Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и стандартизация методов выявления микоплазм-контаминантов медицинских биологических препаратов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и стандартизация методов выявления микоплазм-контаминантов медицинских биологических препаратов"

ГОСКОМИТЕТ РСФСР САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИМ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ Г. Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

БЕРДНИКОВА Зинаида Евтропиевна

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОПЛАЗМ — КОНТАМИНАНТОВ МЕДИЦИНСКИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.07 — Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича Министерства здравоохранения СССР.

Научный руководитель: доктор медицинских наук Шалунова Н. В.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Андреева 3. М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Раковская И. В., доктор биологических наук, профессор Рунова В. Ф.

Ведущая организация — Московский НИИ вирусных препаратов АМН.

Зашита диссертации состоится « О^Ф. » 991 г.

в « /У. » час. на заседании специализированного совета

К.084.18.01. Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИЭМ им. Г. Н. Габричевского.

Автореферат диссертации разослан « 991 г.

Ученый секретарь специализированного совета к. м. н.

Ермоленко 3. Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуалъйость проблемы. Вопросы изучения контаминации медицин-ких иммунобиологических препаратов (МИБП) агентами различной приводы до настоящего времени остаются одноГ.чи актуальных проблем ри оценке качестза биологических препаратов, выпускаемых медицин-кой промышленностью. Среди контамшшрувдих агентов особое место анимагат микоплазмы, источником которых могут быть ткани и органы упоров, используемые дая приготовления клеточных субстратов, ¡елковые компоненты питательных сред, а также персонал, занимаются изготовлением препаратов.

В настоящее время при изготовлении и контроле МИШ таолъ-;уется около 20 различных первичных и перевиваемых клеточных ¡уль'-ур. Широкое использование клеточных культур при производст-ie и контроле вирусных вакцин, а также в научных исследованиях федъявляет к ним ряд определенных требований. Одним из требова-шй ВОЗ является недопустимость микробной, вирусной и микоплаз-юняой контаминации. Последняя инфекция чаще всего носит скрытый, [атеятный характер, но иногда влияет на структуру и функции клеток-, [рисутстше микоплаэм в клеточных культурах может приводить к из-аенегапо роста клеток, их пралиферативной активности и индукции /юреологических изменений (Каган Г.Я., Раковская И.В., 1968; Barile U., 1981J Mo Garrit'y G., 1979 и др.), к ингибицшГили стимуляции трансформации лшлфоцитов (Barile И., 1973; Coll В., 1982; I др.), к изменешш синтеза углеводов, аминокислот, РНК и ДНК, ЭНЗИМНОГО состава клеток ( Barile М., 1968, 1975, 1981; Мс Garri-ty G. И Др., 1978; St'anbridge Е. И др., 1978; ¿¿anbrldge Е., [981), индукции хромосомных аберраций (Barile Ы., 1981; Nichols sv., 197»), '

Известно, что первичные культуры и диплоидные штаммы клеток юнташнированы микоплазмами незначительно - 1-4 % (Раковская И.В., Зульфович Ю.В., 1990; Barile М., 1981). ' '

В клеточных культурах взаимодействие вирусов и мшсоплазм зависит от вида клеток, природы вирусов и микоплазм. Показано шгибиторное действие микоплаэм на гемагглютширующуга активность i репродукцию ряда вирусов (Раковская И.В., Вулвфович Ю.В., 1990; Gray J., 1982 ). Доказано как стимулирующее, так и ингибирую-цее действие микоплаэм на продукцию интерферона (Раковская И.В., Зульфович Ю.В., 1990; Смирнова Т.Д., Каган Г.Я., 1971; Barile ы.,' 1979). Рад исследователей приходит к виводу, что оди'л.'. из оопс.мих

источников загрязнения клеточных линий млколлазмаш являеюя сыворотка животных - один из компонентов питательных сред дои культивирования вирусов в клеточных культурах (Каган Г.Я., Раковокая И.В. 1968; Икоев В.Н., 1972; Раковокая И.В,, Вульфович Ю.В., 1990; Burile M., и др., 1952; Baille м., 1975)- 3 пользу этого свидетельствует широкое инфицирование крупного рогатого скота различными видами микоплазм, сопровождающееся продолжительной циркуляцией возбудителя в крови животных (Коромнслов Г.Ф., Месарош Я., 1987; Dolg P.A., 19815 Garg D.N. . 'и др., 1988; Stipkovits Ь. й др., 1983; Jasper D. , 1987; Jasper D. " и ДР., 1987; ïaoudi А. и Др., 1985; Poumarat ï. И др., 1987; Tanskanen Б., 1987,1988; Trichard О. и др., 1985).

Из вышеизложенного ясно, что контроль сыворотки крови, используемой при культивировании клеток на наличие микоплазм, является необходимым и обязательным.

, \ В производственных условиях при изготовлений вирусных препаратов при контроле их стерильности от вдкослазыенной инфекции требуются высокочувствительные и доступные методы. Увеличение доступности, чувствительности, экономичности и быстроты получения результатов позволяют в конечном счете выпускать препараты, отвечающие более высоким требованиям стерильности и показателям качества.

В действующей в настоящее вреда НТД единственным критерием оценки качества сыворотки крупного рогатого скота являются физико-химические показатели и отсутствие микробной контаминации. Современные методы выявления микоплазм, првдлаггшмые ВОЗ и фирмами, производящими препараты, основаны только на микробиологическом методе с использованием искусственных питательных сред в разной модификации.

