовместимого ПК АТ 286/287, применяемая на всех этапах эксперимента, включая ввод первичяой информации, рутинные расчеты параметров экспериментов, хранение результатов промежуточных экспериментов, обработку и хранение окончательных результатов.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на научной конференции на кафедре медицинской генетики 1ША им. И.Ц.Сеченова 1 декабря 1993 г., и на мехлабораторном научном семинаре Института клинической генетики а профилактики врожденных и наследственных заболеваний, который состоялся 7 апреля 1994 г.

Публикации по материалам работы опубликовано 2 печатные работы.

Структура и обьем работы

Работа излохела на 7Л г е-траквдах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, методических рекомендаций по применение нового минисателлитного зонда 1Ы4 и списка литературы. Диссертация содержит //£- рисунков и С таблиц. Библиографический указатель включает /// названий.

Материал исследования

В работе исследованы образцы ДНК от 133 детей и их родителей (всего 82 супружеских пары). Образцы крови для выделения ДНК от семей собирали в г. Новомосковске, Тульской области и в г. Дедовске, Московской области. Кроме того в работе использовали

материал, полученный от семей из разных регионов Европейской части России, обратившихся для решения вопроса о спорном отцовстве. Готовые препараты ДНК от членов семей« обратившихся в медико-генетическую консультацию по поводу аутосомно-рецессивных заболеваний были любезно предоставлены проф. Барановым B.C., Саикт Петербург; я н.с. лаборатории популяционной генетики МГНЦ РАМН Петровой Н.В., заведующий лабораторией - член-корр. РАМН, профессор Гинтер Е.К. Независимые клоны клеточной культуры HeLa получены и любезно предоставлены в.н.с. лаборатории общей цитогенетики МГНЦ РАМН Раевской Г.Б.

ДНК из лимфоцитов крови выделяли одним из следующих методов: методом фенольной экстракции с предварительным выделением ядер лимфоцитов, методом фенольной . экстракции из лизатов цельной крови, методом выделения ДНК с применением перхлората натрия или преципитацией белков насыщенным раствором NaCl. Плазмйдную ДНК получали методом щелочного лизиса. Концентрацию препаратов ДНК определяли на спектрофотометре либо флуориметрическим методом.

Рестрикцию геномной ДНК осуществляли 10-кратным избытком рестргастазы Bsurl в универсальном среднесолевом буфере (Маниатис, 1984) при 37°С в течение ночи. Полноту рестрикции контролировали по результатам электрофореза аликвоты ДНК в 0,7% агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием.

Электрофорез Bsurl-гидролизатов геномной ДНК проводили в 0,7% агарозном геле размером 27x30 см, толщиной 0,8 см при напряжении 1 V/cm 48 часов.

Перенос ДНК на нейлоновые фильтры проводили по методу Саузерна с небольшими модификациями. Радиоактивное мечение зондов осуществляли методом статистической затравки, условия гибридизации и отмывки варьировали в зависимости от используемого зонда. После 'ауторадиографии результаты анализа

ДНК профилей каждой семьи заносили в специально разработанную базу данных. Статистическую обработку данных проводили при помощи компьютерных программ и в статистическом пакете "Статграф".

Результаты и обсуждение

Мрр.. метода

В течение последних 10 лет обсуждаются молекулярно-генетические подходы к учету мутаций. По идее метод регистрации генных мутаций-на уровне нуклеотидных последовательностей должен был бы снять все сомнения при генетическом мониторинге. Однако из-за технических трудностей современные молекулярно-генетические методы детекции мутаций не дают возможности эффективно регистрировать редкие мутационные события в уникальных локусах в больших популяциях. Для получения статистически достоверных результатов, если выявляются мутации в отдельном локусе или даже нескольких, размеры выборок* должны составить миллионы индивидов.

Другие возможности для определения частоты мутаций на уровне ДНК - это использование гкяерзариабелышх районов. В них возможно прямое измерение частоты мутаций, поскольку будучи относительно нейтральными, такие мутации не подвергаются жесткому давлению отбора и не приводят к увеличению генетического груза в популяциях.

