Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка лабораторной технологии получения андрогенных растений моркови IN VITRO

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Разработка лабораторной технологии получения андрогенных растений моркови IN VITRO"

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР

На правах рукописи

ТАГАНОВ Бешим Овезгелдиевич

УДК 635.132 : 631.527.5

РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ АНДРОГЕННЫХ РАСТЕНИЙ МОРКОВИ IN VITRO

Специальность 06.01.05 — селекция и семеноводство

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1991

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур в 1987—1990 гг.

Научный руководитель — доктор биологических наук Заичкин Э И.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Дрягина И. В., кандидат биологических наук Марьяхина И. Я.

Ведущее предприятие — Московская сельскохозяйственная академия им. К. А. Тимирязева.

Защита состоится . . /УАЯ.......1991 Г.

в «/3» час. на заседании специализированного совета К 120.89.01 при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте селекции и семеноводства овощных культур по адресу: 143080 Московская обл., Одинцовский район, п/о Лесной городок, иос. ВНИИССОК.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ученый секретарь специализированного совета —

А. С. Агапов

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Морковь гл-<.:?,.{) является одной из цен-

ных и незаменимых ово!у«сс культур, обладающей отличными ьку с изыми и диетическими качествами.

В селекционной работа о морковью вое большее внимание уделяется созданию гагерозасных гибридов, обладающих важными хозяйственными признаками. Но процесс выведения подобных гибридов длителен и трудоемок. Презде всего это связано с получением гомозиготных лингй. Использование нетрадиционных подходов, з частности, метода экспериментального аадрогенеза в значительной мере ^окорило бы процесс полу чет; я таких л к ни Я, а следовательно в выведение гетерозяоннх гибридов.

Для моркови вопросы» связанные о получением андрогенных растений экспериментальным путем, не изучены. В связи с этим актуально получение гаги садов а дагаплоядов морковж с использованием культуры пыльная ов.

Надь в задача исследований. Цэль работы заключалась в отработке элементов технологий получения андрогенных растет а моркови о яопользованяем культуры двлышоэ. Дм достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

выявить роль генотипа растений-доноров в процессах каллус о-и эмбриогенеза;

изучить эффективность приемов низкотемпературных предобработок соцветий на частоту каллуоо- и эмбриогенеза;

изучить значение стадии развития микроспор в культивируемых пальниках на эффективность каллу с о- з эмбриогенеза;

определить оптимальный состав питательных сред для индукций каллу со- и эмбриогенеза;

изучить влияние консистенция питательной среды яа частоту каллус о- и эмбриогенеза;

отработать условия регенерации растений из полученных каллу ооз и эмбриоидов;

провести цптогенетическяй анализ растеннй-регенврантов и оценку на однородность по корнеплодам.

Научная новизна. Впервые отработаны элементы лабораторной технологии долучения-андрогеншас растений ыоркови методами окопе»» ри,(витального андрогеназа. Поэтапно изучены в оптимизированы условия, влиявщив на процессы каллусо- и эмбриогенеза (температурила воздействия ка соцветия перед изолированием пыльников, состав питатальной сроды е еа консистенция и т.д.).

Практическая значимость

1. Разработана лабораторная гехиидогЕЯ получения андроген-ных растений моркови с использованием культуры пыльников.

2. Подготовлены "Катодачаадаа указания 'по получению андро-генных растений в культура ццлыщков моркови путем прямого эм-бри оиогекеза" (1931).

Апробация работы. Результаты исследований долокены на заседаниях ученого совета ВНЖСШ, г.Москва (1988-1990 гг.), Международной конференция "Биология культивяруе.\щ клеток и био-технадогия", г.Наэосябирск (1988 г.), Научно-производственной конференции "Молодые учение - сельскому хозяйству Нечерноземной зоны", г.Ыосква (1989 г.), Всесоюзной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Основные направления КПП в картофелеводстве е плодоводстве и овощеводстве", г .Минск (1989 г.), а таказ на П Messy народном симпозиуме по эмбриологии и семенному размножению, г.Ленинград (1990 г.).

■ Публикация в печати. По материалам исолздоьавдй опубликовано 4 научные статьи,

-

Объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит/^ рисунков и ^"таблиц. Состоит пэ введения, трех глав, выводов,предложений селекционной практике, приложений л заключения. Спиоок использованной литераторы вкли-чает^/íj? наименований, з том чкслв^^" на иностранных языках.