цель исследования. Целью настоящего исследования явилась унификация и стандартизация методов обнаружения микоплазменной контаминации МИШ и коммерческих сывороток крови различных животных, используемых дая приготовления клеточных к/льтур, предназначенных для производства и контроля МИШ. На основании разработанных методов изучение уровня контаминации .выпускаемых в стране препаратов.

Для достижения указанных целей ставились следующие задачи:

I. Дать сравнительную оценку качества питательных сред, используемых для культивирования микоплазм и их стандартизация на основе количественных показателей и воспроизводимости роста микоплазм. •

2. Разработать и изучить в соотвотстнии с требованиями ВОЗ раслевоЙ стандартный образец (0С0) тест-штамма микоплазм о долью пользования его для оценки качества различных серий питательных |0Д, получаемых в учреждениях страны. (

3. Разработать чувствительный метод выявления минимального отчества микоплазм на искусственных питательных средах.

4. Разработать цитохимический метод выявления микоплазм-конта-[налтов сыворотки крупного рогатого скота.

Научная новизна

- Впервые научно обосновала необходимость совершенствования стандартизации методов контроля МИБП на отсутствие миконлазмон->й контаминации.

- Определены оптимальные условия, способствующие выявлению шималыюго количества микоплазм и сыворотках животных.

- Дана оценка качества сложных по составу искусственных пита-шньос сред, иопользуемых для выявления микоплазм.

- Впервые показана возможность применения клеточных культур [Я обнаружения цитохимичоским методом мнконлазм в сыворотке кропи >ушюго рогатого скота.

•- Впервые в стране получен отргюлевой стандартный образец ютчитамма Муоор1ииша ¡и^1п1п1 а-'^О для определения чуистии-эльности искусственной питательной сроды для выявления микоплазм оценки ее стандартности.

При выполнении этих исследоьшшй подучены результаты, позво-шцио сделать ряд научных обобщений:

- Данные по изученью уровня контаминации сыворо'/..и различ-

к животных, позволили теоретически обосновать и эксперименталь-э апробировать чувствительный мотод выявления минимальных- коди-зств'микоплазм при изучении уровня контаминации сывороток живог-п, различающихся как по принадлежности к видам животных, так и з способу приготовления коммерческого препарата. '

- Сравнительное изучение информативности различ!шх методов ¿явления микоплазм в сыворотках животных позволило обосновать зобходимость применения при выпуске коммерческих препарате!) сы-зротки крупного рогатого скота, используемой для выращивания гбетратов МИБЛ, двух методов - микробиологического и цитохшли-зского.

- Эксперментально обоснована необходимость использования

тест-штамма Иусор1 тая arginlai G230 для определения качеси и стандартизации питательных сред, применяемых для выявления мтоплазм-контамяиантов МИШ.

Практическая ценность и реализация результатов исследовш в практике здравоохранения.

- Разработана схема контроля сыворотки крови животных на контаминацию шшоаяазиаыя, которая отличается чувствительноеи простотой постановка экспериментов, воспроизводимостью резуль: тов. На основании яроведендах исследований разработаны и внед] ны в практику здравоохранения методические указания: "Контрол: сыворотки крови крупного рогатого скота на отсутствие вирусов-контаминантов и микоплазм", М., 1988, утвержденные Минздравом (РД 42-28-14-88). Методика вводится в НГД на различные препар; трабунцие проведения контроля на наличие микоплазм, что позва повысить качество проводимого исследования.

- Дяя определения чувствительности искусственной питател среды разработан отраслевой стандартный образец тест-штамма plasma arginini G2J0 (0С0 42-28-I0E-87). На 0С0 составлены Свидетельство и Инструкция по применен™. Препарат использует практическими учреждениями при приготовлении каждой новой сер питательной среды для оценки ее качества.

Основные положения, выносимые на :зааиту

1. Результаты изучения качества питательных сред для кул зирования микоплазм на основа Количественных показателей и во производимое^ роста микоплазм в средах, различных по составу

2. Получение и изучение стандартного образца тест-штамма Mycoplasma arginini G230 дои определения пригодности питате rsx. сред для контроля ШБП на отсутствие школлазм-контамияая

3. Итоги изучения выделения микоплазм из сыворотки крови различных животных на искусственных питательных средах в разл ных модификациях.

4. Возможность использования цитохимического метода выяе микоплазм-контаминантов сыворотки крови крупного рогатого скс

5. Данные многолетних наблюдений по выявлению микоплазм-таминантов в МИБП, поступающие в ГИСК в порядке Госнадзора.

Публикации; по теме диссертации опубликовано 7 работ.

Апробация работы. Основные положения и выводы диссортацион-й работы были доложены и обсуждены на объединенном заседании облемных комиссий Научного Совета по шлробиологяи АМН СССР "Мединская микробиология" и "Теоретическая прикладная иммунология" вместно с секцией микробиологии ВЮМЭП им. И.И.Мечникова (29 ап-ля 1989 г.) и на заседании Ученого Совета ТЮК им. Л.А.Тарасовичей мая 1991 г.) и рекомендована к защите.

Структура и объем работы. Работа изложена на 136 страницах шнописного текста, содержит 15 таблиц и 10 рисунков. Список ли-ратуры включает 190 источников, из которых 45 отечественных и 5 иностранных авторов.

