Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка иммунобиотехнологического способа регуляции аппетита, обмена веществ и продуктивности свиней методом иммунонейтрализации холецистокинина

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммунобиотехнологического способа регуляции аппетита, обмена веществ и продуктивности свиней методом иммунонейтрализации холецистокинина"

¿ЧесЮсд

> ■ г. •-->

1 < ^ 1,'г,

- 9 (МЛ

На правах рукописи

НАЗАРОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

РАЗРАБОТКА ИММУЮБИОТЕШОМГНЧЕСКОГО СПОСОБА РЕГУЛЯЦИИ АППЕТИТА, ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ И ПРОДУКТИВНОСТИ СШЕЙ МЕТОЛОМ ИИМУНОНЕЙТРАШЗАЦИИ ХОМЕЦИСГГОКИНМНЛ

03.00.13. - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидат биологических наук

БОРОВСК - 1997

Работа выполнена в лаборатории иммунобиотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

В. А. Галочкин Официальные оппоненты : доктор биологических наук,

Ведущее учреждение - Всероссийский институт животноводства

на заседании Диссертационного Совета Д 020.17.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Адрес института: 249010, г. Боровск-3, Калужская область,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

профессор ¡0.!'. ¡Намиерев доктор биологических наук, Л. В. Харитонов

Защита диссертации состоится

¿ШУЯ 1997 г.

ВНИИФБиП с/х животных.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат сельскохозяйственных наук

Г.В. Дворянчиков^

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследований. В ряду известных способов регуляции продуктивности сельскохозяйственных животных видное место задает новый и интенсивно разрабатываемый во всем мире иммунобио-гехнологический подход. Принцип этого направления заключается в 1ммунокоррекции избранной для регуляции физиологической функции эрганизма методом иммунонейтрализации биологически активного ве-цества - ключевого регулятора данной функции. Иммунонейтрализация 'иммуноингибирование) достигается за счет иммунизации животных шмуногенными конъюгатами синтетических аналогов избранного эндогенного вещества. Результатом данной манипуляции является выра-зотка животнш антител способных избирательно взаимодействовать и шшать биологической активности конкретный регуляторный пептид. Вследствие такого воздействия наступает коррекция (аутоиммунокор-эекция) конкретной функции, что должно повлечь за собой достиже-гае желаемых биохимических и зоотехнических эффектов.

Проблема регуляции аппетита имеет большое значение для сельскохозяйственной науки и практики. Известно, что рост и развитие звиней с консолидированным генотипом лимитируется количеством готребляемых кормов. Поэтому, логично поставить задачу повысить фодуктивность свиней, стимулируя у них аппетит. На сегодня достоверно установлено, что среди многочисленных факторов причастных с регуляции аппетита, одним из основных физиологических ингибито->ов аппетита является гормон пептидной природы, синтезируемый ¡труктурами желудочно-кишечного тракта и мозга - холецистокинин ;ХЦК). Следовательно, вызвав снижение концентрации циркулирующего ЦК в организме свиней, можно стимулировать у них аппетит, а знают повысить продуктивность животных.

- г -

Цель и задачи исследований: Настоящая работа предпринята целью экспериментальной проверки рабочей гипотезы о потенциалы) возможности повышения потребления корма, интенсификации обме веществ и увеличения продуктивности свиней, используя прием aj иммунонейтрализации эндогенного ХЦК. Из наиболее важных задач р ботой планировалось:

1. Создание иммуногенных конъюгатов окта- и тетрапептидн фрагментов ХЦК с природными и синтетическими полимерными носит лями. Изучение возможности этих конъюгатов вызывать иммунный о вет организма на пептиднне фрагменты и способности образовали на них антител нейгрализовывать эндогенный ХЦК.

2. Отработка- оптимальной схемы иммунизации и подбор наибол эффективных иммуностимуляторов и адъювантов.

3. Получение новых знаний о принципиальной возможности per: ляции аппетита свиней с использованием приема индуцированной а; тоиммунонейтрализации эндогенного ХЦК введением конъюгатов окт< и тетрапептидных фрагментов этого гормона (ХЦК-8 и ХЦК-4) с пр] родными и синтетическими полимерными носителями.

4. Изучение влияния примененного типа воздействия - иммунс нейтрализации ХЦК на отдельные стороны метаболизма, скорость рос та, продуктивность свиней и качество получаемой продукции.

Научная новизна. Впервые показана принципиальная возможное) регуляции аппетита, обмена веществ и продуктивности свиней ис пользуя метод иммунонейтрализации эндогенного ХЦК введением яа вотным иммуногенных конъюгатов как ХЦК-8, так и ХЦК-4 с носителя ми различной природы. Показано, что в условиях иммунонейтрализг ции ХЦК повышение потребления кормов не приводит к снижению и конверсии в продукцию. Полученные данные позволяют постулироват

аличие перераспределения метаболических потоков у иммунизирован-ых животных на преимущественный синтез мышечных белков, по срав-ению с жировыми компонентами тела, при сохранности величин ос-овных показателей обмена веществ в рамках физиологической нормы, ледствием этих процессов в организме свиней явились такие поло-ительные изменения, как повышение выхода мяса и снижение коли-ества жира в туше, а также уменьшение содержания жира в мышечной кани, при повышении количества белка. Показано, что для регуля-щ обмена веществ существенное значение может иметь, ранее неи-учавшийся с этой целью, тетрапептидный фрагмент ХЦК. Разработан использован в работе иммуноферментный способ оценки титра анти-ел к ХЦК-8 и ХЦК-4 в составе различных конъюгатов.