Необходимо признать существование определенных сложностей в экстраполяции данных, полученных при изучении гипервариабельных районов, на кодирующие участки генома из-за принципиального отличия в механизмах мутаций. Механизмы мутаций в минисателлитных локусах не известны и являются предметом.научных исследований. Возможно, что высокая частота мутаций в ГВР во

многом определяется их структурой. Однако, существует ряд доводов в пользу изучения мутаций в ГВР.

В настоящее время формируется представление о том, что тандемно повторяющиеся последовательности ДНК . не являются абсолютно неактивной частью генома, а играют роль в образовании структур ДНК высокого порядка, необходимых для пространственной организации хроматина в интерфазном ядре, для осуществления ДНК-белковых взаимодействий, для процессов упаковки хроматина и т.д. Упорядоченное образование и функционирование структур высокого порядка возможно благодаря существованию высоко консервативного Кода (кодов) ДНК, получившему название кода укладки хроматина (DNA folding code), в основе которого лежит сайтспецифическая организация тандемно повторяющихся последовательностей. Исходя из функциональной значимости кода укладки хроматина, постулируется действие отбора на стабилизацию структур, обусловленных этим кодом.

ГВР, как часть генома, a priori подвергаются мутагенным воздействиям в равной степени с другими его частями. Следовательно, на основании регистрации изменения мутационных частот в этой части генома вследствие мутагенных нагрузок можно судить об изменении мутационных частот в других частях генома.

Ю.Е.Дуброва к A.Jeffreys, 1993, опубликовали результаты экспериментов, в которых было показано наличие индуцированного радиацией мутагенеза у мыгей в локусах, выявляемых минисателлитными зондами 33.6 и 33.15. Согласно этим данным удваивающая доза для мышей составляет приблизительно 0,5 Гр.

Блоки совершенных тандемных повторов обнаружены в нитронах некоторых генов и даже в пределах открытых рамок считывания. Установлено, что причиной ряда моногенных наследственных

заболеваний является амплификация простых триплетных повторов в кодирующих участках генов.

С нашей точки зрения, наиболее приемлемым методом регистрации мутаций в ГВР является метод, основанный на сравнении ДНК профилей ребенка и обоих родителей, полученных блот-гибридизацией по Саузерну с мультилокусными минисателлитными зондами. Наличие в ДНК профиле ребенка полосы, отсутствующей в ДНК профилях обоих родителей, учитывается, как мутация de novo в половой клетке одного из родителей (рис. 1).

«ЮГ lUUin 11ДШШI» IKItntn

гляаалмютлыш гопмищп юим га ышпг иптмп!

Рисунок 1. Основные этапы эксперимента.

Преимущества данного подхода перед другими подходами заключаются в том, что совместное выявление большого числа локусов при помощи одного зонда, наряду с высокими частотами мутаций в этих локусах, позволит значительно уменьшить объем выборки и затраты времени, необходимые для получения

и

статистически достоверных результатов. Количество доступных для исследования локусов можно увеличить последовательной гибридизацией одного фильтра с несколькими различными минисателлитными зондами.

После того, как была определена основная стратегия поиска мутаций, необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценка и отбор подходящих маркеров для поиска мутаций.

2.Подбор условий проведения эксперимента, включая сбор биологического материала, выбор оптимальных условия проведения электрофореза и блот-гибридизации.

3.Сравнение характеристик выбранного полиморфного маркера с характеристиками существующих аналогов.

' 4.Определение необходимых размеров выборок для сравнения уровней мутаций в популяциях, подвергавшихся мутагенным воздействиями, и в популяциях, свободных от мутагенных нагрузок на основании предварительных оценок.

Опенка и отбор подходящи маркеров для поиска мутаций

Для выбора подходящего полиморфного маркера Б.Й.Рогаевым была любезно предоставлекч серия мияисателлитных зондов: YNH-24, YCMM-100, Redl, Red2, Red4, 5 и 6. Первые два локусспецифических зонда, полученные Nakamura, широко используются в различных лабораториях и хорошо охарактеризованы в литературе. Остальные зонды недавно получены сотрудником лаборатории Е.И.Рогаева А.Б.Шленским, и еще не были подробно охарактеризовали. Последовательность Redl (Repeat Envelope Deletion) представляет собой продукт нескольких циклов отхига-лигирования частично комплементарных друг другу синтетических олигонуклеотидов длиной около 150 п.о., клонированный в векторе pUC13. Последовательность этих олигонуклеотидов гомологична тандемным повторам env гена вируса * иммунодефицита человека HIV-I.