X х X

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю, «тору медицинских наук Н.В.Шалуновой за предложенную тему, вни-.ние и руководство при выполнении диссертационной работы.

Сердечно благодарю доктора медицинских наук, профессора М.Андрееву за ценные советы и помощь при оформлении диссертации, [уболо признательна за ценные консультации и содействие в оформ- • шин работы кандидату биологичоских наук В.В.Неустроевой.

Искренне признательна заведующем/ лабораторией клеточных куль-гр Контрольного института ветеринарных препаратов В.Н.Ночевному i предоставление материалов для проведения исследований на пер-гешсх клеточных культурах животного происхождения.

Благодарю коллектив лаборатории контроля медицинских, препара-ш на отсутствие контаминирующих агентов за дружеское участие и шарнщескую помощь, а дирекцию ГИСК им. Л.А.Тарасовича - за предо-гавленную возможность для осуществления данных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ' МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ

Штаммы микоплазм . .

В экспериментах нами были использованы следующие музейные' гаммы микоплазм: U.agalactiae, II. arg i ni ni, M.nycoides var.: /coi— ea, M.hominis, Ы.órala, M.fermentans, M.pneumoniae, A.lailawii, зделенные от больных и здоровых животных и человека, а также из . 1еашей среды, которые являются явными шш возможными контаминан- ■ зш биологических препаратов. При выборе штаммов учитывали имею-

щуюся в литературе информацию о контаминации микоплазмами кулы клеток, используемых для диагностики и промышленного изготовлен вирусных иммунобиологических препаратов.

Загрязнение клоточных культур, сыворотки животных связано разнообразными путями порадлчи и широким распространенном мико-нлазм сроди жипотних, чоловнка и внешней среды.

Все музейные штаммы микоплазм, любезно предоставленные нал лабораторией микоплазм и ■ L-форм бактерий НИИЭМ им. Н.Ф.ГамалЕ АМН СССР, которые первоначально были получены от Freuadt'a (1г,

tut of Mediclnok: Mycrobtology Aarhus unlveroitet Aarchus C.Denm в 1974 году. Штаммы микоплазм хранили при температуре 4 °С на я кой питательной среде - бульоне и пересевали один раз в месяц. В лаборатории штаммы прошли около 200 пассажей, не изменив свое морфологии и культу ральных свойств.

Искусственные питательные среды

Для культивирования микоплазм приме юти среды, приготовле} на триптическом переваре сердца крупного рогатого скота по npoi предложенной Каган Г.Я. и Раковской И.В. (1958).

Для выделения и культивирования микоплазм применяли три ei питательных сред: бульон, полужидкий 0,3 1» агар, и плотный 1,3 агар. Перед использованием агаровые среди растапливали на вода! бане до полного расплавления агара, охлаждали до 40^45 °С и вне ли 15 % нормальной лошадиной сыворотки, без консерванта. Предвг тольно проводили контроль сыворотки на игличиз бактериальной и коплазмонной контаминации. Полужидкие среды разливали в npoönpi плотные - в чашки Петри.

Плотность студня агара плотной cpe;w по Валенту составлял? 170 г. Физико-химические показатоли питательных сред определял! согласно "Методическим указаниям по применению физико-химичесю методов контроля питательных сред". - М., 1977. Всего было приз товлено и использовано при проведении экспериментов 54 серии ш тельных сред, из них: бульонной сроды - 15 серий, полужидкой с] - 32 серии, плотной среды - 7 серий. Питательны« среды готовши сотрудники лаборатории стандартизации и контроля бактериологии« ских питательных сред ГИСК им. Л.А.Тарасовича.

Титрование микоплазм проводили на полужидкой сродэ мотодо? десятикратных разведений, используя на каадое разведение по 4 i бирки. Пробирки инкубировали в точение 7 суток при температура

36+1) °С во влажной атмосфере. В последнем разведе!ши, где иа-лвдали рост микоплазм во всех четырех пробирках, подсчитывали оличество колоний, их среднеарифметическое значение, умноженное а соответствующее разведение и является титром исходной культуры, модельных опытах дая заражения опытных образцов сыворотки, с елью обнаружения минимального количества микоплазм, использовали азличные разввде1шя (от Ю-1 до 1<Г*2) музейных штаммов, описан-ых выше, при этом разведения штаммов проводили непосредственно а сыворотке крупного рогатого скота» Каждое разведение исследуе-юй сыворотки в количестве 10 мл высевали по I ш в каждую из де-яти пробирок о полужидкой средой. Материалы инкубировали 14 суток ¡о влажной атмосфере при температуре (36+1) °С. Для выявления рос-'а посевы просматривали в проходящем света на 3, 7, 10, 14 сутки, [скусстленно инфицированную сыворотки исследовали в соответствии : методгдкой проведения контроля медицинских иммунобиологических [реп-фатов на наличие микоплазм, изложенной в приказе Минздрава ¡CCP № 31 от 13.01.1983 г. "Об унификации методов контроля меди-денс:шх 'иммунобиологичоских препаратов".

