Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка культуральных моделей нервной ткани и их использование для изучения воздействия гиполипидемических препаратов на клетки мозга человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Разработка культуральных моделей нервной ткани и их использование для изучения воздействия гиполипидемических препаратов на клетки мозга человека"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЦВДИЩШЦ
На правах,рукописи
ОД
. ПАВЛОВ
Олег Владимирович '. ;
РАЗРАБОТКА, ЮГЯЬТУРАЯЬШХ МОДЕЛЕЙ НЕРВНОЙ ТКАНИ ' Я ЯХ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ ГШЮЛНПИДЕМИЧВСЖИХ ПРЕПАРАТОВ на клетки КОЗ ГА чкловркл
Специальность: 03.00.04 - Биохикиф
АВТОРВФВРАЯ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических иаук
Санкт-Петербург 1994
Работа выполнена й Физиологическом отделе нн. Н.П.Павлопа ноучно-иссяодовательсхого института экспериментальной пернцины РАНН (директор - академик 1>АНН Б.Н.Ткаченко).
, Научний руководитель:
доктор медицинских наук, член-корреспондант РАМН, профессор Г.Й.Варташгн
ОфМциалыше оппоненты:
Ведущее учреждение:
доктор биологических наук
Б.Казакова
доктор биологических наук ■ в
Н.И.Чаднсова Институт зкспериигнтальной кардиологии К1Щ РАМП
Защита диссертации состоится ч^У" с 1Ъ часов на "заседании Специализированного Ученого Совета (В 001.23.01) по присуждения ученой степени кандидата наук при Науч-но-иссладоватеяьскон институте экспериментальной недицинга 1'ЛМК по алресу1 197376 Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.
С диссертацией ножно ознакомиться в библиотеке НИИЭН РАНН по адресу« 157376 Санкт-Петербург, ул. окад. Павлова, 12.
Автореферат разослан
199 г
Ученый секретарь Специализированного совато, "кандидат биологическим наук
О. Г,Купикова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Применение гиполипиденических препаратов для лечения сердеч--сосудистых заболеваний, связанных с нарушением липидного обмена высоким содержанием холестерина в крови, в настоящее время при-ло массовый характер. Одним из наиболее эффективных и перепек-вных классов антигиперхолестеринемических препаратов в настоящее емя считается группа ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы, называемые кже "статинами" или "монакояинами". Среди препаратов этой группы иболее широкое распространение получил ловастатин (мевипэлин, ■ вакор) и его структурные аналоги. Другим широко используемым «паратом является антиоксидант пробукол, обладавший гилолипиде-ческим и антиатеросклеротическин действием. Он является одним из многих средств, эффективных при лечении гомозиготной семейной лерхолестеринемин. ■
При оцёнке эффективности гиполипиденических препаратов обычно следуется их способность снижать содержание холестерина в экс-* ацеребральном комлартменте, в первую очередь - в сосудистом рус. При этом, как правило, вне поля зрения исследователей остается зможность проникновения препаратов я центральную нервную систему $С) ни» влияния на клетки ноэга пациентов, находящихся на пос-янной гиполипидеиической терапии. t
К настоящему времени, однако, накоплено достаточное количест- , фактов, свидетельствующих о влиянии некоторых гилолипидеми-ския препаратов на нврвиуо систему. • Так показано, что у пацнен-э, приникавших ловастатин н его липофильные аналоги, наблодалось «ращение продолжительности и нарушения сна, а также заметно удиались некоторые психомоторные реакции [Roth е.а.,1992t Schae-r,1983t Vgontzas е.а.,1991]. Пробукоя также способен оказывать ияние на процессы, происходящие в нервной систека [Kburatanl а., 1988] , .
Литературные данные сви&втедьствупт о уом, что внеокояипо-льнка препараты способны достаточно легко проникать через плечные мембраны, в том числе м Г36, а относительная автономность стены метаболизма холестерина а ЦНС делает ее уязвимой для воз-йствия высокоэффективных препаратов, которые способны влмять на дельные стадии синтеза, транспорта и утилизация холестерина.» згу и, тек самый, нарушать его геиеостаэ.
Несмотря на то, что эффекты этих препаратов па клетки раавкч»
- г -
них тканей достаточно широко изучаются на моделях in vivo и ii vitro, в литератур«'отсутствуют данные о непосредственной алиянш этих препаратов на клетки нервной системы человека и животных и < характере такого воздействия на клеточном уровне.
Очевидно, что В условиях целостного организма практически невозможно оценить степень и характер воздействия данных препарато1 на нейрон» и глив ЦНС человека. В то же время, использование культур нервной ткани позволяет с выс.окой степенью достоверности смоделировать in vitro ситуацию, имитирующую проникновение в мозг ли-пофильных гиполипидемических препаратов и сцвпит» ст^г.с;;:. «s-
посредственного воздействия на нейрональные и гпиалълые клетки
Цель» настоящего исследования явилось изучение влияния "терапевтических" концентраций ловастатина и его аналогов, а также про-букола на культивируемые in vitro клетки ЦНС человека.
В задачи исследования входило:
- получение различных типов культур нервной ткани человека;
- разработка на основе культивируемых клеток мозга человек! (нейронов и астроцитов) адекватных моделей in vitro, которые поя волили бы изучать эффекты тестируемых препаратов на клеточно-моле кулярном уровне;
- изучение' непосредственного влияния тестируемых препарате на различные процессы жизнедеятельности нейрональных и глиальны клеток ЦНС человека, в частности; отдельные стадии метаболизма хо лестерина, пролиферативную активность, рост и выживаемость, уль траструктурнуо организацию.
Научная новизна работы
В процессе исследования были разработаны оригинальные метод получения и долговременного культивирования клеток ЦНС человека.
Впервые в условиях in vitro была смоделирована ситуация дол говременного непосредственного воздействия "терапевтических" кон центраций ловастатина и пробухола на клетки мозга человека, чт позволило продемонстрировать выракзнный негативный эффект ловаста тина на нейрональные и глиальные платки ЦНС человека и стимулируя ще« влияние пробукола на рост и развитие нейрональных клеток.
Научно-практическое значение полученных результатов
1. Полученные в ходе данного исследования результаты могут ыть использованы для выработки рекомендаций по практическому при-ененив гиполипидемических препаратов с учетом их возможного ействия на центральную нервнуо систему человека.
2. Разработанные в ходе исследования культуральные модели мо-ут быть использованы для тестирования нобых лекарственных препа-атов на стадии предклинических испытаний, что позволит существен-о сократить сроки их внедрения в практику здравоохранения, ¿¡наше . одели даст возможность за относительно короткий срок обнаружить озможные побочные эффекты препаратов, для выявления которых в клинике требуются годы.
3. Обнаруженный нейритстимулирующий эффект пробукола после ополнительных исследований может быть использован для стимуляции эгенерационных процессов в нервной системе.
Положения, выносипиэ на защиту
1. Разработаны новуе методы получения нейронов и астроцитов КС человека, способных к длительному существование р условиях веточной культуры.
2. На основе культур клеток головного мозга человека созданы одели, позволявшие в условиях in vitro изучатьt
- синтез холестерина и активность лнп-рецепторов в клетках ерзной Ткани челойека?
- функционально-морфологические характеристики основных типов поток мозга человека в процессе их развития
3. Выявлен нейротоксический эффект лозастаткка на культуры щеток мозга человека при концентрациях препарата, которые при-^тствуют в организме пациентов а процессе лечения.
«. Установлено, что пробукол стимулирует рост и днфференци-эаку нервных клеток, а также увеличивает срок и* жизни в культу-s.
5. Показано, что пробукол заметно нивелирует негативные цито-зксические эффекты ловастатина в культурах нейронов человека 'при зпбинировакнок применении этих препаратов.
Апробация работц •
Научные результаты, представленные а диссертации, были доло-
жены на II Всесоюзном симпозиуме "Возбудимые клетки в культуре ткани" (Пущино, 1989 г.) и XIY ежегодной конференции университета г. Сиднея (Австралия, 2-4 февраля 1994г.)« Тезисы работы были опубликованы в сборнике "Возбудимые клетки в культуре ткаии "(1990) и Трудах Австралийского общества нейронаук (Proceedings of Australian Heuroscience Society, 1994, V. 5).
лиссертаиня изложена на 139 страницах и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, юс обсуждение и выводы. Работа содержит 7.1 рисунок и 8 таблиц, список литературы включает 189 источников, из них 46 работ принадлежит отечественным авторам и 143 - зарубежны«.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе были использованы различные типы культур клеток ЦНС человека, полученные нэ эмбриональной нервной ткани: органотипи-чесхие культуры, смешанные глио-нейроналыше куаьтуры, "чистые" культуры нейрональных агрегатов, "чистые" культуры первичных аст-роцитов, а. также линия инмортализованных зстроцитов человека ASCh-7. Клетки нервной ткани культивировали в бессывороточной среда.
Пробукол растворяли в этаноле и затем эмульгировали с 1%->шм раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА). Монаколины растворяли в динегилсульфоксиде (ДМСО), а затем разводили до желаемых концентраций средой ДНЕМ. К культура« добавляли 100-кратные растворы препаратов, которые составляли 1% от объема среды в культу-ральном сосуде. В контрольных опытах в культуры добавляли соответствуете количества этанола, БСА и ДМСО.
Уровень эндогенного синтезе холестерина клетками UHC человека определяли по включению 1<С-ацетата во внутриклеточный холестерин. Клетки инкубировали с 5 мкхи *4С-ацетата и соответствующий количество« тестируемого препарата в бессывороточкой среде в течение 3 часов.
Лкпидм экстрагировали смесью гексан/изопропаньл, выпаривали под струей азота, м растворяли в хлороформе. Образцы по 20 мкл наносили на Пластинки анализировали методом тонкослойной хроматогра-
ли. Определяли количество радиоактивного ацетата, включившегося в неточный холестерин, в расчете на ииллигракк белка. Допзависиные ривые аппроксимировались'с помощью компьютеризованного потшоми-"ьного регрессионного анализа, и по этин кривым определяли значащи IC50. IC50 соответствует концентрации препарата, необходимой 1Я ингибирования синтеза холестерина на 50% от максимальной веди-Mat ингибироваиия. Сравнение кривых ингибирования проводили пос-гдством компьютеризованного дисперсионного анализа (AN0VA).
Активность ЛНП-рецепторов определяли по специфическому сцязы-»нию 1251-ЛНП первичными и иммортализованными астроцитами, пред-арительно инкубированными с 100 нг/мл ловастатина или 20 мкг/кл робукола.
Количество клеток подсчитывали с помощью гемоцитометра, жиз-гспособность клеток•определяли по включение трипаиового синего.
Прижизненное наблюдение за культурами И фотосъемку проиэводи-4 с помощью инвертированного фаэово-контрастного фотомикроскопа Lynpua IMT-2 при увеличениях от х50 до х375.
Для трансмиссионной электронной микроскопии использовали гльтуры, растущие на коллагеновых подложках. Препараты анадизиро-»ди с помощьв электронного микроскопа JEM-100C. .
