Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гиперрепликация ДНК в процессах восстановления структуры и функции клеточных популяций

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гиперрепликация ДНК в процессах восстановления структуры и функции клеточных популяций"

<изии81гъь <т,гцт1Ъ5П№зиъ 'и^гп-вбпн/ъьрь иэодзм» ииилх>ит>и

№||]Ы|П1(Ш^Ц иЬйишршйтр^О Г>бит[илп1Ш

^иритмд ыьъи №ШЫ.Ь

аъгс>-11 ^'пь-ррь-'пц^измгъ пааивм. <пп<ппм.зиамгьирь мипш-заишгь апкиизии-зь чь-ри.адьчии'ь адрссгоизъьгпыг

Ч-. 00.03 15п|Ь1)гн[ш|[1Й ЦЬВишршОгпр.|тО Ь1 чЬОЬш^Цш

ЦЬСишршОш^шй (}{илгир.|тиС(1Ьр|1 Т1п1[шпр[1 q[lшшl^ш[i шит^бшО^ ЬицдйшО ^шш^шб чЪ^тдйиШ ЙЬт} штЪйифтипвдтб

ЬРЬОДг. 1998

/ Г ...... г - -

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

КАРАЛОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

ГИПЕРРЕПЛИКАЦИЯ ДНК В ПРОЦЕССАХ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ

0Г>. Г <•>

Дисссертация в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук, по специальности

00.03. Молекулярная биология и генетика

ЕРЕВАН 1998

U2|uuiuiuißpi! tiuiwiujulbit Unibljni|uij|iG ijbfitiuipuiGnipjuiG hGuuifimnimmil /« q.UU/

linGum[inuiGm 1(ийишрш(1ш1|шС qfimnipjniGübpti titilpnnp ITiuquipjuiG 3ni.

TluyimiGuiliiuG pGiyiliiSuiJunuGbp'

1[ЬСишрш(1ш1{шС qtiinmpjniGQbpJi ipilpnnp, идопфЬипр <uiprupjni(ijui(i Р. U". IjbGuuipiuGiuljuiG qtiuimpjruGGbpji ipilpunp TjtuqujpjuiG U. P-. ljtiGuuipuiGuil{uiG qfimmpjniGGbpfi rpiljump (UuuujuipjiuG Q .

Цпшршшшр liuimSuiljbpmmpjiufi'

U]ujipuip <Ьршдм uiüij. UpUuiGji «ЧЬинЦиШ P-d^uilpuG <шйш1ишршй

^lU^miquiGmpjniGtj liuijuiGiupu t йшриф i 11998p i). 11.00

A< 4-UU, <. Iu.Pniß{iuipjmß{i шЦ. iiböuwpfiiJJiw^ hßumjimnimli /375014, L-pLiuifi, "1. UbimljJi, 5/1/ i5umGuiq}imuigi}ui& Junphpi^i GJiumruü:

UmUGuijutiunipjruÜQ ljmph]]\ l йшйпршйш^

«. Ч-ЦЦ, luiiinüjiiupjuiüli uiüij. 4büuuip(iil}\iuj}i Миифииииф qpuiijuipujGniii UbinSmqJipj) шпшр^шй t Q Q 03 . 1998p UiuuGiuq]iimii1iuiQ JunphpijJi ршришщшр, ,

llLGuiupiuGuilpuG q[imn!pjtiiüGbp[i цп^шпр

Работа выполнена в Институте Молекулярной Биологии Национальной Академии Наук Республики Армения.

Консультант: Доктор биологических наук, профессор Магакян Ю. А.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Арутюнян Р. М. Доктор биологических наук Назарян К. Б. Доктор биологических наук Гаспарян Г. Г.

Ведущая организация:

Ереванский Государственный Медицинский Университет

Защита состоится 11 марта 1998 в 11.00 ч. на заседании Специализированного Совета 042 при институте биохимии им. акад. Г. X. Бунятяна HAH РА (375014, Ереван ул. Паруйра Севака, 5/1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. акад. Г. X. Бунятяна HAH РА

Автореферат диссертации разослан 63. ¿3,1998 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

Доктор биологических наук, профессор -/Оои^ХР, Симонян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Одной из главных проблем современной молекулярной и клеточной биологии является раскрытие механизмов регуляции развития и функционирования клеточных систем эукариот. Все модели для их изучения создаются и используются с целью познания механизмов регуляции нормального и патологического роста и развития клеточных популяций животных и человека. Однако, несмотря на многочисленные Экспериментальные . данные и большое число предложенных теоретических разработок, эта проблема до сих пор далека от разрешения. Важнейшим звеном в ее решении является изучение внутриклеточных, популяционных и системных механизмов регуляции двух фундаментальных процессов - пролиферации и цитодифференцировки, соотношение которых изменяется в ходе развития и функционирования каждой клеточной полуляции и определяется деятельностью генетического аппарата клеток и регуляцией его активности. Поэтому особо важное место в этих исследованиях занимает изучение количественных и структурных изменений ДНК в ядрах клеток, значение, этих изменений в осуществлении процесса цитодифференцировки, их взаимосвязи с терминальной специализацией и, в конечном итоге, реализации программы развития клеточных популяций в целом.

Исследуя характер изменений в количестве ДНК, степени выраженности этого явления в клетках и его роли, места и значения при развитии всех известных типов клеточных популяций - растущих, обновляющихся и долгоживущих, Ю.. А. Магакяном была выдвинута, а затем биологически и математически обоснована концепция, согласно которой в нормальных условиях развития популяций при необходимости ускорения процессов цитодифференцировки и интенсификации тканеспецифических синтезов включаются резервные механизмы активации генома в виде дополнительного синтеза ДНК, названного "гиперрепликацией" ДНК (Магакян, 1990). В этих же исследованиях было показано, что гиперрепликация ДНК, будучи средством повышения надежности генетического аппарата клетки и адаптации к внешним условиям, может быть закреплена в эволюции вида и входить в программу нормального развития различных клеточных систем. Было показано также, что клетками, в зависимости от ситуации, могут быть использованы различные способы умножения своего генома в целом и отдельных его участков или блоков (полиплоидия, политения и амплификация генов).

Между тем значительный интерес представлял также вопрос о роли, месте и значении "гиперрепликации ДНК при восстановлении клеточных популяций в экстремальных условиях и патологии, так как обдюизвестно, что в основе восстановления поврежденных органов и тканей лежат такие фундаментальные процессы, как размножение и гипертрофия клеток, причем доля участия их при регенерации разных органов неодинакова. В центре внимания при исследовании процессов регенерации всегда стояли три основных вопроса: каким образом реализуется процесс регенерации, каковы внутриклеточные и надклеточные источники восстановления и как регулируются

регенерационные процессы. Исходя из этогс^ было естественным проведение исследований характера функционирования различных клеточных систем при разного рода патологиях и в экстремальных условиях, выделяя в качестве главной задачи анализ проявлений и роли гиперрепликации ДНК, индукция запуска механизмов которой, представлялась вполне вероятной в этих условиях. Учитывая то, что между процессами регенерации и эмбриональным развитием органов и тканей наблюдается определенное сходство, а также то, что гиперрепликация ДНК нередко входит в программу развития эмбриональных популяций в норме, представлялось интересным проведение сравнительного анализа проявлений гиперрепликации ДНК в аналогичных эмбриональных и регенерирующих клеточных системах. При этом мы исходили из положения о том, что в основе регуляции размножения, дифференцировки, специализации и жизнедеятельности клеток в делом лежит, во первых, регламентация со стороны генома клетки и суммарного генома популяции и, во вторых, возможность реализации генетически обусловленных потенций к сохранению жизнеспособности в изменившейся ситуации.

Важное место в наших исследованиях заняло также изучение влияния биологически активных веществ на восстановительные процессы при различных патологиях и в экстремальных условиях и проявлений гиперрепликации ДНК при этом.

В качестве модели при исследованиях стабильных клеточных популяций были аыбраны паренхиматозные органы, в частности, печень и поджелудочная железа, в программу нормального развития которых входит гиперрепликация ДНК путем их полиплоидизации и образования двуядерных клеток. Она наблюдается в постнатальном развитии крыс и носит необратимый характер, поэтому в этих исследованиях изучалась не инициация процесса гиперрепликадии ДНК при патологии, а степень выраженности этого явления под влиянием повреждающих факторов. Этим и обусловлен интерес к изучению жизнедеятельности панкреацитов и гепатоцитов в патологии и к выяснению взаимозависимостей между внутриклеточными и популяционньшм системами регуляции, определяющими характер функционирования механизмов гиперрепликации ДНК, степени ее выраженности в норме и патологии и вклада в процесс самосохранения популяции.

Интересно было также выяснить имеет ли место индуцированная .гиперрепликация ДНК, в той или иной форме своего проявления в популяциях, где в нормальных условиях все клетки диплоидны. К таким популяциям относятся непрерывно обновляющиеся во взрослом организме популяции, например гемопоэтическая популяция, среди клеток которой согласно литературных данным, лишь у мегакариоцитов сильно выраженная полиплоидия входит в программу дифференцировки при нормальном тромбопоэзе (Garcia, 1964, Westte, Penington, 1972, Abramov 1985). Поэтому нами и было предпринято исследование поведения клеток моноцитопоэтической и эритротюэтической линий в аспекте проблемы гиперрелликации ДНК в патологии и в экстремальных условиях И влияния биологически активных "веществ на процесс^ цитодифференцировки в этих условиях.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы явилось исследование изменений возникающих в системах регуляции размножения и функционирования клеточных популяций в экстремальных условиях, при экспериментально вызванных патологиях и восстановительных процессах без воздействия и в присутствии различных биологически активных веществ, проявления, степени выраженности и роли гиперрепликации ДНК в восстановлении структуры клеточных популяций и уровня тканеспецифичеческих синтезов, а также изучение возможных проявлений эмбриональных механизмов гиперрепликзции ДКК в посткатальном развитии при некоторых патологиях и в экстремальных условиях у представителей разных классов позвоночных.

Очевидно, что изучение биологии клетки, ее структур и процессов метаболизма на современном этапе прежде всего предполагает исследование их химической природы. Цитоспектрофотометрия является главным методом, с помощью которого возможно исследовать вещества непосредственно там, где они синтезируются и функционируют, не нарушая, при этом, структуры как клеток, так и популяции в целом. Поэтому большое внимание в работе было уделено также оптимизации методов □Шоспектрофотометрии и разработке новых методов объективной оценки распределения исследуемых вешеств в клетке.

Для разрешения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1.Усовершенствовать метода цитофотометрии препаратов, окрашенных по Фельгену, для исследования ДНК.

2.Разработать - новые методы объективной оценки распределения веществ и анализа структуры хроматина в клетке.

