Сохранение митохондриальной сети как основы для исследований участия митохондрий в физиологической регуляции

Захарченко, Марина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сохранение митохондриальной сети как основы для исследований участия митохондрий в физиологической регуляции
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Сохранение митохондриальной сети как основы для исследований участия митохондрий в физиологической регуляции"

005018022

На правах рукописи

Захарченко Марина Владимировна

СОХРАНЕНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ СЕТИ КАК ОСНОВЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ УЧАСТИЯ МИТОХОНДРИЙ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ

03.03.01 - ФИЗИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 ДПР 2012

Пущино - 2012

005018022

Работа выполнена в лаборатории энергетики биологических систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г.Пущино

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Кондрашова Мария Николаевна

доктор биологических наук, профессор Миронова Галина Дмитриевна (зав. лаб. митохондриального транспорта ИТЭБ РАН, Пущино)

доктор биологических наук, профессор Розенфельд Александр Семенович (зав. лаб. функциональной диагностики каф. спортивных дисциплин РГППУ, Екатеринбург)

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино

Защита состоится «25» апреля 2012 в 1330 на заседании совета Д002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино Московской > области, ул. Институтская,3, ИТЭБ РАН ' '

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан » марта 2012

Ученый секретарь ^

диссертационного совета, С?

кандидат физ.-мат.наук " Ч Н.Ф.Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Актуальной задачей современной физиологии и фундаментальной медицины является выяснение участия митохондрий (MX) в определении физиологического состояния организма, выявлении различий между нормой и патологией по реакциям MX. Сложились такие пограничные между биохимией, физиологией и медициной области знания как Митохондриальная физиология, Митохондриальные болезни, Митохондриальная медицина. Они базируются на понимании того, что нарушения митохондриальных процессов лежат в основе развития патологических изменений в организме. Однако это установлено в исследованиях сильно выраженных патологий, в том числе, обусловленных генетическими нарушениями. В настоящее время наиболее актуальной задачей является выявление ранних дисфункций MX, предшествующих клиническим проявлениям болезни и гораздо легче поддающихся нормализации или позволяющих вовремя устранить причину болезни. Они плохо обнаруживаются в принятых условиях исследования изолированных митохондрий. Тем более использование для этой цели биоптатов тканей от больных не оправдано для широких исследований и ввиду травматичное™ для человека, и ввиду грубого повреждения митохондрий, маскирующего функциональные изменения, что и было предметом нашего исследования.

Связь структурных изменений и функции макромолекул на микроскопическом уровне была ведущей идеей в исследованиях основателя Института Биологической Физики, Г.М. Франка. Еще в 60-е г. работами А.Л. Шабадаша, проводившимися в Московском Институте Биофизики, родоначальнике Института Биофизики в Пущино, было показано, что структура митохондрий претерпевает цикл изменений в клетке «отдельные бусинки - цепь бусинок - плотный точечный шар» при различных функциональных состояниях клетки (Шабадаш, 1968). В настоящее время установлено, что MX в клетках объединены в динамичную сеть с участием эндоплазматического ретикулума - митохондриально-ретикулярную сеть (MPC); структурные изменения MPC связаны с физиологическими условиями и метаболическим состоянием MX (Bereiter-Hahn and Voth, 1994; van der Bliek, 2009). Достигнуты большие успехи в выяснении механизмов организации этой сети, осуществляющейся двумя противоположными процессами - деления и слияния MX (Hoppins et al., 2007; Palmer et al., 2011).Процессы слияния и деления MX включены в разные виды жизнедеятельности клетки: эмбриональное развитие, дыхание, кальциевая сигнализация, активность нейронов, апоптоз и др. (Chan, 2006; Suen et al.,

2008). Таким образом, взаимосвязь структурной организации и функции MPC становится очевидной.

Биофизический подход помог нам увидеть недостаток принятых биохимических методов изучения выделенных MX, состоящий в разрушении MPC и поставить задачу максимально возможного сохранения ее в исследованиях ex vivo для более полного наблюдения физиологической регуляции, осуществляющейся в организме. Это было осуществлено на основании сочетания традиционного цитохимического метода изучении MX в лимфоцитах на мазке крови с современными и улучшенными разработками состава сред в биохимических исследованиях. Разработанный метод был назван цитобиохимическим (ЦБХ).

Фундаментальным открытием в области физиологической регуляции было выявление связи системы висцеральной регуляции, состоящей из двух реципрокных частей - адренергической и холинергической, с митохондриальными процессами через окисление только двух субстратов: янтарной кислоты (ЯНТ) и а-кетоглутарата (КГЛ) и их дегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназу (СДГ) и а-кетоглутаратдегидрогеназу (КДГ) (Бабский и др., 2001; Кондрашова и др., 2003). Согласно этим представлениям окисление ЯНТ осуществляет энергообеспечение при активности тканей, а окисление КГЛ - в состоянии восстановления после деятельности. Эти представления были обоснованы исследованиями на организме (Maevsky et al., 1982; Кондрашова и Бабский, 1986) а также опытами на выделенных MX (Кондрашова и Долиба, 1989; Долиба и др., 2001; Шостаковская и др., 1986).Опыты на организме показали, что субстраты обладают сильным регуляторным действием в организме, причем в концентрациях много меньше тех, которые необходимы для обеспечения митохондрий субстратом (Maevsky et al., 1982; Маевский и др., 2001; Бабский и др., 2001; Кондрашова, 2002). Это привело к предположению, что механизм физиологической активности ЯНТ и КГЛ является сигнальным. Такое представление было поддержано независимым открытием специфических рецепторов именно только для этих двух субстратов (Не et al., 2004).

Цели и задачи диссертационной работы.

Целью работы была разработка методов исследования MX, сохраняющих организацию MX, через которую осуществляется физиологическая регуляция, удовлетворяющих запросы диагностики. Использование разработанных методов для исследования различных физиологических состояний организма, выявляющего баланс симпатической и парасимпатической регуляции в организме.

Задачи исследования: 1. Исследование возможности сохранения нативной MPC в гомогенате печени крысы при биохимических исследованиях.

1.1. Изучить влияние компонентов среды и условий выделения на организацию MX в гомогенате печени крысы;

1.2. Изучить влияние веществ, используемых в полярографических исследованиях на организацию MX в гомогенате печени крысы;

2. Исследовать изменения MPC и дыхания MX при изменениях физиологического состояния, вызванного ИС различной продолжительности;

3. Исследование возможности сохранения нативной MPC в лимфоцитах, иммобилизованных на стекле при их исследовании цитобиохимическим методом;

3.1. Определить сохранность MPC в лимфоцитах на мазке крови;

3.2. Оптимизировать состав среды инкубации для сохранения состояния покоя MX в лимфоцитах на мазке крови при измерении их активности;

4. Определить чувствительность цитобиохимического метода к изменениям физиологического состояния организма на моделях стресса различной интенсивности;

4.1. Исследовать ответы СДГ и КДГ при повышении адренергической регуляции в организме в ответ на тяжелые формы стресса;

4.2. Для выявления возможностей ранней (доклинической) диагностики патологических состояний исследовать чувствительность разработанного метода на мягких моделях стресса;

4.3. Исследовать изменения активности СДГ в ответ на введение ЯНТ как синергиста АДР;

4.4. Исследовать ответ СДГ и КДГ на стрессовые воздействия в зависимости от исходного физиологического состояния.

Научная новизна.

Впервые показано, что под воздействием условий, создаваемых в полярографической ячейке для исследования дыхания MX, происходит разрушение MPC. Это является причиной, которая ослабляет или делает невозможным наблюдение на выделенных препаратах физиологических изменений дыхания MX.

Благодаря использованию метода, сохраняющего для исследований нативную сеть MX, получены новые экспериментальные доказательства существования связи активности адренергической системы с сукцинатдегидрогеназой, окисляющей янтарную кислоту, а холинэргической регуляции с а-кетоглутаратдегидрогеназой, окисляющей а-кетоглутаровую кислоту.

Выявленные изменения митохондриальных процессов на разработанной модели перехода от физиологического напряжения, вызывающего усиление адаптационных реакций, к предпатологии, связанной с возникновением повреждений

метаболизма, позволяют впервые описать механизм перехода от стимулирующего действия нагрузок к повреждающему.

Практическая ценность.

Работа имеет фундаментальную и практическую значимость как принципиально новый, высокочувствительный к изменениям в организме диагностико-информативный способ измерения баланса симпатической — парасимпатической систем по измерению активностей СДГ И КДГ в лимфоцитах крови.

Эта разработка остро востребована в медицине для ранней диагностики доклинических нарушений физиологического состояния.

Дополнительным преимуществом предлагаемого метода является то, что работа проводится в капле крови на мазке, что позволяет широко применять метод в клинике в отличие от обычных способов, требующих взятия биоптата ткани.

На основе понимания биохимических механизмов предпатологических изменений могут быть предложены новые способы диагностики состояний организма, а также усиления адаптации и коррекции ее нарушений путем использования природных веществ, в частности метаболитов митохондрий.

Апробация. Основные положения диссертации докладывались на8-й международной конференции «Митохондриальная физиология» ("MIP", Бордо, Франция, 2011); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005, 2007, 2009, 2011), Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы стресса» (Витебск, 2011), YIII и IX съездах Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2008, 2010), III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии (Москва, 2010), 16-ми 14-м Европейских конференциях по Биоэнергетике (ЕВЕС, Варшава, Польша, 2010, Москва, 2006) и др.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано более 24 печатных работ, из них 1 патент и 8статей.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения. Работа изложена на 135 страницах, содержит 5 таблиц и 29 рисунков. Список литературы включает 210 источников отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовали самцов крыс линии Вистар разведения вивария ИТЭБ РАН. В большинстве опытов использованы половозрелые крысы - возраст 2 мес. При выявлении соотношения изменений активности СДГ и КДГ использованы неполовозрелые крысы возрастом 1,5 мес.

