Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕСТ- СИСТЕМ НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО- БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НЕКРОБАКТЕРИОЗА

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕСТ- СИСТЕМ НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО- БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НЕКРОБАКТЕРИОЗА"

я-з зчм

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

РОМАНЕНКО МИХАИЛ НИКОЛАЕВИЧ

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НЕКРОБАКТЕРИОЗА \

На правах рукописи

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Шелково — 2004 г.

Всероссийский научно-исследоваггельский и технологический институт биологической промышленности

, . ч „ ,На правах рукописи

РОМАНЯНКО МИХАИЛ НИКОЛАЕВИЧ

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДУШ ДИАГНОСТИКИ НЕКРОБАКТЕРИОЗА ,

03.00.23 - биотехнология Автореферат

диссертация аа соискаянеученой степечв кандидата биологических наук

■ * К, 1 _ г

Шелково - 2004 г.

-......ЦН6МСХА,

гшш

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП)

Научный руководитель: доктор биологических наук Дмитрий Павлович Кузнецов

~ Научный консультант: академик РЛСХН, доктор ветеринарных наук, профессор, лауреат Государственной . премии РФ Анатолий Яковлевич Самуйленко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Олег Анатольевич Верховскнй;

доктор ветеринарных наук, заслуженный ветеринарный врач Российской Федерации Николай Васильевич Мельник*

Ведущее учреждение;

Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, ' ■■ . '

Зашита состоится 16 января 2004 года в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (141142, г.Щелково, Московская область, пос. Биокомбинат, ВНИТИБП).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан 15 декабря 2003г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических на

' ■ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ' ''

t , .■ / j .............. , "

Актуальность темы. Одно из центральных " мест' в ' инфекционной

патологии крупного рогатого скота занимает некробактериоз, Некробактериоз -инфекционная болезнь, проявляющаяся' гнойно-некротическими'поражениями всех органов и тканей организма. Это'заболевание наносило и продолжает накосить значительный экономический ушерб, - — '' г ~

Кроме raro, в последние годы прослеживается тенденция к обострению эпизоотической ситуации по некробактериозу, что связано с'усложнившимися хозя Пствекно-экономическими условиями ведения животноводства.

Экономический ущерб, причиняемый этой инфекцией, огромен. Он складывается из затрат, связанных с. профилактикой и лечением больных, гибелью или преждевременной выбраковкой животных, потерей продуктивности И других расходов, обусловленных' мероприятиями no'f ликвидации болезни. Некробактериоз поражает" все виды домашних'и диких животных, птиц, пресмыкающихся и человека. Наиболее чувствительны к данной инфекции олени н овцы,' а также крупный рогатый скот, свиньи, лошади^ Географически некробактериЬз'распространен на всех континентах, во всех странах, даже с высоко развитым животноводством. В Российской Федерации некробактериоз поражает ежегодно'до 7% крупного "рогатого скота и16% мелкого рогатого скота, занимая, таким образом, третье пораспространенности' место после лейкоза и туберкулеза: Огромный ущерб болезнь наносит оленеводству: из заболевших за год 50-70 тыс. оленей погибает 30-35% животных. Существенны потери от некробактериоза в хозяйствах, содержащих крупный рогатый скот.

; В настоящее..время; для: выявления tr~идентификации- возбудителя некробактериоза применяют-- серологические,' * ; . биохимические, микробиологические методы, а также постановку биопробы на лабораторных животных. * ,

Реакция иммунофлуоресиенции (РИФ) , с, успехом используют для обнаружения микробных антигенов в различных патологических материалах. Предложены и применяются несколько вариантов РИФ. _

Длительность,;, трудоемкость, недостаточная > специфичность • н чувствительность,- применяемых .в настоящее/.время ..методов, заставляет исследователей^ обратить , особое ' внимание на..разработку и внедрение..в ветеринарную практику новых высокочувствительных;и.специфичных.методов диагностики некробактериоза. В этой .связи актуальным является внедрение методов диагностики на основе нммуноферментного анализа (ИФА). Основными достоинствами ИФА являются высокая чувствительность, возможность анализа соединений с различной молекулярной массой, строго инструментальный учет' результатов; что позволяет увеличить число проб,"унифицировать методы и

реагенты, атаюке вести прямую обработку информации.