Клеточше культуры

В экспериментах были использованы первично трипсинизированныа елетш: тестикулц эмбриона быка (ТБ), клетки почки эмбрионов коров [ГШ), фибробласты куриных эмбрионов (ФКЭ) и перепелиных эмбрионов [ФПЭ); перевиваемые линии - клетки Hela , полученные из коллекции музея клеточных культур Института им. Д.И.Ивановского АМН СССР, л клетки почки эмбрионов коров ьтвк , полученные из Института закцин и сывороток ЧФР. Диплоидный штамм представлен ' ютками кож-■ю-шшечной ткани эмбриона человека М-22, установленной в Институте нещиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР. Все перечисленные кулíтуры клеток получали по общепринятым методикам (Анджапаридзе Э.Г. и др., 1962; Голубев Д.Б, и др., 1976). Первично трипешшзи-ровишые культуры выращивали в матрасах вместимостью 250 мл;тЛле образования монослоя клетки снимали смесью, состоящей из равных объемов версена и трипсина и засевали по 1,8 мл в пробирли с покровными стеклами по 400-500 тыс/мл; перевиваемые - по 200-:50 тыс/мл. Средой культивирования для ПЭК, ТБ, ФКЭ, ФПЭ служил 0,5 % гидролизат лактальбумина на растворе Хенхса или среда 199, для Hela и mdbk - среда Игла МЕМ.

Учет результатов опытов проводили путем просмотра препаратов в люминесцентном микроскопе при большом увеличении об. х90 (масляная иммерсия), или об. х70 (водная иммерсия), используя синие и фиолетовые фильтры типа SC-I-4, ОС 15-2» БС 8-2.

Статистическая обработка рвзудьтй'л'ОВ была проведена по оби принятым методам (Бессмертный Б.С., а др., 1961; Каминский Л.С. 1964). Подсчет титра проводили по методу Reed Ь., Muench н.(IS для уровня вероятности 95

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАН/Я И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Качество питательной среды для культивирования микоплазм и ее стандартизация

Для выявления микоплазм у нао в стране используются искусс венные питательные сроды лабораторного приготовления. Качество сред зависит от используемых для этих целей ингредиентов, kotoj в свою очередь, являются не стандартными в связи со способом из получения.

К началу наших исследований в стране отсутствовали требовг ния и методы контроля качества питательных сред для выявления i коплазменной контаминации. В связи с этим представлялась крайне необходимой разработка системы, которая позволяла бы оценивать качество каждой приготовленной серии с;оеды, что делало бы возмс ным получение сравнимых результатов пр:а проведении эксперименте и при контроле МИБП на отсутствие микоплазм.

-На первом этапе работы следовало забрать вид микоплазм дш проверки чувствительное!, среды, которая обеспечивала бы рост минимального их колиуества, В экспериментах при подборе штамма ^пользовали данные, полученные в результате многократного onpt деления титра микоплазм и наблюдения за ростом в бульонной сре; Исследовали следуиэдие виды микоплазм: li.agalaotiae, u. arginini M.mycoides var.mycoidss, M.pneumoniae, li.fermentans, M.hominis M.orale, A.iaidlawii. с разными видами микоплазм опыты noBTopj 2-8 раз с использованием 2-5 серий .питательных сред. ,

Анализ полученных результатов показал, что у большинства видов микоплазм различия в титре не отмечались, что могло свид( тельствовать о незначительной зависимости воспроизводишсги результатов титрования этих видов микоплазм от чувствительности ; пользуемых сред. Значительные колебания в титре (дэ 2,5 lg ) наблюдали у трех BTûMMOB - М.arginini, Й.agalactia©, M.pnovunoi

связанные с качеством различных серий среда. Учитывая го, что *ва последних вида микоплазм, редко встречающиеся контаминанты, i M.arginini - частый контаминант коммерческих препаратов сы-зоротки и клеточных культур, дальнейшие исследования были продольны с этим видом микоплазм. Для этого ¿.arginini был многодетно протитровая на разных сериях среды. Результаты, полученные з этих опытах, показали возшгшость получения воспроизводимых результатов на одной и той ке серии среды и способность u.arginint щфференцировать среды различного качества. Эти данные и тот факт, jto M.arginini широко распространенный, контаминант коммерческих фепаратов сыворотки, позволили предложить его для проверки качества полужидкой питательной среды, содержащей 0,3 % агара, пред-шзначенной для проведения контрольных испытаний ЩБП на наличие лико плазм.

Стабилизация жизнеспособных микоплазм методом

лао^ильного.высушивания

Результаты исследования свойств штамма M.arginini показали, 1то при культивировании его в бульонной срзде наблюдалось колеба- ■ аие титра в разных опытах. В связи с этим следовало провести исследования по получению штамма, стабильно сохраняющего свои исходные свойства. Для решения этой задачи были проведены опыты по юлучению лиофшшзированного препарата.

Проведешше опыты на '¿0 ампулах лиофилизированного препарата покЕзали, что культура M.arginini, сохраняла жизнеспособность, iopoiuo воспроизводилась при инкубировании в течение 7 суток при гемг.ературе (36+1) °С в бульонной среде и характеризоьалась типичным ростом на полужидкой среде. Содержание жизнеспособных микоплазм в I мл. исходной и лиофилизированной культурах колеба.Лсь незначительно в пределах от Ю7,0 до I07'5 КОЕ/мл. Это свидетельствовало о том, что лиофялизация не оказывает существенного влмя-ния на уровень жизнеспособности штамма M.arginini. Полученные результаты позволили использовать ex tempore растворенный лио-филизированный шташ M.arginini для определения чувствительности среды, которая считалась пригодной для проведения контрольных ио-" питаний на наличие микоплазм при титре штата M.arginini не нн-ае, чем Ю^ КОЕ/мл, на 7 сутки инкубации культуры при температуре (36+1) °С. *

Получение и изучение стандартного образца штамма м. arKinj.nl Важное значение для оценки воспроизводимости результатов при проведении контрольных испытаний МИБП имеет использование отрасле вых стандартных образцов, являющихся важной частью характеристик, изучаемых процессов.