Представленные данные являются -результатами . двух или трех «ссариментоз? каждое определение проводилось' в 3-4 повторах. Дос-эверность различий определяли по t-хритериа Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Первый этап исследования был посвящен разработке культураль-¿х моделей, позволяющих проводить тестирование препаратов в усдо-isat бессывороточного культивирования. Поскольку об аналогичных ¡¡следованиях на клетках нервной ткани,человека в литература не эобщается, некоторые методы получения и культивирования клеток злилось разрабатывать заново. В результате были разработаны орк-шальные методики получения и культивирования "чистых" культур jух основных типов клеток мозга человека: астроцитоа и неЯроноэ.
В немногочисленных работах по культивированию клеток нервней сани человека наиболее часто используются смешанные глио-нейро-»льныэ (Kennedy e.a.,19S0f Matteon, Rychiik, 1990,- Silanl .a.,1983) или глиальные культуры [Alois! e.a., 1992i Ennaa в.a.,
1992; Kennedy е.a.,1986]. Селективные бессывороточные среды, в которых выживают преимущественно нейроны, основаны на составе, предложенном Боттенстейном и Сато (Botténstein, Sato, 1979] для культивирования клеток нейробластомы крысы. Однако, в этих средах пролиферация . глиальных клеток подавляется в недостаточной степени В более поздних работах были предприняты попытки усовершенствовать состав этой среды, в результате чего количество компонентов среды увеличилось с 5 до 19 [Cestclli е.а., 1985] и даже 31 [Brewer, cot-.man. 19а91. Несмотря на большую селективность таких сред, сложность приготовления и хранения существенно снижает их преимущества и значительно усложняет культуральные работы с человеческим материалом, особенно,.когда они носят регулярный характер.
В связи с этим нами была разработана наиболее оптимальная И относительно простая процедура получения нейрональных клеток головного мозга человека, способных к длительному культивированию в бессывороточкой среде.
Основными принципиальными моментами этой процедуры являются реагрегация клеток, отбор и культивирование клеточных агрегатов в бессывороточной среде Н2 [Bottenstein,Sato, 1979], и применение цитозинарабиноэида в качестве антимитотического агента. Агрегация необходима для успевшего выживания и развития нейробластов, а также частичной очистки культур от ненейрональных клеток. Из результатов электронноннкроскопического и иммуноцитохикического анализа следует, что на начальной стадии культивирования нейрона л ььше агрегаты содержат небольшое количество глиальных клеток, • избавиться от которых легче всего в первые дни культивирования, когда их число инициально, это достигается сочетанием культивирования в среда Н2 и применением цитозинарабиноэида. Оставшиеся в незначительной количестве глиальные клетки не способны пролиферировать даже после перевода культур в среду, содержащую сыворотку. В то же время ней-роналыше клетки в составе агрегатов сохраняют способность к диф-ференцировке и росту.
Описанная процедура позволяет получать культуры нейрональных клеток человека достаточно высокой степени чистоты (954 и выае).
Хотя составы бессывороточных сред для культивирования глиальных клеток были разработаны достаточно давно, они не получили нирокого распространения в исследовательской практике, и в литературе практически отсутствуит данные об условиях бессывороточного
'льтивироьания глнальных клеток, в частности, астроцитов. При портках культивирования астроцитов человека (как первичных, так и сморта ли зованных) в средах G4 и G5 [Bottenstein,1985] мы наблвда-9 массовую гибель клеток. Возникла необходимость подобрать опти-1льные условия для бессывороточного культивирования астроглиаль-IX клеток человека.
С этой цельо был проведен сравнительный анализ влияния ряда ■ссывороточиых сред различного состава и различных подложек на «неспособность астроглиальных клеток.
Иммортализованные астроциты человека ASCh-7 высаживали на 1шки Петри (диакетр 30 мм) в количестве 104 .клеток на Пашку. Чаи-i были покрыты 4 типами подложек:
1) 0,1 мг/мл поли-Ь-орнитина (ПЛО)г 2) 0,1 иг/мл поли-Ь-лизи-1 (ПЛЛ)г 3) 20 мкг/мл фибронектина (ФН)г 4) сочетание ПЛЯ и ФН ГЛЛ-ФН). .
Клетки культивировались в средах следувщих составов: | среда G4; 2) среда G5 » среда G4 + 10 нг/мл эпидермального росшего фактора; 3) среда G6 « среда G5 + 0,4% глюкозы + 2 ИМ •глутаминаг 4) среда G7 - среда G6 + 0,4 ед./мл инсулина. Контро-!М служила *среда DMEM с эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС). ipes 1 и 5 суток культивирования снимали прикрепившиеся к подлож-I клетки и подсчитывали их количество и доли живых клеток.
Через 1 сутки культивирования различия в количестве прихре-[ванхся клеток были еще не столь выражены, однако доля живых кле-iK, способных к пролиферации, на подложках иэ ПЛЛ и ПЛО была за-:тко ниже, чем на ФН м ПЛЛ-ФН. Эти различия увеличивались при льнейиеп культивировании. Через 5 суток культивирования коли"-ictbo прикрепившихся клеток и доля жизнеспособных клеток на ПЛЛ и о были а 2-3,5 раза меньше, чем на ФН и Ш1Л-ФН. Количество и ^неспособность клеток, растущих на Ш1Л-ФН практически не отличись от контрольных культур.
Эксперименты по культивирование первичных астроцитов человека бессывороточных средах G4 и G5 дали результаты (Табл.1), анало-чные тем, которые были получены на икморталиэованных астроцитах.
Таблица 1.
Выживаеность первичных астроцитов при различных условиях культивирования через 5 сут. Указано количество прикрепившихся клеток х 104 (среднее+ стандартное отклонение). В скобках указана доля живых клеток.
Субстрат\Среда ДМЕМ-15 %ЭТС (контроль) Среда G4 Среда G5
ПЛЛ 46,6+2,2 (98%) 14,4£3,0 (25%) 15,012,7 (29%)
ФН 45,Iii,7 (98%) 33,512,8 (97%) 34,013,1 (98%)
ПЛЛ-ФН 46,812,1 (99%) 42,413,6 (98%) 43,413,4 (99%)
Количество прикрепившихся к подложке клеток свидетельствуе об ее адгезивных свойствах, а доля жизнеспособных клеток отражав способность субстрата поддерживать нормальный клеточный рост. П этим свойстван субстраты можно расположить в следующем порядке ПЛО < ШШ < ФН < ПЛЛ-ФН. Сочетание искусственного полимера ПЛЛ и ФН, являющегося природным субстратом, с которым клетки взаина действуют посредством специфических рецепторов, обеспечивает нам лучшую выживаемость и рост астроглии в бессывороточной среде.
На основании этих результатов для дальнейшего бессывороточнс го культивирования первичных и иммортализованных астроцитов чело века была выбрана среда G5, а в качестве субстрата - ПЛЛ-ФН.
Проведенное нами сравнение различных типов культуральных пол ложек и сред различного состава показало, что при бессывороточнс культивировании астроглии человека выживаеность и рост клеток за висят, в первую очередь, от природы субстрата. Во всех предшеству ющих работах, посвященных проблемам бессывороточного кулътивирова ния клеток мозга, основное внимание уделялось компонентам пита тельной среды, а не характеру субстрата культивирования [Bottens
lin, 1985j Brewer, Cotman, 1989? Cestclli e.a., 1985]. В наших же слериментах свойства субстрата, напротив, в значительной мере ¡ределяли процесс прикрепления клеток к подложке и их последующий
ict.
Для получения надежных и воспроизводимых результатов в опытах » определению уровня эндогенного синтеза холестерина ><еобходимо то подобрать такой состав среды культивирования, который бы
14
¡еспечивал максимально возможную скорость включения С-ацотата клеточный холестерин и минимальную ошибку в определении резуль-iTa. Мы провели сравнение сред следующих составов (Рис.1):
1) среда DMEM с ЭТС (15% ЭТО для первичных и 5% ЭТС для им-морталиэованных;
2) среда G5 - 1 сутки культивирования;
3) среда G5 с 10% делипидированной сыворотки человека (ДСЧ) - 1 сутки культивирования?
4) среда DMEM с 10% ДСЧ - 1 сутки культивирования; .5) среда G5 - 2 суток культивирования;
6) среда G5 с 10% ДСЧ - 2 суток культивирования;
7) среда DMEM с 10% ДСЧ - 2 суток культивирования...
гл.
Включение О ацетата (CPU/иг) * 1000
СЬракчша - К53 Ешюртыпюиаш
1 2 3 4 5 в 7
re. 1. Влияние состава среды культивирования на уровень синтез» шестерина в первичных и имморталкэованних астроцитах человека ю включению 14С-ацетата во тгутрнкпеточиый холестерин).
Результаты экспериментов (Рис.1) свидетельствуют, что удаление липндов иэ культуральной среды заметно стимулирует эндогенны; синтез холестерина в клетках. Длительность культивирования в средах, не содержащих липиды, не оказывала столь заметного влияния не синтез холестерина: в большинстве случаев различия между культурами, содержащимися в этих средах 1 сутки или 2 суток было статистически недостоверным. Наиболее выраженным оказался эффект среды Gí на иммортализованные клетки, однако, существенная разница в уровне синтеза холестерина между первичными и иммортализованными клетками, а также значительная ошибка В определении результата по ¡¡оголяли использокэть среду GS в экспериментах по определению эндоген-
-
ного синтеза холестерина в астроцитах человека.
По наоеку мнению, наиболее оптимальным является сочетание среды GS к 10% ДСЧ. Эта среда использовалась в дальнейших экспериментах по определению уровня синтеза холестерина в астроглнальньа клетках.
Проведенное нами исследование показало, что ловастатин и егс структурные аналоги эффективно снижают синтез холестерина в нервных клетках человека аналогично тому, как это показано для других типов клеток человека и животных [Sviridov е.а., 1990].
Ловастатин 8 диапазоне концентраций 0.01-Í000 нг/мл вызывал доээависимой икгибирование внутриклеточного синтеза холестерина е реагрегированных мозговых клетках и в астроцитах человека (Рис.2). Характер кривых ингибирования для разных типов культур заметно отличался. В реагрегированмых клетках и ммморталиэованных астроцитах происходило плавное снижение уровня синтеза холестерина во всей диапазоне исследуекых концентраций (Рис.2А,В), тогда как а первичных астроглиальных клетках наблюдалось резкое падение уровня синтеза холестерина вдвое уже при минимальной исследуемой концентрации ловастатима - 0.01 нг/мл (Рис.2Б).
Компьютеризованный дисперсионный анализ (AN0VA) продемонстрировал достоверное отличие кривой ингибирования ловастатином синтеза холестерина в первичных астроцитах от кривых ингибирования для двух других типов культур {? - 5,322* d.f21 Р < 0,01).
120
100
80
60
I *0
20
А. Гпио-нСЙроналмше агрегаты
эксперимент 1 эксперимент 2
С I-
0.00 0.01 0.' 1 10 100 1000 концентрами« повастетияа (яг/ нп)
5 120 3
® 100 г
я
| 60 а
~ ео
I 40
| го
I 0
I,.