- • • -.-.''г!; ■. . - - <■ ■ ь . : ■ •

Таким образам, создание тест-систем для ускоренной диагностики:

некробактериоза на сегоднящниП лень является важной и актуальной задачей.- ^

. ,, настоящей: работы являлась разработка д и агностику мо в на основе

очищенного антигена Г.тсгорЪогит, определение.белкового состава и изучение и мму но генных свойств его отдельных компонентовдяя}использования их при создании, иммуноферментной, люминесцентной и гистохимической тесг-сисгем для диагностики некробактериоза при определении уровня антител, в крови больных и переболевших животных .и определения; наличия антигенов Р.песгорЬогитв гнойно-некротических очагах. . , , • ,

Решались следующие задачи: -•*■■■ , . ■ ■ -■ .

1. Разработать [метод получения очищенного' антмгемР.песгорЬогит и изучить белковый состав антигена ЕпесгорНогит* -- ' '.V • ■

2. Изучить клеточный' и ' гуморальный* иммунитет КРС при иекробаетериозе. ■ " ' ''"* " '' .....

Л , • * • , ' - - ^ ' *

3. Выделить 1ёО КРС, получить анти-1 КРС сыворотки на кроликах.

4. Выделить знт-Г.песгорНогит антитела^ из' сывороток клинически Сольных животных.

5. Изготовить коньюгат пероксидазы из хрена с аити-!^ КРС иконьюгаты ы\тн-Р.тсгорЬогит 1з<ЗсФИТЦиПХ. ... -,л\ ■

6. Провести сравнительную оценку эффективности определения, уровня атн-Г.песгорЬогит антител и- антигена Р-.песгоркогит' в' патологическом материале традиционными методами иИФА*. ' " ' : : ' "

7. Разработать тест-систему для диагностики иекробактериоза при определении уровня аитинекробактериозных антител в крови больных и-переболевших животных к определения наличия антигенов Р.песгорЬогит в гнойно-некротических очагах методом иммуноферментногоанализа,-

Научная новизна: Разработан метод "получения очищенного антигена Р.песгорЬогит, определен" белковыйсостав'' Р.песгорЬогит й изучены иммуиогенмые свойства его отдельных компонентов^ ''

Установлено, что в крови вакцинированных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфошш>в (Е), ЕАС-В-лимфошпов и АСК на 7-е сутки, что свидетельствует о совпадении динамики образования спонтанных Е-лимфоштов с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК.

Показана возможность выделения антинекробактериозных антител из сыворотки переболевших животных с помошью аффинной хроматографии на нерастворимой фракции бактериальных клеток:!. ' * 4 -

Впервые в Российской Федерации разработана им му ноферментная, люминесцентная и гистохимическая тест-систсмы для г диагностики некробактериоза КРС на основе очищенного антигена Ь\песгорИогит.

Практическая значимость работы. Разработана иммуноферментная, люминесцентная и гистохимическая- тест-системы, предназначенные для диагностики- некробактериоза КРС. Созданы' «Набор' для серологической иммунофермектной диагностики некробактериоза -' КРС Н*С», «Набор для иммуиоферментной диагностики некробактериоза КРС'.Н-А» и ¡.«Набор для люминесцентной .диагностики-некробактериоза. КРС Н-Л». .Материалы работы использованы при составлении научно-технической документации (НД) которая утверждается в установленном порядке. Наборыг- предназначаются для индикации антигенов Г.песгорИотт ■ и количественного определения - анти-Р.песгорЬогит антител в сьшороткахкрови КРС . ,, .

Внедрение,-а . практику' указанных наборов' позволитг проводить диагностику некробактериоза КРС в племенных и пользовательских хозяйствах при первых проявлениях .клинических, признаков, .что будет способствовать оздоровлению хозяйств,, обеспечению ,эпизоотологического благополучия,, повышению сохранности и .продуктивности .поголовья, улучшению; качества продукции. *

Апробация работы; Материалы диссертации были доложены и положительно оценены на заседаниях Ученого Совета ВНИТИБП 2000^2003 г.

Результаты работы доложены на XI Московском Международном Ветеринарном Конгрессе (Москва, 2003 г). '

По материалам диссертации опубликовано 3 работы. ..'. ■'■. • л ■ .

Структура м'объем работы. Материалы диссертации изложены на НО страницах' машинописного текста и состоят из следующих' разделов*: обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение . результатов, выводы и практические ', предложения: Список литературы; содержит , 165 источников/ из них * 100 зарубежных»1 и- 65 отечественных авторов. Работа иллюстрирована 21 рисунками, 10 таблицами; В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных

этапов работы. " . .

, г . г'; • ■■■■ - . . ■ ■ ■ ■

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

, :' : 1. Материалы и методьг ' .*

* Работа выполнена в отделе молекулярной'биологии ВНИТИБП в 20002003 гг. в соответствии с плановой научнонсследовательской тематикой.

