Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка лабораторной технологии получения андрогенных растений белокочанной капусты с использованием культуры пыльников

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка лабораторной технологии получения андрогенных растений белокочанной капусты с использованием культуры пыльников"

россипсдяя йклдеш сельскохозяйственных паук научно - исследовательский институт

сельскохозяйственной биотехнологии

на правах рдкаписк

СЁИОВЙ наталья вльевна

РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЙНДРОГЕНШ РАСТЕНИЙ БЕЛОКОЧАННОЙ КППНСТЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЯЛЬТНРЫ пыльников

(03.00.23 - Биотехнилогиа)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соисканий ученой степени кандидата биологических наук

КОСКВА - 1992

Работа выполнена во ВНИИ селекции и сеиеководстса овощных кдльтцр

Научнай руководитель: доктор биологических наук З.И. Заичкин

Официальные оппоненты: Член-корреспондент ОН РМ,доктор сельскохозяйственных наук, профессор H.H. Балаоова кандидат биологических наук H.S. Нарьпхина

Веддчее учревдение: Институт обчей генетики АН России

Защита состоится " " 1992 г. в час. на за-

седании специализированного совета Д 020.40.С1 при НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН ( 127253,Носква, ул. Псковская, д. 12, корп. 4).

С материалами диссертации ыонш ознакомиться в библиотеке НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Автореферат разослан * " 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических надк

/ /

С.А. ИЕЛИКОВА

йктдальность теин.

Белокочанная хапдста является одной из основиак овоцинх :дльтдр навой страна.В последнее время »ирокое распространенна I цнровоЯ практике полцчило использование гвторозисных гибридов дла выращивания капдстк. Такие гибриды но только болов дро-гаЛнч.но а благодари вировишшостк соонх характеристик, лачяо |ригод»н к иеханнзиропаниой цборкп. Для пвлцчзннп геторозиснкя ■ибридов нвобхсдиин константные линии,выведение которых авлп-!тся достаточно трудовнниц процессом, Методом инбридинга для юлучеиия гоиозиготньх линий белокочанной капусты - перекресг-[оопмоЕцейся кдльтдри с двцхлотнин цикжом развития,тробдетсв [в менее 10 - 12 лот.

Совреиошшо развитие бистохнологичпских методов,приионяв-:зх в селекции,направлено на использование нетрадкционннх под-:одоп, позволявших эффективно канипулировать с гоноиоа внсгих -астений на древне клетки,ткани и органов. Перспективным ието-ок,теоретически позволшщнм значительно,в 2- 3 раэа.дскорить елекциоиный процесс .является кетод производства гапяендних астсиий с поисчьа кцяьтура пыльников - метод андрогэнеза In it.ro. Нетод кильтщш гшльпкков испояьздатса многих странах ира для целей селекции ,с ого поие^ьп цпв полдчени яоровио рактичесвио результаты.

В лнтегатнро ?нгеетса несколько сообщений об кнддкция ыяьцепего эмбриогенеза в пняьтдре палькаков белокочанной кадета, Одрако.полцчвикна результаты ае позволит оироко ис-ольэоаать этот метод в селекционной практике. Отсцтствцет одробпо разработанная и ушшврсальлая технология кцльтнраль-аго этапа,не оптимизирована цсловяя для эффективного зндро-внеза in vitro.

Цель работ: Визвлеиие эаконоиерлостей андрогензза in itro и создание лабораторной технологии получении гндрогеннах астений белокочанной капцстн.

Для достигонм Цоли било необходнио ревить следдаггио апачи:

1, Оптимизировать цело виз андрогшшого цикла и определить *$9Я7!Ш!Ш6 пути получения растений белокочанной капнети для тактического использовании, .

2. Исследовать влияние различных ннддцирдвчих факторов на чтешявность пыльцевого эмбриогенеза в кдльтура пыльников.

3. Изучить цитоэибриологическнв основы прямого андрога-неза; пути н есобешшсти развития пыльцы в культуре.

4. Провасти цитологической,морфологическое,генетическое исследование полученных растений - регенерантов.

Научнаа новизна.

