Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка контроля контаминации продукции птицеводства термофильными кампилобактериями

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка контроля контаминации продукции птицеводства термофильными кампилобактериями"

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВ ОЛЕГ АНДРЕЕВИЧ

РАЗРАБОТКА КОНТРОЛЯ КОНТАМИНАЦИИ ПРОДУКЦИИ ПТИЦЕВОДСТВА ТЕРМОФИЛЬНЫМИ КАМПИЛОБАКТЕРИЯМИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004697113

— ¿.ли

Москва-2010

004607113

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (ГОУ ВПО «МГУПБ»)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук доцент Скляров О.Д.

доктор биологических наук Телишевская Л.Я.

доктор биологических наук Бедоева З.М.

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Федеральный Центр токсикологии и радиационной безопасности» (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань).

Защита состоится ^¿Щ^РУ 2010 г. в часов на заседании дис-

сертационного совета Д.220.011.01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») по адресу: Россия, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ».

Автореферат разослан « Ж 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, заслуженный ветеринарный врач РФ

С

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы

Кампилобактсриозы - заболевания животных и человека, проявляющиеся преимущественно в виде энтеритов и поражения органов размножения.

Впервые микроорганизмы, именуемые сегодня кампилобактериями, были выделены в 1909 году из экссудата матки абортировавшей овцы и в 1913 году - от абортировавшей коровы. Несколько позже бактерии, имеющие сходные характеристики, были изолированы из плодных оболочек и плодов абортировавших коров. T.Smith, M.S.Taylor, (1919) описали данного возбудителя, назвав его Vibrio fetus, а болезнь, вызываемую им, - виб-риозом [Smith Т., 1919]. По мере получения новых данных о свойствах этих возбудителей таксономия рода Vibrio существенно изменилась. В 1963 году по предложению M.Sebald и M.Veron (1963) было предложено микроаэрофильные вибрионы выделить в новый род - Campylobacter (греч. - изогнутая палочка). С учетом данных последних лет номенклатуры и таксономии род Campylobacter spp постоянно совершенствуется [King Е.О., 1962; Smibert R.M., 1978]. Согласно номенклатуры, официально признанной сегодня, род Campylobacter, входящий в семейство Campylobacteraceae, порядок Campylobacterales, класс Epsilonproteobacteria, тип Proteobacteria, объединяет 29 видов и 10 подвидов бактерий (http://www.bacterio.cict.fr/).

Более 30 лет с момента первого выделения возбудителя считалось, что к нему восприимчивы только животные. Однако после регистрации абортов у женщин, обусловленных заражением культурой подвида fetus, количество данных о роли кампилобактерий в патологии у человека выросло. Согласно многочисленным публикациям, термофильные камгшло-бактерии в качестве этиологического фактора острых кишечных заболеваний человека встречаются не реже, чем сальмонеллы, шигеллы и ротави-

русы (Bryner J. H. et al, 1962; Karmali M.A., 1979; Megraud F., 1981; Cottral G.E., 1978, Coker A.O. et al. 2002).

Резервуаром кампилобактерий являются, в первую очередь, дикая й домашняя птица, а также другие животные (Минаев В.И., 1988; Чайка H.A. и др., 1988; Baker R.C., 1987). Наибольшую опасность для здоровья человека и животных представляют термофильные кампилобактерии, в первую очередь, Campylobacter jejuni subspecies jejuni, затем Campylobacter coli, а из нетермофильных Campylobacter fetus subspecies fetus, вызывающие тяжело протекающие инфекции, осложненные сепсисом.

Данные научных публикаций свидетельствуют о том, что основными источниками возбудителя кампилобактериоза являются больные и клинически здоровые животные-бактерионосители, выделяющие его преимущественно с экскрементами и реже с молоком (Чайка H.A. и др., 1988; Deboer E.et. al., 1990).

Значительную эпидемическую опасность представляет продукция животноводства, контаминированная возбудителем в процессе послеубой-ной обработки животных-бактерионосителей. Имеются сообщения об инфицировании людей, контактирующих с больными кампилобактериозом животными или бактерионосителями (Чайка H.A. и др., 1988; Grant LH. et. al., 1980).

Исследований, посвященных выделению, идентификации, дифференциации кампилобактерий и решению проблемы кампилобактериоза, как животных, так и человека выполнено достаточно много и в первую очередь за рубежом (Bolton F.J. et al., 1992; Report prepared for Ministry of Health Revised May. - 2003). Впрочем, немало работ, посвященных решению этой проблемы, выполнено и опубликовано российскими учеными (Алабугина Т.В., 1998; Шурышева Ж.Н., 2007). В итоге, на сегодняшний день, предложено несколько способов выделения термофильных кампилобактерий из продукции животноводства и попытки совершенст-

вования их не прекращаются, но пока не выбраны универсальная среда и способ, которые можно было бы рекомендовать для исследования всех видов продукции.

Российская Федерация обладает развитой отраслью птицеводства, наряду с этим мясо птицы является одной из основных статей экспорта. В частности, в 2006 г. США экспортировали в Россию около 700 тысяч тонн мяса птицы. В рамках задач Всемирной Торговой Организации гармонизация стандартов безопасности пищевых продуктов имеет огромное значение. Ключевым аспектом гармонизации стандартов является признание эквивалентности различных аналитических методик торговых партнеров.

В связи с этим, исследования, посвященные оптимизации порядка выделения термофильных кампилобактерий от животных и продукции животноводства вообще, а птицеводства, в частности, молено считать актуальными.

1.2. Цель и задачи работы

Целью настоящей работы был подбор оптимальных средств, способов и схем для мониторинга термофильных кампилобактерий.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

- изучить дифференциально-диагностические свойства термофильных кампилобактерий;

- подобрать питательные среды с выраженными ростообеспечиваю-щими свойствами для кампилобактерий;

- изучить возможность выделения возбудителя из образцов содержимого тонкого отдела кишеченика или помета кур и цыплят;

- подобрать оптимальные схемы контроля продукции птицеводства на наличие

кампилобактерий с использованием образцов смывов с тушек птицы или ж частей, контаминированных кампилобактериями;

- разработать методические рекомендации по контролю продукции птицеводства на наличие кампилобактерий.

1.3. Научная новизна

Впервые получены данные по сравнительному испытанию росто-обеспечивающих свойств ряда отечественных и зарубежных питательных сред и по оценке эффективности схем выделения кампилобактерий из патологического, а также биологического материала, неконтаминированного и контаминированного культурами термофильных кампилобактерий разных видов.

1.4. Практическая значимость

Предложены средства, способы и методологические подходы для проведения мониторинга термофильных кампилобактерий, что имеет важное противоэпизоотическое и провоэпидемическое значение, так как способствует разработке и проведению мероприятий по профилактике и борьбе с вызываемыми ими заболеваниями животных и человека. Совершенствование диагностики кампилобактериозов способствует повышению эффективности проведения производственного контроля продукции в условиях птицеперерабатывающих предприятий и диагностических исследований в ветеринарных лабораториях.

1.5. Апробация полученных результатов

Материалы диссертации доложены на заседаниях кафедры микро-биологиии ГОУ ВПО «МГУПБ» в 2007- 2009 гг. и опубликованы в 2-х научных статьях в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межкафедральном совещании сотрудников ГОУ ВПО «МГУПБ».

1.6. Основные положения, выносимые на защиту

Данные о ростообеспечивающих свойствах полужидкой и плотной питательных сред для термофильных кампилобактерий отечественного и

зарубежного производства, эффективности селективных добавок для кам-пилобакгерий, способов и схем их выделения из биологического материала.

1.7. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 139 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение.

Работа иллюстрирована 18 таблицами, 1 рисунком. Библиографический список включает в себя 220 наименований, в том числе 170 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

В работе использовали: С02-инкубатор (Sanyo); весы с точностью измерения до второго знака; микроскоп с фазовоконтрастным устройством и объективом х 90-100 с масляной иммерсией; лабораторную посуду (чашки Петри, пробирки, пипетки, шпатели и т.п.); оптический стандарт мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича на 10 ед.; предметные и покровные стекла;

- штаммы микроорганизмов:

№ п/п Наименование №jY°

1 С. jejuni subspecies jejuni 70.2T

2 С. jejuni subspecies jejuni 11168

3 С. coli 43477

4 C.lari 729

5 С. fetus subspecies fetus 5396

6 C. fetus subspecies venerealis 6829

7 Camp, sputorum s. bubulus 53103

8 Salmonella enteritidis 1654

9 Salmonella enteritidis R-6

10 Escherichia coli 1330

11 Proteus vulgaris IC-24

12 Staphylococcus aureus 209-P

- питательные среды: Кампилобакагар, ФГУП ГНЦПМ (г. Обо-

ленск); Мясо-пептонный печеночный полужидкий агар (ПЖА), ФГУ «ВГНКИ»; Campylobacter Agar Base, M 994- Основа агара для кампилобак-терий; Columbia Blood Agar Basa M 144 - Колумбия агар; - Karmali agar M 887 Кармали агар (HiMedia);- Brucella Broth Base M348 - Бульон для бруцелл (производства HiMedia Laboratories Limited, кат., Mumbai - 400 086, India).

- аэротолерантную добавку (HiMedia);

- селекционирующие добавки: (НИЦФ, Санкт-Петербург), BlaserWang, Preston, Karmali, Skirrow (HiMedia).

Объектами исследования служили:

- содержимое слепых отростков кишечника (цыплят-бройлеров) или помет в количестве 283 образцов от птицы шести птитицефабрик Московской и Рязанской областей;

- куриные голени в количестве 75 и окорочка в количестве 35 штук, приобретенные в розницу и сохраняемые перед использованием в работе в морозильной камере в течение 3-4 дней;

- тушки и содержимое слепых отростков 15 кур, убитых непосрест-венно перед исследованием.

Для изготовления исходных суспензий односуточные второй генерации культуры кампилобакгерий, протея, сальмонелл, эшерихий и стафилококков, выращенные на M 144, суспендировали, каждую отдельно, в физиологическом растворе с таким расчетом, чтобы суспензии по мутности были идентичными оптическому стандартному образцу мутности ГИСК на 10 ЕД, что соответствует концентрации примерно 1хЮ9 микробных клеток указанной микрофлоры в 1 мл.

Содержимое слепых отростков кишечника цыплят/кур или их помет подготавливали для исследования следующим образом: навеску содержимого массой 1 г помещали в бактериологические пробирки со стерильным физиологическим раствором из расчета 1:10 (вес/объем) и суспендировали

с помощью стеклянных палочек. Пробирки с исходной супензией выдерживали при комнатной температуре в течение 10-15 мин для осаждения крупных частиц. Исходные суспензии разводили последовательно десятикратно до 10"3 (1:100 и 1:1000).

Суспензии из двух последних разведений по 0,05-0,1 мл высевали на дно столбиков ПЖА в трех пробирках и на кампилобакагр с 7 % гемолизи-рованной крови барана в трех чашках, с селективной добавкой НИЦФ и добавкой Preston (в одном опыте) в каждой из сред. Посевной материал распределяли по поверхности питательной среды с помощью шпателя. После каждой манипуляции шпатель погружали в 96 %-ный спирт и обжигали.

После убоя 15 кур с внутренней поверхности потрошеных тушек общей площадью примерно 100 см2 были сделаны смывы с помощью стерильных тампонов на жесткой металлической проволоке, укрепленных в резиновых пробках и вставленных в бактериологические пробирки с 10 мл стерильного бруцеллезного бульона М348. Каждый из смывов развели 1:1 аналогичным бульоном и посеяли по 0,3 мл в ПЖА в две пробирки и на агар М 144 без селективной добавки в одну пробирку и с селективной добавкой Skirrow в две пробирки.