Бактериальная' масса JFusobacterium necrophorum- была ' получена с Щелковского биокомбината (производственный штамм F.necropHorum «O-F» (ВИЭВ)). ■ ■ ' •• '' 1 ■ - ' ' ■

Бактериальную массу F.mcrophorum дезинтегрировали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10'секунд импульсивно б раз.

Реакцию торможения гемагглютинации проводили по методу Simon P.S. (1975) В реакций участвовали три компонента: иммунная сыворотка, антиген

(испытуемый материал) и сенсибилизированные эритроцит

' ■■ (■ : ■ ■ . - i ' --iL'

Электрофорез в ДСН - ПААГ проводили по методу, Лаэмл и. . t - ..

«Вестерн» иммуноблотгинг и электроперенос , белков * осуществляли по методике Тоубина' (1984). Иммуноиндикацию белков на.,ннтроцеллюлозных мембранах проводили непрямым методом ИФА; , , ...•■; ...... ) ■

Гипериммунные полислецифические антисыворотки.к IgG КРС получали по методу,, разработан ному в лаборагтории иммунологити утвержденному, на методическом совете ВНИТИОП. ( , . * / ■■■■■■•

• ¿Иммуноглобулииы'класса G (IgG) выделяли из цельной сыворотки КРС высаливанием- сернокислыми аммонием *: с последующим* обессоливанием препарата: гельфильтрацией - на сефадексс G-25" и-очисткой' ионообменной', хроматографией,на ДЕАЕ-Трисакрил-М* ■ ■ -" ••■ ■ -

.Очистку анти-IgG КРС проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными на ВгСп-Сефарозе 4B(Fluka) IgG КРС, по стандартной методике.' Контроль чистоты препаратов IgG проводили с ломошью диск-электрофореза в 7,5 % пол иакриламидном! геле (ПААГ) в слабощелочной

"ь- * * ■ '

среде. Однородностьи. .специфичность препаратов^,. IgG проверяли^ в иммуноэлектрофорезе (ИЭФ). ,• ■ ; • -

Для получения коньюгатов .анти-IgG КРС .с пероксидазой- из,хрена (RZ>3,0) использовали лериодатный метод Nakane Р (1974). Рабочее разведение коньюгата определяли согласно временной инструкции по изготовлению и контролю • антивидовых .. иммуноглобулинов, меченных пероксидазой,' утвержденной Главбиопрочом Агролрома СССР в 1986 г. Реакцию учитывали ■ на автоматическом спектрофотометре.

В работе использовали стандартные методы прямого и непрямого твердофазного ИФА на 96 луночных" микропланшетах по Engvall (1971) и др., а также метод конкурентного ИФА по Van Weeman (1971) и др.. Результаты анализа учитывали визуально или фотометрически через 15 - ЗО минут после внесения субстратного раствора:- : ... ■ • ■: - ; • •'•"

: Коньюгат ; антн-F.necrophorum IgG - ФИТЦ, а'также анти-lgG-KPC -ФИТЦ получали по Coons А.Н. (1950). '

При-изучении- клеточного иммунитета кровь-лабораторных животных стабилизировали-0,1%» ЭДТА. Выделение 'лимфоцитов из" кров и животных проводили методом1'- градиентного центрифугирования, на Фиколле-400. Абсолютное количество лейкоцитов крови определяли в жидкости Тюрля в камере Горяева, относительное.- визуально под световым микроскопом в мазках крови, окрашенных по Романовскому. . • . . •

Для количественного определения' В-лимфоцитов; применяли метод комплементе вязы воющего {ЕАС РОК) розеткообрааовання,'Т-лимфоцитов'-метод спонтанного (Е РОК) розеткообразования,- ■■ ■ t'. ■

Количественное определение и оценку функциональной'активности Т-лимфоцитов в крови, и лимфойдных органах проводили с использованием реакции розеткообразования (Е-РОК), постановку и учет которой осуществляли по стандартным методикам (Караулов А.В.*, 1999) в нашей модификации! *

ELISPOT * проводили по методу' Sedgwick J.D. (1998), Результаты

• . ■ - . . .... _ »-л ч . ■

оценивали с помощью микроскопа (Х40).

■■**'•' ' ' Результаты исследований !

