Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Разработка лабораторной технологии получения гиногенных растений моркови in vitro
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство
Автореферат диссертации по теме "Разработка лабораторной технологии получения гиногенных растений моркови in vitro"
■Й-.Ш6-/
На правах рукописи
ДОМБЛИДЕС Артур Сергеевич
. РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ГИНОГЕННЫХ РАСТЕНИЙ МОРКОВИ //V У1ТЯО
Специальность: 06.01.05 - селекммя и семеноводство
АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соасшм ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук
МОСКВА -2001
Диссертация выполнена в лаборатории биотехнологии ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур в 1997-2000 гг.
Научный руководитель: кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник Г.Б. Тюк» вин
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, член-корреспондент АН РМ Н.Н.Балашова
кандидат сельскохозяйственных наук старший научный сотрудник В.ИЛсунов
Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский
институт сельскохозяйственной биотехнологии
Защита диссертации состоится «_____и............2001 года в.....часов
на заседании диссертационного совета Д 220.019.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте селекции и семеноводства овощных культур по адресу: 143080, Московская обл., Одинцовский р-н, п/о Лесной городок, пос. ВНИИССОК. Факс (095) 599-22-77; E-mail: vniispok(g}<rebpi
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур
Автореферат разослан «.....»............ 2001 года
Ученый секретарь диссертаииоиного сотата Д i'i л? {'-> доктор оельскохозяСст'!?--
.. ' /V"
Е.Г. Доб руцкая
■ ' ^ ОБЩАЯ XAPAICrÉPIICI IIKA РАБОТЫ V •
- Актуальность "темы. Современная селекционная практика нуждается в но-выхметодах, которые позволили бы повысить эффективность селекционного ' - процесса „ улучшить качество конечного продукта. Используя методы' • V биотехнологии растений, такиёкакандрогенез и гиногенез in v/fro, можно сократить сроки создания линий моркови в 3-4 раза. При этом, дм получения •гетерознсных гибридов F| моркови наряду с фертильными линиями В и С, ; которые можно получить, используя метод андрогенеза (Тюхавин, Шмыкова, -,.-' 1999), необходимы и линии А с мужской стерильностью. Процесс получения стерильных линий моркови методами традиционное селекции-довольно длителен и трудоемок, и не всегда удается получить4линии, отвечающие . требованиям гетерозисной селекции. Для ускоренного создания выровненных : линий с мужской стерильностью в лаборатории биотехнологии ВНИИССОК . проводятся исследования по разработкеметода гиногенеза моркови. .
Цель и задачи исследований, Цельюданной работы являлась отработка ряда этапов лабораторной технологии получения гнногенных растений моркови in vitro и оценка полученных дигаплоидных линий in vivo. Исходя из постав' ленной цели, нами решались следующие задачи: . ■■ '
1. Изучить взаимосвязь между морфологическими показателями соцветий, ор-'; ганов цветка и процессами микро- н макроспорогенеза уморкови для отбора ! , . необходимых экстанто» в культуру; . \
- 2. Определить оптимальные стадии зародышевого мешка, при которых происходит развитие гиногешшх структур у культивируемых in vitro семяпочек;
3. Изучил, цитологические особенности гиногениого развития каллусных и эмбриоидных структур из клеток зародышевого мешка;'
4. Разработать элементы технологии получения гнногенных растений моркови методом культуры неопыленных семяпочек; ^ ■ V. / ,
5. Провести оценку андро- и гнногенных растений моркови по морфологиче- : ским, биохимическим и молекулярным показателям. >■.".■■.:■.
........
1 '*-* *'•". ■ . % :',**'> * 'г-. . - * ■. ... .
. " л ' ".- ' " "> - : ; ~ 1 - ■' " ^ - ■ ■^ '■+ ^ " ^ . .; t V ' 4 Г . - 1 ■ -
'■: ,*чД Научна» новизна. В работе показаны корреляционные взаимосвязи между ' • "
»'-л. "V." *.■■., -Л 1-ч'-'Л^Л.гЦ»; 'чч;!.!, '1; ; ■. . .- ■ . ■.
/ ' стадиями развития микро- и макрогамегофнт Выявлена способность 2,4-Д ин- - - ; .. . ^ - V-. дуцировать деление клеток зародышевого мешка с последующим образованием ^ -
' * ''' >- ^'*1'V- ' ' :ч 1 > |. • .-,<".<- . • ' ... - . . . ■ ч ' -У. >
.. ; - . .га них каллуса и эмбриоидов. Предлагаемая технология позволяет, используя ■■■' у ,*-« „•■'■"-м >- ..»:*:•;<?' '.А - ' • ■--- Л;.,"'"-.'
1 одно фертильное растение моркови, одновременно получать как андро генные, V ^
.'так и гашнгенные линии.'Проведенные морфологический, бнохимический и мо-' * ^ ''
лекулярный анализырастений ^ моркови подтвердили андро- и гиногенное ' ■
происхождение линий. Впервые была показана возможность использования ти- ^' ■ г«-,.
; ^ ' диазурона в ячестве индуктора гиногенного развития моркови. : Г : :;. ■;
; - . Цраутичес^ значимость. Морфологическое и цитологическое ' изучение ! *
-. ' - -развития соцветия моркови и стадий развития мужского и женского гаметофи- *
^ -5'-w.fi ?>Т'- . г'и • ГГ-1..'- иг'.:, ч* ;; -у " Т -'-Г
. тов позволили выявить морфологические показатели для отбора необходимых .:,--
■ | -''- ч г'-,>- г.,, »'"»г^э- ,:-- ¡>- К'у. ч ', »•-.. и' <.* -I . -т.-' ' "¡.
".- эксплантов с донорного растения для культивирования т уНго без трудоемкого ; ; цитологического анализа. Показано, что наиболее информативными морфоло-: ^т '-1 5
. : ■■ '.'. ■ - > I'. .-' ; 5 , \ ■ > >>,■'"' 1. • ■ -- ' .- .3"'.'-.1- .' ■ ^ г I .. ». ■ ^ ' ;
■ гическими показателями для отбора необходимых эксплантов с нужными ста- • Т днями развития маиро- и микроспор являются линейные размеры пыльников.; . ^ ^
-л. :,; ^Были разработаны этапы получения гиногенных растений и показана возмож-1-^ :
. Ч - т. 1' ■ 1 ' ~ к V4'.; - ■ ' ' ■■ - ■ < >,"-. л л. "1 - Ч - • 'Л-*' "
- • \ностъ использования культуры неопыленных семяпочек т уНго как для получе-* - - ^г ния фертильных, так и стерильныч линий. Для расширения спектра генетйч^-'. • ,
^ . Г' -- .. . • - "г■ ■ У." . .. ^ *.• > г. . ^ - ^" " ' - ... V >■. : ^ - . ... . .. .. ^ -
разнообразия растеннй-регенерантов моркови," полученных методом ти- ; ^ • . ' ногенсза. мож!» рскомеиловап. использование тилиа^урона. . " ^ . ■ :
> Г"'. - ~ ■" V ' ' Ч ' * -.Г .¿.е- —1 !
, ».„-г ■'.„■ ¡Дпр^шрщ- работы. Материалы / диссерташш гфедставлялись на:лШ
- ' V:; ^-Г ^^Л ; ЛГ'''.'*' -I \ ' . ; . '.'Л >¡1.' .'.>г- ^ ' .'-' '-'и
: ' . Международном симпозиуме «Новые ' : и т > нетрадиционные; - растения н
. - - ли . - г ' > . ч '. . ■ - ; . ' ■ - (-■■ ■ ■ • ■ ■.. . ^ . ..■ ' ..^ ' • * '
г" перспективы их использования», Пущине," 1999; Пятой Междунфодной конфе- ■
\ ; - Г Л;. ■, ; :, I :~>-1 ^'И -1 л .■-ч,*^"'' • п.-«.",?.'. ■■
; -ч • ' ре1щии «Регуляторы роста и развития растений», Москва, 1999; Метадународ*',""Л-V
,'-••: '-М1. -■< ."--.' - (С^К:.';!-;-'^.:-« 1 >Гы ■.-*;■' ■.-. . '
■ ной научной• конференции молодых ученых-овощеводов (вторые Квасников-
■ с кие чтения),. Москва, 2000; Международной научно-практической конферен- - ^ ■ ^
^ ^ ции «Селекция и семеноводство овощных культур в ХХ! веке», Москва, 2000; II' . Международной , научной■ конеренции «Биотехнология в^растениеводстве,г > ; : живпггноволстве и петепинапии»'. Москва. 2000."' ' с_ : ■ -
»•Т..- " " ч« -.'
г*.VV
: • •. ,• ," Структура и объем работы , Д и<хжртешиониа* ■ ■" работа изложена ' на . 140 -. - Г.' '" ■
. - ^ ]58; наименования^^(45;отечественньгх^и ^ 113^иностранных)/. Диссертация ч " ^ ' ; -г4' иллюстрирована 39 рисунками, включая фотоснимки, и содержит 17 таблиц.у * ^ >
: ';*■"Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории биотехнологии, : >:
: 8Р V ВНИИ селекции и семеноводстваовощных культур! > ■ ч*-' - * • •
'X'.' Объектами исследований служили растения морковнеортов Нантская*4, у V "
• , 4 111,1Ж^Ч V А л У ■' ■ ' , ■ * '' ' ' ' ТМ111 ЧГ\ > п * * ^ - ' - . . ^
- шейком грунте (пленочная теплица), а сорта НИИОХ 336 в вегетационной ка- \ - мере (подвал ВНИИССОК) над лампами ДРИ 2000при освещенности клк,,.--*-гЛ - ' '.16-часовом фотопериоде и температуре 20-25 С. Стерилизацию первичных экс- .
плантов^ (бутонов) пр<^дили "в течение 20 минут воднымраствором ' ^ > ; -
,- •* сулемы с добавлением »с нему вкачестве эмульгатораТвина 20 в соотношении -' капля на 100 мл раствора! После стерилиэашш бутоны трёхкратно промывали ; ; . ■ • по 10 мин в стерильной дистиллированной воде. " • ; •• ^ ;• • . • . - - - . •
,■ * Андротенез т уНго. Культивирование пыльников проводили по методике,*^ ■.., . ' разработанной в лаборатории биотехнологии ВНИИССОК" (Тюкавин, Шмыко- -'ч '
/ ."' 'Л-:^,..,, ^ 1 1'м'г1-'>.■■■ •.'л• • и!- ч '. »V*' '»•¿ч.-^я *
;; 'гг ' Г^н9гене? № Методика культивирование завязей;и/или семяпочек . %
аналогична методике культивирования пыльников и заключается в следующем:. ■ /
аТ ; . Г 1 — первичными эксплангтами являются бутоны, которые культивируются в те- ;
; - '1 чение 2-4 недель в темноте на агаркюванной среде МСм (Маздйа е1 а1, 198!) с ; . V: .
v ? •до образования гшбриойдов и/или эмбрногенногЪ каллуса; 3 — эмбриоиды и/кпи - ^ ' •
~ 1У: \ часта кгшлуса персносятся на среду МСм с тйетшк>м(0,1 мг/л) ! регенераций
•'"'■,^'¿4 .V >. f ..'..• .. -.V-' - ;. ^ ; • ;. •. / ." - -. •.*.• * • <■■.
11. > пиная спела: гле нпет rmoiieec лппхюплии! гтпопосткпа m шльтивитпемых мс—. " ~ *
"--Г " * ^ . " .... г.. <■
. ;■ Культивирование м упю Акдротенные и гииотенные растения-регенеранты • ;
V "'/ - - .г-: - ■ ' . . ■■ '•' * • - ' •>': /..-V-'. - • . ■-«;
" • высотой около 8-10 см, вынимали из пробирок и высаживал» в торфяные гор- V ч .„ 'Ч-.:---'-'V- ' .. ' ' • ; • \
г шочки со стерильной почвенной смесью, состоящей из дерновой земли и торфа - . л >
. : .V • • V, : » - ." ■■ • •- " : • - •• - ,-<...... • •• - - -V; , .
"»"л-: в соотношении 1:2. Растения накрывали слегка перфорированными полиэтиле. .х •; новыми пакетами. Через 2-3 недели после появления 2-3 новых листьев пакеты С
. - . , ■ снимали. Укорененные растения Яо моркови высаживали в пленочную теплицу ^ ' для дальнейшего выращивания.; ■ • . . ^ • . : * V ' • _ •>1\< ■
. " . . . .г... „ ^ , . - V . „: . . . г - »' ) _ '' ' '.'Ч -! . М ■*» * ' * '. / ' ' - ^ V . .
' .Л' /. Г* Л. г-^..^..Ч.».. * о: МЧАМПИКАЙАП» к. ■ ' ' ' ■
- моркови 'высаживали. в
"" " ...... : . -И»/»*';»..
> пленочную теплицу. Во:время цветения проводили ' j-'rS индивидуальное самоопыление каждого андрогешюго и гиногенного растения ; i/.-j-V --t в отдельности..- Полученные от каждого 'растения семена. высаживали на -. следующий, год в теплицу. Контролем - служили "семена; суперэлиты ' сорта л :
■ Л:Нантская4.1-1>у- •' - .' - ' -
; RAPD ~ аиалю проводили на базе лаборатории генома растений центра -„7;Г - Биоиюкеиерин РАЛ. ^Для выделения растительной 'ДНК' был' испольюаан :
' * '.-. ' i ; - ■ ' J - • - Vf.-1 ' .. V' "Lp t i г n i, ' .. j-, h * . ' • ■ ■ ■
'•'•. : * ? •i. •'«^ " '.:V.V- Т'Л" /. - > У.; Г ^-"V V" •
J;.-"- ' ■ -.• - • ^ . ... ~. - ..V ■ : • -:, ч ; ■-■-.■«•Л
■ роспор и пыльцы проводили по'общепринятым методикам (Паушева, ■ 1988). *■■■ ■
:*::<;х,'—' •.-.-. • / • v.