Смывы, оставшиеся после прямого посева, разделили на две группы и внесли в них цефоперазон, в смывы первой группы непосредственно перед инкубированием в С02 - инкубаторе с микроаэ-рофильными условиями (5 % 02, 10 % С02 и 85 % N2), а второй - после 4 ч. инкубирования при таких же условиях и режиме. Общее время инкубирования смывов составило 24 ч.

Посевы инкубировали при температуре 42 °С на полужидкой среде в обычном термостате, на плотной - в С02-инкубаторе (5 % 02, 10 % С02 и 85 % N2) в течение 48 ч. Учет результатов посевов проводили каждые 24 ч.

Видовую дифференциацию Campylobacter spp. проводили по общепринятым тестам: с учетом их морфологических, тинкториальных, культу-ральных и ферментативных свойств. В частности проводили тесты на ка-талазу, цитохромоксидазу, способность гидролизовать гиппурат натрия, и расти на питательных средах с содержанием различных ингибирующих средств.

Достоверность различий между результатами сравнительных исследований, проведенных с использованием разных питательных сред и схем, оценивали по критерию Стыодента (Ашмарин И.П. и др., 1971).

Состав микрофлоры кишечника птиц изучали путем определения наличия микроорганизмов: - разных родов и видов семейства Enterobacteri-асеае; нитрифицирующих анаэробных бактерий рода Clostridium; энтерококков; спорообразующих аэробных бактерий рода Bacillus; молочнокислых бактерий рода Lactobacillus.

Для выделения энтеробактерий использовали агар Плоскирева; нитрифицирующих клостридий - агар Вильсона-Блера; энтерококков - МПА с 1% - й глюкозой и 0,02% азида натрия (рН 9,6); спорообразующих аэробов - МПА (материал до посева прогревали в водяной бане при 100 °С в течение 2 мин), молочнокислых бактерий - плотный гидролизат молока с мелом.

Разведенные в стерильном физиологическом растворе пробы материала (1:100-1:200) засевали бактериологической петлей частыми, широкими штрихами на поверхность застывшей и подсушенной плотной среды в чашках Петри (для выделения энтерококков, спорообразующих аэробов, энтеробактерий). Для выделения клостридий и молочнокислых бактерий материал (в объеме 0,5-1,0 см) вносили в расплавленный и остуженный до 40-45 °С агар Вильсона-Блера и на гидролизат молока с мелом в пробирках. После суспендирования материала в расплавленных средах содержимое пробирок переливали в стерильные чашки. Посевы выдерживали при

комнатной температуре до застывания сред. Для создания анаэробных условий выращивания факультативных клостридий на застывший агар Виль-сона-Блера наслаивали слой (толщиной 2,5-3 мм) расплавленного и остуженного до 40-45 °С обычного МПА. Инкубирование посевов проводили при 37 °С в течение 24-48 ч, энтерококки выращивали при 43-44 °С. Родовую и видовую идентификацию выделенных культур микробов осуществляли на основе определения морфологических, тинкториальных и культу-ральных свойств, а у энтеробактерий - еще и биохимических признаков.

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Изучение дифференциально-диагностических признаков камнилобактерий

С целью исключения использования в работе культур микроорганизмов, не относящихся к роду Campylobacter, была выполнена проверка дифференциально-диагностических признаков всех используемых штаммов кампилобактерий (табл. 1).

Таблица 1

Изучение дифференциально-диагностических признаков ____кампилобактерий__

Признаки штаммы

jejuni coli 43477 lari 729 fetus 5396 venerealis 6829 bubulus 53103

Г70.2Т 11168

Каталаза + + + + + + -

Оксидаза + + + + + + +

Рост при 25 "С - - - - + + +

37 °С + 4- + + + + +

42 "С + г + + + - - -

Переход в кокковую форму + + + + - - -

Гидролиз гиппурата + + - - - - -

Продукция НгБ: а) ацетат свинца б)трехса-харный агар + + + + + + +

- - - - - - +

Рост на среде глицин, 1 % + + + + + - +

желчь, 1 % + + ч + + + -

NaCl, 3,5% - - - - - - +

1* Ч ч ч ч р р р

2* Р р р р ч ч ч

3* Р р р р р р р

4* Ч/Ч ч/ч ч/ч ч/ч р/р р/р р/р

Редукция селенита + + + + + - +

Примечание: (+) - наличие признака; (-) - отсутствие признака; (Ч) - чувствительны; (Р) - резистентны. Чувствительность к: - 1 * - налидиксовой кислоте; 2* - цефа-дотиау; 3* - трифениптетразолшо; 4* - бриллиантовому зеленому, 1:100000/1:33000.

Согласно результатам определения дифференциально диагностических признаков, все проверенные штаммы соответствовали паспортным данным.

Дополнительно принадлежность этих штаммов к роду Campylobacter была подтверждена результатами определения процента содержания в их геномах пар азотистых оснований GC по отношению к их общему количеству (табл. 2)

Таблица 2

Нуклеотидный состав ДНК кампилобактерий

Вид/подвид Штамм %ГЦ

С. jejuni subspecies jejuni 702T 33,2

С. jejuni subspecies jejuni 11168 34,0

C.coli 43477 32,5

C.lari 729 32,5

C. fetus subspecies fetus 5396 34,2

C. fetus subspecies venerealis 6829 34,5

Camp, sputorum s. bubulus 53103 35,1

E. coli (контроль) K12 51,6

Как видно из материалов таблицы у всех проверенных штаммов кампилобактерий данный показатель был в пределах от 32,5 до 35,1 мол. %, при норме 30-38 мол. %. В препарате ДНК культуры штамма К12 Е.соН, взятом в качестве внутреннего стандарта, содержание ГЦ пар составило 51,6 мол.%.

2.2.2. Сравнительное изучение ростообеснечивающих и селективных свойств ПЖА

Исходные суспензии кампилобактерий и сопутствующей микрофлоры с концентрацией микробных клеток Г109 в 1 мл развели последовательно десятикратно до 10"7.

Суспензии кампилобактерий и сопутствующей микрофлоры каждого разведения в объеме по 0,1 мл внесли в пробирки на дно столбика ПЖА без и с селективной добавкой (табл. 3).

Таблица 3

Схема изготовления суспензий микроорганизмов с разной концентрацией микробных клеток

Культура Исходная концентрация Концентрация микробных клеток, 1/01 мл

Кампилобактерии 110" 10s 10' 106 10* 10" 10 102

10' ю6 10s 104 102 10

Сопутствующая микрофлора I10y 10s 10' 10" 10b 104 10J 102

10' 106 10s 104 10J 102 10

Посевы инкубировали при температуре 37 °С: кампилобактерий - в микроаэрофильных условиях; сопутствующей микрофлоруы - в обычном термостате. Учет результатов посевов на питательных средах проводили ежесуточно в течение 12 суток (табл. 4).

Таблица 4

Изучение ростообеспечивающих и селективных свойств ПЖА с селективной добавкой НИЦФ с использованием монокультур бактерий

Среда Штамм Время регистрации роста кампилобактерий

(сутки) в зависимости от засевной дозы

10' 106 103 104 10 10 10

ПЖА 70.2Tjejuni 1 1 2 3 4 4 6

11168 jejuni 1 1 2 2 4 4 5

43447 coli 1 1 2 2 3 4 4

729 lari 1 1 2 3 4 4 5

5396fetus 1 2 3 4 5 5 5

11168 venerealis 1 2 2 3 4 4 4

53103 bubulus 1 2 2 3 4 4 5

P. vulgaris 1 1 1 1 1 1 1

E.coli 1 1 1 1 1 1 1

St. aureus 1 1 1 1 1 1 1

Salm. Ent. 1 1 1 1 1 1 1

ПЖА* 7 0.2Tjejuni 2 3 3 4 5 6 -

¡1168 jejuni 2 3 4 5 6 8 -

43447 coli 2 3 4 5 6 6 -

729 lari 3 4 5 7 9 - -

5396 fetus 7 8 10 11 12 - -

11168 venerealis 6 7 8 9 10 12 -

53103 bubulus 2 4 6 7 9 9 12

P. vulgaris - - - - - - -

E.coli - - - - - - -

St. aureus - - - - - - -

Salm. Ent. - - - - - - -

Примечания: (1,2...)- сутки, на которые зарегистрирован рост культуры; (-) - отсутствие роста культуры, * ПЖА с селективной добавкой НИЦФ (полимиксин В, рифампицин, ристомицин и амфотерицин В, фузидин).

Согласно табличным данным, ПЖА без селективной добавки обеспечила рост монокультур всех штаммов кампилобактерий и сопутствующей микрофлоры независимо от степени разведения, при этом время регистрации роста кампилобактерий зависело от засевной дозы. Так, рост кам-пилобактериий разных видов, посеянных в дозе 1' 107, наблюдали через 24-48 ч. культивирования, посеянных в дозе 10 микробных клеток - на 4-6 сутки с момента посева. Рост культур штаммов протея, эшерихий, стафилококка и сальмонелл был зарегистрирован через сутки после посева и не зависел от посевной дозы.

На питательной среде с селективной добавкой рост культур штаммов кампилобактерий был несколько замедлен, Минимальная доза кампилобактерий, обеспечившая рост культуры на селективной среде, составила: подвида jejuni - МО2, coli - ПО2, Ian - ПО3, fetus - 1'104; venerealis -НО2; bubiilus - 1101 микробных клеток. Роста сопутствующей микрофлоры на питательной среде с селективной добавкой зарегистрировано не было.

В следующем опыте смеси, состоящие из 0,1 мл суспензий кампилобактерий в дозе 1'106 и 0,1 мл сопутствующей микрофлоры в дозе 1105 микробных клеток, посеяли на дно столбиков ПЖА в пробирки без селек-

тивной и с селективной добавкой.

Посевы инкубировали в микроаэрофилышх условиях при температуре 42 °С (табл. 6).

Таблица 6

Результаты изучения ростообеспечивающих и селективных свойств ПЖА с использованием смеси культур кампилобактерий и сопутствующей микрофлоры

Смесь культур Время регистрации роста

кампнлобактерий/сопутствугащей

микрофлоры, (сутки)

ПЖА ПЖА*

70.2Т jejuni + St. aureus -/1 3/-

70.2Т jejuni + E.coli -/1 31-

70.2T jejuni + Pr.vulgaris -/1 31-

70.2T jejuni + Salm. Enterilidis -/1 31-

11168 jejuni + St. aureus -/1 2/-

11168 jejuni + E. coli -/1 3/-

11168 jejuni + Pr. Vulgaris -/1 31-

11168 jejuni i + Salm. Enter. -/1 21-

43447 coli + St. aureus -/1 31-

43447 coli + E. coli -/1 3/-

43447 coli + Pr. Vulgaris -/1 31-

43447 coli + Salm. Enter. -/1 31-

729 lari + St. aureus -/1 31-

729 lari + E. coli -/1 31-

729 lari + Pr. Vulgaris -/1 3!-

729 lari + Salm. Enter. -/1 31-

Примечание: (1,2...)- сутки, па которые зарегистрирован рост культуры; (-) -отсутствие роста культуры; ПЖА* - с селективной добавкой НИЦФ.

Согласно табличным данным на питательной среде без селективной

добавки культуры сопутствующей микрофлоры подавляют рост кампилобактерий. 'Гак, через одни сутки после посева на питательной среде без селективной добавки во всех пробирках наблюдали рост культур сопутствующей микрофлоры. На ПЖА с селективной добавкой в течение 2-4 суток выросли только культуры кампилобактерий, роста сопутствующей микрофлоры зарегистрировано не было.

2.2.3. Оценка ростообеспечивающих свойств полужидкой и плотных питательных сред для культивирования кампилобактерий

Суспензии кампилобактерий с концентрацией 1'Ю9 в 1 мл развели

последовательно десятикратно до 10~6 и из последнего разведения по 0,1 мл посеяли в две пробирки на дно столбиков ПЖА и на плотные питательные среды (каждую культуру штамма на пять чашек с каждой питательной средой). Посевы инкубировали при 37-38 °С в течение семи суток (табл. 7).