Проводились исследования на крысах в разном физиологическом состоянии: 1) интактные в состоянии физиологического покоя; 2) после введения различных доз адреналина - 25мкг, 50 мкг /100 г веса, внутрибрюшинно, за 30 мин до декапитации; 3) после иммобилизационного стресса двух видов: грубого, с фиксацией животных за лапы и резцы в положении на животе(ИС), и мягкого, психоэмоционального стресса (ПЭС), вызванного помещением животного в пенал с ограничением движения без боли, продолжительностью 30, 60, 120, 180 мин и 24 часа. Животных усыпляли в герметичной камере, предварительно заполненной углекислым газом. После этого декапитировали, и, слив первые капли крови, забирали кровь для исследований и извлекали печень и тимус.

Отдельные эксперименты проводились на двух кроликах-самцах породы Шиншилла разведения вивария ИТЭБ РАН. Возраст - 4 месяца; вес 3,7 и 4,5 кг. Каплю крови для мазков брали из ушной вены до и через 30 мин после введения в ушную вену адреналина 10 мкг/кг веса или ЯНТ 20 мг/кг per os.

Видеомикроскопические измерения гомогената печени крыс. Гомогенат печени крысы получали в среде KCl (125 мМ KCl (Sigma), 10 мМ Hepes (Sigma), pH 7,2). Контрольные и опытные пробы гомогената (1 мл) хранили в термостатируемых ячейках при 2 °С или 12 °С. Для видеомикроскопических измерений 30 мкл гомогената добавляли к 1 мл той же среды выделения, перемешивали при стандартной скорости в течение 5 мин, помещали в камеру Нейбауэра и микроскопировали с применением техники темного поля. Полученные изображения подвергались количественному морфометрическому анализу с помощью программы Image Tool, версия 2

Цитобиохимические исследования лимфоцитов в мазке крови. На предметные одноразовые стекла фирмы 'Menzel - Glaser" (Germany) наносили по 5 мкл крови и делали тонкие мазки. Фиксация. Свежеприготовленные тонкие мазки крови фиксировали в течение 30 сек. 60% ацетоном (ОСЧ 9-5, Химмед Москва) при комнатной температуре. Затем ополаскивали дистиллированной водой и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Проведение реакции восстановления нитросинего тетразолия (HCT). Реакцию восстановления проводили на мазках в цитобиохимической среде с разными добавками при инкубации в течение 1 часа при 37°С, pH - 7,2 ± 0,05. Основная среда инкубации содержит 125 мМ KCl (Sigma), 10 мМ HEPES, 1,22 мМ нитросинего тетразолия хлорида (Dudley Chemical Corporation).

Добавки к основной среде:

1. без добавок - для определения уровня эндогенных субстратов (ЭС)

2. малонат (МАЛ) 5 мМ - для определения вклада эндогенной ЯНТ (ЭЯНТ)

3. ЯНТ 5 мМ - для определения активности СДГ

4. КГЛ 5 мМ + МАЛ 5 мМ + НАД 0,5 мМ. - для определения активности КДГ

После инкубации мазки промывали дистиллированной водой, докрашивали ядра нейтральным красным 0,5% (чда) в течение 8 мин, снова промывали дистиллированной водой.

Микроскопирование. Мазки после развития окраски HCT микроскопировали под масляной иммерсией на микроскопе Микмед-2 («Ломо», Россия), при увеличении 6,3 х 100/1,30, соединенном с видеокамерой MINTRON CCD MTV-1 802 СВ («Кандела», Россия). Из мазков крови под микроскопом выбирали 30 лимфоцитов и подвергали количественному морфометрическому анализу с помощью программы Image Tool, версия 2 (The University of Texas Health Science Centerin San Antonio, США).

Активность фермента в клетках автоматически определяли как площадь продукта реакции - формазана, интенсивность которой превышала по оптической плотности определенный фоновый уровень. В градациях уровня плотности серого цвета от 0 (черный цвет) до 255 (белый цвет) выбирался уровень, равный 150.

Окраска родамином 123. Мазки крови, зафиксированные в ацетоне (как описано выше) инкубировали в основной среде инкубации (125 мМ KCl, 10 мМ HEPES), содержащей 5 мМ ЯНТ и флуоресцентный краситель родамин 123 (10 мкг/мл) в течение 10 мин при 37 °С. После этого мазки исследовали под микроскопом Leica DMI 6000CS, оборудованном конфокальной системой Leica TCSSP5. Длины волны возбуждения и эмиссии - 488 нм и 520 нм соответственно. Работа проводилась совместно с В.А.Яшиным (ИБК).

Электронная микроскопиям последующая трехмерная реконструкция ультратонких серийных срезов гомогената печени крысы проводились совместно с д.б.н. В.И. Поповым (ИБК РАН) и A.B. Темновым по Popov et al., 2005.

Полярографические исследования. Дыхание митохондрий измеряли полярографическим методом с помощью закрытого платинового электрода Кларка в термостатируемой (26°С) кювете объемом 1 мл при постоянной фиксированной скорости перемешивания. Среда инкубации содержала: 125 мМ KCl, 10 мМ HEPES-КОН, pH 7.2, 2 мМ КН2Р04. В кювету вносили 50 мкл гомогената. Работа проведена совместно с к.б.н. Н.И.Федотчевой.

Статистика

Статистический анализ проводили по /-критерию Стьюдента в программах Excell и Статистика вер.4.03.

Важным достоинством метода, проводимого путем компьютерного морфометрического анализа окрашенных объектов в 30 лимфоцитах является высокая статистическая достоверность каждой отдельной величины. Число окрашенных объектов п составляет от 250-350 для проб со средней активностью до 600-700 для проб с высокой активностью и порядка 100 для проб с низкой активностью. Поэтому, благодаря большому объему выборки, результаты, представленные отдельно для каждого индивидуума в виде средних значений площади окрашенных объектов (М) в каждой пробе, являются статистически достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.Исследование митохондрий в концентрированном гомогенате

При исследовании физиологической регуляции функций МХ в организме важно использовать метод получения тканевого препарата, который максимально возможно сохраняет нативное состояние органелл в организме. Основываясь на предыдущих исследованиях М.Н.Кондрашовой (КоМгаБЬоуа е1 а1., 2001), для проведения I биохимических исследований и изучения ключевых функций МХ был разработан протокол получения МХ в концентрированном гомогенате печени крысы. В отличие от стандартного выделения МХ, в разработанных условиях (КС1 используется вместо сахарозы, слабое разведение ткани, и температура 12°С вместо 0°С) в гомогенате ткани сохраняются ансамбли МХ с ЭР - блоки сети (рис.1 А), что было подтверждено методом 3-хмерной реконструкции серийных срезов электронно-микроскопических изображений (рис. 1Б).

Рисунок. 1.Ансамбли

Методом микроскопии в темном поле было показано, что МХ в концентрированном гомогенате сохраняют способность к самоорганизации -спонтанному формированию в процессе хранения более крупных трехмерных структур, что можно рассматривать как восстановление нативной сети.

1.1 Изучение факторов среды выделения, влияющих на ассоциацию митохондрий.

Влияние сахарозы. Среда на основе сахарозы незаменима для выделения изолированных МХ и исследования биохимических функций. С помощью установки для морфометрического исследования ансамблей МХ можно не только показать сам факт деструктивного действия сахарозы, но и количественно оценить этот процесс. На рис. 2 показано проявление деструктивного действия сахарозы на MPC: помещение препарата всего на 1 минуту в среду, содержащую 0,25 M сахарозу, приводит к распаду ансамблей и уменьшении их средней площади на 30%, 2 мин - более чем в 3,5

MPC в гомогенате печени крысы. А-микроскопия в темном поле. Б - 3-хмерная реконструкция серийных срезов электронно-микроскопических фотографий, светлые - МХ, темный - ЭР.

S. 50

2 S 40

£ 30

i 20

1 10

Перемешивание s KCl. 5 мин

Перемешивание 8 сахарозе, 1 мин 2 мин 5 мин

Рисунок 2.Разрушающее действие сахарозы на MPC. 30 мкл густого гомогената (1:1), приготовленного в среде KCl, перемешивали 5 мин в 970 мкл среды KCl (контроль) или в среде на основе сахарозы (0,25 М) в течение 1, 2 или 5 минут. M ± SEM, п=4, * - р< 0,05, ** - р < 0,001 относительно контроля.

отдельные гранулы. При этом полностью прекращается

раза, а через 5 мин нахождения в среде с сахарозой ансамбли

практически полностью рассыпаются на отдельные МХ - их средняя площадь уменьшается в 5 раз!

Влияние концентрации гомогената на самосборку фрагментов сети.

Было также показано, обычно используемое сильное разведение

гомогената при выделении МХ - 1:10 и 1:8 приводит к сильному распаду сети на спонтанная самосборка сети.

тепловое (12 °С) хранение; % - холодоеое (2 °С) хранение;

20 40 60 80 100 120 140 Время хранения гомогената, мин

Рисунок 3. Влияние температуры хранения на размеры и скорость самосборки MPC. По данным измерений (п=8 в каждой группе) показаны линии регрессии, построенные с помощью полиномов 2-го порядка, и 95% доверительный интервал.

Рассыпание сети под воздействием холода.

Проведение исследований МХ при температуре 2-4°С оказывает сильное разрушающее действие на MPC. Вероятно, это обусловлено

деполимеризацией тубулина при этой температуре. Наилучшее защитное действие мы наблюдали в интервале 1215 °С. На рис. 3 показано, что ансамбли, полученные и хранимые при 12 °С исходно крупнее, чем «холодовые», и значительно увеличиваются в процессе хранения. Способность к укрупнению мелких ансамблей в «холодовых» гомогенатах иссякает примерно после часа хранения, в то время как в тепловых гомогенатах, укрупнение

гораздо сильнее выражено на протяжении первого часа и стабильнее сохраняется при более длительном хранении.