у V : Отологические исследования проаодили на временных препаратах- При выде-:
' -7 ,т Нашей модификации вместо цитазы использовался фермент маиерозим («Servswi''> " •
•*.'■_ ^. ;; • '--ч'пчч я"",1!'"!'!!:' ''!:"'';: г-.'Ч- v ■ .v -'„' ■ v .. «■ >'(■":> t - \
■:: ■... ■!: Математическая обоаооггка 'данник * Пои • nfinaRante - wc№nHM«iT9i».iiiji '
: i ? Математическа^_убработка 'данных * При обработке эксперимеш-альных: .''* ."; ' ' /данных,* использовали;^общепринятыемагематикснстатстическиеметоды "" v,V'
; u -j J. Определение взаимосвязи между стадиями развития мужского иженского^-у . •;. ; Г ' i '; ,... . гаметофита и линейными размерами соцветия и цветка моркови ~ * :, •; '
w - i ; ПеРеход с гаметофитного nyni развития на спорофитный при культивиро-, ■■
вании in vitro как Пыльников» так и семяпочек возможен лишь на определённой »•' ■л' ^ ;' .: •• ••-•.v»* ,<.•:: .'....•-ч т.:.-"';V • :•; ' : ... •'., '•'Т:.:-? • . л стадии развития гаметофита. Успех получения каялусных и/или эмбриоидных J
. ;_л> | : ; ; ... • ^ .—wi. ■ " . . . ... ' _ . . ' .. * . ' ; т
' - гаплоидных- структур зависит от правильной оценки исходного состояния раз- • , ? "*';* ■ вития гаметофита донорного растения,' ' ■ V'
Lv ~1; ^ Г-.Соцветие'у моркови —'сложный эоигик, состоящий из гтростых зонтичков,"!^ ''^/
" 1 * ' • каЛпЛ UW№UUU У Tin гттипяпи -1 fftl^rirU b lAuruuwav' tiArtVAnu Muv lt1HlAi*VUft norti.' J' ..' "
■> *\ {наружние лепестки значительно крупнее внутренних).'Чашечка редуцирована ; , - ^ - / '' »-> и состоит кз пяти небольших зубцов. Венчик из пяти свободных лепестков бе- : > . ;V- лого цвета с загнутой внутрь верхушкой. Андроцей из пяти чередующихся с
'\ : лепестками тычинок; нити тычинок длиннее лепестков. Гинецей синкарпный ' ,•»'.
.-г»': 1 . А;,ч .3*■■ ^ЧД-.'.'^^Т}, л
;■' л образован двумя плодолистиками. Столбико» два, в основании их — двухраз— .■>
г i.'.'¿"v-v 'В таблице 1 представлены стадииразвития мужского и женского гам его--' Л
' ■... ^ ^ ■ г ).v + у .л, i • v г .J ■ '. . >; ':: ,. '.v.' . » ' - /Г'Т ' ,*.:-. , i. : -.v *.
•".л
; 'Л (^'•лЛЯ ^ -^^лТ)V I* Л ч^'Г^т1 е.4.;:Л*Г. г/ .1, 'л,<;_■ Таблица I
Д : ' Х- * ^Соотношение между стадиямимужского и женского гаметофито» в цветках ж^коеи^.-;^^" ^
-„'-/" Вариант . "
- -л '1 - г.
* 4 Г- ■■
V ■ V1 . - -+г.* . л
. . . т- - 1 . • ■. - г- I . .V,
Стадии рмвитик мужского гаието-- фита ч Л А » д *
• у _ Материнская клетка пыльцы *
^Тетрадамикроспор , ^ г
.<• ;■' Распад тетрад
^■*' . I ■ >. 1 . -<"./ т .л 1 '... -г
, , ^ ~ п' — 1 . — ■■ *
, Молодые микроспоры
- 4".' Одноидерные микроспоры
: Поэдике одноядерные микроспоры
'1 -"Даухклеточиая лыпыи-''^ ^ ^
-■•Т- % •■■ ч ■ • * ■¡'¿■-■■Л
Тре*клегочна<пильца ^ ¿.^е. ........_____ _
Стадии развития женского гаметофи-' ;,*
Зачатки шкзк *1
• Зачатки семяпочек и материиска* -клеткамакроспор.С:
Материнская клетка макроспор и ли-/ ' . ^. нейная тетрада макроспор
Линейная тетрада макроспор н одно. . идерныЯ зародышевый мешок .;
■ ? ■ -
Одновдериый и двумерный зароды- -шевый мешок ч- 1-;,
................... 7.......-----------—..........
ДвуадерныЙ и четирекядерный заро- 1 жУи 1Д""1®®"® мешки ^ ■ :
¿Четыремдч'иыЯ н тоскмиядерный
. зародышевые мешки ;»4 ъ -л,
, Восьмиядеркый н семиклеючниЯ ; ■: зародышеаые мешкн не достигший - окончательной степени зрелости ^ {; '
'7. Зрелый зародышевый мешок % ^
■ : , г. ?
.регрессионного анализа было показано, что взаимосвязь между макро- и мик- '
■,'!■■5-и - . С;*?-'-. Л"'11 VV. 1:Л'""й ' ' Л /»л'.
рогамегофитом в соцветии моркови достаточно сильная, с коэффициентом кор- ,: •
" ; - , реляцни 0,89. Это позволяет по стадии развития микрогаметофита определить
.. ' ^ < • • л < '•>••4... Ч.1: • >м »*« г-— - • •<*■ .¿.л ..:!. .>• ^'> .
V г состояние раввигия зародышевого мешка, что является менее трудоемким^ Од- ^.
V I * нако наиболее быстрой и гтростой являегся визуальная оценка состояния гаме-',, .
''V,.^I.• •>.• г« '-., и- •> ^'.■--г-.'л.'Л "■■.^¿'"аЬ.-;^,
.'Лтофига по морфологическим признакам цветка и соцветия. Для нзучениявзаи- у;.
: - ; мосвязи мгжду стадиями развития макро- и микрогаметофита и морфолотче- :
■■>''"(,' './зд'.^иц^:;. <:*."'>>-.^■■ V"'.* '
У скимн показателями соцветия и цветка использовали 7 зонтиков диаметром от 2 »
■'•■ '..' -'¡'-г.'' 1 >-,"* ■
,г ^ V до 14 мм растений моркови сорта Нанггская 4, выращенных в открытом грунте. / V •*..
' • N • ч.- ^ г;!/- Г.г •' V". ""V" ,
; Во всех исследуемых эонтичках были представлены бутоны со всеми описан- \
■г V у.--"'!'Л ^ь:. л1 ' .■.»'■ -¡г-.'.-- ц.'-г-ч-^;-^'.^ч* ~
^ ' : ными в таблице 1 стадиями развития макро- и микрогаметофита. '. а ^ -V
■ "-.V: \ ; / — ..■. , у,* ■ ■ - ■■■. ? . .■- А < • ■■' ' . ■* ■ .1 ч--' . I ■ \ '-•у. *1' »
;; ' ^ ^: ^ ч ]'< -."-.ч : " ^ ~^ У.'
'Кг 'г*-""
Корреляционная зависимость выявлена между: всеми морфологическими показателями соцветия, цветка и стациями развития мужского и женского гаме- ; тофитов (табл. 2),.Наименьшая корреляция наблюдается между диаметром зон-^ тика и стадией развития макро-* и микрогаметофита. Коэффициент корреляции .равен 0,66, что позволяет лишь приблизительно оценить состояние гаметофита .по размеру зонтичка! Наиболее тесная корреляционная зависимость проявлялась между стадиями макро- и микрогаметофита и линейными размерами орга- -нов цветка моркови. Наибольшие значения коэффициентов корреляции (0,90— 0,95) отмечались мезеду линейными размерами пыльников и стадиями развития мужского и'женского гаметофитов (табл. 2). Высокая степень корреляции ' позволяет, ммерив линейные параметры пыльников и используя формулы уравнений теоретических прямых.определнть стадии развития микроспор, • ' J пыльцы и зародышевого мешка с достаточной точностью. При этом необходи- ■ мо учитывать, что морфологические показатели могут изменяться в зависимости от условий выращивания и генотипа донорного растения. ' • г ' 1 2. Культура пыяьников и неопыленных семяпочек MopKoeu tn vitro , v
< - ;Дигаплононые шорофиты ... vitro - как .пыльников,% так' и "семяпочек. У фертильных ' растений можно' использовать' оба'метода. Для' выявления 'особенностей этих'методов были ' взятьг с одного растения моркови сорта Нантская 4 семь соцветий первого порядка различного диаметра: 2-2,5 см, 3-3,5 см, 4-4,5 см, 5-5,5 см, 6-6,5 см, 7-7,5 см н 8-8,5 см. Бутоны вышеперечисленных зонтиков использовали для — j1 культивирования in vitro пыльников и семяпочек. В каждом сложном зонтике' зонтичкн разделяли на шесть вариантов (табл. 3). Бутоны в зонтичках также были , поделены на два типа:} крайние , и центральные. Все бутоны были ' помешены на индуктивную питательную среду МСм, согласно методике. Затем „ после предкультйвирования бутонов выделенные:из бутонов пыльники и : семяпочки были перенесены на свежую среду того же состава. *. '. 1 * "
'■ , ■л' а-- . "-■.■'■ ' ■ V ■ Ч'.'- : > - п '" ; -л ^ ■. ■ ^Табпниа2
■ : .■; ? ■■■л1 .:■■:■.7 г о' ■„:■■■■■; ■ - ■ ^
Зависшиос^межлу иШ1дми развита! мужского н женского гаме^
■' ■ ■ ЧЧг ''' -': /■: г морковн сорпВаятелей ,-!;;■■*?: - . ■; ' :■' <'■
1 , Морфологические признаки (X) ;•; !Женский гаметофит (У). • Мужской гаметофит (У) ; Г
V" . ■ Л ^ ' Ч Уравнение регрессии Уравнение регрессии ■
■ .' Диаметр мигачи .: ■V. 0.79 ±0.10 . • У-О.ЗОЧШ'Х го.«±оЪ ■ У" 1.99 + 0.57*Х :
Длинапышмка в-'^-^"' л ' 0.94 ±0.03 ; ,. 0.90 ± 0.07 - • 4 | У ; 2.37 ♦ 20 93*Х,
- Ширина пыльника У ; ■ ■ ■;4 ■ .'''.'"'. / о.95±о.о$ ' V 3 46 + 23.84*Х г : 0.90 ±0л7 : .у - 1.69 + 20. п^х ;
■ Высота нектароносного даем ■г.. * '.' 0 89 ± 0.07 . ; ; 4=0.82 +213б«Х 7 ' /- с. .0.81 ±0.09 ■■ ' У-0.7б + 20.44«Х ■.;; ■■>■■■ л ■.;■,. - ■
\ Ширина нектароносного диска • Ч \ : ' 'V- ! 0.92 ±0.06 ' 0.82 ±009 . У ^ 0.05 + 8.99*Х
Двиназаздэи- ■'■ ' 089±0.07 : .У-0.82+ 12 21»Х ; : 0.81 ±0.09 > . . У-2.0$ + 9.97»Х
Н--Ширина аияэи г 4- »1' -г ' 0.89 ±0.07 г У*3.17 + 13.89*Х ч 0 81 ± 009 :"Уг1.Ц+и20*Х !
: Длина семяпочки %, - Г1 . ' ■0.88 ±0.08 ' .. V-1.79+ 15.35*Х ■;. ; о,8о ± ода ; У~2 87+ 12.40*Х. :
Ширина семяпочки V: ■ 0.79 ±010 Л-].39.+ 29.0'Х" ■ аб9±о,п У-164 + 22.7ГХ л
Примечание: во всех случаях > Ьи^; Р & 0.001
"V Схема высадки эксплаитов в экспериментах по получению »ндрогенных и гиногениы* ', * ': - i
*'. .» ; '■]': 'г. v г- »л-: растений in vir/ч» ; ;'.?<.'■/ ^-'-^".у Jv *'■■* V.
.¿i - - Вариаит .-' i ; • !"■"'.ii • .■ .. 11 ■"'..»''■ - ' .. Расположение бутонов в юн-' •/. ?Г,К?Х , . * Ркположсмм мнпшп 1 сложном » , *; ' ?* зонтике 1 i
крайние; ''' V.iV.' центральные ' , ^ " V', --''у "j "Я i" ■ i' • -'i ■ .tir^ ч 1-2 ряд эоитичков в сложном зонтике --■■*■ ■'v^"'' =: '-'':.'■'>■V'L'r.-j
крайние i";:"- -. - - - V ■ t .-. < . . .,- ■ . , ■ j' j,. '.у --- J ^ ■ J . . , . i- ■ - . .<... -. - ' ^ 3-4 ряд эонтачков s сложном зонтике . • л/•• ;
центральные Х - '* • ' -,
Крайние';.!.,"-- 1 центральные ■: Зонтнчки, расположенные в центре сложного аоктикя ^ - ;
' V -jZ." T
г V ". . . r
'V .. > J
ч f '
- ; .У1- ; : ' ' )Судьтура пыльников. Первое появление каллусовго разросшихся пыльии-^. -'' • ' . г* ков зонтика диаметром 2-2,5 см наблюдалось через пять - шесть недель культи- > > '
':-< V вирования. Появление эмбриотенных структур не было отмечено в течение все- ;- ■' 4
■ '' V".^'-'Ч ' \ *1 ' ''■?'--:*. "."Г" "'Л 1 ■.:1 ■ ■ .'.'.">'■ ■ -' - ."',"■. Г-'-"' ■■■
го времени культивирования. Наиболее активное образование каллуса наблю- -.4;'- -
. ■ *... *
- • i .'
-- . f -'
далось упыльннков первого варианта (табл. 4). К12 неделям процент каллу-. >
~ • • .* . . ■■.■•- j - '■ •..:. ••• ' •* . ■ ' i \ ? ■ " сующихся пыльников составлял 22,2 %. Только 4 % и 6,8 % пыльников иролу- : -
1 -ч ■ : ■ ... "-.■-"■'*'->:- ■, *:■■ » ^ ^
цировали каллус у третьего и четвертого-вариантов соответственно. В пятом - -». v" i -
; -: " .'л".■ ■ ';*-' '.':!"i
варианте отреагировало только 2,4% пыльников. . .- г v i •* ' • , ■ ■
V Г-.... ■ - - : < ^ :■ 'i, i"'; *jr *-T:iX '' s
■ ' ду Итак, в итоге можно отметить, что процесс андрогенеза зависит от распо-- -. "
ч1 " ^ -*-'-"' V-';-' ■ " ■ - л-■ А- : i.»n. J'; -' • -i-i J.;. ,'Э
ложения пыльника в соцветий и, соответственно, от стадии развития микроспор, находящихся в нем. *" ' о " ч. •' • . •*. V. i— . —' В наших исследованиях наибольший процент андрогенного каллуса обра- » * . ^
: -■ v — ^ ,■ ' - - - - ■ > ...■ у. .j...,. ■ ....7 j\\ .'**- ^ ■ .. . j ■; " -
зовывался. ю: пыльников, содержащих в себе молодые пыльцевые зерна и ; t
■ -. ус; • "■ t L.; - ■ 1 - - 1 ".'* - - . . ^..; ;.".». , \ . -. '
микроспоры на одноядерной стадии развития, в то время как пыльники с мик- г - ■ роспорами на более ранних стадиях развития не продуцировали андрогеккых ! г*' структур. Эти результаты подтверждаются исследованиями, проведенными в ^Y. ; С Т - лаборатории биотехнологии ВНИИССОК,' где было показано, что спорофитное " .. развитие Г в • результате" деления ^микроспор , происходит, при 'нарушении' -1
'*'. •... • = прохождения процесса. : ассиметричного диффчжншфующего . митоза.' ' .;
г, "Г".-7 ■ ' "..:-..; • <•<."•'•"••* Нарушение митоза приходится на поэднеодиоядерную стадию развития,когда^
; V- происходит деление на вегетативную и генеративную клетки (Тюкавин и др., • * *;
■'■> 1999).' Наибольшее количество микроспор, находящихся на этой стадии, было ; '
.•-:• \ - ■-,_■■*■ *■■*. ■ • > . " - • •••_ -.*->■ - ; * • ■ •« ч •••
">'..' "; * обнаружено в крайних бутонах- зонтичков -1—2 рядовсоцветия (35,1 %),'и в <-;
крайних бутонах зонтичков 3-4 рядов соцветия (41,0 %).