2. ^Получение антигена

Бактериальную массу Fusobacterium necrophorum, полученную с Щелковского биокомбината (производственный

штамм F. necrophorum «0*1»

: + I ■' н .г .' " *L - - ' ' i * ■ ■

(ВИЭВ)), ресуспендировали в фосфатном буферном- растворе (рН 7,2), разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 15 секунд импульсивно б раз. Затем разрушенную ультразвуком бактериальную массу Fusobacterium necrophorum вновь ресуспендировали в фосфатном буферном растворе и центрифугировали 30 мин'при 5000 об/мин. Полученный супернатант» •• фракционировали методом- -..гель-фильтрации на хроматографнческой колонке К 25/100 (Pharmacia) с Тоуореаг! 55 S. Получаемые

фракции собирали с помощью коллектора фракций. Измерение оптической плотности полученных фракций проводили, на спектрофотометре СФ г 26 при длине волны 260 км. Содержимое надосадка разделялось на два выраженных пика. , ......... . • , . .. . .1 . .. ■

С целью определения наиболее активных в иммунологическом отношении фракций была построена кривая отношения1 ОП4м нм'(акговностъ' в ИФА);к ОП;вднм. Молекулярная масса белков^спеиифнчных в ИФА, распределялась в диапазоне от ЗО до 300 кнлодальтон. < - , • *.-,■■-■ • . . .

Наиболее активные фракции были' объединены, сконцентрированы ультрафильтрацией, предварительно очищены от низкомолекулярных продуктов на Сефадексе G-25 и иммобилизованы на BiCN Сефарозе 4В по стандартной методике. . , '

Сравнительное. изучение полипептидных , профилей полученных, фракций проводили с помощью электрофореза в 7,5% ПААГ с окрашиванием амидочерным. Фракции с наибольшей иммунной активностью в ИФА состояли из 13 полипептидов с молекулярными массами от 30 до ЗОО кДа.

Дня определения, пол и пептидной, специфичности антител белки, разделенные электрофорезом а ПААГ, переносили на- нитроцеллюлозные мембраны и. исследовали с помощью иммуноблотинга с сывороткой К PC, переболевшего некробактериозом, разведенной 1:50 (титр в ИФА 1:102400).

Результаты исследования белков методом иммуноблотинга показали, что

*, . ; . , : ■ t I г > t

антитела сыворотки переболевшего некробактернозом животного реагировали с большинством белков, присутствующих в объединенной: фракции. Наиболее

яркие полосы соответствовали полипептидам с м.м. 300,93,75 и 55 кДа.

. - • , • » ■■- . v ■ . . -

2.2.Клеточный и гуморальный иммунитет.КРС при некробактериозе, ,

ъ I Одним ¡из основных показателей оценки состояния .иммунной ^системы является) определение ' количества» ' и" 1 функциональных-- свойств

им м у некомпетентных клеток. Использование-' реакций розеткообразовани я (РОК) для выявления популяций лимфоцитов, а так же характеристика'АСК дает возможность оценить потенциал иммунного ответа на инфицирование организма Р.песгорЬогит. ■ , . ■, ^ *

До настоящего времени количественную оценку Т- и В-субполуляций лимфоцитов проводят в основном методом розеткообразовання. Каждая реакция РОК тшшрует определенные субпопуляции.лимфоцитов: спонтанные (Е) - Т-л им фо питы, так как они имеют рецептор на своей поверхности к определенным эритроцитом, комплемекгзависимые (БАС) - В-лнмфошггы с рецептором к СЗ компоненту комплемента. ,

Сравнительно недавно- введенный._ в. практику метод точечного иммуноферментного анализа ЕЫ5РОТ,в настоя шее время широко применяется при исследованиях в области иммунологии, ЕивРОТ основан на обнаружении и подсчете АС^ сорбированных на нктрриеллюлозной^ мембране, выстилающей дно 9б-луночной микропанели. Данный, метод предоставляет, возможность выявлять единичные антителосекретируюшие В-лимфоииты.

Для изучения напряженности клеточного и гуморального иммунитета при

некробактериозе использовали опытную (п-б) и коктрольную^п-б) группы

телят. Предварительно все животные были проверены на отсутствие антител к

Р.юсгоркогит;Телятам опытной группы вводили некробактериозную вакцину ' ' ...... ' : с ■>

производства'- ГЩБК-- (Щелковский биокомбинат) согласно - наставлению.