2. МЕСТО, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ЛРШЕДЕНШ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проводились в 1987-1990 гг. в лаборатории биотехнологии ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур„

В качестве исходных образцов использовали оорта Нантоная-4, Московская зимняя A-5I5, вооеыь меясортовых в мелишнейншс гвбря~ доз ?2 й четыре инбредных линии из коллекции лаборатории ге*-нзтлки з цитологии ВНИИ СС ОК.

Дяя культивирования пыльников применялись следующие питательные среды: модифицированная срзда ЭДурасига а Оку га <- ШЛ / '4амck-tu.uci¿u j t 1981), Гамборга, Эвелэнга - B5

(ficuniny. , 1968), Нича {MUk , 1969) я среда

JS 6 ( <■, 1978) с добавление« веществ ауксин овей

(2,4-Д,ИУК,ШК,НУК) и цятокишшовой (кинетин, аденпн, зеатин, БАП) природы. Органические соединения: гидролиза? казеина, гидролизах казеина с дрожжевым экстрактам, аспарагив я глутамин такзз были использованы з экспериментах. В случав применения твердых питательных сред добавляли агар в концентрации 0,8$. Содарканиа сахарозы 2,0$. Ш среды 5,6-5,8.

Растения-доноры в зависимости от времени года выращивались в различных условиях: лотом - на поле, а в остальное время - в зимней теплице.

Приемы низкотемпературной предобработка соцветий включали следующие варианты:

1. Контроль - без температурной предобработки.

2. Температура +2+3°0,в течение 18-20 часов.

3. Температура +6+7°С,в течение 46-48 часов.

Стерилизацию питательных, растворов проводили 6 автоклава

при I атм, температура +120°С, в течение 20 минут.

Стерилизация растительного материала перед выделением пыльников осуществлялась в 10% растворе хлорамина в течение 15-20 ми« нут с последующей трехкратной промывкой сЮрильной метилированной водой.

Выделение пьиьников выполнялось лцц микроскопом МБО-Ю с помощью препоровальных игл.

Пыльники в течение первых четырех недель культивировались в термостате при полной темноте и температуре +25°С. В дальнвйием оне переносились на свагрустановка: фотопэряод 16 часов, интенсивность освещения 3500-4500 люкс, температура +22+25°G. По мере появления каллусов и ембриоидов было осуществлено субкультввиро-вание их на регенерацн ошше среды. Условия культивирований рас*, тителького материала в период регенераций растений аналогичны о вышеприведенными: фотоцериод 16 часов, интенсивность освещения 3500-4500 люкс, температура +22+25°С.

В доследующем растания-рвгвнвранты дореносилаоь в т орфо-пере г нойные горшочки, заправленные почвенной скосьв: торф, перогной, песок в соотноизнии 1:1:1,идя se на стеллааи в. зямкш) годлицу.

По мэре формирования корнеплодов, горшки о растениями, в отдельных случаях корнеплода, переносились в 5>ой отрои, где бшш созданы условия для прохождения яровизации: слабое oosoaiamso, температура +5+6°С. Продолжительность яровизации составила 75-80 дней»

После яровизации корнеплоды высаливались на стеллажи в теи-

Эмбриогенез

Г ■I

Пильняки

- ЛЪ ■

Каляусогвнез

ш

§

Додравдванзв регенерация эмбриолдов побегов

Укоренение

Пврзсадка в гор$о-пврвгвойнна горшки

Яровизация и посадка з грунт

Получение сеглян от семоолнлотм

//////У / —7777 //; /7-

,Рио. I. Пооладэвательяосгь атааов работ в исследованиях по культуре пыльников моркови

лица иле на пола. С началом цветения каадоз растение было вэсдиро-» bsho по отдельности с помощью рукав-изоляторов и проводилось оа-моопыление в пределах растения (гейтеногамно). Полученные о? самоопыления семена высевались б ноле для оценки на однородность по корнеплодам.

Схема операций, выполняемых в экспериментах по культура пыльников моркови с указанием этапов, приведена на рисунка I.

Биохшичвомй анализ корнеплодов для определения содержания каротина, сухих зеществ, Сахаров и нитратов проводился согласно общепринятым методикам (Ермаков А.И. я др., 1972)»

Цитологические анализы до определению фергильности пыльцы растений, стадии развития микроспор в изолируемых пыльниках, пло~ едкости растеыий-регенерантоз выполнялись по методикам, предложенный НаушевоЙ З.П. (I9SO).