. \ . * V
- г,
-и
- V V ■ Таблица 4 '
-Г £'>',■ • ." V Образование каллусов из пьшьнико» моркови ¡п чИго, " *,-. - ; -
— I. ,
V 7 -' ■. г л ■
Вариант • '• Количество высажеинич пилкииксю, ИГГ с ' - . V ." 4 1-? ; \ ^ л .•Т. Сч^- • " Время культивирования / у. ■
- 5 ? !« • Ч/Х ;.■ К недель » .1 ■ ' т ^ ' . 10 недель ; * 12.недель
^ 1 - ' ; .1..... 45 ;-17.8±3,7 20,0 ± 6.0 с •• 22.2 ± 6,Г
"2- " .г.:- • у; Итого ~ -'50 . ' 44 -и-"'. ' -о. ~ : 2.0 ±2.0 . 'V* >"л ••.2,3 ±2^ • '. 2.4 ± 2,4 . ГА1 -V •• ■■^.■ А '0 . 1 V .,■ 2,0 ±2,0 - . • 6,8 ±3,8.- »•;<•{ '' ^ " 2,4±2,4^ \ > 0 • : "4,0±2,8 6,8 ±3,8 ; • -2,4±2,4 . . • 0 . .. .. 6.7±13 1 6.8 ±3,8 ^ 4 '■■ - ■ - . . ^,2,4±2.4 ■ о '•"
а .л!'.:.
. ' 'V- н
* '' - Культура' неопылённых семяпочек.: Образование каллусов и эмбриоидов - происходило у семяпочек,- выделенных из" бутонов* зонтиков'диаметром .7-7,5 \ см и 8-8,5 см (табл. 5). Первоначально семяпочки увеличились в размере и по^*' 1 бурели, а через 5 недель культивирования наблюдалось появление каллусов и, ■ эмбриоидов. Образование этих структур происходило у микропнлярного конца побуревших семяпочек. После десяти недель культивирования процесс индук-
.Т.' . - "
^ ,: I;" ^ .
;.!)--■ -' >1 -.-.-У. -ид
■ч »
цин ;гиногенеза прекращался. Наиболее активно1 процесс' каллу сообразовали* протекал в семяпочках пятого варианта зонтика диаметром 7—7,3 см и третьего
т.* ■ Г', ^ .. г.. ^ '. ''. , ■ -1. Г ' т.' ■ р . . ..п. • I ■'. . - ~ - 'т , . ■
■ варианта зонтика диаметром 8-^8,5'см. Количество семяпочек, образовавших
■ -r'.-'Í!*'.' 'i»' ^ ïi'/ \ l i' v'7 : / ! * 'í- ''' ^ ^ » ' ^ ' f-v • "s •• i • ''I.- !¡? ¡^ 1 .. i í .Г . , . J- . r^ " ^ h - ^ . -, • * . ■ 1 ' 'г,/'.' -, "f -y; ,-vfi-i'lV, Л"'. ' \\
w;г:1-- -Л""' V...;^,;•Я''-• •>■ i' О6р«оваяме шиусов в/мя эмбриоидов кэ ««опиленных семточек морковн ая viíro,% i--.. ;
' V 1 V ■ Количество шсажшных семяпочес, Î ШТ! о i, '. ■ ' ■ ■. ■. [í i * ' V' j í Ví.O'V. \ V . Врем* »ул^тшироааяня,,
•r',*Варианты ' Í ■■ ^ Í '■ t , ., -.V. ' ; i ■*».'; .'i 8 иеяеяь'' ¿ Д'Т ■ -, ^ *. ^ 10кеде,»; 12 ймеяь ; î.i.'^-,'-J
J . ' , '* Кмлусы 1 '"í J ' í j ,. Эмбрнонды (Каллусы-. Эмбришиш -с - .т ■ 1 . ' : 'í .' Каллусы': 'Л ... , = ' ' ^ i !• Л * " Эмбрнонды •" 1 ' ; Каллусы Эибриоилы ' r".' >.' • l1* j;>;i
' ' i í 1 <-->,T-\ ' •V- ' * : . ^ ч - • , ' X -,' ' ' Диаметр сложного зонтика 7-7,5 см' U ' ï ^ Î'VJ. r' ': m, j1" -^ . ~ ■■ t. ■- ., - -r ^^ ^ i
yr. i"- ^ V '¡Y. о; v ' -ií.' ' '€ -41, V О/-4.8 ± 3.5 : 17.5±J.O v >71±4.0 : v !1.9±5.<h . 17.5 ±5.0 * ^ о' . / V0 > ~ • ' 19.0 ± 6.1 ' -, 17,5 ±Ï0j • . - •Го'-' ■■ï'otë ' il-r- ' * • 0- : >9.0 ± 6. J ' • 17.5 ± 5.0 ¿V0 сЛч,^.
4 У V v/' ь'::::, Втого í1.'. Х'.у'44уу ' .>V* ' . m » ' 4.3 i 3.0 . 9.1 ± 4.3 • 9J±¿1 í2,2 ¿2.2 2J±2.3 ' 'Гу 0-i* : 2 .1 ± 1.0 ; ; 10.9 ± 4j5 : ; 20.5 ±6.1 \ - .0 :• ' 15J î 2.6 ; 2.2 ±2.3 i ;'и.4±5.8Г ,3J;±Íj .í ;; 109 ± 46 . 36.4 :: io6±i9: -.2.2±2.2 ' Л ■ ,7. .. : О/-.' • 0; aî±oi 10.9 ±4.6 ■ — • . -;36,4±7J s--''î'O t. , ; i .1- '20.612J r2.2±2Í " .. . • ' - ; •• ,0 *, •i' ^ ;€U±05 ■ . ví;.¡
■ ' У / К " \ Г"' ft - ' ■:■'.* L- .*, '.- Диаметр сложного зонтика S-8,5 см V -Í ..С " f **—*;••*—"........»j.——.i—-г.д..———
î-V..<
.'<'■t ■ ■■ ■ -"-л 'S ¿ ' í i*
- íí'- ? ■' V il L .
...<'.Л 3 .y*;' ■ - r ' i .s '..4. ■ 1
: : ' Л-'l ';¡'
•• •• 6 c-
//i'. . i; * . - .. ' < v T
• Г ...v.- *• s • • »V ; ; .1
:• - 45 •. ■■:
V- -. f-. .^',
7 "50 i-.'--í.*' 261 .
,24,4 ±6.4" ■Í3±4.o;i 236 ± 5*7 !
° : ! 5.3 ± 3.6 í-• ¿O ±3.4
¿iíHi
; l.î ±1.8 >
0t: «
i'"4 '
o -- :
- • •■>
' 0.4 ±0.4 V
"24.4 ±6.4 ->
■'83 ±4.0 :
;2T3±6,0?
o': • '
r• » -r • V
,5.3 ±3.6 ,60 i 3.4/.i 1Î.4 ¿2.1 \
'•'••'о ч •
••• >, ?■, t • •/•
' 36±*2J'„
• , ®.. « í ^■■.o'.J.
ОЛ10.6 i
'26.7 ±6.6 f 10.4 ±44? 30.9 ; 6.2 í 0 .. ''. 7.9 ± 4.4 ';-'6.0 + 3.4 "lM±2.1r'
/V 0 , 36±2.5
•'.> o':?.
Ш>
- 0.s±0.6
:' 28.9 ± 6.8/ j0.4±4.4
.'30.9 + 6.2'
f:- > V 0 :
,'-7.9 ±4.4; ti 6.0 ±3.4 >
•:is?>±2j
i ". • ' - l r.: • V
Я •. o Г.*
- г
V 0 и •
3.6 ±2.5
. > í A •'Ü8±0.6
■ 4 . i. -i1.* . i- л t ■: >, ' - V:C ■ -- 1 ■ ',';. * v * ; "■■.■..» ' ч / "S 1 'X 1 - ■■■' v- • .. ■... i'.' , - -. " -, '
У - • -г- '.-?'".•..> V;.
Л у , ; Появление каллуса и эмбриоидов лишь из семяпочек, выделенных из бу-Д-г; • „У / 'тонов зонтиков с диаметром 7-7,5см и 8-8,5 см;указывает.лгго для индукции г".
4ганогенеза, также'как и андрогеиеза, одним из решающих факторов является4'У
■ ■ ' •"•:- ' -"'.(■•; ""-.V. • ' -- • л- • : .. • Г г •! •«. .-■(•"..■ *
■■'-•■'■*■ ~ - стадия раз виги* гаметофигаОсобенность пшогенеза состоит в том, что он г*" ■-
I HH--ÍÍ
1 v : дуцируется в'семяпочках морфологически более развитых бутонов^ т.е. на бо-' ■;
,': ■". . ." " Í í \, : w" " : , ■ ^ V ':^ . ■" >.г,• ^.'- .' ■ . , . у ^ .
у ; ^ у Уу лее поздних стадиях развития гаметофита. У: ^"' ' у ■■■ ■уУ'.1'".*• '*1 ■
Vi," '*•'."- \ • :Т 'Г .'. •;.-;•. • ^ . . у, • ...
У\ меньшего размера, и ядра эндосперма в них находились в цмгтре. Длина заро- >
«.С --'.'Г. r->:-v - - s- ' k л: (у:,;- -v-.Ч'.:
■У.;'y-iV. дышееых мешков в семяпочках крайних бутонов составляла 150 микрон, а в-у<чгу,у
У центральных около 100 микрон' В семяпочках бутонов зонтика диаметром 8- .. »
- ■■■ .' •<• i :>,"■: i" ^ . о-^ ■;. .;. . д ' . t - '
; Vf 8,5 см зародышевые мешки были иа более поздней стадии развития, ядро эк- v~ ' V-'
■'.ti.-1'' f■.-. .'-i -■ i г■ <* \ ■ i'-, ч.- .с-- \ ■■ ■■. ^ ,"f:*.У , У_¡-- .--'У - досперма располагалось под клетками яйцевого аппарата, и сами они достигли ^ J '"-y-;
t■ i^- •, •••-• х - •. • - •• - j • • у .yV
-----—----------, размера, В крайних бутонах этого зонтика находились4
своего. максимального
t ■ . ■■ ш ■ ■■ . . -■»
v * У : зародышевые мешки,'длина которых составляла 270 микрон.'Данные цитологи-™ ;
"•* ■■ ■■ " У." 1 У" i1* ч; ■■■ ;„".> Ч 1 J ■ —•• .1-' < ■ '- Т\ -
"У УГ .ческою шшлиза свидстсльствун^г о том, «rio индукция гиногемеза у моркови , V*" происходит в семиклеточном зародышевом мешке, в период его.потдпего со- ,
. ■ ■ г' Г - •' .-..i --А,.- ' ' .'•*•»• -.i- ' ■ • ; I . . : • ■■•''Л-; »У
; о. ' ческих 'тканей семяпочки, которые к этому времени будут достаточно специа-V ч
,' . • • . 4. Цитологическое изучение процесса гиногенеэа в культуре неопывенных .. -* • .. . •' , У'У | ^ 'У, ' У..*' ''.семяпочек моркови т \itro ' У; г"
М Литературных данных по цитологическому изучению изменешй.'проис- "^-
'** V •• .. ■. .. .. > V--у > "<.'■ ■ ■:■ ' у -"у ;" •• • * • у;*^ у'
^ V - : ходящих с гаплоидными клетками зародышевого мешка в условиях культиви- • - 'У'
<; пример, у свеклы образование эмбриовдов происходит главным. образом «ий-.р
' . Ч цеклетки, но также возможно развитие! их и из однойиз синергиднли антипо-.
, л V - -V ^• <■-** ".. : '■ у' л-'** :,- ■*-■'"■■ * '•■<>,•■ - •••
ч. ; днальных клеток (Мвепшеоп е| а].,. 1985). В других исследованиях по культиви-, ' . . - -..; „ *;;■'*: .-.* г' 'У . '/л-'' :'.-*■ г:-—-,■>...' ,-„
, ~~ рованюо семяпочек свеклы было показано, что .эмбриоеды, образовывались и! - *
■ 1, .. ' •. ■ , ■ * - .... .л? ■ - ч • - - * •- ■' . . .- § • ^ . >1.■. ' ~
Л': ";.*'- Ч ' яйцеклетки или антиподиальных клеток,- синергиды при этом дегенерировали С' - - * V (ВоззоцЬтЛ, Новетапз, .1985). При культивировании семяпочек риса прол иферз- " у' 7' ция тканей каллусного .типа и образование эмбриоидов происходило т синер-
V? -I ^1 «^й г■ V ЙД^?''■' С* ' ' С'у
: ; / Наши исследования показали, что первые деления гаплоидных клеток за-« 4
I ' родышевого мешка происходят при культивировании неопыленных завязей наА
- А " ' , вергшотся "сильному растяжению. В них происходит увеличение вакуолей, ядро - . . ' - - . ч ; принимает, пристеночное положение. При этом семяпочка сильно увеличивает- ^ ^ , j Ç' ся в'размереГ Кутикулярная оболочка зароды шевого'мешта лщируется в^ тме-"
. В наших исследованиях активные деления клеток наблюдались в районе
f с ' ," t ■ -..-v. -v :,■.*.> --г;: :: "Г"' : iг*:'.:- ..¿' ' ;• - i. яйцевого аппарата, где. как мы предполагаем^ начальные деления происходили .
v г v ■ — ч ч '.'*' ' ' * / - ' i ' ' - , 4 - " : ' г Vt- .i- '' » t ч
-, в яйцеклетке, а синергнаы в процессе развития подвергались деградации!-Скоп-. '
; , . ■ t *_-, ..V ; '■• ; ' ' ^ - < ■ ■;.■* .л v.: ! ,» Î -Д'.--' ■■»:* J-I-
'"'\î ""ленйя темноокрашенныхклеток также было обнаружение в районе антипод и»
. --г "Т*- 'У " '"'jT ч *' "I., i'-1 "■'1 i'-^ V-' '
• • 'центре зародышевого мешка,-вероятно и клетка эндосперма также способна к".V
: -"v'-i- -" ч -î' • ••« ->v; ; -¿i, ..л—I-Î с.;, i.' Ï,:. VV'L- ^ТЙ" .* '
4Vj развивитию без оплодотворения в условиях in vitro. Такие достаточно большие —
■ ■ - ' " - * î*';-.-.)'.1/ 'f-V.M с :ЧГ^».F ;"■■■-
::-Г скопдения каллуса в семяпочках появлялись через 2-З недели культивирования -.-
. ' . с - • -- ' . ^ ' . Ч - ' : ■. .-'- ' ■ ' V . - ч Ч -Ч' • О ■ I . - Ч - " J .4 ' . .. É ■
•• " --завязей на индуктивной среде. Хорошо дифференцированных змбриогенных .J ^ образований не было встречено при делениях гаплоидных ядер зародышевого; ' ¿ - 'Ч*'мешка. Все деления носили характер каллусообразования. Клелси делились во iV-Jвсех.-1, направлениях, •. образуя^, таким- образом ^халлусные,;; массы,-, которые, '*. ■'-■ прорывая интегументы семяпочек, выходклй наружу через микропиле.,Через 3-'
• Ï-4' неделиt были ^обнаружены культивируемые семятючкн,, в, которых полость'*; î' ■ зародышевого мешка была полностью заполнена темноокрашенными клетками.