Таблица 7

Оценка ростообеспечивающих свойств питательных сред, выбранных для работы

Среда Ростовая добавка * Селективная добавка ] Среднее количество колоний на средах:

без селективных добавок с селективными добавкам

702Т 43477 729 702Т 4347 729

ПЖА ** - **** + + + + + +

Кампи-лобака-гар *** те 00 ОТ **** 84 ±8,95 111 ±8,94 89 ±7,32 85 ±6,26 79 ±5,33 91 ±4,81

М994 -II- -II- РР 006 76 ±4,64 97 ±14 99 ±2,683 81 +7,37 96 ±7,58 85 ±6,87

М 144 -II- -II- 1Ф 006 89 ±6,41 106 ±7,58 95 ±6,63 87 ±4 85 ±4,64 88 ±2,29

М 887 - -II- го 067 54 ±7,26 112 ±8,97 90 ±3,46 49 ±3,45 89 ±10,69 101 ±11,70

Примечание: * - аэротолерантная добавка; ** - аминопептид 7 %; *** - кровь барана, 7 %; **** - селективная добавка НИЦФ - полимиксин В, рифампицин, ристо-миции и амфотерицин В, фузидин; (+) - зарегистрировал рост культуры кампилобакте-рий на ПЖА.

Как видно из материалов таблицы ПЖА без селективной и с селективной добавкой НИЦФ обеспечил рост всех культур штаммов термофильных кампилобактерий в течение 48-96 ч.

Согласно полученным результатам, статистически достоверных различий (р>0,05) между средним количеством колоний кампилобактерий указанных видов, выросших на используемых в опыте питательных средах фирмы «ШМесИа» в пяти чашках не установлено, причем это относится и к показателям количества колоний, выросших на питательных средах без и

с селективными добавками. Исключение составила среда М887, на которой, как без селективной добавки, так и с нею, количество колоний штамма № 70.2Т было статистически достоверно ниже (р <0,05).

2.2.4. Определение уровня кампилобактерионосительства у цыплят-бройлеров и его зависимости от микробиоценоза кишечника

В ходе выполненных исследований кампилобактерии были обнаружены в образцах содержимого тонкого отдела кишечника или помета цыплят-бройлеров шести птицефабрик Московской и Рязанской областей (табл.8).

Таблица 8

Частота обнаружения кампилобактерии в пробах слепой кишки и фекалий цыплят-бройлеров

Название птицефабрики Способ выращивания цыплят Исследовано проб Выделено культур Campylobacter

jejuni coli lari

1* 2*

Братцевская Клеточный 18 2 2 2 0 0

Бройлер Рязани Напольный 16 4 4 4 0 0

Петелинская Клеточный 10 4 4 1 0 0

Петелинская Напольный 11 9 9 9 0 0

Кучинской птицеводческий ллемзавод Клеточный 31 31 31 31 0 0

эпх внитип Напольный 40 34 38 19 8 4

эпх внитип Напольный 31 31 31 19 12 0

ОАО «Птицедар» Напольный 31 9 10 10 0 0

Всего 188 124 129 95 20 4

Примечание: 1 * - ПЖА, 2* - Кампилобакагар

В частности, кампилобактерии были выделены из 188 исследованных образцов содержимого тонкого отдела кишечника/помета из 129 (68,6 %). При этом оказалось, что кишечник исследованной птицы был колонизирован преимущественно кампилобактериями подвида jejuni,ro общего числа выделенных культур 95 (76 %) были типированы, как бактерии именно этого подвида, 20 культур (15,5 %) были отнесены к виду coli, 4 (3,1 %) - к подвиду lari.

Пробы 10 культур, выделенных из 30 образцов помета цыплят-бройлеров ОАО «Птицедар», после пересева и культивирования на плотной питательной среде, были протестированы с номощыо сотрудников отдела биотехнологии ФГУ «ВГНКИ» в полимеразной цепной реакции с использованием ПЦР-тест системы «Кам-бак» (рис. 1).

Рисунок 1. Электрофореграмма результатов тестирования культур, выделенных из содержимого слепой кишки цыплят ОАО «Птицедар»:

К— отрицательный контроль ПЦР (деионизированная вода);

К+ - положительный контроль ПЦР (ДНК С. jejuni s. jejuni штамма 70.2Т - специфическая полоса ампликона на уровне 600 п.н.);

М - маркер молекулярной массы (набор фрагментов ДНК длиной 630. 450 и 330

п.н.)

В итоге, согласно результатам типирования, в том числе и молеку-лярно-генетического, все 10 выделенных культур были отнесены к кампи-лобактериям пoдвидajejuni.

Определение уровня кампилобактерионосительства у цыплят-бройлеров и его зависимости от микробиоценоза кишечника было проведено с использованием с содержимого тонкого отдела кишечника птицы трех птицефабрик: «Братцезская», «Бройлер Рязани» и «Петелинская», содержащей и не содержащей Campylobacter spp. Всего было исследовано 80 проб содержимого слепой кишки и сборных проб фекалий цыплят-бройлеров от 4 до 43-дневного возраста.

Согласно полученным результатам, преобладающими по численности являлись энтеробактерии родов Escherichia и Enterococcus, у цыплят Братцевской птицефабрики по сравнению с птицей других птицефабрик чаще встречались бактерии рода Proteus. На Пегелинской птицефабрике, наряду с высоким уровнем эшерихий и энтерококков, выделяли значительное количество стафилококков и тетракокков; значительно меньшее число выделет!ых культур пришлось на молочнокислые бактерии (кокковые и палочковидные). Довольно низкий уровень составляли спорообра-зующие аэробные бактерии рода Bacillus, а. наименьшее количество - нитрифицирующие анаэробные бактерии рода Clostridium, их удалось выделять лишь у некоторых цыплят. Отсутствие существенных различий между составом и количественным уровнем энтеробактерий, энтерококков, нитрифицирующих анаэробных клостридий, аэробных бацилл и молочнокислых бактерий в кишечнике цыплят, свободных и не свободных от носи-тельства термофильных камнилобактерий, дает основание считать эти микроорганизмы неспособными оказывать влияние на рост и колонизацию слизистой кишечника кампилобактериями.

2.2.5. Сравнительная оценка схем, средств и способов выделения термофильных камнилобактерий из продукции птицеводства

Суспензии односуточных агаровых культуры штаммов 702Т jejuni, 43477 coli, 729 lari с концентрацией 1'109 в 1 мл в объеме по 30 мл внесли в стерильные полиэтиленовые пакеты, и поместили в них по одной куриной голени. После экспозиции в течение 15 мин при комнатной температуре голени перенесли в отдельные полиэтиленовые пакеты с предварительно внесенной в каждый по 50 мл 1%-ной пептонной водой. Еще в два пакета с пептонной водой в таком же количеств поместили по куриной голени, lie контаминированной кампилобактериями. Пакеты с содержимым выдержали при комнатной температуре в течение в 15 мин, несколько раз встряхнув.

Суспензию (смывы) из каждого пакета в объеме по 0,2 мл посеяли на МППЖА с 7 % аминопептида в пробирках и Кампилобакагар (ГНЦПМ), Columbia Blood Agar Basa, Blood Free Campylobacter Selectivity Agar Base, Campylobacter agar Base M994 (HiMedia) с 7 % дефибршшро-ванной крови барана и с селективными добавками.

С поверхности голеней, извлеченных из пакетов, стерильными ватными тампонами были взяты смывы для бактериологического исследования. Бактериологические посевы на плотные питательные среды выполнили путем нанесения непрерывного штриха в ПЖА путем погружения тампонов, которые оставили в питательной среде на весь период инкубирования. Все посевы инкубировали при 42 °С в микроаэрофильных условиях. Учет результатов посевов проводили ежедневно в течение 4 суток (табл. 10).

Таблица 9

Выделение культур термофильных камиилобактерий с поверхности куриных голеней

Питательные среды, ростовые и селективные добавки Наличие культуры кампилобактерий

Смывы с куриных голеней

коитаминированных кампилобактериями неконтами-нированной

702Т 43477 729 контроль

смыв тампон смыв тампон смыв тампон смыв тампон

ПЖА Аминопеп-тид, 7 % НИ ЦФ + + + + + - - -

Кампилобакагар кровь барана, 7 % SR0 84Е + \ + - + - - -

M 144 -II- -II- + + + - + - - -

M 887 -II- -II- + - + - + - - -

M 994 -II- + + + - - - - -

Примечание: (+) наличие роста культуры штамма; (-) отсутствие роста культуры.

Селективные добавки: - ПЖА, НИЦФ - полимиксин В, рифампицин, ристоми-цин и амфотерицин В, фузидии; - плотные питательные среды - Цефоперазон из расчета 3 мг/100 мл

Согласно результатам учета посевов по истечении срока наблюдения, признаки роста посторонней микрофлоры в разных количествах наблюдали на всех питательных средах. Наряду с этом рост культур кампи-лобактерий был зарегистрирован на:

- полужидкой питательной среде, как в пробирках, засеянных испытуемой суспезией с помощью пипеток, так и в пробирках, засеянных смывами, взятыми непосредственно с куриных голеней с помощью тампонов (путем погружения тампонов);

- на всех плотных питательных средах, засеянных испытуемой суспензией с помощью пипеток, культуры росли как в виде отдельных колоний, так и в виде ограниченных неправильной формы, незначительных по объему (общей площадью до 1,5 см2) участков сплошного роста.

При учете посевов на плотных средах, засеянных смывми, взятыми с круриных голеней с помощью тампонов, наблюдали рост только кампило-бактерий штамма 70.2Т подвида jejuni на Кампилобакагаре (ГНЦПМ), Columbia Blood Agar Basa M 144 (HiMedia) и Campylobacter agar Base M 887 (HiMedia). Культуры кампилобактерий видов coli и lari на всех плотных питательных средах, засеянных таким образом, роста не дали.

Также не был зарегистрирован рост культур кампилобактерий на всех питательных средах, засеянных помощью тампонов смывами с поверхности неконтаминировапных ими куриных голеней.

Следующим этапом работы стал опыт, посвященный бактериологическому исследованию смывов с внутренней поверхности тушек кур, клеточного содержания в ОПХ «Манихино», полученных непосрественно после их убоя. Согласно полученным данным культура кампилобактерий была выделена только из образца смыва с тушки № 3, посеянного на ПЖА, в который селективную добавку внесли после предварительного четырехчасового инкубирования. По результатам дифференциации культура была отнесена к подвиду jejuni. При учете результатов посевов содержимого

слепых отростков кишечника от этих же кур культуры кампилобактерий были выделены из образцов содержимого тонкого отдела кишечника кур № 3 и 13, инкубированных на плотной питательной среде Ml44 с содержанием 7 % аминопетида и с цефоперазоном. Причем в первом случае внесенного в смыв непсредственно перед инкубированием, а во втором - после 4 ч. инкубирования посевов. Культуры, выделенные из содержимого кишечника, также были отнесены к повиду jejuni.

Завершающим этапом диссертационных исследований являлась оценка эффективности двух схем контроля наличия Campylobacter spp. в смывах с куриных голеней и окорочков в трех опытах.

На первом этапе каждого из опытов использовали способ обогатительного посева. При этом каждую из 35 куриных голеней (окорочков) поместили в Brucella Broth (HiMedia) с добавлением 7 % аминопептида, разлитого по 100 мл в отдельные стерильные, герметично закрывающиеся пластиковые пакеты. После получения смывов голени из пакетов извлекли. Часть полученных смывов и чистого бульона контаминировали культурами кампилобактерий в разных дозах.

Все посевы и образцы неконтаминированных смывов и бульона инкубировали в микроаэрофильных условиях (в пакеты закачивали с соблюдением правил асептики газовую смесь, состоящую из 5 % О2, 10 % СОг и 85 % N2) в С02-инкубаторе при 37 °С в течение 4 ч.

