Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка метода определения активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов как показателя адренергической регуляции в организме

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка метода определения активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов как показателя адренергической регуляции в организме"

На правах рукописи

Хундерякова Наталья Васильевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ЛИМФОЦИТОВ КАК ПОКАЗАТЕЛЯ АДРЕНЕРГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ В ОРГАНИЗМЕ

03 00 02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ163391

Пущино - 2007

003163391

Работа выполнена в лаборатории « Энергетики биологических процессов» Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г Пущино)

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Заслуженный деятель науки РФ доктор биологических наук, профессор Мария Николаевна Кондрашова (ИТЭБ РАН, г Пущино)

доктор биологических наук, профессор Галина Дмитриевна Миронова (ИТЭБ РАН, г. Пущино)

доктор медицинских наук, профессор Владимир Сергеевич Сухоруков ФГУ «Московкий НИИ педиатрии и детской хирургии Росмедтехнологий» г. Москва

Ведущая организация.

ГУНЙИ фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН г Томска

Защита состоится "2?" Яи уЧ^Ц 2008 г в__часов на заседании Совета

Д 002 093 01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская обл, г Пущино, ул Институтская, д 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Автореферат разослан "2^" ^[¿{/АЬ^А 2007 г Ученый секретарь

Совета, к ф -м н Н. Ф Панина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Окисление сукцинатдегидрогеназой (СДГ) янтарной кислоты (ЯНТ) в митохондриях является наиболее мощным процессом энергообеспечения Предшествующими работами М Н Кондрашовой и сотрудников, показано, что этот процесс является основным при больших энергетических запросах - работе, стрессе, заболеваниях [Кондрашова М Н. с соавт 1973, 1976, 1982, 1988, 1991) Кроме того, установлено, что ЯНТ в микромолярных концентрациях проявляет регуляторное, "сигнальное" действие, стимулируя выделение адреналина/норадреналина [Maevsky, EI, etal,1982, 2003], которые в свою очередь активируют СДГ и окисление ЯНТ [Kondrashova, М N, etal, 2002, 2003] По - видимому это действие реализуется через специфические рецепторы из группы орфановых (orphan receptors) [Не W et al, 2004] Взаимосвязь окисления ЯНТ и ее сигнального действия с катехоламинами было выделено как новая физиологическая система регуляции - субстратно - гормональная [Kondrashova, М N, et al, 2002, 2005; Maevsky, EI, et al, 2006] Поэтому определение активности СДГ может служить показателем уровня адренэргической регуляции в организме

Исследования механизмов связи физиологических состояний и митохондриальных процессов сформировали новые научные направления - Митохондриальная физиология, Митохондриальные болезни, Митохондриальная медицина Эти области нуждаются во введении специальных стандартных показателей В клинических исследованиях цитохимическое определение активности СДГ в лимфоцитах на мазке крови по восстановлению тетразолиевых красителей является информативным первоочередным уже зарекомендовавшим себя показателем метаболизма в организме [Нарциссов РП, 1969, Зарецкая Ю.М 1983, Петричук СВ, 2005, Поборский 2005] Клиническая цитохимия рассматривает клетку как самостоятельный орган со всеми свойствами целого организма, что в полной мере относится к лимфоцитам периферической крови Лимфоциты рассматриваются не только как клетки специальной иммунной защиты, но и как элементы единой информационной системы, отражающей состояние организма и процесс его развития Биохимические методы определения СДГ не применяются по причине невозможности широкого взятия тканей для выделения митохондрий Но они имеют и другой очевидный, но привычный и потому не учитываемый недостаток Он состоит в нарушении важнейшего с точки зрения биофизики свойства живых тканей - их структурной и ультраструктурной организации в частности, и митохондрий в клетке при их выделении При этом разрушается паракристаллический комплекс ферментов матрикса - метаболой и теряются физические механизмы

регуляции ферментов [вгеге Р А 1985, 1987, РаЫегй Ь А, 1988; ЛюбаревАЕ 1987, 1989] Недостаточно оцененным преимуществом цитохимического метода является сохранение структурной нативной организации в мазке Его можно рассматривать как иммобилизацию ферментов на подложке в клеточной среде, которая стабилизирует даже выделенные ферменты на длительное время [Вудворд Дж, 1988]

Однако применяемый состав и концентрации реактивов для этого давно разработанного метода не соответствуют современным биохимическим условиям работы с митохондриями Наиболее известным способом определения СДГ является цитохимический метод Нахлас рЧасЫав е! а1, 1957] и различные его модификации [Нарциссов Р П 1969, Петричук СВ, 2005, 0иа§1шо, Б, 1960, Пирс Э,1962, Зарецкая ЮМ 1983] На основании вышеописанного, был разработан новый цитобиохимический метод определения СДГ в лимфоцитах крови (СДГЛФ), сочетающий преимущества биохимического и цитохимического методов и исключающий их недостатки Данное изобретение значительно повышает чувствительность измерения активности СДГ вне организма, в лимфоцитах к изменениям состояния в организме, обусловленным адренэргической регуляцией Это осуществляется путем приближения состава сред к биохимическим условиям При этом необходимо использовать весь комплекс разработанных изменений состава сред, поскольку частичная замена мало эффективна Кроме того, были введены дополнительные определения окисления и действия ЯНТ в митохондриях На основании этих определений предложен более правильный способ расчета физиологической активности СДГЛФ, который сильнее коррелирует с адренэргической регуляцией Предложенные измерения впервые характеризуют действие ЯНТ в митохондриях не по одному показателю, а по специфическому паттерну (узору) характеристик Установлено, что существуют несколько типов паттернов у здоровых животных или людей Они служат чувствительной индивидуальной характеристикой При усилении действия адреналина в организме наблюдается возрастание амплитуды изменений паттернов с прохождением четко выявляемых стадий активации, гиперактивации, ингибирования Для реализации разработанного метода создан стандартный набор сухих реактивов высокой чистоты, позволяющий унифицировать измерения в разных лабораториях

Метод использует традиционную для Института Биофизики современную компьютеризованную видеомикроскопию, что обеспечивает автоматизацию обработки изображений объективность измерения, необходимый для статистической репрезентативности объем выборки

Цель работы Разработка метода определения активности СДГ в лимфоцитах более чувствительного, чем традиционные цитохимические

методы, к уровню адренэргической регуляции в организме, благодаря максимально возможному сохранению структурной организации митохондрий и иммобилизованной СДГЛФ в измеряемом препарате Использование разработанного метода для исследования проблемы участия ЯНТ в энергообеспечении при разных физиологических и патологических состояниях крысы и человека и рекомендации средств оптимизирующих функционирование этого центрального механизма энергообеспечения

Задачи исследования:

1 Разработать оптимальные условия состава среды инкубации (величину pH, влияние ЭДТА, ИЗЛ, набор дополнительных показателей восстановления HCT) для выявления функциональной активности СДГЛФ

2 Измерить активность СДГЛФ в разработанных условиях при разной степени выраженности адренергической регуляции у крыс (гиперактивные новорожденные крысята, сравнительно с показателями взрослых животных интактных - в покое и при активации адреналином)

3 Определить для группы здоровых добровольцев цитобиохимические показатели взаимодействия ЯНТ с митохондриями

4. Определить у пациентов (с пищевой аллергией и гипертонией) цитобиохимические показатели взаимодействия ЯНТ с митохондриями и сопоставить с их функциональным состоянием организма

5 Участвовать в создании набора реактивов для стандартизации результатов, получаемых в разных лабораториях при определении активности СДГЛФ и других характеристик действия ЯНТ в митохондриях и в патентовании разработанного способа

Научная новизна работы. Мы повысили информативность существующих, ставших традиционными цитохимических методов определения активности СДГЛФ за счет разработки среды, приближенной к внутриклеточной, проведения дополнительных измерений комплекса нескольких показателей восстановления HCT, определяющих не только активность, но и функциональное состояние СДГ по специфическому паттерну - узору характеристик, и введением нового способа расчета, более точно определяющего активность СДГ ("Истинная" активность)

Благодаря этому выявили несколько уровней функциональной активности СДГЛФ, при разных состояниях организма.

Впервые у новорожденных крысят выявили гиперактивацию СДГЛФ, по сравнению с взрослыми животными в покое и при физиологической активации адреналином

Впервые в группе здоровых обследуемых выявлены четыре типа цитобиохимических паттернов взаимодействия ЯНТ с митохондриями, свидетельствующих о разном функциональном состоянии СДГЛФ, включая неизвестное ранее латентное состояние

Впервые у пациентов с пищевой аллергией и гипертонией обнаружены четыре типа цитобиохимических паттернов,

свидетельствующих о разном функциональном состоянии СДГ, отличающихся от здоровых утратой латентного состояния, увеличением амплитуды показателей и активирующим действием ИЗЛ.

Величина амплитуды прогрессивно нарастает при развитии активации и патологии (это явление названо метаболическая гипертрофия) и может служить более чувствительным показателем выявления, развития и эффективности лечения гипертонии, чем просто измерение артериального давления

Научно-практическая значимость. 1 Разработанный метод соответствует запросам новых областей медицины- «Митохондриальных болезней» и «Митохондриальной медицины», учитывающих ведущую роль первичных и вторичных повреждений митохондрий в развитии и лечении заболеваний Он является прямым показателем активности наиболее мощного процесса энергообеспечения в митохондриях -окисления ЯНТ и может служить для диагностики и контроля лечения

2 Как другие функциональные показатели, этот метод должен быть стандартизован Учитывая высокую чувствительность цитохимического определения к качеству реактивов, для получения стандартных результатов с нашим участием разработан и запатентован стандартный набор реактивов биохимической квалификации

3 На основании определения уровня реактивности организма с помощью описанного метода возможно подбирать индивидуальную дозу лекарств и сочетать лекарства с природными регуляторами активности СДГ В частности, на основании наших результатов представляется перспективным использование ИЗЛ, как метаболита, выраженно нормализующего начальные патологические сдвиги - гиперактивацию СДГ, а также и более глубокие - активировать ингибированную СДГ

Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы доложены на II международной научно - практической конференции «Медбиотек Перспективы развития биотехнологии в России», (Пущино

2005), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино 2005, 2007), на 10-й международной школе -конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино

2006), I Всероссийская научно-практическая конференция "Теория и практика использования новой техники и новых технологий в здравоохранении", (Сочи, 2006), 14th European Bioenergetics Conference, EBEC, (Moscow, 2006), Симпозиуме «Регуляторы энергетического обмена» (Томск, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 статьи

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д б н проф М Н Кондрашовой за предложенную тему и руководство работой, неоценимую профессиональную помощь и всестороннюю поддержку; д б н проф Г Д Мироновой за советы при написании диссертации, дмн проф ЕИ Маевскому за помощь при статистической обработке результатов и важные замечания при обсуждении результатов экспериментов, особую благодарность не MB Захарченко и А В Захарченко которые непосредственно принимали участие в выполнении настоящих исследований

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, основных выводов работы, списка литературы Диссертация изложена на страницах

машинописного текста, содержит рисунков и таблиц Список литературы включает_наименований

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили крысы - самцы линии «Вистар>> весом 180 - 200 г., интактные и при введении физиологической стимулирующей дозы адреналина 25мкг/100г введенной за 30 мин до декапитащш, новорожденные крысята трех или четырехдневные разведения вивария ИТЭБ РАН У животных кровь забирали при декапитации

Были исследованы цитобиохимические показатели восстановления НСТ при определении активности СДГЛФ в группе здоровых добровольцев (п = 20) (аспиранты, научные сотрудники ИТЭБ РАН) возраста от 23 до 45 лет

Исследована группа пациентов с аллергическими реакциями на пищевые продукты в некоторых случаях с сопутствующей гипертонией, состоящие на учете в аллергологической клинике доктора Волкова (ООО «Эколабмедтест») Было обследовано 9 пациентов из них 3 мужчин и 6 женщин, возраст от 34 до 71 года, все работоспособны На момент обследования пациенты от 3 до 12 месяцев придерживались индивидуально подобранной диеты, не содержащей аллергенных для них продуктов. Перед взятием крови у всех пациентов измеряли артериальное давление (АД) и пульс

Забор крови у людей. Кровь для анализа забирали утром с 8 до 11 часов, натощак из пальца или вены вакуумным способом Из этой крови делали тонкие мазки на предметных обезжиренных стеклах для последующего определения активности СДГ Следует отметить, что качественные мазки можно получить только на чистых обезжиренных предметных стеклах Мы в своей работе использовали одноразовые

стекла фирмы 'Menzel - Glaser" (Germany).