Анализ полученного селекционного материала моркови методом электрофореза глобулинов семян проводили по Калининой Л.М. (Калинина ЛЛЛ. и др., 1990),

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по Доспехов^ Б.А. и Лакину Г.Ф. (1985, 1990).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭНСШЗРШЕНТСВ

3.1. Изучение роли генотипа'растений-доноров в процессах каллус о- я эмбриогенеза и отбор отзывчивых образцов

Пс мнению многочисленных исследователей, в. оксперш.зонты по культуре Пильняков и отдельных пыльцевых зерен долено быть чано возможно большее количество генотипов исследуемого вида» Это, прежде всаго3 объясняется генетической обусловлен!:остью каллу со- и ЕМбриоганеза из шлышков (jH<U:s-<th:i-c,-?-¿ г 1982; Иарунгняо 1!.Ы.в IS85; .%кьянюк С.Ф, и др.5 1968).

В швах исследованиях. среду 14 ясшпавксс образцов било отобрано пять гшютипов, которые отличались наибольшей калл^со-

я эмбрпогенноЯ активностью. Б таблица I приведена общая сценка каллу с о- и эмбриогенной активности отзывчивых генотипов. Эта данные служат подтверждением генетической детерминированности процессов каллу со- я эмбриогенеза.

Таблица I

Оценка каллу о о- и эмбриогенной активности отзывчивых генотипов (1987-1990 гг.)

Образец Посалено Кз них

пыльников, шт. каллусогенных эмОриогенных

ИТ. % шт. %

Нантская 4 3404 95 4,4 55 2,1

Московская зимняя А-5Г5 574 18 3,1 . -

Гибрид íj й 931 3930 150 . 4,0 228 5,6

Гибрид $2 Я 385 400 10 2,5 14 3,5

Гибрид ?2 Jí 31 1212 27 2,2 37 3,0

Примечание: Гибрид ^ й 931 был отобран как отзывчивый генотип в экспериментах, проведенных в 1987 году. В дальнейшем» о цельв изучения методических вопросов этот образец был поддержан в культуре путем клонирования, поэтому далее в текста будет обозначен как клен гибрида ?2 # 931.

Гот факт, что в числе отзывчивых генотипов не оказалось иябрадных линий,объясняется относительно гомозиготным состоянием генома последних, т.е. чем гетерозиготное исходная образец, тем больше вероятности того, что пыльники, изолированные из таких растений, окажутся активными в культуре.

3.2. Изучение влияния стадии развития микроспор на частоту эмбриогенеза

Как известно, существенным фактором в получении гаплоидов андрогенкого происхождения является культивирование пыльников с микроспорами на определенной стадии развития 19В6;

л/

- ~Г -

КгМбг- е/аЦ, 1986 и др.).

В наших исследованиях для сравнения были взяты пыльники о цакроспорам;; на стадии.тетрад и одноядерных микроспор. В результате удадооь установить оптимальную эыбриокомпетентнув стадию развития микроспор (табл. 2).

Таблица 2

Интенсивность эмбриогенеза в зависимости от стадии развития микроспор в культивируемых пыльниках (1990 г.)

пЛп.„„, ¡Состав пи- [Всего по- ¡Из них пыльники о микроспорами иирайьц .гат9ЛЬ1Юй ] салено |_на отадик__

ореды

ИТ.

!

тетрада одноядерных микроспор

шт. \% эмбрио-¡ганных шт. } % эыбрио-I генных

Клон нич+0,1 мг/л спл

гибрида 2,4-Д Ь0°

Г1 * 331 № 6+0,1 иг/л 2,4—Д

30 О

300 4,66±1,2 200 7,0+1,8 140 11,4±2,7 160 15,0+2,8

Данные экспериментов, приведенные в таблица 2, показывают эффективность культивирования пыльников с микроспорами на одноядерной стадии, которая не зависимо от состава питательной срэдц обеспечивает повышение выхода эыбриоидов в 1,5-2 раза.

Следует отметить, что дальнейшие эксперименты, в основном, проводились с пшьникаш, содержащая', одноядерные микроспоры. Для удобства работа по отбору таких еьшышков определили соответствующий морфологический критерий (см. кике).