3.Используя в комплексе современные методы аналитической биологии клетки исследовать:

а. Зависимости между процессами пролиферации и цитодифференцировки при регенерации стабильных и постоянно обновляющихся клеточных систем;

б. Действие биологически активных веществ на процессы восстановления клеточных популяций при патологии и в экстремальных условиях;

в. Динамику синтеза и накопления ДНК, РНК, суммарного и ткзнеспецифического белков в клетках исследуемых популяций в эмбриогенезе, во взрослом организме в норме, патологии, экстремальных условиях и при воздействии биологически активными веществами;

4.Сравнить механизмы дифференцировки клеточных популяций в эмбриональном развитии с механизмами восстановительных процессов этих же популяций во взрослом состоянии в экстремальных условиях.

5.Выяснить роль, и значение гиперрепликации ДНК в восстановительных процессах.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

На основе проведенных нами методических исследований Сыли усовершенствованы существующие и разработаны новые метода подготовки биологического материала для количественных цитохимических исследований ДНК и анализа данных, получаемых с помощью сканирующей цитофотометрии и ЭВМ. Даны рекомендации по применению фиксаторов, условий гидролиза, окрашиванию препаратов, способам приготовления реактива Шиффа. В результате этих работ значительно повысилась точность измерений и снизился коэффициент вариации до 3,5%^ ^|то при наличии современной сканирующей аппаратуры в комплексе с ЭВМ сделало возможным анализ структуры цитологических объектов на основе количественной оценки распределения в них изучаемого вещества. Это в свою очередь позволило на основе разработанных нами новых методов объективной оценки распределения веществ в клетке и имеющихся в литературе данных, создать программное обеспечение паспортизации клеток, которое может быть рекомендовано для использования в биологических лабораториях и в практике медицинских учреждений. Многие из наших рекомендаций используются в методических руководствах ( см, "Методические рекомендации по использованию методов количественной цитохимии для определения состава клеточных популяций и свойств хроматина у растений и животных", из-во АФИ, Л.,1964).

Впервые проведено систематическое исследование взаимосвязей между гиперрепликацией ДНК в различных её проявлениях и процессами регенерации при патологии и в экстремальных условиях на специально подобранных клеточных системах, представляющих разные типы клеточных популяций - стабильные и постоянно обновляющиеся:

а) впервые получены новые данные о динамике синтеза и содержания нуклеиновых кислот и белков, а также о распределении экзогенных панкреацитов и тепатоцитов по плоидности на разных стадиях экспериментально вызванного острого панкреатита у крыс; показано, что в неповрежденной части поджелудочной железы и в печени кардинально изменяется распределение исследуемых клеток по классам плоидности и начинают преобладать (свыше 60% популяции) 4с и (2с+2с)клетки, характеризующиеся значительно более высокой активностью синтеза и накопления РНК и белка, чем у аналогичных клеток в норме.

б) Показано, что тиосульфат натрия в первой фазе острого панкреатита повышает устойчивость панкреацитов и гепатоцитов к действию токсинов и снижает активность протеаз, образующихся при некробиозе, а во второй фазе стимулирует синтез ДНК в этих клетках и их размножение, ускоряя темпы восстановления численности жизнеспособных клеток и предотвращает переход панкреатита в хроническую форму.

в)Впервые среди макрофагов лимфоузлов и селезенки мышей линии СНА выявлены клетки с гипердиплоидным и тетраплоидным содержанием ДНК в ядрах. При канцерогенезу доля таких клеток уменьшается в связи с их миграцией в опухоль, Введение ретиноидов восстанавливает численность гиперреплицированных макрофагов до уровня у интактных мышей и доля синтезирующих ДНК клеток достигает 2,8%.Вероятно

ретиноиды ускоряют процессы созревания макрофагов, их активацию и обновление.

г) Показана способность эритроидных клеток взрослых птиц избирать разные пути дифференцировки и специализации в зависимости от остроты экспериментально вызванной анемии у птиц, направленные на ускорение восстановления численности эритроцитов и титра гемоглобина в крови и обусловленные разными способами гиперрепликации ДНК и степенью цД выраженности.

д)Нами открыт неизвестный путь ускоренной дифференцировки первичных эритроидных клеток в терминально специализированные клетки-ретикулоциты, сопряженный с выходом их из цикла в фазах Сх и Сг,ч направленный на повышение содержания гемоглобина в этих клетках.

е) Впервые показано, что в первичных эритроидных клетках куриных зародышей происходит синтез и накопление экстрахромосомной ДНК, которая локализуется в акцессорных ядрах и обусловливает накопление повышенного количества гемоглобина в этих клетках.

ж) Впервые показано, что в поогнатальном развитии клеточных популяций в экстремальных условиях у представителей разных классов позвоночных возможно проявление эмбриональных механизмов гиперрепликации ДНК, не имеющих места в нормальных условиях их жизнедеятельности.

Наши исследования позволили выяснить, что гиперрэпликация ДНК играет важную роль не только а развитии клеточных популяций, но и при патологии, и в экстремальных условиях. Механизм гиперрепликации ДНК не обязательно действует постоянно, а скорее всего обеспечивает жизнедеятельность и функционирование клеточных систем на стыке процессов пролиферации и дифференцировки и определяет способность клетки решать задачи, предусмотренные программой раззития в особых, экстремальных для возможностей популяций условиях, поэтому гиперрепликацию ДНК наряду с пролиферацией и дифференцировкой следует отнести к фундаментальным явлениям в развитии биологических систем, закрепленных в процессе эволюции.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ:

1. Оптимизация методов количественного определения ДНК а клетке и анализ распределения веществ в микрообъекте.

2. Разработка програмного обеспечения биологических исследований.

3. Исследование гиперрепликации ДНК в стабильных клеточных популяциях (экзокринных панкреацитах и гепатоцитах ) при патологии на модели острого экспериментально вызванного панкреатита у крыс.

4. Сравнительный анализ выраженности явления гиперрепликации ДНК в панкреацитах и гепатоцитах крыс при действии на процесс индуцированного острого панкреатита тиосульфатом натрия.

5. Обнаружение гидеррепликации ДНК в макрофагах мышей в норме при экспериментально вызванном канцерогенезе и в условиях воздействия на него ретиноидами.

6. Выявление гиперрепликации ДНК при экспериментально вызванной фенилгидразиновой анемии у птиц. Определение взаимозависимости

между степенью тяжести анемии и формой проявления гиперрепликации ДНК.

7. Исследование влияния гемина на процессы клеточной дифференцировки при сильной анемии у птиц.

8. Сравнительный анализ гиперрепликации ДНК в эритроидных клетках при разной остроте анемии у взрослых животных и в первичном эритропоэзе у лтиц.

9. Изучение резервных механизмов регуляции эритропоэза при острой фенилгидразиновсй анемии у крыс.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Диссертационная работа заслушана и обсуждена на Ученом совете Института молекулярной биологии АН РА.

Основные результаты работы представлены на 2 Всесоюзном симпозиуме по соматической полиплоидии {Ереван, 1977), на научной конференции по вопросам молекулярно-клеточной биологии (Ереван, 1979 и 1983), на 7, 8 и 9 Всесоюзных симпозиумах "Структура и функция клеточного ядра" (Харьков, 1980; Пущино, 1984, Черноголовка, 1987), на 7 Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, 1981),на 4 Советско-западногерманском симпозиуме "Структура и транскрипция генома" (Ереван, 1981), на Всесоюзном совещании "Автоматизация цитологических исследований (Киев, 1983), на республиканской конференции "Макромолекулы и функция клеток" (Ереван, 1986), на научно-практической конференции "Новые приложения морфометрии и математическое моделирование в медико-биологических исследованиях" (Харьков, 1990), на Всесоюзном совещании "Функциональная морфология клетки" (Санкт-Петербург, 1991), на международной конференции "World of microstructure" (Севан, 1996) и на конференции «Электронная микроскопия-97» Ереван 1997.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

1. Методические разработки и рекомендации по фиксации, условиям гидролиза и окрашиванию препаратов вошли в руководство "Методические рекомендации по использованию методов количественной цитохимии для определения состава клеточных популяций и свойств хроматина у растений и животных" для студентов и аспирантов Ленинградского Агрофизического института (Из-во АФИ, Л., 1984) .

2. Методическая монография "Цитофотометрия ДНК" (в соавторстве с Магакяном Ю.А.), Из-во АН Арм.ССР, Ереван, 1989. Работа суммирует результаты собственных исследований автора, которые были выполнены в 1978-1989 гг. в Отделе физико-химической биологии клетки (зав. д.б.н., профессор Магакян Ю.А.) Института молекулярной биологии НАН РА.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация зыпслнека в форме научного доклада. Объем диссертационной работы изложен на 60 страницах машинописного текста, состоит из общей характеристики работы, экспериментальной части, включающей 3 раздела и 9 глав, выводов и списка опубликованных работ автора. Работа иллюстрирована 25 рисунками ИЗ таблицайА

МАТЕРИМ И МЕТОДЫ

1.Объекты исследований.

а) гепатоциты крыс, б) экзокринные панкреациты крыс, в) эритроидные клетки крыс, г) эритроидные клетки голубей д) первичные эритроидные клетки эмбрионов кур, е) макрофаги селезенки и лимфоузлов линейных мышей ж) клетки Т-лимфоСластоидных линий in vitro.

Кроме того для решения различных методических вопросов были использованы клетки различных тканей отличающиеся друг от друга по содержанию ДНК и по плотности упаковки хроматина в ядрах. 2.Методы:

а) В зависимости от задач исследования и специфики объекта готовили парафиновые срезы (толщиной не более 5 мкм), мазки или отпечатки.

б) Окрашивание препаратов.

Для цитоморфологических исследований препараты окрашивали гематоксилином по Майеру, эозином и азур-эозином по Май-Грюнвальду (Ромейс, 1954).

Для одновременного выявления в клетках ДНК и суммарного белка препараты окрашивали фуксином по Фельгену и нафтоловым желтым S (Gaub, Zetteberg, 1975).

Для определения количества гемоглобина, ДНК и суммарного белка в одной и той же клетке была впервые применена методика их последовательной фотометрии: сначала на неокрашенных препаратах определяли количество гемоглобина, а затем, после фиксирования координат измеренных клеток и окрашивания по вышеприведенной методике, количество ДНК и суммарного белка (Магакян Ю. А., Каралова Е. М., 1989).

Для выявления суммарных нуклеиновых кислот препараты окрашивали галлоцианином и хромовыми квасцами (Зандриттер и др., 1969) .

Для количественного анализа гликогена использовали реакцию ШИК (Кудрявцев Б. Н., и др., 1972).