.'-'-У//--.-\J :
• • V., '• " '..г ~ •' "'•'••'•• •: ,Л ... ..' • Л' е.". -V-:" 1 . ' ч , '
< - Для дальнейшего уточнения у каких клеток зародышевого мешка моркови О - ■;*;
:: регуляторы роста индуцируют клеточные деления, были проведены следующие^.;1-: ;. '■'.
/исследования. Срезанные зонтики первого порядка диаметромот 4 до .7 см фер- *, • ^ .
^ ;.ч'тильных растенийморкови сорта Нактская 4 ¿Г образцов Г-76' и' Лн селеищии * \ .
• - * ' 4- : >
~ >■. ВНИИО с ЦМС петалоидного типа помещали в сосуды с водой и водными рас- 7- у.ч
творами, содержащими 1 мг/л, 2 мг/л и 4мг/л 2,4-Д и ИУК (по 3 соцветия в ка-1/.г' -; "
ждом варианте)*. и>5тологическ»)й анализ зародышевых'мешков проводили вд^ ~ у
'рез 1; 3,6 И 9 суток. Зародышевые мешки выделялись из крайних бутонов крае- 'О1 .;".■,
, , выхзокшчков соцветия. В исходном материале в исследуемых бутонах зонти--.'л1. »••• V ' .* V ¡-.... ■,"■ к'
¡ ков'днаметром 4—5 см преобладали семяпочки с 8-ядерными зародышевыми
мешками, а в зонтиках большего размера женский гаметофит находился на ста*..:
.дай. 7-клеточиого зародышевого^ мешка.' Характер изменений,- вызываемых,,-^- ; > -.
, . 2,4-Д и ИУК в клетках зародышевого мешка, сильно различался. ИУК усилива- ; -X*-:
ла вакуолюаиию клеток зародышевого мешка, что приводило к нарушению их о У".-;, ■
" ' гюлярюацть При действии 2,4-Д' в ряде семяпочек ^наблюдалась' деградация' <
.г; *.■,:..-.г..• •• '.г.-.'^ - : г...*. > ■- : -л
^ ■ ; клеток зародышевого мешка. У другой части семяпочек происходили деления "
> , . ,. ." , . . ..........■ ........• - -
^;, ядер клеток зародышевого,мешка без нарушения их поляризации. Чаще этому V .
. ; подвергалась яйцеклетка. В некоторых случаях такие деления затрагивали все" -
" ч клетки яйшвохю аппарат Однако в одном случас, после суток воздействия . ^
" V1™■■'-■■>• -■.".¿■-р'.Ч'ч- .л.1- *.'. --с«- '-■.'.*.."■-)
>2,4-Д мы наблюдали поделившееся ядро однои;из синергад в зародышевом. , <
_ •. ': ~Таким образом. нашн цитологические исследования показали.'что в про
и"
' Регенерация андрбгенных и гнногенных растений: - - :Ч'' 'Для регенерации растений'из каллусных тканей, образовавшихся в процес- „Г' : Г** се культивировагам т \zilro пыльников и семяпочек,'нами использовалась среда-.
; - - ■ ■.. "ЧГ 1*. ::...... - *'... • • - ' ■-.^У'С-'1
' '..'* МОи (лпишати I) I мг/л кннетиня1 Онупп 80% высаженных на эту соелу кал- ' • '"' •
У Г. лусов приступили к образованию проростков. В среднем из одной семяпочки • -1 у
г-., г- ч ■■:■,« •' .■ -ji ■ -rr ' " , '* : • 'v - •* .■■ . ••4' •-••.— '--у ' :'
' s r» f "i ■* '».t T¿ J. А С r» f» ■ Л ' , J ''"Г '' t. • ,41 „Г"*- • V • 1 ■ ' • • ■ № г « и* ♦• i' - ,
. После адаптации растений-ресенерангов in vivo было получено 23 анщкн ■ ^: ,
.'." . генных, и 165 гиногенных растений/ Все растения имели одинаковую окраску
'.V-V'- : • •'<••':;■:• Ч' " . ••; '. > • • . сг ' ,..." ..Г . J.-4..' ' » .
; ',í листьев и корнеплодов. Однако имелся целый ряд различий по морфологиче- ;;
'."у. "'^.'.л-•<-'•г-■; »..••.-..'.•'•., "vi^ v- ••-,•~ ' ■
, '„ í-.. ским признакам между группами андрогенных и гиногенных растений. /у
»>' "...t^'l '.чч* тч С' " .-'i1 ..-v".'; . * ,.-> 1.' . '..• ' ,< ■
■ У , / • Гиногенные растеши« Ro имели полуразвалистую розетку листьев, тогда ¿ ; ^ \
■ 1V ;^ 'У'т^^У ■'.!•■ i»« --¡i ..'^.^-i,-,..::■..'„*ч;'С '-;.-'■«-%-'r.-.'V,'
v v « как у андрогенных растений Ro была прямостоячая розетка листьев, что обес- • • ¿'• гтечивалось наличием у андрогенных растений как уголковой колленхимы, так. '> , - и "еще слоя пластинчатой колленхимы в черешках'листьевУ У гиногенных рас-* ,
- „ ^ угений была только уголковая колленхима. У растений моркови, полученных-. : * •. ' Путем гнногенеза, сегментики листа были узкими й имели ланцетную форму, а У.-;
у андрогенных растений cerMetmtKU были более укороченными и,по форме ";» iiy-" • У [фиближались к осгрогородчатым. Всс андро)снные растения имели достаточ- V -/ ! • ..но сильное опушекиелистьев и черешков,' втоже время гиногенные растения Су V г у - ^^имели как и неопушенные, так и опушенные листья. Семенные растения К« ■ ;
*-■■ .... . также имели некотсфые морфологические различия между собой. Андрогёиные ' '
:г? г.» г : .¿V i-' i'-- у; --'„''^: ^ !: Л-.' v •• У/
г . * < семенные растения Ro имели толстые стебли и густое жесткое опушение на них. ;. ^'О ': -■V»:!;г*. ::■■'..'■ гл. -'V*-'- !•.'. .-• 'Ч' ■ '"í'-ív.'. v : %v -
- : Растения;гиногенного'происхождения; не имели опушения, - либо ■ оно было «'-Л'..':.У
Г- • р..;. - • "г ' ■ : .;.,• : • •
' : • : очень редким.;; V--.;-' t \ ..¡г...; J .г-л ., -V'.. v
" 7. Оценка растений моркови, полученных методом андро- и гиногенеза , ,.'".'' \íí :,Перед использованием линий," полученных методсни андро-. и;гиногенеза, - ~ > ?
I ** ■ - . ( ' . ■ _. - .. ■ ; . .. . "' ' . " ; ' - * t .. Л. ^ _ . Т . . ^ ' . ^ - . Г",
TV«»;'4": .'.'?■■необходимо оценить*их по степени гомогенности и провести оценку селекци- • окно важных признаков.'Накопленный опыт, в .мировой практике,доказывает,
' ' ^ ' ->.0'"! . . '■:_ Г ' J' > * ' ~ ' Л - ■гт Г"''- 'Г ' ■ ¿7 ( ■ Л*' V,.' . , Ч' v - ■''ir- ' -
>' что в большинстве случаев полученные методом андро^ и гиногенеза линии от- ¡, • ' У, - /: личаются наибольшеЙ гомшиготностьк>, но в некоторых случаях могут усту- ■ J
?•-••/;••.<•>-'• •'• ¡-^"1 ■[■,■ .-.^S Л"', ^ -f--,
- ^ i" !', пать исходному генотипу по ряду селекционно значимых признаков (Baenziger " i: V:; •
-1','--; » 1 '•■ i ^ii'--,;.*^.^-.-, 'уч,' ».i:", vií.^'.'í-ii,^ i*ff i-, , ,*,•■:-'.'.v i АО п. ^ .1 1 rv\ т. Лй«,.:^ ^ п_________ _______— _____-
**. :• меретабаха отмечается,'что андро- и гиногеннме'линий мало чем отличались"' Г; ' по хоэяйствётго тнным^тнакам от исходиого *ра<ггения (К1ип^гаЬ1го^ Отита,-; ;
-.-"'1985; Отита; УотЬ¡¿V 1974; ВиНс, Маш^ет/1976;*'Агс1а ег а!.; 1978); Это еще " V "
г ■ к*-.■--,■,"- —V : ''.г- ........*• •• -'• ь\,<*% г ':•••.••• •.. -••
. ■ . раз подчеркивает необходимость проведения оценки полученных линий по мо- " г - -
.У- лекулярным,биохимическими морфологическим показателям. *■:**
.; г Молекулярная оценка на основе ИАРР технологии. ЯАРР анализ1 ДНК' ••. •:„.' •.
; .-1; ,„ . - ■. ■ 1 .... ,. ь - ... - .,т. . •,. — ■, 1' >Л ; ' 51 4,"4 ?■'.
' . растений анпрогенных и гиногенных линий, а также их исходной сортовой .--- ■"*"■■-Л->— ;■■ ■■■■ ■ ' •' ,;': Г" * -1 ^ ^ ^ , „ау,- - -Л .
, V ; популяции показал, что при наличии в их ИАРЭ спектрах общих фрагментов ♦ ' ;
. ' ■ ~ ' ' ' V у '' ■ ;- " ' - ■;'''''' ^ . ..< ;>.•">- ^■ . -.
;: '> 'для каждой линии был характерен свой специфический набор фрагментов. Та- V V ;
' -.'V ■■''■"Г'-""-, г,.1; 1..Г1-.■=■.■!, - л'.-л'-'^си..*..,«-. ^ Ч ■. кая гамегоклональная изменчивость подтверждалась также и результатами кла- ' ' ,
X \ стерното анализа. Из рисунка I видно, что каждая из дйгаллоидных линий вы- ;
■ деляется в обособленный кластер.'При этом максимальное генетическое рас-'' ; '>
. . * . - ^ ** ' ■ • . »■, ^ т ■ - ".. I л, ^ ■ : « .. ; , * '
• - ? . Ч. ч . - 1 - / I .1 г *■ V * ^ т ' *' 5- . V: '■ - -" ' ' .Г, '^ . - *
[Л..ч,М|-- - -—..........——-—-~|М
- - , ■ - ' < . I ■ ■ ——1 г ; 1. • о.—г _ .. ' 5 ; ■ '
• Л'-"К* -—_——1 ---——.— V,-' ; *~-■
I *. Ч J - ^ "Я," J35
... V \ >v/•-»*': > 01
Г.;, Vt,.
' . ~ / ^ ; »
Î 35 .
Рнс.1. Дендрограмма, генетического сходства растений моркови сортовой лолудяцнк Нант- ■ -:_ . ' Осая-4 (N) к подученных на ее основе «ндрогенных линий № 11 и № 12 (P1I и Р12) н гино- J_Lr -, . ' ^ ■ ; генных линий № 20,4,'>6 23 JS20.4," S23X построенная методом LÏPGMA анализа полимор- ^Ч • - V- фиэмвихRAPDфрагментов, t " • ; f ' f1 "Г Y' ' î-- ' i
- ■ - - y Л .-'i.'f î '¡l'ioV W'i^y ■ ^"ir..-;
г _ S- ."стояние между андрогенными линиями и исходной сортовой попумцией Нант- - '
. товой От свидетельствует о том, что андрогениыс линии iciютически ближе к исходной сортовой популяции Нантская4,~чем гиногенные линий, ^ ' -Молекулярно-пенетический анализ растений R( пяти линий моркови, полученных путем прямого эмбриогенеза при культивировании in vitro пыльников и семяпочек, выявил значительное снижение гетерогенности по сравнению с нс. ходной сортовой популяцией Нантская 4'(рис.1.). Типичное генетическое расстояние для этих пяти линий в среднем составило 0,03, а максимальное генети-' ческое расстояние в среднем — 0,13. В контрольном же образце (Нантская 4) эти показатели равнялись 0,11 и 0,18 соответственно. Андрогенные линий, полу-, чекные из исходной сортовой популяции Нантская 4, оказались менее полиморфными,'нежели гиногенные линии, полученные ю той же сортовой популяции. Так, для андрогенных линий № M и Jft 12 максимальное генетическое расстояние внутри линий составило 0,07 и 0,04 соответственно, а для гнногенных ; линий № 20,4, J>& 23' этот'же показатель равнялся 0,13, 0,08 соответственно. Наименее полиморфной среди андрогенных линий оказалась линия .№12, а среди линий, полученных через культуру семяпочек, линия № 23. у ' ' ■ - : .Таким образом, показана возможность получения фертильных выравненных линий не только путём андрогенезЦ- но и путем гиногенеза при испольэо-■ вании вкачестведоноровфертильныхрастенийморкови. ; !