Создание разных состояний животного и эвтаназия. Были исследованы крысы в разном физиологическом состоянии 1) интактные в состоянии физиологического покоя, 2) после внутрибрюшинного введения физиологической стимулирующей дозы адреналина (25мкг/100г веса за 30 мин до декапитации), 3) после введения стрессовой дозы адреналина (50мкг/100г веса внутрибрюшинно за 30 мин до декапитации), 4) после иммобилизационного стресса разной продолжительности (30 мин, 3 часа, 6 часов), 5) новорожденные крысята трех и четырехдневные Эвтаназию проводили после засыпания в камере, заполненной С02 без возбуждения животного, что также существенно для более полного сохранения состояния покоя интактных животных Герметичную камеру полностью заполняли СОг только после этого помещали в нее животных Через 20-30 сек у животных происходила остановка дыхания, однако работа сердца продолжалась, тогда крысу быстро извлекали из камеры и декапитировали

Обработка мазков крови и проведение реакции восстановления нитросинего тетразолия (HCT)

Фиксация. Свежеприготовленные тонкие мазки крови фиксировали в течение 30 сек 60% ацетоном (ОСЧ 9-5, Химмед Москва), забуференным 10 мМ HEPES, при комнатной температуре, pH 5,2 - 5,4 Затем ополаскивали дистиллированной водой и высушивали на воздухе при комнатной температуре Раствор может многократно использоваться в течение 1 месяца Следует хранить фиксирующий раствор в склянке с притертой стеклянной крышкой, при комнатной температуре, без попадания яркого света

Восстановление HCT. Реакцию восстановления проводили в цитобиохимической среде с разными добавками при инкубации в течение 1 часа при 37°С, pH - 7,2 ± 0,05 Основная среда инкубации состоит из KCl, осч (Реахим, Донецк) 125 мМ, HEPES (Sigma) 10 мМ, Нитросиний тетразолий хлорид (Dudley Chemical Corporation) - 1,22 мМ Добавки к основной среде ингибитор СДГ малоновая кислота (МАЛ) (Sigma) 5мМ, янтарная кислота (ЯНТ) (Sigma) 5 мМ, ЯНТ 5 мкМ,

ЯНТ 5 мМ и изолимонная кислота (ИЗЛ) (монокалиевая соль, осч, ИБФМ РАН, Пущино) 5мМ После инкубации мазки промывали дистиллированной водой, докрашивали ядра нейтральным красным 0,5% (чда) в течение 6-8 мин, снова промывали дистиллированной водой Микроскопирование. Мазки после развития окраски HCT микроскопировали под масляной иммерсией на микроскопе Микмед-2 («Ломо», Россия), при увеличении 6,3 х 100/1,30, соединенном с видеокамерой MINTRON CCD MTV-1 802 СВ («Кандела», Россия) В каждом мазке крови выбирали 30 лимфоцитов и полученные фотографии клеток подвергали количественному морфометрическому анализу с помощью программы Image Tool, версия 2 (The University of Texas Health

Science Center m San Antonio, США) В качестве характеристики активности фермента в клетках автоматически определяли площадь продукта реакции - формазана, интенсивность которой превышала по оптической плотности определенный пороговый уровень В градациях уровня плотности серого цвета от 0 (черный цвет) до 255 (белый цвет) этот уровень принимался равным 150 При желании выделить области (гранулы) большей интенсивности уровень сравнения может быть приближен к черному цвету, например 130 Далее для каждого мазка получали среднее значение площади окраски делением общей площади всех окрашенных объектов на их количество

Статистика. Каждая величина активности СДГ лимфоцитов является средним значением площади сканирования множества окрашенных участков, содержащихся в 30 лимфоцитах При высокой активности СДГ число окрашенных объектов N приближается к 2000 и соответственно возрастает площадь окраски При наиболее низкой - уменьшаются величина N порядка 150 объектов и площадь окраски формазана Поэтому каждое значение СДГ лимфоцитов является статистически значимым при объеме выборки N>150

Результаты исследования групп животных и пациентов представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента /-Test с использованием программы Microsoft Office Excel 2003. Однако для метода позволяющего выявить различие форм паттернов были использованы также непараметрические критерии знаков отклонений и критерий U-Вилкоксона - Манна - Уитни, как более адекватные способы оценки [ГублерЕВ 1978]

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Принцип подбора условий для цитобиохимических исследований. Подбор состава сред проведен с целью повышения чувствительности измеряемой активности СДГ к изменениям состояния организма на основе принципа, отличающегося от всех предыдущих цитохимических исследований Обычно при подборе состава сред исследователи выбирают условия максимальной окраски контрольного показателя, отрабатываемого на животном или человеке в нормальном состоянии

Использованный нами принцип состоит в подборе состава растворов, обеспечивающих минимальное значение окраски у спокойного животного Это достигает цели получения максимальной разницы показателей между спокойным и возбужденным организмом. У спокойного животного повышение окраски свидетельствует об активации СДГ, что обусловлено активирующим - "возбуждающим" действием компонентов раствора Такая активация - возбуждение клеток в мазке компонентами раствора - уменьшает или полностью уничтожает

наблюдение активации, реализующейся в организме Этот критерий мы называем функциональной чувствительностью Проведенное исследование впервые обосновывает такой принцип подбора состава растворов. Разработанная среда способствует максимально возможному сохранению состояния покоя в организме - in vivo, в клетках на мазке - ех vivo Мы проводим подбор состава сред не только на спокойном животном, но и на животном, возбужденном введением активирующей дозы адреналина или стрессом Критерием правильности подбора условий является выявление максимальной разницы показателей при разных физиологических состояниях, а не максимального окрашивания у спокойного животного Поскольку предлагаемый способ основан на использовании современных биохимических данных для усовершенствования стандартного цитохимического метода, он назван цитобиохимическим

Различие состава инкубационных сред растворов по цитохимическим аналогам и по разработанному цитобиохимическому способу Предыдущими исследованиями нашей группы, были подобраны оптимальные физиологические условия среды инкубации, приближенные к внутриклеточным, для определения активности СДГЛФ

Применявшийся в цитохимии янтарнокислый натрий (ХЧ) в широком диапазоне концентраций от 2,5 до 100 мМ в разработанной нами среде, был заменен на 5мМ янтарной кислоты (ОСЧ) субстратной концентрации наиболее чувствительной к физиологическому состоянию организма

Во всех без исключения цитохимических методах определения дегидрогеназ вносится огромное количество фосфата и натрия от 50 мМ до 150 мМ совершенно не нужное для протекания изучаемого процесса, а только в качестве буфера Даже 1 мМ фосфата вызывает значительное набухание (возбуждение) выделенных митохондрий Однако в опытах на выделенных митохондриях по изучению основного энергетического процесса фосфорилирования нельзя обойтись без добавления 1-3-5 мМ фосфата В данном случае, фосфат не нужен для протекания изучаемой реакции и поэтому был заменен КС1 и буфером HEPES

Дополнительным отличием нашей процедуры от аналогов является использование в качестве основного красителя - акцептора электронов нитросинего тетразолия хлорида - (НСТ) В аналоге применяется пара-нитрофиолетовый тетразолий (пНФТ) ввиду того, что он образует более четкие гранулы, которые удобно считать визуально НСТ, однако, используется в большинстве других аналогов ввиду большей чувствительности и стойкости окраски Кроме того, НСТ и пНФТ как показано в работе [Altman, FP, 1976] восстанавливаются на разных участках дыхательной цепи митохондрий, НФТ - на участке цитохром С - цитохромоксидаза, а НСТ - на участке флавинзависимых дегидрогеназ, таким образом он является более специфичным для СДГ

Изучение влияния рН в интервале величин 7,2 и 7,4 на активность СДГЛФ в разных физиологических состояниях у крыс.

Было проведено исследование влияния изменения рН в интервале величин 7,2 и 7,4 на активность СДГЛФ при разных физиологических состояниях у крыс Начиная с исходных работ Нахласа и Пирса, и продолжая отечественными работами по цитохимическому определению активности СДГ, приводятся величины рН в диапазоне от 7,2 до 7,6 без комментариев о возможном влиянии изменения этого показателя на результат измерения У нас в лаборатории этому вопросу на протяжении длительного времени уделялось внимание Ответ на него искали в работах не только на интактных животных, но и при действии адреналина Были получены раннее данные А Бабского и Н И Федотчевой по дыханию митохондрий, что эффект действия адреналина лучше выявляется при рН 7,2 чем при величине 7,4 Выбор более щелочных значений может мотивироваться тем, что рН крови составляет 7,4 Однако для митохондрий и клеток повышение рН от 7,2 до 7,4 активирует дыхание митохондрий, подобно адреналину Ответ на адреналин обусловлен выбросом ионов кальция Щелочной сдвиг рН как раз в области 7,2 - 7,4 приводит к выбросу АТФ из клетки, который стимулирует выброс С а2* из ретикулума [Баумуратов АС и др , 2004].По данным работ, приведенных Скулачевым В П, этот же щелочной сдвиг рН активирует синтез ДНК от нуля до максимума [Скулачев В П. 1989, РоиуБве^ I, е1 а1. 1985, 1984, Оги^ет Я , е1 а1, 1985, НеякеЛ ТII, е! а1., 1985]

В наших опытах на лимфоцитах мы нашли такую же зависимость, рН 7,4 снимает активацию адреналином, которая четко видна при рН 7,2 Проведено измерение СДГ на животных в состоянии покоя, активации иммобилизационным стрессом 30 мин, 3 часа, 6 часов сразу после стрессового воздействия или через сутки На рис 1 данные расположены слева направо в порядке возрастания активности СДГ от 0,38 до 1,94 Видно, что рН 7,4 активирует самую низкую ингибированную активность, мало влияет на невысокую активность в покое и прогрессивно значительно снижает наблюдаемую на мазке величину активности у возбужденных животных, у которых СДГ активирована в организме Эти данные показывают, что, казалось бы "небольшой" щелочной сдвиг на 0,2, которому не придается особого значения в принятых цитохимических методах, сильно меняет результаты и мешает полноценному выявлению активированных состояний СДГ в организме Именно поэтому предлагается использовать для повышения функциональной чувствительности рН 7,2 ± 0,05, при котором окраска в норме меньше, а разница между спокойным и возбужденным адреналином животным больше

Рис. 1 Влияние рН 7,2 и 7,4, среды инкубации на активность СДГ лимфоцитов. Физиологические состояния животных: 1) 6 час. стресс, 2) 3 час стресс, 3) контроль 4) 3 часа стресс 5) контроль 6) 30 мин. стресс

Влияние 1мМ ЭДТА в среде инкубации и в среде фиксации на определение активности СДГ.

Другим фактором уменьшающим и даже снимающим эффект адреналина в условиях эксперимента является внесение хелаторов кальция ЭДТА или ЭГТА. Следует отметить , что хелаторы Са2+ в виде трилона Б (EDTA-2Na) в количестве 170 мМ входит в принятые условия цитохимического метода (Нарциссов, Р.П. 1969), он используется и в среде инкубации и в фиксирующем растворе. Однако по нашим данным применение ЭДТА в биохимических исследованиях препятствует наблюдению опосредуемой ионами Са2+ активации окисления ЯНТ адреналином на митохондриях. Предшествующими работами в нашей лаборатории Н.И. Федотчевой на гомогенате печени крыс было показано, что добавление в среду инкубации 50 - 100 мкМ ЭГТА снижало активирующее действие адреналина на функции митохондрий. Поэтому мы провели исследование влияния содержание ЭДТА в среде инкубации на результаты измерения активности СДГЛФ.

В нашем эксперименте добавка 1 мМ ЭДТА в среду инкубации с 5мМ ЯНТ приводила к такому же эффекту, повышению активности СДГЛФ у контрольных и уменьшению у опытных (рис.2). Из рис.2 видно, что самое низкое значение СДГ контрольного животного при добавлении ЭДТА повышается примерно на 20%, а самое высокое значение СДГ при активации адреналином на 50% и 30%. Снижение усиливается при использовании высокой дозы адреналина, которая вызывает переход от активации СДГ к ее ингибированию. Степень действия ЭДТА усиливается при более сильном повышении активности СДГ, при активации адреналином.

Таким образом, влияние ЭДТА в среде инкубации на измеряемую величину активности СДГ, подобно щелочному сдвигу pH. ЭДТА активирует показатель для спокойного животного и снижает величину активации адреналином. Внесение ЭДТА в ацетон во время 30 -

секундной фиксации влияет значительно меньше, чем его внесение в среду инкубации, где проводится окрашивание в течение часа (данные не приведены). Однако, направленность влияния аналогична таковой при добавлении ЭДТА в среду инкубации. Таким образом, при проведении измерения активности СДГ в среде инкубации и фиксации лучше исключить ЭДТА, чтобы не менять физиологическую концентрацию кальция, которая опосредует действие адреналина.

Рис.2 Влияние добавки 1мМ ЭДТА в среде инкубации на активность СДГ лимфоцитов крыс.

адреналин 50мкг/100г

Выявление физиологической модуляции СДГЛФ при внесении регуляторов на примере изолимонной кислоты (ИЗЛ).

Для того, чтобы определить является ли данная активность СДГ нормой для данного организма или для него это сниженная или повышенная активность, мы ввели дополнительную пробу с модулятором 5мМ ЯНТ + 5мМ ИЗЛ. Было показано, что ИЗЛ мало влияет на СДГ организмов в состоянии нормы, однако повышает активность в

В наших исследованиях выявлена новая сторона регуляторного действия ИЗЛ — она может не только повышать ингибированное состояние, но и снимать гиперактивацию, приближая ее к норме. Мы исследовали более широкий набор состояний, чем ранее. Были

представлены состояния выраженной активации адреналином при введении физиологической стимулирующей дозы, тоже при усилении активирующего действия лазером, и при 30 мин иммобилизационном стрессе В наших условиях при добавлении только ЯНТ наблюдали значительную активацию СДГ Видно, что добавка ИЗЛ не влияет на активность СДГ интактного животного №1 Введение адреналина активирует СДГ в три - пять раз №2, 3, 4, что близко к активации адреналином физиологических функций и дыхания митохондрий Добавление ИЗЛ устраняет эту гиперактивацию, возвращая активность СДГ в область нормы Еще более грубое воздействие ЗОмин стресса, приводящее к гиперактивации СДГ, также снимается добавкой ИЗЛ В системе 6 часового стресса, в фазу угнетения у животного ингибированная СДГ активируется добавкой ИЗЛ Таким образом, видно, что снижение гиперактивации ИЗЛ имеет более сильный регуляторный эффект, чем снятие ингибирования Причина гиперактивации, как и причина ингибирования активности СДГ - одна и та же - ослабление энергетического контроля скорости дыхания в митохондриях Гиперактивация - начальная стадия возбуждения ткани Она является следствием ослабления энергетического контроля дыхания высоким потенциалом и АТФ Расход АТФ на функционирование включает и активацию дыхания Однако, гиперактивация опасна развитием патологических процессов Именно поэтому многие регуляторы гиперэргических состояний, в частности лекарства от гипертонии содержат блокаторы адреналина (адренорецепторов) Таким образом, ИЗЛ оказывает действие подобное гипотензивным препаратам регуляторам гиперэргических состояний ИЗЛ обеспечивает энергонезависимый «легкий» приток электронов и протонов в дыхательную цепь, доступный и при значительном расходе энергии при сильном воздействии Это поддерживает уровень энергизации MX и предупреждает развитие как начальной деэнергизации, проявляющейся гиперактивацией, так и более глубокой деэнергизации, приводящей к ингибированию СДГ При гиперактивированной адреналином СДГ дыхательной цепи дополнительное восстановление ИЗЛ приводит к торможению поступления протонов и электронов от СДГ к акцептору коэнзиму Q Это снижение радикально отличается от игибирования ее ЩУК и объясняется переходом фермента в нативную конформацию Таким образом, применение ИЗЛ позволяет выявить два противоположных отклонения (гиперактивацию и ингибирование) состояния СДГ от уровня покоя Несмотря на кажущуюся противоположность двух обнаруженных эффектов ИЗЛ в двух состояниях их механизм един

Как отмечено на всех трех примерах влияния щелочного сдвига pH в интервале от 7,2 до 7,4, наличия ЭДТА и ИЗЛ видно, что эти воздействия включают механизмы активации кальциевого сигнала Это приводит для

СДГЛФ контрольного животного к активации, а возбужденного животного к ингибированию Таким образом, подбор условий эксперимента, позволяющих максимально сохранить состояние фермента в организме, дает возможность еще чувствительнее выявить ex vivo цитобиохимическими измерениями физиологическую модуляцию активности СДГЛФ m vivo и увеличить информативность метода

Значение проб, выявляющих функциональную активность СДГЛФ. Расчет уровня эндогенной ЯНТ, истинной активное! и СДГ.