Синтез ДНК и РНК исследовали с помощью авторадиографии. В зависимости от задач Н3-гимидин или Н3-уридон взрослым животным вводили парэнтерально или внутривенно, а эмбрионам кур - в пугу. Препараты обрабатывали общепринятыми методами с использованием ядерных эмульсий и определяли индекс метки.

в) Количественный анализ.

Количество и концентрацию исследуемых веществ определяли с помощью сканирующего микроскопа-фотометра SMP-05 (Opton), оснащенного управляющим компьютером IBM 386.

Спектральные характеристики веществ, выявляемых

стехиометрически связывающимися красителями, снимали на ширинг-микроспектрофотометре "Марш" (Агроскин J1. С., Папаян Г.В., 1977).

Одновременное определение количества и распределения ДНК, белка и других веществ в клетках проводили с помощью системы анализа изображений IBAS-2 (Opton) по фирменной программе или сконструированного в Отделе физико-химической биологии клетки ИМБ HAH РА телевизионного анализатора изображений по нашей программе "BIOSCAN".

Последующую обработку данных и их многопараметрический анализ производили на быстродействующем компьютере IBM 486.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РАЗДЕЛ 1 МЕТОДИЧЕСКИЕ РАЗРАБОТКИ Глава I.

Оптимизация методов приготовления препаратов для количественной цитохимии ДНК.

Для решения этой задачи нами было проведено сравнительное исследование содержания окрашенной фуксином ДНК в ядрах эритроцитов и моноцитов петуха и распределения оптических плотностей в скано- и гистограммах при 6 различных способах и продолжительности фиксации препаратов: 96% и 100% этанол, фиксатор Карнуа (100%-й этанол-хлороформ-ледяная уксусная кислота; 6:3:1), ФСУ (40%-й формалин-100%-й метанол-ледяная уксусная кислота; 9:3:1), МФУ (100%-й ыетанол-$|-й формалин-ледяная уксусная кислота; 17:2:1) и ЭУФ (96%-й этанол-ледяная уксусная кислота; 3:1 и формалин в конечной концентрации, равной 2%) . Продолжительность фиксации - 15-150 мин. с интервалом 15 мин. Препараты, фиксированные в растворах с формалином, промывали в проточной воде (2 ч) . Гидролиз проводили в 5 н HCl, 60 мин при 22°С, препараты окрашивали реактивом Шиффа по Фельгену, заключали в бальзам и фотометрировали. Для получения объективных характеристик степени компактизации или декомпактизации хроматина при разных способах фиксации использовали сканограммы численных значений оптических плотностей в каждой измеренной точке ядер, определяли полную экстинкцию объекта, вычисляли коэффициенты рельефности и вариации и строили частотные и взвешенные гистограммы распределения ДНК-фуксина в ядре.

Показано, что количество ДНК-фуксина, при прочих равных условиях проведения реакции Фельгена, в большой степени зависит от способа и продолжительности фиксации. Лучшим из фиксаторов оказался ЭУФ, после которого окраска наиболее интенсивна и практически не зависит от продолжительности фиксации, а структура хроматина сохраняется лучшим образом. Поэтому для определения количества ДНК мы рекомендуем фиксировать препараты в ЭУФ в течение 1 ч с последующей промывкой мазков или отпечатков в проточной воде 2,5 ч. и сушкой на воздухе (рис 1).

* 'т '«'¿>

Рис 1. Изменения в содержании ДНК-фуксина в ядрах эритроцитов петуха в зависимости от способа и продолжительности фиксации.

По осям абсцисс - продолжительность фиксации (мин)j по осям ординат - количество ДНК-фуксина усл. ед. темными кружками отме-чены точки, соответствующие тем срокам фиксации, для которых

проводились исследования по программам Агеа^йап print, а) 96% этанол, О) 1004 этанол, в) фиксатор Карнуа, г) ФСУ, д) МФУ, е) ЭУФ.

Ввиду того, что при окраске ДНК по Фельгену реактивом Шиффа необходимо проведение предварительного гидролиза, условия которого играют важнейшую роль в реакции Фельгена, нами была исследована его кинетика при разных режимах температуры и концентрации кислоты, которая четко отражается в кривых гидролиза, а.

i

Рис 2. Кривые гидролиза ДНК эритроцитов (1) и моноцитов (2} при разных условиях его проведения.

По оси абсцисс продолжительность гидролиза (мин) по оси ординат количество ДНК-фуксина уел ед. Условия гидролиза: а) 1н. HCL 60"С, б) 5н. HCL ' 37°С, в) 5н. HCL 22°С. Стрелками отмечены

достоверно различающиеся

значения. количества ДНК-фуксина у эритроцитов и моноцитов.'

ЭУФ

Нами на мазках в течение 75

периферической крови петуха, мин, исследовано действие

фиксированных в 3-х вариантов

гидролиза: 1) 1н HCL, 60 С, 4-30 мин с интервалами 2 мин., 2) 5н HCL, 37°С, 4-34 мин с интервалами 3 мин., 3) 5н HCL, 22°С, 10-150 мин., с интервалами 10 мин. Показано, что кривые гидролиза во всех вариантах моновершинны, но при 22°С наблюдаемся плато, что и делает этот тип гидролиза предпочтительным. Поэтому рекомендуется именно этот вариант гидролиза (рис 2¡.Нами была также определена зависимость интегральной оптической плотности и спектров

поглощения ДНК-фуксина от качества красителя и способа приготовления реактива Щиффа. Выло апробировано 6 прописей приготовления реактива и 10 фуксинов. Показано, что многие, из выпускающихся различными фирмами красителей, не пригодны для количественной цитохимии, поскольку характер кривых спектра фуксина, связавшегося с ДНК в сильной степени зависит от их качества (рис.3);

м> № ко

Рис 3. Спектральные характеристики л. фуксинов разных марок, обязавшихся с

— ДНК ядер эритроцитов петуха, окрашенных реактивом Шиффа по Стоуэллу.

^ По оси абсцисс - длины волн (нм) по

— оси ординат - оптическая плотность, " уел ед.

1. Fushin basish special. (Shusardt)

— 2. Diaxnantfashin ¡Merck). 3. Фуксин основной для фуксин-сернистой кислоты. {Reanal) 4. Neufushin pulfer fur die Microskopie (Merck). 5. фуксии основной для микробиологических целей. 6. Фуксин основной для фуксин-сернистой кислоты (ТУ 1738-52) 7. Фуксин основной для фуксин-сернистой кислоты (1964) 8. Фуксин основной (ЗТУ 2766 51) 9. Fushin basic (Sigma). 10. Fushin basish (Serva)

в го время, как интенсивность окрашивания ДНК и длительность сохранения уровня рН раствора в значительной степени определяются способом его приготовления. По этим показателям лучшими оказались фуксин Diamant фирмы Merck и пропись, предложенная Стоуэллом.

Глава II

Использование данных сканирующей цитофотометрии для анализа распределения поглощающего вещества в клетках.

В последние годы в практике цитологических исследований большое распространение получают методы цифрового анализа изображений и среди них представление объекта в виде цифрового поля, полутоновой и псевдоцветной топограмм, псевдорельефа, гистограмм распределения оптических плотностей, а также различные статистические показатели.

Изображение микрообъекга в виде цифрового поля наиболее полно отражает картину распределения вещества, привязывая каждое цифровое значение измеренной точки поля к топографии клеточных структур. Этот метод был использован нами в исследованиях первичных эритроидных клеток кур, что позволило получить ранее неизвестную информацию о распределении и количестве ДНК в их ядрах. Представление объекта в виде цифрового поля или голограммы мы с успехом использовали также для оценки качества препаратов, выявления потёков и других дефектов в результате разрушения клеток

и

при обработке материала. Однако топограммный анализ может быть затруднен при сравнении структур с нечеткой пространственной локализацией концентрации вещества. В этом случае необходимую информацию мы получали с помощью гистограмм распределения оптических плотностей, которые позволяют охватить всю картину распределения локальных концентраций и оценить различия или сходство сравниваемых объектов. Использование гистограмм позволило нам объяснить природу потерь ДНК при разных условиях гидролиза, строго количественно оценить их величину и судить о соотношениях в ядрах компактизированиого и рыхлого хроматина и рекомендовать наиболее оптимальные условия проведения гидролиза.

Частотные гистограммы, построенные традиционны способом, в ряде случаев не позволяют получить представление о вкладе вещества той или иной плотности в суммарное его содержание, что затрудняет оценку биологической значимости изменений в распределении вещества, таге как при этом не учитывается различие классов гистограмм по "весу". Этого недостатка лишены предложенные нами взвешенные гистограммы, где высоты столбцов в избранном интервале плотностей равны количеству вещества в нем и соответственно сумма высот всех ее столбцов равна содержанию вещества в объекте. Благодаря этому легко установить вклад разных классов плотностей в суммарную оптическую плотность объекта. По взвешенным гистограммам можно выбрать уровень дискриминации при фотометрии, оценив допустимую величину потерь. Гистограммный анализ позволяет вычислить среднюю гистограмму и получить характеристику распределения вещества внутри клеток данной группы, что упрощает сопоставление разных групп. Оперируя ими можно не только сравнить различия распределения веществ в объект-е, но и оценить достоверность результатов. Но гистограммы и их параметры не содержат информации о характере распределения вещества по полю и поэтому недостаточны для морфологического описания. Этот недостаток ликвидируют предложенные нами коэффициент рельефности -р, отражающий пространственные перестройки объекта, текстурный коэффициент - б, определяющий степень мозаичкости объекта, не зависящий от величины поглощающего фона и не изменяющийся при пропорциональном нарастании плотности всех гранул, и коэффициент взаиморасположения частиц - г), который отражает характер перемещения оптически плотных гранул по фону. Между коэффициентами наблюдается хорошо выраженная корреляция, поэтому их совместное использование вносит существенный вклад в информацию о нерегулярности и изменениях в распределении веществ в клетках (рис.4).

Рис 4. Характеристика перераспределения вещества между фоном и частицами и распределения частиц с помощью показателя рельефности р (1), текстурного коэффициента 9 (2) и коэффициента взаиморасположения частиц т](3) .

По вертикали - значения показателей. 1-1У - варианты распределения вещества и частиц.

На основании проведенных исследований нами была разработана многопараметрическая система паспортизации клеток, включающая как известные статистические характеристики (средняя ошибка, дисперсия, коэффициенты: асимметрии, эксцесса, автокорреляции, средней абсолютной разницы), так и предложенные нами коэффициенты.