3.3. Ощеледениэ мдр^рло^ического критерия МЯ. отбора ттнльнэтщв о .никррспррамя на

Из литературных источников иэвоотно, что у разных культур для удобства работы по отбору пыльников, содержащих микроспоры на необходимой стадшх развитая изначально устанавливается определен-

Полз - 1988 г.

70

65

60-

--- Теплица - лото 1988 г.

1-0 15 20 25

Диаметр сложного зонтика, мм

30 35

?ио. 2» Соотношение меаду диаметрам сложного зонтяна л количеством

одноядерных микроспор в изолируемых пыльниках ./nid;'.!гг. г^^п/

ный морфологический критерий. Например, в культуре пыльников представителей семейства Капустные, характерной особенностью которых являются большие размеры пыльников, в качестве такого критерия служит соотношение длины лепестка к длине пыльника в бутонах ( К(-(-и- ,-/.^,1986).

В исследованиях, проведенных наш по культуре' пыльников моркови, в качества такого критерия послужил диметр сложного зонтика. Было установлено, что существует соотношение мевду диаметром слоя« ноге зонтика и количество« микроспор на одноядерной стадии развития в изолируемых пыльниках (рис. 2). Так же выявили зависимость данного соотношения от условий выращивания растений-доноров. Высокая температура воздуха в теплице или аналогичные условия при выращивании растений в поле, способствовали ускоренному протеканий процесса микроспорогенеза. При этом пыльники с микроспорами на одноядерной стадии стадии встречались в зонтиках с небольшим диаметром. Тогда как сравнительно низкая среднесуточная температура летних месяцев затягивала этот процесс, в результате чего высокий процент пыльников с одноядерными микроспорами бил обнаружен у зонтиков с большим диаметром.

Следует отметить, что данное соотношение в незначительной степени обусловлено в генотипом походного образца..

3.4. Изучение э<ЗДектквно,ста нвзкотемтюРв?урр>пс

предобработок соцветий ка частоту эмбриогенезу

Как свидетельствуют сообщения многочисленных исследователей, различные приемы предобработок (температурные воздействия, различные козы радиации и т.д.) вф^гашцо шишат на процессы калдусо- к эмбриогенеза (Нгуен Тхп Дао, 1377; Стакнс В.П., Бутонко Р.Г., 1986 др.).

В наших исследованиях било изучено влияние одного из вышеприведенных приемов - воздействие на соцветия низкими положительными температурами (табл. 3).

Таблица 3

Изучение влияния низкотемпературных предобработок соцветий на частоту эмбриогенеза - клон гибрида й 931 (1989-1990 гг.)

1 I

Режим преобра- !Состав пита- Шосаже-ботки !тельной среды!но пыль! ' киков, _! _! ит.

:

5» эмбриоген- (Выход эмбри-

-V гп.гт!т,ии1тп1 пттттпл I*л п I

а

ных пыльников!оидов на эы-

!бриогенный _!пнлытак. ат.

Контроль (без предобработки)

+2+3°С, 20 час. +6+7°С, 48 час.

Нич+ОД да/л (жидкая)

300

350 350

3,0+1,0

12,611,7 6,8+1,3

1,5

3 2

В результате экспериментов установлено, что значительное повышенна числа эыбриогенных пыльников наблюдается при воздействии на соцветия низкой положительной температурой равной +2+3°С в течение 20 часов (более чем в четыре раза превышает аналогичный. показатель по контролю). При этом также возрастает выход эмбриои-дов на змбриогенннй пыльник.

В целом, в обоих вариантах опыта, где соцветия были выдержаны при низких температурах частота эмбриогенеза значительно выше,-чем в контрольном варианте. Это, по-видимому, связано с пулом выбриогенной пыльцы, накапливаемой в период низкотемпературной предобработки.

3.5. Сравнительное изучение эффективности основного

состава питательной стелы в процэсоаз, .аЖРДЕЗВЁаа

Данные, приведенные в таблице 4, свцдетельствувт о том, что интенсивность процесса эмбриогенеза находится в прямой зависимое-

-У/-

ти от основного состава сред. Сашй высокий показатель по коли- . чеазгву эыбркагенних пыльников наблюдается на среда & 6, Но число эыбриоидов на отдельно взятый шбриогенний пыштк было выше на среде Нича.