м
® 100 л
I
| 80 В
ео
«
1 40
I
и
20
Б. Первичные агтрещиты
эксперимент 1 эксперимент Z
0.00 0.01 0.1 1 -10 100 1000 концеитраци» ловастатина (нг/мл)
Э. Имморталияоьанныв аетроциты
эксперимент 1 эксперимент 2
*.....
Рис.2. Влияние ловастатииа на синтйэ холестерина в клетках ЦЯС человека.' Результаты представлена и виде среднего^ ошибка среднего, п » 3.
т~
О иС '■> 0
0.1 1 10 ¡ОС
:нарктраш!Я пова^тагпна (чг/и.'О
1000
' В Табл. 2 приведены вычисленные значения 1С$о для всех типов культур , использованных в экспериментах»
Таблица 2.
Значения 1С50 для ингибиторов ГНГ-КоА редукгазы в разных типах культур клеток ЦНС человека.
Тип культуры
Концентрация препарата, иг/нл Ловасгатии Коипактин Монакодин Ь монаколин X
Реагрегирован-
кые клетки мозга . 0,30
Первичные астроцнты 0,0063
Цмкортализовашше астроцнты А5СЬ-7 . , 0,94
Реагрегирован- ' - "
ные клетки иоэга ■ 0,<2
Первичные астроццгы о/оовв
Эксперимент 1 1,32 г—
2,67 Э-*3
48,0 37,6
Эксперимент 2.
•I .. • > <
46,6 >21
91,4
29,5
■718
Илморталиэованные астроциты А5СЬ~7
0,12
2,59
320
128
Как видно иэ Табл.2, во%-ное подавление цинтеза довеете.ином в первичны* клетка» наблюдалось при концепт рациях препарата примерно в 100 раз ниже; чем а двух остальных типах культур, хотя максикадыше эффекты ннгибирования для всех трех типов культур достоверно не отличались, м и* величина составила 70-80% (Табл.3).
Таблица 3.
1аксииальный эффект ингибчрованяя синтеза холестерина ингибиторами ~МГ-КоА редуктазы в разных типах культур клеток ЦЧС человека.
Тип культуры
Ловастатин Кокпактин Монако л ин Ь Монаколин X Эксперимент 1 78,5+0,7
70,8+2,6 52,9+3,1 63,9±4,1
'еагрегирован-
ша клетки мозга 76,9+1.5
1ервичныа астроциты 80,7^1.7
1кмортализованные »строциты ЛЗСЬ-7
70,6±1.7 69,5±1.7 5б,4±9,2 49,2+10,3
Эксперимент 2 77,5±1.0 85,0+0,9 первичные астроциты 81,6±0.1 73,1±1,4 4б,1±3,4
'еагрегирован-ше клетки мозга
!ммортализованные астроциты А5СЬ-7
73,8+2,5
83,5±0.б % 74,3±1,0 44,9+8,0 63,9+4,5
Результаты представлены в виде среднего ± стандартное отклонение (г-3)
Эффективность ингибировачия компактинои вклочгния 14С-ацетата 1 клеточный холестерин во ьсех трех типах культур была несколько шже, чем у ловастатниа. Об этом Свидетельствует отличия кривых шгибирования компактинои и ." овастатином синтеза яолостерниа в тервичныл (Р = 33,942; й.Г3; Р<0,СЭ01) и икмортализоваюшх (К ™ 17,926: 3; р<0,0001), а также значения Ю50 (Табл. 2). Кри-
вые ингибирования этих препаратов для реатретированных клеток мозга не имели достоверных отличии. Величины иаксниального эффекта ингибирования для ловастатина и компактина также были близки (Табл. 3).
Достоверных различий ме:*ду кривыми ингибирования синтеза в
первичных и инкортализоианных астроцитах дл*1 компактнна и монако-дннов Ь и X не отмечено.
На основании полученных результатов можно расположит*) данные препараты следующим образом (в порядке возрастания их ингибиторкой активностиt нонаколин L < Монаковин X < комлактин < ловастатин.
Из представленных результатов следует, что прч терапевтических концентрациях (10-100 нг/мл) урове~и> синтеза холестерина во всех типах культур'клеток ЦНС человека состаьллет 35-50% от исходного уровня, а значения 1С5о в 100-10000 раз ниже, чем концентрации лаааитатипа, i>úHñp>~"¿KB£c:»C Z ПЛ™ I". ЦС* .
Повышенная чувствительность первичных ас-троцмтов к ловастати-ну заслуживает особого вникания, поскольку астроциты являются, с одной стороны, ключевым званом в метаболизме холестерина в мозгу (Boyles е.а., 1985; Hofnan е.а.,1987; Pitas е.а.,1987; Swanson е.а.,1988], а с другой стороны - теми клетками , которые первыми сталкиваются - с проникающими из крови через гэБ химическими соединениями [Гоядстейн,Бенц,198б]. Можно предположить, что ингибитор^ кый эффект ловастатина ln vivo в перрую очередь проявляется в аст-роГлиалышх хлетхах, • •
Следствием, этого является увеличение активности ЛЬЛ-рацепто-ров, наблюдаемое' в культурах первичных и лкнорталиj .званкых астро-цитов при воздействии яозастатина,соответственно•иа 100 к 50%. При этом уровень синтеза Холестерина в обоих iяпах -астроцитов. составлял около 30% от исходного уровня.
Наблюдаемые различия в чувствительности клеток к ингибитора« эндогенного скнтеэа холестерина рока не имеют однозначного объяснения. Поскольку »то явление не наблюдается а бесклв1зчкой системе и проявляется только.г клеточных моделях, могно утверждать, что различия в чувствительности клеток к ингибитора» ГКГ-КоА редуктааы отражают различия на клеточном уровне. Это могут быть различия во внутриклеточной локализации фермента, или различная скорость превращения неактивной'яактоннои форт' вещества в активную гидрокси-кислотную форму [Sviridov е.а., 1990].
Пробукод, в отличие oí ингибиторов Гкг-КоА редуктаэы, не вызывал достоверная изменений в уровне включения 14С-ацетата во всех трех типах исследуемых культур как после 3-часовой, так и 24-"асо-воа инкубации клеток с различными дозами препарата и даже при концентрациях препарата на порядок выяе терапептичаских.
Для оценки эффектов ловастатина на пролифератквнуп активность троцитоз клетки линии ASCh-7 культивировали в бессывороточной 1еде G5, с двуня концентрациями препарата (5 нг/мя и 100 нг/нл).
Ан^имитотический эффект ловастатина в культуре аотроглиальных еток человека носил выраженный доээависимий' характер (Рис.ЗА). :ли при концентрации препарата 5 нг/ил, характер кривой роста :еток практически не отличался от контроля, то доза 100 нг/ня 1Лностьв подавляла пролиферации клеток в бессывороточной среде, ггласно нашим данным, в этом диапазоне концентраций падение уров-i синтеза холестерина в клетктк ASCh-7 составляет около 20%.
Очевидно, при концентрации 3 нг/ил, когда гш не наблюдали ви-шого оффехта ловастатина на ародифсрапио клеток, действие препа-iTa компенсировалось повышенной продукцией ферментов эндогенного ¡нтеза холестерина. В результате в клетке образовывался холсств-IH в количестве, достаточном цпя ncsr:. 1?>яа:шя нормальной пролнфе-геивной активности. При. концентрации 100 вг/мя клетки были у»а ¡способны восполнить недостаток продуктов синтеза за счет внут-:нних ресурсов, что проявлялось в полной остановка роста астроп"-
)В.
• Таким образом, критическая концентрация яовастаткна лежит в зеделах 5-100 «г/ял. Этот интервал пклячсГат а себя, согласно лп-гратурным данным [lievacor, Product ¡tonography', 1903; O'DonneAl .a. ,199-3; Sviridov a.a.,1993], t "терапевтические" концентрации, Знаруяснваеиые а кроем пациентов.
Ч '
В наших экспериментах отсутствие холестерина в культура лыюЛ зеде и значительное подавление эндогенного синтеза создавали ея-1>ацик>, в которой дефицит холестерина, необходгоюго для построения гмбраи активно делящихся клеток, по-иидимому, являйся ■ основном »кторои, ограничивающим пролнферативнуп активность 'астроцлтов. го предположение подтверждается тем- фактом, что добавлен?» сызо-зтки, содержащей холестерин, полностьв устраняло нпгнбиториыв эф-экт ловастатина.
На Рис. ЗБ представлены кривые роста клеток ASCh-7 а присуте-' вии пробукола, В течение 7 суток но отмечено достоверных нзмеле-ий пролиферативной активности клеток, инкубированных с 10 ивг/мя 20 мкг/мл препарата.
Рис. 3. Влияние доэастчгкна (Л) и пробукола (Б) на пролиферации иинортапизованных астроцитов в б@ссывороточ<<ой сред®. Клетки
линии АБСП-7 высаживали на 35-ин чавки Петри, снимали трипсином
»
кождиа 1-2 суток и подсчитывали их количество. Результаты представлены В виде среднего, п «• 3.
В проведенном нами ..сследования было впервые продеионстриро-но цитотоксическое действие "терапевтических" концентраций ло-статина на "чистые™ нейрональные культуры. Через 2-3 суток инку-ции п 10 нг/ил и 100 НГ/-Ш ловастатина з культуре нгйроналытх регатов наблюдалась остановка иейриткого роста, а на 4-5 сутки чинались дегенеративные изменения г разрушение нейритов, наруша-е целостности агрегатов, массовая гибель клеток, приводящие в ore к гибели культур. Добавление сыворотки э культуральную среду едотвращало эти процессы t и цнтотоксический эффект ловастатина присутствии сыворотки инк ist на проявлялся на светооптичесгсом овне. Результаты исследования влияния "терапевтических концент-ций" пробукола (10 ккг/кя и 20 шг/пл) представлены в Табл. 4.
блица 4.
ияние пробукола на интенсив..ость нейритного роста в культуре йрональных агрегатов.
Культура исследовали на 5 и 10 сутки после добавления 20 икг/нл обукола в бессквороточнуо среду Н2. 'Интенсивность нейритного ста оценивалась по следующим параметрам! средняя длина нейритов км), измеряемая от края нейрсналыяог® агрегата, ш плотность неа-тного роста, определяемая как количество радиаяько ориентирован-, х нейритов, Пересекающих сегмент длиной в 200 нкк на расстоянии 0 ним от края агрьгата. , •*,•'•
средняя длина Плотность
нейритов,икн • нейритного роста
Контроль Пробукол
контроль Пробукол
297,0 ± 56,6 347,5 ± 47,9
5 суток
10 суток
23,1 + 3,1 28,7 + 3,7
25,3 ± 4,4 61,7 ± 5,7
Данные представлены в виде средних ± стандартное отклонение, = 20-23 (при измерении длины нейрнтов), п » 10 (пря пэмэреияи
отности).
Р < 0.01;
Р < 0.001.
Большой интерес представляет не йритстиг-у пирующий эффект про букола в "чистых" нейрональных культурах, который бьш впервые про демонстрирован в данном исследовании. Ьод действием пробукола уве личивалась средняя длина нейритов и особенно плотность нейритног роста - в 2,4 раза по сравнению с контролем.