По истечении 4 ч. в каждый пакет внесли по 3 мл раствора цефопе-разона с содержанием 3 мг антибиотика, повторно закачали в пакет газовую смесь и инкубировали в С02 - инкубаторе при 42 °С в течение 20 ч. Через 24 ч. общего инкубирования по 5 мл содержимого из каждого пакета перенесли в 2 стерильные бактериологические пробирки, составили их описи и исследовали в соответствии с положениями двух разных схем.

Далее, согласно условиям первой схемы, содержимое 50 пробирок неразведенное и в разведении бульоном 1:100 пересеяли штрихом на

Karmali agar в чашках Петри, из расчета каждую пробу на питательную среду в двух чашках. Посевы инкубировали при 42 °С в течение 48 ч. в микроаэрофильных условиях.

По условиям второй схемы неразведенное содержимое пробирок пересеяли:

- в мясо-пептонный печеночный полужидкий агар (ГОКА) в 3 пробирки, в том числе по 0,05 и 0,1 мл в питательную среду без селективной добавки; по 0,2 мл в питательную среду с селективной добавкой Blaisera-Wanga (HiMedia);

- на Columbia agar в 3 чашках Петри по 0,1 мл, в том числе на питательную среду с 5 % аминопептида в одной чашке; на питательную среду с 5 % аминопептида и с цефоперазоном в одной чашке; на питательную среду с 5 % дефибринированной крови и селективной добавкой Blaisera-Wanga в одной чашке.

Все посевы инкубировали при 42 °С в течение 48 ч. в микроаэрофильных условиях.

По условиям первой схемы все колонии и культуры с характерной для Campylobacter spp. морфологией пересеяли в Brucella Broth с добавлением аэротолерантной добавки (FBP, HiMedia), каждую в 2 пробирки и инкубировали при 42 °С в течение 24 ч. в микроаэрофильных условиях.

По условиям второй схемы все колонии и культуры с характерной для Campylobacter spp. морфологией пересеяли с ПЖА на ПЖА, с плотной питательной среды - штрихом на плотную питательную среду в чашках Петри. Посевы инкубировали при 42 °С в течение 24 ч. в микроаэрофильных условиях. Выделенные при этом культуры идентифицировали (табл. 11).

Согласно данным первого опыта, из 35 образцов материала, конта-минированного термофильными кампилобактериями, положительный ре-

зультат был получен в 13 случаях по результатам тестирования по условиям первой схемы и 15 случаях - по условиям второй схемы.

Таблица 10

Результаты исследования смывов с куриных голеней и окорочков, искусственно контаминированных Campylobacter spp.

№ проб среда форма I Штамм, м.к./мл Оценка

Опыт 4* Опыт 5* Опыт 6*

1-я схема 2-я схема 1-я схема 2-я схема 1-я схема 2-я схема

1 Brucella broth смыв jejuni, 100 0/5 0/5 2/5 3/5 3/5 3/5

2 -II- смыв jejuni, 1000 3/5 4/5 5/5 5/5 5/5 5/5

3 -II- смыв coli, 100 0/5 0/5 1/5 2/5 3/5 3/5

4 смыв coli, 1000 1/5 2/5 3/5 5/5 5/5 5/5

5 чистый jejuni, 1107 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3

6 -II- вдетый jejuni, 100 3/5 3/5 4/5 4/5 4/5 4/5

7 -II- чистый coli, 100 3/5 3/5 4/5 4/5 3/5 4/5

4 -II- чистый не конт. 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2

8 -II- смыв не конт. 0/15 0/15 0/15 0/15 0/15 0/15

Итого 13/50 15/50 22/50 26/50 26/50 27/50

Примечание: Цефоперазон во всех пробирках, 3 мг/100 мл: 4* - с добавлением через 4 часа инкубирования; 5* - перед инкубированием; 6* - с добавлением перед инкубированием посевов селективной добавки НИЦФ.

Во втором опыте было выполнено аналогичное по методологии исследование с тем лишь исключением, что в смывы сразу после их получения внесли используемый в качестве селективной добавки цефоперазон из расчета 3 мг/100 мл. Согласно полученным данным, из 35 образцов материала, контаминированного термофильными кампилобактериями, положительный результат был получен в 22 случаях по результатам тестирования по условиям первой схемы и 26 случаях - по условиям второй схемы.

В третьем опыте было выполнено аналогичное по методологии исследование за тем исключением, что смывы готовили с использованием куриных окорочков, после извлечения их из питательного бульона, расфа-

сованного в пакеты, и контаминации посевов кампилобактериями в них внесли селективную добавку НИЦФ. Согласно табличным данным, из 35 образцов материала, контаминированного термофильными кампилобактериями, положительный результат был получен в 26 случаях по результатам тестирования по условиям первой схемы и 27 случаях - по условиям второй схемы.

3. ВЫВОДЫ

1. Питательные среды Кампилобакагар (НПО "Питательные среды", г. Оболенск), Columbia Blood Agar Base M 144, Campylobacter agar Base M994 без селективных добавок и с селективными добавками: Blaser-Wang (FD006), Preston (FD 067) HiMedia и НИЦФ (С.-Петербург) обеспечивают рост кампилобактерий подвида jejuni, видов coli и lari. без достоверных различий (р>0,05) между средним количеством выросших на них колоний и обладают, соответственно, ростообеспечивающими свойствами в отношении термофильных бактерий рода Campylobacter и умеренно ингиби-рующими в отношении микрофлоры содержимого кишечника птицы.

2. Факт необеспечения роста заданного количества КОЕ культуры штамма 70.2Т подвида jejuni Blood Free Campylobacter Selectivity Agar Base M887 (агар Кармали) как с слелективной добавкой, так и без нее, в сравнении с другими используемыми в работе питательными средами, свидетельствует о целесообразности применения при бактериологическом исследовании на кампилобактериоз более чем одной питательной среды.

3. Время роста монокультур штаммов кампилобактерий подвидов venerealis, jejuni; видов fetus, coli, lari, биовара bubulus и сопутствующей микрофлоры (культур штаммов протея, эшерихий, стафилококков и сальмонелл) на элективном ПЖА зависит от засевной дозы. Рост кампилобак-териий разных видов, посеянных в дозе 1107, наблюдали через 24-48 ч., а в дозе 10 микробных клеток - на 4-6 сутки с момента посева. Рост всех

культур штаммов протея, эшерихий, стафилококка и сальмонелл был зарегистрирован через 24 ч. инкубирования независимо от посевной дозы.

На ПЖА с селективными добавками рост указанной микрофлоры ингибирован в разной степени. Мнимальная доза кампилобактерий, обеспечившая рост культуры на селективной среде, составила: подвида jejuni 102, coli - 102, lari - 103, fetus - 104; venerealis - 102; bubulus - 10l микробных клеток.

Культуры штаммов протея, эшерихий, стафилококка и сальмонелл, посеянные в дозе 105, роста не дали.

4. ПЖА с селективной добавкой, в случае хранения в темном месте при температуре от 2 до 10 °С сохраняет ростообеспечивающие свойства в отношении кампилобактерий и ингибирующие - в отношении сальмонелл, протея, стафилококков, эшерихий, иерсиний.

5. Термофильные кампилобактерии, выделяемые из содержимого кишечника цыплят и кур, с использованием плотных и полужидких питательных сред затруднительно идентифицировать только по оценке их морфологических и культуральных свойств. Это обусловлено быстрой, начиная со 2-х суток роста, диссоциацией бактерий (при бактериоскопиче-ском исследовании мазков культур, окрашенных по Граму, выявляются коккоподобные структуры с нечетким контуром, розового цвета) и контаминацией культур посторонней микрофлорой. В связи с этим для получения объективных результатов идентификации и типирования целесообразно проводить их комплексное тестирование, в том числе с использованием молекулярно-генетических методов.

6. Максимальный диагностический эффект при тестировании смывов с куриных голеней и окрочков, контаминированных культурами термофильных кампилобактерий, обеспечивает внесение в смывы селективной добавки НИЦФ непосредственно перед инкубированием в сравнении с до-

бавкой цефоперазона как перед началом инкубирования посевов и, тем более, через 4 ч. с момента начала инкубирования.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты собственных исследований дтссертационной работы использованы при разработке следующих нормативных документов:

- «Методические рекомендации по контролю продукции птицеводства на наличие кампилобактерий», утвержденные директором ФГУ «ВГНКИ» 09.02. 2010 г.;

- проекта «Методические указания по выделению термофильных кампилобактерий», направленные для рассмотрения и утверждения в Рос-сельхознадзор.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Яковлев O.A. Уровень кампилобактерионосительства у цыплят-бройлеров и его зависимость от микробиоценоза кишечника / О.Л.Яковлев, Д.И.Скородумов, О.Д.Скляров, А.Н.Панин, Л.С.Каврук // Ветеринарный врач. - 2010. - № 3. - С. 24-27.

2. Скляров О.Д. Сравнительное изучение эффективности разных средств и схем выделения термофильных кампилобактерий / О.Д.Скляров, А.Н.Панин, О.А.Яковлев, Д.И.Скородумов // Ветеринарный врач. - 2010. -№ 3. - С. 17-20.

ВНИИВСГЭ, 2010 г., г. Москва, Звенигородское ш., д. 5. Заказ 353/3, тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Яковлев, Олег Андреевич

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Краткие исторические данные.

1.2. Характеристика возбудителя болезни.

1.2.1. Морфологические свойства.

1.2.2. Культуральные свойства.

1.3. Эпизоотологические данные.

1.4. Патогенез.

1.5. Диагностика кампилобактериоза животных.

1.5.1. Питательные среды для кампилобактерий.

1.5.2. Современные методы диагностики кампилобактериоза.

1.5.3. Идентификация кампилобактерий.

1.5.4. Антибиотикорезистентность кампилобактерий.

1.6. Анализ обзора литературы.

2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы.

2.2. Результаты собственных исследований.

2.2.1. Изучение дифференциально-диагно стических признаков кампилобактерии.

2.2.2. Сравнительное изучение ростообеспечивающих и селектив- 62 ных свойств ПЖА.

2.2.3. Оценка ростообеспечивающих свойств полужидкой и плотных питательных сред для культивирования кампилобакте

2.2.4. Определение уровня кампилобактерионосительства у цыплят-бройлеров и его зависимости от микробиоценоза кишечника.

2.2.5. Сравнительная оценка схем, средств и способов выделения термофильных кампилобактерий из продукции птицеводст

3. Обсумедения результатов собственных исследований.

4. Выводы.

5. Практические предложения.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Разработка контроля контаминации продукции птицеводства термофильными кампилобактериями"

Актуальность темы. Кампилобактериозы — заболевания животных и человека, проявляющиеся преимущественно в виде энтеритов1 и поражения органов размножения.

Резервуаром кампилобактерий являются, в первую очередь, дикая и домашняя птица, а также другие животные (Минаев В.И. 1988, Чайка H.A. и др. 1988, BakerR.C., 1987). Наибольшую опасность для здоровья человека и животных представляют термофильные кампилобактерии, в первую очередь, Campylobacter jejuni subspecies jejuni, затем Campylobacter coli, а из нетермофильных Campylobacter fetus subspecies fetus, вызывающие тяжело протекающие инфекции, осложненные сепсисом.

Данные научных публикаций свидетельствуют о том, что основными источниками возбудителя кампилобактериоза являются больные и клинически здоровые животные-бактерионосители, выделяющие его преимущественно с экскрементами и реже с молоком (Чайка H.A., и др., 1988, Deboer Е. et. al., 1990)

Значительную эпидемическую опасность представляет продукция животноводства, контаминированная возбудителем в процессе послеубойной обработки животных-бактерионосителей. Имеются сообщения о инфицировании людей, контактирующих с больными кампилобактериозом животными или бактерионосителями*(Чайка H.A., и др., 1988, Grant LH. et. al., 1980).