Остальные пробы получены путем скрининга геномных и хромосомных клонотек человека последовательностью Redl и частично охарактеризованы автором на материале 10 семей и 20 неродственных индивидов.

Критериями отбора для зондов были:

«максимальное количество обнаруживаемых локусов для мультилокусных зондов (не менее 15);

«максимальный полиморфизм локусов в популяциях (не менее 99% гетерозиготности для локусспецифичных зондов);

«полная воспроизводимость электрофоретической картины при повторных исследованиях образцов ДНК одного и того же индивида;

«при использовании двух или нескольких зондов недопустимо перекрывание локусов, выявляемых разными зондами;

«выявляемые локусы должны строго демонстрировать менделевский тип передачи.

Зонды YNH24 и YCUM1Q1 были предоставлены в виде вставок. Локус, выявляемый YNH24 (D2S44) расположен на длинном плече хромосомы II, характеризуется 95%-й степенью гетерозиготности. из-за несоотЕстс.-екя диапазонов длин аллелей YNH24 и мультилокусных зондов выбор компромиссных условия электрофореза для гибридизации с одним фильтром крайне затруднен без потери разрешающей способности. Локус D14S13 (14q). выявляемый зондом YCMM101 имеет сходные характеристики, но степень гетерозиготности в популяции ниже - 85%. Odelberg и соавт., 1989 в 59 семьях, состоящих из 3-х поколений с большими сибствами не обнаружили в этих локусах ни одной мутации. Для сравнения, гетерозиготность в локусо D1S7, частота мутаций в котором достигает 5,2%, составляет 99,4%. Частота мутаций в минисателлитных локусах на локус/на гамету становится существенной при гетерозиготности свыше 97%. Очевидно, что

локусы D2S44 и D14S13 не пригодны для определения мутационных частот. Поэтому в дальнейшем пробу YNH24 и YCMM101 применяли ' только как дополнительный тест в случае сомнений в принадлежности образцов ДНК членам одной семьи.

Зонды Red2, Red4, Red6 представляют собой участки генома человека, полученные скринингом геномных клонотек синтетической последовательностью Redl. Зонд Red5 получен при скрининге этой же последовательностью клонотеки 21-ой хромосомы. Условия гибридизации и отмывки для всех проб суммированы в табл. 1. В предварительных экспериментах все. зонды последовательно гибридизовали с одними и теми же фильтрами, на которых были фиксированы образцы ДНК нескольких семей.

Таблица 1

Условия гибридизации и отмывки для зондов семейства Red и зондов

YNH24 и YCMM101

Зонд Гибридизация Отмывка

YNH24 0,5 M NaH2P04, 65°C • O.lxSSC, 65°C

YCMM101 0,f il NaH2P04,' 65°C O.lxSSC, 65°C

Redl 0,5 M NaH2P04, 55°C lxSSC, 550C

Red2 0,5 M NaH2P04, 55°C lxSSC, 55°C

Red4 0,5 M NaH2P04, O.lxSSC,

55°C-62°C 55°C-62°C

Red5 0,5 M NaH2P04, 60°C O.lxSSC, 60°C

Red6 0,5 M Nah2P04, 62°C O.lxSSC, 62°C

Зонды Red5 а йедб выявляли ДНК-профили, состоящие из 8-10 полиморфных полос высокой интенсивности в диапазоне 0,5-10 т.п.о. Наблюдалось довольно. много общих п:лос у неродственных

индивидов. При совмещении двух автографов ДНК-профили, выявляемые этими пробами, полностью совпадали. ДНК-профили, выявляемые зондами Redl, Red2 и Red4, демонстрировали более сложную ялектрофоретическую картину, состоявшую а среднем из 20 высоко полиморфных полос на индивида для каждого зонда. При этом обнаруживалось существенное сходство между фингерпринтами, полученными при гибридизации с каждым из трех зондов. Совпадающими оказалось не менее 80% полос при попарном спавнении. Для некоторых из совпадающих полос отмечались небольшие различия в интенсивности. Кроме того, для ДНК профилей, выявляемых зондом Redl, характерно присутствие двух неполиморфных полос размером 6 и 4 т.п.о.