" Биохимическая характеристика. При анализе углеводов было показано, что по содержанию суммы Сахаров в корнеплодах растений Ri моркови андроген-ные и гиногенные линии значительно превышали исходную сортовую популя-.. цию Нантская 4. Эти данные согласуются с результатами, проведенных ранее исследований (Дорохов и др., 1997). ■■.;■"■■ .■.■■■'' -f-; 0 ■."'. J :
. . Морфологическая оценка линий. Для характеристики степени выравненно-сти полученного материала был'- вычислен* коэффициент варнациц (V). Наи, меньшая изменчивость признаков наблюдалась у гиногенной линии № 23 ' (табл. б). Коэффициент вариации указывает на незначительную степень
; Коэффициенты вариации морфологических признаков андрогекньи я гомогенных растемяй Rj моркови
Таблица 6'
■ Вариант Л; •:}. .у. -■■■'■■;.' V ts .*■,■'.■ • 1' Длинал ; листа ';* .Ширина^ , ллста -- 'Длина ' черешка' 'Толщина .черешка Количество сегментов листа S; Длина.. корнеплода ■Диаметр'; корнеплода ' Масс» корнеплода ■i ■ ?>,- *
''J * . Наятскм4(кои1р<иь) :г "¿Л- . . 18.05 '••. 21.49, 12.93 22.86 ~ .'. 16.74 2J.64 ; ;.'; 22.25 : 60.34
у Андрогеким линия №11'. •• 32.57 J . ■: 13.«' '23.23 : 12.43 i 30.88 ' V 23.47 : .'. 67.29 "
. Анлрогеивая линия №1 2 ■>. > V-; 10.00^ r; UI9 17.68 У 8.30 ' , .i 35.00' 20.60; 43.45 •
.' Гиногенная лики* №23 ¿'(-v • 10.87 \ у- 9.96 U 57;. . :8.51 '6.52 19.48 ' is jo - :i 55.32 ;r
■'■■ Гикогекнаялиния№20.4 : ; 15.59 i: 20.28 ; 22.72 25.75 ■ 9.79,'. ■ ' 18.95 ■ 24.771.;- г 55.11 , Г
Разница между коэффициентами вариации
: 'О::
м Анд. линия №11 иНантска*4 ' 015 Щ ' 1108 j : 0.75 •0.37, ' , ' 4.31 . 5.24 122 б.« :
.Аналиния№12иНзнтская4 ~ -8XI5 г .18.30**; **.. 1.26 ; „"-5.18 4 44* !>•!»'£•' ; -6.16; . ' -1*65 Г .; • -16.89
- Гик. линия №23и11антс)ая4 -7.18* ¡У „ -1.36 14.35« »10.22** ' 15 -5 02 > :
,. Гни. линия №20.4 и Наитская 4 i -2.46 .1.21 , .9.80* ''289. г -695« ■. 469 ' • 2J2 -V :•• -5.23
Анл.№11иАид.№12/ V" 8.20 -у .-29.40« / -0.51 ; - с. . ^ ' ; ■. :'_5.55 ' 4.13 / -4.12. 2V7 V 23.84
Анд №11 иГин.№23; м/." 7.33* % 22.61'* - • 2.11 14.72** 5.91» , 11.40 . 537 V 11.97 f:
Ана.№11 иГин.№20 4 ';\'.yv А * .9.04* •• ; -2.52 ' ! ;z64: 11.93* ^ -1.30 " 12.18 >
Am. №12 и Гин. №23' - - 0.87 "■6.79** ' , 2.62 ;; '917 ; \1.78 . 15.52" -1187
,., Анд. №12 и Гин №20.4 .: ' -5.5? '". -17.1 !♦♦ J-8.53' ,'-8.07 ч': ■i -1-49 , ; 16.05 -4.17 -г . -П.66 . .
сем. №23 и Гик. №20.4 ■ : •' ч"./ Й -4.72 * -П.15" -1725« ;: ".3.27 ; 0.53'- .. -¿67? " 0.21 •
Примечание: (*) и(**) статистически Значимые различия соответственно при Р К 0,05 и Pi0,01.'.
•v: ^ . изменчивости. по размерам корнеплодов. Из андрогенных линий наиболее вы--'
равненной lio морфологическим признакам листьев.была линия № 12, однако'.. ,
■-"С1 Í-- г t-* . • ■.... >'■'-! v V vi.'О*
V ; . но выравненное™ длиныкорнеплодовона уступала другим_ линиям.,Оценить-.
линию моркови по количественным;характеристикам;корнеплода достаточно • ,
'.. "•.сложно, так как изменчивость этих признаков определяется не,только геноти-<: • V
.^;>\.-?*пом растения,' но и агротехническими условиями выращивания. .^.^ плv ■
8. Апробация метода гиногенеза на других генотипах моркови
;".>,' :В качестве донорногорастения мы использовали сорт НИИОХ 336 со сте- "Ч'
ьл:".*'--;: ?i" ; ч' •.'"-■'a-: k'.'j *- -, - ¡s >л-< • "iVj.> i..-■■--'*"• '• " ' '•■
■- -Первое появление .гиногенных образований^произошло; через:четыре; ■
¿„у;.-.'» -.- г.-. ••••;*•••—:•,,•,• ¿"„.-^ -г";, - г, ■■■-«:-*:■ - *. .. % ■■ -■.-■■■■
"*.'' недели и продолжалось1 до десятой недели культивирования. Процент семяпо-- .
; ; " чек с каллусом был заметно выше у сорта НИИОХ ЗЭ6 (54,9%) по сравнению с '
. ■ Ч , -.4 Ч г. •!• ■-<_■;.. ■ т " ' С - - ••• -,-- ' •
сортом Нантская4 (10,9%) через 10 недель. Кроме того только у сорта НИИОХ 14 > '
■ ■ . • •••-•;: ..-••<-•• •.' 'I- ">■.',,-;■■ ■/'■
• 336 наблюдалось образование эмбриоидов (табл.' 7). При питологическом ала-.:
• V, лнзе было показа>юг что (жмяпочки высаженных вариантов содержали в себе ' V
\ЛГ - - , • 'Г.-; ^^ »> '
V т семн-клеточные зародышевые мешки. г.. 1 ? ^ ..,, ■ .
Ле"'^ Г .Высокий процент семяпочек с каллусами и эмбриоидами у сорта НИИОХ
'. ;' з36|можно объяснить тем,'что отклонения в развитии"мужской генеративной'-!',; ' ч*'' \ ' сферы могут вызывать" определенные отклонения в женском гаметофите, кото-," -/у ■'■Урые могут дать началогиногенному раэвнтиюиз гаплоидных ядер. Тахое явле-''^ ™ '..Г;
, наблюдалось при культивировании "неопыленных семяпочек свеклы (Зна- - "V
V-' ' " - и---*->:*./-
менская, Подвигина, устное сообщение). .^ . ■ ■.> .V •.':••'•'
■'У.'"- - .лг: ,1 Т. тД ' ■ <-, V:--"
•■'-•; "Л } Ыаши исследования по получшию гиногенных растений моркови показали
' ^•.•.достаточно высокий выход' гиногенных структур: у"' моркови по: сравнению с : \ -
' другими видами покрытосемянных растений.? В ■ исследованиях по гнногенезуи1'* -
наименьший процент эмбриогенеза 0,28% из семяпочек был отмечен у лука
■. "К - . ■ ■■ . : " 1 - Г' ч . , ■. .. - , ( ■■.,
; Г' - (Сатрк>п,"АНоп). 1990). В экспериментах по получению гаплоидных растений . ;. /*
.1-- - т . ^^ ''
.г.«*.*-:
.V , "'•':'• '•: ^ •> - ''' ; Л ''„'Л
до 7,6% и для культуры завязей от ]% до 35,3%*для разных;генотипов - ' ■ ;••' (Уап всуг С1 а1, 1987).- В других исследованиях по свекле общее количество эм-* л; Учбриоидов5составляло 2,56% от культивируемыхсемя почек; В экспериментах с; ;Л'
- * - ,. . ■ . ■ ' 1 " ' ' ■ . ^ з ' ' > "■ ■ ■ ■ ■.--■. У - ' . .
;..культурой неопыле!ашх семяпочек шалфея мускатного (Бутара,-Русина, 1989). .V. . частота гаплоидного каллусогенеза у изучаемых сортов варьирует » довольно'- С
- . . .. Г - * д. 1 -' у V? ^^ *у.>--5У,-5*. »-"^¡Л' £»!*¥ Таблица 7 П ■ - ^
; ... V 1 '.' I ; "* '-•> ,■■ „..
' ' л- ^'Образование каллусов н/или эмбриокдоа из неопыленных семяпочек иоркови сорта„ ГД"-- ' * * 1 ' . "'"• • . ; ~ ' - : Нантская 4 и НИИОХ 336 т чаго ■ Ч: - I - " - Л-,;:*'А- '- /
-Г1
\ У . <' ' -' \. «
' ■-к -Нантская 4
и
- ' 'НИИОХ 336 г
. Вариант;
е"41-*7' ШЙШ ^ >
I ^ л _. V
• •• . I ' " .'.V .3 V
М^ЬГ.*!-
¿Количество ^ ' высаженных . семапочек, шт
» -•*',' и ■ 'V'
. ' Каллусы, % ^ .¿,
211 • • / ' 1 .' '..
' 6.7 ±3,7 > . ■ ,
Ъ ^ '' чу г? ■
• 11,1 ±6,0 .4(1 10,94 237
. .53'6±4>1'.> г '
- "V .. ■. .
'Эмбрмокды,%-(1
' Г?'О ' 1'!'г '.." '/'ш • ' , '.
V . I -' - , - • ' Н' .-. Т. " , ■
..■■.. --Н------ ■ I Г ■ ' , -
■■■■■■ ■—1 1 - V
■1*■, о .-ч• ■г;-
■ * ^ ^с:»;^^'.'' .1":
'• • • О.ч / »•.
^^ .'. 0 : ^ ' < \ .
• „ ■• у--.-:..
„Чг "
: > Исходя из этого видно, что немаловажную роль в получении гиногенных^
• , "и
л .. с_
;А Использование тидиазурона в качестве индуктора гиногенеза в культуре;■ ^ ■ 1неопыченных семяпочек моркови * ^ у
Ч ^Из вышекзложшшых даннь'х видно, что используемая - в качестве регуляД
тора роста 2,4-Д индуцирует гиногенез лишь у 20^-30% семяпочек моркови, ,то-^
. гда' как другая часть не образует гиногйшых1 структур. Это ограничивает воз- '
- , моясность метода; вовлекать в селекц»«оиный лроцссс! все многообразие обра- -
Чзуюшегося в результате мейоза генетического материала.; Использование в ка- '
Г.:^':^- Л/
"..'■''1 У-"'"*.
- 4 - 20 :
h 1 i : ^ ■ \ Ï- 1 "
,, 1 чсстве индуктора гиногенеза регуляторов роста с другим типом активности, в у-. *>'•■■.
~ Lt*'--- • - -■' - "'-"У: ■>,■.<!* У. - ' ' с*-..' .. ,'i ; - 1'* ■'-■ V '."Л,
г-; --,- ^частности цитокининовой,* может активгаировать«молчащиел сеьмпочки. Та- ■.
V *. ' * . ким вещестмм, индуцирутощим гиногенез, у ряда других культур (луха, огур-; •
1и) являетсятидиазурон- производное фенил мочеаины.^у .Гт/.^.у;^.,',,..:;
..v-;'- . Т~г,7»Простерилизоваиные бутоны высаживали на среду МСм с 0,15 ыг/л и 0,20 - ..' у
•Î , * • . . .'• ь. - V 1 .v'; -V ■-. ■ •:• ' '■•'.■". V: ■ - • Г " '• - •.
:'., : мг/л тидиазуроиа и культивировали в течение двух недель в темноте при тем-^ V . ' У 0 У- ■'■*■ к - ?-■■-* ' '.*■*- >i i'-'-r' ■-■> '-': " .'""■-".■*-■" -Т-
пературе 25 С. Затем из разросшихся завязей выделяли семяпочки и высажива- : . : ; . - • V ■ ■' . Г'.•г^ - • Г.
: ; - ли на свежие агаризоваиные средьгс добавлением 0,2 мг/л НУК или 2,4-Д. Для - .. -, ; :
0' •регенерации;растений т^полученных ^рфогениых^с^укгур.использовали
; » .У л. ертду МСм с 0.1 мг/л кинетина. ^ ¿};; Ч ^тк-^^Л^гг;'у-■ .
С. ». - г - ,* - Через 4—5 недель культивирования после пересадки на среды с ауксинами к .'
... ""'-Д..- - —•• • - - *• * .....■ ■- - • •
- -г. , î . . наблюдалось появление различных структур из микронилярных концов семя-
'ï почек.,Пути морфогенеза в зависимости от,.сочетания применяемых регулято-v <
' . ^ ров роста были различными^ Эти типы ^морфогенеза сильно отличались'от ран-' •
] . описанного) индуцируемого 2,4-Д"Для них было характерно образование :
V • . ,. 'л.• • ■ ' ï ■■ ■*.. г--" - —,. .--.v n-,v ;>.. ; Тг утолшешмх корней. Они могли появляться из семяпочки или.формировались-у -
;v'>' ;. • » из каядуса. Однако в отличие от обычного ризогенеза в культуре моркови Ш vi- * '
ï * - . ,'/го такие образования развивались в дальнейшем в нормальные растения. ■. ■
.. . . ..... . *- . •. ; •. • ......•. - •
* г-4 .. ~. дяторов роста, наблюдались морфологические различия в форме листовых сег- ^ /
".V. - .. ; -v. - у...... .■■■■.-..?;; - ■ J.".-; ..>. . .
. ."Л члит^н ' 'Vm tvioiwtrr л mit «лплnL-irinuuii* пап»tiuuf.iv ллы*тйииН пмч/латл. J >'.
/ ■ ^ - , , ; : > pek€>meiiîiauiïii к производству Й . Г-; : -
y\v, " i " ~ -У Предлогаемая технология получения геногенных растений моркови in vitro . ' .
rV , • •< "V ¡: "i' - ; : - * . . 1. -.s'- - V ■ r:'i.: .i.-
■ -., . ■* может быть использована для ускоренного получения гомозиготных стериль-,
* -у V с--:- '-.л^ /;-v> .4 ■ ч,
Л'" '-
I ~ "■ v■....: - •> ^ j s,.- _ _ - у. - . 'ч. - ,.. . (-I ■■■ VI '■'■■'- * - .
: . ' ВЫВОДЫ;-:*.-■•>». '.¡^i v-V.; "..'■*■*'■,"?'"■
-у*'•'■''/rY:y :.-V.: ; ';■;'*■'. -
/: 1 ^ Между4 стадиями развития мужского и женского ■' гаметофитов и' линей-'* > .'V;
.. . -■£ л... - V. > 'v'- " . ' • ': -' " - ; V У
у'у , ными размерами' зонгичка и цветка наблюдается высокая' корреляция:
■ - .л- .¡. I-,::,. У- t -v ■.■>■- *■ у- ...■■■■■ '.. л ■■■■-,-■■■ ■ ; :x. ■' '• --V
УУ"\ :большее значения коэффициентов корреляции {0,90 — 0,95) отмечались между ;>> Yy
Л. 1- !■!. i V'' ч' >..= ' -'е * ' ' ■■■•'. -■''.'•"■
линейными размерами пыльников и стадиями развития макро- и микроспор. - ; : " '
■ • ;.- . ч .... , -. . -'У..У ... : - - 'f, /-: _ . - у ■. , '. ■ *
> v -; у Использование этих показателей позволяет упростить отбор эксплантов морко- '.С- ; ■. \ -
л Ji V -.'¿г-. У.'::. ■/. -"fl. '.' ' гк-- ;
Г /Лч- ви с оптимальной стадией развития гаметофита.; ^ ">.>_ ' ' - J,T:'
" i '"Г, Стадия развития зародышевого мешка играет важную роль в процессе ги*л • .