Используя эту систему для анализа реальных биологических объектов, мы выявили объективную картину распределения веществ в каждом из исследованных нами типов клеток, что сделало возможной количественную оценку их специфичности. Предпринятое в дальнейшем их применение для оценки различий в структуре хроматина ядер гепатоцитов крыс, окрашенных фуксином и нафтоловым желтым S, при остром панкреатите и его лечении тиосульфатом натрия, показало, что предложенные нами параметрические характеристики в числовом представлении отражают реальное морфофункциональное состояние хроматина, т.к. выявленные нами достоверные изменения в столь консервативной структуре как хроматин, могли быть обусловлены только воздействием факторов, специфичных для данной патологии.

Важно отметить, что хотя система многопараметрической обработки данных сканирования была разработана в первую очередь для анализа количества у распределения ДНК в:..идоах она, будучи универсальной, с успехом может быть испольэаййна для подобного исследования любых клеточных структур и веществ- - белков, липидов, углеводов и пр.

Так, интересные данные были получены нами при анализе количества и распределения белков р24 и др41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ1) , ^выявленных методом непрямого перок-сидааного окрашивания (Кущ А. А. и др., 1994) в инфицированных Т лимфоцитах линий МТ4 и Jurcat-tat in vitro. Был определен максимум поглощения .комплекса антитело-антиген, равный <П0нм, и впервые лримеиея цитофотометрический многопараметрический анализ: количества и распределения этих белков, благодаря чему бьпггитголучена недоступная ранее информация об их поведении «-зараженных клетках в процессе развития инфекции. Удалось- устаяш^итк„различия в динамике содержания и распределения: -б^.пкип обеих линий и

показать, что в отличие от клеточных Оадки^^содоржание которых прямо коррелирует с площадью клетки,- ■■вирусные „балки - ведут себя иначе. Можно полагать, что фактором,- ояредёляицим-массу белков р24 и др41 в клетке, является их концентрация в каждой данной точке, а не размеры клетки.

Рис. 5. Изменение в кинетике содержания и характера распределения белков ВИЧ-1 в зараженных клетках в процессе развития инфекции. По осям абцисс - время культивирования (сут); по осям ординат -значения параметров (услов.ед.).а,б - масса белков; в, г концентрация; д,е - площадь; ж, з - периметр, и, к - среднее арифметическое отклонение, л, м - показатели рельефности, н,о -текстурный коэффициент п,р - коэффициент взаиморасположения частиц. Полые кружки - белок др41, заполненные - белок - р24

Сказанное подтверждают кривые кинетики значений среднего арифметического отклонения и коэффициента рельефности (рис 5) .

Эта информация, отражающая белок-синтезирующую активность ВИЧ, впервые указывает на значение концентрации и, соответственно, месторасположения конкретных белков вируса для функционирования и выживания пораженных клеток. Еще более важно, что полученная информация впервые позволила объективно судить не только о динамике развития вирусной инфекции, но и об "отношении" к ней клеток разного происхождения, о чем наглядно свидетельствуют данные мкогопараметрического анализа. Необходимо подчеркнуть, что различия обнаруживаются не только в связи с принадлежностью клеток к разным линиям, но и в поведении белков, отличающихся по выполняемым функциям. Данные иммуноцитофотомегрии и многопараметрического анализа позволили вскрыть тонкие механизмы взаимоотношений между вирусом и клеткой.

таким образом, разработанная нами система паспортизации клеток и ее программное обеспечение могут быть рекомендованы для использования в биологических лабораториях и в практике медицинских учреждений.

РАЗДЕЛ II. ГИПЕРРЕПЛИКАЦИЯ ДНК В СТАБИЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ В

ПАТОЛОГИИ

Глава III.

Морфофункциональные и количественные цитохимические изменения экзокринных панкреацитов при остром экспериментальном панкреатите у крыс

Проблема регенерации органов, восстановления их функций нарушенных в результате различных повреждении занимает важное место в современной биологии и медицине. Классическими объектами при этих исследованиях являются паренхиматозные органы, в частности, печень и поджелудочная железа, патологические процессы в которых широко распространены и имеют жизненно важное значение (Савельев, 1983, Канаян А. С., 1984, Кудрявцев В, Н., 1991).

В работе нами была использована предложенная Скмаворяном (1973) методика получения экспериментального острого панкреатита (ЭОП) у крыс путем охлаждения селезеночного отдела поджелудочной железы (ПЖ) струей хлорэтила в течение 1,5 мин. Температура ткани при этом понижалась до -30°С , затем охлажденный участок в течение 30-60 сек. оттаивался между пальцами до восстановления нормальной температуры, извлеченные ткани погружали в брюшную полость и зашивали рану послойно. Крыс весом 150-160 г. оперировали под общим наркозом, предварительно, за сутки до операции выдерживая без пищи, но не ограничивая потребление воды, в целях синхронизации секреторного цикла экзокринных панкреацитов (ЭЛ) и накопления в их цитоплазме зимогенных гранул (Пермяков, Подольский 1973) . Было прооперированно 120 крыс. Контролем служили содержащиеся в тех же условиях и также прооперированные, но без охлаждения селезеночного отдела крысы, а также интактные особи. Спустя 3 и 6 часов, а также на 1, 2, 3, 7, 14, 20, 21, 22 и 30-е сутки животных декапитирозали (не менее 5 особей на каждый срок)

извлекали не подвергшийся охлаждению дуоденальный отдел ПЖ и печени и исследовали. Части животных ежесуточно парэнтерально вводили 30%-й водный раствор тиосульфата натрия (ТСН) из расчета 50 мг на 100 г. веса животного в течение 3 сут. и 25 мг в последующие сутки. За час до забоя части крыс внутривенно вводили Н3~тимидин, (по 3 особи на каждый срок в подопытной контрольной группах).

Производили описание структурно-морфологических изменений в клетках и тканях, морфометрический анализ панкреацитов и гепатоцитов, определяли индекс меченых клеток и митотический индекс, подсчитывали число одно- и двуядерных клеток, их общую численность на единицу площади среза (0,01 им) и долю жизнеспособных клеток. Цитоспектрофотометрически определяли количество ДНК, суммарных нуклеиновых кислот общего белка в клетках, а также гликогена в гепатоцитах.

Полученные нами данные свидетельствуют, что распределение одно- и двуядерных панкреацитов по классам плоидности у интактных крыс типично для паренхиматозных органов в нормальном состоянии: около 60% составляют диплоидные, в том числе циклирующие клетки, а остальная часть популяции представлена полиплоидными, в подавляющем большинстве двуядерными элементами. Лишь 0,8% клеток включает Н3-тимидин (рис. 6 ) и только 1% делится (рис. 7).

0 к 1 з т 14 30

Рис 7. Изменения кинетики итотической активности зкзокринных анкреацитов под действием тиосуль-ата натрия в процессе эксперимен-ального острого панкреатита у рыс.

По оси абсцисс - время, сут; по си ординат - митотический индекс % 1. контроль (интактные крысы), 2. контроль (панкреатит) 3. опыт.

О"' ' 30

Рис 6. Изменения кинетики синтеза ДНК в экзокринных панкреацитах под действием тиосульфата натрия в процессе экспериментального острого

панкреатита у крыс. По оси абсцисс - время, сут; по оси ординат - индекс мечения %0

Уже через сутки после индукции острого панкреатита резко сокращается доля 2с клеток, вследствие дегенерации и пикноза ядер в результате некроза клеток, а также в связи с синтезом ДНК частью из них. Индекс мечения к этому времени возрастает втрое, при неизменно низких значениях митотического коэффициента. Доля отсутствующих в норме гиподиплоидных клеток в популяции составляет 7,0%. Изменения, выявленные на 1-е сутки, усиливаются, и к 3-м суткам число деградирующих панкреацитов достигает 14% и возрастает количество гипотетраплоидных двуядерных клеток (рис 8). При этом, в результате

активации синтеза ДНК в двуядерных панкреацитах увеличивается доли 4с- и 8с- клеток, что согласуется с данными авторадиографии (число меченых панкреацитов к этому времени достигает 6,4% ). Несколько повышается и митотический коэффициент, но если учесть что он, в первую очередь, зависит от деления ядер 4с- и Эс- клеток, а не их размножения, т.к. число одноядерных 4с- клеток к этому времени возрастает более, чем в 3 раза по сравнению с 1-ми сутками, то становится очевидным, что это свидетельствует об интенсификации процесса гиперрепликации ДНК в панкреацитах. В это же время происходит максимальное развитие патологического процесса, что проявляется в увеличении числа дегенерирующих клеток с пикнотическими ядрами, сильно вакуолизированной цитоплазмой и некрозами ацинусов с нарушенной архитектониникой, а также в сильно выраженных междольковом, межацинарном и внутриклеточном отеков. Интересно, что именно в этих участках, в основном, выявляются делящиеся и синтезирующие ДНК клетки. Это подтверждает высказанное ранее Савельевым с соавт. (1973) предположение, что выброс в интерстиций при некробиотических разрушениях клеток плазменных ингибиторов способствует блокированию до того активированных протеолитических ферментных систем и создает условия для активации регенерационных процессов. Эту стадии панкреатита мы определили, как завершающую состояние т.н. "первичного аффекта", характеризующуюся использованием для восстановления гомеостаза органа всех наличных ресурсов панкреацитов при одновременном распространении интерстициального отека ткани, который по всей вероятности, предшествует новой фазе в развитии панкреатита. Он протекает на фоне сильно обострившейся интоксикации, вызванной некробиотическими процессами в пораженном отделе железы, что также является дополнительным индуктором интенсификации регенерационных процессов в дуоденальном отделе. К 7-м суткам в дуоденальном отделе уже наблюдаются многочисленные нормально скомплектованные ацинусы с активно синтезирующими зимоген одно- и двуядерными клетками, и резкое сокращение числа гиподиплоидных и гилотетраплоидных деградирующих панкреацитов. При эггом увеличивается доля нормальных синтезирующих ДНК 2с- клеток, а также 2с- и 4с- панкреацитов, что согласуется с авторадоографическими и цитоморфологическими данными, свидетельствующими о наибольшей интенсивности восстановительных процессов в это время. Достигнув максимума к 7-м суткам эти процессы с меньшей интенсивностью продолжаются в течение следующей недели. На 14-е сутки, на фоне сокращения количества гиподиплоидных и гипотетраплоидных и возрастания числа нормальных 2с-, 4с- и 8с-панкреацитов, снижается доля клеток с "промежуточными" значениями ДНК, т.е. проходящих фазу синтеза (рис. 8) . Это четко согласуется с данными об уменьшении числа меченных панкреацитов к этому времени. В дальнейшем острый панкреатит переходит в хроническую форму и на 30-е сутки, при почти полном соответствии распределения двуядерных клеток по содержанию ДНК таковому у интактных крыс, число 2с-клеток уменьшается вдвое при многократном увеличении доли 4с клеток. Поэтому более 60% популяции составляют одно и двуядерные 4с- панкреатиты. Это свидетельствует о блоке значительной части панкреацитов в фазе С2 при практически полном отсутствии гиподиплоидных и гипотетраплоидных панкреацитов. Поскольку возрастание объема "фракции" 4с- панкреацитов наблюдается уже с 14-

х суток, можно предположить, что клетки в этом состоянии наиболее устойчивы к разного рода вредным воздействиям при некробиозе железы.

