Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и применение цитоспектрофотометрического метода изменения величины рН в живой клетке

ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Оглоблина, Татьяна Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. РОЛЬ рН В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ КЛЕТОК.

1.1.Влияние рН на внутриклеточные процессы.

1.2.Анализ , методов измерения внутриклеточных рН. . IS

1.2.1.Измерение рН выделенной из клеток цито- 13 плазмы простыми электродами.

1.2.2.Микроэлектродный метод определения внутриклеточного рН

I.2.3.Определение рН клеток по распределению жирорастворимых слабых кислот или оснований.

1.2.4.Определение рН клеток с помощью колориметрии или фдуориметрии.2,

1.2.5.Метод определения рН клеток с помощью ядерно-магнитного резонанса.Я

ГЛАВА П. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПРИЖИЗНЕННОГО ОПРВДЕЛЕНШ

ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО рН. ТОЧНОСТЬ МЕТОДА.

П.1. Выбор красителя.

П. 2. Материал и методы.

П.З. Обоснование метода.

П.3.1. Результаты спектрального анализа растворов нейтрального красного. Выбор длин волн 46 П.З,2. Построение калибровочных кривых.

П. 4. Анализ погрешностей метода.

П.4.1. Правомочность экстраполяции зависимости K=f(pH) в область 10^-ной концентрации нейтрального красного.

П. 4.2. Точность определения рН структур с раз- 62. личной концентрацией нейтрального красного. 62 П.4.3. ^лияние накопления нейтрального красного на рН самой структуры.

П.4.4. Связь нейтрального красного с белками. . . 71 П.4.5. Связь нейтрального красного с мембранами.

П.4.6. Изменение ионной силы среды.

П. 4.7. Спектральная ширина щели монохроматора.

П.4.8. Точность записи спектра. ВО

П.4.9. Рассеянный свет; эффект Шварцшильда-Виллигера.

П. 4.10. Свет люминесценции нейтрального красного. 84-П.4.11. Положение измерительного зонда и фокусировка объекта.

П.4.12. Суммарная ошибка измерения рН. Проверка разработанного метода.

ГЛАВА Ш. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗРАБОТАННОГО МЕТОДА ДЛЯ ПРИЖИЗНЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ рН ЛИЗОСОМ И ЦИТОПЛАЗМЫ В НОРМЕ И ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ. 95 Ш.1. Краткая характеристика лизосомального аппарата клеток.

Ш.2.Нейтральный красный и гранулообразование в клетках.

Ш.З. Материал и методы.

Ш.4. Определение и характеристика рН лизосом клеток культуры ткани.

Ш.5. Оценка возможного влияния температуры инкубации на состояние клеток и величину внутрилизосомального рН.Ш

Ш.5.1. Обоснование проведения экспериментов при 20°С Ш Ш.5.2.'Сравнение включения 3Н-тимидина в ДНК клеток при 37° и 20°С.1Я

Ш.5.3. Сохранение клетками способности к делению и к синхронизации митозов после длительного воздействия комнатной температуры

Ш.5.4. Сравнение рН лизосом клеток при 37° и 20°С. -130 Ш.6. Влияние различных агентов на рН внутриклеточных структур. . .132,

Ш.6.1. Длияние концентрации нейтрального красного в среде на рН внутриклеточных структур. 132. Ш.6.2. Влияние рН среды на величину рН лизосом и цитоплазмы.

Ш.6.3. Действие протонофоров на величину рН лизосом и цитоплазмы клеток.14

Ш.6.4. Действие моноиодацетата. . из

Ш.6.5. Действие амитала.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и применение цитоспектрофотометрического метода изменения величины рН в живой клетке"

Актуальность проблемы. В настоящее время внимание исследователей все больше привлекает изучение рН в живых клетках и их отдельных компартментах.

Активность ферментов (разные ферменты клетки имеют различные рН-оптимумы в диапазоне от 2.5 до 9.0 ед), распределение и накопление слабых кислот и оснований, транспорт субстратов через мембраны, направление ферментативных реакций, биосинтезы и пролиферация - все эти процессы в большой степени зависят от величины рН в клетке и среде.