Наблюдаемый эффект пробуксла на нейритогенеэ, по-нашему мне кию, может быть объяснен влиянием препарата на синтез аполипопро Теина Б (апоЕ) в нервной ткани [Aburatanl , 19S8], Ранее был показано, что апоЕ может модулировать не..ритогенез, влияя на взаи нйппной клетки с внеклеточный идтриксом и изменяя сте пень адгезии нейрит-иатрикс [Mahley, I9u8; Handelmann е.а., 1992] При этом изменяется характер роста нейритов.
Таким образок, к известному гилохол -стеринемическому действи пробукола добавляется еще одно свойство - нейритстинулирующий эф фект, которое ножет быть использовано как в экспериментах in viv и in vitro, так, возможно, и в клинической пракгике. Однако, дл этого необходимы дальнейаие эксперименты, которые позволили б оценить возможность и степень такого применения пробукола.
Кроне того пробукол увеличивал срок' жи-ни нейрональнмх куль тур в бессывороточной среде N2 на в-¿2 суток. ,
В данной работе. впервые были показан i изненеии-т ультраструхт ры клеток мозга под влияние» тестируемых препаратов.' Ловастати вызывал замедление дифференцирован нейро^ластов в нейроны а так* деструктивные изменения в дифференцирующихся нейрональных клетках что, в конечной сфате, приводило к. их гибели. В контрольных куль турах не набЛодалось каких-либо структурных повреждений в диффа ренцирующихся нейробластах.
Мы также наблюдали Эффект ловастатина на астроглиальныз клет ки в составе эксплантатов: значительное увеличьчие количества г.н эосои и остаточных т4!яец в цитоплазме астроцитов, локалькые лог реждени* цитоплазмы, формирование в цитогпазив плотно упакованш пучков глмофиланентов и разнообразные повреждения мембраны. '
Многочисленные деструктивные иэне> шия, наблюдаемые в нейрс надьных и глиальних клеткам на ультраструктурнон уровне, привод« <де» к гибели клеток, свидетельствуют об общем цитотоксическои э4 фект«/ловастатина. Ярко выраженные характерные повреждения меиС ран, очевидно, связаны с недостатком холестерина, необ.:одимо1 компонента клеточных иекбран.
Ультраструктурный анализ эксплантатов, культивируемых в зисутствии 20 мкг/мя npo6vKona, показал, что в отличие от ловас-1тина пробукол не только не препятствовал росту неркчых хлеток зловека в культуре, но и способствовал их развитию, iто выража-эсь в увеличении количества и гиперпказии цитоплазматических ор-шелл, а также в стимуляции дифференцировки яейробластов.
При изучении комбинированного воздействия пробукола и ловас-1тина было показано, что пробукол в значительной степени ослабля-р негативное влияние яовастатина на "чистые" культуры нейронов гловека. В среде, содержащей и ловастатин, и пробукол, не наблю-1Лось ранней остановки нейритного роста и дегенеративных процесса, которые имели место при действии риного ловастатина. В культе нейрональных агрегатов формировались нейриты, хотя скорость и тотность нейритного .роста а присутствии пробукола и яовастатина лпи ниже, чек в контроле. Признаки гибели нейрональных клеток, якубированных с яовастатином и пробукояок, становились заметными шь к концу срока культивированчя, то есть на 11-12 сутки.
Таким образом, присутствие пробукола делало возможный ограни-энный рост и развитие нейрональных клеток человека, а также за-5Тно увеличивало срок их жизни, несмотря на воздействие токсичес-зй концентрации ловастатина.
Полученные реьультаты свидетельствуют о том, что!
- разработанные в ходе исследования куяьтуральныа модели яв-яются адекватными для оценки нейротрэпных эффектов проникавших в эзг гиполипидемических препаратов»
, ' - гиполипидемические препарата, которые были протестирована данной работе существенно различается по своему воздействию на петки ЦНС человека.
В отсутствие источника экзогенного холестертт фармакологи-еские концентрации ловастатина оказывают негативное воздействие а рост и жизнеспособность нервных клеток и делают невозможным их альнейтее развитие в культуре. Основываясь на этих данных, можно редставить, как в системе in vivo проникающие в мозг препараты пособны нарупать гонеостаэ нозга за счет разбалансйровакия виут-имозговой системы липидного обмена, что, в конечном счете, прлвэ-ит к трофическим нарушениям и, как следствие, к нарушениям иарэ-оп деятельности пациентов. Этим можно объяснить побочные иепрот-
ропные эффекты , наблюдаемые при клиническом применении гиполипи-дамических препаратов [Roth е.а.,1992; Schaefer,1988; Vgontzas е.а.,1991].
Антиоксидант пробукол, также использующийся для лечения ги-лерхолестеринении, не только не оказывал Hei атнвного воздействия на клетки ЦНС Человека в культуре, но и способствовал их росту и выживаемости. Перспективной кажется возможность комплексной гипо-'липидемической терапии, одним из компонентов которой может быть пробукол, благотворно влияющий на нераные клетки и способный "уравновешивать" отрицательные эффекты ловаотатина или его аналогов. Однако это предположение нуждается а дополнительной Пров-арке.
Вместе с тек, следует заметить, что при ьсей значимости полученных нами результатов - это лишь результаты исследований in vitro. Поэтому было бы некорректно механически экстраполировать результаты, полученные в культуре эмбриональной -скани, на взрослый иозг in vivo.- Очевидно, что у пациентов ловастауин не вызывает стояь значительных изменений, какие наблюдаются в культуре нервной ткани, в силу действия множества других факторов, воспроизвести которые в куяьтуральной модели невозможно:*
Тем не менее, нами результаты ь сочетании, с' клиническими наблюдениями дат- основания для постановки вслроед о бс lee взвешенною подхода % выбору лекарств, применяемых для .лечения гиперходвстерк-меннн. При раэаработке.новых лекарственных средств возможные ней-ротропниа эффекты, .'несомненно, должны приниматься во внимание наравне с гмлохолестеринемкческой м алгиатеросклерЬтиЧеской эффективностью препарата.
..■'•■V ■■ ВЫВОДИ- О У"-. "
1. На основе нового способа кусьтивировангя, использующего методы реагрегации клеток/ бессывороточного фльтиаированмя к применения цмтозинарабммозида, ' получены высог-.ообогаценкые {более 95% чмстотм) культур» нейронов головного мозга человека, способные к длительнояу существованию в условиях in vitro.
2. Получены чистые «более 95% чистоты) культуры первичных »строцнтов человека и разработаны условия их долговременного (до Э месяцев) культивирован»!* в бессывороточной среде.
3. Созданы культуралькые модели, позволяете изучать ряд - функционалwho-норфологически* характеристик основных типе л ,клеток
i Л / ■
il
- n -
ЦНС человека п процесса их развития in vitro.
4. Ловасъатии и его структурные аналоги подавляют внутрикле-ТОЧ1ШЙ синтез холестерина В нейрональних и глиалы;чх клетках на 50-30% j культуры первичных астроцитоз челонека обладают посыпанной чувствительность^} к иаяым дозаи ловастатина»
5. Концентрации ловастатина, которые присутствует а организме пациентов при,клиническом применении этого препарата, оказывает нейротоксическое действие на культуры нервней ткани, что выражается в подавлении роста, нарушении ультраструктуры и гибели клеток ЦНС человека. • • '
' б. Пробукол стимулирует рост нейритов n культурах нейрональ-ных агрегатов, способствует днфференцнровкз нейронов и увеличивает срок их жизни в культуре на 8-12 суток.
7. При комбинированием действии прсбукола и ловастатина пробукол в значительной степени -ослабляет негативное влияние ловастатина на рост и жизнеспособность нейронов человека а культуре.
Список работ, . опубпяжовайтпе по у'ет] диссертации 1, Бобрыпаз Й.В., Балабанов. D. В.", Пазлез О.В., Чукасов В.П. Элоктрогто-микросхопичаскоа исследование развития нейронов в орга-нотипических культурах керы головного :Гозга ^мбриона человека// ЦИТОЛОГИЯ, 1989, Т.31, ÎÏ 12, С. 1453-1458. '
2. Чуиасов Е.И., Бобрыяав|а.Э*, Еаяабанаа D.S., Павлов O.S. Ультраструктурные особенности раавития пейральных платок корн го левного нозга человека а культуре// В сб.s"Ультраструктура и пластичность нейронов". Пуцчпо, 1990. С. 135-142.
3. Бобрьшев D.O., Балабанов Й.В., Золотухина Е;Л., Павлов O.K., Чуиасов Е.П. Особенности дифференшгровки нэйронэп s ергано-тотичэской культура коры головного козга человека'// Возбудяныэ клетки в культуре ткани. Патер. II Всесовзн. симпозиума, 1939, Пу-пишо. Пуцино, 1990, С. 83-05.
4. Балабанов D.D., Павлов О.В., Побрывав В.В., Чумасой П.Я. Получение чистых культур нейроналышх клеток иоэга эмбриона человека// Таи яе, С. 74-76.
5. Балабанов S3.в., Боб^ызев Ю.В., Завизион В.ft., Павлов O.S., Трахт H.H. Сравнительный анализ корфофуякдегснальныж свойстз культивируемых in vitro первичных н ¡тмортализоваткга астрсиитов статного мозга эмбрионов человака// Тая rta, С. 78-S0.
6. Балабанов Ю.В., Павлов О.В., Бобрышев C.B. Получение "чи тых" культур нейронов головного мозга эмбрионов человека// Цитол гия. 1992, Т. 34, H S, С. 83-88.
7. Y.Bobryshev, ï.Balabanov, O.Pavlov. Effects of hypolipip demie druçrs (lovastatin and pjrobucol) on human neuronal and 9Ü cells// Proc.Aust.Neurosci. Soc. 1994, V.5, P.230.
8. O.Pavlov, ¥.Bobtyshev, Y.Bala^anov, K.Ashwell. An in vit study of the effects of lovastatin on human fetal brain cells Neurotoxicology and Teratology. 1994 (принята к печати).
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павлов, Олег Владимирович
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Ингибиторы ГМГ-КоА редуктаэы и пробукол как j* представители наиболее эффективных современных антигиперхолестеринемических препаратов
1.2. Влияние гиполипидемических препаратов на ЦНС in 16 vivo
1.3. Теоретические основы нейротропного действия гиполипидемических препаратов
1.3.1. Проникновение липофильных соединении через гематоэнцефалический барьер
1.3.2. Особенности метаболизма холестерина в ЦНС
1.4. Культура нервной ткани как адекватная модель для изучения нейротропных эффектов гиполипидемических препаратов
1.4.1. Способы культивирования клеток нервной ткани и их применение
1.4.2. Бессывороточное культивирование клеток нервной ткани
1.4.3. Клетки животных и клетки человека
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка культуральных моделей нервной ткани и их использование для изучения воздействия гиполипидемических препаратов на клетки мозга человека"
Актуальность проблемы
Применение гиполипидемических препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с нарушением липидного обмена и высоким содержанием холестерина в крови, в настоящее время приняло массовый характер. Активно ведутся разработки ноеых лекарственных препаратов, способных эффективно понижать содержание липидов, в первую очередь холестерина, в крови.