Рис 8. Изменения распределения экзокринных панкреацитов у крыс по классам плоидности в процессе экспериментального острого панкреатита и под действием тиосульфата натрия. Ио горизонтали - классы плоидности, с; по вертикали -число клеток, I. а - контроль (интактные крысы), б-е - 1,3,7,14 и 30-е сут после индукции панкреатита соответственно; левые столбики из каждой пары - контроль правые -опыт - панкреатит и ТСН, заштрихованные участки двуядерные ЭП.

В связи с изложенным представляют интерес данные, характеризующие изменения содержания РНК в клетках на разных стадиях болезни(рис. 9). К 1-м суткам ее содержание значительно увеличивается, в особенности в одноядерных панкреатитах, что согласуется с данными об интенсификации их функциональной активности, однако затем РНК-синтезирующая активность снижается и количество РНК в них к 3-м суткам становится даже ниже, чем в клетках у интактных крыс. Именно в это время достигают максимума некробиотитические процессы в паренхиме дуоденального отдела поджелудочной железы, но параллельно начинаются процессы восстановления численности панкреацитов и интенсификации их функциональной активности, что находит отражение в непрерывном увеличении содержания РНК и к 14-м суткам оно оказывается в несколько раз выше, чем у здоровых крыс. Особенно сильно выражен этот процесс, как и в период "первичного аффекта", у одноядерных клеток. При переходе в хроническое состояние содержание РНК остается примерно на том же уровне.

Несколько иначе выглядит кинетика содержания суммарного белка. В отличие от РНК количество белка к 1-м суткам снижается, затем возрастает вплоть до 14-х суток, после чего при переходе в хроническую стадию вновь незначительно падает {рис. 10). Основываясь на данных, приведенных раннее, можно полагать, что и первое и второе повышение количества белка обусловлены активацией экзокринной функции клеток. Это также хорошо согласуется с динамикой регенерациоиного процесса. Следует отметить, что колебания в содержании белка, как и колебания в содержании РНК, сильнее выражены у одноядерных (в особенности диплоидных), чем у двуядерных клеток.

то »■

1 3

я

I I »

Рис 9. и 10. Изменения кинетики содержания суммарных нуклеиновых кислот (РНК) и суммарного белка в экзокринных панкреатитах под действием тиосульфата натрия в процессе экспериментального острого панкреатита у крыс.

По оси абсцисс - время, сут; по оси ординат - количество вещества, усл. ед. 1. контроль (интактные крысы), 2. контроль (панкреатит) 3. Опыт (панкреатит и ТСН).

Это подтверждает предположение о том, что клетки с высоким содержанием ДНК в ядрах (4с-, 2с+2с, 8с-) более устойчивы к воздействию вредных веществ, образующихся при некробиоз, чем 2с-клетки. Чтобы охарактеризовать динамику регенерационного процесса при панкреатите в целом, и представить вклад в этот процесс клеток с повышенным в результате гиперрепликации содержанием ДНК в ядрах, мы использовали показатель численности жизнеспособных клеток (как сохранившихся после индукции панкреатита, так и вновь образовавшихся), приходящихся на единицу площади среза железы. Оказалось, что после значительного понижения к 3-м суткам, идет непрерывное восстановление ил численности, так что к 30-м суткам жизнеспособные клетки составляют 99% популяции. Существенно, что эти клетки функционально намного активнее, чем панкреациты интактных крыс, доказательством чему является более высокое суммарное содержание в них нуклеиновых кислот, в первую очередь РНК (в 3 раза) и белка(в 1,5 раза).Если учесть что размеры панкреацитов к 30-м суткам лишь ненамного больше, чем у интактных крыс, то следует полагать, что накопление больших количеств РНК и белка происходи® за счет увеличения их концентрации в клетках. Важно отметить, что основная нагрузка при этом приходится на блокированные в постмитотической фазе цикла двуядерные (2с+2с) панкреациты и на блокированные в постсинтетическом периоде одноядерные 4с- панкреациты, составляющие более 60% популяции.

Суммируя результаты гисто- и цитоморфологических, авторадиографических и количественных цитохимических исследований жизнедеятельности панкреацитов в процессе острого и хронического панкреатита у крыс, можно заключить, что он приводит к существенной перестройке механизмов регуляции на клеточном и популяционном уровнях, происходящей в два этапа. Первый, завершающийся на 3-й сутки острого панкреатита, характеризуется активацией внутриклеточных защитных механизмов экзокринных панкреацитов в ответ на токсическое воздействие продуктов распада ткани поджелудочной железы при лекробиозе и проявляется в быстром накоплении РНК, интенсификации экзокринной функции панкреацитов и в изменении ряда цитоморфологических параметров. На втором этапе включаются надклеточные (популядионные) механизмы регуляции,

направленные на восстановление численности жизнеспособных клеток, их быструю адаптацию к изменившимся условиям и стабилизацию функционирования в этих условиях. Существенную роль в активации защитных механизмов системы экэокринных ланкреацитов играет кардинальное перераспределение их по плоидности: формируется качественно иная структура популяции с преобладанием {свыше 60%) 4с- и (2с+2с) клеток, обладающих в несколько раз более высокой активностью синтеза и накопления РНК и белка по сравнению с нормой. Происходит это в результате реализации "резервной программы" ускоренной гиперрелликации ДНК, интенсификации ее синтеза, т.е. в данном случае кратного 2с умножения числа геномов в клетках и дозы генов в популяции, а также митотической активности панкреацитов, и на этой основе повышения содержания в них РНК и белка, восстановления их численности и, в итоге, зкзокринной функции поджелудочной железы в целом.

В наших опытах острый панкреатит к концу второй фазы переходил в хроническую форму. Между тем известно, что при благоприятном течении отечной формы острого панкреатита возможно "спонтанное самоизлечение" (Савельев и др., 1983), как мы полагаем, в результате преобладания защитной функции системы жизнеобеспечения панкреоцитов над некробиотическими процессами в течение 2-й фазы острого панкреатита. Этому могло бы способствовать введение биологически активных веществ, ингибирующих деятельность ферментов протеолиза и препятствующих развитию хронического панкреатита на иммунной основе. К ним можно отнести тиосульфат натрия, обладающий дезинтоксикационными, десенсибилизирующими, антигистаминными и стабилизирующими клеточные мембраны свойствами (Van Canaghen, 1972, Trinkus, 1976) и способностью подавлять протеиназную активность (Van Canaghen 1972). Из медицинской практики известно также, что тиосульфат натрия стимулирует регенерацию тканей и органов при их частичной резекции (Анисимова и др., 1973) и при разного рода патологиях, связанных с развитием некробиотических процессов ' (Кибрик, Жильцова, 1984; Кибрик и др.,1886). Вместе с тем недостаточно были выяснены механизмы воздействия этого препарата на указанные выше процессы и практически отсутствовали сведения о проявлении его действия на клеточном уровне. Этим и был обусловлен наш интерес к изучению поведения экэокринных панкреацитов и их популяции в целом в ответ на введение тиосульфата натрия. Исследования показали, что митотическая активность панкреацитов у крыег которым вводили тиосульфат натрия, на первом этапе панкреатита оказывается ниже, чем у животных, которым его не вводили. Эти -различия особенно сильно проявляются на 7-е сутки, т.е. на пике пролиферативной активности клеток контрольной группы (рис. 6).»,.Яа втором же этапе, когда у контрольных крыс значения митотического коэффициента снижаются, в опыте наблюдается значительное «х-повышение, так что к концу исследованного нами периода панкреатита, т.е. к тому времени, когда процесс у контрольных крыс приобретает хронический характер, митотическая активность панкреацитоаг-в подопытной группе эказывается в 3 раза выше, чем в опыте-,. _-:-Эти данные хорсво согласуются с данными авторадиографическаго анализа Д^К синтезирующей активности панкреацитов, обнаруживающей те же тенденции. Существенные различия наблюдаются и в кинетике

содержания РНК и общего белка в панкреацитак между подопытной и контрольной группами на первом и втором этапах болезни. Можно видеть, что содержание РНК в клетках обеих групп (рис 9) значительно выше, чем в панкреацитах у интактных крыс. Однако, если в контрольной группе, после некоторого повышения на 1-е сутки панкреатита, происходит резкое (почти в 3 раза) падение ее количества к 3-м суткам, то в подопытной группе око составляет всего 25%. Такая тенденция сохраняется до 7-х суток, а затем снижается, в то время как у нелеченных животных она возрастает и к концу второго этапа панкреатита в 1,5 раза превышает содержание РНК в панкреацитах подопытных крыс.

Несколько иная картина наблюдается в кинетике содержания общего Селка (рис. 9), которая также неодинакова в контроле и опыте, хотя различия между группами, как и колебания его в процессе панкреатита менее выражены. Можно отметить, однако, значительное возрастание количества общего белка в панкреацитах контрольных крыс к 14-м сутками большую стабильность этого параметра у подопытных животных в течение всего исследованного периода.

Согласно известным представлениям об определенной альтернативности процессов ауто и гетеросинтезов в клетках, кинетика содержания РНК и белка в экзокринных панкреацитах находится в зависимости от их пролиферативной активности, что подтверждается и в описанной выше ситуации: при сравнении данных, характеризующих кинетику митотической и ДНК-синтезируюией активности, с одной стороны, и содержания РНК и общего белка, с другой стороны, четко прослеживается обратная зависимость между этими показателями, особенно сильно выраженная в кинетике содержания РНК.

Вместе с тем очевидно, что структура популяции панкреацитов, в свою очередь, находится в тесной связи с их пролиферативной и функциональной активностью, что отражается и на распределении клеток по классам плоидности, и на численности деградирующих клеток, и на соотношении одно- и двуядерных клеток. Значительно сокращается численность деградирующих т.е. с тотодиплоидным(среда одноядерных) и гипо тетраплоидным(среди двуянерных) содержанием ДНК в ядрах клеток особенно сильно выраженное на 3-й сутки, когда некробиотические процессы достигают максимума, из чего следует, что ТСН каким то образом повышает сопротивляемость клеток воздействию токсических веществ, образующихся при некрозе ткани поджелудочной железы. Со второго этапа панкреатита количество одно и двуядерных панкреацитов, содержащих 4с- ДНК и выше, оказывается большим в подопытной группе животных, которым вводили ТСН (рис. 8), а эти панкреациты, как было показано ранее, обладают не только более высокой секреторной активностью по сравнению с диплоидными, но и большей устойчивостью к действию токсинов, что возможно опосредованно связано с введением ТСН и играет определенную роль в смягчении остроты течения заболевания. Об этом свидетельствует и то, что распределение клеток по классам плоидности в популяции панкреацитов подопытной группы крыс более близко к таковому в интактной группе, чем в контрольной (рис. 8).