Анализ, проведенный на седьмой' день культивирования пыльников в условиях освещенности, показал, что эыбркоструктуры, появившиеся на питательной среде способны развиваться до проростков на исходной ш среде. Однако, на средах НяЧа и!6 развитие ам-брюидов приостановилось ка ранних стадиях - глобулярные и сердцевидные эыбриоидо (табл. 4),

Таблица 4

Интенсивность эмбриогенеза в зависимости от основного состава питательной среды «* клон гибрида Рт й 931 - (1988-1990 гг.)

Шо сажено ' Среда [пыльников,

! шт. __!_

'йа них э^бр^огвндкр^_ • | ЩИркбиррв. тт.

шт. \ % | всего на амбриогенный

- ■ I пыльник

___I-_I______________

В5 200 12 6,0+1,7 18 1,5

Нич 200 . 14 7,0±1,8 .28 2

№ 6 160 24 15,0+2,0 40 1,7' ,

Примечание: в экспериментах использованы жидкие среды.

Следует отметить, что эыбри'оиды, индуцированные ка средах различного минерального состава, проявляют неодинаковую степень придиваеыооти при переносе на регенерацпокнув среду. В стой плане лучшие показатели могут быть получены при использовании штатапь-¡юй среды по прошхси Гамборга, 8веданга~В§.

3.6. Изучение влияния различных концентраций 2,4-Д

1#ло исследовано влияние как низких (0,08-0,1 .ur/л), так и высоких (до 2,0 мг/л) концентраций 2,4-Д,

Данные, приведенные в таблице 5, свидетельствуют, что низкие концентрации 2,4-Д (до 0,1 мг/л), независимо от минерального состава питательной среды, способствуют эмбриогенезу. Дальнейшее повышение ее концентрации вызывает каллусогенез. Однако, на среда В5 при концентрации 2,4-Д - 0,2 мг/л, часть пыльников индуцирует эмбриогенез.

Таблица 5

Влияние различных концентраций 2,4-Д на частоту каллусо-и змбриогенных пыльников - клон гибрида Pj $ 931 (1988-1990 гг.)

-1-,-,----

Питательная! Концентрашш ¡Посажено ! Из woe. %_

среда 1 2,4-Д, мг/л !пыльников,! змбриогенных!каллусогенннх _!_! шт. 1 -_1

Вб 0,1 200 6,0+1,7

0,2 200 4,0*1,1 4,0*1,1

0,08 150 2,0

6 0,1 300 13,3*0,6

0,2 185 - 38,4+3,8

3.7. Изучение влияния консистенции питательной

.и заЗшдшшаа Многими авторам отмечена эффективность применения жидких питательных сред по сравнении с агаризовандаши ( V'CbnLctit , HcAdtJa^, IS76; Резникова O.A., 1984 и др.).

В целом результаты проведенный пата исследований согласуются о выводами вышеупомянутых исследователей (табл. 6).

Результаты экспериментов показали, что* на агаризовашшх средах индукция каллузеогеноза приходилась на третьи неделю и длилась

Таблица 6

Влияние консистенции питательной среды на интенсивность каллусо- и эмбриогенеза (клон гибрида № 931) (1987-1990 гг.)

Среда ; Состав среды

Посажено пыльников, шт.

Из них, %

каллусогенных ~ К и эыбриогенннх - Э

Жидкая МСМ+0,2 мг/л 84

Твердая 2,4-Ди кинетина 99

Еидкая Нич+0,1 мг/л 200

Твердая 2,4-Д 200

13,1±3,7-К 6,2±2,0-К

1.0-3

до конца шестой недели со дня посадки пыльников. Тогда -как на жидких средах продолжительность каллусообразования была более длительной по времени и наблюдалась до конца седьмой недели.

■ В процессе эмбриогенеза использование гладких сред положительно повлияло не только на количество зыбриогенных шмышков, но и на выход эмбриоццов на отдельно взятый эмбриогенннй пыльник.

3.8. Оптимизация условий - регенерации паотений из каллусов к эмбряоипов

3.8 Л. Регенерация раотепий из каллусов Важнейшим этапом в процессе получения андрогеналх растений является этап регенерации. В наших исследованиях для регенерации раотений кз каллусов была использована питательная среда МШ с добавлением кинетина.