Научно-практическая значимость работы. Предпринятую нами по-ытку регуляции аппетита, обмена веществ и продуктивности свиней етодом аутоиммуноингибирования эндогенного ХЦК с помощью иммуно-енных конъюгатов ХЦК-8 и ХЦК-4 можно оценить как начальный поло-;ительный опыт в плане осуществления поиска иммунобиотехнологи-еских способов регуляции продуктивности сельскохозяйственных жи-отных. Полученный экспериментальный материал мы рассматриваем, реаде всего, с точки зрения не столько ответов на поставленные опросы, сколько поиска и постановки новых вопросов и полагаем, то он послужит основой для дальнейшего развития теоретических редставлений на сложном пути практической реализации идеи "имму-обиотехнологического конструирования" животных с управляемыми бменом веществ и продуктивностью. Частным пунктом этой глобаль-ой программы явится разработка одной из вакцин нового типа и но-ого поколения - "вакцины аппетита".

Апробация работы. Основные положения диссертационной рабоа доложены и обсуждены на второй Международной конференции "Акту альные проблемы биологии животноводства" (Россия, Боровск, 1995) межлабораторном заседании ВНШФЕиП сельскохозяйственных животны (Боровск, 1997). Работа частично финансировалась РФФИ, гран N-94-04-12520а. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения обзора литературы, описания материалов и методов исследования результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов Изложена страницах машинописи, содержит 16 таблиц и 5 ри-

сунков. Библиография 318 наименований, в том числе 282 на иностранных языках.

Положения выносимые на защиту.

1. Конъюгаты синтетических С-концевых окта- и тетрафрагмен-тов ХЦК с природными и синтетическими полимерными носителями им-муногенны и вызывают в организме синтез антител, способных перекрестно реагировать с нативным ХЦК.

2. Антитела, выработанные на синтетические фрагменты ХЦК ослабляют ингибирующее влияние эндогенного ХЦК на аппетит.

3. Следствием аутоиммунонейтрализации эндогенного ХЦК в организме растущих свиней явилось: повышение аппетита; ускорение роста; изменения в обмене веществ, обусловившие перераспределение потока метаболитов на преимущественный синтез мышечных белков; повышение эффективности трансформации питательных веществ корма и повышенный выход более качественной продукции.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Опыт проводили в условиях вивария ВНШФБиП сельскохозяйственных животных на помесных подсвинках ландрас х крупная белая, в течение 107 сут. Было сформировано пять групп животных аналогов, по 5 гол. в каждой. Живая масса подсвинков в начале опыта, в возрасте 5 мес, составляла 49,6 ± 1,2 кг. (в среднем по всем группам). Животных кормили вволю, 2 раза в сутки, комбикормами стандартной рецептуры рекомендованной ВАСХНИЛ (1985), соответственно возрасту животных.

За время опыта подсвинков подвергли 4-кратной иммунизации. Подсвинкам 1 (контрольной) группы вводили плацебо; животным 2-ой и 3-ей опытных групп вводили конъюгаты синтетического С-терминального октапептида ХЦКгб-зз.соответственно, с бычьим сывороточным альбумином 0ЩК-8-БСА) и с сополимером винилпирролидона с кротоновой кислотой (ХЦК-8-СП); животным 4-ой и 5-ой опытных групп - конъюгаты синтетического С-терминального тетрапептида ХЦКзо-зз. соответственно, с БСА (ХЦК-4-БСА) и с СП (ХЦК-4-СП). Пептиды и конъюгаты были синтезированы во Всероссийском НШ защиты животных (г. Владимир"). Во всех использованных конъюгатах на одну молекулу носителя приходилось приблизительно восемь-десять молекул гаптена.

Первичную иммунизацию проводили с полным адъювантом Фрейнда. Последующие бустерные инъекции осуществляли с неполным адъювантом на 20-е, 62-е и 88-е сутки от начала опыта. Доза вводимых препаратов составляла 1-2 мг. пептида в конъюгаге на одну голову, в 2 мл. водномасляяной эмульсии на одну иммунизацию.

Для оценки влияния иммунизации на аппетит подсвинков, на

- в -

протяжении всего опыта, ежесуточно, после каждого кормления л водили групповой учет поедаемости корма. Взвешивали животных начале опыта, перед каждой иммунизацией и по завершении опы Образцы крови из краевой ушной вены брали перед началом опыта на 14-е сутки после каждой иммунизации (до утреннего кормлени а также через 4 недели после второй иммунизации.

Реакцию иммунной системы на вводимые антигены оценивали титрам антител к окта- и тетрафрагментам ХЦК и БСА в конъюгат; для чего использовали разработанный нами метод, представляю» собой разновидность твердофазного, гетерогенного, неконкурент иммуноферментного анализа.

С целью изучения влияния введенных конъюгатов на обмен I ществ свиней анализировали следующие показатели крови: содержав глюкозы - глюкозооксидазным методом; мочевины - по цветной реа ции с диацетилмонооксимом; общего белка - по О.Н. 1хмгу е а1.(1951); общих липидов - по Го1сН е1 а1. (1957); активност а,-амилазы - с динитросалициловым реагентом. В крови также измер ли концентрацию сомаготропина. Метод определения гормона, разр, ботанный в ВНШФБиП сельскохозяйственных животных, представляв собой разновидность иммуноферментного анализа, усовершенствова! ный использованием стрептавидин-биотинового комплекса.

Для конечной оценки эффективности проведенной иммунокорре! ции в организме подсвинков учитывали их продуктивность и эффе! тивность конверсии потребленных кормов. В конце опыта прове.! контрольный убой животных с обвалкой туш. В мышечной ткани анал& зировали содержание воды, сухого вещества, белка и жира по стаг дартным методикам. Статистическую обработку полученных даннь: проводили по Стьюденгу (Плахотинский, 1970).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Характеристика иммунного ответа организма подсвинков на »ведение коньюгагов ХЦК-8 и ХЦК-4 с носителями различной природы.