В то время, как зонды Redl и Red2 обеспечивали получение удовлетворительных фингерпринтов в относительно мягких условиях гибридизации при не очень высоких значениях отношения сигнал/фон, зонд Red4 обеспечивал воспроизводимые результаты в широком диапазоне, температур (табл. 1), выявляя до 30 и более високр полиморфных полос. Наиболее высокое отношение сигнал/фон без потери минорнгх фрагментов получали при температуре отмывки 62°С. Однако, даже при наличии фона на дорожке затруднений в чтении фингерпринта не наблюдалось. Таким образом, только один из предложенных зондов, а именно Red4, отвечал нашим критериям и был отобран для дальнейшей работы. Способность к гибридизации в жестких условиях - уникальное для мультилокусных минисателлитных зондов свойство, гарантирующее высокую воспроизводимость результатов.

Адаптация метода к требованиям генетического мониторинга

Блот-гибридизацяя по Сауэерну является достаточно трудоемким, длительным и дорогостоящим методом. Поэтому, на данном этапе была поставлена задача модифицировать этот метод.

максимально упростив отдельные этапы и опустив все не существенные для качества 9тап<:.

Сравнением различных методов выделения ДНК показано, что замена фенольной экстракции на осаждение белков насыщенным раствором НаС1 позволяет получать достаточно чистые препрЪаты ДНК и не снижает качества фингерпринтов. Применением для электрофореза камеры с размерами геля 27x30 см мы добились увеличения числа одновременно анализируемых образцов до 40, что в 1,5-2 раза больше, чем для стандартных моделей аппаратов для электрофореза; При этом, емкость камеры составляет всего 2,5 л. Близкое расположение электрофоретических дорожек облегчает сравнение полос при семейном анализе. О качестве фингерпринтов, получаемых по упрощенной схеме можно судить по следующей иллюстрации (рис. 2).

о^ао^ао^о р^ао-^-а о^о о^а о^-а о^ао^а

Я— ■*• '

.Ц^тгЩ* ф -

. — я.

---* -.Л.,* •:,<*>

. * г.!* «,•> »

- . , Я»

и «

«I

3 5? ' Т" ч»

* * * . ' в

г -

23И

» ж ■ «И

• ; ... 4,

• * . у*;

•

», 2 'V > ЧИ

г -«•*£:!!::"111 _Г'^'р:*;И" ' *

£.. Т ь ~' " «• »¡Г

Т'«^ 'Я Д • 41 *

„ 4л 1 А , * * • * * *

«г > г,

г -«

а

2. Гкбрвдизация семейных образцов ДНК с зондом Р>£с14.

Определение основных характеристик аингерпринтов. выявляемых зондом !Ы4

Семейный анализ проводили путем сравнения ДНК профилей ребенка и родителей. Совпадающими считали полосы, занимающие одинаковые позиции на радиоавтографе (допустимое различие в положении полос не более 0,5 мм) и различающиеся по интенсивности не более, чем в 2 раза. Наличие полосы в определенной позиции у одного из членов семьи отмечали единицей ("1"), состояние соответствующей позиции ДНК профилей остальных членов семьи принимали значение "1" или "0", в зависимости от наличия или отсутствия полосы. Учет прекращали при достижении участка радиоавтографа, соответствующего длине - фрагмента 3,5 т.п.о. Полученные данные вводили в базу данных и анализировали при помощи компьютерных программ.

На фингерпринтах 82-х отцов выявлено суммарно 1755 полос. Среднее число полос равно 21,40 1 5,92. Индивидуальные колебания 6-37.

У 82-х матерей обнаружено 1776 полос. Среднее число -21,66 1 5,49. Индивидуальные колебания - 7-32.

Как видно из представленных данных, не обнаружено половых различий в числе полос. Следовательно, минисателлитная ДНК мало представлена в X-хромосоме. Среднее число полос в общей выборке поставляет 21,59 ± 5,63.

У 113 детей выявлено 2467 полос. Среднее число - 21,83 + 5,33 Индивидуальные колебания - 8-38.