^ " ногенното развишя~при культивировании in у^о неопыленных семяпочек мор- I" -
; " ' -кови. Индукция гиногенеза у моркови возможна лишь из клеток семиклеточно-' ' 4
"'.•г;'"., - . > \' •i'i.'v'S".' ■ j? - ^ ■,
¡V" --'- *' 3.'Развитие морфотенкых структур (каллуса и эмбриоидов) при культивиро- > ■■¡. * «■:".;*-. ' г.':'~ ■:. :..: ...г :.-.:, :.г ■ : . . -v . О"-'-"
■- ^ , вакии in vitro неопыленных семяпочек моркови происходит из гаплоидных кле^■
^ ' " , ' ' T f ч * Jll ' ' »"'.44 ^ , ' ь . . ^Jj l" г •' , . , '. ■ л* 4 .ф» _ V V ' *. ■ ' Г** , 'ъ f . V , ^
" г., : - ток зародышевого мешка, чаще всего из яйцеклетки. '^ ;1. -: ' ^ 1 г •"* v
: ' - ■* •• ^ ^
< - ^ 4. Основным индуктором делений ядер в клетках зародышевого мешка при ;.
' • " ' семяпочек моркови является 2Д-Д.- v1'-?^ ^
; ; " г .^ S^ncwy^eiiH^'inmoreHHHe Hl^aH^ моркови 'показали наи- ' ' < ••
.^^Л бoльшy^oVыpaв^мннoerь пo cpaвнeни^o с исходным сортом при молекуляроной " * , •'
- " > оцеЙке H^i^i'^PD^^oA^«;'"и''Y , :
■■■ . . .....;; . . .'.'- • . ; • •. « '
• ' \ • 5 6!;Раз)работанная методика культивирования -мУ v///-o неопыленных семяио- ' ■
1 4 Ж IQfJAMJ V rm^J М^НП 4 ППУ! VnVJtl BP njfioijpv If» fftf v nwiuiJiwinnA ■ : : т
'*■-•'' ' •семяпочек моркови 'с целью расширения генетическога' разнообрвЬия 'получае-; , г. •
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ J" .
> I.'. Домблцдес A.C., Тюкавин Г.Б.j Шмыкова H.A. Особенности анатомического i у ' t - " строения черешков листьев андро- и "гиногекных растений; моркови R» '--с ^1; ^ ' ;:, Новые » - иетрадиционные растения и i перспективы гихI использования: ;,* у ^ ; Труды. III Междунар. симн. 21-25 июня 1999:- Пущино, 1999. Т. 2. С.:273^:1'. '
• ' 275. ■■'f."1 - " v.' .• .'••'• v. .,''.•■ Л-."'"-.
• • " • '.. > • л . ■ ... VУЛ"-.'-; .• ?• -
' 2.; Домблидес А.С./Тюкавин Г.Б.С Шмыкова H.A. Влияние регуляторов роста - ■
' на образование:;; эмбриогенных структурв■'■■ зародышевых; • мешках - ••
' ■,„*■*.. неопыленных семяпочек моркови // Регуляторы роста и развития растений:
' ■ - . Тез. докл. Пятой Междунар. конф. 29 июня - 1 июля 1999.-М., 1999. Ч. 2. Г- » ; < "•*. • < C.3J8-319. -, - ••
"■.'■".V-..". .. .1 . • ' 'г- -■-,:- .у.-- ' ¿у
' ;'. •, 3.- Домблидес A.C. Влияние 2,4-Д и ИУК; на развитие 'женского гаметофита^ ;
"'-.з7.; Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке: Междунар. научно-^ * ; > V ■•' \ {фактическая конф.24-27июля2000.М.,'2000. Т. 2. С. 277-279.> ■ уД. у*. *> Tiiiltfivin П П ПпшЫ|Неб A S ' ^hmvlinvn N Av llvnnmvck'nF гягт!с in vifm \ - ' ' '
Y ' "6. Домблидес A.C.,. Тюкавин Г. Б,,' Шмыкова H.A.'- Получение , гиногенкых. ^ -. * \> растений моркови in vitro с использованием тидиазурона // Биотехнология в, v"^
^-.•.y'. > ' ^ :V' '•Л'',' i ■ К Л ..v
, - ' • \ ••• ... . " • . Г- . . '. . .v. г: Т-.7Л , Л.*-;. ...... f.
Объем ■ . Зак. 306 Тираж /ОО '
. Издательство МСХА
127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 /
Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Домблидес, Артур Сергеевич
введение. i обзор литературы:
1.1. значение гаплоидов для селекции.
1.2. получение гаплоидов из клеток-гамет.
1.3. получение гаплоидных растений при использовании мужского гаметофита in vitro.
1.4. метод культуры неопыленных семяпочек и завязей in vitro.
1.5. факторы влияющие на процесс гиногенеза in vitro
1.5.1. способы культивирования.
1.5.2. еенотипдонорного растения.
1.5.3. состав питательной среды.
1.5.4. стадия развития зародышевого мешка.
1.6. пути развития гиногенеза in vitro т.
1.7. получение дигаплоидов у моркови W&Itro
1.6. перспективы метода гиногенеза in vitro. ii материалы и методы исследований. ш экспериментальная часть
3.1. изучение взаимосвязи между стадиями развития мужского и женского гаметофитов и морфологическими показателями репродуктивных органов моркови.
3.1.1. развитие мужского гаметофита моркови.
3.1.2. развитие женского гаметофита моркови.
3.1.3. взаимосвязь между стадиями развития мужского и женского гаметофитов моркови.
3.1.4. взаимосвязь между стадией развития микро и макрогаметофита и морфологическими показателями соцветия.
3.2. культура пыльников и неопыленных семяпочек моркови.
3.2.1. культура цветочных бутонов моркови.
3.2.2. культура пыльников моркови in vitro.
3.2.3. культура неопыленных семяпочек in vitro.
3.3. оптимальные стадии развития мужского и женского гаметофитов для индукции гиногенеза и андрогенеза у моркови in vitro.
3.5. цитологическое изучение процесса гиногенеза в культуре неопыленных семяпочек моркови in vitro.
3.5.1. влияние 2,4 Д и ИУК на женский гаметофит моркови.
3.6. регенерация растений моркови.
3.7. особенности анатомического строения андро - и гиногенных растений моркови r 0.
3.7.1. растения-регенеранты моркови репродуктивного периода онтогенеза.
3.8. оценка растений моркови, полученных методом андро- и гиногенеза in vitro.
3.8.1. оценка линии с использованием rapd - анализа.
3.8.2. биохимический анализ.
3.8.3. морфологическая оценка растений.
3.9. адаптация метода гиногенеза на других генотипах морковий.
3.9.1. цитологическое изучение модификаций дифференциации тканей пыльников моркови сорта НИИОХ 336 с петалоидным типом стерильности.
3.9.2. культура неопыленных семяпочек сорта нииох 336 и нантская
3.10. использование тидиазурона в качестве индуктора гиногенеза в культуре неопыленных семяпочек моркови.
Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Разработка лабораторной технологии получения гиногенных растений моркови in vitro"
Широкое возделывание моркови во всех странах обусловлено высокой питательной ценностью ее корнеплодов. Ее выращивают повсеместно как вкусный овощ и как основной источник соединений изопреновой природы -каротина, или провитамина А (Сечкарев, 1971). На мировом рынке широким спросом пользуются гетерозисные гибриды Fi. В России работа по созданию межлинейных гибридов моркови Fj на базе ЦМС была начата в 70-х годах Н.И. Жидковой с сотрудниками, в результате чего был создан первый отечественный гибрид Fi Калисто (Сазонова, Власова 1990). Для того, чтобы достигнуть однородности линии по определенным селекционно-ценным признакам, используя методы традиционной селекции, требуется 5-7 поколений инбридинга. Поскольку морковь относится к двулетним культурам, то для получения таких линий необходимо затратить 10-14, а то и более лет.
Современная селекционная практика нуждается в новейших методах, которые призваны повысить ее эффективность. Наряду с традиционными, все большее применение в селекции находят биотехнологические методы, позволяющие ускорить селекционный процесс и повысить качество конечного продукта. Используя методы биотехнологии растений такие как культура пыльников и неопыленных семяпочек in vitro, можно сократить сроки создания константных линий моркови в 3-4 раза. При этом, для получения гетерозисных гибридов Fi моркови наряду с фертильными линиями В и С, которые можно получить используя культуру пыльников, необходимы и линии А с мужской стерильностью. Процесс получения стерильных линий моркови методами традиционной селекции довольно длителен и трудоемок и не всегда удается получить линии, отвечающие требованиям гетерозисной селекции (Тюкавин, Шмыкова, 1999).
С целью ускоренного создания выровненных линий с мужской стерильностью в лаборатории биотехнологии ВНИИССОК помимо получения 5 растений методом андрогенеза in vitro проводятся исследования по разработке метода культуры семяпочек моркови.
Цель и задачи исследований
Целью данной работы являлась отработка ряда этапов лабораторной технологии получения гиногенных растений моркови in vitro и оценка полученных дигаштоидных линий in vivo. Исходя из поставленной цели, нами решались следующие задачи:
1. Изучить взаимосвязь между морфологическими показателями соцветий, органов цветка и процессами микро- и макроспорогенеза у моркови для отбора необходимых эксплантов в культуру;
2. Определить оптимальные стадии зародышевого мешка, при которых происходит развитие гиногенных структур у культивируемых in vitro семяпочек;
3. Изучить цитологические особенности гиногенного развития каллусных и эмбриоидных структур из клеток зародышевого мешка;
4. Разработать элементы технологии получения гиногенных растений моркови методом культуры неопыленных семяпочек;
5. Провести оценку андро- и гиногенных растений моркови по морфологическим, биохимическим и молекулярным показателям.
Научная новизна
В работе показаны корреляционные взаимосвязи между стадиями развития микро- и макрогаметофита. Выявлена способность 2,4-Д индуцировать деление клеток зародышевого мешка с последующим образованием из них каллуса и эмбриоидов. Предлагаемая технология позволяет, используя одно фертильное растение моркови, одновременно получать как андрогенные, так и гиногенные линии. Проведенные 6 морфологический, биохимический и молекулярный анализы растений Ri моркови подтвердили андро- и гиногенное происхождение этих линий. Впервые была показана возможность использования тидиазурона в качестве индуктора галогенного развития моркови.
Практическая значимость
Морфологическое и цитологическое изучение развития соцветия моркови и стадий развития мужского и женского гаметофитов позволили выявить морфологические показатели для отбора необходимых эксплантов с донорного растения для культивирования in vitro, без трудоемкого цитологического анализа. Показано, что наиболее информативными морфологическими показателями для отбора необходимых эксплантов с нужными стадиями развития макро- и микроспор являются линейные размеры пыльников. Были разработаны этапы получения гиногенных растений, и показана возможность использования культуры неопыленных семяпочек in vitro как для получения фертильных, так и стерильных линий. Для расширения спектра генетического разнообразия растений-регенерантов моркови, полученных методом гиногенеза, можно рекомендовать использование тидиазурона.
I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Домблидес, Артур Сергеевич
ВЫВОДЫ:
1. Между стадиями развития мужского и женского гаметофитов и линейными размерами зонтичка и цветка наблюдается высокая корреляция. Наибольшее значения коэффициентов корреляции (0.90 - 0.95) отмечались между линейными размерами пыльников и стадиями развития макро- и микроспор. Использование этих показателей позволяет упростить отбор эксплантов моркови с оптимальной стадией развития гаметофита.
2. Стадия развития зародышевого мешка играет важную роль в процессе гиногенного развития при культивировании in vitro неопыленных семяпочек моркови. Индукция гиногенеза у моркови возможна лишь из клеток семиклеточного зародышевого мешка.
122
Заключение:
Исследования по получению гаплоидных растений через культуру пыльников и неопыленных семяпочек в настоящее время имеют три основных направления:
1. Фундаментальное исследования, ставящие своей целью изучение закономерностей дедифференцировки и редифференцировки репродуктивных клеток и регуляцию этих процессов.
2. Прикладное направление, целью которого является получение гаплоидов и гомозиготных диплоидов хозяйственно - ценных культур, используя в основном метод эмпирического подбора оптимальных условий для индукции эмбриогенеза или органогенеза.
3. Оценка полученных линий различными методами и выявление из них наиболее подходящих для дальнейшего использования в селекционных программах.
Экспериментальный материал полученный в процессе исследований осветил основные моменты всех трех основных направлений касающхся получения гаплоидных растений из гамет. Впервые было показано на моркови, что гаплоидные клетки зародышевого мешка моркови способны приступать к гиногенному развитию в условиях in vitro, это открывает достаточно большие возможности для получения дигаплоидных растений из клеток макрогаметофита также как и из микрогаметофита. При этом установлено, что только глубоко дифференцированные клетки макрогаметофита приступают к гиногенезу.
Данная работа показала высокую эффективность применения данного метода и открыла большие прикладные возможности гиногенеза in vitro для решения селекционных задач.
120
Полученные в ходе исследований андро - и гиногенные линии оказались на много более выровненными, чем растения исходного сорта Нантская 4, что было установлено RAPD анализом. Морфологический и биохимический анализы также подтвердили выровненность полученных линий.
Накопленный материал свидетельствует о том, что теоретические и прикладные возможности гаплоидной технологии могут быть успешно реализованы в сочетании с традиционными методами генетико-селекционной работы при условии высокой эффективности и продуктивности андро и гиногенеза.
РЕКОМЕНДАЦИИ К ПРОИЗВОДСТВУ
Предлагаемая технология получения гиногенных растений моркови in vitro может быть использована для ускоренного получения гомозиготных стерильных и фертильных линий при создании гетерозисных гибридов Fi моркови.
Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Домблидес, Артур Сергеевич, Москва
1. Атанас А Биотехнология в растениводстве /Новосибирск 1993 - С 241.
2. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Матвеева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro эмбриоидогенез у покрытосеменных растений.//Ботанический журнал 1978 - Т. 63 - № 1 - С. 87-111.
3. Бернд Б. Физиолого-генетические особенности андрогенеза в культуре пыльников дикого картофеля. Автореф. дис.канд. б. н. М., 1985. - С. 18
4. Бугара A.M., Русина JT.B. Гаплоидный каллусогенез в культуре неоплодотворенных семяпочек шалфея мускатного.// Физиология и биохимия культурных растений. 1989. - Т. 21. - № 6. - С. 554 - 560.
5. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе.// МГУ Москва 1999.
6. Давоян Э.И. Получение гаплоидов у риса методом культивирования неоплодотворенных завязей in vitro// Доклады ВАСХНИЛ. 1985
7. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. 5-е издание и доп. М.: Агропроиздат, 1985 - 351 с.