По мнению некоторых авторов величина рН в клетке может иметь важное функционально-регуляторное значение /Полевой,1975; бег в оп, 1978/. Это ставит перед исследователями вопрос о пространственно-временной организации клетки по величине рН» По-видимому, у клетки может быть две возможности: либо поддерживать рН на постоянном уровне, либо изменять величину рН внутриклеточных структур в процессе метаболизма. В первом случае многие ферменты никогда не будут работать в оптимальном режиме и не смогут проявить максимальную активность. Во втором - кавдый фермент в какой-то период времени сможет работать при оптимальном или близком к нему значении рН.

Второй путь, по-видимому, более целесообразен, и доказательством тому служит разделение клетки на компартменты, имеющие различные рН.

Многочисленными исследователями показано, что рН однотипных компонентов в клетках различного происхождения очень сходны: в цитоплазме растительных и животных клеток - нейтральная или слабощелочная среда с рН 7.0-7.2 ед; в лизосомах, пи

- б щеварительных вакуолях простейших, центральных вакуолях клеток растений - кислая среда с рН порядка 3.5-5.5 ед; кислая среда также в хромафинных гранулах и освещенных тилакоидах; в митохондриях и матриксе хлоропластов рН выше, чем в цитоплазме

7,6-8.5) / Полевой, Саламатова 1980; Lynn,I968; De Duve et al.,1974? Gerson,I978; Tager et al., 1982 /.

Однако, эти данные не дают ответа на вопрос о динамике рН в различных компартментах, т.е. о временной организации рН в клетке. Этот вопрос представляет собой интерес в отношении таких гетерогенных органоидов как лизосомы, которые являясь органоидом внутриклеточного пищеварения, содержат большее количество кислых гдцролаз, с рН-оптимумами от 2.5 до 7.6 ед. В связи с этим можно предположить, что лизосомы должны быть ге-терогенны по величине рН.

К сожалению, большая часть измерений рН сделана на популяциях клеток или в суспензиях органоидов и дает средне статистические значения рН в них. При этом теряется информация о размахе индивидуальных изменений изучаемого параметра. Кроме того, особенности функционирования интактных клеток и органоидов могут быть иными, чем при выделении их в суспензии / Mego et al., 1972; Schneider, 1977 /.

Исследование изменений рН отдельных компартментов может иметь большое значение и при изучении механизма действия на клетки различных агентов.

Из всего сказанного следует, что для выявления пространственно-временной организации клеток по величине рН и выяснению роли рН в процессах клеточного метаболизма, необходимо иметь метод, позволяющий изучать динамику этого параметра в

- 7 индивидуальных клетках и органоидах. Однако, до сих пор такого метода не существовало.

В свяаи с этим перед нами была поставлена задача разработки метода определения рН в отдельных лизосомах и участках цитоплазмы живой клетки в течение длительного времени, анализа погрешностей метода и применения метода для исследования клеток культур ткани в норме и при некоторых воздействиях.

Заключение Диссертация по теме "Цитология", Оглоблина, Татьяна Александровна

выводы

1. Разработан новый метод прижизненного определения рН в индивидуальных лизосомах и участках цитоплазмы живых клеток, позволяющий в течение длительного времени проводить многократные измерения в одних и тех же объектах с целью изучения в них динамики рН. Метод основан на витальном окрашивании клеток индикаторным красителем нейтральным красным, определении оптических плотностей структур в двух длинах волн (450 и 470нм), вычислении их отношения и определении по этому отношению величины рН с помощью калибровочных кривых (или соответствующих таблиц).

2. Рабочий диапазон метода от 4.5 до 7.28ед рН. Максимальная ошибка метода наблюдается в области кислых значений рН: она составляет для рН=4.7 + 0.34 ед. и по мере увеличения рН объекта значительно уменьшается (до + 0.08 ед.).

3. С помощью разработанного метода установлена значительная гетерогенность лизосом живой клетки по величине рН, причем для более крупных лизосом характерны большие значения рН. Среднее рН лизосом в живых клетках исследованных культур составляет 5.8 ед.

4. Обнаружены периодические изменения рН в индивидуальных лизосомах с размахом от 4.5 до 7,0 ед. и средним периодом от 15 до 45 минут. В различных лизосомах одной клетки колебания несинхранны.