Пептиды ХЦК-8 и ХЦК-4 неиммуногенны. Для придания им способности стимулировать антителогенез к себе их конъюгировали с БСА и с сополимером винилпирродидона с кретоновой кислотой (СП) - как неспецифическим Т-независимым иммуностимулятором. Титры антител, выраженные в кратности максимального разведения сыворотки при котором обнаруживаются антитела, были невысокими и равнялись после последней иммунизации во 2-ой группе - 1:32, в 3-ей группе - 1:16, в 4-ой группе - 1:16, в 5-ой группе - 1:8. В целом, иммунная система подсвинков адекватно реагировала на введенные антигены, о чем говорят титры антител к высокомолекулярному фрагменту в составе части конъюгатов - БСА, величины которых после третьей иммунизации составили 1:10000 во 2-ой группе и 1:1000 в 4-ой группе. Несмотря на невысокие по значению титры антител к ХЦК-8 и ХЦК-4 можно полагать, что данного количества антител было достаточно для снижения в крови эндогенного ХЦК, поскольку величина его физиологической концентрации незначительна и измеряется пикомолями. Максимальной иммуногенностью обладал конъюгат ХЦК-8-БСА. Однако, исходя из равноценности величин тигра антител к ХЦК-8 и ХЦК-4 в различных конъюгатах можно предполагать, что все испытанные антигенные конструкции потенциально пригодны для стимуляции аппетита у свиней.

3.2. Влияние введения конъюгатов ХДК-8 и ХЦК-4 с носителями различной природы на аппетит подсвинков.

Одним из физиологических эффектов иммунонейтрализации энд< генного ХЦК является повышение аппетита у животных. В условю нашего эксперимента наибольшее влияние на потребление корма ок; зали конъюгаты ХЦК-8-БСА и ХЦК-8-СП (Табл. 1). Максимально стиад лировав аппетит уже после первой иммунизации, соответственно, I 61 % (2 группа) и 46 % (3 группа), эти антигены в целом за опь повысили потребление корма у животных на 117 % (2 группа) и 109 (3 группа).

Таблица 1

Динамика среднесуточного потребления корма подсвинками по периодам иммунизации, г/сутки.

N группы Периоды после очередной иммунизации

1 иммунизация 2 иммунизация 3 иммунизация 4 иммунизация За весь опыт, в среднем

1 группа контрольная 1877 1778 2632 3467 2439

2 группа ХЦК-8-БСА % к контролю 3029 161 1229 69 2371 90 4770 138 2850 117

3 группа ХЦК-8-СП % к контролю 2744 146 2236 126 2567 98 3098 89 2661 109

4 группа ХЦК-4-БСА % к контролю 2211 118 1815 102 2728 104 3438 99 2548 104

5 группа ХЦК-4-СП % к контролю 2105 112 1794 101 2804 107 3109 90 2453 101

- я -

Конъюгаты ХЦК-4 столь значимого воздействия на аппетит подсвинков, за исключением первой иммунизации, не оказали, что наиболее вероятно можно объяснить недостаточной иммунонейгрализацией эндогенного ХЦК в силу низкой перекрестной реактивности антител выработанных на ХЦК-4 с ХЦК-8.

После второй иммунизации у подсвинков 2-ой группы было отмечено снижение потребления корма до 69 1 от контроля. По нашему мнению, данный факт можно объяснить возникновением после второго введения конъюгата ХЦК-8-БСА временной компенсаторной реакции организма в ответ на иммунонейтрализацию ХЦК, выразившейся, по принципу обратной связи, в повышении синтеза и секреции гормона, а следовательно, повлекшей за собой эффект снижения аппетита.

Конъюгат ХЦК-8-СП оказал в два раза меньшее стимулирующее влияние на аппетит подсвинков. Снижение эффекта мы склонны связывать со способностью данного конъюгата, в отличии от ХЦК-8-БСА, взаимодействовать с рецепторами ХЦК, в силу высокой сорбционной активности сцепления СП в составе конъюгата с различными белковыми поверхностями. Результатом данного взаимодействия является возможное проявление конъюгатом ХЦК-8-СП биологических свойств эндогенного гормона, что необходимо учитывать при выборе СП в качестве носителя неиммуногенных веществ.

В каждом отдельном периоде нами были выявлены дни с повышенным и пониженным потреблением корма подсвинками. В группах иммунизированных животных дни с повышенным потреблением корма приходились главным образом на начало и середину периода после иммунизации, что по времени совпадало с максимальной антительной реакцией организма на введенные антигены (на 7-14 дн.). Данный факт мы также считаем подтверждением исходного теоретического по-

ложения работы об активации аппетита у свиней методом иммунонейт-рализации эндогенного ХЦК. У подсвинков контрольной группы дни ( повышенным потреблением корма, в основном, приходились на коне1 каждого периода.

3.3. Влияние !2£»у:&гза1лии синтетическими фрагментами ХЦК на скорость прироста живой массы у подсвинков.

Живая масса подсвинков в начале эксперимента составляла 49,6 ± 1,2 кг. (в среднем по всем группам). В ходе опыта, иммунизированные животные имели более высокий прирост живой массы относительно контрольной группы: 60,9 ± 1,2 кг. (контроль - 100 %>), 70,9 ± 2,1 кг. (2 группа - 116 %, Р<0,01) 68,6 ± 2,0 кг. (3 группа - 113 X, Р<0,05), 64,3 ± 1,5 кг. (4 группа - 106 %), 62,5 + 0,9 кг. (5 группа - 103 %). Динамика прироста живой массы подсвинков отражена в таблице 2. Из таблицы видно, что наибольший эффект на скорость роста животных проявили конъюгаты ХЦК-8-БСА и ХЦК-8-СП. Конъюгаты ХЦК-4 значимого влияния на величину среднесуточных привесов не оказали.