Проведенные исследования, результатом которых было приготовление и изучение лиофилизироваяной культуры М.»ге1п1п1 , позвал ли поставить вопрос о получении стандартного образца, который моя было бы использовать доя оцешш чувствительности питательных сред Исследования по этоцу разделу работы были проведены в соответстви с требованиями ВОЗ (Сер. тех.докладов »626, 1981), предъявляемым к стандартам, референс-реагентам и реперенс-пре паратам.

Результаты исследования физических и биологических свойств гомогенного пула бульонной культури ы.аг;1п1п1 показали, что ле филизированшй препарат шел вид мелкопористой массы светложелтот цвета, дающий равномерную взвесь в течение I мин после внесения р творителя. Остаточная влажность не превышала 1,5 %, среднеарифмет ческое значение веса сухого вещества составило 0,433+0,005, при к фициенте вариации 1,3 %. Титр препарата составлял 10^»®±Р»05 КОЕ/ и практически не отличался от исходного до лиофилизации, Получен* препарат не содержал посторонней микрофлоры. При изучении стабили ности свойств, препарата по истечении I, 3, 6, 12 месяцев установи но, что при хранении ампул в температурном режиме (6+2) °С и мину 20 °С снижения тигра не отмечалось, что подтвервдало'сгабияьноси полученного препарата.

Таким образом, данные, полученные нами при исследовании лио-филизированного образца шта^ла М.агц1п1г.1 , отвечают требования!, предъявляемым к эталонном препаратам. Его характеристика: стабшп носгъ, точность розлива, низкая остаточная влажность - удовлетворяли требованиям и позволили рекомендовать его в качестве стадца| та для определения качества питательной среды без предварительно! подроста в бульоне. Использование стандартного образца для изуче! среды при проведении контрольных испытаний на наличие микоплазм г зволяет унифицировать качество различных лабораторных серий и стг дартизовагь условия проведения контроля.

Таким образом, разработан простой, воспроизводимый, чувствительный метод проверки качества полужидкой питательной среды, используемой для проведения контрольных испытаний на наличие микоплазм с помощью лиофилизированного стандартного образца штамма

л

i.arginini Q230. Метод прошел широкую апробацию и внедрен в практику контроля ШБП на наличие микоплазм для постоянного использова-гия. Эти исследования позволили перейти к следующему .этапу - разра-5откэ системы выявления контаминации микоплазмами ШЕИ.

♦

Разработка системы обнаруж81шя микошгазменной контаминации сыворотки крови Я1Ш0ТИЫХ - основного ингредиента литатель-ных сред для выращивания клеточных культур

Исследования, представлениио в этом разделе работы были вызва-ш тем, что к началу наших исследований в стране не было регламентированных методов контроля сыворотки крови животных на наличие ликоплазм-контаминантов, а методика контроля различных препаратов ie позволяла выявлять контаминацию микоплаэмами с достаточной стернью достоверности.

Об атом можно было судить по результатам наших многолетних ^следований - около 2 тысяч с рий различных препаратов - на отсутствие микоплазм. Контаминация микоплазмами была обнаружена в 0,75 % случаев. Наиболее часто микопказмы выявлялись в клеточных культурах (23 %), полученных из различных лабораторий страны, что объяснюсь, в первую очередь, применением конташнированных ингредиен-гов питательных сред, и, главным образом, сыворотки крупного рогатого скота.

На первом этапе этой работы проводилось изучение возможности обнаружения наиболее часто встречающихся видов микоплазм: M.agaiac-tiae, M.arginini, M.hominis, M.mycoides var. mycoides, M.pneumoniae, M.orale, U.fermontans, A.landlawii В МОДеЛЬНЫХ ОПЫТЭХ В искусственно инфицированной сыворотке крупного рогатого скота при высеве материала на полужидкую питательную среду. Результаты, полученные в этих экспериментах, указали на определенный уровень чувствительности полужидкой среды, позволяющей при первичном посеве выявлять микоплазмы разных видов в инфицированной сыворотке крови крупного рогатого скота при первичном посеве.