Одним из наиболее эффективных и перспективных классов антиги-перхолестеринемических препаратов в настоящее время считается группа ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы, называемых также "статинами" или "монаколинами". Среди препаратов этой группы наиболее широкое распространение получил ловастатин (мевинолин, Мевакор) и его структурные аналоги.
Другим широко используемым препаратом является антиоксидант пробукол, обладающий гиполипидемическим и антиатеросклеротическим действием. Он является одним из немногих средств, эффективных при лечении гомозиготной семейной гиперхолестеринемии.
При оценке эффективности гиполипидемических препаратов обычно исследуется их способность снижать содержание холестерина в экстрацеребральном компартменте, в первую очередь - в сосудистом русле. При этом, как правило, вне поля зрения исследователей остается возможность проникновения препаратов в ЦНС и их влияния на клетки мозга пациентов, находящихся на постоянной гиполипидеми-ческой терапии.
К настоящему времени, однако, накоплено достаточное количество фактов, свидетельствующих о влиянии некоторых гиполипидемических препаратов на нервную систему. Так показано, что у пациентов, принимавших ловастатин и его липофильные аналоги, наблюдалось сокращение продолжительности и нарушения сна, а также заметно ухудшались некоторые психомоторные реакции.
Пробукол также способен оказывать влияние на процессы, происходящие в нервной системе, однако характер его воздействия существенно отличается от эффектов ловастатина и его аналогов.
Литературные данные свидетельствуют о том, что высоколипо-фильные препараты способны достаточно легко проникать через клеточные мембраны, в том числе и ГЗБ, а относительная автономность метаболизма холестерина в ЦНС делает ее уязвимой для высокоэффективных препаратов, которые способны влиять на отдельные стадии синтеза, транспорта и утилизации холестерина в мозгу и, тем самым, нарушать его гомеостаз.
Очевидно, что в условиях целостного организма практически невозможно оценить степень и характер воздействия данных препаратов на нейроны и глию ЦНС человека. В то же время, использование культур нервной ткани позволяет с высокой степенью достоверности смоделировать in vitro ситуацию, имитирующую проникновение в мозг ли-пофильных гиполипидемических препаратов и оценить степень их непосредственного воздействия на нейрональные и глиальные клетки. Это дает возможность объяснить на клеточно-молекулярном уровне нейротропные эффекты, которые наблюдаются при приеме некоторых из этих препаратов, а также обнаружить эффекты, не выявляемые при наблюдениях in vivo.
Несмотря на то, что влияние этих препаратов на клетки различных тканей достаточно широко изучается на моделях in vivo и in vitro, в литературе практически отсутствуют данные о непосредственном влиянии "терапевтических" концентраций этих препаратов на клетки нервной системы человека и животных и о характере такого воздействия на клеточном уровне.
Вместе с тем, современные методы культивирования позволяют получить различные типы клеточных культур и разработать на их основе адекватные модели для изучения различных аспектов функционирования клеток мозга человека и нейротропных эффектов фармакологических препаратов, проникающих в мозг.
Цеди и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния "терапевтических" концентраций ловастатина и его аналогов, а также пробукола на культивируемые in vitro клетки ЦНС человека.
В задачи исследования входило:
- получение различных типов культур нервной ткани человека;
- разработка на основе культивируемых клеток мозга человека (нейронов и астроцитов) адекватных моделей in vitro, которые позволили бы изучать эффекты тестируемых препаратов на клеточно-моле-кулярном уровне;
- изучение непосредственного влияния тестируемых препаратов на различные процессы жизнедеятельности нейрональных и глиальных клеток ЦНС человека, в частности: отдельные стадии метаболизма холестерина, пролиферативную активность, рост и выживаемость, ультраструктурную организацию.
Положения, выносимые на защиту
1. Разработаны новые методы получения нейронов и астроцитов ЦНС человека, способных к длительному существованию в условиях клеточной культуры.
2. На основе культур клеток головного мозга человека созданы модели, позволяющие в условиях in vitro изучать:
- синтез холестерина и активность ЛНП-рецепторов в клетках нервной ткани человека;
- функционально- морфологические характеристики основных типов клеток мозга человека в процессе их развития
3. Выявлен нейротокоический аффект ловастатина на культуры клеток мозга человека при концентрациях препарата, которые присутствуют в организме пациентов в процессе лечения.
4. Установлено, что пробукол стимулирует рост и дифференци-ровку нервных клеток, а также увеличивает срок их жизни в культуре.
5. Показано, что пробукол заметно нивелирует негативные цито-токсические эффекты ловастатина в культурах нейронов человека при комбинированном применении этих препаратов.
Научная новизна работы
В процессе исследования были разработаны оригинальные методы получения и долговременного культивирования клеток ЦНС человека.
Впервые в условиях in vitro была смоделирована ситуация долговременного непосредственного воздействия "терапевтических" концентраций ловастатина и пробукола на клетки мозга человека, что-позволило продемонстрировать выраженный негативный эффект ловастатина на нейрональные и глиальные клетки ЦНС человека и стимулирующее влияние пробукола на рост и развитие нейрональных клеток.
Научно-практическое значение полученных результатов
1. Полученные в ходе данного исследования результаты могут быть использованы для выработки рекомендации по практическому применению гиполипидемических препаратов с учетом их возможного действия на центральную нервную систему человека.
2. Разработанные в ходе исследования культуральные модели могут быть использованы для тестирования новых лекарственных препаратов на стадии предклинических испытаний, что позволит существенно сократить сроки их внедрения в практику здравоохранения. Данные модели дают возможность за относительно короткий срок обнаружить возможные побочные эффекты препаратов, для выявления которых в кли-ннике требуются годы.
3. Обнаруженный нейритстимулирующий эффект пробукола после дополнительных исследований может быть использован для стимуляции регенерационных процессов в нервной системе.
Апробация работы
Научные результаты, представленные в диссертации, были доложены на II Всесоюзном симпозиуме "Возбудимые клетки в культуре ткани" (Пущино, 1989 г.) и XIY ежегодной конференции университета г. Сиднея (Австралия, 2-4 февраля 1994г.). Тезисы работы были опубликованы в сборнике "Возбудимые клетки в культуре ткани "(1990) и Трудах Австралийского общества нейронаук (Proceedings of Australian Neuroscience Society, 1994, V. 5).
Структура диссертации
Диссертация изложена на 139 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа содержит 21 рисунок и 8 таблиц. Список литературы включает 189 источников.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Павлов, Олег Владимирович
5. ВЫВОДЫ
1. На основе нового способа культивирования, использующего методы реагрегации клеток, бессывороточного культивирования и применения цитозинарабинозида, получены высокообогащенные (более 95% чистоты) культуры нейронов головного мозга человека, способные к длительному существованию в условиях in vitro.
2. Получены чистые (более 95% чистоты) культуры первичных астроцитов человека и разработаны условия их долговременного (до 3 месяцев) культивирования в бессывороточной среде.
3. Созданы культуральные модели, позволяющие изучать ряд функционально-морфологических характеристик основных типов клеток ЦНС человека в процессе их развития in vitro.
4. Ловастатин и его структурные аналоги подавляют внутриклеточный синтез холестерина в нейрональных и глиальных клетках на 50-80%; культуры первичных астроцитов человека обладают повышенной чувствительностью к малым дозам ловастатина.
5. Концентрации ловастатина, которые присутствуют в организме пациентов при клиническом применении этого препарата, оказывают нейротоксическое действие на культуры нервной ткани, что выражается в подавлении роста, нарушении ультраструктуры и гибели клеток ЦНС человека.
6. Пробукол стимулирует рост нейритов в культурах нейрональных агрегатов, способствует дифференцировке нейронов и увеличивает срок их жизни в культуре на 8-12 суток.
7. При комбинированном действии пробукола и ловастатина пробукол в значительной степени ослабляет негативное влияние ловастатина на рост и жизнеспособность нейронов человека в культуре.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлов, Олег Владимирович, Санкт-Петербург
1. Балабанов Ю.В., Вартанян Г.А., Силаков В.Л. Выявление факторов позной асимметрии в культуре ткани гипофиза под действием ликво-ра кошек с унилатеральным повреждением коры большого мозга. Бюлл. зкспер. биол. мед. 1988. Т. 55, N 2, С. 160-163.
2. Балабанов Ю.В., Бобрышев Ю.В., Чумасов Е.И. Особенности роста глии в культурах ткани коры большого мозга крыс// Арх. анат., гистол., змбриол. 1989. Т. 96, N 5. С. 25-31.
3. Балабанов Ю.В., Завизион Б.А., Трахт И.Н. Получение иммортализованных астроцитов спинного мозга эмбрионов человека// Докл. акад. наук СССР. 1990. Г. 315. N 5, С. 1238-1241.
4. Балабанов Ю.В., Павлов О.В., Бобрышев Ю.В. Получение "чистых" культур нейронов головного мозга эмбрионов человека// Цитология. 1992, Т. 34, N 5, С. 83-88.
5. Бобрышев Ю.В., Балабанов Ю.В., Чеботарь Н.А., Конописцева Л. А. Гибель астроцитов в органотипических культурах спинного мозга плодов крыс с односторонней микромелией// Онтогенез. 1990. Т. 21, N 4, С. 380-387.
6. Буравлев В.М. Особенности клеток мозга эмбрионов, полученных от больных шизофренией женщин в условиях культивирования m vitro// Журн. невропатологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. 1971. Т. 716, С. 1238-1241.
7. Буравлев В.М. Цитоморфологическое и кариологическое исследование эксплантатов мозга эмбрионов, абортированных у женщин, больных шизофренией// Автореф. дис. . канд.биол.наук. М., 1972. 120 с.
8. Буравлев В.М. Особенности влияния in vitro психофармакологических средств на эмбриональную ткань мозга плодов больных шизофренией матерей// Журн. невропатол. и психиатрии им. С.С.Корсакова. 1978. Т.78, С. 1070-1075.
9. Буравлев В.М. Использование культуры нервной ткани в исследованиях некоторых психических заболеваний человека// Руководство по культивированию нервной ткани. М.: Наука, 1988. С. 248-252.
10. Буравлев В.М. Накопление глиофибрилл в культивируемой нервной ткани плодов человека (электронная микроскопия и иммуноцитохи-мия)// Возбудимые клетки в культуре ткани. Матер. II Всесоюзн. симпозиума, 1989, Пущино. Пущино 1990. С. 87-89.
11. Буравлев В.М., Павлова Е.В., Востриков В.М. Влияние биологических жидкостей и экстракта мозга лиц с болезнью Альцгеймера на культуру нервной ткани// Журн. невропатологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. 1986. Т. 86, Вып. 7, С. 1007-1111.
12. Викторов И.В. Направленная миграция и дифференцировка ней-робластов в органной культуре спинного мозга мышиных эмбрионов// Бюлл. экспер. биологии и медицины. 1976. Т. 82, С. 1002-1005.