Сопоставление полос детей с полосами родителей показало, что, в среднем 7,58 ± 2,90 полос ребенка совпадают с полосами отца, 7,61 х 2,60 - с полосами матери, и 6,6413,1 - с полосами и отца и матери, что соотв.тствует предположении о менделевском

кодоминантном типе наследования минисателлнтных аллелей. Основные характеристики фингерпринтов, выявляемых зондом red4, суммированы в табл. 2.

Таблица 2

Основные характеристики фингарпринтов, выявляемых зондом Redl__

Среднее число полос у матери 21.66 (16.92)

Среднее число полос у отца 21.40 (16.76)

Среднее число общ. полос у родителей 7.90 (5.17)

Коэффициент совпадения полос (х) 0.363 (0.299) Среднее число материнских

полос у ребенка 7,61 (6.30) Среднее число отцовских

полос у ребенка 7.58 (6.45)

Число мутантных полос на ребенка 0,177 (0,159)

Частота мутаций /на полосу/на ребенка 0,0081 (0,0094)

В скобках даны значения соответствующих параметров, полученные при изъятии из анализа фрагментов длиной менее 5 т.п.о.

У детей выявлено 20 мутантных полос. Следовательно, частота мутаций (на полосу/на ребенка), равна 0,0081. (20:2467), среднее число мутаций на индивида - 0,177 (20:113). Специфичность метода по отношению к регистрируемым мутантным фрагментам гарантирована воспроизводимостью результатов в повторных: экспериментах. При сравнении ДНК профилей почти 200 независимых клонов клеточной культуры НеЬа обнаруживается полная идентичность сравниваемых ДНК профилей. Это свидетельствует, о прекрасной воспроизводимости и надежности результатов, получаемых при гибридизации с зондом Red4. (рис. 3).

-г!"**"2;

»«««««Я* »»•»»•»«М

Рисунок' 3. Воспроизводимость результатов. Гибридизация Взиг1-гидролиэатов геномной ДНК индивидуальных клонов . клеточной культуры НеЬа с зондом Red4. Полная идентичность ДНК профилей.

Тривиальной причиной наблюдаемого несоответствия ДНК профилей ребенка и его родителей может быть несоответствие паспортного отцовства биологическому. На 30 случаях решения споров об отцовстве с совместным применением зонда Red4 и локусспецифичных минисателлитных маркеров УШ24 и УСММ101 показана высокая информативность зонда Red4 для тестирования отцовства. На основании анализа Red4-фингepпpинтoв нам удалось в партии образцов крови, часть из которых поступила в лабораторию без маркировки, определить принадлежность анонимных образцов определенным семьям (рис. 4). Таким образом метод учета мутаций в ГВР, выявляемых зондом Red4 располагает достаточно надежным

внутренним контролем по отношению к наблюдаемому несоответствию ДНК профиля ребенка и его родителей.

<г ш

•_____

дс

ОтОП-т-

шш ш

г

«1

„ « г.

г*-*. •

Рисунок 4. Эффективность использования полиморфного маркера 1Ы4 для определения семейной принадлежности анонимных образцов ДНК. Семья из 9 сибсов и их родителей использовалась для проведения сегрегационного анализа. Стрелками отмечены мутантные полосы.

Коэффициент совпадения полос рассчитывали на основании сравнения ДБК профилей, родителей по формуле;

X - 2НаЬ/(На + Нь).

где Маь - число полос с одинаковой злектрофоретической подвижностью у индивидов А и В, На - число полос у индивида Д.,

N5 - число полос у индивида Ь. Следует обратить внимание на повышенное значение среднего числа полос общих для обоих родителей, что влечет за собой высокое значение коэффициента совпадения. Это обусловлено резким повышением количества полос на участке радиоавтографа, соответствующего длине фрагментов менее 5 т.п.о. После исключения фрагментов указанной длины из анализа значение коэффициента совпадения уменьшилось до 0,29, но осталось несколько выше ожидаемого. Этот факт, по видимому, можно объяснить тем, что 1/3 выборки составили семьи с аут' сомно-рецессивной патологией, для которой характерно повышенная частота кровного родства между родителями. Подобное явление описанс для популяций с повышенным уровнем инбридинга, и в семьях с рецессивной . патологией (Семина, 1993). Для подтверждения нашей гипотезы значение коэффициента совпадения было рассчитано на основании анализа ДНК профилей 75 пар неродственных индивидов. Результаты анализа представлены в табл. 3 в сравнении с характеристиками известных минисателлитных маркеров 33.6 и 33.15. Именно это значение коэффициента совпадения необходимо применять пра тестировании отцовства и идентификации личности (только для данной рестриктазы и условий электрофореза).