5. При действии некоторых агентов (повышенных концентраций НК, протонофоров, ингибитора гликолиза) наблюдаются сходные процессы: рН лизосом возрастает, а рН цитоплазмы уменьшается, что приводит к уменьшению градиента рН между этими структурами с 1.2 ед до 0.3-0.0 ед. Одновременно наблюдается подавление процесса гранулообразования в клетке. Высказывается предположение, что причиной снижения гранулообразующей способности клеток является уменьшение градиента рН между лизосомами и цитоплазмой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Итак, разработанный метод многократного измерения величины рН в лизосомах и участках цитоплазмы живых клеток, окрашенных НК, позволил впервые изучить динамику рН в индивидуальных лизосомах и дать характеристику изменений рН как в индивидуальных лизосомах, так и в их популяции, с точки зрения пространственно-временной гетерогенности рН в них.

Впервые обнаружены периодические изменения величины рН в лизосомах во времени, что является практическим подтверждением теоретических предположений ряда исследователей /Goettiich-Riemann et al., 1971; Gordon, 1973 / О необходимости циклических изменений внутрилизосомального рН, которые ускоряют переваривание макромолекул.

Обнаружена корреляция величины градиента рН между лизосомами и цитоплазмой клеток с их способностью к процессу грануло

- 150 образования при действии ряда ингибиторов энергетического метаболизма. Высказано предположение, что угнетение гранулооб-разования наблвдается только при условии, если агент вызывает снижение градиента рН между внутриклеточными структурами.

- ст

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Оглоблина, Татьяна Александровна, Москва

1. Агроскин Л.С.,Папаян Г.В., Раутиан Л. П. Ре гяо тшруюпшй Ши-ринг-микроспектрофотометр. Цитология,1970,т.12,JM.с.548-558.

2. Агроскин Л.С.,Папаян Г.В. Цитофотометрия.-Л.:"Наука",1977.-273 с.

3. Александров В.Я. 0 защитном значении для клетки гранулярного связывания витальных красителей.-Арх.анат.1939,т.22,ЖЕ,с.67-73.

4. Андрианов В.К.Воробьева И.А.,Курелла Г.А.Исследование природы потенциала покоя клеток Niteiia 2.Влияние рН среды на потенциал покоя клеток Witeila Биофизика,1968,т.13,N2, с.335-336.

5. Бошсов А.Б.Булычев А.Г.Румянцев Л.П. Изменение лизосом в экспоненциально растущей синхронизованной и дифференцирующейся культурах L-клеток.-Цитология,1982,т.24,№10.с.1233 -1237.- 154

6. Гельфанд ^.И.Ррзенблат В.А. Микротрубочки. Их структура, химия и функциональная роль.-Биологич. химия (итоги науки и техн.),1977,т.II,с.78-144.

7. Рольфанд К.А. .Комшзсарчик Д.Ю.Левин C.B.Розенталь Д.Д., Трошин A.C. Ультроструктура аксона краба и его проницаемость для витальных красителей.-Цитология,1966,т.8,$5,с. 585-597.

8. Граменицкий Е.М. Прижизненная окраска клеток и тканей.-Ji. :^едгиз, 1963,-263с.

9. Догель В.а.Полянский Ю.И. Дейсин Е.М. Общая протозоология.-М-Д.: изд АН СССР,1962,-559с.

10. Евреинова Т.Н. концентрирование веществ и действие ферментов в коацерватах.-М.:Наука,1966,-273с.

11. Зеленин A.B. .Бирюзова В.И.,Воротницкая Н.Е. .Ляпунова E.H. Выделение субклеточной фракции, обогащенной цитоплазматичес-кими акридиновыми гранулами.- ДАН СССР,1965,тД62,М,с.925-927.

12. Зеленин A.B. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой.-М. .-Наука, 1971, -287с.

13. Кирьянова Е.А.Зеленин A.B. Некоторые закономерности накопления инородных для клетки веществ в лизосомахг- ДАН СССР, 1970,т.190,№2,с.451-454.

14. Конев C.B. Храповицкий В.П.Летзенкевич С.Н. Структурное изменение клеточных ядер в физиологическом интервале рН.-Биофизика,1978, т.23,М, с. 654-657,

15. Левин C.B.Гольфанд К.А. Шапиро Е.А. Зависимость скорости проникновения нейтрального красного в клетку от сорбционной способности её диффузионных препятствий.-Биофизика, 1968, т.13, №3,с.542-544.