250%

200%-

150%

го

3 о с с: к ск х

О) О.

100%

50%

1.2 Влияние веществ, используемых в полярографических исследованиях на организацию МХ.

На рис. 4 приведены изменения площади ансамблей под действием обычных добавок при исследовании окислительного фосфорилирования (ОФ): неорганического

фосфата (ФН), АДФ, Са2+, АТФ и олигомицина.

Все активаторы ОФ вызывают рассыпание

ансамблей (рис.4). На примере ФН видно, что это действие значительно

сильнее на холоду, чем при 12°С. Добавка АДФ до концентрации 200 мкМ в ячейку, содержащую, как указано, 30 мкл гомогената, за 5 мин приводила к уменьшению площади

ансамблей МХ в 2 раза. Добавление активатора дыхания МХ и других физиологических процессов ионов Са2+ приводило к снижению площади

ансамблей МХ в 3 раза, т.е. к их рассыпанию. Продукт ОФ АТФ - оказывал противоположный эффект. Добавка АТФ (до концентрации 400 мкМ) за 5 мин до измерений приводила к увеличению площади ансамблей МХ в 1,5-2 раза.

1 2

5 6

Рисунок 4. Изменение размеров ансамблей митохондрий относительно контроля (100%) под действием веществ, используемых в полярографических измерениях дыхания

МХ.

Добавки вносили в ячейку, содержащую 30 мкл гомогената и 970 мкл среды KCl на 5 мин с перемешиванием до конечной концентрации.

1 - Фн (1мМ) при тепловом хранении гомогената (12°С)

2 - Фн (1мМ) при холодовом хранении гомогената (2°С)

3 - АДФ (200 мкМ) при тепловом хранении гомогената (12°С)

4 - СаС12 (0,1 мМ) при тепловом хранении гомогената (12°С)

5 - АТФ (400 мкМ) при тепловом хранении гомогената

(12°С)

6- олигомицин (10 мкг) и АТФ (400 мкМ) при тепловом хранении гомогената (12°С) М ± SEM, п=4, * - р< 0,05 относительно контроля.

Специфичность действия АТФ подтверждалась тем, что предварительное добавление олигомицина (1 мг/мг белка) снимало ее эффект.

начальный размер MPC скорость сборки MPC

! Sä

О.

- -0.3 о

1.3 Изменения организации MX и их дыхания при иммобилизационном стрессе. Для того чтобы понять, как могут сказаться влияния условий измерения дыхания на результатах исследований отличий функций MX в организме в покое и при возбуждении, нужно было выяснить, каковы изменения MPC при этих состояниях. В качестве модели реакции организма на возбуждение использовали иммобилизационный стресс (ИС) различной продолжительности. Как показано на рис. 5А размер ансамблей выявлял динамику изменений при стрессе, однако, не очень

сильно выраженную.

Наблюдалось начальное

повышение размеров

ансамблей, но к 24 часам ИС оно снижалось не сильно, приближаясь к контролю, хотя состояние животных при этом резко отличалось. Более сильно менялся процесс сборки ансамблей. Он нарушался с самого начала ИС и прогрессивно падал до очень низкого уровня при 24 часах ИС. Изменения площадей ансамблей MX

соответствовали изменениям фосфорилирующего дыхания, которые, однако, также значительно отставали от степени изменений

физиологического состояния. Как показано на рис. 5Б, острая фаза стресса характеризовалась гиперактивацией окисления янтарной кислоты (ЯНТ), обусловленной адренергической регуляцией.

Рисунок 5. Динамика структурных и функциональных изменений MPC в гомогенате печени крыс при иммобилизационном стрессе различной

продолжительности.

А - изменения начального размера ансамблей и скорости самосборки MPC; Б - фосфорилирующее дыхание MX (в присутствии 200 мкМ АДФ). Субстрат окисления: белые столбики - ЯНТ 5 мМ; серые столбики - КГЛ 5 мМ в присутствии 5 мМ малоната. M ± SEM, п=4, * - р< 0,05 относительно контроля.

Восстановительная фаза, усиливающаяся к 6-ти часам, характеризовалась активацией окисления а-кетоглутаровой кислоты (КГЛ), которая обусловлена холинэргической регуляцией, поддерживающей восстановление после активной деятельности, а на уровне MX обнаруженным нами регуляторным снижением гиперактивации окисления ЯНТ. Такие изменения соответствуют представлению о преобладании адаптационных реакций на этой стадии ИС. Однако не было отчетливых отличий при 24-часовом ИС, состояние животных в котором резко отличается от контроля. Поэтому создается впечатление, что высокий уровень дыхания и в контроле, и при 24-часовом стрессе, как и размер ансамблей, в основном обусловлены условиями измерения.

Малая чувствительность изменений дыхания к значительным изменениям физиологического состояния понятна на основании проведенных микроскопических измерений. Они показывают, что основные факторы, использующиеся при исследованиях окислительного фосфорилирования, стимулируют распад ансамблей MX. При нарастании стресса в организме, также происходит увеличение преобладания распада MPC над ее сборкой.

Таким образом, распад MPC, вызванный условиями выделения и исследования, препятствует выявлению в полном объеме изменений активности MX в организме. Некоторая часть изменений еще может сохраняться в условиях концентрированного по белку гомогената ткани в среде KCl. Однако на выделенных MX к концу полярографического измерения дыхания не сохраняется даже мелких ансамблей MX.

Проведенные сопоставления биохимических и микроскопических исследований различий MX под воздействием условий исследования вне организма и в организме отчетливо показывают, что разрушение MPC экспериментальными условиями является причиной, которая ослабляет или делает невозможным наблюдение на выделенных препаратах физиологических изменений дыхания MX.

2. Исследования митохондрий в лимфоцитах на мазке крови цитобиохимическим методом

Традиционные цитохимические измерения активности дегидрогеназ MX в лимфоцитах с помощью нитросинего тетразолия широко используются в фундаментальных и клинических исследованиях (Nachlas et al., 1957; Quaglino and Hayhoe, 1960; Pearse, 1960; Narcissov, 1969; 1999; Altaian, 1976; Lippold, 1982; Zaretskaja, 1983; Noorden Van and Butcher, 1991; Petrichuk et al., 2005; Sukhorukov et al., 1997; Vishnevsky et al., 2004a, 2004b, 2006). Мы предположили, что чувствительность цитохимических исследований к физиологическому состоянию объясняется хорошей сохранностью MPC благодаря иммобилизации клеток на стекле во внутриклеточном окружении. Фиксация на стекле подобна подготовке иммобилизованных ферментов в

тонком слое. Иммобилизованное состояние изолированных ферментов увеличивает стабильность ферментов по сравнению с их состоянием в растворе (Woodward, 1985). Поэтому, цитохимический метод имеет преимущество перед классическими биохимическими исследованиями в том, что сохраняет сеть ex -vivo.

Однако существенный недостаток цитохимического метода состоит в том, что состав среды нефизиологичен. Главным компонентом цитохимической среды является фосфатный буфер, содержащий 15-100 мМ Фн вместо 1-5 мМ Фн, используемого в биохимических средах; присутствие ионов натрия, токсичного для MX. Также используются нефизиологические концентрации ЯНТ 50-100 мМ вместо 0,25 - 5 мМ. Таким образом, эта среда не отвечает современным требованиям биохимических исследований MX и не соответствует физиологическим условиям в клетке. Будет показано, что использование нефизиологической среды устраняет преимущества процедуры иммобилизации.

2.1 Разработка ЦБХ метода

Влияние концентрации ЯНТ

На рис.6 представлены диаграммы для сравнения величин активности СДГ в покое и при введении адреналина животному при использовании в качестве субстрата окисления ЯНТ в концентрациях 50мМ и 5 мМ, в традиционной цитохимической среде. При использовании высокой концентрации ЯНТ - 50 мМ уже в контроле (покое) наблюдается активация СДГ. Избыток ЯНТ в среде инкубации, вносит дополнительный артефакт и в реакцию митохондрий животного после введения адреналина. Это может объясняться тем, что повышение концентрации ЯНТ приводит к переходу от активации СДГ через гиперактивацию к ее ингибированию, обусловленному

увеличенным образованием естественного ингибитора СДГ - оксалацетата. В таких условиях дополнительная активация адреналином в организме приводит только к небольшому повышению активности 12

1,2

0,8

*Е =*- 0,6 Сó

0,4 0,2 0

□ Интактное животное В Введение АДР 25 мкг/ЮОг

ЯНТбОмМ ЯНТ 5 мМ

Рисунок 6. Влияние концентрации ЯНТ на активность СДГ и ее активацию при введении адреналина in vivo. Лимфоциты на мазке крови крысы, среда инкубации -фосфатный буфер 16,6 мМ, pH 7,2. М ± SEM, отличия достоверны р< 0,05 (* - от интактного животного; # - от 50 мМ ЯНТ)

фермента. При использовании принятой в биохимии концентрации ЯНТ - 5 мМ активность СДГ в контроле ниже, благодаря чему при стимуляции опытного животного адреналином удается выявить гораздо большую активацию СДГ - на 183%, в то время как при 50 мМ ЯНТ - всего на 31%.

Исключение натрия и фосфата из буфера и их замена на HEPES.

Измерение активности СДГ в цитохимической среде, но с концентрацией ЯНТ пониженной с 50 мМ до 5 мМ, показало, что наблюдаемая активация СДГ при инъекции адреналина составляла 160% (рис.7, А). Использование более физиологичной, цитобиохимической среды, сделало возможным наблюдение гораздо большего эффекта введенного адреналина - увеличение активности СДГ до 300% (рис.7, Б).