13. Викторов И.В. Формирование связей межжду изолированными органотипическими эксплантатами мозга// Функционально-структурные основы системной деятельности и механизмы пластичности мозга. М.: АМН СССР. Ин-т мозга, 1976. Вып.5. С. 78-82.
14. Викторов И.В. Развитие и пластичность нейронов в тканевых и клеточных культурах// Автореф. дис. . д-ра биол наук. М., 1987.
15. Викторов И.В., Хаспеков Л.Г. Формирование клеточных структур и межнейронных связей в органотипической культуре ткани гиппо-кампа новорожденных мышей// Нейрофизиология. 1976. Т. 8, С. 384-391.
16. Викторов И.В., Шаронова И.Н. Формирование функциональных синаптических связей между гетерогенными образованиями мозга в органотипической культуре нервной ткани// Там же. 1980. Т. 12, С. 490-497.
17. Викторов И.В., Вербицкая Л.Б., Шашкова Н.А. Синаптогенез в культуре мозжечка// Современные представления о функциях мозжечка. Ереван: Изд-во АН АрмССР, 1984. С. 31-41.
18. Викторов И.В., Хаспеков Л.Г., Шашкова Н.А. Культивирование ткани и клеток центральной нервной системы // Руководство по культивированию нервной ткани. М.: Наука, 1988. С. 141-167.
19. Вильнер Б.Я. Использование тканевых и клеточных культур в изучении патогенеза заболеваний нервной системы// Руководство по культивированию нервной ткани. М.: Наука, 1988. С. 242-248.
20. Вильнер Б.Я. Развитие клеток симпатоадреналовой системы в культуре// Возбудимые клетки в культуре ткани. Матер. II Всесоюзн. симпозиума, 1989, Пущино. Пущино 1990. С. 18-23.
21. Вильнер Б.Я., Дикушина Ж.В., Лущицкая Н.И., Пашковская М.И. Развитие нервных клеток в культуре ткани спинного мозга крыс m vitro//Механизмы нейрогуморальных регуляций функций. Минск: Наука и техника, 1975. С. 229-237.
22. Востриков В.М., Буравлев В.М., Бурбаева Г.Ш., Турсунова
23. Ю.Д. Идентификация клеток различного генеза в культуре эмбрионального мозга человека с помощью моноклональных антител к глиальному фибриллярному кислому белку// Журн. невропатол. и психиатрии им. С.С.Корсакова. 1989. Т.89, С. 40-43.
24. Голдстейн Г.У., Бенц А.Л. Гематоэнцефалический барьер// В мире науки. 1986. N 11, С. 40-49.
25. Ильинский О.Б., Козлова М.В., Кондрикова Е.С., Титов М.И., Беспалова Ж.Д., Ярыгин К.Н., Юрченко Н.Н. Влияние опиоидных пептидов на нервную ткань in vitro// Нейрофизиология. 1985. Т. 17, N 4, С. 549-557.
26. Кимелберг Г.К., Норенберг М.Д. Астроциты// В мире науки. 1989. N 6, С. 32-41.
27. Крепе Е.М. Липиды клеточных мембран. Эволюция липидов мозга. Адаптационная функция липидов. Л.: Наука, 1981. 339 с.
28. Лакеев Ю.В., Косых В.А., Косенков Е.И., Цибульский В.П., Тихомиров О.Ю., Антонов И.А., Репин B.C. Пробукол итокоферол стимулируют синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика// Биохимия. 1993. Т. 58. Вып. 3, С. 406-415.
29. Ланкин В.З., Лупанов В.П., Лякишев А.А, Ревенко В.М. Механизмы антиатерогенного действия пробукола и перспективы его клинического применения// Кардиология. 1991. Т. 31, N 6, С. 87-90.
30. Медведев С.В., Чумасов Е.И., Балабанов Ю.В., Силаков В.Л., Гурчин Ф.А. О биологической активности ликвора больных с поврежденным спинным мозгом// ДАН СССР. 1987. Т. 2936, N 1, С. 243-245.
31. Оленев С.Н. Дифференциация нервной ткани в культуре// Культура нервной ткани. М.: Медицина, 1977. С. 5-62.
32. Руководство по культивированию нервной ткани. Методы. Техника. Проблемыю М.: Наука, 1988 318 с.
33. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии, т. 2,3. М.: Мир, 1981.
34. Халанский А. С. Опухоли и трансформированные клетки нервной системы в культуре// Руководство по культивированию нервной ткани. М.: Наука, 1988. С. 252-259.
35. Чубаков А.Р., Сотников О.С. Формирование связей между ядрами шва и гиппокампа в культуре ткани (прижизненные функциональные и морфологические исследования)// Арх. анат., гистол., эмбриол. 1982. Т. 82, С. 11-20.
36. Чубаков А. Р. Нейромедиаторы в культурах ЦНС и их роль в развитии нервной ткани// Руководство по культивированию нервной ткани. М.: Наука, 1988. С. 182-200.
37. ЧумасовЕ.И., Чубаков А. Р., Коновалов Г. В., Громова Е. А. Влияние серотонина на рост и дифференцировку клеточных элементов гиппокампа в условиях культивирования// Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1978. Т. 74, С. 98-106.
38. ЧумасовЕ.И., Чубаков А.Р., Коновалов Г.В., Громова Е.А. Влияние норадреналина на рост и дифференцировку клеточных элементов гиппокампа крыс в условиях эксплантации// Там же. 1980. Т. 78, С. 13-22.
39. Чумасов Е.И., Чалисова Н.И. Современные аспекты культивирования нервных тканей// Арх. анат., гистол., эмбриол. 1985. Т. 89, N 9, С. 87-93.
40. Чумасов Е.И., Бобрышев Ю.В., Балабанов Ю.В., Павлов О.В. Ультраструктурные особенности развития нейральных клеток эмбриональной закладки коры головного мозга человека в культуре// Ультраструктура и пластичность нейронов. Пущино, 1990. С. 135-142.
41. Эдельман М. "Молекулы адгезии клеток" и их роль в эмбриональном развитии// В мире науки. 1984. N 6, С. 70-82.
42. Aburatani Н. , Matsumoto A., Kodama Т., Takaku F. , Fukazawa С., Itakura Н. Increased level of messenger ribonucleic acid for apolipoprotein E in the spleen of probucol-treated rabbits// Am. J. Cardiol. 1988. V. 62, P. 60B-65B.
43. Alberts A.W. Discovery, biochemistry and biology of lovastatin// Am. J. Cardiol. 1988. V. 62, H 15, P. 10J-15J.
44. Almazan G., Honegger P., Matthieu J.-M., Guentert-Laubert
45. B. Epidermal growth factor and bovine growth hormone stimulate differentiation and myelination of brain cell aggregates in culture// Dev. Brain Res. 1985. V. 21, P. 45-54.
46. Aloisi F. , Borsellino G., Samoggia P., Testa U., Chelucci
47. C., Russo G., Peschle C. , Levi G. Astrocyte cultures from human embryonic brain: characterization and modulation of surface molecules by inflammatory cytokines// J. Neurosci. Res. 1992. V. 32, P. 494-506.
48. Anastasi A., Betteridge D.J., Galton D.J. Effect of probucol and other drugs on sterol synthesis in human lymphocytes// Diet and Drugs in Atherosclerosis. N.Y.: Raven Press, 1980. P. 161-163.
49. Asher R., Bignami A. Hyaluronate binding and CD44 expression in human glioblastoma cells and astrocytes. Exp. Cell.
50. Res. 1992. V. 203, P. 80-90.
51. Assouline J.G., Bosch P., Lim R. , Kim S. , Jensen R. , Pantazis N.J. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors// Dev. Brain Res. 1937. V. 31, P. 103-113.
52. Atterwill C.K., Pillar A.M., Prince A.K. The effects of ethylcholine mustard aziridinium (ECMA) in rat brain reaggregate cultures// Br. J. Pharm. 1936. V. 33, P. 355P.
53. Banker G.A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture// Science. 1930. V. 209, P. 309-310.
54. Barochovsky 0., Bradford H.F. Development of transmitter-releasing capacity in neuron-enriched tissue culture// J. Keurochem. 1937. V. 43, P. 737-797.
55. Barth J.D., Kruisbrink O.A.E., Van Dijk A.L. Inhibitors of hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase for treating hyperholesterolaemia// Br. Med. J. 1990. V. 301, К 6753, P. 669.
56. Bloom F.E. Neurochemical transmission and the central nervous system// Gilman A.G., Goodman L.S., Gilman A., eds. Goodman and Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. 6th ed. New York: MacMillan, 1930. P. 235-257.
57. Bornstein M.B. Reconstituted rat-tail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximov slices androller tubes// Lab. Invest. 1958. V. 13, P. 134-137.
58. Bottenstein J.E. Growth and differentiation of neural cells in defined media// Cell culture in the neurosciencss. N.Y., London: Plenum Press, 1935. P.3-43.
59. Bottenstein J.E.,Sato G.H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76, N 1, P. 514-517.
60. Brewer G.J., Cotman C.W. Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density:advantages of a sandwich culture technique or low oxygen. Brain Res. 1989. V. 494, P. 65-74.
61. Bunge M.B., Bunge R.P., Peterson E.R. The onset of synaptic formation in spinal cord cultures as studied by electron microscopy// Brain Res. 1967. V. 6, P. 728-749.
62. Cepco C.L. Immortalization of neural cells via oncogene transduction// Trends in Neurosci. 1988. V. 11, N 1, P. 6-8.
63. Cepco C.L. Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction// Ann. Rev. Neurosci. 1989. V. 12, P. 47-65.
64. Cestelli A., Savettieri G., Ferraro D., Vitale F.
65. Formulation of a novel synthetic medium for selectively culturing rat CMS neurons// Dbv. Brain Res. 1985. V.22, P. 219-227.
66. Cheng J.Т., Yang C.F., Jou T.C. Inhibitory effect of 1-ascorbic acid on the growth of astrocytes in cell culture// Neuropharmacology. 1933. V. 27, N 11, P. 1179-1182.
67. Choi B.H., Kim R.C. Expression of glial fibrillary acidic protein in immature oligodendroglia// Science. 1984. V. 223, N 4634, P. 407-409.
68. Cholewinski A.J., Wilkin G.P. Astrocytes from forebrain, cerebellum, and spinal cord differ in their responses to vasoactive intestinal peptide// J. NeurochBtn. 1988. V. 51, P. 1626-1633.
69. Dambergs R., Lean J., Kidson C. SBlBction of differentiated neurons in embryonal mouse brain cultures using arabinofuranosylcytosine// Exp. Neurol. 1978. V. 59, N 2, P. 296-303.
70. Dehouck M.-P., Jol1iet-Riant P., Bree F. , Fruchart J.-C., Cecchelli R., Tillement J.-P. Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models// J. Neurochem. 1992. V. 58, N 5, P. 1790-1797.
71. De La Vega F.M., Mendosa-Figueroa T. Effects of probucol on lipid metabolism and secretion in long-term cultures of adult rat hepatocytes// Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1081, N 3, P. 293-300.
72. De Long G.R. Histogenesis of fetal mouse isocortex and hippocampus in reaggregating cell cultures// Dev. Biol. 1970. V. 22, P. 563-583.