Как видно из табл. 3, основные характеристики зонда Ие(14 и близки к аналогичным характеристикам зондов 33.6и 33.15, широко применяемых в популяционных исследованиях и судебно-медю, ;нской практике.

Для того, чтобы подтвердить независимый характер передачи Кей4 фрагментов (иными словами, отсутствие сцепления между минисателлитными локусами), был проведен сегрегационный анализ в семье состоящей из 9 сибсов и их родителей (рис 4). Из 27 доступных в данной семье анализу фрагментов- обнаружены 2 пары

Таблица 3

Основные характеристики ДНК фингерпринтов выявляемых зондом Ие<14 в сравнении с зондами 33.6 и

33.15

• ЗЗ.б 33.15 ИеЗД*

Среднее число полос, п+(зй)

у отцов 17,91+3,57 16,99+3,41 17,21+3,78»

у матерей 18,22+3,59 17,15+3,28

Среднее число совпадакщих полос, б+СбД)

между матерями и отцами 2,63+1,71 2,37+1,71 2,40+0,81*

Средняя частота совпадения полос, х 0,144 0,137 0,145«

Среднее число мутантных полос 0,098 0,195 0,159

(0,177)

Частота мутаций /на полосу/на ребенка 0,0052 0,0110 0,0094

(0,0081)

«Неродственные индивиды

В скобках даны значения для йесМ, полученные при учете полос до 3,5 т.п.о.

аллельных фрагментов и 2 сцепленных фрагмента. Наблюдаемая частота передачи материнских фрагментов несколько выше, чем отцовских (0,56 и 0,48 соответственно), однако различия не достоверны вследствие малого размера выборки. Средняя частота передачи полосы в данной родословной составляет 0,52, что не противоречит предположению о менделввеком типе наследования. При попарном анализе не обнаружено повышения частоты совместной передачи фрагментов. Наблюдаемое распределение частот совместной передачи или не передачи пар фрагментов ("11" + "00") не отлг тется от теоретически ожидаемого биномиального распределения со средним 4,5.

Представление данные можно суммировать следующим образом: основные характеристики нового минисателлитного маркера Ией4 близки к характеристикам известных минисателлитных маркеров 33.6 и 33.15; большинство локусов, выявляемых на фингерпринте, находятся в гетерозиготном состоянии, представлены только одним гомологом и не сцеплены между собой; характер передачи фрагментов соответствует предположению о менделевском типе наследования.

Определение размеров выборки, необходимой для регистрации двукратного и 50%-го повышения частоты мутаций

Исходя из приведенных данных можно рассчитать объем выборок, необходимый для оценки повышения частоты мутаций. Расчеты гоказали, что для регистрации двукратного повышения V стоты мутаций необходима выборка не менее 113 индивидов (и их родителей) в каждой из сравниваемых групп, а для 50%-го повышения - не менее 304 индивидов. Такая работа может быть выполнена двумя исследователями и двумя техническими помощниками в течение одного года, т.е. это вполне приемлемый объем работы для лаборатории. При со лестном. использование других зондов

RESTRICTION (Рестрикция)

Н рестрикции N образца

MAIHJLIST (основной список)

дата поступления

N образца*

N семьи

фамилия

имя

пол

отношение родства

в. пункт <-

конц. ДНК

¡ССОИ) (условия рестрикции)

номер рестрикции« дата рестрикции рестриктаза количество ДНК нагрузка ферментом заданный объем реакции

<

RSTR_ENZ (Рестриктазы)

рестриктаза» тип буфера

температура инкубации активность

TWN (и. пункты)

н. пункт»

FILTER (порядок расположения образцов на фильтре)

—>

*—

H фильтра* < H дорожки H образца

FAM_LIST (финтерпринты)

H фильтра* номер семьи* н. пункт

Вектора [10,7] Двумерный массив

образцы [12] Одномерный N образца массив Число полос

FILTERS (условия

злектрофореза)

К'фильтра* дата электрофореза концентрация агарозы Время разгонки Тип буфера длина геля

-<

ДНК профиль [50] вложенный полоса массив

положение

Т

Рисунок 5. Упрощенная структура базы данных •Ключевые поля

Стрелками обозначены связи между файлами В квадратных скобках указана размерность массивов

(например, 33.6 и ЗЗЛ5) среднее число зарегистрированных мутация увг точится минимум в 2 раза и численность выборки можно сократить.