В работе индуцирован високозффактианкй прииой андрогеие белокочанной капусты, подобраны генотипы и условны ннкуба цни.пры которая болов чей у 10* посаввнных пыльников ындуциру етса эмбриогенез, Проведен критический анализ рада факто ров,влиявших на эффективность atoro процесса.исследованы цито эмбриологи» )ские особенности развитии пыльцы в культуре. Впер вио показано,что пврекясчение развитие ныльцы белокочанной на пусты со спорофитного на гаветофитный путь развития происходи' в период первого митоза. Установлено , что пыльца в культур! пыльников белокочанной капусты развиваатса по пути "Б",a Tatest показано, что в начальный период развитие по спорофитному пут! могут складываться благоприятные условий - отсутствие цятото-кии, дли слияния ядер,т.е. спонтанной диплоидазацик. Проведв1 цитологический,морфологический,электрофорвтичвекий анализ растений- регенерантов,подтвервдаючий их андрогенное происхомдш»

Практическое значение.

Разработана лабораторная технология для производства анд-рогенных растений. Полученные в данной работе растениа-регене-ранты использованы в селекционных исследованиях в лаборатории селекции капусты BHHHCCDK, Закономерности,установленные в данной работе на белокочанной капусте .могут быть использованы для получение гаглоидов у других видов ,а такве дло увеличения выхода андрогениых растений рода Brassica.

ЙПРОЕАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные материалы диссертационной работы доловени на следующих совещаниях и симпозиумах; Всесоезная научно-практи-ческав конференции положил специалистов "Основные направление НТП в картофелеводстве.гиадоводстве и овощеводстве."(Минск,iSßl Конференция «алодых ученых ВНИИССОК (Коек,обл.,1989), S1 Вэв-дународный симпозиум "Embryology and seed reproduction." tЛенинград,1990 Конференция молодых ученых сельскохозяйственной академии им, К.й.Тимирязева (Москва,1991), Всвсоизнаи конференции "Достижение биотехнологии - агропромышленному комплексу" (Черновцы,1991)

ПУБЛИКАЦИИ. Яо те^в диссертации опубликовано 6 работ.

Объём и структура работы, Диссвртационная работа нзлоаена ¡а 129 стр.машинописного текста и состоит из впадения,хитора-•урного oöajpa,зкспвримантаяьной части и обсу*дения результа-■ов.выводоа.списка литературы,Список используемой литература жлвчает 137 наименований (33 отечоственннх и 154 инострашшх). (кссертациа иллюстрирована 25 рисунками, пилимая фотоснимки л :одзраит 17 таблиц.

ЗКСПЕРИШГШЬНПЯ ЧАСТЬ.

Цатериалы и методы.

Ь работе были использованы 12 сортов и иеалинсйннх гибридов белокочанной напусти (Brassica capitata CL.) Per«;,) из кол-10кции лаборатории капуста ЗШШССОК. Иы применяли общепринятые !отоди работы с культурами растительной ткани (Бутеи-{0,1984). Для культивирования пыльников использовали среду "ааборга В5 С1968) в модификации Хв11ег ( 1975,197?) : HUK -3.1 иг/л, HUK - 0.1 иг/л, глутлиин - 800 иг/я, серии - 100 ¡¡г/л, CaCig* 2 H^fl - 730 мг/л, сахароза - 100 г/л, pH - 5.8. Нвяьиики культивировали в стеклоиных. чааках Петри диаметроя 10

Пованввивсо зибриоиды на стадии крупных глобул ,а такве сердце или торпедоэидной фазе своего дазвития помечали на без-гормональ.чуя среду Гааборга В5 (1S68) в чавкя Петри по 10- 50 втык на чаяку, Нормально развипапцисса эибриоиды переносили каадае 3 педали на свевуя среду Е5, рвгенеранты доращивались з колбах на 50 ил.Цукроразшюаение растений из эксплантантов эиб-риондов проводили на средах, иидуцируоцих побегообразования, табл.g В последующем растения с нормально развитии листь-вяи н кориовой систоксП высотой около 5 см переносились в тор-Звпдрагиойныо горзки,заправленные почвенной сиесьв: торф.пэрег-геой,песок в соотнояении 1:1:1.Посла нодрачиваиия растения переносили в пластиковые гораки больаего обгона,запревлешша этой яв смесья.

Последовательность этапов работ,проводиинх в экспериментах по изучения пыльцевого андрогвнеза в культуре лвльяикоп (•елокочашшй капусты,представлена на рис.1.

Цитологический анализ проводили во временных ацотокаран-нобнх препаратах. Стпдив развития пальца и процент стерилышк зерен определили, аиалчзкруя 300 пнльцевых клеток. Культивируете пальники фиксировались d ацетоалкоголе (1:3) чераз 1,3,5,6,7,9,11,14 и 21 сутки. Плоидиость регепэрантов онреда-

Рис.1 . Последовательность проведения различних этапов работ с культурой пилышков белокочанной капусты.