Для более полной характеристики состояния функциональной активности СДГ в организме мы проводили комплексное определение включающее несколько проб, перечисленных ниже в том порядке, как мы их приводим на паттернах Восстановление НСТ 1 За счет окисления эндогенных субстратов (ЭС) 2 В присутствии 5мМ малоната -ингибитора СДГ (МАЛ) 3 В присутствии 5мМ ЯНТ (СДГ) 4 В присутствии 5мМ ЯНТ и 5мМ ИЗЛ (ИЗЛ)

Проба 3 В присутствии 5мМ ЯНТ (общая активность СДГ) В цитохимии активность СДГ определяется как восстановление НСТ в пробе с добавлением субстратных мМ количеств ЯНТ, в нашем случае 5 мМ Однако при этом не учитывается восстановление НСТ за счет других процессов, в частности, окисления НСТ всеми НАД-ЗС субстратами В биохимических исследованиях проводится определение вклада разных процессов применением специфических ингибиторов и учет этих величин при расчете С этой целью мы использовали пробы 1 и 2 Пробы 1 и 2 За счет окисления ЭС и в присутсгвии 5мМ малоната. Эти показатели необходимы для повышения точности измерения величины активности СДГ и определения вклада эндогенной ЯНТ (ЭЯНТ) Более точным показателем активности СДГ является разность между восстановлением в пробе с 5мМ ЯНТ (проба 3) и на ЭС (проба 1) Эта разность вычленяет прибавку восстановления за счет именно ЯНТ, добавленной в пробу Для еще более точного определения активности СДГЛФ, мы применяем измерение в присутствии 5мМ МАЛ (проба 2) [Кондрашова МН, с соавт 1977] Добавление 5мМ МАЛ исключает основную часть восстановления за счет ЭЯНТ Это выражается в уменьшении восстановления НСТ в пробе 2 по сравнению с пробой 1 Таким образом, часть восстановления в пробе 1 обусловлена окислением ЭЯНТ и только остаток определяется другими НАД-ЗС процессами Поэтому для более точного определения окисляющей ЯНТ мы вычитаем из показателя общего восстановления с 5мМ ЯНТ (проба 3) именно этот остаток с 5мМ МАЛ (проба 2) Принятое определение активности СДГ по общему восстановлению мы называем «общей» активностью, а более точное и близкое к физиологическому с вычетом вклада других процессов - "истинной активностью" Соотношение вклада окисления ЯНТ и других процессов меняется при разных состояниях организма и

является дополнительной информативной характеристикой Мы обнаружили в ряде случаев, что 5мМ МАЛ не снижает, а повышает окраску при низкой активности СДГ Такое повышение может указывать на образование супероксида [Квепгепко М, е1 а1, 1984 , Бетт О V ег а1, 2001, КагакоГ 1£Е Ы а!, 2006] Если показатели с МАЛ хотя бы несколько ниже пробы с ЭС, это свидетельствует о большей активности адренэргической регуляции, стимулирующей окисление ЯНТ Даже небольшая тенденция к повышению восстановления в пробе с МАЛ указывает на ослабление адренэргической активации Поэтому показателю мы выделяем несколько градаций (уровней) состояния покоя Проба 4 Двойное (гомеостазирующее) действие модулятора ИЗЛ как информативный показатель функционального состояния СДГЛФ Реакция СДГ на модуляторы позволяет значительно более чувствительно выявить физиологическое состояние исследуемого организма, чем просто величина активности В отличие от широко используемого активатора СДГ глутаминовой кислоты ИЗЛ почти не используется для устранения ингибирования этого фермента Имеются лишь единичные работы, показывающие это действие Возможно, это объясняется тем, что коммерческая ИЗЛ предлагается в форме дорогостоящего рацемата, полученного химическим синтезом Мы имели возможность использовать чистую природную форму ИЗЛ (осч), полученную микробиологическим синтезом [ИБФМ РАН, Пущино] Активирующее СДГ действие ИЗЛ позволяет выявить скрытое торможение этого фермента ЩУК или серотонином [Ковдрашова МН 1986] Впервые в нашей работе выявилось и второе регуляторное действие ИЗЛ на активность СДГ - снижение гиперактивации Его значение может быть еще более важным, чем активация ингибированного Причина гиперактивации, как и причина более глубокого ингибирования активности СДГ - одна и та же - ослабление энергетического контроля скорости дыхания в митохондриях

Закономерное сочетание величин перечисленных показателей позволяет выделить характерные паттерны (узоры) реакций у человека и животных для состояний с разной степенью адренэргической регуляции

Измерение активности СДГЛФ у новорожденных крысят сравнительно со взрослыми животными в покое и при активации адреналином

Физиологическое состояние новорожденных по сравнению с взрослыми животными характеризуется сильным сдвигом в сторону преобладания симпатической (адренэргической) регуляции [Аршавский И А 1982] Нашей задачей было выяснение возможности выявления этих физиологических различий разработанным методом Были исследованы две группы взрослых крыс интактные и животные при введении

адреналина 25мкг/100г, для выяснения у них уровня адренергической регуляции (рис 4).

"г 3,5

1-2,5

0,5

Адреналин

Рис 4. Показатели активности СДГ у взрослых интактных крыс и при физиологической стимуляции адреналином. Незаполненные столбики -восстановление НСТ на ЭС, диагональные полоски - с 5мМ МАЛ, черные - с 5мМ ЯНТ. Даны средние значения и стандартные отклонения по группе. Приведены исследования 12 животных по шесть в каждой группе. Различия достоверны *р < 0,001, по сравнению с интактными.

Измерялись три основных показателя восстановления НСТ, характеризующих функциональную активность СДГ; 1) на эндогенных субстратах, 2) в присутствии 5мМ МАЛ, 3) при окислении 5мМ ЯНТ. Видно, что у интактных крыс все три показателя, находятся на низком уровне в пределах 0,4 - 0,50 мкм2, активность СДГ в пробе с добавлением ЯНТ на этом же уровне или превышает уровень восстановления ЭС только на 5- 15%. У животных с введенным адреналином наблюдается увеличение в два - три раза показателя 5мМ ЯНТ, достигая величины 1,4 мкм2.

Величина активации под воздействием введенного адреналина у взрослых крыс, приближается по амплитуде к сильной активации ими физиологических процессов в организме и значительно больше тех эффектов, которые наблюдаются на выделенных митохондриях. Активация адреналином при использовании нашего метода от 150% до 300% , а при измерении дыхания на выделенных митохондриях от 20% до 50%. Это объясняется сохранением в наших условиях исходного состояния покоя, которое утрачивается при выделении митохондрий или помещении лимфоцитов в нефизиологическую среду. Свидетельством этого является наблюдение в наших условиях практически неактивной СДГ при обеспечении полноценного покоя животного, это состояние является латентным. Оно отчетливо видно на лимфоцитах взрослых крыс в покое: несмотря на добавление ЯНТ, СДГ практически не отвечает, как будто она «спит» или выключена. Это хорошо соответствует адренэргическим влияниям в организме - они отключаются в период покоя и включаются при активации. Сохранение состояния покоя в разработанных нами условиях и позволило выявить более отчетливо взаимную связь окисления ЯНТ и действия адреналина, обозначенную нами как симпатическая половина субстратно - гормональной системы, обеспечивающей синтез АТФ при активности. Показано, что

переключение от состояния покоя на стимулированный адреналином/норадреналином активный тип обмена связано с увеличением вклада в процессы окисления ускоренного образования ЯНТ путем переаминирования ГЛУ и ЩУК [Кондрашова МН 1991 ] Эти реакции образуют цикл, названный «усеченным циклом Кребса» [Coleman, Р S 1991] Его роль, по нашему мнению, состоит в увеличении вклада окисления ЯНТ в энергообеспечение при большом расходе АТФ

У большинства новорожденных крысят, выявлено значительное повышение трех исследуемых показателей сравнительно с взрослыми даже после введения адреналина По этим показателям мы распределили всех новорожденных из двух исследованных пометов в три подгруппы (Рис 5) Подгруппа 1 с высокой активностью, гиперактивной СДГЛФ, подгруппа 2 с активностью СДГЛФ, как у адреналиновых взрослых особей и подгруппа 3 со значительно более низкой СДГЛФ Подгруппы новорожденных отличаются не только активностью СДГ при окислении ЯНТ, но и соотношением ее с двумя другими показателями пробами с МАЛ и ЭС Выявленное разделение новорожденных, даже взятых от одной матери, на три подгруппы согласуется с известной гетерогенностью популяции и последующим отбором более приспособленных. Это характерно для всех млекопитающих, рождающих группу детенышей В условиях нашего вивария крысы рождают 4-12 детенышей Часть из них погибает в первые два - три дня после рождения, крыса - мать сама их «затаптывает» Выживают наиболее здоровые и активные Вероятно, что подгруппа с высокой СДГЛФ соответствует физиологически крепким или более зрелым особям, а подгруппа с низкой активностью — ослабленным, отстающим в развитии

Сопоставление взрослых и новорожденных крыс по «истинной активности» СДГ, рассчитанной по разности между пробой с 5мМ ЯНТ и с добавлением 5мМ МАЛ, различия между группами имеют еще большую амплитуду, чем по «общей» активности СДГ У взрослых крыс в покое значение истинной СДГ равно нулю (0,09) латентое состояние При введении адреналина истинная СДГ увеличена в 7 раз, что составляет 0,87 В гиперактивной подгруппе новорожденных эта величина увеличила в 24 раза и составляет 2,91, во второй активной подгруппе истинная СДГ 1,1,что в 10 раз выше, чем у взрослых в покое и при введении адреналина

Значительно более высокий уровень окисления ЯНТ у новорожденных выявленный в данной работе по сравнению с взрослыми может использоваться как для поддержания интенсивного энергообеспечения в MX, так и для сигнальной активации выделения катехоламинов, доминирующих гормонов для раннего онтогенеза

4.5

Рис. 5 Цитобиохимические показатели новорожденных крысят разделенных на три подгруппы в зависимости от величины активности

СДГ: 1 - гиперактивная : 2 - активная, 3 - низкая.

Обозначения как на Рис. 4. Даны средние значения и стандартные отклонения. Различия достоверны *р < 0,001, ** р <0,05 по

г

з

сравнению с взрослыми интактными.

Наши данные согласуются и с литературными данными о значительном повышении концентрации ЯНТ у новорожденных, чем у взрослых, судя по ее выделению в моче [Guneral F. and Bachmann С.,1994]. Представление о преобладании адренэргических реакций у новорожденных, базирующееся на физиологических данных [Аршавский И.А. 1982], подкрепляется и определениями катехоламинов в крови [Абрамченко A.B. 2006]. Таким образом, СДГ является ферментом, через который в митохондриях «замыкается» взаимодействие субстратно -гормональных партнеров: ЯНТ - катехоламины.

Применение разработанного метода для выявления различий физиологического состояния у человека

Исследования на здоровых обследуемых. При исследовании основных показателей восстановления HCT: 1) ЭС; 2) 5мМ МАЛ; 3) 5мМ ЯНТ; выявлены 4 типа цитобиохимических паттерна (узора) здоровых добровольцев. Паттерны характеризуют физиологическое состояние митохондрий и позволяют рассчитать более корректно функциональную активность СДГ, которую мы классифицировали в группы: 1- глубокий покой; 2- оперативный покой: 3 - активация (возбужденная норма); 4 -активация, сдерживаемая ингибированием. У обследуемых измеряли АД и пульс. Величины АД во всех случаях соответствовали возрастной норме обследуемых (данные не приведены).

На рис 6. представлены по одному примеру паттернов типичных для каждой подгруппы, а в таблице 2 даны средние значения и стандартные отклонения показателей восстановления HCT. В каждой подгруппе обследуемых величина «общей» активности СДГ закономерно связана с величинами введенных нами показателей. Эти паттерны дают индивидуализированную характеристику обследуемого организма и основание для понимания связи с физиологическим состоянием организма. Важно отметить, что при повторных исследованиях

показателей восстановления НСТ у нескольких индивидуумов было выявлено, что вариации сочетаний показателей воспроизводятся закономерно. Перечислим характеристики показателей паттернов каждой подгруппы здоровых обследуемых.

Подгруппа 1. Глубокий покой - состояние глубокого покоя, когда трудно быстро перейти к активности (п = 7) (рис. 6А). Показатель глубокого покоя - повышение окраски МАЛ - рассматриваем как более полное подавление СДГ, которое открывает дорогу окислению НАД-ЗС, характерному по нашим предшествующим исследованиям для покоя. Низкие ЭС и низкая «общая» СДГЛФ.

Подгруппа 2. Оперативный покой - состояние покоя, от которого легко перейти к активности (п = 6), (рис.бБ). Признак оперативности покоя -появление снижения окраски МАЛ. Оно указывает, что окисление ЯНТ участвует в ЭС. По нашим представлениям это признак адренергического влияния.

Подгруппа 3. Активация (возбужденная норма) - активированное состояние до работы (п = 3), (рис.бВ). В первую очередь выступает возрастание общей активности СДГ. Оно сохраняется и при вычете проб, отражающих участие других процессов. О возбужденном состоянии в этой группе свидетельствует большая чувствительность ЭС к МАЛ -большой вклад ЭЯНТ в ЭС - сильное адренергическое действие. И Высокое значение «общей» активности СДГ. Г~~~--

Подгруппа 4. Активация, сдерживаемая ингибированием (п = 4), (рис. 6Г). Общая активность СДГ снижена по сравнению с возбужденной подгруппой. Сильное повышение окраски МАЛ по сравнению с ЭС свидетельствует об усилении окисления НАД - ЗС субстратов. Окраска при окислении НАД-ЗС может быть обусловлена дегидрогеназами и супероксидом. Судя по тому, что МАЛ усиливает окраску ЭС вероятнее, что СДГ гиперактивна и сдерживается торможением внутренними регуляторами - ЩУК, серотонииом, то есть в конечном итоге -ингибирована. Это признаки стрессового напряжения. Для него типично

-1-1_Л--1 1 IWJ.II ну -

г- активация, 0,05 по сравнению с

сдерживасмло показателями для покоя по

ингибированием (Ц-КрИТерИЮ В-М-У).