( . 1 ■ " • '

Контрольной-группеживотных'вводили неполный адью вант ФреЛндаг Кровь брали на 1,3,5,7," 9,11 и 14 день после введения вакцины." .....; \

н . о * " ■ " I «

Проведенные исследования показали наличие в крови как опытных, так и контрольных телят. 1^-секретирующих клеток. В крови контрольных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества «спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК клеток на 7 сутки. Полученные данные

'свидетельствуют-о том.что-динамика образования спонтанных.-Е-лимфоцитов совпадала с таковой ЕАС-В-лимфоцигов иАСК. ,, ■•■ ,

2.3.Разработка иммунофлуоресцентной тест-системы для определения Р.песгорИогит в патматериапе 1

Для " - детекции Р. песгоркогит в • патмате риале реакции

'иммунофлуоресиенции' (РИФ), необходимо бь1по " создать тест систему, основными компонентами которой "являются: .коньюгат'анги-/^ песгорЬогит -ФИТЦ (для ■ прямого* метода), коньюпгг антикв КРС - ФИТЦ и-анти-' Р.песгорЬогит КРС'(для непрямого метода).'* ; ■

Иатматериал, полученный от больных, и подозрительных животных различных хозяйств; был'использован для сравнительной оценки - прямого и ■непрямого РИФ.* Результаты, полученные'» РИФ, сравнивали с результатами в РТГА. Из 130 образцов патматериала 8 образцов оказались отрицательными во всех трех "реакциях, 4 образца- отрицагельными'в'РТГА'Ли положительными в двух вариантах РИФ,-остальные были положительными во всех трех реакциях;

."'.■", Таблица!.

Сравнительная оценка чувствительности РТГА и РИФ при обнаружении Р.песгорИогит в натматернале, (п*6)

РТГА* ' . КОЛ-ВО- . образцов .Прямой РИФ Кол-во образцов Непрямой " РИФ , Кол-во образцов

64-128 14 13" 13

"■' 32-64 66' | | | ТТТ ' 66- " +++- 66 *

2-16 " 38 ' 39 '++' - " 39'

+ • 1.-4'-'»' '4 *

.-'..V 8" ■ . 1: - ... ■■.8м

*- представлены значения, обрата ые титрам в РТГА о • , ; >

Оба варианта РИФ не уступают по чувствительности такому -надежному методу.как РТГА. Неоспоримым преимуществом РИФ являются простота и высокая ^скорость постановки реакции. Метод технически не сложен, хотя и требует определенных навыков в интерпретации результата. ,

2.4.Разрабогтка тест-системы для индикации антител к Е песгоркогит в ' • .сыворотке КРС - *

Для детекции антител к Р.песгорНопт в сы воротке - крови [ КРС в ИФА необходимо было разработать тестейстему, основными компонентами которой являются антиген, специфическая (из неблагополучных по некробактериозу КРС хозяйств) юпи-Г.песгоркогит ^ сыворотка,, .отрицательная (контрольная) сыворотка и коньюгаг антн-^О КРС с пероксидазой из хрена.

'VЛ В качестве фермента для маркирования антител использовали;пероксидазу из хрена (ПХ), марки А, ИХ - 2,9 - 3,1. Рабочая концентрация полученного иммунопероксидазного коньюгата составила 200 иг/мл (в расчете на ПХ). При данном разведении величина ОП«и> в реакции с положительным антигеном составила .1,48, с отрицательным - 0,02 оптические единицы.

С.целью оптимизации процесса постановки реакции, для увеличения точности, чувствительности и уменьшения расхода реактивов, были подобраны концентрации используемых реагентов. Для определения концентрации антигена при < постановке-ИФА> его титровали с положительной и отрицательной сыворотками в разведении 1:200. > ■ •

~ Оптимальное разведение антигена составило 1:400, что обеспечивало высокий уровень оптической плотности (ОП+м равен 1,3 - 1,5) и достоверное различие результатов со специфической и контрольной сыворотками. '' ' .

Для определения пороговой чувствительности ИФА определяли зависимость величины ОП«о продукта реакции от разведения сыворотки. Опыт

проводили при рабочей, концентрации сорбированного антигена Р.песгоркогит. Двукратные разведения положительной сыворотки начинали с разведения 1:100. Достоверно регистрируемое различие в показаниях ОГЦэд (болеечем в: 2 раза) наблюдалось при разведении специфической и контрольной сывороток с 1:200. , При разведении ниже 1:200 наблюдается неспецифическое взаимодействие, что сказывается на результатах реакции.',.,; : . . ,, , •

* Таким образом, была определена концентрация антигена Р.песгорЪогит и положительной сыворотки, которые могут быть использованы для диагностики

, некробакгериоза КРС иммуноферментным методом.1 • *■

2.5 ^Сравнительная оценкачу вствительносги И ФА'для детекции антител - сыворотке больных животных с другимиметодами исследования * '

* • Методом . ИФА;;И' РПГА1 было^ исследовано г 145;-сывороток КРС, полученных из различных хозяйств. . „ I ■ - ^ <••-..

I» . « . " - Л ■ . , г. .