Однако, учитывая то, что сыворотка крупного рогатого скота может быть инфицирована незначительным количеством микоплазм и исследуемый объем 10 мл может быть недостаточен для проведения достоверного исследования, нами оыли предприняты попытки повысить чувствительность так называемого микробиологического метода. Для этого в экспериментах была проведена сравнительная оценка возможности выявления малых доз микоплазм в инфицированной сыворотке м'етодоа

методом первичного посева на полужидкую среду и методом, предусма: ривакацим предварительную инкубацию инфицированной сыворотки в булз оно с последующим высевом на полужидкую и плотную среды. Данные, i лученные на основании 3-7 повторных экспериментов со штаммами мик< плазм M.arginini, M.agalactiae, M.mycoides var. myc. ПОЗВОЛИЛИ _ при.'.ти к выводу, что система индикации мпкоплазм, включающая предварительное культивирование 100 мл инфицированной сыворотки в 300 бульонной среды в течение 7 суток с последующим высевом на полужц кую среду и дальнейшим культивированием 14 суток, позволяет выявлять низкий уровень контаминации для всех изученных штаммов микоп. (до разведения Ю-9), за счет первичного подращивания исходного ч! ла клеток микоплазм, которыми были контаминированы сыворотки кров; крупного рогатого скота. Подученные в этих экспериментах результа1 согласуются с данными Barile м. и Kern т. (1971) о том, что предварительная инкубация большое объемов сыворотки в питательном бульоне повышает возможность выявления микоплазм. Следует подчеркнуть, что на плотной среде уровень выявления микоплазм регистриро вали только в сыворотках инфицированных до Ю"^ разведения, т.е. результаты приближались к данным прямого высева. Первичная инкуба щш в бульонной среде в течение 10 и 17 суток с последующим высев на плотную и полужидкую среду на приводила к повышению чувствител иости метода. В последующих экспериментах с набором других 5 штам М0В ЫИКОПлазм: M.hominis, К.pneumoniae, K.orale, V.i'ermentans, A.iaidiawil било выявлено, что чувствительность прздложенной си теш культивирования с подращиванием для обнаружения шшимального количества микоплазм имела преимущества перед всеми ранее ррименя к шли, т.е. била выше, чем при прямом высеве инфицированной сыворо ки на .юлунидкую среду и при вторичном высеве на плотные питатель ные средн.. Анализ полученных данных указал на определенные закона мерности обнаружения минимального количества микоплазм после инку бацни в бульонной среде, а схема обнаружения микоплазм, предусмат равающая предварительное подращивание в бульонной среде в течение 7 суток с последующ;™ высевом на полужидкую сред/' и культивирован 14 суток, -явилась наиболее чувствительной, позь а гяющей выявлять я значительный уровень контаминации. Предлагаемая схема индикации и коплазм по чувствительности превосходит регламенаированный в НГД в настоящее время для МИБП прямой выспв инфицированной сыворотки ¡.а полужидкую среду на 2-3 lg и рекомендована как оптимальный f:.!КиОбИОЛОГИЧЭСКИЙ метод дня контроля сыворотки крови крупного--" рогато® скота .

Схема включает в себя:

1. Посев больших объемов сыворотки (100 мл) в трехкратный. Зъем (300 мл) бульонной средн. Инкубация в течение 7 суток во' ладной атмосфере при температуре (36+1) °С. л

2. последующий пересев на полужидкую среду, содержащую 0,3 % тара (по I мл в каждую из 10 прооирок). Инкубация 14 суток во лажной атмосфере при температуре (36+1) °С.

Разработанная двухэтапная схема индикации микоплазм была ис~ ользована нами при контроле коммерческих серий сыворотки крови азних животных. Контаминация г,'.неоплазма!,и била оонаружена в сы-оротке крови крупного рогатого скота, суягных овец и плодо.в ко-ов в 13 %, 3,2 % и 3,1 %, соответственно.

Данные, подученные в этом разделе работы позволгли заключить, то система, разработанная в экспериментальных условиях с искус-твендам заражением сыворотки зровн крупного рогатого скота полостью оправдывает себя при пр<ведении контроля коммерческих сыао-10Т0К, используемых при производстве медицинских иммунобиологиче-ких препаратов.

Цитохимический метод выявления микоплазм-контаминантов

сыворотки крупного рогатого скота

Методы индикации микоплазм в сыворотке крови животных, су-¡есгаузощие в настоящее время, ограничиваются различными модификациями микробиологического метода, ходя известно, что не все вида «лкоплазм могут расти на искусственных питательных средах. Широкое фимэнение цитохимического метода быстрого обнаружши микоплазм ) инфицированных клеточных культурах с использованием флюореевдг-зующгос красителе!! позволили нагл предпринять попытку использовать слеточные культуры для непосредственного обнаружения в сыворотке сруппого рогатого скота мшеоплазм-контамянадтов. В первой серии зпытов при подбора чувствительной клеточной культура для индика-щи мгасоплазм-контаминантов в искусственно инфицированной сыворот-се крупного рогатого^скота использовали первично трипсинизирован-ше клеточные культуры ТБ и ПЭК и шт&чма микоплазм: м.ацахас^ае, Л.агЕ1п1п1, М.mycoid.es уаг. шусо1с1ез, - применяя в качестве флюоро-срома оливомицин. С целью получения более "чистых" препаратов и ¡адекного выявления микоплазм в клеточных культурах, использовали 1вухсуточные культуры с меньшим количеством артефактов, так как 1а более поздних сроках наблюдали болыг/п з згу [ценность монослоя,

что мешало обнаружению микоплазм. На поздних стадиях формировать монсслоя наблюдали возшишовение сферически фрагментов с ярким свечением, связанное с разрушением и дегенерацией ядер клеток.

Б клеточных культурах, свободных от микоплазм, наблюдали ярго светящиеся желто-зеленые ядра на фоне темной цитоплазмы. В инфицированных клеточных культурах отмечали наличие мелких р$е рических образований, желто-зеленого цвета, расположенных вне кл ток, -по ходу клеточной мембраны и на поверхности клеток, что характерно для микоплазм.