ляли в клетках кончиков коронков.

Digk-электрофорез водорастворимой фракции изофврыентов зсторазн из молодых листьев проводили в цолочиой системе.пред-локешшй Орнстейном и Дзписом СOrnstein,Davis, 13G4),при папря-яении U=200 В в точении А часоп. Для проявления изофсрмснов эстсразы использовали раствор следящего состава: 0.05 У фосфатный буфер,рН-7.0 - 100 мл., dl -иафтилацетат ~ 10 иг.проч-носиний ВВ соль - 50 иг. Окраску проводили о точении 1.5 часов при 35 С.

РЕЗУЛЬТАТЫ И 05ШДЕНЙЕ.

1. Индукция пряного эмбриогенеза,

1.1. Влияние генотипа Змбриогвнний потенциал у изученных образцов сильно зависел от генотипа растений - доноров пальников, таблица 1, Из изцчешшх 12 вариантов пыльцевой эмбриогенез gдалось индицировать а 9: К-16,17,21,103,109,234,239, СПР-10, Били выявлены генотипы с высоким дровней индукции эмбриогенеза (более 500 эибриоидов на 1000 посаженных пыльников)-К—103,235,239,сродним (болев 100 змбриоидов на 1000 посаженных пыльников) - К-16,234 и низким (менее 100 змбриоидов на 1000 посаменных пыльников)- К-17, 21, 109, СПР-10* Результаты,полученные с генотипами К-103, 235 и 239,били сравнимы с максимальными роэультатамй,получаемыми на рапсе (Kaller,1984,1990).

Появление первых беловато-аеятых змбриоидов отмечали цяв через 10 дней после инициации культуры.Процесс их формирования обычно продолгался е*е 2-3 недели.Как правило,одновременно иа поверхности пыльника змбриоиды- были располоиены в разных стадиях - от глобулярной,до полнастьв дифференцированных зародн-яай.

1.2. Морфологический критерий бдтонов В качества морфологического критерия,по которому иоано бнло бы садить о степени зрелости пыльцы в пнльникв.бнл взпт индекс "К",который определяется как:

К=( длина лепестка)/(длина пыльника) Нами бал проведен анализ частоты встречаемости в постлейо-тических пыльниках различных стадий от тетрад до трехадерних пыльцевых зерен в зависимости от индекса батонов К.Для каидого значения индекса К исследовалось не менее 20-25 бутонов по 0 пыльников в кавдоы. Работа была выполнена с батонами сорта

■ 5 -

Таблица 1.

Зависимость частоте и эффективности пальцевого эмбриогенеза в культуре пвльников белокочанной капуста от генотипа.

Генотип Посажено Пыльников с Отсажено Зибриоидов на Содераание сте-

пальников эмбриоидами змбриоидов 1000 посаженных рильных зерек

вт. г ВТ. пальников г

К-3 70 0 0 0

К-16 864 4; 8^5.7 326±17 > 380 -

К—17 120 O.Saü.? 1 8 -

К-1Э 84 0 0 0 30.5±3.0

К—21 284 0.4t0.3 1 4 -

К-103 1032 18.4±0.3 517±16 501 34.9*3.3

К-109 72 2.3±1.9 3 40 9.3±1.1

К-234 1134 5.3±0.6 100±10 140 3,7+0.5

К-235 1798 10.1±0.7 930±12 520 7.7±0.8

К-239 1572 14.4+0.9 954±13 607 4.0±1.0

СПР-10 120 0.1 1 4 8.1+2.3

СПР-11 200 0 0 0 -

Слава", Установлено,чго в зависимости от индекса К меняется оотновение различных стадий сперматогенеза. Так, одноядерное акуолиэироианныо кикроспоры находятся в 65Х пыльников,взятых ¡з бцганоо с ипдгксом К в продолах от 1/4 до 7/8,с максиналь-(ым их уровнем при К=3/4 - 76Х. Одно-двуядорныв клетки |рисутствуит в 62/С пильникоп из бутонов с индексом К от 3/4 до 1/4 с максимумом при при К=1 - 05Z. Гакны образом индекс К [охот быть использован для целей отбора подходящих пальников.

Было проведано исследование частота появления змбриоидов 13 пнлмшеоп в зависимости от индекса К, таблица 2.

Таблица 2

Зависимость числа ответивиих пнльииков и эффективности пальцевого эмбриогенеза от индекса батонов "К".