Исследований, посвященных выделению, идентификации, дифференциации кампилобактерий и решению проблемы кампилобактериоза, как животных, так и человека, выполнено достаточно много и, в первую очередь за рубежом (Bolton, F.J. et al. 1992., Report prepared for Ministry of Health Revised May. - 2003.). Впрочем, немало исследований, посвященных решению этой проблемы, выполнено и опубликовано и российскими исследователями (Минаева Н.З., 1992; Порин A.A., 1990; Алабугина Т.В., 1998; Шурышева Ж.Н., 2007 и др.). В итоге, на сегодняшний день предложено несколько способов выделения термофильных камлилобактерий из продукции животноводства, и попытки совершенствования их не прекращаются, но пока не выбраны универсальная среда и способ, которые можно было бы рекомендовать для исследования всех видов продукции.

Российская Федерация обладает развитой отраслью птицеводства, наряду с этим мясо птицы является одной из основных статей импорта. В частности, в 2006 г. США экспортировали в Россию около 700 тысяч тонн мяса птицы. В рамках задач Всемирной Торговой Организации, гармонизация стандартов безопасности пищевых продуктов имеет огромное значение. Ключевым аспектом гармонизации стандартов является признание эквивалентности различных аналитических методик торговых партнеров.

В связи с этим, исследования, посвященные оптимизации порядка выделения термофильных кампилобактерий от животных и продукции животноводства вообще, а птицеводства, в частности, можно считать актуальными.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы был подбор оптимальных средств, способов^ схем для монитогинга термофильных кампилобактерий.

Для достижения поставленной цели на разрешение были поставлены следующие задачи:

- изучить дифференциально-диагностические свойства термофильных кампилобактерий;

- подобрать питательные среды с выраженными ростообеспечивающи-ми свойствами для кампилобактерий;

- изучить возможность выделения-возбудителя из образцов содержимого тонкого отдела кишеченика или помета кур и цыплят;

- подобрать оптимальные схемы контроля продукции птицеводства на наличие кампилобактерий с использованием образцов смывов с тушек птицы или их частей, контаминированных кампилобактериями;

- разработать методические рекомендации по контролю продукции птицеводства на наличие кампилобактерий.

Научная новизна. Впервые получены данные сравнительного испытания ростообеспечивающих свойств ряда отечественных и зарубежных питательных сред для кампилобактерий. Проведено сравнение эффективности схем выделения кампилобактерий из патологического, а также биологического материала, неконтаминированного и контаминированного культурами термофильных кампилобактерий разных видов.

Практическая значимость. Предложены средства, способы и мето-логические подходы для проведения мониторинга термофильных кампилобактерий, что имеет важное противоэпизоотическое и противоэпидемическое значение, так как способствует разработке и проведению мероприятий по профилактике и.борьбе с вызываемыми ими заболеваниями животных и человека. Совершенствование диагностики кампилобактериозов способствует повышению эффективности проведения производственного контроля продукции(в условиях птицеперерабатывающих предприятий и диагностических исследований в ветеринарных лабораториях.

Апробация полученных результатов: Материалы« диссертации доложены на заседаниях кафедры микробиологиии ГОУ ВПО «МГУlib» в 20072009 гг. и опубликованы в 2-х научных статьях в журнале, рекомендованном ВАК РФ:

Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межкафедральном совещании сотрудников' ГОУ ВПО «МГУПБ».

Основные положения, выносимые на защиту. Данные о ростообеспе-чнвающих свойствах полужидкой и плотной питательных сред для термофильных кампилобактерий отечественного и зарубежного производства, эффективности селективных добавок для кампилобактерий, способов и схем их выделения из биологического материала.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Яковлев, Олег Андреевич

41 ВЫВОДЫ

1. Питательные среды Кампилобакагар (НПО "Питательные среды", г. Оболенск), Columbia Blood Agar Base M 144, Campylobacter agar Base M994 без селективных добавок и с селективными добавками: Blaser-Wang (FD006), Preston (FD 067) HiMedia и НИЦФ (С.-Петербург) обеспечивают рост кампилобактерий подвида jejuni, видов coli и lari. без достоверных различий (р>0,05) между средним количеством выросших на них колоний и обладают соответственно ростообеспечивающими свойствами в отношении термофильных бактерий рода Campylobacter и умеренно ингибирующими в отношении микрофлоры содержимого кишечника птицы.

2. Факт необеспечения роста заданного- количества КОЕ культуры штамма 70.2Т подвида jejuni Blood Free Campylobacter Selectivity Agar Base M887 (агар Кармали) как с слелективной добавкой, так и без нее, в сравнении с другими используемыми в работе питательными средами, свидетельствует о целесообразности применения при бактериологическом исследовании на кампилобактериоз более чем одной питательной среды.

3. Время роста монокультур штаммов кампилобактерий подвидов venerealis, jejuni; видов fetus, coli, lari и биовара bubulus и сопутствующей микрофлоры (культур штаммов протея, эшерихий, стафилококков и сальмонелл) на элективном ПЖА зависит от засевной дозы. Рост а кампилобактериий разных видов, посеянных в дозе 110, наблюдали через 24-48, а в дозе 10 микробных клеток — на 4-6 сутки с момента посева. Рост всех культур штаммов протея, эшерихий, стафилококка и сальмонелл был зарегистрирован через 24 часа инкубирования независимо от посевной дозы.

На ПЖА с селективными добавками рост указанной микрофлоры ингибирован в разной степени. Мнимальная доза кампилобактерий, обеспечившая рост культуры на селективной среде, составила: подвида о • о • з 4 о jejuni составила 10", coli — 10", lari — 10 , fetus — 10 ; venerealis — 10"; bubulus —101 микробных клеток.

Культуры штаммов протея, эшерихий, стафилококка и сальмонелл, посеянные в дозе 105, роста не дали.

4. ПЖА с селективной добавкой, в случае хранения в темном месте при температуре от 2 до 10 °С, сохраняет ростообеспечивающие свойства в отношении кампилобактерий и ингибирующие — в отношении сальмонелл, протея, стафилококков, эшерихий, иерсиний втечение 10 дней.

5. Термофильные кампилобактерии, выделяемые из содержимого кишечника цыплят и кур с использованиеми плотных и полужидких питательные сред, затруднительно идентифицировать, только по оценке их морфологических и культуральных свойств. Это обусловлено быстрой, начиная со 2 суток роста, диссоциацией бактерий (при бактериоскопическом исследовании мазков, культур, окрашенных по Грамму, выявляются коккоподобные структуры с нечетким контуром, розового цвета) и контаминацией культур посторонней микрофлорой. В связи с этим, для получения объективных результатов идентификации и типирования целесообразно проводить их комплексное тестирование, в том числе с использованием молекулярно-генетических.методов.

• 6. Максимальный диагностический эффект при тестировании смывов с куриных голеней и окрочков, контаминированных культурами термофильных кампилобактерий, обеспечивает внесение в смывы селективной добавки НИЦФ непосредственно перед инкубированием, в сравнении с добавкой цефоперазона, как перед началом инкубирования посевов и, тем более, через 4 часа с момента начала инкубирования.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты собственных исследований использованы при разработке:

- Методических рекомендаций по контролю продукции птицеводства на наличие кампилобактерий, утвержденных директором ФГУ «ВГНКИ» 09.02.2010 г.;

- проекта «Методические указания по выделению термофильных кампилобактерий», направленных для рассмотрения и утверждения в Россельхознадзор.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Яковлев, Олег Андреевич, Москва

1. Анисимова JI.B. Интенсификация выращивания кампилобактеров / JI.B. Анисимова, Б.А. Никаноров, Е.Г. Фирсанова и др. // Передовой науч.-производств. опыт в биолог, промышленности. М., 1980. — С. 8-11.

2. Ашмарин И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов / И.П. Ашмарин, H.H. Васильев, В.А. Амбросов. JL: Изд-во Ленинградского университета, 1971. - 78 с.

3. Башкатов Г. А. Кампилобактериоз овец / .Г-А. Башкатов и др.. М.: Колос, 1991.

4. Бондаренко В.З. Этиологическая роль подвидов Campylobacter в патологии животных и человека / В.З. Бондаренко, В.В. Белик // Матер. Всероссийской конф. Львов, 1988. - С. 415-416.

5. Воробьев A.A. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / A.A. Воробьев, A.C. Быков. — М.: Медицинское информационное агентство, 2003. — 256с.

6. Глушков А. А. Вибриоз (Кампилобактериоз) животных: лекция / A.A. Глушков. -М.: Моск. вет. акад. им. К.И. Скрябина, 1983. — 24 с.

7. Голиков A.B. Вибриоз животных и птицы / A.B. Голиков. М.: Россельхозиздат, 1978. - 112 с.

8. Голиков A.B. Селективная среда для выделения термофильных кампилобактеров / A.B. Голиков, И.В. Зенин // Ветеринария. — 1987. — № 4. С. 66-67.

9. Голиков A.B. Среда для выделения вибрионов из патологического материала / A.B. Голиков, В.В. Концевенко, Д.С. Лодьянова // Ветеринария.- 1975.-№6.-С. 104-105:

10. Голиков А.В. Твердая среда для выделения кампилобактеров / А.В. Голиков, А.С. Вовк, В.В. Полупанова // Ветеринария. 1980. - №6. — С. 69-70.

11. Горелов А.В. Антилизоцимная активность кампилобактеров и ее клиническое значение / А.В. Горелов, В.Г. Жуховицкий // Материалы международного симпозиума. -М., 1995. С. 90.

12. Демченко А.Г. Метод выделения Campylobacter jejuni из молока и его биологические свойства: автрореф. дис. . канд. вет. наук. — М., 1995. — 24 с.

13. Демченко. Г.Г. Возможность получения антигенного эритроцитарного кампилобактериозного диагностикума / Г.Г. Демченко // Меры борьбы с инфекционными, паразитарными и незаразными болезнями сельскохозяйственных животными в Казахстане. — Алма-Ата, 1985. С.

14. ЕжЖченко Р.И. Вибриоз крупного рогатого скота / Р.И. Евсейченко. -Минск: Урожай, 1968. 157 с.

15. Жакипбаева Б.Т. Микробиологическая характеристика и санитарноsэпидемиологические особенности кампилобактериозов на промышленных птицекомплексах: автрореф. дис. . канд. мед. наук. Алма-Ата, 1992-21 с.

16. Каравайчик A.A. Роль С. jejuni и С. fetus s. fetus в кампилобактериозной патологии собак / A.A. Каравайчик // Сб. науч. тр. М., 2001. - Т. 62. -С.175-185.

17. Кирик Д.Л. Особенности эпидемиологии кампилобактериоза в современных условиях / Д.Л. Кирик и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. -№ 3. - С. 60-63.

18. Кирьянов Е.А. Кампилобактериоз животных: лекция / Е.А. Кирьянов. -Уссурийск, 1992.-35 с.

19. Коротеева A.A. Питательные среды для культивирования кампилобактеров / A.A. Коротеева // Культуры клеток и тканей в ветеринарии; под ред. A.A. Коротеевой. М., 1983. - С. 90-91.

20. Кхокхер P.C. Серологическая типизация кампилобактериоза овец с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), / P.C. Кхокхер, М.'А. Лучко // Бюлл. ВНИИ эксперим. ветеринарии. — М., 1988. — Вып. 65. —

21. Сарэййва Н.В. Лабораторная диагностика кампилобактериоза: Проспект на ВДНХ / Н.В. Сафонова, Л.Б. Хазенсон, З.Н. Матвеева и др.. Л., 1987.-27 с.

22. Минаева; Н.З. Внутривидовое типирование кампилобактеров как элемент эпидемиологического надзора за кампилобактериозом: автрореф. дис. . канд. мед. наук. — М., 1992. — 24 с.