73. Dietschy J.M., Turley S.D., Spady D.K. Role of liver in the maintenance of cholesterol and low density lipoprotein homeostasis in different animal species, including humans// J. Lipid. Res. 1993.1. V. 34, N10, P. 1637-1659.
74. Elder G.A. , Major E.O. Early appearance of type II astrocytes in developing human fetal brain// Dev. Brain Res. 1938. V. 42, P. 146-150.
75. Ennas M.G., Cocchia D., Silvetti E., Sogos V. , Riva A., TorBlli S., Gremo F. Immunocompetent cell markers in human fetal astrocytes and neurons in culture// J. Neurosci. Res. 1992. V. 32, P. 424-436.
76. Espinosa de los Monteros A., Foucaud B. Effect of iron and transferrin on pure oligodendrocytes in culture; characterisation of a high-affinity transferrin receptor at different ages// Dev. Brain Res. 1987. V. 35, P. 123-130.
77. Evrard C., Galiana E., Rouget P. Establishment of "normal" nervous cell lines after transfer of polyoma virus and adenovirus early genes into murine brain cells// EMBO J. 1986. V. 5, N 12, P. 3157-3162.
78. Evrard C., Borde I., Marin P., Galiana E., Premont J., Gros F., Rouget P. Immortalization of bipotential and plastic glio-neuronal precursor cells// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87, P. 3062-3066.
79. Fairbanks K.P., Witte L.D., Goodman D.S. Relationship between mevalonate and mitogenesis in human fibroblasts stimulated with platelet-dBrived growth factor// J. Biol. Chem. 1984. V. 259, N 3, P. 1546-1551.
80. Fawcett J.W., Fersht N., Housden L., Schachner M., Pesheva
81. P. Axonal growth on astrocytes is not inhibited by oligodendrocytes// J. Cell Sci. 1992. V. 103, P. 571-579.
82. Fischbach G., Nelson P. Cell culture in neurobiology// Handbook of physiology. H.Y.: Acad. Press, 1977. V. 1, P. 719-768.
83. Fok-Seang J., MillBr R.H. Astrocyte precursors in neonatal rat spinal cord cultures// J. Neurosci. 1992. V. 12, N 7, P. 2751-2764.
84. Fontana A., Kristensen F. , Dubs R. , Gemsa D., Weber E. Production of prostaglandin E and interleukin-1 like growth factor by cultured astrocytes and C6 glioma cells// J. Immunol. 1982. V. 129. N 6, P. 2413-2419.
85. Garber B. Cell aggregation and recognition in sel1fassembly of brain tissue// Cell, Tissue and Organ Cultures in Neurobiology. N.Y.: Acad, press, 1977, P. 515-537.
86. Giulian D., Lachman L.B. Interleukin-I stimulation of astroglial proliferation after brain injury// Science. 1985. V. 228, P. 497-499.
87. Godfrey E.W., Nelson P.G., Schrier В. Neurons from fetal rat brain in a new cell culture system: a multidisciplinary analysis// Brain Res. 1975. V. 90, P. 1-21.
88. Goldman S.A., Pulsinelli W.A., Clarke W.Y., Kraig R.P., Plum F. The effects of extracellular acidosis on neurons and glia in vitro// J. Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1989. V. 9, P. 471-477.
89. Goodman D.S., Noble R.P., Dell R.B. Three-pool model of the long term turnover of plasma cholesterol in man// J. Lipid Res. 1973. V. 14, N 2, P. 178-188.
90. Grega D.S. Culturing spinal cord explants in a collagen gel// J. Neurosci. Meth. 1984. V. 11, P. 199-203.
91. Grisham J.W., Smith G.J. Predictive and mechnistic evsluation of toxic responses in mammalian cell culture systems// Pharm. Rev. 1984. V. 36, N 2, P. 151S-171S.
92. Grumet M., Hoffman S.r Crossin K.L., Edelman G.M. Cytotactin, an extracellular matrix protein of neural and non-neural tissues that mediates glia-neuron interaction// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1935. V. 82, P. 8075-3079.
93. Grundy S.M. Drug therapy of hyperlipidaemia. N.Y.:Gower Medical Publishing, 1990.
94. Habenicht A.J.E., Glomset J.A., Ross R. Relation of cholesterol and mevalonic acid to the cell cycle in smooth muscle and Swiss 3T3 cells stimulated to divide by platelet-derived growth factor// J. Biol. Chem. 1980. V.255, N 1, P. 5134-5140.
95. Hemmendinger L.M., Garber B.B., Hoffmann P.C., Heller A. Target neuron-specific process formation by embryonic mesencephalic dopamine neurons in vitro// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78, N 2, P. 1264-1268.
96. Hertz L., Dreijer J., Schousboe A. Energy metabolism in glutamatergic neurons, GABAergic neurons and astrocytes in primary cultures// Neurochem Res. 1983. V. 13,N 7, P. 605-610.
97. Hill M.A. The growth of motoneurons and their neurites in relation to Schwann cells harvested from sciatic nerve// Dev. Brain Res. 1937. V. 33, P. 243-253.
98. Hofmann S.I., Russel D.W., Goldstein J.L., Brown M.S. rnRNAfor low density lipoprotein receptor in brain and spinal cord of immature and mature rabbits// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1937. V. 84, P. 6312-6316.
99. Honegger P. Biochemical differentiation in serum-free aggregating brain cell cultures// Cell culture in the neurosciences. N. У. , London: Plenum Press, 1985. P. 223-243.
100. Honegger P., Richelson E. Biochemical differentiation of mechanically dissociated mammalian brain in aggregating cell culture. Brain Res. 1976. V. 109, P. 335-354.
101. Honegger P., Richelson E. Kainic acid alters neurochemical development in fetal rat brain aggregating cell cultures// Brain Res. 1977. V. 138, P. 580-584.
102. Honegger P., Lenoir D. Triiodthyronine enhancement of neuronal differentiation in aggregating fetal rat brain cells cultured in a chemically defined medium// Brain Res. 1980. V. 199, P. 425-434.
103. Honegger P, Werffeli P. Use of aggregating cell cultures for toxicological studies. Experientia. 1988. V. 44, P. 817-823.
104. Ignatius M.J., Gebicke-Harter P.J., Skene J.H.P., Schilling J.W. , Weisgraber K.H., Mahley R.W., Shooter E. Expression of apolipoprotein E during nerve degeneration and regeneration// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1936. V. 83, P. 1125-1129.
105. Ignatius M.J., Shooter E.M., Pitas R.E., Mahley R.W. Lipoprotein uptake by neuronal growth cones in vitro// Science. 1987. V. 236, P. 959-962.
106. Ilyinsky O.B., Kozlova M.V., Kondrikova E.S., Kalentchuk V.U., Titov M.I., Bespalova Z.D. Effects of opioid peptides and naloxone on nervous tissue in culture// Neuroscience. 1987. V. 22, N 2, P. 719-735.
107. Kennedy P.G.E., Lisak R.P., Raff M.C. Cell-type epocific markers for human glial and neuronal cells in culture// Lab. Invest. 19S0. V. 43, К 4, P. 342-351.
108. Kennedy P.G.E., Fok-Seang J. Studies on the development, antigenic phenotype and function of human glial cells in culture// Brain. 1936. V. 109, Part YI, P.1261-1277.
109. Kozak L.P., Eppig J.J., Dahl D., Bignami A. Ultrastructural and immunohistоlogical characterization of a cell culture model for the study of neuronal-glial interactions// Dev. Biol. 1977. V. 59, P. 206-227.
110. Kozlova M.V., Ilyinsky O.B., Kalentchuk V.U., Kondrikova E.S. Stimulatory effect of substance P on sympathetic ganglia and spinal cord in culture// Neurosci. Lett. 1937. V. 82, N 1, P. 16-20.
111. La Du B.N., Maudel H.G., Way E.L. eds. Fundamentals of drug metabolism and drug disposition. Baltimore: Williams and Wilkins, 1971.
112. Langston J.W. MPTP and Parkinson's disease// Trends in Neurosci. 1935. V. 8, P. 79-83.
113. Leonetti C., D'Agnano I., Del Bufalo D., Carapella C.M., Zupi G. Hunan glioma lines as experimental model for biological and chemosensitivity studies// J. Neurosurg. Sci. 1989. V. 33, N 1, P. 39-42.
114. Letourneau P.C. Cel1-to-substratum adhesion and guidance of axonal elongation// Dev. Biol. 1975. V. 44, P. 92-101.
115. Letourneau P.C. Possible roles for eel1-to-substratum adhesionin neuronal morphogenesis// Ibid. P. 77-91.
116. Letourneau P.C. Cel1-substratum adhesion of neurits growth conBS and its role in neurite elongation// Exp. Cell Res. 1979. V.
117. Lewin R. Parkinson's disease: an environmental cause?// Science. 1985. V. 229, P. 257-258.
118. Lim R., Miller K.F. An improved procedure for the isolation of glia maturation factor// J Cell. Physiol. 1984. V. 119, P. 255-259.
119. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent// J. Biol. Chem. 1951. V. 193, P. 265-275.
120. Mahley R.W. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology// Science. 1988. V. 240, N 4852, P. 622-629.
121. Mahley R.W., Innerarity T.L., Rail S.C., Weisgraber K.H. Plasma lipoproteins: apolipoprotein structure and function// J. Lipid Res. 1984, V. 25, P. 1277-1294.
122. Mahoney E.M., Child M.J., Smith-Monroy C.A. Differential transport of pravastatin and lovastatin by hepatocytes and fibroblasts// Circulation. 1990, V. 82, (Suppl. 3), P. Ill 6.
123. Maier C.E., Watanabe M., Singer M., McQuarrie I.G., Sunshine J., Rutishauser U. Expression and function of neural cell adhesion molecule during limb regeneration// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83, P. 3395-8399.
124. Matsumura H., Takahata R., Kantha S.S., Hayaishi 0. The effects of lovastatin, simvastatin, and pravastatin on sleep-wake activity in rats (Abstr.)// XI International symposium on drugsaffecting lipid metabolism. Florence, Italy. May 1992.
125. Mattson M.P., Rychlik B. Cell culture of cryopreserved human fetal cerebral cortical and hippocampal neurons: neuronal development and responses to trophic factors// Brain Res. 1990. V. 522., P. 204-214.
126. McCarthy K.D., de Vellis J. Preparation of separate astroglial and oligodendrog1ial cell cultures from rat cerebral tissue// J. Cell Biol. 1930. V. 35, P. 390-902.
127. McCaslin P.P., Morgan W.W. Cultured cerebellar cells as an in vitro model of excitatory amino acid receptor function// Brain Res. 1987. V. 417, P. 380-334.
128. Mevacor, Product Monography. 1983. Merck & Co.,Inc.,Rahway.
129. Millaruelo A.I., Nieto-Sampedro M., Cotman C. Cooperation between nerve growth factor and laminin or fibronectin in promoting sensory neuron survival and neurite outgrowth// Dev. Brain Res. 1988. V. 38, P.219-228.