О снижении остроты течения болезни под действием ТСН свидетельствует также состояние экзокринной системы в целом:

уменьшаются внутриклеточный межацинарный и междолъковый отеки, а также размеры клеток. Численность же и доля жизнеспособных клеток достоверно увеличивается, что особенно выражено в период наибольшей остроты панкреатита, когда орган находится в состоянии "первичного аффекта". Лишь на 14-е сутки происходит выравнивание между группами по этим показателям. Все изложенное позволяет полагать, что ТСН, повышая резистентность панкреацитов к действию токсических веществ, препятствует переходу панкреатита в хроническое состояние, и способствует восстановлению нормального функционирования неповрежденного сегмента поджелудочной железы.

Таким образом, введение ТСН предупреждает развитие отека стромы, дистрофических изменений и внутриклеточного отека панкреацитов в жизнеспособных участках железы, имеющих место в фазе "первичного аффекта" у контрольных крыс. ТСН препятствует накоплению больших количеств белка в клетках, что согласуется с ранее полученными данными о меньшей интенсивности включения 14С-лейцина в эти клетки в присутствии ТСН (Канаян А. С. и др., 1983), тем самым тормозя секреторную активность жизнеспособных панкреацитов, на которую, как известно, расходуется около 90% белка, и создавая условия относительного "покоя". Последнее также способствует повышению резистентности клеток к действию патогенных веществ из поврежденных участков.

Исходя из наших и литературных данных, можно предположить, что введение ТСН создает условия, какие наблюдаются при панкреаэктоыии, т.е. когда некробиотические явления а ткани железы практически отсутствуют. Это обусловлено способностью ТСН выделять сульфит-ионы, которые выводят из организма цианиды, образующиеся при некрозе. ТСН также обладает стабилизирующими мембрану свойствами: при остром панкреатите, вследствие активации перекисного окисления липидов, происходят глубокие нарушения в структуре биомембран и повышение их ионной проницаемости, а ТСН, будучи активным зятиоксидантом, способствует его нормализации и ослаблению остроты панкреатита.

Глава IV

Морфофункциональные и количественные цитохимические изменения гепатоцитов при остром панкреатите у крыс

Широко известны функциональные связи поджелудочной железы и печени, деэинтоксикационная функция: которой обеспечивает защиту организма от вышедших в портальный кровоток и лимфатическую систему агрессивных ферментов и иных биологически активных веществ и продуктов распада поджелудочной железы при некробиозе: функциональные нарушения печени при этом выявляются примерно у 65% больных (Савельев и др.,1983!. Однако механизмы, лежащие в основе панкреатогенкой гепатаргии и токсической дистрофии печени, развивающиеся при панкреатите, практически неизвестны. Печень, как венозный коллектор брюшных органов, должна подвергаться воздействию панкреагевных ферментов и токсинов, определяющих

специфичность происходящих в ней изменений. Подтверждают это постмортальные исследования печени, показавшие дистрофические и дегенеративные изменения (Канаян А. С., 1984). Весьма вероятно было полагать, . что в основе этих нарушений лежат изменения функционирования гепатоцитов, что и послужило основанием для проведения параллельно с экзокринными панкреацитамм комплексного исследования популяции гепатоцитов на модели острого панкреатита у крыс.

Цитофотометрический и авторадиографический анализы гепатоцитов выявили функциональные изменения в последних уже через 3 часа после индукции ЭОП. Так, почти в 2 раза по сравнению с нормой возрастает их митотическая активность и держится на этом уровне вплоть до 3-х суток. В первые часы развития заболевания синтез ДНК в гепатоцитах лишь незначительно превышает контроль и, в основном, идет в одноядерных гепатоцитах, но уже к концу первых суток возрастает почти втрое (рис. 11 и 12). Доля меченых двуядерных гепатоцитов начинает увеличиваться позже и достигает максимума к 7-м суткам, когда они составляют более половины меченых гепатоцитов. Очевидно, что увеличение индекса мочения в целом, наблюдаемое через 24 часа после индукции панкреатита, происходит в результате активации синтеза ДНК именно в двуядерных гепатоцитах. По нашим данным через б часов после заболевания содержание гликогена в гепатоцитах снижается в 6 раз по сравнению с контролем (рис. 13)

Рис.11. Изменения кинетики митотической активности гепатоцитов под действием тиосуль-фата натрия в процессе

экспериментального острого панкреатита у крыс.

По оси абцисс - время, сут; по оси ординат - митотический индекс, %. 1 - контроль (интактные крысы); 2 - контроль (панкреатит); 3 - опыт (панкреатит + ТСН).

Рис.12. Изменения кинетики синтеза ДНК в гепатоцитах под действием тиосульфата натрия в процессе экспериментального острого панкреатита у крыс.

По оси абцисс - время, сут; по оси ординат - индекс мечения, °/оо- Остальные обозначения те же, что и на рис.11.

Рис.13. Изменения кинетики содержания гликогена в гепатоцитах под действием тиосульфата натрия в процессе

экспериментального острого панкреатита у крыс. По оси абцисс - время, сут; по оси ординат - количество гдикогера, усл. ед. Остальные обозначения те же^ что и на рис.11.

и лишь спустя 24 часа начинает вновь повышаться. Претерпевает изменения и состав популяции гепатоцитов по плоидности: во-первых, появляются гиподиплоидные клетки, 65% которых составляют одноядерные гепатоциты и всего 35% приходится на долю двуядерных, что, вероятнее всего, говорит, о большей устойчивости последних при первой атаке панкреатических токсинов (рис. 14). А Д

Рис.14. Изменения распределения

гепатоцитов по классам плоидности под действием тиосульфата натрия в процессе экспериментального острого панкреатита у крыс.

По горизонтали - классы плоидности, с; по вертиткали - число клеток, %. а - контроль (интактные крысы); б-з -6ч, 1, 3, 7, 14, 21, 30-е сут после индукции панкреатита соответственно; левые столбики из каждой пары - контроль, правые - опыт (панкреатит + ТСН); заштрихованные участки столбиков -двуядерные гепатоциты.

2с 4с 8с 2с 4с 8с

Увеличение числа клеток с промежуточными значениями ДНК в ядрах обусловлено теми же причинами, а не нарастанием числа синтезирующих ДНК гепатоцитов, т.к. индекс мечения в это время сохраняется на уровне контроля (4%), доля же 2с-, 4с-, и (4с+4с) гепатоцитов сокращается в 2-2,5 раза, а 8с- и 16с- клетки вообще не обнаруживаются. Однако при этом в 1,5 раза возрастает число (2с+2с) клеток и, в результате несколько возрастает фракция двуядерных гепатоцитов. На первые сутки, когда начинаются восстановительные процессы в И и печени, картина распределения по плоидности меняется. На 30% увеличивается число 2с- клеток, что связано не с интенсификацией их митотической активности, а с делением (2с+ 2с) клеток, численность которых сокращается вдвое и не сопровождается увеличением количества двуядерных клеток с пониженным содержанием ДНК в ядрах. Возрастание доли гипотетраплоидных клеток на 37% также связано не с деградацией фракции 4с клеток, а с нарастанием ДНК- синтезирующей активности в популяции почти в 5 раз. Исходя из этих данных можно полагать, что деятельность популяционных механизмов регуляции на данном этапе панкреатита направлена прежде всего на восполнение активно функционирующих 2с и 4с клеток. Именно с этим следует связывать начало восстановительных процессов в печени, что проявляется в возрастании числа синтезирующих ДНК клеток и интенсификации гликогенобразующей функции (рис. 13). Накопление одно- и двуядерных гепатоцитов высокой плоидности идет вплоть до 14-х суток, когда фракция двуядерных клеток достигает 42% популяции. Однако, восстановительные процессы, достигнув пика к 7-м суткам, затем несколько ослабевают и с 14-х суток выходят на "плато",

когда между ними и процессами деградации устанавливается некое равновесие. На нашей модели панкреатита восстановительные процессы вновь идут на спад и болезнь переходит в хроническую стадию, когда опять увеличивается доля клеток с пониженным содержанием ДНК и при этом резко снижается число синтезирующих ДНК клеток. Превалирование в популяции 4с и (2с+2с) клеток, наблюдающееся на 30-е сутки, свидетельствует о большей устойчивости их к новой атаке токсинов. На основании всего изложенного можно констатировать, что популяция гепатоцитов является динамичной и реактивной системой. Это находит отражение в кинетике синтеза ДНК, митотической активности, накоплении и расходовании энергетических ресурсов и в постоянном перераспределении состава популяции по плоидности. Высокая динамичность и реактивность этой саморегулирующейся' популяции клеток обусловлена уникальной полифункциональностью печени и той ролью, которую она играет в организме. Исходя из результатов анализа данных, можно сделать вывод о том, что в этом "повинны" не столько внутриклеточные, сколько популяционные механизмы регуляции функционирования системы в целом. Будучи в значительной степени самоорганизующейся, открытой системой, популяция гепатоцитов быстро реагирует на экстремальность ситуации активацией всех средств защиты, что опосредовано воздействует на процессы, идущие в поджелудочной железе при болезни. Затем, пройдя период адаптации к экстремальным условиям, система выходит на новый уровень гомеостаза, при котором ее реакции на повторные сигналы о ситуации в железе ослабевают. В этом, как мы полагаем, заключается одна из главных причин перехода заболевания в хроническое состояние. Для того, чтобы вывести популяцию из создавшегося динамического "равновесия" требуется воздействие новых факторов, стимулирующих функциональную активность клеток печени и способных дестабилизировать равновесное состояние популяции. К таким факторам относится ТСН, использованный в нашей работе. Поведение гепатоцитов под действием ТСН кардинально изменяется по сравнению с контролем по всем кинетическим параметрам. Это подтверждает данные о высокой их реактивности и свидетельствует о непосредственном влиянии ТСН на гепатоциты. Так, ДНК-синтезируюиая активность их после введения ТСН в начале 1-го этапа намного выше, чем в печени больных крыс, которым ТСН не вводили ( рис. .12). К 3-м суткам она резко понижается (в отличие от контрольной группы, где синтез ДНК в это время максимален), держится на этом уровне до 14-х суток и снова снижается (как и в контроле) до уровня у интактных крыс. Влияние ТСН на митотическую активность еще сильнее: повышение к 7-м и незначительное снижение на 14-е сутки сменяется резким нарастанием к 21-м и далее к 30-м с?уткам, т.е. именно во время перехода панкреатита в хроническую форму у крыс, которым ТСН не вводили.(рис. 11). Изменения в ДНК-синтезирующей и митотической активности гепатоцитов отражаются на распределении клеток в составе популяции по классам плоидности (рис. 14). Сокращаются в числе, а затем полностью исчезают гиподиплоидные клетки. Параллельно растет доля 4с и (2с42с> клеток, наиболее устойчивых к патогенным факторам.