23. Определитель бактерий Берджи: В 2 т. / под ред. Д. Хоулт. — М., 1997. -Т. 2.-С. 44-45,61-64.

24. Панин А.Н. Методические указания по индикации возбудителя кампилобактериоза- C.jejuni методом полимеразной цепной реакции /

25. A.Н. Панин, К.В. Шумилов, К.Н. Груздев, И.Л. Обухов, О .Д. Скляров,

26. B.В. Покровский, Г.А. Шипулин, О.Ю. Шипулина. — Владимир, 1998. —

27. По^аЗйютина Л.В. Чувствительность возбудителей кампилобактериоза кнекоторым-антибиотикам / JI.BI Пожало стина, А.В. Солодовникова, А.А. Аваков // Антибиотики и химиотерапия. -М.: Медицина, 1992. -№8.-Т. 37.

28. Порин А.А. Совершенствование методов выделения бактерий рода Campylobacter: автрореф. дис. . канд. мед. наук. — Л., 1990. -24с.

29. Пособие для врачей ЦНИИ эпидемиологии. Микробиологическая диагностика заболеваний, вызванных микроаэрофильными изогнутыми бактериями. М., 2002*. - 42с.

30. Пыхтарева Е.И. Выделение и биологические свойства термофильных кампилобакгерий: автореф. дис. . канд. вет. наук — Белгород, 1990. -12с.

31. Равилов А.З. Микробиологические среды / А.З. Равилов, Р.Я. Гильмутдинов, М.Ш. Хусаинов. Казань: Фэн, 1999. -398 с.

32. Сидоров М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Б. Федотов. -М.: Колос, 1995. -319 с.

33. Скляров О.Д. Ростообеспечивающие и селективные свойства питательных сред для кампилобактеров / О.Д. Скляров // Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных: мат. междунар. научно-практич. конф. — Минск: Хата, 2000. С. 330-332.

34. Триленко П.А. Вибриоз крупного рогатого скота и овец / П.А. Триленко. М., 1961.-248 с.

35. Триленко П.А. Диагностика инфекционных абортов крупного рогатого скота / П.А. Триленко. М.: Сельхозиздат, 1956. - 287 с.

36. Чайка H.A. Кампилобактериоз / H.A. Чайка, Л.Б. Хазенсон, Ж.П. Бутцлер // Медицина. 1988. -№ 8. - С. 40-43.

37. Чайка H.A. Кокковидная форма возбудителей кампилобактериоза / H.A. Чайка, О.В. Рыбальченко, Н.В. Сафонова // Острые кишечные инфекции: сборник. Л., 1987. - Вып. 1Г. - С. 36.

38. Чайка H.A. Чувствительность кампилобактеров к антибиотикам / H.A. Чайка, Л.Б. Хазензон, Ж.П. Бутцлер и др. // Кампилобактериоз. — М., 1988.-С. 156-180.

39. Шаталов В.Ф. Совершенствование питательных сред для диагностики вибриоза / В.Ф. Шаталов, Л.П. Храпковская // Диагностика, профилактика- и меры борьбы с бол. с.-х. животных на фермах и комплексах: сб. науч. тр. — Новочеркасск, 1978. —№20. СЛ75-181.

40. Шишов В.П. Промышленное изготовление вакцины против кампилобактериоза крупного рогатого скота / В.П. Шишов, М.Я. Ярцев //Сб. научн. трудов, 1989.

41. Шманов К.С. Изоляция С. jejuni от животных / К.С. Шманов // Ветеринария. 1986. - №4. - С.37-38.

42. Шумилов К.В. Кампилобактериоз животных / К.В. Шумилов, О.Д. Скляров, Л.П. Мельниченко и др. // Ветеринария. 1999. - №9. - С. 613.

43. Aarestrup F.M., Nielsen Е.М., Madsen М., Engberg J. Antimicrobial susceptibility patterns of. thermophilic Campylobacter spp. from humans, pigs, cattle, and broilers in Denmark.// Antimicrob Agents Chemother.-1997.-vol.41 .-p.2244-2250.

44. Abbott S.L., Waddington M., Lindquist D. et al. Description of Campylobacter curvus and C.curvus-Like strains Associated with sporadic episodes of bloody gastroenteritidis and» Brainerd's diarrhea.// J.of Clin. Microbiol.-2005.-vol.43.No2.-p.585-588.

45. Acevedo E.S., Perez-Perez G., Felix Soto J.N., Hinojosa Ahumada M. & Bessudo D.M. (1987). Aislamiento de Campylobacter jejunr у Campylobacter coli en pollos. Veterinaria Mexico, 18,-p.l09-113.

46. Alios B.M: Campylobacter jejuni infections: update on-emerging issuers-and trends.// Clin. Infect. Dis.-2001.-vol.32.-p. 1201-1206.

47. Al-Mashat R.R. Campylobacter spp. in enteric lesions in cattle / Al-Mashat R.R., Taylor D J. //Vet. Rec. 1980. -V.107. -P.31-34.

48. Al-Mashat R.R. Production of diarrhea and dysentery in experimental calves by feeding pure cultures of Campylobacter fetus subspecies jejuni / Al-Mashat R.R., Taylor D.J. // Vet. Rec. 1980. - V. 107. - P.459-464.

49. Altekruse S.F., Stern N.J., Fields P.I., Swerdlow D.L. Campylobacter jejuni~an emerging foodborne pathogen. // Emerg Infect Dis.-1999.-vol.5.- p. 28-35.

50. Altekruse S.F., Swerdlow D.L. and Stern N.J. Campylobacter jejuni.// Vet. Clin. North. Am. FoodAnim. Pract.1998.-voL14.-p. 31-40.

51. Annual report on zoonoses in Denmark 2002. Danish Ministry of Food, Agriculture- and Fisheries cited 2006 Jan 2. // ijht. no http://www.dfvf.dk/Files/Filer/Zoonosecentret/Publikationer/

52. Annual report on zoonoses in Denmark 2003. Danish Ministry of Food, Agriculture and Fisheries cited 2006 Jan 2.// ijht. ITo http://www.dfVf.dk/files/filer/zoonosecentret/publikationer/

53. Ansary A. and Radu S. Conjugal transfer of antibiotic resistances and plasmids from Campylobacter jejuni clinical isolates.// FEMS Microbiol Lett.- 1992.-vol.2.-p.l25-128.

54. Atanassova V., Ring C. Prevalence of Campylobacter spp. in pou try and poultry meat in Germany.// Int J Food Microbiol.-1999.-vol.51.-p. 187190.58.

55. Bacon D.J., Aim. R.A., Burr D.H. et al. Involvement of a Plasmid in Virulence of Campylobacter jejuni.// Infection and Immunity.-2000.- Vol. 68, No. 8.- p. 4384-4390.

56. Berrang M.E.; Buhr R.J.; Cason J.A. Campylobacter recovery from -external and internal organs of commercial1 broiler carcass prior to scalding.// Poultry See- 2000- Vol.79 N 2 P. 286-290

57. Berrang M.E.; Buhr R.J.; Cason J:A. Campylobacter recovery from -external and internal organs of commercial broiler carcass prior to scalding.// Poultry Sa- 2000- Vol.79 N 2 P. 286-290

58. Beumer R.R:, deVries J. and Rombouts F.M. Campylobacter jejuni non culturable coccoid cells.// Int J Food Microbiol.-1992.-vol.-15.-p. 153-163

59. Biochemical and serological characterization of Campylobacter strains isolated from aborted bovine fetuses / Varga J., Fodor L., Fazekas B. et al. // Acta Vet. Hung. 1986. - V.34. - №1-2. -P.55-59.

60. Blaser M.J., G.P. Perez P.F., Smith C. M. et al. Extra intestinal Campylobacter jejuni and Campylobacter coli infections: host factors and strain characteristics.// J. Infect. Dis.-1986.-vol. 153.-p. 552-559

61. Bryner J. H. Dissociation studies of vibrios from the bovine genital tract /

62. Bryner J. H., Frank A. H., O'Berry P. A. // Am. J. vet. Res. 1962. - V.23. -P.32-41.

63. Bruce D., Zochowski W. &'Ferguson L.R. (1977). Campylobacter enteritis. British Medical Journal, 2, -pi219-1220.

64. Buck G.E., Parshall, K.A. and Davis, C.P. Electron microscopy of the coccoid form of Campylobacter jejuni.// J Clin Microbiol.-1983.-vol.18.-p. 420-421.

65. Campbell S. L., Cookingham C. A. The enigma of winter dysentery.// Cornell. Vet., 1978

66. Campylobacter enteritis: clinical and epidemiologic features / Blaser M.J., Berkowitz J.D, La Force F.M. , Cravens J., Reller L.B., Wang H.-L.L. // Ann. intern. Med. 1979. - V.91. -№ 2. - P.179.

67. Cardinale E., Dromigny J.-A., Tall F. et al. Fluoroquinolone Susceptibility of Campylobacter Strains, Senegal // Emerg. Infect. Dis.-2003.- Vol. 9, No. 11, ijht. no: http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol9noll/02-Q693

68. Cari S., Blair E.//J. Bacteriol., 1964, V. 88

69. Chow A. Susceptibility of Campylobacter fetus to 22 antibacterial agents / Chow A., Patten V., Bednoir D. // Antimicrob. Ag. Chemother. 1978. -V.13.-№3.-P. 416-418.

70. Coker A.O., Isokpehi R.D., Thomas B.N. et al. Human Campylobacteriosis in Developing Countries // Emerg. Infect. Dis.-2002.-vol.8 No3.- liht. no http://www.cdc.gOv/ncidod/EID/vol8no3/01 -0233 .htm

71. Cottbal G.E. Campylobacter and vibrio / Cottbal G.E. // Manual of standardized methods for veterinary microbiolody. Cornell Univ. Press, Ithaca, 1978. - P.461-471.

72. Cottral G.E. Campylobacter and vibrio. In "Manual of standardized methods for veterinary microbiolody"// Cornell Univ. Press., Ithaca, 1978

73. Deming M.S., Tauxe R.V., Blake P. A., Dixon S.E. et al. Campylobacterenteritis at a university: transmission from eating chicken and from cats.//Am. J. Epidemiol.-1987.-vol.l26.-p.526-534.

74. Disk sensitivity testing for Campylobacter jejuni / Vanhoof R., Dierickx R., Coignau H., Hubrechts J.M. Kaufman L., Butzler J.P. // Eur. J. Clin. Microbiol. 1984. -V. 3. -№ 2. - P. 160-162.

75. Eberhart-Phillips J., Walker N., Garrett N., Bell D., Sinclair D. et al. Campylobacteriosis in New Zealand: results of a case-control study. // J. Epidemiol. Community Health.- 1997.-vol. 51.-p.686-691.

76. Effler P., Ieong M.-C, Kimura A., Nakata M. et al. Sporadic Campylobacter jejuni infections in Hawaii: associations with prior antibiotic use and commercially prepared chicken. // J. Infect. Dis.- 2001.-vol.183.-p.H52-l 155.

77. Endtz H.P., Ruijs G.J., vanKlingeren B. et al., Quinolon resistance in Campylobacter isolated, from man and poultry following the introduction'of fluoroquinolones in veterinary medicine.// J. Antimicrob. Chemother-1991.-vol.27.-p: 199-208.

78. Engberg J., Aarestrup F.M., Taylor D.E., Gerner-Smidt P., Nachamkin I. Quinolone and macrolide resistance in Campvlobacterjejuni and C coli: resistance mechanisms and trends in human isolates.// Emerg Infect Dis.-2001 .-vol.7.-p.24-34.

79. Evaluation of transport and storage techniques for isolation- of Campylobacter fetus subsp. jejuni from turkey fecal specimens / Luechtefeld N.W., Wang W-L.L., Blaser M.J., and L.B. Reller. // J. Clin. Microbiol. -1981. V.13. — P.438-443.