Следует отметить, что повышенный прирост живой массы у подсвинков иммунизированных конъюгагами ХЦК-8 мог наблюдаться не только в связи с повышенным аппетитом, но и по причине активизации у этих животных ссмаготропиновой системы, вследствие ингиби-рования эндогенного ХЦК (Табл. 3). Гак, нами установлен факт повышения за опытный период уровня СТГ в крови у подсвинков 2-ой группы, иммунизированных конъюгатом ХЦК-8-БСА, с исходного уровня - 1,6 ± 0,37 до 2,8 + 0,53 нг/мл.

Таблица 2

Динамика среднесуточных приростов живой массы подсвинков,

г/сутки.

Периоды между взвешиваниями

12.04 -04.05

05.05 -07.06

08.06 -28.06

За весь опыт

1 группа

контроль 494 ± 24 439 ± 21 612 ± 20 762 ± 42 577 ± 27 Z к предыдущему

взвешиванию - 89 139 125

2 группа ** * + ХЦК-8-БСА 797 ± 35 317 ± 28 541 ± 25 1029 + 53 671 ± 35 Z к преды-

дущему взвешиванию % к контролю 161

40 72

171

190 135

116

3 группа **

ХЦК-8-СП 712 ± 15 552 ± 20 597 + 19 700 ± 39 640 ± 23 % к предыдущему

взвешиванию - 78 108 117

% к контролю 144 126 98 92 111

4 группа +

ХЦК-4-БСА 579 ± 28 448 ± 29 632 ± 15 752 ± 46 603 + 30 % к предыдущему

взвешиванию - 77 141 119

% к контролю 117 102 103 99 105

5 группа +

ХЦК-4-СП 564 ± 23 443 ± 19 635 ± 18 686 ± 24 582 ± 21 % к предыдущему

взвешиванию - 79 143 108

% к контролю 114 101 104 90

101

Здесь и далее: + - Р<0,1; х - Р<0,05; * - Р<0,01; ** - Р<0,001

Примечательно, что динамика колебания титра антител к ХЦК-8, уровня потребления корма и скорости роста совпадали, что можно считать весомым подтверждением выдвинутой рабочей гипотезы.

Концентрация соматотропина в сыворотке крови

Таблица 3 подсвинков, нг/мл.

N группы Взятия крови

1-ое взятие 2-ое взятие 3-ие взятие 4-ое взятие 5-ое взятие 6-ое взятие

1 группа контрольная 1,3 ± 0,40 1,1 ± 0,12 1,7 ± 0,58 1,4 ± 0,39 1,2 ± 0,40 2,6 + 0,34

2 группа ХЦК-8-БСА % к контролю 1,6 ± 0,37 123 2,2 ± 0,81 200 2,6 ± 0,60 153 X 3,7 ± 0,57 264 X 2,4 ± 0,30 200 3,0 ± 0,36 115

3 группа ХЦК-8-СП % к контролю 2,4 ± 0,51 185 1.4 ± 0,30 127 1,9 ± 0,36 112 1,7 ± 0,32 121 1,4 ± 0,36 116 1,3 ± 0,60 50

4 группа ХЦК-4-БСА % к контролю 2,0 ± 0,62 154 1,3 ± 0,26 118 1,6 ± 0,17 94 1,2 ± 0,23 86 1,0 ± 0,22 83 1,3 ± 0.06 50

5 группа ХЦК-4-СП % к контролю 3,4 ± 0,94 262 2,4 ± 0,88 218 2,8 ± 1,18 165 2,2 ± 0,85 157 1,8 ± 0,50 150 2,8 ± 0,87 108

Примечание к таблице: 1-ое взятие крови - перед опытом; 2-ое взятие крови - после первой иммунизации; 3-ие взятие крови - через 14 дней после второй иммунизации; 4-ое взятие крови - через 41 день после второй иммунизации; 5-ое и 6-ое взятия крови, соответственно, после третьей и четвертой иммунизации.

3.4. Влияние иммунонейтрализации эндогенного ХЦК на эффективность конверсии корма.

Важным моментом при разработке любых способов стимуляции аппетита у животных является знание о влиянии применяемого метода на эффективность конверсии потребляемых кормов. Величины оплаты корма иммунизированными и контрольными подсвинками были почти на одном уровне.Более того,у опытных подсвинков в отличии от контрольных затраты корма на прирост 1 кг живой массы за отдельные периоды эксперимента и в целом за опыт были несколько ниже. У жи-

вотных 2-ой опытной группы оплата корма в первый опытный период была снижена на 19 %. Важно отметитить, что в этот опытный отрезок, когда у остальных иммунизированных животных аппетит был также повышен, как и у животных 2-ой группы, то и оплата корма у них была снижена по сравнению с контролем на 3-5 %. Следовательно, в условиях нашего эксперимента эффективность конверсии повышенно потребляемых кормов не снижалась, что является важным экономическим стимулом для продолжения работ по созданию иммунобиотехноло-гических способов регуляции аппетита и продуктивности свиней.

3.5. Влияние иммунизации конъюгатакм С-концевых окта- и тетраф-рагментов ХЦК на продуктивность и качество продукции подсвинков.

С точки зрения зоотехнической науки считается общепринятым, что существующие высококонсолидированные генотипы свиней мясного направления продуктивности в фазе активного роста на повышенное потребление энергии с кормом не отвечают повышением ее конверсии в жир, а увеличивают прирост мышечной ткани вплоть до достижения беконного веса. Используя прием иммунонейтрализации эндогенного ХЦК, мы расчитывали вызвать определенные изменения в обмене веществ у свиней, а следовательно и их продуктивности. Результаты контрольного убоя показали, что убойный выход туш иммунизированных животных был на 5-12 % выше, чем в контроле (Табл. 4). Обращают на себя выраженные различия количественных и качественных изменений в составе туш подсвинков иммунизированных разными конъ-югатами. Так, общее содержание мяса в тушах подсвинков 2-ой группы было выше - на 19 %, в 5-ой группе - на 9 %, чем в контроле. Соотношение мышечной ткани с весом туши также превышало контроль

на 1,6-3,5 %. В свою очередь, у подсвинков 2-ой группы было снижено содержание подкожного жира - на 15 а у подсвинков 5-ой группы - содержание внутреннего жира - на 24 %. Эти данные предполагают, что процессы биосинтеза мышечной ткани у животных рассматриваемых групп преобладали над процессами синтеза жира в теле.