Таким образом, нами было показано, что введение ТСН оказывает-не опосредованное, а прямое влияние на жизнедеятельность

гепатоцитов: повышает устойчивость гепатоцитов к действию панкреатогенных токсинов стимулирует синтез ДНК, митотическую активность, восстановление численности и снижает напряженность выполняемой ими дезинтоксикационной функции. Тем самым Оыло доказано, что ТСН непосредственно воздействует на популяцию гепатоцитов. Однако, оставался открытым наиболее важный вопрос: является ли активация деятельности гепатоцитов и их популяции в целом одним из факторов, предотвращающих переход острого панкреатита в хроническую форму? Результаты наших исследований свидетельствуют об активации многих жизненно важных функций гепатоцитов под воздействием ТСН, показатели ряда других сторон их жизнедеятельности, отражающих (хотя бы косвенно) их участие в выполнении печенью защитной, дезинтоксикационной, поддержания энергетического баланса и иных функций, оказались более низкими, чем у крыс, которым ТСН не вводили. Так, резкое падение количества гликогена в первые часы после индукции панкреатита в сравнении с интактными крысами, несколько менее выраженное, чем в контроле, сменяется относительно плавным нарастанием до уровня, характерного для клеток интактных крыс, без флуктуаций в кинетике накопления и расходования сильно вы^* раженных в контроле (рис.14). Мы полагаем,что эти различия в кинетике содержания гликогена в гепатоцитах непосредственно определяются различиями в функциональном состоянии поджелудочной железы между подопытными и контрольными крысами и, в первую очередь, островков Лангерганса. Невозможно представить, чтобы повреждения одного из ее сегментов и некроз не отразились на деятельности островковых клеток. Отметим, также, что в период развития панкреатита у островковых клеток крыс, не подвергшихся воздействию ТСН, в несколько раз возрастает ДНК-синтезирующая и митотическая активность, очевидно, с целью компенсации потерь при некрозе селезеночного сегмента, вызванного хлорэтилсм.Присутствие в ткани железы некробиотических токсинов, как мы полагаем, также вызывает нарушения в функционировании островковых клеток, в частности, сс-клеток, продуцирующих инсулин и глюкагон. В свою очередь нарушения в синтезе этих гормонов, непосредственно участвующих в регуляции содержания гликогена в гепатоцитах, и их соотношения в крови, обусловливают' столь значительные колебания его содержания в клетках печени крыс, которым не вводили ТСН. Из этого следует, что выравнивание перепадов кривой, характеризующей кинетику содержания гликогена в гепатоцитах подопытных крыс, в первую очередь должно быть связано не с непосредственным воздействием на них ТСН, а с нормализацией функционирования под его действием всех клеток железы, выполняющих и экзо, и эндокринные функции, в том числе и а-клеток. Итак, введение ТСН, во-перЕых, способствует нормализации структурной организации и функционирования популяции экзокринкых панкреацитов и гепатоцитов, предотвращая переход панкреатита в хроническую форму, а во-вторых положительно влияет на состояние популяции гепатоцитов при остром панкреатите, о чем свидетельствуют наши данные. Исходя из этого и анализа взаимоотношений между клетками поджелудочной железы и печени мы приходим к парадоксальному, на первый взгляд, выводу о том, что функционирование клеточных систем этих органов в значительной степени независимо. Нам представляется эчевидным, что последствия патологического процесса в

поджелудочной железе оказывают большее влияние на структуру и функционирование популяции гепатоцитов, на характер течения панкреатита. Это определяется различиями в специфике функций, выполняемых ланкреа- и гепатоцитами. Отсюда и различия в реакциях этих клеток, проявляющиеся как в процессе развития панкреатита в "чистом" виде, так и при введении ТСН. В обоих случаях деятельность внутриклеточных и популяционных механизмов регуляции направлена на первом этапе болезни прежде всего на сохранение и восстановление их клеточных систем как таковых. На втором этапе детельность этих механизмов в популяции панкреатитов ограничивается решением тех же (внутрисистемных) проблем, с которыми им удается справиться лишь с помощью внешнего фактора, т.е. ТСН. Активация деятельности гепатоцитов и их дезинтоксикационной функции не оказывает прямого воздействия на характер течения панкреатита, о чем свидетельствуют приведенные выше данные. Популяция гепатоцитов,разрешив проблемы сохранения собственной системы и восстановления гомеостаза в условиях патологического процесса, направляет свою деятельность на защиту организма в целом, на различные системы которого оказывают вредное воздействие выделяемые в кровоток паккреатогенные токсические вещества, и лишь в зтом качестве опосредовано влияет на характер течения острого панкреатита. Под влиянием ТСН, не обладающего органослецифическим действием, восстановление структурно-функциональной организации обеих систем идет параллельно. При этом успешное преодоление новой атаки панкреатита на втором его этапе с помощью ТСН снимает напряженность выполнения дезинтоксикационной функции популяцией гепатоцитов. Именно этим, а не непосредственным воздействием ТСН, объясняется, как мы полагаем, снижение на втором этапе болезни их функциональной активности. по сравнению с той, которая наблюдается в отсутствие ТСН.

Завершая на этом итоговый анализ результатов комплексных исследований, проведенных на модели ЗОН и отмечая положительное действие ТСН на процессы регенерации в популяциях экзокринных панкреацитов и гепатоцитов при панкреатите, рассмотрим механизмы, лежащие в основе "универсального" влияния ТСН на метаболизм клеток, столь различных по выполняемым ими функциям.

Известно, что ТСН является мощным донором серы и в 1000 раз более эффективен в процессе образования роданаюв, чем цистеин и цистин. При посредстве фермента-катализатора . - роданазы, происходит реакция вытеснения сульфид-ионов из молекул ТСН цианид-ионами, а это приводит к детоксикации последних, выведению их из организма и, тем самым, к ослаблению действия цианидов, накапливающихся в межклеточном пространстве и поступающих затем в портальный кровоток. Кроме того ТСН обладает десенсибилизирующими, антигистамикными и стабилизирующими Оиомембраны свойствами. Между тем известно, что острый панкреатит приводит не только к тяжелой эндогенной интоксикации с образованием различных вазоактивных веществ (в их числе гистамина) и выбросу их в кровь, но и к активации протеаз и фосфолипаз. При этом активация перекисного окисления липияов приводит к нарушениям в структуре мембран и повышению их ионной проницаемости. Из этого следует, что интенсификация перекисного окисления липидов является важным патогенетическим звеном в развитии панкреатита, в основе которого

лежат недостаточность антиоксидантной функции исследованных нами клеточных популяций и нарушение отношения "перекисное окисление антиоксиданты". ТСН, как активный антиоксидант способствует его нормализации и, как следствие, ослаблению панкреатита.Наряду с этим, ТСН обладает способностью блокировать внутрипопуляционную активность протеаз путем ингибирующего воздействия на катепсины и восстановления S-S-связей в молекуле фермента до SH, что приводит к потере его активности. Есть сведения об иммунокоррегирующем действии ТСН при осложненных и затяжных формах воспалительных процессов, что немаловажно для предотвращения второй атаки панкреатита, в основе которой лежит иммунное поражение панкреацитов.

Исходя из изложенного можно полагать, что именно широким спектром механизмов регуляции метаболизма клеток, в которых так или иначе принимает участие ТСН, можно объяснить "универсальность" его влияния на поведение панкреацитов и гепатоцитов при панкреатите.

РАЗДЕЛ III.

ГИПЕРРЕПЛИКАЦИЯ ДНК В ОБНОВЛЯЮЩИХСЯ КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ В ПАТОЛОГИИ И ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ

Глава V.

Синтез и содержание ДНК в ядрах макрофагов мышей в норме, при канцерогенезе и при введении животным ретиноидов.

В предыдущем разделе были рассмотрены две клеточные системы, в которых и в нормальном развитии имело место проявление гиперрепликации ДНК, поэтому в этих исследованиях изучалась не инициация процесса гиперрепликации ДНК при патологии, а, прежде всего, степень выраженности этого явления под влиянием повреждающих факторов. Неслучайно, что моделями для этого послужили стабильные клеточные системы. Между тем было интересно выяснить имеет ли место индуцированная гиперрепликация ДНК в той или иной форме своего проявления в популяциях, где в нормальных условиях все клетки диплоидны. К таким популяциям относятся непрерывно обновляющиеся во взрослом организме клеточные системы, например гемопоэтические клетки, среди которых, согласно литературных данным,только у мегакариоцитов сильно выраженая полиплоидия входит в программу цитодифференцировки при нормальном тромбопоэзе. Поэтому нами было проведено исследование поведения клеток моноцитопоэтической и эритропоэтической линий в аспекте проблемы гиперрепликации ДНК в патологии и экстремальных условиях. Моделью для исследования моноцитопоэтических клеток послужили макрофаги лимфоузлов и селезенки половозрелых линейных мышей, зараженных раком поджелудка, без воздействия и при введении животным ретиноидов. Мыши линии СБА, массой 20г, были разделены на 4 группы по 11-15 животных. Одна группа оставалась интзктной, а у мышей 3-х других групп вызывали злокачественный рост введением в мышцу бедра 0,5 мл суспензии клеток рака преджелудка (ПРЖ) в среде 199 (6 мл среды на 1г массы клеток). Продолжительность жизни после

прививки равна 24-30 суток. Эксперименты были начаты на 12-е сутки после прививки, когда опухоль уже была хорошо развита, но метастазов в лимфоузлах, селезенке, печени, дерме и легких не были обнаружены (Азнаурян А. В., и др., 1986). С этого времени двум из трех групп мышей вводили парэнтерально ретиноиды (С-15 или 13-цис-метилретиноат) через каждые 48 часов, 6 раз по 0,1 мл 1% масляного раствора, после чего всех животных забивали и исследовали лимфоузлы и селезенку животных. Для радиоавтографического исследования синтеза ДНК трем особям из каждой группы за сутки до забоя внутрибрюшинно вводили Н3~ тимидин. Активность макрофагов оценивали по их фагоцитарной способности, для чего животным за 2 часа до забоя вводили внутрибрюшинно по 0,2 мл 50% раствора коллоидного угля, исключая тех мышей, у которых исследовали синтез ДНК.