80. Frost J.A., Thwaites R.T. Drug resistance in C. jejuni, C. coli and C. lari isolated from humans in Wales and North West England during 1997.// Working Paper 20.10b. Geneva: World Health Organization; 1998.

81. Frost Oza A.N. Serotyping scheme for Campylobacter jejuni and Campylo' ■ : nobacten coli based on direct agglutination of: heat-stable antigens / Frost Oza A.N., Thwaites R.T., Rowe B. // J. Clin. Microbiol:1998.-V.36. № 2. — P.335-339.

82. Giesendorf B.A., Quint W.G., Henkens M.H.,Stegeman Hi et al. Rapidand sensitive detection of Campylobacter spp. in chicken products by using the polymerasechain reaction;// Appl. Environ. Microbiol.- 1992.-vol. 58.-p. 3804-3808.

83. Grant I.H., Richardson N.J. & Bokkenheuser V.D. (1980). Broiler chickens as potential, source of Campylobacter infections in humans. Journal of Clinical Microbiology 11,-p. 508-510.

84. Griffiths P.L. and Park, R.W.A. Campylobacters associated with human diarrhoeal disease.//J. Appl. Bacteriol.-1990.-vol. 69.-p. 281-301.

85. Gupta A., Nelson J.M., Barrett L.T. et al. Antimicrobial resistance among Campylobacter strains, United States, 1997-2001.// Emerg: Infect. Dis.-2004.-vol. 10 No.6;- u,ht. no:http://www.cdc.gov/ncidodMD/voll0no6/03-0635.htm

86. Hanninen M. The occurrence of thermophilic Campylobacters in mink and an experimental oral infection of pregnant mink by C. jejuni / Hanninen M.,

87. Erman T., Valtonen M. // Acta veter. Scand.-1988. V.29. - №3-4. - B.463-468.

88. Hanninen M.L., Sarelli L., Sukura A., On S.L. et al. Campylobacter hyointestinalis subsp. hyointestinalis, a common Campylobacter species in reindeer.// J. Appl. Microbiol.- 2002.-vol.92.- p.717-723.

89. Hanninen M.X., Pajarre S., Klossner M.L., Rautelin H. Typing of human Campylobacter jejuni isolates in Finland by pulsed-field gel electrophoresis. //J. Clin. Microbiol.- 1998.-vol.36.-p.l787-1789.

90. Harvey S. M. Hippurate hydrolisis by Campylobacter fetus s.// Clin. Microbiol., 1980

91. Hazeleger W.C., Janse J.D., Koenraad P.M.F.J. et al. Temperaturedependent membrane fatty acid and cell physiology changes in coccoid forms of Campylobacter jejuni.// Appl Environ Microbiol.-1995.-vol. 61.-p. 2713-2719.

92. Hebert G., Hollis D. S., Weaver R. E., Lambert M. H., Blaser M. J., Moss C.H. 30 years of campilobacters: biochemical characteristics and a biotyping proposal for Campilobacter jejuni// J. clin. Microbiol;, 1982

93. Hofstad M.S. Hepatitis chickens. A roport of progress in vererinapy medical rescareb / M.S. Hofstad, //Vet. Med. Res. Jnst., Statocoll. Ames. Jowa, 1956. - P. 56-58i

94. Hoge C.W., Gambel J.M., Srijan A., Pitarangsi C, Echeverria P. Trends in antibiotic resistance among diarrheal pathogens isolated in Thailand over 15 years.//Clin. Infect. Dis .-1998.-vol.26.-p.341-345.

95. Hum S. Diagnosis of bovine venereal campylobacteriosis by ELISA / Hum S., Quinn C., Kennedy D. // Aust Vet. J. 1994. - V.71. - № 5. - P.140-143.

96. Improved media for growth and aerotolerance of Campylobacter fetus / George H.A.; Hoffinan P.S., Smilbert R.M., Kreig N.R. // J. Clin. Microbiol. 1978. - V.8. - № 1. -P.36-41.

97. Inglis G.D., Morck D.V., McAllister V.A. et al. Temporal prevalence ofantimicrobial resistance in Campylobacter spp. from beef cattle in Alberta feedlots.// Appl. Environ. Microbiol.- 2006.-vol.72.-p.4088-4095.

98. Isolation of Campylobacter fetus subsp. jejuni from migratory Waterford / Luechtefeld N.W., Blaser M.J., Reiler L.B. et al. // J. Clin. Microbiol. 1980. - V.12. - №3. - P.406-408.

99. Itoh T., Tadano K., Obata H., Shingaki K. et al. Emergence of quinoloneresistance in clinical isolates of Campylobacter jejuni in Japan. In: Newell

100. DG, Ketley J, Feldman RA, editors. In: Abstracts of the 8th International Workshop on Campylobacters, Helicobacters and Related Organisms; 1995 Jul 10-13; t Winchester, United Kingdom. New Haw, Addlestone, England:

101. GehträT.yef&räam^ IlChpriflfoi^lS^- pSfööigaki K. et al. Emergence of quinoloneresistance in clinical isolates of Campylobacter jejuni in Japan. In: Newell DG, Ketley J, Feldman RA, editors. In: Abstracts of the 8th International

102. Workshop on Campylobacters, Helicobacters and Related Organisms; 1995 Jul 10-13; t Winchester, United Kingdom. New Haw, Addlestone, England:

103. Jacobs Reitsma W.F. Campylobacter bacteria in breeder flocks.// Avian.

104. Dis.-1995.-vol:39.-p.355-359.

105. James B. Peter // Rewiews of Infectious Diseases. 1991. - 13. - P.166-171.

106. Jones D.M., Sutcliffe E.M. and Curry A. Recovery of viable butnonculturable Campylobacter jejuni.// J Gen. Microbiol.-1991.-vol. 137.-p.

107. Vibrios (Vibrio jejuni) associated with intestinal disorders ofcows and calves / Jones F. S., Orcutt M. T., Little R. B. // J. exp. Med. — 1931. V.53. - P.853-864.

108. Jones K., Howard S., Wallace J.S. Intermittent shedding ofthermophilicCampylobacters by sheep at pasture.// J. Appl. Microbiol.1999.-vol. 86.-531-536.

109. Jorgensen F., Bailey R., Williams S., et.al. Prevalence and numbers of

110. Salmonella and Campylobacter spp. on raw, whole chickens in relation to sampling methods.// Int. J. Food Microbiol.-2002.-Vol. 76.-p. 151-164.

111. Kapperud G., Skjerve E., Bean N.H., Ostroff S.M., Lassen J. Risk factors forsporadic Campylobacter infections: results of a case-control study in. southeastern Norway.//! Clin.- Microbiol. -1992.-vol.30.-p.3117-3121".

112. Karmali M.A. Application of the Foster principle to isolation of Campylobacters from stools / Karmali M.A., Fleming1 P.C. // J. Clin. Microbiol. 1979. - V. 10. - № 2. - P. 245-247.

113. Karmali M.A. Campylobacter enteritis / Karmali M.A., Fleming P.C. // Can. Med. Ass. J. 1979.-V. 120. - № 12.-P.1525-1532.

114. Karmali M.A. Taxonomy of the genus Campylobacter / Karmali, M.A., Skirrow M.B. // In J.P. Butzler (ed.). Campylobacter Infection in Man and Animals. CRC Press, Boca Raton, FL, 1984. - P.l-20.

115. Keener K.M1, Bashor P.A., Curtis. P.A. Comprehensive review ofCampylobacter and poultry processing // Comprehensive review in food science and*food safety.-2004.-vol.3.- 12p.

116. Ketley J.M. Pathogenesis of enteric infection by Campylobacter./ZMicrobiology. -1997.-V01. 143.-p. 5-21

117. King E.O. Human infection withi Vibrio fetus and a closely related9vibrio.//J. Infect. Dis.-1957.-vol.10T.-p.l 19-128.

118. Kliptein F. et al.// Infect. Immun., 1985, V.50

119. Kosunen T. U. Serology of Campylobacter fetus ss. jejuni. 1. Analysis of Campylobacter jejuni antigens with monoclonal antibodies / Kosunen T. U., Danielsson D., Kjellander J. K. // J. Clin. Microbiol. 1984. -V. 19. - №2. -P.129-133.

120. Kosunen T. U. Serology of Campylobacter fetus ss. jejuni. 1. Analysis of

121. Campylobacter jejuni antigens with monoclonal antibodies / Kosunen T. U., Danielsson D., Kjellander J. K. // J. Clin. Microbiol. 1984. - V.19. - №2. -P.129-133.

122. Kosunen T. U. Serology of Campylobacter fetus ss. jejuni. 2. Serotyping of live bacteria by slide, latex and co- agglutination tests / Kosunen T. U., Danielsson D., Kjellander J. K. // Acta pasth. microbiol. Scand. 90 B. -1982. - P.191-196.

123. Lastovica A.J. Le Roux E., Prevalence and optimal detection of C.upsaliensis in stool specimens.// Clin Infect Dis.-2003.-vol.36.-p. 16241625.

124. Lauwers V. A. Campylobacter serotyping and epidemiology / Lauwers V. A., Vlaes L., Butzler J. P. //Lancet. 1981. - V.17 -№1. - P. 158-159.

125. Lee. E.S.// Infect. Immun., 1983.

126. Li C.C., Chiu C.H., Wu J.L., Huang Y.C., Lin T.Y. Antimicrobialsusceptibilities of Campylobacter jejuni and coli by using E-test in Taiwan.// Scand. J. Infect. Dis.- 1998.-vol.30.-p.39-42.

127. Lim Y.S., Tay L. A one-year study of enteric Campylobacter infections in Singapore.//J. Trop. Med. Hyg.-1992.-vol.95.-p. 119^-123.

128. Lindblom G. B\, Sjogren E., Hansson-Westerberg J. and B. Kayser. Campylobacter upsaliensis, C.sputorum sputorum and C. concisus as common causes of diarrhoea in Swedish children. Scand.// J.Infect. Dis.1995.-vol.27.-p.l87-188.

129. Lior H. Campylobacter butzleri. A serotyping scheme for Campylobacterbutzleri / Lior H., Woodward D.L. // Microb. Ecol. Health and Disease — 1991. №4, Spec. Issue. -P.593.

130. Logue CM., Sherwood J.S., Elijah L.M., Olah P.A., Dockter M.R. The incidence of Campylobacter spp. on processed turkey from processing plants in the midwestern United States.// J. Appl. Microbiol.- 2003.- vol.95,-234

131. Mkwen R. P. L., A. van Belkum, Wagenaar J. A., et al. Lack of Association between the Presence of the pVir Plasmid and Bloody Diarrhea in

132. Campylobacter jejuni Enteritis.//Journal of Clinical Microbiology.-2006.-Vol. 44, No. 5p.-p. 1867-1868.

133. Mazick A., Ethelberg S., Moller Nielsen E. et al. An outbreak of Campylobacter jejuni associated" with consumption of chicken, Copenhagen.//Euro Surveill.- 2006.-vol. 11.-5 p.

134. McCaid L.F., Besser R.E., Hughes J.M. Antimicrobial drug prescription in ambulatory care settings, United States, 1992-2000.// Emerg. Infect. Dis.-2003,-vol 9.- p.432-437.

135. McCoy E.G., Doyle D., Wiltbergsr H., Burda K., Wimter A. Fxagelas ultra. structure and flagela- associated-antigens oi Campylobacter fetus// J Bact.,1975

136. McFadyean F. Final report of the Departamental Committee appointed by the Board and Agriculture and Fisheries to inquire into epizootic abortion / McFadyean F., Stockman S. // Appendix to part II. Abortion in sheep -Wiley, London. 1913. - P.l-64.

137. Medema G.J., Schets F.M:, van de Giessen A.W. and Havelaar, A.H. Lack of colonisation of 1 day old chicks by viable non-culturable Campylobacter jejuni.//J Appl Bacterioi:-1992.-vol. 72.-p. 512-516.