Рис. 6 Типичные паттерны восстановления НСТ здоровых обследуемых. Незаполненные столбики -ЭС, диагональные полоски

- 5мМ МАЛ, черные - 5мМ ЯНТ. А - ]лубокий покой. Б - оперативный покой, В

- активация, Г - активация сдерживаемая ингибиров. Различия достоверны Нр <

А-глубокий Б - оперативный В - активация

18

"ПТПТ

снижение общей активности СДГ и выключение истинной активности Механизм этого снижения иной, чем в 1руппе полноценного покоя Он обусловлен развитием стрессового ингибирования СДГ, которое сдерживает развитие гиперактивации внутренними механизмами, а при их недостаточности лекарствами и может быть признаком предпатологии Следует отметить, что у добровольцев этой группы отмечались признаки стресса

Таблица 2 Типичные сочетания (паттерны) цитобиохимических показателей восстановления HCT у здоровых людей

Подгруппы Эндогенные субстраты ОС) Проба 1 ЭС + Мал 5мМ Проба 2 СДГ Общая ЯНТ 5мМ Проба 3 СДГ Истинная (Расчет)

1 Глубокий покой п=7 0,34 ±0,08 0,43 ± 0,10# " 0,29 ±0,09 0 (-0,05 ±0,1) (3-1)

2 Оперативный покой п=6 0,40 ± 0,09 0,29 ± 0,09# 0,31 ±0,06 0 (0,03 ±0,1) (3-2)

3 Активация п=3 0,6 ± 0,24 0,19 ±0,06° 0,75 ± 0,26" 0,56 ±0,29 (3-2)

4 Активация с ингибированием п=4 0,41 ±0,19 0,74 ± 0,23" 0,46 ± 0,04" 0,05 ±0,23 (3-1)

Представлены средние значения в мкм2 площади восстановления HCT и стандартные отклонения в подгруппах Различия достоверны °р < 0,05 по сравнению с показателями для глубокого и оперативного покоя по (U-критерию В-М-У), #р < 0,05 по (критерию знаков) Истинную активность СДГ рассчитывали как разность между пробой с добавлением ЯНТ и одной из проб без ее добавления, что указано в скобках

Изменения истинной СДГ относительно двух групп покоя, равных нулю, нельзя выразить числом, так как деление на 0 невозможно Эти изменения можно описать как выключение и включение Нулевые значения активности СДГ обозначены жирным шрифтом, чтобы выделить впервые выявленное латентное, выключенное состояние

Данные, представленные в таблице, позволяют увидеть увеличение общей активности СДГ (проба 5мМ ЯНТ) при переходе из состояния глубокого покоя к активации, затем снижение ее при активации, сдерживаемой ингибированием Для обеих подгрупп покоя видно, что все показатели на низком уровне в отличие от других подгрупп При активации, сдерживаемой ингибированием видно характерное увеличение показателя восстановления HCT МАЛ, при низкой общей СДГ что, по-видимому, свидетельствует о нарастании образования супероксида (см механизм выше) При расчете величины истинной СДГ получаем небольшие отрицательные величины для покоя Это свидетельствует об отсутствии активности СДГ в покое, которое мы обозначаем 0 активности СДГ (латентное состояние) Это соответствует состоянию в организме при полноценном покое СДГ активируется

адреналином универсальным стимулятором энергетических процессов при возбуждении [Кулинский В И 1981, Васин М В 1999, Зп/агатаклвЬиап 8,е1а1 1978, 1983]. При полноценном покое эта регуляция отключается. В подгруппе активация высокое среднее значение истинной СДГ 0,56 мкм2, обусловлено включением окисления ЯНТ адреналином Подгруппа активации с ингибированием характеризуется снижением истинной СДГ до 0,05 мкм2

Несмотря на близкие величины расчетной СДГ в первом, втором и четвертом состояниях - 0,05, -0,02 и 0,05 они различны по существу Первые два уходят вниз за 0, свидетельствуя о полном отсутствии активности, что позволяет выразить ее 0 В последнем случае это не латентная, а ингибированная активность Она сохраняет хотя и низкое, но положительное значение Четким критерием различия таких состояний является реакция на ИЗЛ, которая не влияет на латентную активность и повышает ингибированную Это действие будет рассмотрено ниже при описании паттернов пациентов

Таким образом, выявляется высокая информативность показателя «истинной» СДГЛФ, позволяющего увидеть впервые полное отключение активности СДГ в покое, что соответствует переключению от адренергической стимуляции к холинергической в организме и значительно больше различающееся в разных состояниях, чем «общая» активность

Следует отметить, что наше мнение о существовании двух состояний СДГ с низкой (или нереализуемой) активностью не соответствует принятым представлениям, о том, что единственной причиной ее снижения является ингибирование ЩУК [Виноградов А В 1986] По нашему мнению это объясняется тем, что в опытах даже на выделенных митохондриях, а тем более на выделенном ферменте, на которых преимущественно базируются упомянутые представления, утрачивается неактивное латентное состояние

Исследования на пациентах с пищевой аллергией и гипертонией Пациенты рассматриваемой группы могут быть отнесены к условно здоровым, поскольку они работоспособны, однако, по сравнению с описанной выше группой здоровых людей, физиологическое состояние пациентов хуже Исследование показателей восстановления НСТ у группы пациентов также выявило у них закономерное сочетание 4 типов цитобиохимических паттернов, но отличающихся от здоровых людей. Выраженным отличием всей группы пациентов является то, что все показатели у них гораздо выше На рис 7 показаны четыре типа узоров цитобиохимических характеристик митохондрий на пациентах Первые три столбика для каждого пациента - те же показатели, что и у здоровых, а четвертый представляет пробу с добавлением ИЗЛ

Типы цитобиохимических паттернов пациентов по общей СДГ и действию ИЗЛ. Рис.7

Условная норма. К этому типу был отнесен пациент №1, который по физиологическим показателям наиболее близок к норме, хотя его цитобиохимические показатели далеко не идентичны показателям здоровых людей (в 2-3 раза выше) Тем не менее, отсутствие активации ИЗЛ четко указывает на отсутствие напряжения активности СДГ, поэтому он ближе всех к состоянию покоя Кроме того, этот пациент прошел длительное лечение, в результате чего значительно нормализовался его вес - снизился со 120 кг до 80 кг, и соответственно нормализовалось общее состояние По показателям АД и пульса пациент был в пределах его возрастной нормы Поэтому показатели этого пациента были названы нами условной нормой и приняты в качестве основы для сравнения с остальными, т е принимались за 100% Гиперактивация (№№ 3,8,7,6) Этот тип характеризуется повышенной активностью СДГ при 5мМ ЯНТ относительно пациента сравнения, а также превышающей таковую у здоровых людей в группе активации, и квалифицируемую нами как гиперактивация Согласно предшествующим исследованиям на животных [Кондрашова М.Н, 1985, Нарциссов РП, 1988] гиперактивация развивается в начале без ограничения ингибированием, а при усилении патогенного воздействия развивается сдерживающее ее ингибирование Эти стадии четко различаются добавлением ИЗЛ В случае "менее стрессовой" гиперактивации ИЗЛ способна понизить ее Эта реакция наблюдается у пациента №3 У следующих трех пациентов с гиперактивацией, по-видимому, нарастает внутреннее ингибирование, так как ИЗЛ уже не снижает активности, а возникает только тенденция к ее активирующему действию.

По показателям АД первые трое пациентов этой группы имели величину систолического показателя в пределах нормы, но диастолическое давление нарастало, что коррелировало с возрастанием активности СДГ Последний пациент этой группы № 6 с наиболее высокой СДГ имел повышенные показатели АД, характерные для гипертонии

Гиперактивация с ингибированием (№№ 9, 2, 4) Всех пациентов этой подгруппы объединяет снижение общей активности СДГ по сравнению со второй подгруппой и приближение этого показателя к значениям условной нормы Однако эти отличия мало выражены при определении СДГ только с ЯНТ Очевидными отличия этой группы становятся при добавлении ИЗЛ, которое активирует ее на треть или даже в два раза Та тенденция к активации, которая намечалась в предшествующей группе, в данной группе ярко реализуется Видно, что отличия относительно пациента сравнения значительно усиливаются добавлением ИЗЛ

условный покой

гиперакгивация 87% 158% ±20%

гнперактивацня с ингибированием

ингибирование

3 !'2

3

о. .

4

X

3 ».8

В

J

| 11,4

100% 122% 134% ±20%

107% ±20%

№3 Кй №7 Ж.

№ Кй К*

Систолическое 138 Диастолическое 85 ЧСС, уд/мин 58

Артериальное давление, мм рг. ст.

ИЗ 118 129 152 109 128 162 156

67 88 92 114 79 93 128 97

65 89 57 73 66 80 84 73

Рис. 7. Индивидуальные паттерны восстановления HCT в лимфоцитах у пациентов. Незаполненные столбики - на эндогенных субстратах, диагональные полоски - в присутствии 5мМ МАЛ, черные - с 5мМ ЯНТ, серые - 5мМ ЯНТ + 5мМ ИЗЛ.

Превышение восстановления в пробе с ИЗЛ над пробой с ЯНТ является мерой ингибирования СДГ. Превышение восстановления в пробе с ЯНТ над ИЗЛ является показателем гиперактивации СДГ.

Над столбиками в процентах представлены среднее значение ± стандартное отклонение показателей данной подгруппы относительно условного покоя пациента Хй1, принятого за 100%, нижний ряд по пробе с ЯНТ, верхний ряд по пробе с ЯНТ + ИЗЛ. Для второй и третьей подгруппы дано среднее значение ± стандартное отклонение по пациентам (№№ 8, 7, 6) и (К«9 и №2), для пациентов №3 и №4 даны индивидуальные значения. Эти показатели относительно нациента №1 различаются достоверно (р<0,05 U- критерий В-М-У). Внизу приведены показатели АД и пульса.

По показателям АД и пульса только пациент №9 третьей группы может рассматриваться как относительно благополучный. У второго пациента повышено диастолическое давление и пульс, а у последнего пациента очень сильно повышено и систолическое, и диастолическое давление, а также и пульс. По общему состоянию все трое являются сильно неуравновешенными, особенно постоянной нервозностью отличалась пациентка №4.

Ингибирование. К этому типу относится пациент № 5. По нарастанию патологического состояния он помещен после группы гиперактивации с ингибированием. В этом состоянии ингибирование снижает активность СДГ ниже уровня покоя. Это состояние характерно для более глубокой патологии или стресса, что видно и по высокому АД этого пациента. То, что оно не является возвратом к норме видно по сохранению активирующего действия ИЗЛ, которое не проявляется в состоянии полноценного даже условного покоя

22

тттгпг

Ингибирование СДГ в начальных стадиях может иметь защитное значение, а при углублении становится патогенным

Из вышеописанного видно, что цитобиохимический способ хорошо выявляет прогрессирующие изменения характеристик общей СДГ пациентов с нарастанием АД и пульса Эти изменения значительно усиливаются добавлением ИЗЛ

Типы цитобиохимических паттернов пациентов по истинной СДГ и действию ИЗЛ. Рис. 8

При расчете истинной СДГ группы еще больше типизируются Четко выступают сходство внутри групп и различия между ними Видно, что в отличие от здоровых людей, ни у одного из пациентов не отмечается состояние «спящей» СДГ Таким образом, у них не выявляется полноценного покоя Как уже говорилось, к состоянию покоя ближе один из пациентов, №1, его показатели были взяты за 100% В этом состоянии условного покоя истинная СДГ у него минимальна и находится на уровне 0,2 мкм2, что, тем не менее, принципиально отличается от латентной СДГ здоровых людей

Гиперактивация. Преимущества расчета истинной СДГ ясно видны при рассмотрении этой группы Почти все показатели становятся одинаковыми, только отличается реакция на ИЗЛ у пациента 3 Согласно описанию для общей СДГ это указывает на начальную стадию гиперактивации, которая еще может снижаться ИЗЛ

Гиперактивация с ингибированием. Для этой подгруппы еще боле ярко, чем для предыдущей, видно преимущество расчета истинной СДГ Оно делает совершенно отчетливым развитие ингибирования все показатели истинной СДГ в присутствии ЯНТ ниже группы гиперактивации

Добавление ИЗЛ также очень сильно выявляет это ингибирование, значительно повышая активность Это повышение более чем двукратное по отношению к собственной пробе без ИЗЛ и достигает высоких величин, относительно пациента 1

Ингибирование Выражение данных в виде истинной СДГ делает очевидным и преобладание ингибирования в этом случае Преобладание ингибирования относительно условной нормы очевидно и по очень низкой СДГ без ИЗЛ, и по пятикратной активации ИЗЛ относительно собственной пробы с ЯНТ При таком доминировании ингибирования ИЗЛ не активирует СДГ до столь высоких величин, как в предыдущей группе, но все-таки повышает активность по сравнению с условным покоем

Приведенные примеры показывают, что разработанные нами условия проведения реакций и расчета полученных данных для определения истинной СДГ в отсутствие и присутствии ИЗЛ существенно повышают чувствительность исследования к изменению состояния организма Эти

показатели соответствуют тенденции нарастания АД и пульса у рассмотренной последовательности пациентов.

Рис. 8 Истинная СДГ пациентов. Черные столбики - активность СДГ в присутствии 5мМ ЯНТ, серые столбики - 5мМ ЯНТ + 5мМ ИЗЛ. Величину истинной активности СДГ определяли вычитанием из общей активности СДГ без ИЗЛ или с ИЗЛ значений восстановления с 5мМ МАЛ. Ингибирование и гиперактивация СДГ определяются как на Рис. 7.