Известно, что кинетин в концентрациях 0,5-2,0 иг/л вызывает угнетение, а затем и-гибель ткани моркови (КсЬныС , Х959;;Бутонко Р.Г., 1364). В наших исследованиях установлено, что кинетин в более низких концентрациях с табулирует переход каллусов к организованному росту.

-й-

Результаты исследований также показали, что способность каллусов регенерировать растения зависит от двух основных факторов: от генотипа растений-доноров и состава питательной среды, использованной для индукции первичного каллусогенеза (табл. 7).

Таблица 7

Эффективность применения питательной среды Ш.1+0,1 мг/л кинётина дая регенерации растений из каллусов (1987-1988 гг.)

Образец

{Исходная среда

;Субкультиви- { Из них каллусов {ровано каллу-; с морфогенезом ; сов, шт. '''

| шт.

Нантская 4 МСМ+0,2 мг/л

2,4-Д, кинотин

МСМ+1,0 мг/л 2,4-Д

Московская МСМ+0,2 мг/л зимняя А-515 1,4-Д, кинетин

24

24

25

21 87,5+6,7 12 50,0±Ю,2

18 72,0±9,8

Удалось выявить взаимосвязь между-структурно-морфологическими характеристиками каллусов и их способностью регенерировать растения. Каллусы, характеризуемые рыхлой структурой и бледно-зеленой окраской, проявили большую регенерационнув способность, чем каллусы с плотной структурой и иэлтой окраской. Последнее наблюдается у каллусов, индуцируемых на питательных средах, содержащих высокие концентрации 2,4-Д.

Следующим этапом процесса получения растений из каллусов является этап укоренения регенератов.. С этой цельта испытывали два варианта сред: & 1. МСМ без гормонов; & 2. МСМ+О.б мг/л МУК. 3 обоях вариантах но ыонее 90$ рагенорантов формировали корешки. З&инствешиш отличием, наблюдаемым у растений, подраздваемых на среде с ИУК, была способность н формированию более развитой стеблевой части. Формирование корней шло интенсивнее на безгормональной среде.

' -/¿Г-

3.8.2. Подращивание растений из эмбриоидов

Для подращивания раотений из эмбриоидов были испытаны три варианта питательных сред (табл. 8). Добавление в среду кинетина (0,1 мг/л) способствует образованию вторичных эмбриоидов, независимо от концентрации гидролизата казеина. При его отсутствии кадцый отдельно взятый эмбриоид давал начало только одному растении.

Таблица 8

Показатели развития эмбриоидов на питательных средах разного состава (1989-1990 гг.)

СпртйГгпРтга IСубкульти— ; Из них ! Получено состав среды вировано -:--- растений,

Iэмбриоидов,; шт. \ % шт.

__ I ШТ. ! I_!_

МСМ+0,1 мг/л кинетина и 500 мг/л " 60 50 83,3+4,8 - 57 гидр, казеина

МСЯ-гО ,1 мг/л кинетина и 100 мг/л 40 35 87,5±5,2 38 гидр.казеина

МШ+240 мг/л ОТ, 27 90 0+5 45 27

гидр.казеина м г/

В целом все три варианта питательных сред могут быть использованы для подращивания эмбриоидов.

3.9. Результаты патогенетического анализа

В целях выявления гаплоидов проводился подсчет числа хромосом в молодых листочках и корешках растений. А при прямом эмбриогенезе соответствующие анализы проводились на стадии молодых проростков. При этом для цитологического анализа были зафиксированы кусочки тканей проростков в период переноса на регенерационные среди.

Результаты цитологического анализа позволили установить,

что регенеранты каллусного происхождения диплоидные. Среди расте-гшй'змбриогенного происхоздения (просмотрено 30 растений) в большей части встречались дишюидн и анеуплоиды (25 растений) и только в пяти случаях наряду с диплоидными клетками встречались и гаплоидные. Следует отметить, что такое явление наблюдали при просмотре раотительного материала зафиксированного тленно из молодых проростков змбриогенного происхоаденил.

Анализ литературных источников показывает, что у многих культур возможность получения чистых гаплоидов маловероятна или полностью исключена. По мнении авторов исследований на ранних этапах формирования гаплоидов из микроопор в них идет процесс спонтанной дигаллоидизацки, обусловленный генетической нестабильностью гаплоидных клеток. Такое явление наблюдается в культуре пыльников рапса ( Дс'^г- Л&. , 1975), пшеницы {Ски сг л( , 1978), брпссельской капусты (Ос&ап^он, 1986) и многих других культур. Следует отметить, что этот путь получения гомозиготных растений расценивается как наиболее эффективный, т.к. при этом отпадает этап перевода гаплоидов на дигаплоидннй уровень экспериментальным путем.