Использование программного обеспечения

Эпидемиологические исследования, подобные мониторингу мутаций, предполагают работу с большими объемами информации, что требует использование компьютерных баз данных (БД) и программ управления БД для хранения и обработки экспериментальных данных. В соответствии с требованиями настоящего исследования в среде СУБД "Clarion" была разработана база данных, структура, которой представлена на рис. 5. Программа-оболочка позволяет работать с базой данных л диалоговом режиме посредством системы меню и используется не только на этапе окончательного анализа данных но и для рутинных расчетов, например, расчета компонентов реакционной смеси для рестрикции большого количества образцов или при тестировании отцовства. Кроме того был написан пакет программ, использующих информацию непосредственно из БД для статистической обработки данных, для сегрегационного анализа и для подготовки данных к использованию в статистических программах.

ВЫВОДЫ

1.Предложен метод регистрации мутаций в ГВР на основе блот-гибридизации по Саузерну с новым ышисателлитным зондом Red4, в ■ этором все основные этапы экспериментов максимально упрощены без ущерба для качества результатов. Уникальная для миннсагеллитных маркеров воспроизводимость результатов гибридизации в повторных экспериментах сводит к минимуму вероятность ложно положительных результатов при регистрации мутаций de novo.

2.Адекватными методами определены основные характеристики мультилокусного полиморфного маркера 11е(14: » не обнаружено различий в среднем числе полос, выявляемых зондом Ие<14, у мужчин (21,40) и женщин (21,66); * среднее число полос на индивида составляет 21,59 в диапазоне длин фрагментов до 3,5 т.п о. и 17,21 в диапазоне до 5 т.п.о.; » частота совпадения полос в ДНК профилях двух неродственных индивидов в диапазоне от 20 до 5 т.п.о. составляет 0,145; * частота мутий на полосу/на ребенка для локусов, выявляемых зондом Ие14й составляет 0,081; * среднее число мутантных полос на индивида составило 0,177; *. показан менделевский кодоминантный характер передачи Ией4 фрагментов (большинство локусов йей4 находятся в гетерозиготном состоянии, представлены на фингерпринте единственным гбмологом и передаются независимо друг от друга); • основные характеристики данного маркера сходны с характеристиками известных маркеров 33.6 и 33.15.

3. Показана эффективность использования зонда йей4 для идентификации биологического отцовства, что обеспечивает предложенный метод учета мутаций надежным внутренним контролем.

4.Определены размеры выборок, необходимые для надежной регистрации различий мутационных частот в ГВР и затраты рабочего времени для выполнения этой работы. При двукратном повышении частоты мутаций выборки для каждой группы должны составлять не менее 113 человек (и их родителей),, а для 50%-ного повышения -304 индивида (и их родителей). Работа по выявлению 50%-го повышения частоты мутаций может быть завершена двумя исследователями и двумя лаборантами в течение 1 года.

5.Разработана программа базы данных с использованием Несовместимого ПК АТ 286/287, применяемая на всех этапах эксперимента, включая ввод первичной информации, рутинные

расчеты параметров вкспериментов, хранение результатов промежуточных экспериментов, обработку и хранение окончательных результатов.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бочков Н.П., Рогаев Е.И., Поляка O.K., Иленский А.Б., Асанов А.Ю. Выявление гаметических мутаций в гипервариабельных районах ДНК человека с целью генетического мониторинга. • // Доклады Академии наук. 1993, Т. 329, N 6, С. 785-786

2. Бочков Н.П., Моляка D.K., 1'ошков Е.А. Разработка подхода по анализу гипервариабельных районов ДНК для оценки возникновения мутаций у человека. // IV конференция " Геном человека-94" март, 1994 г., С. 11

пода К ПЕЧАТЯМ 4.9k Л •• —: 1ДКА9 б 7 ТИРАЖ too жз.

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ ВОНЦ АМН СССР