Над столбиками в процентах приведена средняя величина ± стандартное отклонение показателей дайной подгруппы относительно условного покоя пациента №1, величины которого приняты за 100%, нижний ряд по пробе с ЯНТ, верхний ряд по пробе с ЯНТ+ИЗЛ. Для второй и третьей подгруппы дано среднее значение ± стандартное отклонение по пациентам (№>№ 8, 7, 6) и (№9 и №2), для пациентов №3 и №4 даны индивидуальные значения. Различия между группами по истинной СДГ отличаются с еще более высокой достоверностью (р<0,001 U-критерий В-М-У), чем по общей, относительно условного покоя пациента Лг«1.

Важно отметить, что амплитуда различий показателей, особенно по истинной СДГ больше чем по АД.

Важным отличием паттернов пациентов от здоровых является увеличение амплитуды всех показателей. Оно видно и по отношению к условно здоровому. А его показатели в свою очередь в 2-3 раза выше таковых у здоровых. Это показывает, что текущее состояние относительного покоя пациентов поддерживается большим объемом метаболических процессов, чем у здоровых. Мы назвали это явление: метаболическая гипертрофия. Подобно морфологической гипертрофии она, по-видимому, свидетельствует о снижении функциональной эффективности рабочей единицы ткани, морфологической или метаболической. Опираясь на эту характеристику, можно предложить в качестве цели, подбора и контроля лечения уменьшение метаболической гипертрофии, то есть приближение к более полному покою здоровых. Достижение латентного состояния, если это окажется возможным, можно расценивать как полное восстановление.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенной работе осуществлена разработка принципиально нового метода определения активности СДГ в митохондриях на основании сочетания преимуществ цитохимического и биохимического методов и исключения их недостатков

Исследовано применение этого метода для выявления различия физиологического состояния крысы и человека В результате разработанных усовершенствований впервые выявлен ряд функциональных состояний СДГ при разных уровнях адренергической регуляции крысы и человека Они перечислены ниже в порядке от покоя для нормы к активности или патологии

1 Глубокий покой Латентная ("Спящая") СДГ

2 Оперативный покой Латентная ("Спящая") СДГ

3 Активация Небольшая активация СДГ

4 Гиперактивация Выраженная активация СДГ Впервые показано, что ИЗЛ снижает гиперактивность

5 Гиперактивация, сдерживаемая ингибированием меньшей или большей степени

Ингибирование выявляется по активации ИЗЛ Активирующее действие ИЗЛ значительно сильнее, чем наблюдалось ранее (см выше) Различия между подгруппами животных и людей проявляются наиболее четко при расчете "истинной" СДГ

Большую амплитуду отличий активности СДГЛФ в зависимости от выраженности адренэргической регуляции удалось выявить благодаря тому, что комплексом условий работы с животным и препаратом нам удается сохранить состояние отключения (латентности) фермента без активации адреналином

Таким образом, измерение описанного выше комплекса показателей восстановления НСТ при использовании предложенных расчетов значений истинной активности СДГ и модулятора ее активности ИЗЛ может служить очень информативным тестом для определения функциональной активности СДГ и выявления уровня адренэргической регуляции в организме

На современном этапе участию митохондрий в поддержании физиологического состояния организма и развитии болезней придается ключевое значение Выделены новые области медицины митохондриальные болезни и митохондриальная медицина Как и другие области медицины, они должны иметь свои стандартные показатели Разработанные нами подходы предлагают создание стандартизованного набора реактивов для определения показателей взаимодействия митохондрий с ЯНТ При таких условиях можно получать универсальные характеристики физиологического состояния организма, отражающие функциональное состояние наиболее мощного фермента энергообеспечения СДГ При использовании предложенного нами набора

реактивов надлежащей квалификации [Заявка на изобретение 2007] появится возможность стандартизации цитобиохимических показателей человека подобно таким характеристикам как АД или пульс

Выводы:

1 Исследована возможность повышения чувствительности традиционного цитохимического метода определения активности СДГЛФ по восстановлению НСТ на мазке к ее изменениям в организме за счет способа расчета, изменения состава сред, приближенных к внутриклеточным, проведения дополнительных измерений нескольких показателей эндогенными субстратами, ингибитором активности СДГ малонатом, миллимолярной концентрацией ЯНТ, с ИЗЛ Благодаря этому выявили несколько уровней функциональной активности СДГЛФ, при разных адренергических состояниях организма

2. Экспериментально обоснованы следующие модификации поддержание рН 7,2 ± 0,05, характерной для внутри митохондриальной среды вместо 7,4 и исключение хелатора кальция ЭДТА 3 Обнаружено двойное регуляторное действие ИЗЛ на активность СДГЛФ - значительное снижение гиперактивации и более сильное, чем было известно, устранение ингибирования Ее добавление позволяет впервые определить не только активность, но и функциональное состояние СДГ

4. Для новорожденных крысят с естественной гиперактивацией адренэргической регуляции характерна и гиперактивация СДГ по сравнению со взрослыми не только в покое, но и при введении адреналина

В ходе иммобилизационного стресса крыс, происходит ярко выраженный переход от гиперактивации СДГ к ее ингибированию. особенно отчетливо выявляемый по смене регуляторного действия ИЗЛ от снижения гиперактивности к уменьшению ингибирования 5 У здоровых людей обнаружено 4 типа цитобиохимических паттернов свидетельствующих о разном функциональном состоянии СДГЛФ, глубокого покоя, оперативного покоя, активации, активации с ингибированием, включая неизвестное ранее латентное состояние 6. У пациентов с пищевой аллергией с гипертонией выявлены 4 типа цитобиохимических паттернов условный покой, гиперактивация и гиперактивация с ингибированием, ингибирование, которые отличаются от здоровых утратой латентного состояния, увеличением амплитуды показателей и активирующим действием ИЗЛ Развитие гиперактивации СДГ коррелирует с нарастанием артериального давления Величина амплитуды прогрессивно нарастает при развитии активации и патологии (это явление названо метаболическая гипертрофия) и может служить показателем развития и эффективности лечения гипертонии, чем просто измерение артериального давления.

7 Проведенное исследование подтверждает и усиливает имевшиеся клинические данные о высокой информативности величины активности СДГ, как показателя состояния организма

Список публикаций по теме диссертации.

1 Vishnevsky Е L, Kondrashova М N, Pushkar D Y, Vishnevsky Е Е , Demidov A A, Sirota TV, Temnov AV, Khunderyakova NV, Zakharchenko MV, Kosyakova N I Role of the impairment of oxidative metabolism m pathogenesis of lower urinary tract symptoms with benign prostatic hyperplasia and their treatment by adrenoblocker alfuzosm Mitochonrion, 3,2003, 67-73

2 Захарченко M В, Катина H С, Хундерякова Н В , Захарченко А В, Кондрашова М Н Биохимическая модификация цитохимического метода определения активности сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах крови//Межд конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» 2005 Пущино с 406 -409

3 Кондрашова М Н, Захарченко М В , Хундерякова Н В , Захарченко А В Способ выявления субстратного и сигнального действия янтарной кислоты по ее влиянию на восстановление нитросинего тетразолия в лимфоцитах на мазке крови, позволяющий определить выраженность симпатической регуляции в организме, а также создание стандартного набора реактивов для его осуществления //Материалы II межд научно-практической конф «Медбиотек-Перспективы развития биотехнологии в России», Пущино, 2005 с 28-30

4 Zakharchenko М V , Khunderyakova N V , Zakharchenko А V, Kondrashova М N Responses of mitochondrion m immobilized lymphocyte //14th European Bioenergetics Conference EBEC Short Reports Suppl Moscow 2006 v 14, p 530-531

5 Хундерякова H В , Захарченко А В , Захарченко M В , Мюллер X, Кондрашова М Н Регуляция превращения янтарной кислоты в лимфоцитах крыс воздействием модулированной частоты лазера на животное //10-я Пущинская школа-конф молодых ученых 2006 с 172-173

6 Хундерякова Н В , Захарченко А В , Захарченко М В , Кондрашова М Н Активность сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах крови у новорожденных крысят //Межд конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» 2007 Пущино с 236-239

7 Захарченко М В , Захарченко А В , Хундерякова Н В , Кондрашова М Н Адреналиноподобное действие янтарной кислоты //Межд конференциия «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» 2007 Пущино с 219-221

8 Волков А В , Хундерякова Н В , Телешева Т Ю , Кондрашова М Н Корреляция характеристик и состояния организма методом газоразрядной визуализации и по активности сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах крови //XI Международный научный конгресс по ГРВ биоэлектрографии 2007, Санкт-Петербург, с 12 - 15

9 Хундерякова Н В , Захарченко М В , Захарченко А В , Кондрашова М Н Цитобиохимический метод определения состояния организма по окислению субстратов в митохондриях лимфоцитов, измеряемого компьютерной видеомикроскопией с разрешением в нанометрах по размеру объектов и наномолях по концентрациям веществ //IV межд конференция Нанобио - и 11 другие новые и перспективные биотехнологии, 2007, Пущино, с 153-158

10 Сирота Т В , Елисеева О П, Хувдерякова Н В, Махотина О А Масло семян амаранта, влияние на энергетические функции активированных адреналином митохондрий печени крыс Биологические мембраны, 2007, т 24, №6, с 457- 465

11 Хундерякова Н В , Волков А В, Телешева Т Ю , Кондрашова М Н Сопоставление интенсивности газоразрядного свечения кожи и активности еукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах при разных состояниях организма 2007 Биофизика, 2008, т 53, №1, с 123-128

12 Хундерякова НВ, Захарченко МВ, Захарченко АВ, Кондрашова МН Гиперактивация еукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах крови новорожденных крысят Биохимия, 2008, т 73, №3, (в печати)

13 Кондрашова МН, Хувдерякова НВ, Захарченко МВ, Захарченко А В Индивидуальная характеристика человека по паттерну (узору) цитобиохимических показателей взаимодействия янтарной кислоты с митохондриями //Материалы Симпозиума «Регуляторы энергетического обмена» (В А Хазанов ред ) Томск, 2007 октябрь (в печати) Продолжающееся издание

14 Хундерякова НВ, Захарченко МВ, Захарченко А В, Кондрашова МН Условия проведения и интерпретация результатов исследований взаимодсиствия янтарной кислоты с митохондриями цитобиохимическим методом //Материалы Симпозиума «Регуляторы энергетического обмена» (В А Хазанов ред) Томск, 2007 октябрь (в печати) Продолжающееся издание

ИТЭБ РАН, Кондрашова М Н, ОАО ДИОД Захарченко М В , Хувдерякова Н В , Маевский Е И Заявка на изобретение Цитобиохимический способ определения активности еукцинатдегидрогеназы, окисления эндогенной янтарной кислоты, сигнального действия микромолярных концентраций янтарной кислоты, его применение для количественной оценки уровня адренергической регуляции в организме, среда и набор для осуществления способа Входящий № 047111 Регистрационный № 2007143021, дата подачи 20 ноября 2007

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ по поддержке Ведущей научной школы Кондрашовой МН (00-15-97847, НШ 824 2000 4), Программа Президиума РАН «Поддержка инноваций» 2005, Программа фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (руководитель Кондрашова М Н) При поддержке ОАО Заводом Экопитания ДИОД (руководитель Тихонов В П )

Подписано в печать 19 12 2007 г Печать трафаретная

Заказ №1068 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495)975-78-56, (499)788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хундерякова, Наталья Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Роль янтарной кислоты в энергообеспечении.

1.1. Субстратно - гормональная система.

1.2. Переаминирование ЩУК - ГЛУ - динамичная основа реципрокной регуляции.

1.3. Сигнальная роль янтарной кислоты в организме.

1.4. Модели исследования разных уровней адренергической регуляции.

1.5. Устойчивое поддёржание физиологической активации организма 20 животных и человека малыми дозами адреналина и янтарной кислоты.

1.6. Гиперактивация новорожденных как модель физиологической адренергической активации.

1.7. Свойства и локализация сукцинатдегидрогеназы.

Глава 2. Методы оценки функционального состояния митохондрий.

2.1. Гистологический метод определения «красных рванных волокон».

2.2. Биохимический метод определения функциональной активности митохондрий.

2.3. Цитохимический метод Нахлас определения активности СДГ.

2.4. Цитохимический метод Нахлас в модификации Нарциссова определения активности СДГ в лимфоцитах периферической крови.

2.5. Активность СДГ лимфоцитов, как показатель состояния внутренних органов и развития организма в целом.

ЧАСТЬ И. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объекты исследования.

3.2. Забор крови у человека.

3.3. Создание разных состояний животного и эвтаназия.

3.4. Обработка, фиксация и окрашивание мазков крови нитросиним тетразолием.

3.5. Микроскопирование и измерение площади окраски.

3.6. Статистика.

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Разработка нового цитобиохимического метода измерения активности сукцинатдегирогеназы в митохондриях лимфоцитов.

4.1. Принцип подбора условий для выявления окисляющей янтарной кислоты в митохондриях на мазке крови.

4.2. Различие состава инкубационных сред растворов по цитохимическим аналогам и по разработанному цитобиохимическому способу.

4.3. Влияние изменения величины рН 7,2 и 7,4 на активность СДГЛФ в присутствии 5мМ сукцината при разных физиологических состояниях животных.

4.5. Влияние содержания 1мМ ЭДТА в среде инкубации на результаты измерения активности сукцинатдегидрогеназы в покое и при действии адреналина на животное.

4.6. Выявление физиологической модуляции сукцинатдегидрогеназы в присутствии изолимонной кислоты у животных в разном физиологическом состоянии.

Глава 5. Применение цитобиохимического метода измерения активности сукцинатдегирогеназы на крысах.

5.1. Значение проб, выявляющих функциональную активность сукцинатдегидрогеназы. Расчет уровня эндогенной янтарной кислоты, истинной активности сукцинатдегидрогеназы.

5.2. Измерение активности сукцинатдегидрогеназы у новорожденных крысят сравнительно с показателями взрослых крыс в покое и при активации адреналином.

5.3. Изучение воздействия модулированной частоты 101 Гц от лазерного диода прибора Curator Professional на регуляцию превращений янтарной кислоты в лимфоцитах крыс.

Глава 6. Исследование взаимодействия ЯНТ с митохондриями условно здоровых добровольцев.

6.1. Четыре типа цитобиохимических паттернов (узоров) взаимодействия ЯНТ с митохондриями условно здоровых добровольцев.

6.2. Пример описания паттернов здоровых добровольцев.

6.3. Пример выявления у людей разного уровня метаболических процессов (метаболическая гипертрофия).

6.4. Выделение групп условно здоровых людей по субстратному действию ЯНТ. Характеристика каждого типа паттерна.