см

Е и

со

1,6 1,2 0,8 0,4

иэс

т ЭС+ 5 мМ МАЛ ЕЯ 5 мМ ЯНТ

Щ 5 мМ ЯНТ + 5 мМ МАЛ

Контроль

АДР

Контроль

АДР

Рисунок7. Влияние состава среды инкубации на активность СДГ при возбуждении животного введением адреналина (25 мкг/100 г веса). А - фосфатный буфер, 16,6 мМ, рН 7.2; Б - среда КС1 125мМ, НЕРЕ5 ЮмМ, рН 7.2; отличия достоверны р< 0,05 от соответствующего контроля

На самом деле стимуляция активности СДГ еще более значительна. Обычно рассматривается окраска лишь в пробах с добавлением ЯНТ. При этом в большинстве случаев не учитывается окрашивание в средах без добавления ЯНТ, хотя известно, что оно происходит. Мы учли эту окраску и проанализировали ее происхождение. Рассмотрим данные для оптимальной среды хлористого калия. Видно, что у

спокойного животного добавление ингибитора СДГ малоната не снижает окраску. Это значит, что она не обусловлена окислением ЯНТ. Видно, что окрашивание при добавлении ЯНТ остается на уровне проб без субстрата. То есть у спокойного животного окисление ЯНТ не низкое, как можно думать без учета пробы без субстрата, а полностью отсутствует!

Это подтверждается и тем, что добавление малоната и в этом случае не ингибирует дыхание. Следовательно, активация адреналином еще радикальнее, так как ее нужно относить не к окраске без субстрата, а к полному отсутствию окрашивания зависящего от эндогенной или добавленной ЯНТ. Видно, что после введения адреналина не только появляется интенсивная окраска, но она сильно ингибируется малонатом, то есть окисление ЯНТ действительно включается. Надо заметить, что окрашивание без субстрата и в этом случае малонатом не ингибируется. "Молчание" СДГ в пробах до добавления ЯНТ и даже при ее добавлении у контрольного животного свидетельствует о полном отключении окисления ЯНТ в состоянии действительного покоя. С такой полнотой это не удавалось выявить раньше в других методических условиях. Таким образом, впервые выявлено переключение адреналином от полного отсутствия окисления ЯНТ в покое к значительной активации этого процесса адреналином, что соответствует большому диапазону активации им физиологических функций.

Таким образом, новый метод для измерения активности МХ ферментов сочетает в себе преимущества цитохимического и биохимического подходов и исключает их недостатки. Поэтому это метод назван цитобиохимическим. Он позволяет исследовать МХ ex vivo близко к их состоянию in vivo.

2.2 Выявление структуры митохондрий потенциал-зависимым флуоресцентным красителем родамином 123

Несмотря на приведённые выше аргументы в пользу использования лимфоцитов, иммобилизованных на стекле, мы постоянно встречали мнение, что это «высушенные клетки с мертвыми МХ внутри». Существовала вероятность, что филаментированные МХ в таких клетках рассыпаны на маленькие гранулы и их способность поддерживать мембранный потенциал потеряна. Для опровержения этого утверждения, мы произвели окрашивание мазка крови потенциал-зависимым флуоресцентным красителем родамином 123. Фотография лимфоцита и нейтрофила, окруженных эритроцитами приведена на рис. 8А.

Яркая зеленая флуоресценция свидетельствует о наличии высокого потенциала на МХ мембране у обеих МХ-содержащих клеток. Также видно, что МХ в этих двух

; ' -- .....

10 цт

Рисунок 8.

Визуализациямембранного потенциала и MPC в клетках на мазке крови с использованием флуоресцентного красителя родамина 123. А - инкубация мазка (предварительно

зафиксированного в ацетоне), 10 мин при 37 "С в ЦБХ среде, в присутствии 5 мМ ЯНТ. Б - то же, но мазок подвергнут замораживанию-оттаиванию.

клетках сохраняют ретикулярную организацию. Флуоресценция МХ, а значит и их потенциал, намного выше, чем в мембране эритроцита. Эти наблюдения показывают, что МХ сохраняют свои нативные свойства в лимфоцитах на мазке крови. Свидетельством того, что мембранный потенциал МХ, наблюдаемый с родамином поддерживается дыханием, подтверждается эффектом, полученным с использованием цианида, антимицина А и повреждением МХ. Инкубация с ингибиторами дыхания в течение 10 мин приводит к появлению множества темных, не флуоресцирующих лимфоцитов. Однако, часть лимфоцитов все же сохраняла флуоресценцию, вероятно, из-за короткого времени действия ингибитора. Наибольшая потеря флуоресценции наблюдалась после 10 мин инкубации мазка, подвергнутого замораживанию и оттаиванию, что разрушало организацию и сами МХ. Эти данные показаны на рис. 8Б.

2.3 Ответы СДГ и КДГ при усилении адренергической регуляции в организме

Ответы СДГ и КДГ на введение адреналина и длительный стресс.

На рис.9 представлена активность СДГ и КДГ интактных крыс, крыс через 30 мин после инъекции активирующей дозы адреналина и 24-часового ПЭС. Инъекция адреналина вызывала реакцию, соответствующую острой фазе стресса (реакции тревоги) (Селье, 1960). Это видно по увеличению активности СДГ более чем в 2 раза и падению активности КДГ более чем в 10 раз. При 24 ч ПЭС наступает фаза истощения. Это подтверждается падением активности СДГ приблизительно до начального уровня. Однако, это не фаза восстановления, т.к. активность КДГ практически исчезает. При длительном возбуждении гиперактивация СДГ ограничивается ингибированием (Кондрашова, 1985). Такое ингибирование окисления КГЛ, наблюдаемое во время длительного предпатогенного или патогенного возбуждения организма можно рассматривать как повреждение процессов восстановления, поддерживаемых холинэргической системой регуляции(Аршавский,

1982). Сравнение значений активностей СДГ и КДГ обеспечивает новую информацию о степени отклонения от нормы в организме. Отношение СДГ/КДГ может служить количественным показателем физиологического состояния. Это отношение для исследуемых состояний приведено на рис 9. Оно показывает большое отличие между состоянием покоя и сильным возбуждением:

отношение это немного меньше единицы у интактного животного,

равно 33 при остром стрессе, вызванном введением

адреналина, и 19 при длительном стрессе. В соответствии с

представлением о

субстратно-гормональной системе, увеличение этого отношения при возбуждении свидетельствует о сильном преобладании адренергической регуляции над холинэргической. В состоянии покоя, они практически полностью уравновешены с небольшим преобладанием холинэргической регуляции. Цитобиохимические измерения позволяют очень точно оценить реципрокные взаимодействия между адренергической и холинэргической регуляцией на физиологическом уровне

Необходимость использования более мягких моделей стресса.

Описанные выше результаты были получены при четко выраженных функциональных нарушениях, т.к. используемые модели - введение адреналина и длительный ИС являются сильными экспериментальными воздействиями. При их использовании хорошо виден ответ организма, но они выходят за рамки физиологических влияний.

Наибольший интерес представляет использование данного метода для выявления патогенных процессов в организме на ранних стадиях, что обеспечит наиболее эффективное их лечение или даже предотвращение. Для исследования этой возможности необходимо использование более мягких моделей стресса. Исследованиями И.А. Аршавского показано что, при воздействии нагрузок

14 12 10 8 6 4 2 0

Контроль

АДР

ПЭС 24 часа

Рисунок 9 Активность СДГ и КДГ в лимфоцитах крови крыс в различных физиологических состояниях: интактное животное, через 30 мин после введения АДР 50 мкг/100г, ПЭС 24 часа. М ± SEM, * - отличия от контроля достоверны р< 0,05

физиологической силы, которые были названы физиологическим стрессом, реализуются активные адаптационные процессы. Механизм стимулирующего влияния на организм нагрузок, находящихся в пределах физиологических возможностей организма, состоит в том, что восстановление трат после работы происходит не только до исходного уровня, но перекрывает его - явление суперкомпенсации, «избыточное» восстановление. В его основе, по-видимому, лежит усиление процессов энергообеспечения, но данные о механизмах регуляции энергетических процессов в митохондриях при физиологическом стрессе отсутствуют. Для решения этой задачи была выбрана и исследована значительно более мягкая модель стресса, использующая ограничение движения крыс путем заключения в тесный пенал без болевых воздействий. Это создает только психоэмоциональный (ПЭС) стресс, который, несомненно, мягче жесткой иммобилизации.

Изменения активности СДГ и КДГ при ПЭС различной продолжительности. На рис. 10 показано, что, несмотря на значительно более мягкие изменения в организме при ПСЭ стрессе, по измерениям ЦБХ методом активности МХ динамика стресса отчетливо выражена, причем с гораздо большей амплитудой, чем по дыханию МХ в КС1 гомогенате.

144% 53%

100%

266%

С] СДГ ШКДГ ♦сдг/кдг

Контроль ПЭС, мин

30 60 120 180

Рисунок 10. Изменения активности СДГ (5 мМ ЯНТ) - белые столбики и КДГ (5 мМ а-КГЛ в присутствии 5 мМ мапоната) -серые столбики в лимфоцитах крови у крыс при психоэмоциональном стрессе различной продолжительности, измеренные разработанным цитобиохимическим методом. Над диаграммами в верхней строке указано в % отношение СДГ в данном состоянии к показателю контроля.