Таблица 4

Результаты контрольного убоя животных.

Показатели 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа

контроль ХЦК-8- ХЦК-8- ХЦК-4- ХЦК-4-

БСА СП БСА СП

Начальная жи- 49,ü i ЬО.З ± 48,5 ± 49,5 ± 50,2 ±

вая масса, кг. 0,5 1,5 ** 1,5 х 1,5 +. 1,2

Живая масса 111,0 ± 121,9 ± 117,8 ± 114,3 ± 113,2 ±

перед убоем, кг. 1,4 2,0 1,5 0,9 1,1

% к контролю 100 110 ** 106 103 * 102 *

Вес туши, кг. 68,3 ± 76,2 ± 73,5 ± 71,4 ± 71,8 ±

0,6 0,9 0,7 0,5 0,6

X к контролю 100 112 108 105 105

% от ж. массы 61,5 62,5 »» 62,4 * 62,5 * 63,3 х

Вес пожелудоч- 118,0 ± 143,0 ± 133,0 ± 127,0 ± 131,0 ±

ной железы, г. 1,1 2,0 3,0 1,5 3,5

X к контролю 100 121 113 108 111

Длина тонкого 20,7 + 22,1 ± 20,6 ± 20,8 ± 20,4 ±

кишечника, м. 0,9 1,1 0,1 1,2 0,1

X к контролю 100 107 100 101 99

Вес тонкого 2,25 ± 2,45 ± 2,28 ± 2,10 + 2,25 +

кишечника, кг. 0,09 0,08 0,13 0,05 0,06

Вес кожи, кг. 9,1 ± 9,8 ± 9,4 ± 8,4 ± 9,5 ±

0,3 0,4 0,4 0,2 0,3

X к контролю 100 108 103 92 *и 104 **

Вес внутреннего 2,5 ± 2,5 ± 2,6 ± 3,0 ± 1,9 ±

жира, кг. 0,04 0,06 0,03 0,07 0,02

% к контролю 100 100 104 120 76

7* к весу туши 3,7 3,3 * 3,5 + 4,2 х 2,6

Вес подкожного 18,4 + 15,6 ± 21,4 ± 21,3 ± 18,2 ±

жира, кг. 0,4 0,6 1,5 0,8 0,4

%.к контролю 100 85 116 116 99

% к весу туши 27 20 », 29 30 25 **

Вес мяса, кг. 37,5 ± 44,8 ± 38,6 ± 37,4 ± 40,8 ±

0,2 0,4 0,4 0,2 0,4

X к контролю 100 119 103 100 109

% к весу туши 55 59 »* 53 52 57

Вес костей, кг. 12,4 + 15,8 ± 13,5 ± 12,7 + 12,8 ±

0,08 0,12 0,10 0,04 0,06

% к контролю 100 •■ 127 109 102 103

% к весу туши 18 21 18 18 18

Иные результаты по содержанию мяса и жира в туше мы получили для животных 3-ей и 4-ой групп. Так, хотя общая мышечная масса у подсвинков 4-ой группы была такая же как у контрольных свиней, а в 3-ей группе даже превысила згу величину на 3 %, но относительное ее количество было ниже на 2-3 В тушах подсвинков 3-ей и 4-ой групп содержание подкожного жира было выше, чем у контрольных на 16 %. У подсвинков 4-ой группы, к тому же, на 20 % было повышено количество внутреннего жира. Какова природа столь различных результатов, на данном этапе, мы можем только предполагать. Вероятно, дифференцированное действие различных конъюгатов С-кон-цевых фрагментов ХЦК на боенские характеристики связаны с 'различиями в их химическом строении, а следовательно с особенностями воздействия каждого из конъюгатов на организм животных.

Из таблицы 4 видно, что иммунонейтрализация ХЦК вызвала усиление у подсвинков 2-ой группы процесса остеогенеза. Относительное количество костной ткани у них было повышено на 21 %. Это можно объяснить активизацией у этих животных соматотропиновой системы, вследствие иммунонейтрализации ХЦК. Также, интересен факт увеличения длины тонкого кишечника у подсвинков 2-ой группы, что вероятно дает этим животным дополнительное преимущество при переваривании корма.

Столь же разительные изменения произошли в химическом составе мышечной ткани подсвинков (Табл. 5). У животных всех опытных групп отмечена общая тенденция, выразившеяся в снижении жира в сухом веществе мышц на 12-30 % и увеличении белка на 2-10 %, при прочих равных показателях. Данная информация представляет значительный научный интерес, поскольку предстоит осмыслить за счет

включения каких метаболических механизмов разные конъюгаты оказали, с одной стороны, дифференцированное действие на содержание в туше - мышечной ткани, внутреннего и подкожного жира, а с другой стороны, необходимо понять и описать метаболические пути приведшие во всех 4-х группах к такому результату, как снижение жира в мышечной ткани и повышение содержания в ней белка. Пока лишь мы можем предполагать, что результатом иммунонейтрализации эндогенного ХЦК явилось перераспределение метаболических потоков, с вовлечением соматотропиновой и инсулиновой гормональных систем.

Таблица 5

Химический состав мышечной ткани подсвинков, %.

N

группы

Показатели

Содержание влаги

Содержание

сухого

вещ-ва.

Содержание жира в сухом вещ-ве.

Содержание белка в сухом вец-ве.