16. Насонов Д.Н. Анализ действия различных раздражителей на клетку методом витальных окрасок,- Труды физиол. ин-та Л1У, 1934,т.14,с.139-150.

17. Насонов Д.Н. Витальное окрашивание, как метод изучения действия различных раздражителей на клетку.- Арх. биол, наук, 1934,т.34,с.163-173.

18. Ньютра.М.Леблон Ш. Аппарат Голэджи.- В кн.: Молекулы и клетки.М:"Мир",1970,в.5,с.93-105.

19. Оглоблина Т.А. Изменение количества ДНК в клетках культуры СПЭВ в процессе роста.- Цитология,1976,т.18,ЖЕО,с.1288-1290.

20. Покровский A.A.Крыстев Л.П.Тутельян В.А.,Кравченко Л.В., Бояджнева Ж.К., Доронин П.Н.Воров Б.И. Морфрлогическая и биохимическая гетерогенность лизосом.-Цитология,1975, т. 17, Ш, с. 954-959.

21. Покровский A.A.»Тутельян В.А. Лизосомы.-М.:Наука,1976.-330с. Полевой В.В.Саламатова Т.С. Протонные насосы и их функциональная роль.- В кн.: Итоги науки и техн. Физиол. раст.: М.,1980,т.4,с.78-125.

22. Полевой В.В. Регуляторные системы организмовгВестн.Моек.Унив.- 159 ~1975,сер.биол.,т.15, ЖЗ,с.104-108.

23. Роскин Г.И.Левинсон Д.Б. Микроскопическая техника,М.»Сов.Наука, 1957, ^-432с.

24. Семеньков П.Г. Изучение проницаемости одиночного мышечного волокна методом прижизненной цитоспектрофотометрии.-В кн:Биофизика живой клетки,Пущино:1970,т.1,с.П8-120.

25. Скулачев В.П. Трансформация энергии в биомембранах.-М. :Наука, 1972,203с.

26. Трошин A.C. Проблемы клеточной проницаемости.М.-Л.:изд.АН СССР, 1956.-379с.

27. Фельдман Н.Л. О распределении основных витальных красителей в клетке.-Л.:Канд.дисс.,1947.-187с.

28. Фельдман Н.Л. Сравнительная токсичность для клетки диффузных и гранулярных красителей.-ДАН СССР,1948,т.59,№,с.961-964.

29. Фельдман Н.Л.О причинах подавления гранулообразования красителей при повреждении клеток. Докл. АН СССР, 1953, т.89, №2,с.345-346.

30. Хруст Ю.Р.Речаник А.И.Литинокая Л.Д.Чепцов С.А. Устройство для одновременного цитофотометрирования и определение плотности метки в окрашенных радиоавтографах.- Вестн.Моск. Универ. сер. биол,1978,$2,с.35-39. .

31. Шапиро Е.А.«Гринфельд М.Г.Трошин A.C.- Кооперативное связывание органических красителей актомиозином лягушки.-Цитология,1974,т.16,Л5,с.582-589.

32. Ausländer W. Junge W. Neutral red a rapid indicator for pH-changes in the inner phase of thylakoids. FEBS Lett., 1975, v.59, p. 310-315.

33. Bainton P.P. Sequential degranulation of the two types of polymorphonuclear leucocyte granules during phagocytosis of microorganisms. J. Cell Biol., 1973, v.58, p. 249-264.

34. Bartels P. Spectralphotometrische Untersuchungen am Neutralrot (I). Protropiegleichgewichte und Normaltemperaturspectren in sichtbaren und ultravioleten Spectralbereich. Z. für Physikal. Chemie, Neue Folge, 1956 a, v.9, p. 74-94.

35. Bartels P. Spectralphotometrische Untersuchungen am Neutralrot (II). Das Assoziationsverhalten in wassriges Lösung. -Z. fur Physikal. Chemie, Neue Folge, 1956Ö , v.9, p. 95-105.

36. Bittar E. Cell pH, Washington: But terworthis, 1964.

37. Braatz-Schade K.» Haberey M. Stockem W« Correlation between membrane potential, cell shape and motile activity in Amoeba proteus. Exptl Cell Res., 1973, v.80, p. 456-459.