В состоянии покоя активности СДГ и КДГ уравновешены, что свидетельствует о

балансе катаболических и анаболических,

восстановительных процессов, активируемых симпатической и

парасимпатической отделами вегетативной нервной системы. При развитии ИС стресса активность СДГ

возрастает через 30 и 60 мин до 270%, а затем

через 2 часа снижается до уровня 145% от контроля, и наконец, к 3 часам ИС составляет только 60% от контроля. Активность КДГ при 30 мин ИС повышается, как

и СДГ, однако возрастание ее активности отстает от повышения активности СДГ. Это отставание усиливается при 60 мин ИС. Очень важно, что при 2-х часовом ИС наблюдается приближение активности КДГ к уровню покоя. Как и СДГ, активность КДГ приближается к уровню покоя, но примерно в полтора раза превышает его. Особенно надо обратить внимание на то, что восстанавливается характерное для покоя уравновешивание СДГ и КДГ с небольшим превышением КДГ. Эти данные впервые в остром опыте четко выявляют фазу развития активной адаптации в результате стрессирующего воздействия в физиологическом диапазоне. После 3 ч ИС наблюдается ингибирование СДГ, и КДГ.

Размах значений активности СДГ и КДГ в крайних состояниях больше пятикратного, в отличие от гораздо меньших изменений дыхания, измеренного полярографическим методом, которые показаны на рис. 5. Явным артефактом измерения в гомогенатах является отсутствие различий между контролем и очень сильно отличающимся 24-часовом ИС в сопоставлении с сильным различием контроля и даже всего только Зч более мягкого ПЭС при исследовании ЦБХ методом.

Мы объясняем это сохранением более низкого уровня дыхания в покое, соответствующего условиям в организме, при работе на иммобилизованных MX. Влияние всех условий, рассыпающих MPC при измерении дыхания обычным способом, «съедает» тот диапазон активности, который лежит между истинным покоем в физиологических условиях и максимальной активностью, поскольку уровень активности СДГ в покое у выделенных митохондрий искусственно приближен к уровню ее активности при возбуждении. Остается напомнить, что исследование еще более грубого ИС стресса по дыханию на выделенных MX (Кондрашова и Григоренко, 1988) выявило еще более узкий диапазон изменения окисления ЯНТ при переходе от активации к торможению, чем на гомогенате. Эти сопоставления показывают, что разрушение ультраструктурной организации MPC in vitro стирает изменения активностей ферментов, имеющие место в организме.

Приведенные на рис. 9 и 10 уровни ответных реакций СДГ и КДГ на различные возбуждающие воздействия представляют удобную для количественного исследования модель перехода от стимулирующих воздействий, повышающих адаптацию (рис. 10) к повреждающему действию (рис. 9). Сопоставление этих ответов впервые позволяет выявить четкую грань между интенсивной активностью, укрепляющей организм, и предпатологией. Выявление первых этапов развития патогенных сдвигов, еще не проявляющихся по клиническим симптомам, является особенно актуальной задачей современной фундаментальной медицины. Выявление нарушений на доклинической стадии заболеваний важно как для ранней диагностики,

так и для поиска средств коррекции этих отклонений путем регуляции митохондриальных процессов.

Разработанные чувствительные критерии изменения состояния организма позволили на уровне митохондрий отчетливо наблюдать тонкие различия физиологического состояния организма, не выявленные ранее биохимическими методами. Примеры таких наблюдений описаны ниже.

Незрелые животные псдг

Зрелые животные

2.4 Исследования зависимости ответа на стресс от исходного физиологического состояния.

Определения активности СДГи КДГ на модели ПЭСу зрелых и незрелых крыс.

В соответствии с работами И.А. Аршавского (Аршавский, 1975) при половом созревании наблюдается усиление адренергической регуляции. Оно проявляется в утрате покоя, возбужденности организма, большей частоте сердцебиения и дыхания и более бурных ответных реакциях на воздействия. Переход четко выражен в короткий срок между концом препубертатного периода и временем созревания. Поэтому были проведены исследования на двух группах животных близких возрастов, 6 и 8 недель, но разделенных критическим этапом онтогенеза - половым созреванием.

По цитобиохимическим показателям обнаружены заметные отличия активности СДГ и КДГ в эти сроки. Как показано на рис.11 (правая панель), контрольные

животные «зрелой» группы находятся в состоянии, характеризуемым как «полный покой». Активность СДГ низка, активность КДГ находится на этом же уровне. Как в приведенных выше примерах отношение около единицы. Такое соотношение активностей этих ферментов свидетельствует о спокойном состоянии, характеризующемся полным уравновешиванием восстановительными процессами расходов на активность.

При действии стресса (ПЭС 30 мин) гиперактивируются расходы на функцию и значительно снижаются восстановительные процессы - активность СДГ составляет

Рисунок 11. Изменения активности СДГ и КДГ лимфоцитов крови зрелых (8 недель) и незрелых (6 недель) крыс в контроле и в ответ на ПЭС. М ± SEM, п=4, *, # - р<0,05 (* - отличие от соответствующего контроля, # - отличие от незрелых).

170% от нормы, а активность КДГ, наоборот, снижается до 60% от уровня контроля. При этом активность КДГ составляет только треть от активности СДГ. Отношение увеличивается до 3,2, указывая на гиперактивацию адренергической регуляции.

Видно, что у животных в периоде перед созреванием (рис.11, левая панель) исходная активность СДГ и КДГ примерно вдвое выше, чем после него.

По цитобиохимическим показателям состояние контрольных животных «незрелой» группы в покое можно охарактеризовать как гиперактивное: Активность СДГ в 2,2 раза превышает активность СДГ зрелых животных и находится на уровне даже более высоком, чем активность СДГ у зрелых животных, подвергнутых ПЭС. Эта активность уравновешена активностью КДГ, но далеко не полностью, образуя соотношение СДГ/КДГ, равное 1,4. Для покоя это сильное снижение КДГ, которое наблюдается при физиологическом стрессе у взрослых. Высокая дыхательная активность митохондрий может определяться как влияниями вегетативной нервной системы, так и внутримитохондриальной регуляцией. В таком состоянии существует риск срыва активности СДГ и перехода в ингибирование. Состояние гиперактивации, усиливающееся в ответ на стрессовые воздействия, подтверждается ответом на ПЭС. ПЭС приводит к гиперактивации, которая в этом случае сопряжена с ингибированием активности СДГ, т.к. активность СДГ значительно (в 2 раза) снижается при действии ПЭС. Активность КДГ также снижается более, чем в два раза, однако соотношение СДГ/КДГ сохраняется в пределах двукратного (=1,8).

Видно несомненное отличие исходного состояния и ответа на стресс незрелых и зрелых животных. Активности обеих дегидрогеназ значительно выше у незрелых животных в покое. Это обусловлено, по-видимому, как преобладанием адренергической регуляции у незрелых, так и связанными с этим изменениями внутримитохондриальной регуляции. А именно, адреналин повышает вклад жирных кислот в окисление, с этим связано повышение образования активных форм кислорода и увеличение экспрессии разобщающих белков (Sabban et al., 2006; Wong et al., 2004). Вместе это приводит к более слабому энергетическому контролю дыхания, то есть повышению его скорости в покое. Мы называем такое состояние гиперактивацией. Как сказано, гиперактивация представляет собой «ускользание» дыхания от наиболее физиологичной энергетической регуляции. Для предупреждения дальнейшего неконтролируемого разгона дыхания в митохондриях функционирует более жесткий способ ингибирования путем торможения активности СДГ щавелевоуксукной кислотой (ЩУК), образующейся из ЯНТ при ее окислении. Чем интенсивнее окисление, тем быстрее и больше образование ЩУК, и тем сильнее торможение окисления ЯНТ (по механизму отрицательной обратной связи). Таким образом, тот же стимул, который вызывает гиперактивацию дыхания, при усилении приведет к его

ингибированию. Этим объясняется противоположность ответа СДГ на ПЭС -ингибирование у незрелых и активация у зрелых животных. Окисление КГЛ и активность КДГ более уязвимы, чем окисление ЯНТ и активность СДГ. Поэтому активность КДГ снижается при ПЭС в обоих случаях.

Именно в найденных различиях кроется повышенная чувствительность юных животных к стрессовым воздействиям, МХ которых не способны еще адекватно обеспечивать возросшую нагрузку на организм энергией.

Выявление индивидуальных различий ответа СДГ кроликов на возбуждение в зависимости от типа их вегетативной регуляции.

Ранее в лаборатории было выявлено 4 типа ЦБХ паттернов у здоровых людей и предположительно они могли отражать различия вегетативного статуса (Кондрашова и др., 2009).

Взаимосвязь между активностью СДГ и состоянием вегетативной нервной системы животных была четко показана в экспериментах на кроликах, имеющих отличительные признаки в поведении. Данные этих экспериментов на двух самцах-кроликах показаны на рис. 12. Активность СДГ измерялась в лимфоцитах интактного животного (до воздействия) и на том же животном после воздействия - через 30 мин после инъекции in vivo мягкой активирующей дозы адреналина (10 мкг/кг) или ЯНТ (20 мг/кгper os.).

Во время эксперимента резко проявились индивидуальные особенности поведения этих кроликов. Один кролик был спокойный и малоподвижный, он не вырывался во время манипуляций, что говорит о доминировании парасимпатической регуляции. Другой кролик был сильно возбудим, вырывался при манипуляциях и был типичным «адренергиком». Разница между кроликами выявилась и в активности СДГ.

На рис. 12 показана активность СДГ- серые столбики, и восстановление НСТ без добавления ЯНТ - на эндогенных субстратах (ЭС).

Для спокойного интактного кролика восстановление НСТ на ЭС было умеренным, обычным для выраженного покоя, и добавление 5 мМ ЯНТ не вызывало активации. То есть, если учитывать восстановление за счет ЭС, СДГ не проявляла активности и полностью выключена (как мы считаем, из-за отсутствия адренергической регуляции). Введение адреналина вызывало значительное увеличение общей активности СДГ. Оно составляло 367% относительно спокойного состояния. В этом случае восстановление НСТ на ЭС понижалось, что свидетельствуя о расходе эндогенных субстратов.