Значение индекса "К"

1/2 3/4 7/8 1 1 1/4

Число посаженных пыльников,ат. Число пыльников с э*брИОИДО)*И,1Т. Число пнльников с экбриодаыи, X Отсдввно эмбриоидов, ВТ. Зыбриоидов/ 1000 пыльников 84 583 251 170 86

3 7? 86 ' 35 1

3.6+2.0 13.2+1.4 33.0±1.8 20.6+3.1 1.2+1.1

4 304 527 20В 1

48+24 52Oí21 2С20+30 1210+31 litlO

Обращает на себя внимание тот факт,что знбркоиды в осио -ном появлялись только из тех пыльников,которые были в бутонах с индексе* К в предолая 3/4-Í с иаксиаумом при К=?/8.Более того 39.Ш всех зыбриоидов били получены из пыльников,которые находились в бутонах с индексом К в продолах 3/4-1.

1.3. Тепловая обработка Известно,что для некоторых видов рода Brassica усиление зибряогенной активности кикроспор иоявт быть достигнуто тепловой обработкой пыльников (KeJler,1984). Мы исследовали на на«их образцах эффективность воздействия

температурой 35°С в течении:0,1,2,3,4 и 3 дней на уровень ин-

-

дукции пыльцевого эмбриогенеза.

Из полученных нами данных (7абл.З) видно,что как чи£ ответиввих пальников,так и число омбриоидов,полученных от 1( посаяанных пыльников.максимально при инкубации пыльников в 1 чвкии I дна при 35°С с последувщш культивирование* при 26 Двух-трехдиевная инкубация при 35° С сливала эффект В£ действия. Тепловая обработка позволяла в'12 раз увеличить е ход ахбриоидов по сравнении с необработанным контролем.

Таблица 3

Влишшо продолжительности теплообработки на часта-ту и эффективность пыльцевого зыбриогенеза

Твплообра- Посажено Пыльников с Отсажено Зыбриондов на

ботка пыльников змбриоидами эмбриоидов 1000 посажен-

дни ВТ. X ■т. ных ПИЛЬНЯКОВ

0 288 0.9±0.5 2 7±5

1 3104 10.8±0,5 1312 422±9

2 1358 4.810.6 149 109±9

3 1160 2.3+0.4 59 5117

4 240 0.4±0.4 4 17+8

3 272 1.8±0.8 9 33±11

1.4. Неловка вырациванид растений В резнльтате нав исследований установлено,что пыльники,изолированные Из бутон растений выращиваемых в условиях климакамерм,обладает сравн тально более высокой способность!) к образовании эмбриоидов.ч растений,вырацонныо в поле,таблица 4. Крохе этого,условна климакамера - контролируемые,что позволяет стандартизирова их при вкрацивании растений-доноров пыльников,

1.5. Возраст растений - доноров Нами было изучена влиан момента взятия бцтоноэ (в начала.середине или конце' перио цветение) на эффективность пыльцевого эмбриогенеза. Как вид из полученных данных (табл.5) .максимальное число ответивв 'пыльников,а также число эмбриоидов на 1000 посаженных пыльн ков было получено из бутонов первых соцветий - 770 эмбрио дов/ЮОО пыльников. Для Пильняков,выделенных из следувдих времени бутонов этот показатель снихалса более чем в 5 раз составлял 130-150 змбриоидов/ЮОО пыльников. В целом,за во период цветения 74.3% аыбриоидов было получено из пкльник ' • 8 -

рвцх батонов.

Таблица 4

Влияние условий вирац^ваниа растений - допоров пальников на эффективность пыльцевого яыбриогенс~а.

1словид Генотип Посаясно Ответило Отслиепо Зыбриои-

шразивания п1/лы1ик011 пыльников энбрноидоп дои/1000

ит г ят ■шлышков

{лимакаыора

10°С, К-103 144 22.313.0 142 980±12

»0 ООО лк К-235 156 16.0+2.0 113 720+35

К-239 294 19.7+6.7 50? 1720126

1олв К-103 888 17.613.3 372 420+17

лгнь 1990г. К-235 890 14.3+3.8 652 940415

К-239 1212 13,8+2,8 436 300+14

Таблица 5

Влияние времени взятии бутонов после окончании процесса яровизации на эффентивнссть пыльцевого эмбриогенеза.

Дни Посажено Ответило Отсавено Змбрнои-

пыльников пыльников змбриоядов дов/1000

пт. X эт. пыльников

18 день 420 ■ 21.4±2.0 324 770+21

22 день 288 13.5±2.0 42 150+21

31 день 336 8,3±1,5 48 140+18

38 день 168 3.6*1,4 23 130126.