6.5. Значения показателей восстановления НСТ и истинной СДГЛФ у здоровых обследуемых.

6.6. Повторные измерения активности СДГ у одного и того же человека.

6.7. Сравнение активности СДГ лимфоцитов периферической и венозной крови условно здоровых людей.

Глава 7. Исследование взаимодействия ЯНТ с митохондриями в группе пациентов с пищевой аллергией и гипертонией.

7.1. Типы цитобиохимических паттернов у пациентов с пищевой аллергией и гипертонией и корреляция их с физиологическими параметрами.

Типы цитобиохимических паттернов пациентов по общей СДГДФ и действию ИЗЛ рис. 24.

7.2. Типы цитобиохимических паттернов пациентов по истинной СДГЛФ и действию ИЗЛ рис. 25.

7.3. Обсуждение сопоставления активности СДГЛФ крови с показателями интенсивности ГРВ у пациентов с пищевой аллергией в некоторых случаях с гипертонией.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка метода определения активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов как показателя адренергической регуляции в организме"

Открытие наследуемых по материнской линии мутаций митохондриальной ДНК стимулировало развитие новой области медицины -митохондриальных болезней, которые обусловлены этими мутациями (Luft 1994; Di Mauro et.al. 1980). Их круг очень широк - нейродегенеративные болезни, проявляющиеся в пожилом возрасте, кардиомиопатии, проявляющиеся в детском возрасте, некоторые формы диабета и связанной с ним ретинопатии и другие. Повреждение функций митохондрий является первичной причиной этих заболеваний (Скулачев 2000; Крыжановский 2002; Литвицкий 2002; Рере 2000; Banaclocha 2001; Sugrue, Tatton , 2001; Ward, 2005). Дисфункции митохондрий (MX) и гипоксию относят к типовым патологическим процессам (Лукьянова 1997; 2000; Hansford et al., 1999; Sastre et al., 2000; Cohen, Gold, 2001; Ward, 2005). Но развитие и других патологий во многих случаях также связано с повреждением митохондриальных процессов, которое является вторичным в развитии заболевания.

При нарушении энергообмена, которое клинические цитохимики обозначают термином "митохондриальная недостаточность", в первую очередь функционально страдают нервная и мышечные системы, в том числе гладкие мышцы т. к. они требуют высокого энергообеспечения, что делает эти ткани уязвимыми к митохондриальной дисфункции. Эти MX болезни называют митохондриальными энцефаломиопатиями, в случаях преимущественного нарушения функций мозга и кардиопатиями в случае преимущественного нарушения сердца (Сухоруков и др. 1997; 2003).

Для лечения вторичных, и даже для первичных митохондриальных болезней разработан новый класс медицинских препаратов - регуляторов энергетического обмена, направленных на поддержание функций митохондрий, а лекарственные препараты составляют современный раздел здравоохранения - "митохондриальную медицину".

Широко используются такие метаболиты митохондрий как коэнзим Q, витамины - Bi, В2, Вб, липоевая кислота, кокарбоксилаза, цитохром с и другие.

В отечественных исследованиях, начиная с 60 - годов, развивиается новое направление посвященное изучению регуляции физиологического состояния организма янтарной кислотой, как физиологически активным веществом и лечебным средством. Огромная заслуга в этом принадлежит М.Н. Кондрашовой и ее школе (Кондрашова 1968; 1972; 1973). В России разработаны и уже длительное время используются стимулирующие биологически активные добавки к пище, содержащие ЯНТ, а также некоторые лекарства (Кондрашова и др. 1976; 1997; 2002; 2006; Хазанов и др. 2002 -2006). Эффективность ЯНТ обусловливается и тем, что нормализация энергетических процессов в митохондриях устраняет нарушения в усвояемости кальция (Kondrashova 1982), а также катионов калия (Саакян 1998), что обеспечивает их участие в метаболизме даже более эффективно, чем введение в условиях ослабленной усвояемости.

В клинических исследованиях цитохимическое определение активности СДГ в лимфоцитах на мазке крови по восстановлению тетразолиевых красителей является информативным показателем уровня метаболизма в организме. (Нарциссов 1969, Зарецкая 1983; Петричук и др. 2005). Клиническая цитохимия рассматривает клетку как самостоятельный орган со всеми свойствами целого организма, что в полной мере относится к лимфоцитам периферической крови. Лимфоциты рассматриваются не только как клетки специальной иммунной защиты, но и как элементы единой информационной системы, отражающей состояние организма и процесс его развития. Биохимические методы определения СДГ не применяются по причине невозможности широкого взятия тканей для выделения митохондрий. Но они имеют и другой очевидный, но привычный и потому не учитываемый недостаток. Он состоит в нарушении важнейшего с точки зрения биофизики свойства живых тканей - их структурной и ультраструктурной организации в частности, и митохондрий в клетке при их выделении. При этом разрушается паракристаллический комплекс ферментов матрикса - метаболой и теряются физические механизмы регуляции ферментов (Shrere 1985; Fahient 1988;

Любарев и Курганов 1987; 1989). Недостаточно оцененным преимуществом цитохимического метода является сохранение структурной организации в мазке. Его можно рассматривать как иммобилизацию ферментов на подложке в клеточной среде, которая стабилизирует даже выделенные ферменты на длительное время (Вудворд 1988). Однако, несмотря на то, что цитохимический метод является информативным и широко используемым более 50 лет Кондрашова М.Н. обратила внимание на наличие весьма существенных недостатков в составе реактивов. Их набор остался в основном неизменным с времен классических работ и не соответствует современным биохимическим условиям работы с митохондриями.

На основании вышеописанного был разработан новый цитобиохимический метод определения СДГ в лимфоцитах крови, сочетающий преимущества биохимических и цитохимических методов и исключающий их недостатки. Нами проведена значительная часть этих исследований, а также получены результаты исследования состояния условно здоровых добровольцев и пациентов с пищевой аллергией. Эти исследования вошли в патент.

Данное изобретение значительно повышает чувствительность измерения активности СДГ вне организма, в лимфоцитах к изменениям состояния в организме, обусловленным адренэргической регуляцией. Это осуществляется путем приближения состава сред к биохимическим условиям. При этом необходимо использовать весь комплекс разработанных изменений состава сред, поскольку частичная замена мало эффективна. Кроме того, были введены дополнительные определения окисления и действия ЯНТ в митохондриях. На основании этих определений Кондрашовой М.Н. предложен более точный способ расчета активности СДГ лимфоцитов, который коррелирует с адренэргической регуляцией. Предложенные измерения впервые характеризуют действие ЯНТ в митохондриях не по одному показателю, а по специфическому паттерну (узору) характеристик. Установлено, что существуют несколько типов паттернов у здоровых животных или людей. Они служат чувствительной индивидуальной характеристикой. При усилении действия адреналина в организме наблюдается возрастание амплитуды изменений паттернов с прохождением четко выявляемых стадий: активации, гиперактивации, ингибирования. Для реализации разработанного метода создан стандартный набор сухих реактивов высокой чистоты, позволяющий унифицировать измерения в разных лабораториях.

Метод использует традиционную для Института Биофизики современную компьютеризованную видеомикроскопию, что обеспечивает автоматизацию обработки изображений: объективность измерения, необходимый для статистической репрезентативности объем выборки.

Целью работы было - разработка метода определения активности СДГ в лимфоцитах на мазке крови более чувствительного, чем традиционные цитохимические методы, к уровню адренэргической регуляции в организме, благодаря максимально возможному сохранению структурной организации митохондрий и иммобилизованной СДГ в измеряемом препарате. Использование разработанного метода для исследования проблемы участия ЯНТ в энергообеспечении при разных физиологических и патологических состояниях крысы и человека и рекомендации средств оптимизирующих функционирование этого центрального механизма энергообеспечения. Задачи исследования:

1. Разработать оптимальные условия состава среды инкубации (величину рН, влияние ЭДТА, ИЗЛ, набор дополнительных показателей восстановления НСТ) для выявления функциональной активности СДГ в лимфоцитах на мазке крови.

2. Измерить активность СДГ лимфоцитов в разработанных условиях при разной степени выраженности адренергической регуляции у крыс (гиперактивные новорожденные крысята, сравнительно с показателями взрослых животных интактных - в покое и при активации адреналином).

3. Исследовать воздействие лазерного диода модулированной частоты 101 Гц от прибора Curator Professional на взаимодействие ЯНТ с митохондриями в лимфоцитах крыс.

4. Определить для группы здоровых добровольцев цитобиохимические показатели взаимодействия ЯНТ с митохондриями.

5. Определить у пациентов (с пищевой аллергией и гипертонией) цитобиохимические показатели взаимодействия ЯНТ с митохондриями и сопоставить с их функциональным состоянием.

6. Участвовать в создании набора реактивов для стандартизации результатов, получаемых в разных лабораториях при определении активности СДГ и других характеристик действия ЯНТ в митохондриях - на лимфоцитах в мазке крови и в патентовании разработанного способа.

Научная новизна работы.

Разработка метода повысила информативность существующих на сегодняшний день и ставших классическими цитохимических методов (Nachlas et. al.1957, Пирс 1962) и различных его модификаций (Quaglino 1960; Нарциссов 1969; Зарецкая 1983; Петричук и др. 2005) определения активности СДГ в лимфоцитах (СДГЛФ), за счет изменения состава сред, приближенной к внутриклеточной, применения физиологических подходов исследования и проведения дополнительных измерений с нескольких показателей восстановления НСТ , определяющих не только активность СДГЛФ , но и функциональное состояние СДГ по специфическому паттерну - узору характеристик. Благодаря этому выявили несколько уровней функциональной активности СДГЛФ, при разных адренергических состояниях организма.

Впервые у новорожденных крысят выявили гиперактивацию СДГЛФ, по сравнению с взрослыми животными в покое и даже при физиологической активации адреналином.

Впервые показано благоприятное действие лазерного диода модулированной частоты 101 Гц от прибора «Curator - professional», на активность СДГЛФ.

Впервые в группе условно здоровых добровольцев выявлены четыре типа цитобиохимических паттернов взаимодействия ЯНТ с митохондриями, связанных с разным функциональным состоянием СДГ.

Впервые у пациентов с пищевой аллергией и гипертонией выявлены четыре разные типы цитобиохимических паттернов, свидетельствующих о разном функциональном состоянии СДГ, отличающихся от здоровых людей утратой латентного состояния, увеличением амплитуды показателей и активирующим действием ИЗЛ.

Величина амплитуды прогрессивно нарастает при развитии активации и патологии (это явление названо метаболическая гипертрофия) и может служить более чувствительным показателем, чем измерение АД для выявления, развития и эффективности лечения гипертонии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Работа посвящена разработке метода для исследования проблемы участия ЯНТ в энергообеспечении при разных физиологических и патологических состояниях крысы и человека и рекомендации средств оптимизирующих функционирование этого центрального механизма энергообеспечения, поэтому в обзоре литературы будет рассмотрено два вопроса:

• роль янтарной кислоты в энергообеспечении

• анализ традиционных методов исследования митохондриальных функций. Сначала будут рассмотрены вопросы о роли ЯНТ как доминирующего субстрата цикла трикарбоновых кислот при физиологической активации; здесь речь пойдет о взаимодействии между двумя субстратами ЯНТ и КГЛ и катехоламинами адреналином и ацетилхолином (субстратно - гормональные взаимодействия), связывающие метаболизм тканей с симпатической и парасимпатической нервной регуляцией, о сигнальной роли ЯНТ в организме. Будет также рассмотрен вопрос о моделях исследования разных уровней адренергической регуляции (стресс Селье, физиологическая активация малыми дозами адреналина и ЯНТ, гиперактивация у новорожденных, сравнительно со взрослыми. Затем будут рассмотрены методы оценки функциональной активности MX, проанализированы их достоинства и недостатки (гистохимический, биохимический, цитохимический) и важность сохранения структурной организации митохондриальной - ретикулярной сети в исследуемых препаратах. Также будут проанализированы существующие аналоги метода определения СДГЛФ периферической крови по восстановлению тетразолиевых красителей.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Хундерякова, Наталья Васильевна

Выводы

1. Исследована возможность повышения чувствительности традиционного цитохимического метода определения активности СДГЛФ по восстановлению НСТ на мазке к ее изменениям в организме за счет: способа расчета, изменения состава сред, приближенных к внутриклеточным, проведения дополнительных измерений нескольких показателей: эндогенными субстратами, ингибитором активности СДГ малонатом, миллимолярной концентрацией ЯНТ с ИЗЛ. Благодаря этому выявили несколько уровней функциональной активности СДГЛФ, при разных адренергических состояниях организма.

2. Экспериментально обоснованы следующие модификации: поддержание рН 7,2 ± 0,05, характерной для внутри митохондриальной среды вместо 7,4 и исключение хелатора кальция ЭДТА.

3. Обнаружено двойное регуляторное действие ИЗЛ на активность СДГЛФ -значительное снижение гиперактивации и более сильное, чем было известно, устранение ингибирования. Ее добавление позволяет впервые определить не только активность, но и функциональное состояние СДГ.

4. Для новорожденных крысят с естественной гиперактивацией адренэргической регуляции характерна и гиперактивация СДГ по сравнению со взрослыми не только в покое, но и при введении адреналина.

В ходе иммобилизационного стресса крыс, происходит ярко выраженный переход от гиперактивации СДГ к ее ингибированию, особенно отчетливо выявляемый по смене регуляторного действия ИЗЛ от снижения гиперактивности к уменьшению ингибирования.

5. Впервые на группах животных выявлено регуляторное действие прибора лазерной терапии Curator Professional с модулированной частотой 101 Гц на основной процесс энергообеспечения в митохондриях за счет окисления ЯНТ.

6. У здоровых людей обнаружено 4 типа цитобиохимических паттернов свидетельствующих о разном функциональном состоянии СДГЛФ; глубокого покоя, оперативного покоя, активации, активации с ингибированием, включая неизвестное ранее латентное состояние.

7. У пациентов с пищевой аллергией с гипертонией выявлены 4 типа цитобиохимических паттернов: условный покой, гиперактивация и гиперактивация с ингибированием, ингибирование, которые отличаются от здоровых утратой латентного состояния, увеличением амплитуды показателей и активирующим действием ИЗЛ. Развитие гиперактивации СДГ коррелирует с нарастанием артериального давления. Величина амплитуды прогрессивно нарастает при развитии активации и патологии (это явление названо метаболическая гипертрофия) и может служить показателем развития и эффективности лечения гипертонии, чем просто измерение артериального давления.