138. Megraud F. Campylobacter jejuni en pathologie humaine. I. Aspects-cliniques et therapeuttques / Megraud F., Latrille J. // Pathol. Biol. (Paris). -1981. V.29.- №4. - P.245-253.

139. Megraud F. Campylobacter jejuni en pathologie humaine. II. Diagnostic biologique et epidemiologic / Megraud F., Latrille J. // Path. Biol. 1981. -V.29.-№5.-P.305-314.

140. Mellick P.W. Diagnosis of vibriosis in the bull by use ot the fluorescent antibody technique: / Mellick P.W., Winter A. J., McEntee K. // Cornell. Vet. -1965. V.55. -P.280-294.

141. Miller V.A., Jensen R., Ogg J. E. Bacteremia in pregnant sheep following oral administration of vibrio fetus// Am J. vet . Res, 1961

142. Nachamkin I., M.J. Blaser and L.S. Tompkins. Campylobacter jejuni Current Status and; Future Trends.// American Society for Microbiology, WashingtonsD.C.-1992.

143. Nachamkin I., Ung H. and Ei M; Increasing fluoroquinolone resistance in Campylobacter jejuni, Pennsylvania, USA 1982-2001.// Emerg. Infect. Dis;-2002.-vol: 8,-p. 1501-1503.

144. Neal K.R., Slack R.C. Diabetes mellitus, anti-secretory drugs and other risk factors for Campylobacter gastro-enteritis in adults: a case-control study.//

145. Epidemiol. Infect- 1997.-vol. 119.-307-311.

146. Newsam I.D. Diagnosis of bovine vibriosis. Past I. The production, and use of standard suspensions of vibrio fetus agglutinating antigen / Newsam I.D., Monsbourgh M.J. // Aust. Vet. J. 1967. - V.43. - №7. -P.237-242.

147. Nielsen E.M., Nielsen N.L. Serotypes and typability of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from poultry products.// Int. J. FoodMicrobiol.- 1999,-vol. 46.-p. 199-205.

148. Nirdnoy W., Mason C.J. and Guerry P. Mosaic Structure of a Multiple- Drug-Resistant, Conjugative Plasmid from Campylobacter jejuni //Antimicrobial Agents and Chemotherapy.-2005.- Vol. 49, No. 6.- p. 2454-2459.

149. Oberhelman R.A., Taylor D.N. Campylobacter infections in developing countries. In: Nachamkin I., Blaser M.J., editors. Campylobacter, 2nd edition. Washington: American Society for Microbiology.- 2000.- p. 139-53.

150. Oliver J.D. The viable but nonculturable state in bacteria.// J Microbiol.-2005,-vol. 43,-p. 93-100.

151. Oosterom J., den Uyl C.H., Banffer J.R., Huisman J. Epidemiologicalinvesti-gations on Campylobacter jejuni in households with a primary infection.// J. Hyg. (Lond).- 1984.-vol.93 .-p.325-32.

152. Osano O., Arimi S.M. Retail poultry and beef as sources of Campylobacter jejuni.//J. East. Afr. Med.-1999.-vol.76.-141-143.

153. Osburn B.I. Experimentally induced Vibrio fetus var. intestinalis infectionin pregnant cows / Osburn B.I., Hoskins R.K. // Am. J. Vet. Res. 1970: — V.31'. -№10.-P.1733-1741.

154. Owen R.J. Determination of DNA of bade composition, of base composition from melting profiles in delute buffers / Owen R.J., Hill L.R., Lapage S.P. // Biopolymers, 1969.-7. P. 503-506.

155. Pearson A. et al.// Campylobacter II Proceeding of the Second Internatiol work- shop on Campylobacter infections. London, 1983.

156. Pearson A.D., Greenwood M., Healing T.D., et al. Colonisation* of broilerchickens by waterborne Campylobacter jejuni.// Appl Environ Microbiol.-1993,-vol 59,-p. 987-996.

157. Pearson A.D., Greenwood M1H., Donaldson J. et al. Continuous sourceoutbreak of campylobacteriosis traced to chicken.// J. Food Prot-2000.- vol.63.-p. 309-14.

158. Penner J. L. Passive hemagglutination technique for serotyping Campylobacter fetus subsp. jejuni on the basis of soluble heat-stable antigens / Penner J. L., Hennessey J. N. // J. Clin. Microbiol. 1980. - V.12. - P.732

159. Picard K. et al. // Campylobacter III. London, 1985. - P. 171-172.

160. Prescott J.L. Campylobacter jejuni enteritis in man and domestic animals / Prescott J.L., Munroe D. L. // J. Am. Vet. Med*. Ass. 1982. - V.181. -P.1524-1530.

161. Quinones-Ramirez E.I., Vazquez-Salinas C, Rodas-Suarez O.R., Ramos, Flores M.O. et al. Frequency of isolation of Campylobacter from roastedchicken samples from Mexico City.// J. Food Prot. -2000.-vol. 63 .-p. 117119.

162. Rautelin H., Hanninen M.L. Campylobacters: the most common bacterial enteropathogens in the Nordic countries.// Ann Med.-2000.-vol.32.-p. 440-445.

163. Riley R.W., Finch M.J. Results of the first year of national surveillance of Campylobacter infection in the United States.// J. Infect. Dis.-1985.-vol.151 .-p.956-959.

164. Rogol M. Detection of resistant isolates of Campylobacter jejuni' by the disc susceptibility method / Rogol M., Michel J. // Eur. J. Clin. Microbiol. 1984. -V.'3'.-N. l.-P. 40-42.

165. Rollins D.M. and Colwell R.R. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment.//Appl Environ Microbiol.-1986.-vol. 52.-p. 531-538.

166. Saenz Y., Zarazaga M., Lantero M:, Gastanares M.J. et al. Antibiotic resistance in Campylobacter strains ¡isolated from animals, foods, and humans in Spain in 1997-1998. //Antimicrob. Agents Chemother.- 2000.-vol. 44.-p.267-271.

167. Saha S.K., Saha S. and Sanyal S.C. Recovery of injured Campylobacter jejunicells after animal passage.// Appl Environ Microbiol.-1991.-vol.57.- p. 33883389.

168. Sails A.D., Fox A.J., Bolton F.J., Wareing D.R., Greenway D.L., A real time

169. PCR assayfor the detection of Campylobacter jejuni in foods after enrichment culture.// Appl. Environ.Microbiol.-2003.-vol. 69.-p. 13831390.

170. Schorr D., Schmid H., Rieder H.L., Baumgartner A.et al. Risk factors for Campylobacter enteritis in Switzerland.// Zentralbl. Hyg. Umweltmed.-1994.-vol.l96.-p.327-337.

171. Sebald M. Teneur en base de 1 'and et classification des Vibrions / Sebald M., Veron M. // Ann. Inst. Past. 1963. - V. 105. - P. 897-910.

172. Shane S.M., Gifford D.H. & Yogasunram K. (1986). Campylobacter jejuni contamination of eggs. Veterinary Research Communications, 10, -p 487492.

173. Skirrow M.B., Blaser M.J. Clinical aspects of Campylobacter infection. In: Nachamkin I, Blaser MJ, editors. Campylobacter.// ASM Press.-Washington.- 2000.- p. 69-88.

174. Smibert R.M. Vibrio fetus var. intestinalis isolated from the intestinal contents of birds / Smibert R.M. // Am. J. vet. Res. 1969. - V.30. - №8. -P.1437-1442.

175. Smibert R.M. Genus II Campylobacter Sebald and Varon 1963 / Smibert R.M., Buchanan S., Gibbons N.E. // In Bergeys Manual of Determinative Bacteriology edited by R. Wilkins, Baltimore. 1974. - P.207-212.

176. Smibert R.M. The genus Campylobacter / Smibert R.M. // Ann. Rev. Microbiol. 1978. - V.32. - P.673-709.

177. Smith T. The etiological relation of Spirilla {Vibrio fetus) to bovine abortion / Smith T. // J. exp. Med. 1919. - V.30. - P.313-323.

178. Specific identification of Campylobacter fetus by PCR targeting variable regions of the 16 S rDNA / Oyarzabal O., Wesley I., Harmon K., Schroeder

179. Tucker L., Barbaree J.M., Lauerman L.H., Backert S., Conner D.E. // Vet. Microbiol. 1997. - V.58. - №1. -P.61-71.

180. Stem N.J., Fedorka-Cray P., Bailey J.S., et.al. Distribution of Campylobacter spp. in selected U.S. poultry production and processing operations.//.!. Food Prot.-2001.-Vol. 11-p. 1705-1710.

181. Stern N.J., Robach M.C. Enumeration of Campylobacter spp. in broiler feces and in corresponding processes carcasses. // J. Food Prot.-2003.-vol. 66,-p. 1557-1563.

182. Studahl A., Andersson Y. Risk factors for indigenous Campylobacter infection: a Swedish case-control study.// Epidemiol. Infect. -2000.-vol.l25.-p.269-75.

183. Svedhen A. Kaijser B., Sjorgen E. // J. Hyg.-1981-vol.87.-p. 421-425.

184. Tholozan J.L., Cappeleir J.M., Tissier J.P., Delattre J.P. and Federighi M.

185. Physiological characterisation of viable-but-nonculturable Campylobacterjejuni cells.// Appl Environ Microbiol.-1999.-vol. 65.-p. 1110-1116.

186. Trasz D.M., Keelan M., Ahmed-Bentley J. et al. pVir and Bloody Diarrhea in

187. Campylobacter jejuni Enteritis// Emerging Inf.Dis.-2005.-vol.11, No 6.- ijht. no http://www.cdc.gov/ncidod/EID/voll Ino06/04-1052.htm

188. Typing of heat-stable and heat-labile antigens of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli by coagglutination / Wong K.H. Skelton S.K. Patton C.M. Feelev J.C. Morris G.// J. Clin. Microbiol. 1985. - V. 21. - №5. -P.702-707.

189. Uematsu K. Campylobacter fetus subspecies fetus / Uematsu K. et al. // Japan Veterinary Medical Association. 1990. - V.43. - №10. -P.713-718.

190. Van Looveren M, Daube G, De Zutter L. et al. Antimicrobialsusceptibilities of Campylobacter strains isolated from food animals in Belgium.//!. Antimicrob. Chemother.-2001.-vol.48.-p.235-240.

191. Vandamme P. Microbiology of Campylobacter infections: taxonomy of the family Campylobacteracea. In Campylobacter ed. Nachamkin, I. and Blaser, M.J.// Washington, DC: ASM Press.-2000.- pp. 3-26

192. Vandenberg O., Dediste A., Houf K., Ibekwem S. et al. Arcobacter species219. in humans.//Emerg. Infect. Dis.-2004.-vol.10.-p. 1863-1867.

193. Vanhoof R., Gordts., Dierickx R. et al. Bacteriostatic and bactericidae activities of 24 antimicrobial agents against Campylobacter fetus subs. Jejuni.//Antimicrob.agents chemoter.-1980.-v.l8.-p.l 18-121.

194. Vinzent R. Septicemie au cours de la grossess due a un vibrion; avortemen consecutive / Vinzent R., Dumas J., Picard N. // Bull. Acad. Natl. Med. (Paris). 1947. - V.131. -P.90-92.

195. Weijtens M.J., van der Plas J., Bijker P.G., Urlings H.A. et al. The transmission- of Campylobacter in piggeries; an epidemiological study.// J. Appl. Microbiol.- 1997.-vol.83.-p. 693-698.

196. V015fte P.L., Baker A.R., James W.O. Strategies to control Salmonella and Campylobacter in raw poultry products.// Rev. Sci. Tech.-1997.-vol.16.-p.525-541.

197. Wistrom J., Norrby S.R. Fluoroquinolones and bacterial enteritis, when and for whom? //J. Antimicrob.Chemother.-1995.-vol.36.-p. 23-39.