38. Brodsky V.Ya. Rhythm of protein synthesis. J. Theor. Biol., 1975, v.55, p. 167-200.

39. Bulychev A. Trouet A. Tulkens P. Uptake and intracellular distribution of neutral red in cultured fibroblasts. Exptl Cell Res., 1978, v.115, p. 343-355.

40. Butler Th.C. « Waddell W.J. Poole D.T. Intracellular pH based on the distribution of weak electrolytes. Fédérai» Proc., 1967, v.26, p. 1327-1332.

41. Coffey W». De Duve C. Digestive activity of lysosomes. I. The digestions of proteins by extracts of rat liver lysosomes. J. Biol. Chem., 1968, v.243, p. 3255-3263.

42. Davson H. Danielli J.P. The permeability of natural membranes. Ins H.afner publishing company,Davien Com., 1970, p.32-34-.

43. De Duve C>. Pressman B.C. Gianetto R. Wattiaux R. Appel-mens F. Tissue fractionation studies. 6. Intracellular distribution patterns of enzymes in rat-liver tissue. Biochem. J., 1955, V.60, p. 604-617.

44. De Duve 0. deBarsy Th. Poole B. Trouet A. Tulkena P. van Hoof F. Commentary. Lysosomotropic agents. Biochem. Pharmacol., 1974, V.23, p. 2495-2534.

45. Dell'Antone P. Evidence for an ATP-driven "proton pump" in rat liver lysosomes by basic dyes uptake. Biochem. Biophys. Res. Com., 1979, v.86, 180-189.

46. Deutsch C.I. Holian A. Holian S.K. Daniele R.P. Wilson D.F. Transmembrane electrical and pH gradients across human erythrocytes and human peripheral lymphocytes. J. Cell Physiol., 1979, v.99, p. 79-94•

47. Eagle H. The effect of environmental pH on the growth of normal and malignant cells.- J.Cell Physiol.,1974, v.82, p.1-8.

48. Eidus I<»Kh.« Korystov Yu.N., Litinslca.la L.L. Morosov M.A. Vekaler A«M* The study of dye accumulation in granules on vital dyeing of Chinese hamster fibroblasts in culture* Stud, bio-phys., 1977, v.62, p. 85-92»

49. Ellis P., Thomas R.C* Direct measurement of the intacellu-lar pH mammalian cardiac muscle» J. Physiol., 1976, v.262, p. 755-771.

50. Falkner G. Horner P. Werdan K„. Heldt H.W. pH changes in the cytoplasm of the blue*-green alga, Anacystis nidulans caused by light-dependent proton flux into the thylakoid space. -Plant Physiol., 1976, v.58, p. 717-718.

51. Fitzsimons R.J.» Sendroiy J* Distribution of electrolytes in human blood, J. Biol* Chem., 1961, v.236, p. 1595-1601.

52. Furusawa K.t Kerridge M.T. The hydrogen ion concentration of the muscles of the cat* J. Physiol. London, 1927, v.63, p. 33-41.

53. Gerson P.P. Burton A.C. The relation of cycling of intracellular pH to mitosis in the acellular slime mould Physarum po-lycephalum. J. Cell Physiol., 1977» v.9i, p. 297-303.

54. Gerson P.F. Intracellular pH and the mitotic cycle in Physarum and mammalian cells* In: Cell cycle regulation, N.-Y. Acad. Press, 1978, p. 105-131*1. Giese C* Cell Physiology. 1968

55. Gillies K.J». Deamer D.W» Intracellular pHj methods and applications. Curr. Top. Bioenerg., 1979, v.9, p. 63-87. '

56. Goettlich-Riemann W., Joung J.Q. Tappel A.L. Catepsins P, A and B and the effect of pH in the pathway of protein hydrolysis. Biochim.Biophys«Acta, 1971, v.243, p. 137-146.-164

57. Gordon A.H. The role of lysosomes in protein catabolism. -'In: Lysosomee in Biol, and Pathol.: Amst.-London, 1973, v.^, p. 89-135.

58. Henning R» pH gradient across the lysosomal membrane generated by selective cation permeability and Donnan equilibrium. -Biochim. Biophys. Acta, 1975, v.401, p. 307-316.