2. Цитологические аспекты пыльцевого эмбриогенеза 2.1« Опраделвние критической стадии микроспороганаза Среди условнЛ,опрвдвяасцнх поведение репродуктивных кле-ок при культивировании пыльников больвоо значение имеет' стана микроспорогенеза.на которой проведена эксплантация.В рабо-ах КеПег (1984,1990) делается заклшченио о наличии в роде гавз1са в зависимости ог вида двух различных "критических" онентов во время никроспорогяиаэа,когда возыозиа индукция зы-

бриогоннсго раяьптия.

Исследование бьло выполнено на пыльниках генотипов К-235 и Н-233. Перод введением пыльников в культуру один из й пыльников фиксировали»он служил источником для цитологического анализа.В слцчао.осли из оставшихся пыльников появлялись аиб-риоидн.в ¡зафиксированном пыльника определяли стадия развития пальцы.Всего било иосаксно 335 нияышков С табл.6).

Таблица 6

Эмбриогоноа п пмлышках белокочанной капусты в зависимости от стадии развитии пь'льцк

Стадия развития пыльцы Пыльников с эмбриоидами Отсажено зкб-рноидов Эмбрноидов на 1 ответивший пальник

г вт. г

Поздняя одноядер- 16,2+2.0 6 2.6 1.0

ная микроспора

Одно-двяядерные 83.6+2.0 228 97.4 7.4

пыльцевые клетки

Всего: 100 234. 100 -

Оказалось,что микроспоры 83.Ш пыльников,в которых отмечен эмбриогенез,находились на стадии одно-двцядерннх клеток. Массовое появление эхбриоидов происходило ливь на стадии од-но-двуядеркых клеток. Из пыльников с пыльцой на этой стадии получено 97.4Х всех зибриоидов.Из пыльников с поздними одноядерными микроспорами отмечено появление лияь единичных эмбри-011 дог.,

Исходя из полученных данннх можно сдолать вывод,что критической стадией,т.е. моментом,ногда возможно перепрограммирование развития микроспор,благодаря внесшим индццирушцим факторам,язляогся стадига одна-двуадорных клеток.Небольиое количество эмбриоидов.появиввихсв из пыльников с поздними одноядерными кикроспорали но противоречат этому заключении,Иикрос-пори в этих пыяышнах находились на стадии поздней интерфа-зи.позтоид небояьвой пул клоток мог начать митоз сразу после посадки пальников на среду.Однако,очевидно,что таких микроспор долхко быть относительно немного,а значит выход эибриои-дов - низкий.что и подтверхдаотся экспериментальными данными.

1.1

2.2. Спорифитнов развитие пчльцц в культура 8 течение врэой недоли культивирсшашш пыльииков,посаяшшых на стадии дно - двуядорных клеток, Гюльпинстпо иииросиор двгонериру-т.остаптся только пустые о иол очки и лмзироианпио клс-ткл. На ротий - четвсртай день культуры попвляотсп относительно крупно округлый клетки,сильно прокрашиваемые ацатпкармнном. Имен-о в таких клетках начиная с пятого - аистого дня культуры о«но било в;|деть первыо снорофитиые долепив. При атом во всох лучдях мы наблюдали только один тип деления - примерно равное ,ол8>те вогетатинногс ядра, этот путь развития обозначен как ;уть "Б'ЧМуромцзп и др., 1390). Исходя из этих наблодений.а так-:в навих данных о тон,что критической для эыбриогвннпго разви-ия пыльцы является стадия одмо-дпуядериих клеток,моямо злкли-ить.что конкретные причины порвклвчениа процессов диффереици-овки микроспор у белокочанной капусты на путь морфогенеза на» ,о искать в молекулярных механизмах парного митоза. ¿lMei.uo в то время возможно пэрепрограымирование их развитии,благодаря неяним индуцирующим факторам.

При цитологическом исследовании развитии пыльцы в культу-1в показано,что после первого спорофитного деления микроспоры [ризнаки разделения клеточной станки (цитотомии) могут как ¡рисутствовать,так и отсутствовать.Таким образом,ухе на ранних тапах эмбриогенеза появляется реальная возможность спонтанной .игаплондизации клеток благодаря слиянию ядор,

2.3. Пыльцевой диморфизм Начиная со стадии поздней иитер-|азы микроспор,в препаратах пыльцы появляется клетки,меньяие ю размерам и не проиравивавцився ацатокарминои.Существование ,вух типов пыльцевых клотек известно как явление "пыльцевого .кнорфизиа". Поскольку есть предположения о возможной прямой заимосвязи процесса андрогензза Лп vit.ro с выраяенностыа ндьцевого диморфизма (НеЬвг1е-ВогС,1988>,нами был изучен этот опрос на пыльце белокочанной капусты. Для зтого у некоторых енотнпор был оценен уровень пыльцевого эмбриогенеза и однов-еманно определено относительное содержание стерильной пыльцы

пыльниках (табл. 1). ,.