8. Проведенное исследование подтверждает и усиливает имевшиеся клинические данные о высокой информативности величины активности СДГ как показателя состояния организма.

Научно - практическая значимость

1. Разработанный метод соответствует запросам новых областей медицины-«Митохондриальных болезней» и «Митохондриальной медицины», учитывающих ведущую роль первичных и вторичных повреждений митохондрий в развитии и лечении заболеваний. Он является прямым показателем активности наиболее мощного процесса энергообеспечения в митохондриях - окисления ЯНТ и может служить для диагностики и контроля лечения.

2. Как другие функциональные показатели, этот метод должен быть стандартизован. Учитывая высокую чувствительность цитохимического определения к качеству реактивов, для получения стандартных результатов с нашим участием разработан и запатентован стандартный набор реактивов биохимической квалификации.

3. На основании определения уровня реактивности организма с помощью описанного метода возможно подбирать индивидуальную дозу лекарств и сочетать лекарства с природными регуляторами активности СДГЛФ. В частности, на основании наших результатов представляется перспективным использование ИЗЛ, как метаболита, выраженно нормализующего начальные патологические сдвиги - гиперактивацию СДГЛФ, а также и более глубокие -активировать ингибированную СДГ.

108

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенной работе осуществлена разработка принципиально нового метода определения активности СДГЛФ в митохондриях на основании сочетания преимуществ цитохимического и биохимического методов и исключения их недостатков. Поэтому метод назван цито-БИО-химическим. Он использует восстановление НСТ для определения взаимодействия ЯНТ с митохондриями. Подобно цитохимическим аналогам метод сохраняет структурную организацию митохондрий в клетке благодаря иммобилизации исследуемых клеток - лимфоцитов в мазке крови на стекле. Это представляет значительное преимущество перед биохимическими методами, которые традиционно связаны с сильным разрушением структуры воздействием сахарозы, холода и центрифугирования. С другой стороны, состав среды проведения реакции в биохимических исследованиях значительно более физиологичен. Разработка физиологической среды для цитохимического исследования значительно повышает его чувствительность к изменению физиологического состояния в организме. Важным усовершенствованием определения СДГЛФ разработанным методом является возможность определения дополнительных показателей взаимодействия ЯНТ с митохондриями - участие в окислении эндогенной ЯНТ, выявление регуляции СДГЛФ. Кроме того, на базе этих определений нами предложено более корректное определение величины активности СДГЛФ с учетом показателей пробы без добавления ЯНТ. Таким образом, вместо определения общей активности препарата по восстановлению НСТ по предложенному способу более точно определяется вклад СДГ. Поэтому мы обозначили используемый обычно показатель как «общую» активность СДГ, а более точно определенную как «истинную».

Исследовано применение этого метода для выявления различия физиологического состояния крысы и человека. В результате разработанных усовершенствований впервые выявлен набор состояний СДГЛФ при разных уровнях адренэргической регуляции крысы и человека. Он характеризуется не только единственным показателем - активностью СДГЛФ, определенной к тому же не в оптимальных условиях, а набором нескольких показателей -паттерном или узором. Эти паттерны представляют собой закономерное соотношение нескольких показателей и встречаются среди обследованных неоднократно. По этому признаку можно выделить несколько подгрупп, характерных и для крысы, и для человека. Они перечислены ниже в порядке от покоя для нормы к активности или патологии.

1. Глубокий покой. Латентная (" Спящая") СДГЛФ.

2. Оперативный покой. Латентная ("Спящая") СДГЛФ.

3. Активация. Небольшая активация СДГЛФ.

4. . Гиперактивация. Выраженная активация СДГЛФ. Впервые показано, что ИЗЛ снижает гиперактивность.

5. . Гиперактивация, сдерживаемая ингибированием меньшей или большей степени. Ингибирование выявляется по активации ИЗЛ. Активирующее действие ИЗЛ значительно сильнее, чем наблюдалось ранее.

Состояние полного отсутствия активности СДГЛФ, несмотря на добавление ЯНТ выявлено впервые благодаря тому, что комплексом условий работы с животным и препаратом нам удается сохранить состояние отключения фермента без активации адреналином. Это состояние не является ингибированным, на что показывает отсутствие эффекта активаторов. Оно представляет собой еще не активированное, латентное состояние фермента. Заключения о состоянии СДГЛФ сделано на основании учета дополнительных предложенных нами показателей взаимодействия ЯНТ с митохондриями.

Новым показателем является выявление двойного регуляторного (гомеостазирующего) действия ИЗЛ - снижение гиперактивации и уменьшение ингибирования

Таким образом, впервые можно выявить несколько уровней активности СДГЛФ при разных состояниях организма. Эти уровни отражают различное функциональное состояние фермента. Полученный результат впервые позволяет предложить биохимическую основу физиологического феномена, выразительно определенного А.А.Ухтомским как "послойное вовлечение живого субстрата в деятельность". Это явление показывает, что при нарастании степени (дозы) воздействия все большая часть ткани переходит из состояния покоя в возбуждение. При этом величина внешнего ответа может не отличаться, но на поддержание его тратятся разные усилия. Большие внутренние траты и обусловливают развитие напряжения при совершении внешне одной и той же работы. Эта же закономерность лежит в основе явления разных уровней (или этажей) адаптационных реакций, которые обнаружены JI.X. Гаркави. Она привлекает внимание к тому, что если внешне сходный ответ вызывается только повышенной дозой адреналина или других активаторов, это свидетельствует о более глубоком отклонении состояния организма от нормы к патологии. Такие состояния соответствуют нашим показателям при развитии ингибирования СДГЛФ.

На основании определения уровня реактивности можно подбирать дозу лекарств и сочетать лекарства с природными регуляторами активности СДГЛФ. В частности, на основании наших результатов представляется перспективным использование ИЗЛ, как метаболита, выражено нормализующего начальные патологические сдвиги - гиперактивацию СДГЛФ, а также и более глубокие - активировать ингибированную СДГЛФ.

Таким образом, проведенное исследование подтверждает имевшиеся клинические данные о высокой информативности величины активности СДГЛФ, как показателя состояния организма. Разработанные нами показатели значительно повышают чувствительность этого теста.

На современном этапе участию митохондрий в поддержании физиологического состояния организма и развитии болезней придается ключевое значение. Выделены новые области медицины - митохондриальные болезни и митохондриальная медицина. Как и другие области медицины, они должны иметь свои стандартные показатели. Разработанные нами подходы предлагают создание стандартизованного набора реактивов для определения показателей взаимодействия митохондрий с ЯНТ. При таких условиях можно получать универсальные характеристики физиологического состояния организма, отражающие функциональное состояние наиболее мощного фермента энергообеспечения СДГ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хундерякова, Наталья Васильевна, Пущино

1. Абрамченко А.В. Фармакотерапия преждевременных родов. Изд-во ЭЛБИ СПб, Санкт-Петербург, 2006, с. 116.

2. Аршавский И.А. Физиологические механизмы и закономерности индивидуального развития. М. 1976, с. 270.

3. Аршавский И.А. Некоторые методологические и теоретические аспекты анализа закономерностей индивидуального развития организмов. Вопросы философии. 1986, И, 95-104.

4. Бабский A.M., Кондрашова М.Н., Шостаковская И.В. Действие и последействие адреналина на дыхание митохондрий. Физиол. Журн., 1985, 31, 301 306.

5. Бабский A.M., Стефанкив Ю.С., Кондрашова М.Н., Шостаковская И.В. Субстратно-гормональная система янтарная кислота катехоламины. Новые данные. В кн.: Митохондрии в патологии. (М.Н.Кондрашова, Ю.Г.Каминский, Е.И.Маевский ред.) ОНТИПущино, 2001, 14-21.

6. Базарнова М.А. Активность некоторых ферментов лейкоцитов периферической крови при хроническом гломерулонефрите. Врачебное дело, 1983, 6, 33-35.

7. Баумуратов А.С., Кононов А. В., Ли В.В., Зинченко В.П. Импульсное освобождение АТФ из клеток асцитной карциномы Эрлиха при действии сапонина и ОН". Биологические мембраны, 2004, 21, 1, 46-52.

8. Васин М.В. Ушаков И.Б., Королева Л.В., Антипов В.В. Роль клеточной гипоксии в противолучевом эффекте радиопротекторов. Радиационная биология радиоэкология. 1999, 39. 2-3. 238-248.

9. Вудворд Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. Из-во «Мир» М. 1988, 177-182.

10. З.Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Кузьменко Т.С., Шихлярова А,И.

11. Антистрессовые реакции и активационная терапия. Реакция активации как путь к здоровью через процессы самоорганизации. Часть 1, Екатеринбург. «Филантроп» 2002, с 196.

12. У^.Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Кузьменко Т.С. Антистрессорные реакции и активационная терапия. М. «Имедис».1998. 654 с.

13. Гинецинский А.Г. Физиологические механизмы водно солевого баланса. Москва - Ленинград. 1964, 240-260.б.Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. 1978, 296 с.

14. Гордеева А. В., Звягильская Р.А., Лабас Ю.А., Биохимия, 2003, 68, 10, 1318

15. Дауранов И.Г. Функциональное состояние лейкоцитов у здоровых недоношенных детей и детей с внутричерепной родовой травмой Педиатрия, 1968, 6. 50-52.

16. Р.Дильман В.М., Анисимов В.Н., Кондрашова М.Н. Влияние янтарной и глутаминовой кислот на чувствительность гипоталамо-гонадотропной системы к ингибирующему действию эстрогенов у старых крыс. Фармакология и токсикология 1976, 3, 540.

17. Зарецкая Ю.М. Энзиматический тест, как вид иммунологического мониторинга кризисов отторжения. Клиническая гшмуногенетика. Медицина. 1983, 163-164.

18. Кребс Г., Корнберг Г. Превращение энергии в живой материи. М., 1959.

19. Кондрашова М.Н. Биохимический цикл возбуждения. Митохондрии, 1968, Наука, М., 122-131.

20. Кондрашова М.Н. Накопление и использование янтарной кислоты в митохондриях. Митохондрии, 1972, Наука, М, 151-169.

21. Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В. Проявления стресса на уровне митохондрий, их стимуляция гормонами и регуляция гидроаэроионами. Журнал общей билогии, 1985, 4, 516-526.

22. Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В. Бабский A.M., Хазанов В.А. Гомеостазирование физиологических функций на уровне митохондрий. Наука. Новосибирск 1987, 40-63.

23. Кондрашова М.Н. Структурно-кинетическая организация цикла трикарбоновых кислот при активном функционировании ткани. Биофизика, 1989, 34, 3, 450-458.

24. Кондрашова М.Н. Взаимодействие процессов переаминирования и окисления. Биохимия 1991, 56, 388-406.

25. Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В., Хижняк Е.П. Теплопродукция в митохондриях при окислении разных субстратов. Биофизика, 1988, 33, 3, 527-528.

26. Кондрашова M.H. Гормоноподобное действие янтарной кислоты. Вопр.Биол. Мед.Фармац. Химии 2002.1, 7-12.

27. Кондрашова М.Н. Субстратно-гормональная система регуляции физиологического состояния. Условия ее выявления. Использование в практике. Горизонты биофизики. ОНТИНЦБИ., Пущшо, 2003, 147-154.

28. Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В. Проявления стресса на уровне митохондрий, их стимуляция гормонами и регуляция гидроаэроионами. Журнал общей билогии, 1985, 4, 516-526.

29. Кондрашова М.Н., Бабский A.M. Изменение стимуляции дыхания адреналином в зависимости от дозы. Укр. Биох. Журн. 1986, 58, 6, 49-54.

30. Кондрашова М.Н. Взаимодействие метаболической и гормональной регуляции (биоэнергетические аспекты) В сб. Регуляторы энергетического обмена (В.А.Хазанов ред.) IX-ый Российский Национальный конгресс «Человек и лекарство», 2002, с. 16-25.

31. Клиническая цитохимия /Под ред. Ягоды А.В., Локтев Н.А., Ставрополь -2005, 485.

32. Кулинский В.И. Кунцевич А.К., Труфанова Л.В. Активация дегидрирования сукцината в печени крыс под влиянием норадреналина, цАМФ и острого охлаждения. Бюл. Эксп. Биол. Мед. 1981, №8, 33-34.

33. Курганов Б.И., Любарев А.Е. Принципы организации и функционирования микрокомпартмента метабол она. Биохимия, 1989, 54, 5, 183-191.

34. Крыжановский Г.Н. Дизрегуляционная патология. М., 2002, 96.

35. Поборский А.Н. Особенности вегетативной регуляции и цитохимического статуса лимфоцитов у детей перед началом обучения в школе. Физиология человека. 2007, 33, 1, 55-62.

36. Лецкий В.Б. Цитохимичская характеристика лейкоцитов в норме, при опухолевых и не опухолевых заболеваниях; автореф. д-ра. мед. наук. В.Б. Лецкого. Л. 1979. 45 с

37. Ленинджер А., Биохимия, пер. с англ., М., 1974.

38. Лойда 3. Госсрау Р., Шиблер Т. /В кн. под. ред. Н.Т. Райхлина. «Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Москва. 1982,211-213.

39. Локтев Н.А. Основы количественной гистохимии. Ставрополь, 1999, 128с.

40. Любарев А.Е., Курганов Б.И. Надмолекулярная организация ферментов цикла трикарбоновых кислот. Молекулярная биология 1987, 21, 5, 1286 -1296.

41. Маевский Е.И., Розенфельд А.С., Гришина Е.В., Кондрашова М.Н. Коррекция метаболического ацидоза путем поддержания функций митохондрий. ОНТИITyufUHo. 2001.

42. Наточин Ю.В. Ионрегулирующая функция почки. Ленинград: Наука. -1976.

43. Нарциссов Р.П. Применение п нитротетразолия фиолетового для количественной цитохимии дегидрогеназ лимфоцитов человека. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1969, LVI, 5,. 85 -91.

44. Нарциссов Р.П. Цитохимия ферментов лейкоцитов в педиатрии. Дисс. Докт. Мед. Наук. М., 1970, с. 378.

45. Нарциссов Р.П. Прогностические возможности клинической цитохимии. Сов. Педиатрия. М., 1984, 267-275.5 7. Нарциссов Р.П. Митохондриальные болезни. Взгляд цитохимика. НЦЗД РАМН. 1999, с 51.