Введенная в организм ЯНТ в естественных микромолярных концентрациях, как показано ранее (Кондрашова, 2002) активирует физиологические функции и СДГ подобно АДР. Однако, впервые ЦБХ методом активация сукцинатдегидрогеназы ЯНТ

§ со

14 12 10 8 6 4 2 0

JÚ¡

наблюдается с такой силой. Она даже превышает сильную активацию адреналином, составляя 462%.

Замечательно, что второй, возбудимый кролик (рис.12Б) проявил резко отличные ЦБХ характеристики СДГ и уровня окисления ЭС.

Прежде всего, ЭС у него практически

отсутствовали в его состоянии покоя, которое не является покоем. Это свидетельствовало об окислении ЭС.

Добавление ЯНТ

приводило к активации примерно такой же, как при введении АДР спокойному кролику. А введение АДР вызывало только небольшое

Контроль Введение Введение АДР ЯНТ

□ ЭС В 5 мМ ЯНТ

Рисунок 12. Ответ СДГ на введение АДР (10 мкг/кг) и ЯНТ (20 мг/кг), измеренный в лимфоцитах крови кроликов в различном физиологическом состоянии: А - спокойный кролик; Б -спонтанно возбужденный кролик.

На рисунке представлены средние из трех измерений на одних и тех же животных; М ± SEM. * - р< 0,05, ** - р<0,01 (от соответствующею контроля)

дополнительное повышение активности. Это указывает на достижение максимально возможной активности, которая находится на грани перехода к ингибированию.

Действительно введение ЯНТ с одной стороны пополняет фонд ЭС, а с другой провоцирует развитие ингибирования, по сравнению с возбужденным исходным состоянием подобно усилению возбуждающего воздействия.

Таким образом, проведение опыта в условиях, хорошо выявляющих ex vivo изменения в организме, гораздо более выражено, чем ранее, показывает адреналиноподобное действие ЯНТ на активность СДГ.

Информативность показателя ЭС в сочетании с СДГ позволяет выявить индивидуальные особенности статуса вегетативной регуляции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Важным направлением внедрения современных технологий в физиологические и клинические исследования должно быть и развитие условий, способствующих сохранению в выделенных препаратах неповрежденного состояния структур, которые представляют собой молекулярные механизмы, лежащие в основе функционирования. Таким естественным способом можно существенно повысить чувствительность методов к изменению состояния организма.

В работе показано, что обязательные условия для измерения дыхания на выделенных MX усиливают повреждение тонкой биофизической организации MX в клетке. Это огрубляет выявление более тонкой и высокоамплитудной динамики физиологической регуляции MX в организме. Без микроскопического наблюдения это не видно, так как рассыпание MPC связано с активацией дыхания, и это вырезает из наблюдения большой диапазон нарастания активности от покоя к возбуждению.

Проведенные в данной работе сопоставления биохимических и микроскопических исследований различий MX под воздействием условий исследования вне организма и в организме отчетливо показывают, что разрушение MPC экспериментальными условиями является причиной, которая ослабляет или делает невозможным наблюдение на выделенных препаратах физиологических изменений дыхания MX. На основании этого вывода мы пришли к убеждению, что никакими компромиссными мерами нельзя предотвратить распад MPC в классических биохимических исследованиях.

В качестве альтернативы существующим методам был разработан новый метод исследования дегидрогеназ MX. Созданный на основе сочетания цитохимических методов иммобилизации на стекле лимфоцитов крови и современных биохимических методов с использованием сред, приближенных по составу к внутриклеточной среде, и, названный, поэтому цитобиохимическим, он позволяет избежать разрушения нативной MPC в экспериментах ex vivo.

Тщательный подбор условий проведения эксперимента позволил получить большую функциональную чувствительность метода к изменениям в организме. Цитобиохимические измерения позволили получить более яркие экспериментальные доказательства существования субстратно-гормональной системы, как физиологической системы регуляции, заключающейся в реципрокных взаимодействиях между холинергической и адренергической системами, двумя субстратами ЯНТ и КГЛ, их рецепторами и ферментами, их окисляющими

Выявление изменения митохондриальных процессов на разработанной модели перехода от физиологического напряжения, вызывающего усиление адаптационных реакций, к предпатологии, связанной с возникновением повреждений метаболизма, позволят впервые описать механизм перехода от стимулирующего действия нагрузок к повреждающему. Установленные показатели изменений могут служить митохондриальными маркерами функциональных сдвигов в организме, которые востребованы современной фундаментальной медициной.

выводы

1. Методом компьютерной морфометрии было показано, а методом 3-х мерной реконструкции серийных срезов электронно-микроскопических снимков подтверждено, что в густом гомогенате печени крысы, приготовленном в среде KCl, сохраняются части MPC, обладающие способностью к самоорганизации. Самоорганизация является характеристикой функционального состояния организма -усиливается при активации физиологических функций и утрачивается при тяжелых патологиях.

2. Показано, что большинство условий и компонентов среды выделения MX (сахароза, разведение гомогената, низкая (0-4 °С) температура)для биохимических исследований, а также добавки для исследования ОФ (АДФ, Са2+, Фн) вызывают разрушение MPC подобно тяжелым формам стресса. Малая чувствительность дыхания выделенных MX к значительным изменениям функционального состояния в организме обусловлена распадом MPC в полярографической ячейке под воздействием вышеуказанных факторов.

3. Экспериментально обоснован выбор концентрации ЯНТ, исключение фосфата натрия и его замена ХЕПЕС в среде инкубации в разработанном ЦБХ методе для сохранения состояния покоя MX.

Методом конфокальной микроскопии лимфоцитов, окрашенных потенциал-зависимым красителем родамином 123, показано, что в лимфоцитах мазка крови, иммобилизованных на стекле, в специально подобранной и приближенной к внутриклеточной среде сохраняется MPC сеть и мембранный потенциал MX.

4. При условии сохранения состояния покоя MX в лимфоцитах животных активности СДГ и КДГ и их соотношение отражают физиологическое состояние всего организма:

В покое активность СДГ выключена, наблюдается только умеренная активность КДГ.

При использовании моделей стресса, выходящего за границы адаптации организма, в MX наблюдается гиперактивация СДГ при катастрофическом падении активности КДГ до нулевых значений.

При стрессе в диапазоне физиологической адаптации сдерживание гиперактивности СДГ сопряжено с нарастанием активности КДГ, что приводит после фазы активации к развитию фазы истинной адаптации, когда восстановительные парасимпатические процессы уравновешивают симпатическую активацию.

5. Сопоставление этих двух типов ответных реакций MX на патогенное воздействие позволяет впервые выявить четкую границу между стимулирующим, тренирующим действием нагрузок и переходом к повреждающему их воздействию, которое в дальнейшем может развиться в патологию. Обнаруженный показатель отвечает самому актуальному запросу современной фундаментальной медицины - наховдению чувствительного маркера ранних митохондриальных дисфункций у человека на доклинической стадии отклонения от нормы

6. Разработанные ЦБХ характеристики позволяют в большом масштабе выявить индивидуальные отличия состояния вегетативной регуляции организма.

У незрелых крыс активность СДГ преобладает над КДГ, а к моменту созревания они обе снижаются и уравновешиваются.

Реакция СДГ на возбуждение, вызванное введением АДР или ЯНТ, резко отличается у спокойного и возбудимого кроликов, как холинэргика или адренэргика соответственно: потеря начального состояния покоя, выражающаяся в исходной гиперактивации СДГ у возбудимого кролика обуславливает значительно меньший ответ на стимулирующее воздействие и увеличение риска перехода к ингибированию..

7. ЦБХ методом показано, что введение ЯНТ in vivo активирует СДГ подобно действию АДР, что подтверждает представление о существование субстратно-гормональной системы висцеральной регуляции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Захарченко М.В., Хундерякова Н.В., Кондрашова М.Н. Важность сохранения биофизической организации выделенных митохондрий для выявления физиологической регуляции их функций // Биофизика. 2011. Том 56 (5), с. 840-847,

2. Kondrashova М., Zakharchenko М., Khunderyakova N. Preservation of the in vivo state of mitochondrial network for ex vivo physiological study of mitochondria // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology.2009. V. 41, pp. 2036-2050,

3. КондрашоваМ.Н., ХундеряковаН.В., Захарченко M.B. Оригинальныйцито-био-химическийметодвыявленияиндивидуальныхразличийфизиологического состояния организма по комплексной характеристике (паттерну) активности сукцинатдегидрогеназы // Российский Биомедицинский Журнал.2009. Том 10, с. 21-43.

4. Овсепян A.A., Бенедиктова Н.И., Захарченко М.В., Казаков P.E., Кондрашова М.Н., Литвинова Е.Г., Саакян И.Р., Сирота Т.В., Ставровская И.Г.,

Шварцбурд П.М. Антиоксидатное и иммунопротекторное действие экстракта личинок восковой моли при окислительном стрессе у крыс, вызванном потреблением корма, обогащенного железом // Вестник новых медицинский технологий. 2009. том XVI, № 1, с. 170- 173,

5. Хундерякова Н.В., Захарченко М.В., Захарченко А.В., Кондрашова М.Н. Гиперактивация сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах крови новорожденных крысят. // Биохимия.2008.Том 73, вып. 3, с. 414-419.

6. Vishnevsky E.L., Kondrashova M.N., Pushkar D.Y., Demidov A.A., Sirota T.V., Temnov A.V., Khunderyakova N.V., Zakharchenko M.V., Kosyakova N.I. Role of the impairment of oxidative metabolism in pathogenesis of lower urinary tract symptoms with benign prostatic hyperplasia and their treatment by (alpha) 1-adrenoblocker alfuzosin. // Mitochondrion. 2003. V. 3(2), p. 67-73.