1 группа

контрольная 73,5 ± 0,2 26,5 ± 0,1

22,11 ± 1,7 51,2 + 2,5

2 группа ХЦК-8-БСА % к контролю

3 группа ХЦК-8-СП % к контролю

4 группа ХЦК-4-БСА % к контролю

5 группа ХЦК-4-СП % к контролю

73,3 ± 0,7 26,8 ± 0,7

100

101

74,3 ± 0,2 25,8 ± 0,2

101

97

73,4 ± 0,6 26,7 ± 0,6

100

101

72,5 +.0,3 27,6 ± 0,3

99

104

19,5 ± 1,2

88

15,7 ± 0,4 71

15,4 ± 0,4 70

17,8 ± 1,6 81

56,1 ± 2,4 110

55,4 ± 2,8 108

54,8 ± 2,0 107

52,4 ± 4,8 102

Отличие в эффектах конъюгатов ХЦК-8 и ХЦК-4 на потребление корма и скорость роста подсвинков, с одной стороны, и однонаправленное действие конъюгатов ХЦК-8-БСА и ХЦК-4-СП на характеристики

туш, а также всех препаратов на химический состав мышечной ткани подсвинков , с другой стороны, позволяет высказать предположение, что если аппетит и скорость роста животных - сфера регуляции ХЦК-8, то обмен веществ преимущественно находится под контролем ХЦК-4.

3.6. Влияние иымуногенных ионъюгатов С-концевых фрагментов ХЦК на обмен веществ у подсвинков.

С целью понять биохимическую природу произошедших изменений в результате иммунонейтрализации эндогенного ХЦК нами были изучены следующие показатели крови: концентрация мочевины, общего белка, общих липидов и глюкозы. Величины всех изученных биохимических показателей колебались в пределах физиологических границ, например концентрация общего белка. Этот факт очень важен, поскольку говорит о том, что иммунизация животных не внесла в их метаболизм каких либо серьезных изменений, могущих привести к нарушению здоровья животных. Однако при более внимательном анализе полученных данных можно выявить некоторые интересные тенденции. Так, у иммунизированных животных концентрация азота мочевины (Табл. 6) в большинстве случаев была ниже величины этого показателя у контрольных животных, что дает основание говорить о более интенсивном процессе анаболизма и снижении процессов катаболизма белковых веществ у иммунизированных подсвинков, о чем свидетельствуют и данные обвалки туш подсвинков и химического состава мышечной ткани.

Концентрация мочевины в сыворотке крови

Таблица 6 подсвинков, мМ.

N группы Взятия крови

1-ое взятие 2-ое взятие 3~ие взятие 4-ое взятие 5-ое взятие 6-ое взятие

1 группа контрольная 4,13 + 0,08 3,81 ± 0,28 4,06 ± 0,15 4,91 ± 0,10 4,40 ± 0,20 3,91 ± 0,20

2 группа ХЦК-8-БСА % к контролю 4,45 ± 0,18 108 3,86 ± 0,30 101 3,85 + 0,12 95 4,86 ± 0,04 95 4,25 ± 0,20 97 3,95 ± 0,10 101

3 группа ХЦК-8-СП % к контролю 3,88 ± 0,18 93 3,70 ± 0,08 97 3,43 ± 0,33 84 4,73 ± 0,15 96 4,40 ± 0,17 100 3,81 ± 0,32 97

4 группа ХЦК-4-БСА % к контролю 3,35 + 0,22 81 3,61 + 0,28 95 3,98 ± 0,33 95 5,06 ± 0,22 103 3,56 + 0,02 81 4,28 ± 0,12 109

5 группа ХЦК-4-СП % к контролю 3,46 ± 0,32 84 3,61 ± 0,01 95 3,91 ± 0,42 96 4,56 ± 0,28 93 3,83 ± 0,18 87 3,85 ± 0,08 98

Примечание: см. примечание к таблице 3.

По нашем/ мнению, достаточно показательные изменения у опытных животных наблюдались в липидном и углеводном обменах веществ. Из таблицы 7 видно, что у животных контрольной группы наблюдалась устойчивая тенденция к повышению содержания общих липидов, что могло быть следствием возрастных изменений и потребления корма вволю. В отличии от этого, у животных 2-ой группы наблюдалось снижение концентрации общих липидов в крови. Вероятно в организме этих подсвинков, в результате иммунонейтрализации эндогенного ХЦК, могли активизироваться процессы использования липидов организма на энергетические цели (обеспечение реакций синтеза белка, терморегуляции, обеспечение энергетических потребностей по перевариванию дополнительно принимаемых кормов на фоне некоторой гипогликемии, о чем будет сказано далее).

Таблица 7

Содержание общих липидов в сыворотке крови, г/л.

N группы Взятия крови

1-ое взятие 3-ие взятие 6-ое взятие

1 группа контрольная 3,00 ± 0,29 3,43 ± 0,50 3,78 + 0,45

2 группа ХЦК- 8-БСА % к контролю 3,58 + 0,99 119 3,35 ± 0,67 98 2,93 ± 0,11 78

3 группа ХЦК-8-СП % к контролю 2,60 ± 0,17 87 3,09 + 0,46 90 2,98 + 0,13 79

4 группа ХЦК-4-БСЛ £ к контролю 3,04 ± 0,21 101 3,81 + 0,37 111 2,90 1 0,35 77

5 группа ХЦК-4-СП % к контролю 3,14 + 0,35 105 3,60 ± 0,31 105 3,11 ± 0,35 82

Примечание: см. примечание к таблице 3.

Динамика колебания общих липидов в крови животных 3-ей и 4-ой групп носила промежуточный характер между 2-ой группой и контролем, что может свидетельствовать об особенностях воздействия соответствующих конъюгатов на организм подсвинков. Примером тому может служить выявленные у животных 3-ей и 4-ой групп противоположные тенденции, а именно: увеличение жира в туше и снижение жира в мышечной ткани.