В клеточных культурах ТБ и ПЭК, инфицированных сывороткой, имеющей разную степень заражения микоплазмами (от 1СГ^ до 10~9) наблюдали в межклеточном пространстве и по границам цитоплазмы клеток микоплазмы, которые располагались в виде тяжей, а также скоплений или отдельных мельчайших светящихся точек. Полученные данные показали возможность использования клеточных культур ТБ I ПЭК в качестве индикаторных для обнаружения минимального количества микоплазм (до разведения ГО*"9) в сыворотке крови крупного рогатого скота,' зараженной микоплазмами.

В связи с тем, что клеточные культуры Ть и ПЭК являются тр; нодоступными и довольно редко используются в лабораториях, их п. готовление требует значительных экономических затрат, связанных с забоем скота, дальнейшие исследования были проведены в первич трипсинизированных клеточных культурах: фибробластов эмбрионов (ФЭК) и перепелов (ФЭП) - более экономичных и широко применяемы в лабораторных исследованиях. Эта серия экспершаш.тов проводила аналогично предыдущей в культурах ТБ и ПЭК. Подученные результа свидетельствовали о возможности использования кяеточных культур ФЭК л ФЭП в качестве индикаторных для обнаружения микоплазм из таминированной сыворотки, поскольку микоплазмы всех использован ввдов были обнаружены в препаратах в разведенки Ю-9, т.е. в тс же количестве, что и в культурах ТБ и ПЭК.

Использование первично трипсинизированных клеточных культ} показало, что приготовленные препараты содержит большое количе ство клеточного детрита, как правило, присутствующего в клеточ! суспензии после трипсинизащщ, что затрудняло обнаружение микоплазм.

Поэтому были проведены опыты по использованию клеточной кз туры первого субпассажа. Препараты, приготовленные с клеточной

культурой первого субпассажа, не содержали клеточного детрита или количество его было незначительным, что давало возможность получать более "чистые" препараты на покровных стеклах. В дальнейшей работе при использовании всех первично трипсинизировалных клеточ~# ных культур для приготовления препаратов использовали только культуры первого субпассажа.

Следующие эксперименты были поставлены аналогично предыдущим с диплоидной клеточной линией кожно-мышечной ткани эмбриона чело-зека М-22.

В экспериментах с клеточной линией М-22 использовали два флюорохрома оливомицин и Hoechst-33258.

При высокой степени заражения, в препаратах с сывороткой, инфицированной разными видами микоплазм, в клетках U-22 выявляли микоплазмы в виде скоплений или "паутинки". При низкой инфицирующей дозе (минимальном количестве микоплазм) инфекционные агенты обнаруживали в виде отдельно светящихся точек.

Результаты.исследования показали возможность использования диплоидной лиши клеток М-22 для обнаружения микоплазм в конташ-нированной сыворотке крупного рогатого скота.

Таким образом, полученные данные позволили сделать вчвод о том, что диплоидные клетки М-22 могут быть использованы в качестве тщутаторной системы для обнаружения микоплазм-контаминантов сыворотки крупного рогатого скота. Однако, чувствительность этой культуры к микоплазмам крупного рогатого скота была ниже, чем первично трипеинизкропанных клеток, что впоследствии не позволило наги рекомендовать эту культуру для контроля сыворотки в практических лабораториях.

Проведение экспериментов с перевиваемыми клеточными линиями Hela и kdbí оказалось невозможным вследствие их частой контаминации кикоплазмами. Особенно ваяно обратить внимание на то, что использование всех видов клеточных культур в качестве индикаторных возможно только после тщательного предварительного их контроля да контаминацию микоплазмами, что делает необходимым изучение контрольных препаратов, выращенных на сыворотла, свооодной от микоплазм.

Таким образом, на основания проведенных исследований установлено, что первично трипсинизировашше клеточные культуры ТБ, ГШ, ФЭК, $ЭП могут быть использованы для обнаружения микоплазм' в сто-ротлах животных в качестве индикаторных клеточных систем. Их применение позволяет вуявля?ь через двое суток минимальную микоалпз?.--;;.

ную контаминации в сыворотке крови цитохимическим методом.

Анализ полученных данных дозволил рекомендовать клеточную культуру фибробдастов эмбрионов кур в качестве индикаторной для обнаружения микоплазменной контаминации низкого уровня, учитывая доступность, простоту ее приготовления, широту использования, в такые чувствительность этих клеток к шкоплазмам животного происхождения.

• .На основании проведенных исследований были сформулированы требования, предъявляемые к клеточным культурам, при применении их как индикаторных для выявления микоплазм-контаминантов сыворотки животных.

1. Формирование монослоя в пробирках на покровных стеклах, через двое суток инкубации не должно превышать 70-80 %. Клетки должны быть полностью распластаны, с хорошо выраженной цитоплазмой, без признаков дегенерации, с устойчивым клеточным монослоем

2. Индикаторная клеточная культура должна быть стерильна, не содержать посторонних агентов.

3. При исследовании сыворотки крупного рогатого скота рекомендуется использовать не менее 4-х препаратов на покровных стек лах, при внесении исследуемой сыворотки в каждую пробирку с инди каторной клеточной культурой. При этом контрольные клеточные культуры выращивают с предварительно проверенной на наличие микс плазм сывороткой крупного рогатого скота.