7. Захарченко M.B., Темнов A.B., Кондрашова М.Н. Влияние карнозина на самоорганизацию ансамблей митохондрий в гомогенате печени крысы. // Биохимия.2003. Том 68, №9, с.1226-1230.

8. Kondrashova M.N., Fedotcheva N.I., Saakyan I.R., Sirota T.V., Lyamzaev K.G., Kulikova (Zakharchenko) M.V., Temnov A.V. Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate. // Mitochondrion. 2001. V.l, p.249-267.

Патент

9. Кондрашова M.H., ОАО ДИОД, Захарченко М.В., Хундерякова Н.В., Маевский Е.И. Пат. № 2007143021/15 (047111). Россия. Цитобиохимический способ определения активности сукцинатдегидрогеназы, окисления эндогенной янтарной кислоты, сигнального действия микромолярных концентраций янтарной кислоты, его применение для количественной оценки уровня адренергической регуляции в организме, среда и набор для осуществления способа. 23 Бюллетень Роспатента. 20.08.09, №2364868.

Сборники трудов научных конференций

10. Захарченко М.В., Захарченко А.В., Федотчева Н.И., Литвинова Е.Г., Кондрашова М.Н. Сравнение биологической активности препаратов дигидрокверцетина и нанодигидрокверцетина на модели симпатической гиперактивации // Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». 2011. (В.П. Зинченко ред.), с. 495-500, 2011.

11. Захарченко М.В., Захарченко А.В., Хундерякова Н.В., Симонова М.А., Васильева А.А., Литвинова Е.Г., Федотчева Н.И., Маевский Е.И., Кондрашова М.Н. Изменения активности митохондрий и иммунной системы при мягком стрессе, стимулирующем «избыточное» восстановление // Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (В.П. Зинченко ред.).2009,с. 431 -437.

12. Овсепян A.A., Захарченко М.В., Захарченко A.B., Хундерякова Н.В., Федотчева Н.И., Литвинова Е.Г., Кондрашова М.Н. Выявление баланса симпатической и парасимпатической регуляции цитобиохимическим методом, коррекция ее нарушений и значение результатов для исследования гипоксии // Патогенез. Научно-практический журнал. Москва, 2008. том 6, №3, с. 79-80.

13. Захарченко М.В., Захарченко A.B., Хундерякова Н.В., Кондрашова М.Н. Адреналиноподобное действие янтарной кислоты. // Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». (В.П.Зинченко ред.) ОНТИ Пущино. 2007., с. 219 -221.

14. Кондрашова М.Н., Захарченко М.В., Самохвалов В.А., Шихлярова А.И., Барсукова Л.П., Марьяновская Г.Я, Гаркави Л.М. Сигнальное действие янтарной кислоты и ее лечебное применение в малых дозах. // 12 Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Регуляторы энергетического обмена. Под ред. В.А.Хазанова. Томск,2005.C.6-16.

15. Кондрашова М.Н., Федотчева Н.И., Саакян И.Р., Сирота Т.В., Захарченко М.В., Леонтьев Д.С., Игнатьев Д.А, Темнов A.B., Самохвалов В.А. Субстратно -гормональная система регуляции физиологического состояния. Условия ее выявления. Использование в практике. // Горизонты биофизики. Пущино,2003.с. 147-154.

16. Захарченко М.В. Исследование биофизических регуляторов самоорганизации митохондрий. // Цитология. 2003. Том 45, №9, с. 877.

17. Бенедиктова Н.И., Куликова (Захарченко) М.В., Темнов A.B., Кондрашова М.Н. Влияние ионов железа на структурную ассоциацию митохондрий. // Материалы всероссийского рабочего совещания «Митохондрии в патологии». Пущино, 2001. с. 144-147.

18. Вишневский Е.Л., Кондрашова М.Н., Сирота Т.В., Темнов A.B., Куликова (Захарченко) М.В., Хундерякова Н.В., Демидов A.A., Вишневский А.Е., Косякова Н.И. Обоснование применения янтарной кислоты для лечения расстройств мочеиспускания у больных доброкачественной гиперплазией простаты. // В кн.: Митохондрии в патологии. Пущино,2001. с. 158-162.

Тезисы научных конференций

19. Zakharchenko M.V., Zakharchenko A.V., Khunderyakova N.V., Tutukina M.N., Simonova M.A., Vasilieva A.A., Romanova O.I., Fedotcheva N.I., Litvinova E.G., Maevsky E.I., Kondrashova M.N. Burst of succinate- and a-ketoglutarate dehydrogenase activity related to expression of succinate dehydrogenase subunit a, succinate receptor and other respiratory chain proteins during the short -term physiological stress in rats // MÍP2011 8th MiPconference, Bordeaux, FR.201 l.P 4-16.

20. Захарченко A.B., Захарченко M.B., Федотчева Н.И., Литвинова Е.Г., Кондрашова М.Н. Влияние дигидрокверцетина и нанодигидрокверцетина на энергетические функции митохондрий и иммунные показатели клеток крови при

физиологическом стрессе // Материалы Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы стресса». 2011, с. 16- 18.

21. Хундерякова Н.В., Захарченко М.В., Захарченко А.В., Симонова М.А., Васильева А.А, Романова О.И., Кондрашова М.Н. Новый высокочувствительный цитобиохимический метод оценки состояния митохондрий в организме животных и человека, основанный на сохранении их физической организации. // III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА -2010".Москва,2010. с. 393-395.

22. Hunderyakova N., Zakharchenko М., Zakharchenko A., Simonova М, Vasilieva A., Romanova О., Fedotcheva N., Litvinova E., Azarashvili A., Maevsky E., Kondrashova M. Changes in sympathetic and parasympathetic regulation connected with succinate dehydrogenase and a-ketoglutarate dehydrogenase activity in different physiological states of the organism. // EBEC abstract book BBA, 2010, vol.1797, p. 142.

23. Захарченко M.B., Захарченко A.B., Хундерякова H.B., Сусликов А.В., Кондрашова М.Н. Высокочувствительный метод измерения ex vivo регуляции активности митохондрий in vivo II Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем. VIII съезд Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков. Минск, Беларусь,2008. 2 ч., с. 65 - 67.

24. Zakharchenko M.V., Chunderyakova N.V., Zakharchenko A.V., Kondrashova M.N. Responses of mitochondrion in immobilized lymphocyte. // 14th European Bioenergetics Conference, Moscow, 2006. EBEC Short Reports, Suppl. v. 14, pp 530-531

Подписано в печать: 20.03.2012

Заказ № 6897 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захарченко, Марина Владимировна, Пущино

61 12-3/920

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Захарченко Марина Владимировна

СОХРАНЕНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ СЕТИ КАК ОСНОВЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ УЧАСТИЯ МИТОХОНДРИЙ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ

РЕГУЛЯЦИИ

03.03.01 - ФИЗИОЛОГИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель Заслуженный деятель науки РФ Доктор биологических наук, профессор Мария Николаевна Кондрашова

Пущино - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Оглавление............................................................................................................2

Список сокращений..............................................................................................5

Введение................................................................................................................6

Глава 1. Обзор литературы по теме исследования............................................13

1.1 Организация МХ в клетке и важность этой организции для функционального состояния МХ....................................................................14

1.1.1 Существование МХ в виде ретикулума.............................................14

1.1.2 Организация МХ ретикулума в различных типах клеток.................16

1.1.3 Ассоциация МХ с другими клеточными структурами и ее функциональное значение...........................................................................19

1.1.4 Регуляция динамики МХ сетей...........................................................20

1.1.5 Роль сбалансированных деления и слияния МХ в физиологии клетки .......................................................................................................................23

1.1.6 Взаимосвязь структурных и функциональных изменений МХ........25

1.2 Обзор современных методов исследования функций МХ и возможности их применения в клинических исследованиях..............................................28

1.2.1 Гистологический метод определения «красных рваных волокон» ..28

1.2.2 Биохимические методы определения функциональной активности митохондрий.................................................................................................29

1.2.3 Цитохимические методы.....................................................................31

1.3 Физиологическая регуляция на уровне МХ.............................................33

1.3.1 Взаимосвязь симпатоадреналовой и холинэргической систем с функциями митохондрий. Субстратно-гормональная система.................34

1.3.2 Выбор СДГ как ключевого фермента в обеспечении энергией физиологических функций..........................................................................36

1.3.3 Роль КДГ как «представителя» парасимпатической регуляции в митохондриях...............................................................................................37

1.3.4 Выбор моделей для исследования разных уровней физиологической регуляции......................................................................................................39

Выводы по главе 1...........................................................................................41

Глава 2. Материалы и методы исследования....................................................44

2.1 Животные и обращение с ними................................................................44

2.2 Видеомикроскопические измерения гомогената печени........................45

2.3 Цитобиохимические исследования дегидрогеназ лимфоцитов..............46

2.4 Измерение дыхания митохондрий............................................................49

2.5 Окраска родамином 123............................................................................50

Глава 3. Исследования митохондрий в концентрированном гомогенате........51

3.1 Наблюдение ансамблей МХ в гомогенатах с помощью световой и электронной микроскопии.............................................................................51

3.1.1 Микроскопия в темном поле...............................................................51

3.1.2 Электронная микроскопия гомогената печени крысы......................52

3.1.3 Самоорганизация МХ в процессе хранения гомогената...................53

3.2 Изучение факторов среды выделения, влияющих на ассоциацию митохондрий....................................................................................................54

3.2.1 Влияние сахарозы................................................................................54

3.2.2 Разведение гомогената........................................................................56

3.2.3 Рассыпание сети под воздействием холода.......................................57

3.2.4 Влияние веществ, используемых в полярографических исследованиях на биофизическую организацию МХ................................60