130. Moscona A.A. Patterns and mechanisms of tissue reconstruction from dissociated cells// Developing Cell Systems and
131. ThBir Control. N.Y.: Ronald PrBss, 1960. P. 45-70.
132. Moscona A.A. Analysis of cell recombinations in experimental synthesis of tissue in vitro// J. CbII. Сотр. Physiol. 1962. V.60, Suppl. 1, P. 65-80.
133. Moscona A.A. Recombination of dissociated cells and the development of cell aggregates// Cell and Tissue in Culture. N.Y.: Acad. Press, 1965. V. 1, P. 489-529.
134. Mosley S.T., Kalinowski S.S., Schafer B.L., Tanaka R.D. TissuB-SBlective acute effects of inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutary1 coenzyme A reductase on cholesterol biosynthesis in lens// J. Lipid. Rbs. 1989. V. 30, К 9, P. 1411-1420.
135. Muller H.W., Ignatius M.J., Hangen D.H., ShootBr E.M. Expression of specific shBath cell protBins during peripheral nerve growth and regeneration in mammals// J. Cell. Biol. 1986. V. 102, N 2, P. 393-402.
136. Munoz D.G., На Т., Uitti R.J. Neurite extension on dibutyryl cyclic AMP-stimulated astrocytes// Exp. Neurol. 1988. V. 101, N 3, P. 374-384.
137. Naruszewicz M., Carew Т.Е., Pittman R.C., Witztum J.L., Steinberg D. A. A novel mechanism by which probucol lowers low density lipoprotein levels demonstrated in the LDL receptor-deficient rabbits// J. Lipid Res. 1984. V. 25, N 11, P. 1206-1213.
138. Neil-Dwyer G., Bartlett J., McAinsh J., Cruickshank J.M. ^-adrenoreceptor blockers and thB blood-brain barrier// Br. J. Clin.
139. Pharmacol. 1981. V. 11, N 6, P. 549-553.
140. NoblB M., Fok-Seang J., Cohen J. Glia are a unique substrate for in vitro growth of central nervous system neurons// J.
141. Neurosci. 1934. V. 4, N7, P. 1392-1903.
142. O'Donnell M.P., Kasiske B.L., Kin Y. , Atluru D. , Kean© W.F. Lovastatin inhibits proliferation of rat mesangial cells// J. Clin Invest. 1993. V.91, P. 83-87.
143. Oorschot D.E. Effect of fluorodeoxyuridine on neurons and non-neuronal cells in cerebral explants// Exp. Brain Res. 1939. V. 78, P. 132-133.
144. Oorschot D.E., Jones D.G. Neuronal survival and neurite growth in cultured cerebral explants: Assessment of the effect of cytosine arabinoside using improved stereology// Brain Res. 1991. V. 546, P. 146-150.
145. Pitas R.E., Boyles J.K., Lee S.H., Foss D., Mahley R.W. Astrocytes synthetize apolipoprotein E and metabolize apolipoprotein E-containing lipoproteins// Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 917, P. 143-161.
146. Pitas R.E., Boyles J.K., Lee S.H., Hui D., Weisgraber K.H. Lipoproteins and their receptors in the central nervous system// J. Biol. Chem. 1987. V. 262, N 29, P. 14352-14360.
147. Poirier J., Hess M. , May P.C., Finch C.E. Astrocytic lipoprotein E mRNA and GFAP mRNA in hippocampus after entorhinal lesioning// Mol. Brain. Res. 1991. V. 11, N 2, P. 97-106.
148. Preobrazhensky S.N., Ivanov V.O., Fuki I.V., Tsibulsky V.P., Kameneva A.M., Repin V.S., Ermolin G.A. Enzyme-linked immunospecific assay of low-density-1ipoprotein receptors// Anal. Biochem. V. 149, P. 269-274.
149. Quesney-Huneeus V., Galick H.A., Siperstein M.D., Erickson S.K., Spenser T.A., Nelson J.A. The dual role of mevalonate in the cell cycle// J. Biol. Chem. 1933. V. 253, N 1, P. 373-335.
150. Raff M.C. Glial cell diversification in the rat opticnerve// Science. 1989. V. 243, N 4897, P. 1450-1455.
151. Raff M.C., Miller R.H., Noble M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or a oligodendrocyte depending on culture medium// Nature. 1983. V. 303, P. 390-396.
152. Raff M.C., Lillien L.E. Differentiation of a bipotential gl'ial progenitor cell: what controls the timing and the choice of developmental pathway?// J. Cell Sci. 1988. Suppl. N 10, P. 77-83.
153. Riederer B.M., Monnet-Tschuidi F., Honegger P. Development and maintenance of the neuronal cytoskeleton in aggregating cell cultures of fetal rat telencephalon and influence of elevated K+ concentrations// J. Neurochem. 1992. V. 58, N 2, P. 649-657.
154. Roth Т., Richardson G.R., Sullivan J.P., Lee R.M., Merlotti L., Roehrs T. Comparative effects of pravastatin and lovastatin on nighttime sleep and daytime performance// Clin. Cardiol. 1992. V. 15, N 6, P. 426-432.
155. Rothe Т., Muller H.W. Uptake of endoneural lipoprotein into Schwann cells and sensory neurons is mediated by low density lipoprotein receptors and stimulated after axonal injury// J. Neurochem. 1991. V. 57, N 6, P. 2016-2025.
156. Samuel P., Perl W. Long-term decay of serum cholesterol radioactivity: body cholesterol metabolism in normals and in patients with hyperlipoproteinemia and atherosclerosis// J. Clin. Invest. 1970. V.49, P. 346-357.
157. Sastry P.S. Lipids of nervous tissue: composition and metabolism// Prog. Lipid Res. 1985. V. 24, N 2, P.69-176.
158. Selak J., Skaper S.D., Varon S. Age-dependent requirements of sympathetic neurons in serum-free culture// Dev. Brain Res. 1983. V. 7, N 2-3, P. 171-179.
159. Scarpini E., Kreider B.Q., Lisak R.P., Meola G., Velicogna M.E., Baron P., Beretta S., Buscaglia M., Ross A.H., Scarlato G. Cultures of human Schwann cells isolated from fetal nerves// Brain Res. 1983. V. 440, P. 261-266.
160. Schunack W. Open acids vs prodrugs: are pharmakokinetic differences clinically relevant?// 57th EAS Meeting. Lisbon, Portugal, May 1991.
161. Schaefer E.J. HMG-CoA reductase inhibitors for hypercholesterolemia (letter)// N. Engl. J. Med. 1988. V. 319. N 13, P. 1222-1223.
162. Silani V. , Pizzuti A., Strada 0., Falini A., Buscaglia M., Scarlato G. Human neuronal cell viability demonstrated in culture after cryopreservation// Brain Res. 1933. V. 473, P. 169-174.
163. Silani V.,Donato M.F., Villani R.M., Scarlato G. Human brain primary cultures// Ital. J. Neurol. Sci. 1991. V. 12, N 5, P. 26-29.
164. Smith G.M., Rutishauser U., Silver J., Miller R.H.Л
165. Maturation of astrocytes in vitro alters the extent and molecular basis of neurite outgrowth// Dev. Biol. 1990. V. 138, N 2, P. 377-390.
166. Snyder S.H., D'Amato R.J. MPTP: A neurotoxin relevant to the pathophysiology of Parkinson's disease// Neurology. 1986. V. 36, P. 250-258.
167. Staels В., van Tol A., Jansen H., Auwerx J. The effect of probucol on lipoprotein metabolism in the rat// Biochim. Biophys.
168. Acta. 1991. V.1035, N 1, P. 131-135.
169. Strandberg Т., Kuusi Т., Tilvis R., MiettinBn T.A. Effect of probucol on cholesterol synthesis, plasma lipoproteins and the activities of lipoprotein and hepatic lipase in the rat// Atherosclerosis. 1931. V. 40, P. 193-201.1. V >
170. Sviridov D.D., Safonova I.G., Pavlov M.Y., Kosykh V.A., Podrez E.A.,Antonov A.S., Fuki I.V., Repin V.S. Inhibition of cholesterol synthesis by. lovastatin tested on six human cell types in vitro// Lipids. 1990. V. 25, P. 177-179.
171. Sviridov D.D., Endo A., Pavlova M.Yu., Eepin V.S., Smirnov V.N. Comparison of the effects of six compactin-related compounds on cholesterol synthesis in five human cell types// Ibid. N 11, P. 635-690.
172. Sviridov D.D., Endo A., Pavlov M.Y., Eepin V.S. Time response of cholesterol synthesis inhibition by compactin-related compounds. In vitro quantitation of the "escape phenomenon"// Ibid. 1993. V. 23, N 6, P. 569-571.
173. Temple S. , Raff M.C. Clonal analysis of oligodendrocyte development in culture: evidence for a developmental clock that counts cell divisions// Cell. 1936. V. 44, P. 773-779.
174. Thompson G.R. A handbook of hyper1ipidaemia. London: Current Science. 1939. - 236p.
175. Tomaselli K.J., Reichardt L.F., Bixby J.L. Distinct molecular interactions mediated neuronal process outgrowth on-Лnon-neuronal cell surfaces and extracellular matrices// J. Cell Biol. 1936. V. 103, N 6, P. 2659-2672.
176. Vgontzas A.N., Kales A., Bixlsr E.O., Manfredi R.L., Tyson K.L. Effects of lovastatin and pravastatin on sleep efficiency and sleep stages// Clin. Pharmacol. Ther. 1991. V. 50, N 6, P. 730-737.Л
177. Wilson J.D. The measurement of the exchangeable pools of cholesterol in the baboon// J. Clin. Invest. 1970. V. 49, P. 346-357.
178. Wu D.K., Scully S., de Vellis J. Induction of glutaminB synthBtasB in rat astrocytes by co-cultivation with embryonic chick neurons// J. Neurochem. 1983. V. 50, P. 929-935.
179. Yamamoto A., Matsuzava Y., Kishino B., Hayashi R., Hirobe K., Kikkawa T. Effect of probucol on homozygous cases of familial-Лhypercholesterolemia// Atherosclerosis. 1983. V. 48, P. 157-166.
180. Yen S.-H., Fields K.L. Antibodies to neurofilament, glial filament, and fibroblast intermediate filament proteins bind to different cell types of the nervous system// J. Cell Biol. 1931. V. 33, P. 115-126.
181. Yong V.W., Kim S.U., Kim M.W., Shin D.H. Growth factors for human glial cells in culture// Glia. 1988. V. 1, P. 113-123.
182. Yong V.W., Yong F.P., Olivier A., Robitaille Y., Antel J.P. Morphologic heterogenity of human adult astrocytes in culture: correlation with HLA-DR expression// J. Neurosci. Res. 1990. V. 27, P. 678-688.
-
Павлов, Олег Владимирович
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 1994
-
ВАК 03.00.04
- Скрининг продуцентов гиполипидемических соединений
- Структурно-функциональные перестройки в мозге реципиентов при трансплантации незрелой нервной ткани различного генеза
- Нейротрофическая регуляция жизнеспособности и дифференцировки трансгенных клеток
- Современные проблемы лечения гидрофобии антирабическими препаратами
- Дифференцировка трансплантатов эмбрионального неокортекса в мозге взрослых крыс