" ' Результаты, полученные в ИФА, сравнивали с результатами,"полученными в-РПГА.'35'СывЬрЬток отрицательных в РПГА соответствовали титру 1:400 в ИФА. Обе методики- позволяют- исследовать - большое" количество сывороток. 1 Преимуществом метода ИФА является его более высокая чувствительность, чем

-РПГА..'. • • ■ • , .. • ■ .. ..

* - %

.,*.,-. Таким-образом, при сравнительной опенке 'уровня шги-Р.песгор/гогит антител, полученных .методами, РПГА. и. ИФА, установлено,, что результаты титрования сывороток в ИФА имеют высокую - степень , соответствия \ с результатами РПГА. Метод чувствителен,- быстр в исполнении и может быть ' использован при определении , .уровня анти-Р.песгорЬогит антител^ при обследовании большого количества животных. . , , ,

Таблица 2.

Сравнительная оценка титров антинекробактериозных антител в ИФА и РПГА

Активность в РПГА* Кол-во «-» сывороток. Кол-во «+» сывороток Титры В ИФА* Кол-во «+», сывороток

- 35 400 35

2-4 7 400-800 ■ 7

4-8:. 34 800-1600 34

8-16 .. ... _ 56 1600-3200 56

32-64 - 10 3200 - 6400 , 10

128-256 - . 3 12800-25600 • 3

*. грсдставлены значения, обрэткь!« ттрам в РТГАи ИФА

2.б.Определение диагностического тнтра антител в ИФА

Для определения диагностического титра антител исследовали сыворотки КРС, распределенных' по пяти группам. Исследования сывороток проводили каждую неделю в течение месяца (четырехкратно), с одновременным контролем клинических признаков некробактериоза и лабораторным подтверждением диагноза. В ходе опыта животные не получали никакого лечения.

На основании полученных данных, результаты которых приведены в таблице 3, намибыл выявлен диагностический титр антинекробактериозных антител. Диагноз на заболевание, животных иекробактериозом считается подтвержденным, в случае если титр исследуемых сывороток, в ИФА 1:800'и выше. Сомнительными считаются, пробы, титр которых в ИФА лежит - в диапазоне от 1:400 до 1:800. В этом случае диагноз может быть подтвержден, если при исследовании сывороток, отобранных с интервалом 14-21 сут после первого исследования отмечается увеличение титра антннекробактериозных антител на 2 и Солее разведения от диагностического титра.

; ' ! ■ ,-.* Таблица 3.

л л:'! -Определение диагностического т[т1раант11некробактерйозных антител в сыворотке больных животных

Труп ■ пы- (П-6) 0 исд. . ,1 нел, ; 1 "" "■ 2. нед > • ' ■ 3 нед ■ 4 нед.

Титл» ИФА* ■ Км ГфОгоас ИНН Титр « • ИФА* Клин. , * Тктр в : ИФА' - К лиг. *фО«и 1 Тита» - ИФА* Клин 1фО» ХиМ Тита в ИФА* Клнк' ГрО«1

1* 200— 400 -200400- - \ 200-400 200-400 200-400 -

* .' ' 8001600'- 3200-. 6400 6400-" 12800 1280025600' 3 1280052000. . 5

V'< 32006400 640012800'- 1280025600' 1280052000 4 2560052000 6

V. 12800-• 25600 2 *' 2560052000' 25600- 52000* 104000 6 52000104000' 6-

3 , 52000104000 6 . 52000104000 ,6. 52000208000: б\ 104000-208000^ .6 104000208000 6

* - представлены значения, обратные титрам в ИФА; ' ■ ■ V « * >> отсутсгйие, кликич«ск11х признаков 11скро<)актериоза- ■

7./', и ••• ••• ' . - : ^ " ■*'■ ' ■ '

*■»:■-<. 2.7.тест-системадля индикации антигенов Г.песгорМогит в латматериале и гнойно-некротическнх: поражениях КРС

гДля ■■ выявления типоспецифнчных: антигенов1 Р.песгорЬогит в патматериале и' гнойно-некротнческих ■ 'поражениях необходимо было разработать тест-систему, основными-компонентами которой являются1 анти РжсгорЬогит О,' коньюгагг анти КРС-ПХ; коньюгат анти Р.песгорНогит

Приготовление 'сорбента- для аффинной хроматографии на основе очищенного видоспецифнчного - антигена- Р,песгоркотт проводили по стандартной методике,. предварительно- очистив! антигенную фракцию от низкомолекулярных продуктов на верЬайех С-25.