3.3 Влияние физиологических факторов in vivo на процессы ассоциации/диссоциации МХ in vitro......................... ....................................63

3.3.1 Иммобилизационный стресс...............................................................63

3.3.2 Введение различных доз адреналина.................................................68

3.4 Изучение действия биологически активных веществ на процессы самоорганизации ансамблей МХ....................................................................71

3.4.1 Влияние прекондиционирования животных приемом Натурального Экстракта Доктора Мухина на структурные и функциональные характеристики МХ при ИС........................................................................72

3.4.2 Влияние окислительного стресса, вызванного длительным приемом препаратов железа на структурную организацию МХ...............................75

3.4.3 Влияние карнозина на самоорганизацию МХ в гомогенате печени крысы............................................................................................................78

Выводы по главе 3...........................................................................................82

Глава 4. Исследования митохондрий в лимфоцитах на мазке крови...............84

4.1 Разработка нового чувствительного к физиологическим изменениям в организме и сохраняющего структуру МХ метода.......................................84

4.1.1 Преимущества и недостатки цитохимического и биохимического методов исследования митохондрий...........................................................84

4.1.2 Влияние компонентов буферного раствора на физиологическую

чувствительность метода.............................................................................87

4.1.4 Выявление структуры и нативности митохондрий потенциал-зависимым флуоресцентным красителем родамином 123.........................93

4.2 Взаимосвязанные ответы СДГ и КДГ при изменении адренергической регуляции в организме....................................................................................95

4.2.1 Изменения активности СДГ и КДГ при использовании моделей стресса, выходящих за границы адаптации организма..............................96

4.2.2 Изменения активности СДГ и КДГ при использовании моделей стресса в диапазоне физиологической адаптации......................................98

4.2.3 Исследования ответа на стресс в зависимости от исходного физиологического состояния............................ ..........................................101

4.3 Коррекция патологических состояний биологически активными препаратами...................................................................................................109

4.3.1 Изучение механизмов лечебного действия препарата из гусениц восковой моли (НЭДМ) по реакциям ДГ митохондрий цитобиохимическим методом........................... .........................................110

4.3.4 Изучение препаратов кверцетина по реакциям ДГ митохондрий цитобиохимическим методом............................ ........................................112

Заключение........................................................................................................116

Выводы..............................................................................................................118

Список литературы...........................................................................................120

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДР адреналин

АЦХ ацетилхолин

дкв дигидрокверцетин

изл изолимонная кислота

ис иммобилизационный стресс

КГЛ а-кетоглутаровая кислота

кдг а -кетоглутаратдегидрогеназа

КС кортикостероиды

КХА катехоламины

МАЛ малонат

МРС митохондриально-ретикулярная сеть

MX митохондрии

НАД-ЗС - НАД-зависимые субстраты

нет нитросиний тетразолий

ОАА оксалоацетат

ПЭС психоэмоциональный стресс

СДГ сукцинатдегидрогеназа

ЦБХ цитобиохимический

ЩУК щавелевоуксусная кислота

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭС эндогенные субстраты

ЭЯНТ эндогенная янтарная кислота

ЯНТ янтарная кислота

RRF «ragged - red fibres» - рваные красные волокна

ВВЕДЕНИЕ

Изучение роли митохондрий (MX) в формировании физиологических и патологических состояний организма является одним из новых направлений современной медицины. Сложились такие пограничные между биохимией, физиологией и медициной области знания как Митохондриальная физиология, Митохондриальные болезни, Митохондриальная медицина. Они базируются на понимании того, что первичные, генетические, или вторичные, фенотипические нарушения митохондриальных процессов лежат в основе поддержания здоровья, развития патологических нарушений, их профилактики и лечения.

В настоящее время установлено, что MX в клетках объединены в динамичную сеть с участием эндоплазматического ретикулума -митохондриально-ретикулярную сеть (MPC); структурные изменения MPC связаны с физиологическими условиями и метаболическим состоянием MX (Bereiter-Hahn et al., 1994; van der Bliek, 2009). Достигнуты большие успехи в выяснении механизмов организации этой сети, осуществляющейся двумя противоположными процессами - деления и слияния MX (Hoppins et al., 2007; Palmer et al, 2011). Процессы слияния и деления MX включены в разные виды жизнедеятельности клетки: эмбриональное развитие, дыхание,

кальциевая сигнализация, активность нейронов, апоптоз и др. (Chan, 2006; Suen et al., 2008). Таким образом, взаимосвязь структурной организации и функции MPC становится очевидной.

Однако большинство биохимических исследований, которые ведутся на данный момент, проводится на MX, которые далеки от своего нативного состояния в клетке. Нарушение структурной организации в процессе исследования может привести к потере важных физиологических параметров по сравнению с таковыми в ткани, могут измениться интенсивность и даже направление путей биохимических реакций.

Роль MX в формировании физиологического состояния организма была

предметом исследования в нашей стране, в частности, в группе

М.Н.Кондрашовой, задолго до современного подъема интереса к этому

вопросу в международном сообществе. Благодаря работам группы сложилось

хорошо известное в России оригинальное представление, согласно которому

субстраты окисления в MX играют роль регуляторов физиологического

состояния. Наиболее яркое явление - огромное преимущество окисления

янтарной кислоты (ЯНТ) как источника энергии в митохондриях над другими

субстратами. На основе этого возникло предположение, что окисление ЯНТ

является основным источником энергообеспечения при активности в отличие

от покоя (Кондрашова, 1989; 1991; Kondrashova et al., 1982; 1988). Вскоре

выяснилось, что регуляция ЯНТ выходит за границы митохондрий. Ранними

работами группы М.Н. Кондрашовой еще в 1976 и 1982 годах было показано,

что в низких микромолярных концентрациях ЯНТ осуществляет регуляцию

гипоталамуса в организме и стимулирует выброс адреналина (АДР) и

норадреналина (Кондрашова, 1976; Maevsky et al., 1982). Эти гормоны, в свою

очередь, активируют образование и окисление ЯНТ (Kondrashova et al., 1982;

1989; 2009; Maevsky et al., 1982; Маевский и др., 2001; Кондрашова, 2002;

Khunderyakova et al., 2010). Выявление двустороннего взаимодействия

субстрата окисления ЯНТ и гормонов адреналина и норадреналина привело к представлению о существовании в организме субстратно-гормональной системы регуляции. Было обнаружено также, что существует вторая часть этой системы, включающая взаимодействие а-кетоглутаровой кислоты (КГЛ) и ацетилхолина(АЦХ) (Долиба и др., 2001; Шостаковская и др., 1986; Апёгееу е1 а1., 1986). Таким образом, субстратно-гормональная система связывает симпатическую и парасимпатическую нервную систему с процессами в митохондриях (Бабский, и др., 2001), (Кондрашова, и др., 2003).

Обширные по тематике и территории исследования по применению ЯНТ для оздоровления и лечения, проводящиеся в России на протяжении уже значительного времени представляют мощную практическую поддержку представлений о ее физиологической роли, сложившихся на основании исследований на животных (Кондрашова, 1997; 2001).

Все эти области нуждаются в разработке новых методов, которые бы

позволили заглянуть «внутрь» митохондрий данного человека или

экспериментального животного, чтобы осуществить индивидуализированную

диагностику и оптимизацию их состояния. При использовании для этих целей

современные принятые биохимические методы изучения энергетических

процессов в митохондриях была показана их малая чувствительность к

изменению состояния в организме. Полагая, что причиной этого является

грубое разрушение структурной организации митохондрий при их

выделении, были предприняты попытки использовать мало разведенный

гомогенат в физиологической концентрации хлористого калия. В этих

препаратах сохранялись части митохондриально-ретикулярной сети, в форме

которой митохондрии существуют в интактной клетке. Микроскопические

исследования такого гомогената впервые выявили распад сети при

стрессовых воздействиях в организме (Кондрашова и др., 1997; КопёгаБЬоуа

et а1., 2001; Захарченко и др., 2003; Темнов и др., 1997). Однако,

дополнительное разведение, которое необходимо для биохимических исследований, устраняло преимущества таких препаратов. Кроме того, использование биоптатов ткани непригодно для широкого применения в клинике. Поэтому было предложено использовать давно существующий опыт цитохимического изучения дегидрогеназ митохондрий по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ) митохондриями в лимфоцитах на мазке крови. В таких препаратах митохондрии сохраняют присущую им структурную организацию в клетке, чему может способствовать иммобилизация на стекле в естественной клеточной среде. Имеющийся большой опыт клинического использования этого метода в лаборатории Р.П. Нарциссова и его коллег показал его информативность, особенно изменений активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ), к изменениям состояния организма (Нарциссов, 1999; Петричук, 2005). Однако, с позиций современных условий исследования митохондрий биохимическими методами, состав сред, разработанный около полувека назад, представлялся неприемлемым. В нашей группе было проведено тщательное изучения влияния отдельных компонентов среды на чувствительность метода к изменению состояния в организме и разработан состав, обеспечивающий значительное ее повышение.

Изучение структуры и функции митохондрий в норме и при патологии существенно расширяет представления о возникновении и развитии многих патологических процессов на уровне клетки и организма в целом. Типы повреждения, связанные с характерными нарушениями биохимических процессов клетки, составляет основу специфических, клинических проявлений заболеваний человека.

Цель работы и задачи исследования

Задачи исследования:

1. Исследование возможности сохранения нативной MPC в гомогенате печени крысы при биохимических исследованиях.

1.1. Изучить влияние компонентов среды и условий выделения на организацию MX в гомогенате печени крысы;

3.1. Определить сохранность MPC в лимфоцитах на мазке крови;

4.3. Исследовать изменения активности СДГ в ответ на введение ЯНТ как синергиста АДР;

Научная новизна.

Информация о работе