46. Петричук С.В., Шищенко В.М., Духова З.Н., Измайлова Т.Д., Семенова П.Ф., Писарева И.В., Поляков С.Д., Корнеева И.Т. Диагностические и прогностические возможности клинической цитохимии. Москва, 2005.

47. Пирс Э. Гистохимия. Теоретическая и прикладная. Под ред. Португалова В.В., М. 1962, 844 845.

48. Регуляторы энергетического обмена. Клинико-фармакологические аспекты. Материалы симпозиумов на ГХ, X, XI, XII, XIII Российском Национальном конгрессе «Человек и Лекарство». В.А.Хазанов ред., Москва, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006.

49. Саакян И.Р. Вопросы медицинской химии,-1998, 44, 2, 151-157.

50. Соколов. В.В., Нарциссов Р.П., Иванова Л.А., Цитохимия ферментов в профпатологии. Москва « Медицина» 1975, 119.

51. Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. М., 1960, 3-17.

52. Сухоруков B.C., Ростовская В.В., Вишневский Е.Л. Показатели энергетической дисфункции почечной лоханки и мочеточника у детей с гидронефротической трансформацией. В сб. «Митохондрии в Саакян И.Р.,

53. Сухоруков B.C. Гистологический анализ митохондриальных нарушений у человека. Сборник трудов Всерос.научн.конф. «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы», М., 2003, Изд-во РУДН, 177-181.

54. Тихонов В.П., Цветков В.Д., Литвинова Е.Г., Сирота Т.В., Кондрашова М.Н. Генерация отрицательных аэроионов растениниями при импульсной электрической стимуляции через почву. Физиология растений, 2004, 51 (3), 459-465.

55. Лукьянова Л. Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции. Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1997, 124, 9, 244-254.

56. Лукьянова Л. Д. Современные проблемы гипоксии. Вестник РАМН. 2000, 2, 3-11.

57. Литвицкий П.Ф. Патофизиология для мед. вузов в 2-х томах. 2002, ГЭОТАР., Медицина.

58. Скулачев В.П. Кислород и явления запрограммированной смерти. Первое Северинское чтение. Рос. биохим. общество, Москва, 2000.

59. Шостаковская И.В., Долиба Н.М., Бабский A.M., Кондрашова М.Н. Активация ацетилхолином окисления альфа-кетоглутарата в митохондриях печени. Укр. Биох. Журн., 1986, 58, 6, 54-61.

60. Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. (М.Н.Кондрашова, Ю.Г.Каминский, Е.И.Маевский ред.) ОНТИ Пущино, 1997.

61. Altman, F.P. Tetrazolium salt and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 1976, 9, 3, 1-56.

62. Asada K. Causes of Photo oxidative Stress and Amelioration of Defense Systems in Plants, Eds: С. H. Foyer, P. M. Mullineaux, Boca Raton, CRC Press, 1994, 77-104.

63. Banaclocha M. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in age-related mitochondrial neurodegenerative diseases. Med. Hypotheses. 2001, Apr., 56(4), 472-7.

64. Bonomi F., Pagani S., Cerletti P., Giori C. Modification of the thermodinamic properties of the electron transferring groups in mitochondrial succinate dehydrogenase upon binding of succinate. Eur. J. Biochem., 1983, 134, 439.

65. Beyer R.E. The participation of coenzyme Q in free radical production and antioxidation. Free Radic Biol Med. 1990;8, 6, 545-65.

66. Chance В., Hollunger G. The interaction of energy and electron transfer reactions in mitochondria. J.Biol.Chem., 1961, 236, 1453-1584.

67. Coleman P.S. in Chemical Carcinogenesis 2. (Columbano, A., ed.), Plenum Press, N.Y., 1991, 265 288.

68. Cohen BH, Gold DR. Mitochondrial cytopathy in adults: what we know so far. Cleve Clin J Med. 2001 Jul; 68(7):625-6, 629-42. Erratum in: Cleve Clin J Med 2001. Sep; 68(9):746.

69. Dogan M.D. Central angoitensin II increases biosynthesis of tyrosine hydroxylase in the rat adrenal medulla. Bioch. Bioph. Res. Comm. 2004, 313 -623.

70. Di Mauro S, Mendell J.R., Sahenk Z., Bachman D., Scarpa A., Scofield R.M., Reiner C. Fatal infantile mitochondrial myopathy and renal dysfunction due to cytochrome-c-oxidase deficiency Neurology. 1980 Aug, 30(8), 795-804

71. Fahien L.A. Kmiotek S.H. McDonald MJ. J. Biol.Chem. 1988, 263, 22, 10687-10697.

72. Jezova M. Angiotensin II AT and AT2 receptors Contribute to maintain basal adrenomedullary norepinephrine synthesis and tyrosine hydroxylase transcription. Endocrinology 2005, 144, 2092.

73. Hansford RG, Tsuchiya N, Pepe S. Mitochondria in heart ischaemia and aging. Biochem Soc Symp. 1999, 66:141-7.

74. He W., Mlao F., Lin D., Schwandner R.T., Wang Z., Gao J., Chen J-L., Tlan H., Ling L. Citric acid cycle intermediates as ligands for orphan G-protein-coupled receptors. Nature, 2004, 429, 188-193.

75. P5.Hesketh T. R., Moore J.P. Morris J. D. H., Taylor M. V., Rogers J., Smith G., Metcalfe J. C. A common seguence of calcium and pH signals in the mitogenic stimulation of eukaryotic cells. Nature. 1985. 313. 481-484.

76. Grinstein S., Goetz J.D. Control of free cytoplasmic calcium by intracellular pH in rat lymphocytes.Biochim Biophys Acta. 1985 Oct 10;819(2):267-70.

77. Guneral, F. and Bachmann, C. Age-Related referece values for urinary organic acids in a healthy Turkish pediatric population. Clin Chem., 1994, 40, 862 -868.

78. Geiszt, M. Cardiovasc. Res, 2006, 71 (2), 289-293.

79. Kazakof, R.E., Litvinova, E.G., Venediktova, N.I., and Kondrashova, M.N. (2006) Bioch. Bioph. Acta. Suppl., 14, P 2.2.19.

80. Kondrashova M.N. Biochemical cycle of excitation. InrBiological and Biochemical Oscillators. Academic Press, New York-London, B. Chance Editor, 1973, 373-389.

81. Kondrashova M.N., Grigorenko E.V., Kosenko E.A. Rapid cycle of substrate oxidation under activation of energy metabolism. The 5th EBEC, 1988, Aberysthwith, 287.

82. Kondrashova M.N., Gogvadze V.G., Babsky A.M. Succinic acid as the only1 Q |energy support of intesive Ca uptake by mitochondria. Bioch. Bioph. Res. Comm. 1982, 109, 2, 376-381.

83. Kondrashova M.N., Doliba N.M. Polarographic observation of substrate-level phosphorylation and its stimulation by acetylcholine. FEBS Lett 1989, 243, 153-155.

84. Kondrashova M.N., Kuznetzova G.D. Succinic acid as a physiological signal molecule. Manchester University Press, Manchester, New York, 1991, 295.

85. Kondrashova M.N. Mechanisms of physiological activity and curative effect of small doses of succinic(amber) acid. Eur.J.Med.Res. 2000, 5, 28.

86. Kondrashova M.N. Perspective of medical treatment with amber (succinic) acid in homeopathic doses. Mitochondrion 2002, 1, 522.

87. Kondrashov F.A., Koonin E.V., Morgunov I.G., Finogenova T.V., and Kondrashova M.N. 2006, Biology Direct, 1, 31 (http://www.biology-direct.com/content/1/1/3 П.

88. Luft R. The development of mitochondrial medicine. Proc. Natl Acad. Sci., USA. 1994 Sep., 13, 91(19), 8731-8.

89. Lehninger. Principles of biochemistry. David L. Nelson., M.M. Cox. Worth publishers.2000.

90. Maevsky E.I., Guzar I.B., Rosenfeld A.S., Kondrashova M.N. Doesn't succinic acid mediate adrenaline stimulation in mitochondria? EBEC Reports. LBTM-CNRS, Lyon. 2, 1982, 537.

91. Maevsky E.I., Rosenfeld A.S., Peskov A.B., Kondrashova M.N. Signal, sympathetic action of succinate in experimental and clinical studies. BBA, Suppl.v.14, 14thEBEC Short Reports, 2006, 536-537.

92. Morgunov, I.G., Kondrashova, M.N., Kamzolova, S.V., Sokolov, A.P., Fedotcheva, N.I., and Finogenova, T.V. Evidence of the glioxylate cycle in the liver of newborn rats. Med Sci Monit., 2005, 11, 57 60.

93. Muller, H., Kondrashova, M.N. Quantenmedizin melodishes licht gegen alterungund Zellschadigung. 2006, Raum/Zeit, 143, 75-77.

94. Nachlas M.M., Tsou K.C., De Souza E., Cheng C.S., and Seligman A.M. Cytochemical demonstration of Succinic dehydrogenase by the use of a new p-nitrophenil substituted ditetrazole. J. Histochem. Cytochem., 1957, 5(4), 42036.

95. Nachlas M.M., Walker D.G., Seligman A.M. J. Biophys. Bioche. Cytol., 1958, 4, 29-38.

96. Quaglino, D and Hayhoe, F.G. J. Acetone fixation for the cytochemical demonstration of dehydrogenasee in blood and bone marrow cells. // Nature. 1960, Jul 2; 187:85-6

97. Park J. B, Exp. Mol. Med. 2003, 35 (5), 1563.

98. Popov, V.N., Igamberdiev,A.U., Schnarrenberger, C., and Volvenkin, S.V. FEBS Lett., 1996, 390, 258 60.

99. Pollard P.J., Wortham N.C., Tomlinson I.PM. The TCA cycle and tumorogenesis:the examples of fumarate hydratase and succinate dehydrogenase. Ann Medicine, 2003, 35, 632-639.

100. Pouyssegur J., Franchi A.L., Allemain G., Paris S. Cytoplasmic pH, a key determinant of growth factor- induced DNA synthesis in guiescent fibroblasts // FEBS Lett. 1985. V. 190, 115-119.

101. Pouyssegur J., Sardet C., Franchi C., L Allemain G., Paris S. A specific mutation adolishing Na/ H antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH // Proc.Nat. Acad. Sci. USA. 1984, 81. 4833 -4837.

102. Pepe S. Mitochondrial function in ischaemia and reperfusion of the ageing heart. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2000 Sep., 27(9), 745-50.

103. Rustin P., Munnich A., Rotig A., Succinate dehydrogenase and human diseases: new insights into a well-known enzyme. Eur. J. Human Genetics, 2002, 10, 289-291.

104. Samokhvalov V.N., Ignatov V.A, Kondrashova M.N. Inhibition of Krebs cycle and activation of glyoxylate cycle in the course of chronological aging of Saccharomyces cerevisiae. Compensatory role of succinate oxidation. Biochimie. 2004, 86, 39-46.

105. Sastre J, Pallardo FV, Vina J. Mitochondrial oxidative stress plays a key role in aging and apoptosis. IUBMB Life. 2000, May; 49(5), 427-35.

106. Sinhorin V.D.G., Roehrs C., Pasin J.S.M., Belle N.A.V., Rubin M.A., Mello C.F.,. Succinate causes oxidative damage through N-methyl-D- aspartate-mediated mechanisms. Brain Res., 2005, 1051, 66-71.

107. Sivaramakrishnan S., Ramasarma T. Activation of succinate dehyrogenase in brown adipose tissue mitochondria. Indian Jornal of Biochemistry biophysics, February 1978, 15. 14-18.

108. Sivaramakrishnan S., Ramasarma T. Noradrenaline stimulates succinate dehudrogenase through (3 adrenergic receptors. Indian Jornal of Biochemistry biophysics. February 1983. V. 20. 16-22.

109. Sivaramakrishnan S., Panini S. R., Ramasarma T. Activation of succinate dehydrogenase in isolated mitochondria by noradrenaline. Indian Jornal of Biochemistry biophysics. February. 1983. V. 20. P. 23-28.

110. Singer T.P., Kearney E.B., Kenney W.C. Succinate dehydrogenase, в кн.: Advances in Enzymology and related subjects of biochemistry, N. Y., 1973, 37.

111. Srere P.A. in; Organized multienzyme systems: catalytic properties/ Welch G.R., ed. N.Y., Acad.Press, 1985, 89 127.

112. Sugrue M., Tatton W. Mitochondrial membrane potential in aging cells. Biol Signals Recept. 2001 May-Aug., 10(3-4), 176-88.

113. Turrens J.F. Superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Bioscience Reports, 1997, 17, 1,3-8.

114. Ward D.S, Evenson K.R, Vaughn A., Rodgers A.B., Troiano R.P. Accelerometer use in physical activity: best practices and research recommendations. Med Sci Sports Exerc. 2005,Nov, 37(11 Suppl), 582-8.

115. Wojtczak A.B. Inhibitory action of oxalacetate on succinate oxidation in rat liver mitochondria and the mechanism of its reversal. Bioch.Biophys. Acta, 1969. 172, 1, 52-65.1201. Благодарности.

116. Выражаю глубокую признательность д.м.н. проф. Зав. лаб. Евгению Ильичу Маевскому за консультации по вопросам статистики, весьма ценные советы по нестандартным методам оценки результатов.

117. Выражаю благодарность за помощь в экспериментальной работе с животными, работе с видео микроскопией, при компьютерной обработке видеоизображений сотрудникам нашей лаборатории Марине Владимировне Захарченко и Андрею Владимировичу Захарченко.

118. Глубоко признательна сотрудникам института микробиологии (ИБФМ) г. Пущино к.б.н. Игорю Григорьевичу Моргунову за ценное обсуждение функционирования глиоксилатного цикла у новорожденных и д.б.н. проф.

119. Татьяне Васильевне Финогеновой автору природного препарата изолимонной кислоты, за любезно предоставленную ИЗЛ для исследований.

120. Хочу выразить особую благодарность Директору завода «Диод» Владимиру Петровичу Тихонову за многолетнюю финансовую поддержку нашей лаборатории, которая была очень необходима при проведении этой работы.

121. Сердечная благодарность моей семье супругу Хундерякову Александру Евгеньевичу и маме Бутяновой Розе Алексеевне за всестороннюю помощь.