. Коньюгат йкти-Р.лесгорЬогит — ПХ получали по стандартной методике. ■

'Далее была определена концентрация'«первых» антител, при которой антитела покрывали бы максимально возможную часть поверхности лунки при сорбировании. Последовательные двойные -разведения «первых» антител начиная с 1:100 были нанесены в лунки миропланшет в 0,01М карбонатном буфере рН 8,0 (сорбционный буфер). После часовой инкубации при +37°С и стандартной процедуры- отмывки в-- лунки добавляли анги-КРС иммунопероксидазный коньюгат в рабочем разведении и после часовой инкубации- при +37°С проявляли реакцию. Последнее разведение антител подложки, после которого начинает падать оптическая плотность, соответствует

■ I * *

их концентрации - ЗООнг/мл и, соответственно, их оптимальному количеству* (ЗОнг) на ЛуНКу.

Для детекции некробактериозных антигенов первые антитела сорбировали в определенной, как описано выше, рабочей концентрации на микропланшеты в сорбцнонном буфере и после часовой инкубации при +37°С и стандартной процедуры отмывки.в лунки'добавляли последовательные двойные разведения некробактернозной массы в ЗФР-Т и нормальной (предварительно протестированной на отсутствие антител к Р.песгорИогит) сывороткой КРС, содержащей 0,1% Твина-20, в качестве модели баксодержащей суспензии. После часовой инкубации и отмывки добавляли анти -КпесгорЬогит сыворотку КРС в разведении, 1:200 в ЗФР-Т, инкубировали в течение часа при +37°С, отмывали и добавляли анти-^С КРС иммунопероксидазный коньюгат.

Таким образом, были получены все необходимые компоненты тест-системы для детекции антигенов-Р, песгорНогит методом И ФА и создания на ее основе набора для имму нофермектной индикации Р. песгор!югит.

'Г -* ■ : ■ Таблица 4.

Сравнительная оценка чувствит^ьностн РТГА, конкурентного и «сэндвич» ИФАпри обнаружении Р.песгорИорлт в патматериале. ,

_ 1 1 . . РТГА Кол-во образ цо в Кол-во + ; , образно в * Конкурент' ный ИФАг *Кол-во'+" ' образцов« «Сэндвич» :.|,:ИФА;. Кол-во + образцов -

12 .'■ .12 ■ 12

' "г ' '44' 32-64 . '44 " 32-64 44

■ 29 '' " . 64-128 29 ." '64-128 29

16-32 - ■ ■'згу. *' 128-256! \ "31 . 128-256 31

32-64, т 1 зз 256-512" ";\1зз. ■ : 256-512 33 "

64-128 - 15. . 512-1024 15 .-512-1024 15 '

. .....^ ■ *- представлены значения обратные-пгтрам в ;ИФА и РТГА .- -

.*;. . .Патматериал;: полученный; от,: больных и подозрительных животных. . ( различных хозяйств, был использован для сравнительной оценки конкурентного И «СЭНДВИЧ» —вариантов ИФА,, К Г^Ч/.

г Результаты; полученныев'ИФА,' сравнивали с результатам неполученным и в РТГА; Из 130 образце впатматериал а* 12 образцов° оказались отри цате льным и ■ во всех трехреакцнях,'44 образца^- отрицательными в РТГА й положительными -1 в двух вариантах ИФА,' остальные были"положительными во всех трех реакциях!1

'(.->■ ■ 2.8.Тест-система для гистохимической индикации антигенов

: . ЕпесгорЬогйтв патматериале.". (. : г: ■ -

' Для- выявления , типоспецифичных антигенов Р.песгорИогигп' в патматериале и гнойно-некротических поражениях был, разработан гистохимический вариант ИФА, * основными ' компонентом которого был .

коньюгат анти F.mcrophorum IgG-ПХ. Для проявления реакции использовалась субстратная смесь, образующая нерастворимый окрашенный продукт; раствор тетрагидрохлорида 3,3 диаминобензндина рН 7,6, содержащий 0,01% Н;02

На чистые предметные стекла наносили мазки из пораженных областей. Мазки фиксировали метиловым или этиловым спиртом 15 минут, после чего трехкратно промывали ФБР с 0,0194 Triton X 350. Затем наносили коньюгат amn-F.necrophorum IgG-ПХ в рабочей концентрации в ФБР с 0,01% Triton X 350. После часовой инкубации при +37ОС мазок трехкратно отмывали и вносили субстратную смесь. Инкубировали 5-10 мин при комнатной температуре. Окрашивание останавливали промыванием образца G«дистиллированной водой. Учет реакции проводили под световым микроскопом при увеличении X 40.