Представленные в таблице 1 результаты не дает основания ,ло заключения о взаимосвязи этих явлений у изученных гечоти-ов.Есть генотипы с относительно высоким содерианием стериль-ой пыльцы и низким уровнем эмбриогенеза - К-19 и .наоборот,с изким содержанием стерильной пыльцы и высоким уровнем эмбрио-

- И -

геноза - К-234,230.

3. Регепррацка растений Эмбриоиды после появления на пс верхности пыльников переносились на безгормональнув среду Гак борга В5 (1364).В таблице 7 представлении данные о рвгенерацу растений на этой среде,которые были затем высажены в грунт, такве о число растений,получаемых на 1000 посажанных пыльнике в зависимости от генотииа.

Таблица ?

Выход дкорешшх растений - регенерантов из эмбрио-идса белокочанной капусты на среде В5.

■ Генотип 1 ......- - - Посааено эмбриоидов «т. Получено Растений/1000 ПЫЛЬНИКОВ

ат. X

К-16 К-1СЗ К-234 К-235 К-239 271 507 51 714 906 34 19 8 21 93 12.5+2.0 3.7±0.2 15.6±5.0 2.9+0.6 10.3±1.0 46 1 7 19 + 1 22 + 7 15 + 2 63+6

Всего: 2086 184 6,83:0.5 33+5

Из данных таблицы 7 видно,что из отчего числа высаженныз на бвзгормональнув сроду В5 андрогеикых растений в средне* только С.8Я регенерировали в'нормальные растения.В завксивост» от генотипа этот показатель колебался от 2.92 до 15.62. Такяи образой, с помощьв такого подхода удалось получить в зависимости от генотипа от 15 до 63 растений на 1000 посаненны* пыльников.

4. Иикроразынояение растений Большинство выяивсих Бмбри-ондов формируат удлиненные или утолщенные гнпокотилм и пассивные котиледоны и не образует нормального побега.Для тего,чтобы регенерировать растешш из аномальных зыбриеидов, их нарезали на зкепяанты диаметром 1 см. и толщиной 1-3 мм и поискали на среды,индуцирующие побегообразование, Культивирование на таких побегоиндуцирупг.их ерпдах проводилось в течении 1-2 месяцев. Результаты этого экспериментам такае состав побегоиидуциру»-цих сред представлены в таблице й. В таблице суммированы данные о растениях - регенерантах, проведвих как этап побегообра-

■ 12

ювання.так м укоренения и адаптация в грунте.

Таблица 8

Виход укоренных растекся - регенераитов из экс-ллантантоо знбриокдов белокочанной капуст».

Среда Минеральный Содержание Посаяено Получено Растений

состав Фитогориоков эксплант. растений на 1 эис-

цг/л ат. ат. плантапт

Я-1 НИ БЙП- 1.0 53 17 0.26+0.06

ГК- 0.1

!?-2 М5 Зеатин- 1.0 11? 52 0.44+0.05

ИНК- 0.1

Й-3 ^ 2-1Р- 4.0 90 3 0.10+0.03

Я-4 МБ БАЛ- 1.13 45 4 0.09*0.04

0.585

Й-5 В5 ЗИП- 1.0 81 3 0.11+0.04

ГК- 0.1

Я-6 В5 Зеатин- 1.0 03 2 0.03+0.02

НИК- 0.1

К-7 В5 2-1Р- 4.0 64 3 0.041:0.03

й-8 В5 Ш- 3.0 45 3 0.05+0.03

1ШК- 1.0

Лучаие результаты Сняя получена на среде Я-1, Н-2. На 9тнк средах в некоторых случаях иояно было видеть формирование, на поверхности ахспланта больиого количества,до 50 и более, взогнутнх побегов,из кэторвх поело черенкования и пересадки на езезяе среди того ве состава мояяо бэло подучить нормальные побега. » 1

Пояученнае на лобегомндццирувдих средах побеги укореняли на средах для ризогенеза. Эти среды наели «инеральнуш основу КБ и следивпий гормональная состав : НЭК - 1.0 мг/нл;И11К - 1.0 кг/ал.КЙН - 0.1 мг/ил:ИЗК - 1.0'иг/мл,Ш - 0.01 иг/мл. Данные среды практически не отличались по числу побегов.индуцируичих рязогенеэ (52-5931). Однако на средах, содержащих кинетии.о^ра-зузчнеса корпя бнлн толце и многочисленнее.