59. Hes R. Measurement of intracellular pH. Biosci. Rep., 1981, v.l., p. 687-699.

60. Hollemans M. Rei.ingoud D.J. Tager J.M. Evidence against a MgATP-dependent proton pump in rat-liver lysosomes. Biochim. Biophys. Acta, 1979, v.551. p. 55-66.

61. Hsung J. C. Hang A. Intracellular pH of Thermoplasma acido-phila. Biochim. Biophys. Acta, 1975» v.389, p. 477-482.

62. Jensen M.S. Bainton P.P. Temporal changes in pH within the phagocytic vacuole of the polymorphonuclear neutrophilic leucocyte. J. Cell Biol., 1973, v.56, p. 379-388.

63. Johnson J.J. Epel P. Paul M. Intracellular pH and activation of sea urchin eggs after fertilization. Nature, 1976, v.262, p. 661-664.

64. Johnson J.J. Epel D. Intracellular pH of sea urchin eggs measured by the dimethyloxazolidinedione (DM0) method. -J. Cell Biol., 1981, v.89, p. 284-291.

65. Junge WM Renger G., Ausländer W. Proton release into the internal phase of thylakoids due to photosynthetic water oxidation. FEBS. Letters, 1977, v.79, p. 155-159.

66. Kaminskas E. The pH~dependenae of sugar transport and of glycolysis in cultured Ehrlich ascites-tumor cells. Biochem. J., 1978, v.172, p. 453-459.

67. Kirk P.W« Neutral red as a lipid fluorochrome. Stain technol., 1970, v.4£, p. 1-4.

68. Koenig H, Intravital staining of lysosomes by basic dyes and metallic ions. J* Histochem. Cytochem., 1963, v.11, p. 120-121•

69. Kogure K., Busto RM Schneiberg P., Reinmuth Q»M. Dynamics of cerebral metabolism during moderate hypercapnia. J. Neuro-chem., 1975, v.24, p. 471-478.

70. Mandell G.L. Intraphagosomal pH of human polymorphonuclear neutrophils. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1970, v.134, p. 447-449.

71. Mego I.L. The effect of pH on cathepsin activities in mouse liver-heterolysosomes. Biochem. J., 1971, v.122, p. 445-452.

72. Mego J.L. Purther evidence for a proton pump in mouse kidney phagolysosomes: effect of nigericin and 2,4-dinitrophenoi on theatimulation of intralysosomal proteolysis ATP. Biochem. Bio-phys. Res. Com., 1975, v.67, p. 571-575»

73. Mego J.Ii. The ATP-dependent proton pump in lysoBome membranes. Still a valid hypothesis. FEBS Lett., 1979, v.107, p. 113116.

74. Mitchell P. Chemiosmotic ooupling in oxidative and photosyn-thetio phosphorylation. Biol. Rev», Cambridge, Phil. Soc., 1966, v.41, p. 445-502.

75. Ohkuma S. Poole B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc. Natl Ao. Sei. USA, 1978, v.75, p.3327-3331.

76. Ohkuma S», Poole B. Cytoplasmic vacuolation of mouse peritoneal macrophages and the uptake into lysosomes of weakly basic substances. J. Cell Biol., 1981, v.90, p. 656-664.

77. Overton E. Uber die osmotischen Eigenschaften der Zelle in ihrer Bedeutung für Toxikologie und Pharmakologie. Z. Phys.

78. Chem., 1897, v.22, p. 189-209.

79. Pick U.» Avron M» A method for measuring the internal pH inilluminated chloroplasts based on the stimulation of proton uptake by amines. Eur. J« Biochem., 1976 a, v.70, p. 569-576.

80. Pick U. Avron M. Neutral red response as a measure of the pH gradient across chloroplast membranes in the light. FEBS Letters, 19766" , v.65, p. 348-353.

81. Poole D.T. Butler T.C. Waddell W.J. Intracellular pH of the Ehrlich ascites tumor cell. J. Nat. Ganc. Inst., 1964, v.¿2, p. 939-946.

82. Poole B», Ohkuma S» Effect of weak bases on the intralysosomal pH in mouse peritoneal macrophages. J.Cell Biol., 1981,v.90, p. 665-669.