8. П.Дьячук, Т.И. Дьячук, H.A. Культура пыльников злаков: современное состояние, проблемы перспективы.//Сельскохозяйственнаябиотехнология. 1989. - №5 - С. 3-9.
9. Еналеева Н.Х., Тырнов B.C. Хохлов С.С. Выделение зародышевых мешков покрытосеменных растений путем мацерации тканей.// Цитология и генетика. 1972. Т. VI. - № 5.
10. Ермаков И.П., Матвеева Н.П. Диморфизм пыльцы и андрогенез в культуре пыльников и микроспор// Вестн. МГУ Серия 16 Биология 1986 - №3.
11. Гришина Е.В., Зайцева М.И. Получение гаплоидов кукурузы при воздействии химическими мутагенами и физиологическими активными веществами.// Апомиксис и цитоэмбриология растений: Саратов. 1968. С. 65-68.
12. Знаменская В.В. Жужжалова Т.П. Подвигина O.A. Инукция гаплоидов в культуре неоплодотворенных семяпочек Beta vulgaris // Embriology and seed reproduction: Proc. XI Int. Symp. July 3-7, 1990, St. Petesburg, Nauka.
13. Ивановская E.B. Дифференцировка тканей и клеточные деления // Изв. Ан. СССР серия биолог. 1975. С. 237-252.
14. Кордюм E.JI. Цитоэмбриология семейства зонтичных. Киев: Наукова думка, 1967. - 176 с.
15. Кучко A.A., Маруненко И.М. Культура изолированных пыльников картофеля. //Сельскохозяйственая биология 1983 - № 5. - С. 16-18124
16. Ю.Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А., Шеремет A.M. Скрещивание Hordeum vulgare х Seeale cereale как возможность получения гаплоидов.// Научно-техническ. Бюллетень Всесоюзного селекционного-генетического института 1981. - №3 - С. 19-22.
17. Лукьянюк С.Ф. Разработка приемов in vitro для получения гаплоидов ячменя и тритикале. Автореф. дис.канд. б. н. -М., 1983. С. 18.
18. Магешвари П. Эмбриология покрытосеменных. Пер с англ. М.: 1954 -439 с.
19. Нгуен Тхи Дао, Шамина З.Б. Культура изолированных пыльников томатов. //Физиология растений. 1978. - Т. 25 - С. 155-160
20. Ницше В., Венцель Г. Гаплоиды в селекции растений. М.: Колос, 1980. -С. 126.
21. Орел Л.И. Цитоэмбриологическое изучение цитоплазматической мужской стериьности у лука // Тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции 1968. - Т. 40. - № 1 - С. 163-176.
22. Павлова М.К. Культура неолодотворенных завязей и семяпочек возмжности и перспективы // Сельскохозяйственная биология 1987. - № 1 .- С. 23-33.
23. Петров Д.Ф., Белоусова Н.И. Фокина Е.С. Передача апомиксиса от трипсакум к кукурузно-подобным гибридам // Отдаленая гибритизация и апомиксис. Новосибирск, 1982. - С. 32-52.
24. Плохинский H.A. Биометрия. 2-е изд., М.: Изд. МГУ, 1970.
25. Подвигина O.A. Культура неопыленных семяпочек как способ получения гаплоидных растений.// Обеспечение эффективного функционирования производственного потенциала АПК России в условиях различных отношений Воронеж, 1993 - С. 127-128.
26. Рахимбаев И.Р., Тивари Ш., Кударов Б.С. Экспериментальная гаплоидия в культуре пыльников и микроспор зерновых злаков// Сельскохозяйственная биология. 1990. - №3. - С. 44 - 55.125
27. Семенова И.В., Казачек Т.И. Создание через культуру пыльников константных линий табака разных сортотипов для селекции.// Культура клеток растений и биотехнология Кишинев - 1983
28. Симоненко В.К. Развитие пыльника и микроспор в фертильных и ЦМС линиях подсолнечника // Цитология и генетика 1982. - Т. 16. - № 5. - С. 32-36.
29. Солнцева М.П. Левковский В.П. Вариант приготовления постоянных окрашенных по Фельгену препаратов целых зародышевых мешков растений, выделенных путем мацерации тканей.// Ботанический журнал. -1978. -Т 63. № 6.
30. Солнцева М.П. Что же такое апомиксис у цветковых растений? Ботанический журнал 1991. - Т 76- № 6. - С. 801 - 808.
31. Таганов Б.О. Культура пыльников моркови in vitro: Автореф. дис.канд. б. н.-М., 1991.-С. 22.
32. Таратонов Н. А. Влияние эндогенных факторов на рост и развитие регенерантов в процессе формирования дигаплоидных форм сахарной свеклы: Автореф. дис. канд. сельхоз наук. Рамонъ., 1999.
33. Тодуа В.А. Явление гаплоидного и диплоидного апомиксиса у рода Nicotiana // Отдаленная гибритизация и апомиксис. Новосибирск: Наука, 1982.-С. 109-119.
34. Тюкавин Г.Б., Тимин Н.И., Буракова И.А. Использование методов культуры тканей растений in vitro в селекции моркови // Науч.-техн. Бюл. ВИР. Л., 1989. Вып. 192. С. 57-60.
35. Тюкавин Г.Б., Таганов Б.О. Эмбриогенез в культуре пыльников растений моркови in vitro // Сборник научных трудов ВНИИССОК М. 1993, С. 12-15.
36. Тюкавин Г.Б. Шмыкова H.A. Эмбриогенез в культуре пыльников моркови in vitro. // Физиология растений. 1999. - Т. 46. - № 6. - С. 876-883.
37. Тырнов B.C. Завалишина А.Н. Возможности использования гаплоидов для решения селекционных биотехнологических и эволюционных проблем.//Достиж. Биотехнол. Агропром. комплексу: Тез. Докл. -Черновцы, 1991. - Т. 1 - С. 59.
38. Хаченко П.Н. Шиловский В.Н. Использование метода культуры пыльников в ускорении селекционного процесса. // Докл. ВАСХНИЛ. -1982-№9-С. 24-25
39. Харченко П.Н. Индуцирование растений из пыльцевого каллуса гибридного происхождения с целью получения гомозиготных форм для селекции.// Культура клеток и биотехнология 1983 - Кишинев - С. 155156.
40. Хржановский В.Г. Пономаренко С.Ф. Практикум по общей ботаники Учеб пособ. М.: Высш. школа 1979 - 422.С., ил.
41. Чумак М.В. Стимуляция гаплоидного апомиксиса у кукурузы // Сборник научных трудов молодых ученых Краснодар: НИИСХ, 1974 - Вып. 4. -С. 76-79.
42. Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре микроспор //Культура клеток растений. М.: Наука. 1981. - С. 124-135
43. Юркова Г.М., Левенко Б.А. Изолированная культура пыльников злаков //Эксприментальная генетика растений. Киев : Наук, думка, 1982. - С. 46-65127
44. Шмыкова H.A. Агафонов А.Ф. Изучение вияния тидиазурона на гиногенез у лука репчатого.// Новые методы селекции и создание адаптивных сортов сельскохозяйственных культур: результаты и перспективы: Тез. Докл. Научной сессии. 1-3 июля 1998 Киров
45. AbdallaM.M.F., Hermsen J.G.T. Diploid parthenogenesis and androgenesis in diploid Solanum.//Euphytica. 1972. - V. 21 P. 426 - 431.
46. Andersen S.B. Anther culture in carrot. // Hereditas. Suppl. 1985. - V. 3. - P 132.
47. Asselin de Beauville, M.: Obtention d haploides in vitro a partir d ovaires non fecondes de Riz, Oryza sativa L. //C.R. Acad. Sei. (Paris) 1980. - V 296 - P. 489-492.
48. Arcia, M.A., Wernsman E.A., and Burk L.G. Performance of anther-derived dihaploids and their converntionally inbred parents as lines, in Fl hybrids, and the F2 generations.// Crop. Sei. 1978. - V. 18. - P. 413-418.
49. Arndt, F., Rusch, R., and Stillfried H.V. SN49537, a new cotton defoliant.// Plant Physiol Abstr. 1976 - V. 57 - P. 599.
50. Ao G.M., Zhao S.X., Li G.H. Induction of haploid plantlets from unpollinated maized ovaries in ovaries in vitro.// Acta Genetica Sinica. 1982. - V 9. - №4. -P. 281-283.
51. Baenziger, P.S., Wesenberg, D.M., Smail, V.M., Alexander, W.L., and Schaeffer, G.W. Agronomic performance of wheat doubled haploid lines derived from cultivars by anthers culture.// Plant Breeding. 1989 - V. 103 -P. 101-109.
52. Baenziger F.S., KudirkaD.T., Schaeffer G.W., Lazer M.D. The significance of doubled haploid variations// 16 th Stadler. Genetic. Symp. On Gene Manipulation in Plant Improvement. 1984. P. 384-314.
53. Barclay I.R. High frequencies of haploid production in wheat (Triticum aestivum) by chomosonal elimination.// Nature V 256 - P. 410-411.
54. Bossoutrot, D., Hosemans, D. Gynogenesis in Beta vulgaris L.: From in vitro culture of unpollinated ovules to the production of doubled haploid plants in soil// Plant Cell Rep. 1985 - V. 4 - P. 300-303.
55. Buchter-Larsen A., Jensen C.J. Development of pathenoginesis pathway for the production of haploid sugar beet plants (Beta vulgaris)// Hereditas Suppl. -1985-V. 3.-P. 135.
56. Burk L.G. Haploids in genetically marked progenies of tobaco. //J.Hered. -1962-V.54-P. 222-225.
57. Burk, L.G. and Matzinger Variation among anther-derived doubled haploids from an inbred line of tobacco.//J. Hered. 1976. - V. 67 - P. 381-384.
58. Cagnet-Sitbon, M. (1980): Recherches peliminaires sur la production d haploides de Gerbera jamsonii par culture d antheres et d ovules non fécondés in vitro.// These de 3e cycle, Amelior. Plantes, Université Paris-Sud, Centre d Orsay
59. Campion, B. and Alloni, C. Induction of haploid plants in onion (Allium cepa L.) by in vitro culture of unpollinated ovules.// Plant Cell, Tissue Organ Culture 1990 - V 20 - P 1 - 6.
60. Campion B., Bohanec B., Javornik B. Gynogenic lines of onion (Allium cepa L.): evidence of their homozygosity.// Theor. Appl. Genet. 1995 - V. 91. - P. 598-602.
61. Chase S.S. Androgenesis its use for transfer of maize cytoplasm.// J.Hered. -1963. -V 54-P. 117-167.
62. Chaieff R.S. Isolation of agronomically useful mutants from plant cell cultures.// Science 1983. - V. 219. - P. 676-682.
63. Cooper D.C., Haploid-diploid twin embryos in Lilium and Nicotiana. //Amer. Jour. Bot. 1943 - V 30. - P. 408-413.
64. Crete P., (1949) Un cas de polyembryonie chez une Gentianacee, 1 Erythraea, centaurium Pers., Bull. Soc. Bot. France, 96, 113-115.129
65. Cuny F., R. Dumas de Vaulx, B Longhi and R. Siadons Analyse des plantes de melon (Cucumis melo L.) issues de croisements avec du pollen irradie a différents doses.//Agronomie 1992. -V 12. -P.623-630.
66. Cuny F., M. Grotte, R. Dumas de Vaulx and A. Rieu Effects of gamma irradiation of pollen on parthtnogenetic haploid production in muskmelon (Cucumis melo L.) //Envivon. Exp. Bot. 1993. -V 33. -P. 301-312.
67. De Beauvill M.A. Obtention d'haploides in vitro a partir d'ovaries non fécondés de Riz. Oryza sativa L. // Comptes rendus hebdomadaizes des seances de l'Academie des Sciences 1980 - V 290. - №6. - P. 489-492.
68. Deimling Sabin Was kann die Zell und Gewebe der pflanzenzuchtung.//Mais. 1994. -22, №1 -P. 10-15.
69. Dore C. Obtention de plantes haploides de chou cabus (Brassica oleracea L. ssp. capitata) apres culture in vitro d'ovules pollen irradie// C.R. Acad. Sei. Paris 1989 - №309 - P. 729-734.
70. Dore C., Marie F., Production of gynogenetic plants of onion (Allium cepa L.) after crossing with irradiated pollen.// Plant Breeding 1993. - V. Ill - P. 142-147.
71. Dumas de Vaulx R. Obtention de plantes haploides chez le melon (Cucumis melo L) après pollinisation par Cucumis fîcifolius // A. Rieh. C.R. Acad. Sei. Paris 1979 - №289. - P. 875-878.
72. Dunstan, D.I. and Short K.C. Improved growth of tissue culture of the onion, Allium cepa. // Physiol. Plant 1977 - №41 - P. 70-72.
73. Edwards K., Johnstone C., Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acids Res. -1991.-V. 19. -№6.-P. 1349.
74. Finnie S.J., Forster B.P., Chalmers K.J., Dyer A.F., Waugh R. Powell W. Genetic stability of microspore-derived doubled haploid of barley: a cytological, biochemical, and molecular study.// Genome 1991. - V.34 - P. 923-928130
75. Flawell R. A model for the mechanism of cytoplasmic male sterility in plants with special reference to maize //Plant Sei. Lett. 1974. - V. 3. - P. 259-263.
76. Friendt W., Breun J., Zuchter S. e. a. Comparative value of androgenetic doubled haploid and convertionally selected spring barley lines.// Plant Breeding. 1986. - № 97 - P. 56-63.
77. Guo G.F., Jia X.J., Chen L.X. Induction of plantles from isolated ovules of Hevea brasiliensis. // Hereditas, China, 1982. - V 4, - №1 - P. 27-28.
78. Guha, S., Johri, B.M. (1966): In vitro development of ovary and ovule of Allium cepa L.// Phytomorphology 1966 - V. 16 - P 353 - 364.
79. Guha, S Maheshawari, S.C. In vitro production of embryos from anthers of Datura II Nature Lond. 1964 - P. 204-497.
80. Haberlandt G. Ueber Zellteilungshormon und ihre Bezehungen zur Wundheilung, Befruchtung, Parthenogenesis und Adventivembryonie// Biol. Zentbl. 1922 - V. 42-P. 145-172.
81. Hakansson, A., Studien über die Entwicklungsgeschichte der Umbrelliferen.// Lunds Univ. Arsskr. 1922. - V.7 - P. 1-118.
82. Hayase H. Cucurbita crosses. Occurrence of haploid twin pair from a Fl progeny of C. maxima and C. moschata. // Jpn. J. Breed. 1954 - V. 4 - P 55.
83. Hoseman P., Bossoutrot D. Induction of haploid plants from in vitro culture of unpollinated ovules Beta (Beta vulgaris L.) //Pflanzenzucht. 1983. - V. 91 -№1,-P. 74-77.