Из таблицы 8 видно, что после первой иммунизации у всех животных снизилась концентрация глюкозы в крови, что можно объяснить возникшей стрессовой ситуацией. На протяжении остальной части эксперимента уровень глюкозы у контрольных подсвинков после первоначального снижения практически не изменился. В отличии от

этого, у иммунизированных подсвинков после второго введения конъ-югатов наблюдалось небольшое повышение концентрации глюкозы, с последующим ее снижением после третьей иммунизации до уровня контроля и даже ниже его, после четвертой иммунизации. Чем можно объяснить такое колебание уровня глюкозы в ходе эксперимента у животных опытных групп?

Таблица 8

Концентрация глюкозы в сыворотке крови подсвинков, мМ.

N группы Взятия крови

1-ое взятие 2-ое взятие 3-ие взятие 4-ое взятие 5-ое взятие 6-ое взятие

1 группа контрольная 4,50 + 0,29 3,20 + 0,41 3,10 ± 0,31 3,40 ± 0,35 3,60 ± 0,18 3,60 ± 0,20

2 группа ХЦК-8-БСА % к контролю 4,30 ± 0,16 96 3,12 ± 0,31 98 4,00 ± 0,26 129 X 5,20 + 0,61 155 3,42 ± 0,06 95 3,52 ± 0,24 99

3 группа ХЦК-8-СП % к контролю 4,80 ± 0,30 107 3,12 ± 0,31 98 4,34 ± 0,44 140 3,86 ± 0,54 115 3,52 ± 0,06 98 3,30 ± 0,08 93

4 группа ХЦК-4-БСД % к контролю 4,30 ± 0,42 96 3,02 ± 0,33 94 3,92 ± 0,52 126 X 4,71 ± 0,42 140 3,96 ± 0,20 110 3,32 ± 0,54 93

5 группа ХЦК-4-СП % к контролю 4,00 ± 0,27 89 3,11 ± 0,42 98 4,57 ± 0,10 147 4,17 ± 0,14 124 3,75 ± 0,10 104 3,27 ± 0,18 92

Примечание: см. примечание к таблице 3.

Ми уже упоминали о возможном компенсаторном повышении концентрации ХЦК у иммунизированных подсвинков после второй иммунизации. Из литературных данных следует, что ХЦК может оказывать определенное влияние на секрецию инсулина и глюкагона, проявляя свойства как ингибитора, так и стимулятора этих процессов. Можно предположить, что в условиях нашего эксперимента, после второй

иммунизации избыточное количество ХЦК ингибировало секрецию инсулина, либо стимулировало секрецию глюкагона. Следствием этих процессов и явилась отмеченная небольшая гипергликемия.

После 3 и 4 иммунизаций, в условиях отсутствия компенсаторной холецистокининэмии, соответсвенно понизился и уровень глюкозы. В связи с этими данными мы можем предложить следующий механизм действия иммунонейтрализации ХЦК на стимуляцию аппетита. Им-мунонейтрализация ХЦК снимает тормозящее влияние этого гастроин-тестинального гормона на высвобождение инсулина в ответ на поступление пищи. В свою очередь, возникшая таким образом умеренная, физиологическая гиперинсулинемия приводит к повышенной мобилизации глюкозы из крови, тем самым сохраняя у животных так называемую "голодную кровь" и пролонгируя у них чувство голода. Поэтому, в условиях некоторой гипогликемии, как мы уже замечали, часть ли-пидов может дополнительно использоваться на энергетические цели.

Таким образом, на основании анализа изменений величин изучавшихся биохимических показателей крови можно сделать предположительный вывод о том, что эндогенный ХЦК прямо или опосредовано вовлечен в регуляцию практически всех видов обмена веществ, ймму-нонейтрализация эндогенного ХЦК, по нашему мнению, и должна была сопровождаться снижением в крови содержания глюкозы, общих липи-дов, азота мочевины, что предполагает активацию в орагнизме иммунизированных животных процессов биосинтеза белка и повышенную мобилизацию липидов на пластические и энергетические цели.

3.7. Влияние иммунизации подсвинков коиьюгатами ХЦК-8 и ХЦК-4 на активность ос-амилазы поджелудочной железы.

Активность <л-амилазы крови в клинической медицине и ветеринарии используется как важный показатель наличия или отсутствия патологии в экзокринной ткани поджелудочной железы. Поэтому, с целью оценки последствий иммуннонейтрализации ХЦК на клиническое состояние поджелудочной железы в сыворотке крови подсвинков исследовали активность й-амилазы (Табл. 9).

Таблица 9

Активность ос-амилазы в сыворотке крови подсвинков, Е

N группы Взятия крови

1-ое взятие 3-ие взятие 6-ое взятие

1 группа контрольная 10,23 ± 0,42 9,56 ± 0,13 11,14 ± 0,24

2 группа ХЦК-8-БСА % к контролю 10,47 ± 0,27 102 9,43 ± 0,15 99 9,80 ± 0,38Х 88

3 группа ХЦК-8-СП % к контролю 10,02 ± 0,10 98 8,93 ± 0,30 93 9,66 ± 0,67+ 87

4 группа ХЦК-4-БСА % к контролю 9,64 ± 0,30 94 9,53 ± 0,41 100 9,76 ± 0,60+ 88

Б группа ХЦК-4-СП % к контролю 10,62 ± 0,31 104 9,85 ± 0,27 103 9,92 ± 0,34Х 89

Примечание: см. примечание к таблице 3.

Из таблицы видно, что активность фермента у иммунизированные животных на протяжении опыта оставалась на уровне контроля и лиш) незначительно снизилась к концу эксперимента. Эти данные говорят

что обнаруженное нами после убоя увеличение веса поджелудочной железы у животных опытных групп (контроль - 118,0 ±1,1 г., 2-я группа - 143,0 ± 2,0 г., 3-я группа - 133,0 ± 3,0 г., 4-я группа - 127,0 ± 1,5 г., 5-я группа - 131,0 ± 3,5 г.) носило не патологический, а функционально-компенсаторный характер. Можно допустить также, что в условиях посгиммунизационной холецистокининэмии включились дополнительные, кроме ХЦК, гастроинтестинальные пептиды оказывающие на поджелудочную железу трофическое и стимулирующее экзокринную функцию действие.