4. При обнаружении минимального количества шкоплазм на индикаторных клеточных культурах в виде единичных отдельно светящихся гранул, при условной интенсивности.контаминации на один крегт", или небольших скоплений хотя бы в одном иоле зрения, из всех исследованных препаратов, следует предполагать контаминации исследованной сыворотки микоплазмами. В этом случае необходимо провести 2-2-кратное повторное исследование на большем количеств препаратог на покровных стеклах. Использовать в качестве индика-.торных две клеточные культуры разного происхождения - животного и человеческого.

Бри обнаружении микоплазм при повторном исследовании сыворотку крупного рогатого скота считают контаминированной. .

Таким образом, следует заключить, что для получения достоверного ответа о наличии микоплазм в сыворотке следует использо-.эать,кроме микробиологического метода, цитохимический метод акспрасс-диагностики с использованием индикаторных клеточных

д. 17 -

зистем различного происхождения, свободных от микоплазм.

В заключение следует сказать, что научные данные, полученные в результате проведенных исследований, использование разработанной схемы контроля сыворотки крови на наличие миколлазм, вклю-^ чающей микробиологический и цитохимический экспресс-метод, применение отраслевого стандартного образца тест-штамма М.а^1п1п1 5250 для оценки качества питательной среды будет способствовать улучшению качества и достоверности проводимого контроля на наличие микоплазм, что несомненно приведет к повышению безопасности выпускаемых в стране МИБП.

ВЫВОДЫ

1. Стандартизован штод контроля чувствительности полужидкой питательной среды, содержащей 0,3 % агара, предназначенной для проведения контрольных испытаний медицинских иммунобиологических препаратов на наличие м \коплазм, позволяющий оценить ее качество.

2. Доказана возможность использования ляофилизированной культуры Мусор1аепа а^1п1п1 <3230 без предварительного подроста для определения качества различных серий питательной среды, что позволяет стандартизовать условия проведения контрольных испытаний на наличие микоплазм.

3. Получен отраслевой стандартный образец тест-штамма

м.argini.ru. -5230 (ОСО 42-28-105-37), предназначенный для оцзнки качества полуыидкой питательной среды.

4. Разработана двухэтапная оптимальная схема индикации микоплазм в сыворотке крови животных микробиологическим методом, включающая культивирование больших объемов сыворотки в бульоне

с посльдугоадш высевом культуры на полужидкую среду.

5. Доказана возможность использования первично- трипсияизиро-ванных клеточных культур ТБ, ПЭК, ФКЭ, ФПЭ и диплоидных клеток М-22 в качестве индикаторных для обнаружения минимального количества микоплазм-контаминантов сыворотки крови цитохимическим методом.

6. Сформулированы требования, предъявляемые к клеточным культурам при использовании их в качестве индикаторных для выявления микоплазм-контаминантов сыворотки крупного рогатого скота.

7. Разработан цитохимический метод экспресс-диагностики микоплазмеиной контаминации с использованием индикаторных кле-

точных систем различного происхождения, свободных от микоплазм о использованием флгорохромного красителя оливомидина.

8. Разработанные и усовершенствованные методы контроля сыворотки крови о0общани ь виде методических указаний: "Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на отсутствие вирухв-конта-минантов 'и микоплазм".

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теш диссертации

1. Способ очистки сыворотки крови крупного рогатого скота/ В ооавт. с Игудшшм Л.И. и др. // Вопр. вирусол, - 1980. - № 5.

С. 640.

2. Каретный Ю.В., Еардкикова З.Е. Методы выявления контами-цируыцих агентов в нормальной сыворотке крови крупного рогатого скота // Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных вируоных upenupaTOBi С6-. науч.тр. Г11СК им. Д.АЛарасеьича. - М., 1984. -С, 74-77.

3. Бердниковэ З.Е. Сравнительное изучение чувствительности методов выявления микоплавм // Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных вирусных препаратов; Сб. науч. тр. ЛЮК им. Л.А. Тарасовича. - f>i., 1985, - С. 42-4Ь.

4» Бердникова ü.tt. Получение и иттистидия стандартного образца штамм Mycoplasma arglniiii // Стьндирти, пп.ммы и методы контроля бактерийных вируешх препаратов: Сб. науч. тр. ПЮК им. Л.А.Тарасевила. - М., 1987. - С. 24-Ü6.

5. Перевиваемая линия клеток шжк - культ/¡ьяышя модель для контроля сывороток крови на контаминанты / В eoübT. с Иетручу Е.М..И др. // Вестник сельскохоз. нау!ш, - 1969. - № Ъ. - С.7^-77

6. Бердникова З.Е., Ыалунова 11.В. Выявление мк.копла;ли в сыворотке крови крупного рогатого скота, исподьзус /oll для выраниша-ния клеточаих культур - субстратов производств, медицинских иммунобиологических препаратов // Журн. микроб.,э'шдзмиол., иммуно-биол. - 1989. - & 10. - С. III-II2.

7. Бердникова З.Е., Шалунова Н.В. Контроле коммерческих препаратов сыворотки крови животных на контаминацио микоплазмами // Питательные среды и сыворотки для культивиро^анля клеток: Тезисы докладов Всес. конференции. - Концерн "Биоцепарат" НПО "Вектор", Кольцове, Новосибирская обл. - I991. - С. 50.