83. Poole-Wilson P.A., Cameron I.R. EGS, intracellular pH, and electrolytes of cardiac and skeletal muscle. Am. J. Physiol., 1975, V.229, p. 1299-1304»

84. Rei.jngoud D.J. Pud P.S. Kas J. Tager J.M. Relationship between medium pH and that of lysosomal matrix as studied by two independent methods* Biochim. Biophys. Acta, 1976a,v.448, p. 290-302.

85. Rei.jngoud D.J«. Qud P.S. Tager J.M. Effect of ionophores on intralysosomal pH. Biochinu Biophys. Acta, 19765 , v.448, p. 303-313.

86. Reifjngoud D.J. Tager M.J. Measurements of intralysosomal pH. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v.297, p. 174-178.

87. Rei.jngoud D.J». lager J.M. Effect of ionophores and temperature on intralysosomal pH. FEBS Lett., 1975, V.J54, p.76-79«

88. Rei;)ngoud D.J. Tager J.M. The permeability properties of the lysosomal membrane. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v.472, p. 419-449.

89. Robbins E. Marcus B.J. Dynamics of acridineorange-cell interaction. I. Interrealtionship of acridine orange particles and cytoplasmic reddening. J» Cell Biol., 1963» v.18, p. 237260.

90. Roos A. Intracellular pH and distribution of weak acids across cell membranes. A study of d«» and 1-lactate and of DM0 in rat diaphragm. J. Physiol. (London), 1975» v.249. p.1-25.

91. Roos A. Boron W.P. Intracellular pH. Physiol. Rev., 1981, v. 61, p. 296-434.

92. Rous P. The relative reaction within living mammalian tissues. I. General features of vital staining with lithmus. -J. Exp. Med., 1924, v.41, p. 379-398.

93. Rottenberg H. Greenwald T., Avron M. Determination of ApH ,in chloroplasts. 1. Distribution of methylamine. — Eur•

94. J* Biochem., 1972, v.25, p. 54-63.

95. Schneider D.L. AÎP-dependent acidification of intact and disrupted lysosomes. Evidence for an ATP-driven proton pump. -J. Biol. Chem., 1981, v.256, p. 3858-3864.

96. Schneider D.L. Membranous localization and properties of ATP-ase of rat liver lysosomes. J. Membr. Biol., 1977, V.34, p. 247-261.

97. Schuldiner S. Rottenberg H«. Avron M. Determination of ApH in chloroplasts. 2. Fluorescent amines as a probe for determination of a pH in chloroplasts. Eur. J. Biochem., 1972, v.25. p. 64-70.

98. Shen S.S. Steinhardt R.A. Direot measurement of intracellular pH during metabolic derepression of the sea urchin egg. -Nature, London, 1978, V.272, p. 253-254.

99. Siefermann-Harms D. The accumulation of neutral red in illuminated thylakoids. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v.504, p. 265-277.

100. Slavik J. Intracellular pH topography: determination by a fluorescent probe. FEBS Lett., 1983, v.156« p. 227-230.

101. Stillwell W. Doram K. Measurement of transmembrane proton diffusion using two liposome-sequestered pH indicator dyes. -Biochem. Biophys. Res. Com., 1980, v.93, p. 326-332.

102. Thomas R.C. Intracellular pH of.snail neurones measured with a new pH-sensitive glass microelestrode. J. Physiol., 1974, v.2,38, p. 159-180.

103. Thomas J.A. Cole K.E. Langworthy T.A. Intracellular pH measurements with a spectroscopic probe generated in situ. -Fed. Proc., 1976, v.35, p. 1455-1461.

104. Valet G. Raffael A. Moroder L. Wünsch E. Ruhenstroth-» Bauer G. Past intracellular pH determination in single cells toy flow-cytometry. Naturwissenschaften, 1981, v.68, p. 265-266.

105. Waddell W.J. Butler T.C. Calculation of intracellular pH from distribution of 5,5-dimethyl-2,4-oxazolidinedione (DM0)s Application to skeletal muscle of the dog. J. Clin. Invest., 1959, V.38, p. 720-729.

106. Warburg Q. Uber die Oxydationen in lebenden Zellen nach Versuchen am Seeigelei. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1910, v.66, p. 305-340.

107. Working P.K., Meizel S. Evidence that an ATP-ase functions in the maintenance of the acidic pH of the hamster sperm acroso-me. J. Biol. Chem., 1981, v.256. p. 4708-4711.