Кроме .'Того, обычно растения-регенеранты разной плоидности встречаются при каллусогенезэ. В связи с тем, что индукция прямого эмбриогенеза в наших иооледовашшх достигнута при использовании минимально низких концентраций гормонов, обладающих в культуре побочным эффектом, вероятность появления ынксоплоидов была сведена к минимуму.

Возможно,в налгах исследованиях кусочки тканей для анализа были зафиксированы в период спонтанной дигаплоидизащга. Как выше било отмечено, гаплоидные клетки обнаружены среди молодых проростков. Однако, анализ корешков и листьев, взятых из регеноран-

тов на более поздней стадии развития, показывает их диплоидность. То есть к моменту фиксации, по-видимому, произошел процесс спонтанной дигаплоидизации. Миксо- и полиплоиды среди них не были обнаружены.

Отсюда следует и л I щ вывод, что анализ плоидности полученного растительного материала не позволяет давать окончательную оценку на дигаплоидность. В связи с этим прибегли к косвенным анализам дигаплоидности, в частности, к электрофоретическому анализу глобулинов семян первого поколения Я. J полученных по образцу Р 385 от двух растений эмбриогенного происхождения. Сравнительное изучение спектров глобулинов семян испытуемых образцов с таковыми родительского растения (гибрид £]-) показало их большое различие. То есть спектры глобулинов предполагаемых дигаплоидов не соответствовали спектрам глобулинов исходного растения, следовательно, это указывает на возможное андрогенное происхождение полученных образцов.

Еде одним подтверждением дигаплоидности полученных образцов является следующий факт. При культивировании пыльников гибридного образца № 931, который был получен, от скрещивания дикой белой моркови с морковью оранжевой окраски корнеплода, на питательных средах разного состава были получены эыбриоиды путем прямого эмбриоидогенеза. Установили, что часть корнеплодов из этго: эмбриоидов имеют окраску, обусловленную рецессивными генами. Это указывает на то, что получена гомозигота по рецессивному признаку окраски.

В связи с тем, что все вышеназванные методы предварительного отбора дигаплоидов (цитологический анализ, электрофоретичес-кий анализ глобулинов) относятся к косвенным, для наиболее достоверного определения природы происхождения полученных нами образцов была проведена оценка на однородность по корнеплодам.

3.10. Оценка ¡а однородность до корнеплодам

Летом 1990 года на поле высевались семена от самоопыления ^ I по пяти растениям, полученным на основе гибридов й 385 и № 210, а такао й 91 - гибрид Ро. Растения по образцу й 385, аз которых были получены семена (2 растения), имели змбриогенное проясхоаденив, а ло образцам Л 210 я 3 91 - каллу снов происхсщце-нив (2 и I растение соответственно).

Несмотря на низкую всхожесть высеянных семян, удалось получить корнеплоды по образцам: 385-1 - 15 шт., 385-2 - 27 шт., 210-1 - 29 тт., 210-2 - 23 шт. и 91 - 8 шт.

Описанием корнеплодов установили, что образцы 385-1 я 385-2 проявляют однородность по всем изучаемым, параметрам (табл. 9).

Таблица 9

Морфолого-анатомичэское описание корнеплодов выравненных форм

Описываемый признак

385-1

385-2

Форма корнеплода Поверхность корнеплода

Форма головки Величина головки Окраска мякотя Окраска сердцевины Размер сзрдцзвивы Оор.ма сердцевины

цилиндрическая

кондчеокач

гладкая с выраяан- гладкая с выражен-

ными глазками слабовогкутая маленькая ораняевая светло-оранжевая маленький округлая

ныма глазками слаб овогиу тая

маленькая светло-ораняевая нелтая средни В

округло-граненая

Аналогичны!) анализ корнеплодов, полученных на основе образцов 13 210 и И 91, показал, что з них сохраняется разнообразие признаков. СтадаемоЗ однородности внутри отдельно ■взятого образца при этом на было достигнуто. По нашему инактэ, это объясняется ооттвчоокпм проаоха-эдекием каллусов и, следовательно,

-М-

указывает на неэффективность применения каллусогекного пути для получения авдрогонных растений моркови.