84. Huang, Q.F., Yang, H.Y., Zhou, C. Embryological observations on ovary culture of unpollinated young flowers in Hordeum vulgare L.// Acta Bot. Sin. -1982 -V 24,-P. 295-300.
85. Hu K.L., Matsubara S., Murakami K. Haploid plant production by anther culture in carrot (Daucus carota L.) //J. Jpn. Soc. Hort. Sei. 1993. - V. 62. - P. 561-565.
86. Jensen, W.A., Schulz, P., Ashton, M.E. An ultrastructural study of early endosperm development and synergid changes in unfertilized cotton ovules. //Planta 1977-V. 133. -P 179- 189.
87. Junzhi Z. Application of anthers culture technique to crop improvement in China // Plant Cell Culture Crop., Improv., Proc., Int., Symp., Calcutta, 1983 610 Dec., N.Y.; L.P. 351-363.
88. Kasha K.J. and E. Reinberg, Recent development in the production and utilization of haploids in barley //Barley Genetics 1982 - V 4. - P. 653-665.
89. Kasha K.J. and Kao K.N. High frequency haploid production and utilization of haploid in barley. // Barley Genetics 4:653-665.
90. Katayama Y., Adachi T. Studies on haploidy in relation to plant breeding. V. Further proposal of hahloid method in plant breeding. 1969. Seiken Ziko № 21-P. 37-44.
91. Kostoff D. An androgenic Nicotiana haploid //Ztschr. F. Zellforsch. u. Mikros. Anat. 1929 - V. 9 - P. 640-642.
92. Keller W.A., Amstrong K.C. Production of haploid via anther culture in Brassica oleracea var. italica. // Euphytica 1983 - V. 32 - P. 151-159.
93. Keller E.R.J, and Korzum L. Ovary and ovule culture for haploid production// In vitro haploid production in higher plants, 1996 V. 1, P.217-235.
94. Kermicle J.L. Androgenesis conditioned by a mutation in maize. // Science. -1969.-Y. 166.-P. 1422-1424.
95. Kumashiro, T. and Oinuma Comparison of genetic variability among anther-derived and ovule derived doudled haploid line of tobacco. //Japan J. Breed. -1985.-V. 35.-P. 301-310.
96. Kuo, C.S. The preliminary studies on culture of unfertilized ovary of rice in vitro. Acta Bot. Sin. 1982 - V 24 - P. 33 - 38.132
97. Kusano S. Experimental studies on embryonal development in an anginosperm.// Jour. Col. Agr. Tokyo Imp.Univ. 1915.,№ 6 P. 7 120.
98. Konar R.N. A haploid tissue from the pollen of Ephedra foliata. // Phytomorphology 1963 - V. 13 - P 170-174.
99. Lacadena, J.R. (): Spontaneous and induced parthenogenesis and androgenesis. In: Haploids in higher plants, advances and potential (ed. Kasha, K.J.), 1974, pp. 13 32. Guelph: Univ. Guelph
100. Lebegue A. Embryologie des Saxifragacees. Polyembryonie chez le Bergenia delavayi Engl., Bull. Soc. Bot. France, 1949 № 96, P. 38-39
101. Lux, H., Herrmann, L., Wetzel, C.: Production of haploid Sugar beet by culturing unpollinated ovules.// Plant Breeding 1990 - V. 104. - P. 177 — 183.
102. Machteld C. Mok, David W.S. Mok, Janet E. Turner, and Cesar Mujer V. Biological and biochemical effects of cytokinin-activ phenylurea derivatives in tissue culture systems.// HortScience 1987 - V. 22. - №6. - P. 1194 - 1196.
103. Magnusson, E.,Wremerth-Weich and Bornman Haploidization of Beta vulgaris ovule culture // Hereditas suppl. 1985 - V. 3 - P. 147-148.
104. Maheshwari N. In vitro culture of excised ovules of Papaver somniferum L. Phytomorphology 1961. - V. 11. - P. 307 - 314.
105. Maheshwari, S.C., Rashid, A., Tyagi, A.K. Haploid from pollen grains -retrospect and prospect// Amer. J. Bot. 1982 - V. 69. - P. 865-879.
106. Maheshwari P., Rungaswary N.S. Embryology in relation to physiology and genetics// Advances in botanical reseach // Ed. R. D. Preston. London, 1965, №2 P. 219-321
107. Masuda K., Kikuta Y., Okazava Y. A revision of medium for somatic embryogenesis in carrot suspension culture. J. Fac. Agr. Hokkaido Univ. -1981. Vol. 60. P. 183-193.
108. Meynet J., R. Barrade, A. Duclos and R. Siadons Dihaploid plants of roses (Rosa and hybrida, cv. Sonia) obtained by pathenogenesis induced using133irradiated pollen and in vitro culture of immature seeds. // Agronomie 1994 -V. 14.-P. 169-175.
109. Mok, M.C., D.W.S. Mok, D.J., Armstrong K., Shudo, Y. Isogai, and T. Okamoto Cytokinin activity of N-phenyl-N-l,2,3-thiadiazol-5-ylurea (Thidiazuron).// Phytochemistry 1982 - V. 21. - P. 1509-1511.
110. Montelango-Escobedo H., Rowe P.R. Haploid induction in potato: cytological basis for the pollinator effect. // Euphytica. 1969 - V. 18 - №1 - P. 116-123.
111. Murashige T. and Skoog F.) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue culture.// Physiol. Plant. 1962 - V 15. - P. 473-495.
112. Niewkerk, J.P. van, R.H. Zimmerman, and I. Fordham Thidiazuron stimulation of apple shoot proliferation in vitro.// HortScience. 1986 - V21. - P. 516518.
113. Nitsh J. Culture in vitro de tissus de fruits. Mesocarpe et endocarpe de pech.// Bull. Soc. Bot. France. 1965. - V 112. - № V2.-P. 22-25.
114. Norreel, B. Etude cytologique de l'androgenese experimentale chez Nicotiana tabacum et Datura innoxia // Bull. Soc. Bot. Fr 1970 P. 117
115. Oinuma, T. and Yoshida, T. Genetic variation among doubled haploid lines of burley tobacco varieties.// Japan. J. Breed. 1974. - V. 24. - P 211-216.
116. Ran, B.D. Induction of haploid plants from unfertilized tobacco ovules.// Zhongguo Yancao. 1980 - V 3. - 25 - 26.
117. Raghavan, V. Role of the generative cell in androgenesis in henbane. Science. 1976-V. 191.-P. 388-389
118. Raquin C. Induction of haploid plants by in vitro culture of petunia ovaries pollinated with irradiated pollen // Z. Pflanzenzuchtg. 1985. - V 94. - P. 166169.134
119. Roger C. Muren. Haploid plant induction from unpollinated ovaries in Onion. // HortScience 1989. - Y. 24. - №5. - P. 833-834.
120. Sachar, R.C., Kapoor, M. In vitro culture of ovules of Zephyranthes.// Phytomorphology 1959. - V. 9. - P. 147 - 156.
121. San Noeum, L.H. Haploids d'Hordeum Vulgare par culture in vitro non fécondés. //Annual. Amelior. Plantes. 1976. -V. 26. - P. 751-754.
122. San Noeum, L.H. (1979): In vitro induction of gynogenesis in higher plants. Proc. Conf. Broadening Genet. Base Crops, Wageningen, 1978, pp. 327 329, Wageningen: Pudoc
123. Sauton A. Effect of season and genotype on gynogenetic haploid production in muckmelon (Cucumis melo L.). Sei. Hortic. 1988. - V. 35 - P. 71-75.
124. Sauton A. and R. Dumas de Vaulx Obtention de plantes haploides chez le melon (Cucumis melo L.) par gynogenes induite par du pollen irradie.// Agronomie 1987 - V. 7 - P. 141-148.
125. Simpson E. Dihaploid production in Barley // Ann. Rept., 1978. - Plant. Breed. Inst., Trumpington. - P. 131.
126. Sitbon M. Production of haploid Gerbera jamesonii plants by in vitro culture unfertilized ovules // Agronomie. 1981 - V. 1 - №9. p. 807-812
127. Shantz, E.M., Steward, F.C. Coconut milk factor: The growth-promoting substance in coconut milk.// J. Amer. Chem. Soc. 1952. - V. 74. - P. 61336135.
128. Sopory S.K. Maheshwari S.C. Development of pollen embryoids in anther cultures of Datura innoxia. 1. General observations and effects of physical farctors. // J. Exp. Bot., 1976 a V. 27 - № 96 - P. 49-57.
129. Sopory, S.K. Physiology of development of pollen embryoids in Datura innoxia//Mill. Ph.D. thesis, University of Delhi. 1972, Delhi
130. Subrahmanyam N.C. Haploidy from Hordeum in perspecific crossis. Part II Dihaploids of H. brachrantherum and H. depressum // Theor. and Appl. Genet. 1976. - V. 55. - № 3 - P. 139-144.135
131. Sun, C-S. Androgenesis in cereal crops. In proceeding of symposium on plant tissue culture. 1978. - p. 117-123. Science Press, Peking.
132. Sunderland N. Anther culture as a mean of haploid induction// Ed. Kasha K.J. Haploid in higher plants: advances and potential. Guelph: University of Guelph Press, 1974. P. 91 122.
133. Sunderland N., Wicks F.M. Embryoid formation in pollen grains of Nicotiana tabacum.//J. Exp. Bot. 1971. -V. 22. - P. 13-226.
134. Sunderland N., Collins G.B., Dunwell J.M. The role nuclear fusion in pollen embryogenesis of Datura innoxia Mill.// Planta. 1974. - V. 117. - P. 227241.
135. Sunderland N., Dunwell J.M. Anther and pollen culture// Plant tissue and cell culture/Ed. H. E. Street. Oxford, 1978. - P. 223-264
136. Symko S. Haploid barley from crosses of Hordeum bulbosum (2 x) and H. vulgare (2 x).// Can. J. Genet. Cytol. 1969. -V. 11. - P 602-608.
137. Siddigui, S.A. (): In vitro culture of ovule of Nicotiana tabacum L. var. NP. 31.// Naturwissenshaften 1964 - V. 51 - P. 517
138. Truong Andre I., Demarly Y. Obtaining plants by in vitro culture of unfertilized maize ovaries (Zea mays L. ) and preliminary studies on the progeny of gynogenetic plant// Z. Pflanzenzucht. - 1984. - V. 92 - № 4 - P. 309-320
139. Tulecke W.R. The pollen culture of C.D. La Rue a tissue from the pollen of Taxus. // Bull. Torrey. Bot. Club. 1959. - V. 86. - P. 283-289.
140. Tuleck W.R. and Sehgal N. Cell proliferation from the pollen of Torrea nucifera // Conf. Boyce Thompson Inst. 1963 V. 22 P. 153-163.
141. Uchimiya, H., Kameya, T., Takanashi, N. In vitro culture of unfertilized ovules in Solanum melongena and Zea mays. //Jpn. J. Breeding 1971. - V 21.-P. 247-250.
142. Van Geyt, J., Speckmann, Jr., D'Halluin K. and Jacobs M. In vitro induction of haploid from unpollinated ovules and ovaries of the sugarbeet (Beta vulgaris L.).// Theor. Appl. Genet. 1987 - V 73. - P. 920 - 925.136
143. Wang, С.С., Kuang, B.J. : Induction of haploid plants from the female gametophyte of Hordeum vulgare L //Acta Botanica Sinica. 1981. - V 23. -P. 329-330.
144. White Ph., Influence of some environmental conditions on the growth of excised root tips of wheat seeding in liquid media. // Plant Physiol. 1932. - V. 4. -P 613-628.
145. Yun J.U., Ri U.Z. Изучение характера регенерации растений из неоплодотворенных яйцеклеток ячменя. //Acta. Acad. Agr. Sei. D. P. R. Korea.-19905-P. 3-8.
146. Zenkteler M. Microsporogenesis and tapetal development in normal and malesterile carrots (Daucus carota L.). // Amer. J. Bot. 1962. - V. 49. - P. 341348.
147. Zenkteler M., Straub J., Citoembryological studes on the process of fertilization and development of haploid embryos of Triticum aestirum L. (2n=42) after crossing with Hordeum bulbosum (2n=14) // Pflanzenzucht. -1979.-V. 82.-P. 36-44.
148. Zhu, Z.C., Wu, H.S., An, Q.K., Liu, Z.Y. In vitro induction of haploid plantlets from the unpollinated ovaries of Triticum and Nicotiana tabacum. Acta Genet. Sin.-1979-№6-P. 181-183
149. Zhu, Z.C., Wu, H.S., An, Q.K., Liu, Z.Y. Induction of haploid plantles from unpollinated ovaries of Triticum aestivum cultured in vitro.// Acta Genet. Sin. 1981 -V 8. -P. 386-390
150. Zhu, Z.C., Wu, H.S., An, Q.K., Liu, Z.Y. In vitro induction of haploid plantles by tissue culture from the unpollinated ovaries of male sterile line Nicotiana// Hereditas. (Beijing) 1980. - V. 2 - P. 36.137
151. Zhou, C., Yang, H.Y. Induction of haploid plantles from unpollinated young ovaries of Oryza sativa L.// Acta Genet. Sin. 1980. - V. 7 - P. 287 - 288.
152. Zhou, C., Yang, H.Y. Induction of haploid rice plantlets by ovary culture.// Plant Science Letters 1981 a. - V. 20. - P 231 - 237.1. УТВЕРЖДАЮ»диктор вниио1. К%\ С • С. Литвин о в1999 г.1. АКТ
153. О передаче селекционного материала, полученного в лаборатории биотехнологии ВНИИССОК методами культуры пыльников и неопыленных семяпочек in vitro из сорта Нантская 4.
154. Нантская 4 -» пыльник № 11 2 корнеплода Ro
155. Нантская 4 пыльник № 12 3 корнеплода R0
156. Нантская 4 —> семяпочка № 21 5 корнеплодов Ro
157. Нантская 4 семяпочка № 23 4 корнеплода Ro1. Старший научный сотрудник1. Старший научный сотрудник1. С. Д. Сапелкина
-
Домблидес, Артур Сергеевич
-
кандидата сельскохозяйственных наук
-
Москва, 2001
-
ВАК 06.01.05
- Белая и черная гнили маточных корнеплодов моркови и разработка мер борьбы с ними в условиях Левобережной Лесостепи УССР
- Эффективность различных норм и соотношений минеральных удобрений на семенниках моркови в условиях Гиссарской долины
- Использование летних посевов в условиях предгорной зоны Северного Кавказа для товарной и семенной моркови
- Повышение сохранности и семенной продуктивности маточных корнеплодов моркови при объемной обработке их химическими препаратами
- Разработка элементов методики ведения семеноводства столовой моркови в условиях Среднего Поволжья