5. Пяондвость растений - регенерантов Кы проаиадизирова-

лп во вренспннх ацетокаркмнавих препаратах кончиков коревков число хрпыосом 19 растений - регенераитов. Среди изученных растений йшт * обнаружено 0 гаплоидов Сп=93.9 диплоидов <2.0=18). 1 триплоид (3п-273 и 1 тетроплоид {^п-ЗВ). Таким образов в швей работе гплломдк составила 422 от числа г.сех про-апалшировшших. растекий - регеиераитов.

Таблица 9

Величина заныкаюздх клеток устьлц листа и их среднее число в пола зрений микроскопа у растений - регеиераитов.

Признак Ллоидность Отношение показателе« гаплоидов к динлоидаи г

1 2"

Длина заннкйвяих •23.8+1.8 16.8+1.6 71.8

клето устыщ, ака

Яирына за»шка»цих 17.8+1.8 13.4+1.Б 70.1

клеток устьиц, кки

Среднее число устьиц 48±3 85±9 177

в поле зреши мнкрос-

кола

Кроме непосредственного определения числа хроаосо» в препаратах китстичзскнк клеток о ндоидности растений ноено судить по некотории аноточкческии признакам раегепкй.в част-носгн.по длине и вирине заичкакдах клеток устьиц листьев, а такхе их числу на единицу площади листа (Хохлов в др..1976).

6 навей работе ь'к исследовали згн признаки на полученных растениях - регекерантах. Для анализа брали самке крупные нкв-ние хшстья растений чйрсз 1.5 иесяца посяе их еьсадкя в грвнт.Всего бало изучено 18 растений.

В таблице 9 представлена средине значения длша и сирины замшгавде клеток устьиц,а танке их чнсео в поле зрения иик-рссхопа в зависимости от гшмдиости. Анализ получении*. данных показывает.что у гапяоядинх растений но сравнении с дмпдокдия-иа длина и яирине зашшадчих клеток устьиц уиеныаетсс в 1.31.4 раза,а число устьиц на единицу шю*ади листа дседкчииаьтся в 1.7 раза. , .

Цельв данной работы биле п г,лучение растеичй белокочанной вапусгв из репродуктиышх клгтод - пшгыде. Пэлучаеше из шш>-

- Н -

яяюмм " отамек*'« «егжжет —>■ -

»оган ЕЗЕТБ.'Э г^г'.'^л сгдда такка зг^а

-■■■-—-- «зсагяв» юзксю ишвгап

Д-г С0 вз 70 3

Рис 2. Спвкурн изофврмеитов эстеразы исходного генотипа -К-235: К1.К2 и растонка - регенерачтов И 2,39,62,63,69,70

а андрогенняе растений в следствии гааотмчвского расщепления ¡шзианов долянв отличаться как друг от друга,так и от исуод-эго гетерозиготного растения (Хохлов к др.,1976),

6. Злектрофороз иаофврцэнтор астераза Иетод использована пзофериентоа з кзчзстро генетических маркеров позволяет вадизировать фпнотигсичасков проявление единичных генов. В анной работе им изучали спектры форыента эстораэы водораство-имой фракции лорсых голодах листьев с ломоцьш днск-злвкгрофо-вза в' полиакрилагшдмоы голе. На рис,2 предстазлены алектрофо-вграинм растений - рогонзрантов и исходного гибридного гено-япа К-235. ёорфологичесш! растения И-235 - однородны,электро-юретнческкй анализ спектров $ериентов эстеразы нескольких астоннЛ И-235 показал,что они на имозт существенных различий.

Спектры изофврзднтоэ эстеразы псах 25 изученных растений-' 1вгенераитов отличались как друг от друга,так я от исходного внотипа,рис,2. Такая сегрегация генетических паркеров возыав-ю только при условии спорофитнего происхождения растений -

рвгенорантов.'.'.о.путем дифферекцировки клеток пыльцы,

В результате проведенных исследований были сделаны следующие ВНВОДМ:

1. Разработана лабораторная тяхнологиа производства анд раганянк растопил белокочанной капусты с поиащъв культур

иылькниое,

2. Процесс андрогеноза in vitro гвизтичоски ^етвржширо паи. Среди 12 изученных генотипов,было отобрано 3 образца высокий ¡¡ровном пыльцевого эмбриогенеза (>500 аыбриоидов н 1000 пыльников),средним (>100 эмбриоидов на 1000 пыльников)

2 образца .низкии (<100 аибриоидов на 1000 пыльников) - 4 об раэца,пыльцевой эмбриогенез отсутствовал у 3 образцов.