выводы.

1. Получены экспериментальные доказательства принципиальной возможности регуляции аппетита, обмена веществ и продуктивности свиней путем введения животным иммуногенных конъюгатов синтетических С-концевых окта- и тетрафрагментов ХЦК.

2. Конъюгаты ХЦК-8-БСА и ХЦК-8-СП вызвали у иммунизированных подсвинков, в целом за опыт, повышение потребления корма, соответственно, на 17 и 9 % и увеличение среднесуточных приростов живой массы на 16 и 11 X. Конъюгаты ХЦК-4, как с БСА, так и с СП не оказали значимого влияния на аппетит и рост животных.

3. Повышенный уровень потребления корма и скорости роста животных, вследствие иммунизации их конъюгатами синтетических фрагментов ХЦК не повлекли за собой увеличения оплаты корма, что говорит о способности иммунизированных животных эффективно конвертировать повышенное количество потребленного корма в продукцию.

4. Конъюгаты ХЦК-8 и ХЦК-4, на базе носителей различной природы, оказали дифференцированное влияние на характеристики туш

подсвинков. Конъюгаты ХЦК-8-БСА и ХЦК-4-СП вызвали увеличение содержания мяса в тушах, соответственно, на 19 и 9 % и снижение содержания подкожного жира на 15 % (для конъюгата ХЦК-8-БСА ) и внутреннего жира на 24 £ (для конъюгата ХЦК-4-СП).

5. Все испытанные конъюгаты оказали сходное действие на химический состав мышечной ткани, выраженное в снижении содержания в сухом веществе жира на 12-30 % и увеличении количества белка на 2-10 %.

6. Величины изученных биохимических показателей крови (глюкоза, азот мочевины, общий белок, общие липиды) у иммунизированных подсвинков находились в пределах физиологических колебаний.

7. У подсвинков, иммунизированных конъюгатом ХЦК-8-БСА, обнаружен повышенный уровень в крови соматотропного гормона. У этих же животных было увеличено содержание костной и мышечной ткани, что позволяет идентифицировать один из механизмов влияния ХЦК нг рост и развитие животных через регуляцию синтеза и секреции СТГ.

8. Полученный фактический материал, при его дальнейшем теоретическом развитии и экспериментальной разработке, может служить основой для создания новых, высокоэффективных, экологически чистых, иммунобиотехнологическик способов регуляции аппетита, обмене веществ и продуктивности животных.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Галочкин В.Д., Эрнст Л.К., Триндо Л.й., Колоскова Е.М., ■ Назаров H.A., Черных В.Я. Иммунобиотехнологический подход к регуляции репродуктивной функции, обмена веществ и продуктивности жи-вотнынх. // Сельскохозяйственная биология.- 1994.- N 7.- С.3-19.

2. Назаров H.A., Галочкин В.А. Поиск способов повышения продуктивности свиней с использованием конъюгатов октафрагмента холецистокинина. // Проблемы физиол., биох., биогехн. и питания с.-х. животных. Отчет ВНШФБиП с.-х. жив.- 1994.- С.180-181.

3. Назаров H.A., Галочкин В.А. Влияние конъюгагов С-концевого тетрапептида холецистокинина на потребление корма, продуктивность и обмен веществ у свиней на откорме. // Проблемы физиол., биох., биотехн. и питания с.-х. животных. Отчет ВНШФБиП с.-х. жив.- 1994,- С.182-183.

4. Назаров H.A., Галочкин В.А. Разработка тест-системы имму-ноферментного анализа для определения тигра антител к окта- и тетрафрагментам холецистокинина. // Проблемы физиол., бибх., биотехн. и питания с.-х. животных. Отчет ВНИИФБиП с.-х. жив.- 1994.-С.184-185.

5. Назаров H.A., Галочкин В.А. Оценка возможности использования тетрафрагмента холецистокинина для регуляции аппетита и продуктивности свиней. // Актуальные проблемы биологии в животноводстве. Мат. 2 Межд. конференции.- Боровск, 1995.- С.149,- (ВНИИФБиП) .

6. Назаров H.A. Разработка иммунобиотехнологического способа регуляции аппетита и продуктивности у откармливаемых свиней. // Актуальные проблемы биологии в животноводстве. Мат. 2 Межд. конференции. - Боровск, 1995,- С. 148,- (ВНШФБиП).

7. Назаров H.A. Иммуноферментный анализ титра антител к ок-та- и тетрафрагментам холецистокинина. // Актуальные проблемы биологии в животноводстве. Мат. 2 Межд. конференции.- Боровск, 1995,- С. 147.- (ВНИИФБиП).

8. Галочкин В.А., Матвеев В.А., Колоскова Е.М., Назаров H.A.

Иммунобиотехнология и продуктивность сельскохозяйственных животных. // Биолог, наука на службе животноводства. Мат. конф. - Боровск, 1995.- С.38-40.

9. Галочкин и.А., Эрнст Л.К., Назаров H.A., Рыбаков С.С., Петров В.Н. йммунонейтрализация холецистокинина как способ регуляции аппетита, обмена веществ и продуктивности свиней. // Сельскохозяйственная биология,- 1996.- N 4.- С.48-58.

Подписано в печать 14.05.97 г. Формат издания 60x90 1/16 _Усл. печ. л. 1.4,. Тираж - 100. Заказ №779_

Отпечатано в печатном цехе ГП УСЗ Минсельхозпрода России 107139, Москва, Орликов пер., 1/11