В таблице 10 приводятся хозяйственно-ценные характеристики, выравненных форм, которые проявили однородность по всем изучаемы!»! параметрам. Данные таблицы показывают, что оба образца превосходят контроль по содержанию таких важных компонентов как: каротин, сахара, а один из образцов и по содержанию сухих веществ.

Кроме того полученные образцы обладают лучшими показателями и по содержанию нитратов в корнеплодах.

Таблица 10

Хозяйственно-ценные характеристики образцов

Образец

Содержание в корнеплодах

корнеплода, г каротина, мг% сухих веществ, общего сахара, нитратов, ыг/кг

Контроль 78,4410,9 (Нантская 4) ~ 9,3 14,2 6,2 99,0

385-1 64,3+8,6 15,2 14,6 8,1 91,5

385-2 40,3+5,8 9,9 13,0 7,9 43,3

В заключение следует отметить, что эксперименты по отбору дигаплоидов будут продолжены по маре подращивания полученного андрогенным путем селекционного материала.

ВЫВОДЫ

I. В результате проведенных исследований разработана методика получения андрогенных растений моркови с использованием .культуры пыльников.

2. Показано, что процессы каллуоо- и эмбриогенеза генетически детерминированы. Доказательством тому служит следующее: среди 14 испытанных образцов отобрано пять генотипов, которые отличались сравнительно высокой каллусо-эмбриогенкой активностью.

3. Определена оптимальная стадия развития микроспор для повышения выхода эмбриоидов - одноядерные микроспора*

4. Установлено, что морфологическим критерием по отбору пыльников с одноядерными микроопорзш слуииг диаметр сложного зонтика.

5. Доказана эффективность предварительного воздействия на ооцввтия низкими"пояокительными температурами (+2+3°0, 20 чао). При атом чаотота эмбриогенеза повышается на четыре раза по сравнения о контрольны!.! вариантом без предобработка.

6. Питательные среды Bg, НИ9 а 6 обеспечивают наибольший выход эмбриоидов, а срада МСМ баз гормонов их дальнейпее развитие в растения-рагекеранты.

7. 2,4-Д в концентрациях 0,65-0,1 ыг/л способствует эмбриогенезу. Дальнейшее повышение ае концентрации вызывает каллу с о-образованао аз соматических клеток пыльника.

8. Применение жидкой среды до сравнении о бинаризованной повышает частоту эмбриогенеза до сема раз, а каллусoreнеза.в 2,5-3 раза.

9. Доказано, что эффективным путем получения андрогенных растений моркови является прямой эмбриогенез, минуя каллу с о ой-! разование.

ПРЕДЛСЖЕКШ СЕЛККЩШНОЙ ПРАКТИКЕ

Разработанная методика получения андрогенных растений моркови позволяет выделить выравненные формы за сравнительно саа-тыз сроки чем методы традиционной оаденцаа. Следовательно, з?а методика могет быть применена з целях практической селекции как Дактор, повышающий эффективность всего селекционного процесса.

Зломенты разработанной методики получения андрогенных растений мокно использовать для разработки лабораторной технологии производства гомозиготных линий моркови.

-21-

Но теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Тюкавин Г.Б.,Тимин Н.И..Заичкин Э.И. .Буракова И. А., Таганов Б.0. Получение растений в культуре изолированных пыльников моркови. Тезисы докладов Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология", Новосибирск, 1988, с. 242

2. Таганов Б.0.,Тюкавин Г.Б. Культура пыльников моркови

"ин витро". Тезисы докладов Всесоюзной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Основные направления НТП в картофелеводстве,плодоводстве и овощеводстве", п.Самохвалозичи. 1989, с.107

3. Таганов Б.0. Разработка метода получения гомозиготных линий моркови с использованием культуры пыльников. Тезисы докладов научно-производственной конференции "Молодые ученые сельскому хозяйству Нечерноземной зоны, Москва, 1990, с.127

4. алшп & В, Зодяпогг & О., Ноиитогю

ч ам&ал. сиМ.изи Ссияюк оп

тМло " (Л^ЫсиМ) XI ^ьугп/асмшггт.—

Ъгг) ¿ПМ€>£с<-М ОпЛ . "^ИПлт^гСиЛ

ъ-ч'то.

-гг-