Таблица 5

'Сравнительная оценка чувствительности гистохимического ЙФА, РТГА и ...... РИФ при обнаружении F.necrophorum в патматериале. (п^б)

РТГА?; Кол-во образно в Прямой РИФ" Кол-во образио в Непрям ott РИФ Кол-во образцов Гнсто ИФА Кол-во образцо в

64^128^ 13 ± 1 -11. тттт 13 ++++ 13 ++++ "3 ,

32-64 66 +++ 66 66 + -И- 66

2-16 • 39 ■■' ++ ' 39 -t-t- 39 ++ 39

v. 4 - ■ ' + - 4 + ■ 4 + 4

Ч . 8i 3 - 8 '■ - 8

*- представлены значения, обратные титрам в РТГА

... - + * *"' Результаты' детекции антигенов Е,песгорЬогит% полученные в

гистохимическом варианте ИФА, сравнивали с результатами РТГА, непрямого и

прямого вариантов РИФ;'Из 130 образцов патматериала 8'образцов оказались

отрицательными во всех четырех реакциях, 4 образца - отрицательными в РТГА

и ¿положительными в двух: вариантах РИФ и гистохимическом варианте ИФА, 'остальные были положительными во всех четырех сравниваемых реакциях. ^

: . . .>',-'> ■' .....

®■ "* ' " 1 выводы: • - ■

1. Отработан метод , получения очищенного антигена У.песгоркогит. С помощью электрофореза в ПААГ в составе антигена определена молекулярная масса белков в диапазоне от.ЗО до 300 КД, специфичных в ИФА.

, 2. Установлено, что в крови вакцинированных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества спонтанных. [Г-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК на 7-е сутки,- что свидетельствует о совпадении, динамики образования спонтанных Е-лимфоцитов с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК.

3. Показана возможность выделения актинекробаюериозных антител из сыворотки переболевших животных с помощью аффинной хроматографии на

нерастворимой фракции бактериальных клеток.-■*■-' —- -

1 * .... - - . ' ■ • 1 '. . : < ;;4. Получены анти-[£С КРС сывороткн-на:кроликах с титром в РДП 1:32 — •

1:256.* Синтезированы - высокоактивные* коньюгаты акта-КРС сФИТЦ'

(1:1000 в непрямой РИФ) и ПХ (1:20000 в непрямом твердофазном ИФА). ч * ~ -

5; Показано, что разработанная)., тест-система характеризуется? специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью результатов. Установлена явная. корреляционная: зависимость методов РТГА и РИФ при обнаружении антигена Р.песгоркогит в гнойно-некротических поражениях КРС, ИФА и РПГА при количественном- определении содержания антител к ЕнесгорЬогит, Выявлено, что метод ИФА' при - определении , антигена ^.песгоркогит, превосходит по чувствительности РТГА. Л . .... .

, | -, б. Технология,, пол учен няд реагентов«, и; методика, проведения ИФА положены ..в основу , разработанной ^тест-системы и* созданы «Набор для люминесцентной диагностики - некробактериоза КРС Н-Л», «Набор для

серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С» и «Набор для гистохимической иммуиоферментной диагностики некробактериоза КРСН-А»; *

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

. В практику предложены иммуноферментная, люминесцентная н гистохимическая тест-системы для обнаружения антител и антигенов к Г.песгорЬогит в сыворотках КРС. Методы может быть рекомендованы для включения в схему лабораторных исследований с иелыо диагностики некробактериоза.

Материалы работы использованы при составлении нормативной документации на «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-Л», «Набор для серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С» и «Набор для гистохимической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А» (ТУ, Инструкция и Наставление)

' СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

К М.Н.Романенко,' В.В.Меньшейин, И.И.Кочиш, ДЛ.Кузнеиов -Разработка тест-систем для детекции антигенов ГизоЬашгЫт песгорЬогит в гнойно-некротических очагах больных животных с помощью ИФА7/ Мат. XI Московского международ, ветер, конгресса, Москва, 2003 г, с.250-252.

2. М.Н.Романенко, В. В.Меньшей ни, И.И.Кочиш, ДЛ.Кузненоа -Использование реакции иммунофлуоресценции (РИФ) для детекции антигенов РшоЬаШгЫт песгорЬогитЛ Мат. XI Московского межцународ. ветер, конгресса, Москва, 2003 г, с,252-253

3. М.Н.Романенко, В.В. Меньшей и н, И.И.Кочиш, Д.П.Кузнецов - Очистка и .получение специфических антител к антигенам РизоЬааегшт песгоркогитЛ

Мат. XI Московского международ, ветер, конгресса, Москва, 2003 г, с.253-255.

Отпечатано в ООО "Мещера" зак. № 790 тор. 100