3. Эффективность пыльцевого эмбриогенеза максимальна i пыльниках бытонов,срезанных с главного побега в начале цвете-ник до раскрытия первых цветов.Для пыльников,выделенных и; слодушьих по времени бутонов этот показатель снижался Gcumi чем в 5 раз.

,4. Иорфологическим критерием для отбора бутонов с оптимальной дли культуры пыльников стадией развития пыльцы tioze: слцкить индекс К-длина лепестка/длина пылышка.99.ВХ всех экб-риоидев было получено из пальников,ваделенних кз бутонов с нн-дексок К=3/4 - 1.

5. Критической стадией для перокличения развития микроспор белокочанной капусте с гахотофитного нз cnapoQunmi путь развития является период первого пыльцевого ыитоза.

6. Спорафитиое развит не микроспор в культура пальник ci происходит по пути "Б",при этой во время первого «итога признаки разделения клеточной стеши (цитотошш) могут отсутствовать,

7. Доказано стннулирупцоц влияние тепловой обработка t начальный период культивирования на интенсивность шгяьцезеге эмбриогенеза.Наиболее эффективным воздействием являлась инкубация ляшышков в течение 1 суток при .Такая обработка с 12 раз. увеличивала выход амбриоидов по сравнения с контролем.

8. На безгорхонаяьной среде В5 в растение рвззивавтсс 6.82 всех посажанных знбриондов.Б зависимости от генотипа на этой срода получено от 15 до S3 растений на 1000 посахенных пыльников.

3. Увеличить выход андрогонных растений uczno . с помодьв индукции иор{!огенэза из . эксплантантсв экбриоидов.Лучвие ре- 16 -

пьгатн получены на среде NS с добавканигзеатин - 1хг/л,1ШК -iMr/л или БАП - 1 иг/л,ГК - 0.1 иг/д.

10. С покочьи цитологического анадипа показано,что среди учошшх растсиий-регонорантвв гаплоиды составляли 42.3Х,дип-иды 47.4% ,трнпломди 5.22 ,тотраплоиды 3.22.

11. Предварительно о плоиднести полученных растений ыовио дить на основании величина гашпмячих клеток устьиц листа,3 плоиднчх растений по сравнение с диплоидннки длина и яирииэ ыыкапдих клеток устьиц уменьваласъ п 1.3-1.4 раза,а их число

единицу плоцади листа увеличивалось в 1,7 раза.

12. С помощьа микрофотографии процесса разпитип микроспор культуро.а тэкзо анализа споктроз иэоферментов аствраз

стений-регеперантов показано их происхолдение из ыикроспор.

СПИСОК РОБОТ.ОПЯоЛЯШйНННХ ПО КПТЕРНПЛП« ДИССЕРТАЦИИ

1. Сёмова Н,В. Культура пыльников и везкоа^ости ов исполь-вания в селекции белокочанной капусты.// Вссс,хоиф.иол.учен.-тек.-1989,- С. 34.

2. ftnohin Y.H..Seoaova H.Y. Esbryogenesis in anthor culture white cabbage.// Eibreology and seed reproduction,Leningrad.-

190.- P.158.

3. Seoaova H,Y.,flnohin У.Н. Structure-functional rolatlon-lip In cultivated cabbago anther: biotechnological aspects.// ibryology and seed reproduction..Leningrad,-1990.-P.149

4. Сёиова Н.В.,Пнохии В.Н. йнднцированний змбриоидогенез культуре пыльников белокочанной капусты.// Доклада В0СХНШ1.-т.-П 8.-С. 27-31.

5.Анохин ПЛ. .Сомова Н.Ш. Структурно-руикциональныв взаи-штновония в пальнике белокочанной капусти в зибриокоипетент-IX стадиях микроспорогенеза.// Доклада ВАСХННЛ.- 1991.-Н 2.. 21-24

6. Сёмова H.D. Культура пыльников белокочанной папуста: ¡дукция прамого эмбриогенеза и регенерация растений.// Всес. знф,- Черновцы,- 1991,- С. 57.

- 17 -