Авторадиографическое и цитоспектрофотометрическое исследование синтеза и содержания ДНК в ядрах макрофагов, проведенное нами, повидимому, впервые выявило, что часть этих терминально дифферернцированных и уже неделящихся клеток, по крайцей мере у мышей, содержит Н2с и. 4с ядра. Гистограммы распределения макрофагов лимфоузлов и селезенки по ■содержанию а ядрах ДНК свидетельствуют как о гиперрепликации ДНК в части макрофагов обеих популяций в норме, так и об уменьшении их числа при канцерогенезе (рис.15). Важно также отметить, что среди макрофагов интактных мышей нами не были обнаружены клетки меченые Н3~тимидином, и ни одного случая митоза. Уменьшение числа гипердиплоидных макрофагов при канцерогенезе можно объяснить их миграцией в опухоль в ответ на развитие рака, поскольку именно клетки с высоким содержанием ДНК в ядрах, по нашим данным, являются наиболее зрелыми, обладающими наибольшей фагоцитарной активностью (свыше 25 поглощенных гранул угля). Это предположение подтверждается и литературными данными об увеличении числа макрофагов в опухолях по мере их роста (Kapp, 1978; Фрейдлин, 1984). Пополнение sse их числа в лимфоузлах и селезенке происходит, вероятно, за счет притока еще не завершивших специализацию моноцитов, отсюда и возрастание,как числа 2с моноцитов, по нашим данным, слабо провляющих фагоцитарную активность, так и появление в последних меченных ядер, полностью отсутствующих в лимфоузлах и селезенке у здоровых мышей. Вполне возможно, что это свидетельствует не о синтезе ДНК в макрофагах и даже моноцитах, а об ускоренном поступлении при канцерогенезе в эти органы не завершивших специализацию и сохранивших метку моноцитов из костного мозга. Это позволяет полагать, что нами наблюдается ускорение процесса специализации макрофагов и миграции зрелых клеток в опухоль. Это подтверкдается тем, что повышенной способностью к миграции обладают т.н. "активированные" макрофаги, для которых свойственно также и неспецифическое противоопухолевое действие, поэтому доля последних в опухоли может достигать 50% всех клеток. Основываясь на изложенном, можно полагать, что активированными макрофагами являются клетки с высоким содержанием ДНК в ядрах, т.к. именно они обладают высокой фагоцитарной активностью и именно их численность понижается при канцерогенезе.

Рис 15. Распределение мононуклеарные макрофагов

лимфоузлов (а) и селезенки (б) мышей в норме, при канцерогенезе без воздействия ретиноидов и при их введении по содержанию в ядрах ДНК. По осям абсцисс - количество клеток, %. по осям ординат -содержание ДНК, уел ед.

I. лимфоциты (диплоидный эталон)

II. макрофаги интактных »аллей,

III. Макрофаги зараженных раком мышей, IV. то же при введении ретиноида С-15 V. То же при введении 13-цис-метил-ретиноата.

Штрихованными линиями

обозначены границы классов 2с и 4с.

Исследование динамики распределения макрофагов по синтезу и содержанию в их ядрах ДНК в условиях воздействия на канцерогенез ретиноидами выявило значительно более высокое количество макрофагов с повышенным содержанием ДНК, чем при "чистом" канцерогенезе. Возрастает и число меченых клеток. Доля макрофагов среди всех клеток лимфоузлов и селезенки не изменяется, нет сдвигов и в средней фагоцитарной активности этих клеток по сравнению с канцерогенезом, из чего можно предположить, что скорость миграции макрофагов в опухоль не увеличивается при введении ретиноидов, но ускоряется процесс специализации макрофагов в селезенке и лимфоузлах. Это прямо коррелирует с повышением уровня содержания ДНК в большинстве макрофагов. Параллельно с одноядерными мы исследовали и многоядерные макрофаги, образование которых связано со слиянием нескольких мононуклеаров. В норме их количество в лимфоузлах не превышает 2,5% от общего числа макрофагов при суммарном содержании ДНК в ядрах, равном 28,6 усл.ед. В селезенке оба эти показателя значительно выше.

При канцерогенезе доля полинуклеаров в обеих популяциях сокращается почти вдвое, но суммарное содержание ДНК остается таким же, как у интактных особей. Это свидетельствует о том, что часть полинуклеаров из обоих органов мигрирует в опухоль, а их новообразования не происходит. Под действием же ретиноидов.

особенно ретиноида С15 резко увеличивается и число многоядерных макрофагов в популяции, и суммарное содержание ДНК в ядрах, и их фагоцитарная активность, о чем говорит образование гигантских аутофагосом и активация их клеточных мембран Рудманом (1987) также было установлено, что активированные макрофаги костного мозга вырабатывают "фактор некроза опухолей", обладающий ингибирующими свойствами даже в незначительных концентрациях и кратковременном воздействии, а в работах Кротковой (1990) было показано, что активированные перитонеалькые и альвеолярные макрофаги рас познают, связывают и лизируют опухолевые клетки. Эта, приобретенная макрофагами в ходе активации, способность обусловлена формированием на их поверхности постоянно экспрессируемых, обладающих высокой скоростью обновления специфических рецепторов.

Таким образом, можно сделать вывод, что в норме процесс обновления популяции макрофагов идет достаточно медленно и поэтому методами авторадиографии включение метки не выявляется. При канцерогенезе этот процесс ускоряется и тогда появляются меченые клетки. Введение ретиноидов еще сильнее стимулирует его, а наличие в популяциях макрофагов гипердиплоидных клеток, численность которых возрастает в присутствии ретиноидов,говорит о том, что в основе ускорения лежит гиперрепликация ДНК.

Глава VI

Гиперрепликация ДНК в условиях анемии у птиц.

Исследованиями Газаряна и Кульминской (1975, 1976) было выявлено два пути развития эритроидных клеток: обычный, наблюдаемый в норме, и укороченный, имеющий место при острой (сублетальной) анемии. Первый осуществляется в костном мозге, при этом в периферической крови наблюдается менее 2 % незрелых клеток - регикулоцитов со слабо выраженной полихроматофилией цитоплазмы и образовавшихся после .прохождения всех костномозговых зритробластических стадий. В условиях же острой анемии у голубей в период наибольшего ее развития, . в периферической крови появляются незрелые костномозговые формы: базофильные эритробласты и ретикулоциты. Последние на пике анемии составляют около 50% клеток крови и образуются из базофилных эритробластов. Авторы пришли к выводу, что при анемии у голубей запускается ускоренный путь образования эритроцитов, названный ими "резервным" эритролоэзом. Нас заинтересовала эта модель, предоставляющая редкую возможность исследовать не только динамику дифференцировки эритроидных клеток при анемии, но и содержания в них ДНК, суммарного белка и гемоглобина и, что очень важно, определения количества указанных веществ в одной и той же клетке последовательно.

Работу проводили на интакгных и анемизириванных фенилгидразином голубях (Газарян и др., 1971). Исследовали клетки эритроидного ряда костного мозга на 2е и 5е сутки и клетки периферической крови на 5, б, 6,5, 7 и 7,5 суток от начала анемизации, а также клетки костного мозга и

периферической крови интактных птиц. Острую анемию вызывали ежесуточными инъекциями фенилгидразина в течение 4х суток в дозе 15 мг/кг, умеренную 10 мг/кг и слабую 10 мг/кг в течение 2х суток. При исследовании влияния гемина на процессы клеточной дифференцировки при резервном эритропоэзе у голубей с 5х (пик острой анемии) по 10е сутки ежесуточно вводили по 1,2 мг гемина. Кровь извлекали из сосудов цевки одного и того же голубя до анемизации и в течение всего периода анемии, а затем на 5, 10е и 15е сутки после начала инъекций и готовили мазки. Кроме того в течение 5х суток дробно, через каждые 2 часа исследовали кровь для определения ммтотического индекса, клеточного состава популяции и динамики прохождения клетками последовательных стадий дифференцировки. В норме базофильные эритробласты. костного мозга диплоидны за исключением небольшой фракции клеток, находящихся в Б и в2 фазах, но уже на 2е сутки после анемизации вся популяция становится теяраплоидной и остается таковой до 5х суток (рис.16).

Рис 16. Распределение эритробластов голубей при анемии по содержанию ДНК (а), общего белка (Ö) и гемоглобина (в). По осям абсцисс количество вещества, уел ед; по осям ординат -число клеток. Э - эритроциты

периферической крови интактного голубя; БК -базофильные эритробласты костного мозга (I - в норме, II и III на 2-е и

5-е сутки анемии соответственно); БЭ базофильные эритробласты периферической крови на

6-е сутки анемии.

fä' so /¡о

Содержание же общего белка в тетраплоидных эритробластах остается на диплоидном уровне и только к 5-м суткам удваивается, а гемоглобин вообще не выявляется. Значит, в ходе анемии вся популяция базофильных эритробластов костного мозга сначала удваивает количество ДНК в ядрах ,затем, после некоторого лаг-периода в них удваивается содержание общего белка и в этом состоянии они выводятся в кровь, где начинают накапливать

гемоглобин и, минуя эритробластические стадии не делясь проходят стадии базофильного ,полихроматофильного и ортохромного ретикулоцитов, после чего делятся и превращаются в эритроциты. По существу весь процесс дифференцировки и специализации эритроидные клетки проходят в тетраплоидном состоянии, ибо в момент, когда клетки выходят из этого состояния путем деления, количество гемоглобина в них уже находится на уровне нормы. Следовательно, переход в тетраплоидное состояние, в данном случае, является переходом в состояние активной дифференцировки и специализации. Можно полагать ,что этот механизм предоставляет клетке определенные преимуиества по сравнению с механизмом дифференцировки диплоидной клетки, по видимому, и количественного (интенсификация процессов), и качественного (изменение самого способа дифференцировки) характера. Особый интерес представляет факт появления измеримого количества гемоглобина в базофильных эритробластах периферической крови, ибо в норме и даже при анемии в костной мозге в этих клетках он не выявляется ,а поскольку базофильные эритробласты обычно в крови не встречаются, можно полагать, что в условиях анемии происходит индукция синтеза гемоглобина в этих незрелых формах. Затем клетки удваивают количество белка и вступают в процесс дифференцировки и специализации, в течение которого претерпевают множество изменений в морфологии и метаболизме. Ярким примером последнего является накопления в них специфического белка — гемоглобина. Лишь после стадии полихроматофильного ретикулоцита эти клетки делятся, превращаясь в диплоидные ретикулоциты. Следовательно, при анемии гемоглобин синтезируется и накапливается в клетках, в которых уже произошла компактизация хроматина. Эти тонкие противоречия в морфогенезе и биосинтезе специфического белка представляют большой интерес, так как в их основе лежит про явление деятельности различных механизмов регуляции. Один контролирует совокупность морфологических изменений в клетке и ядре, другой же функционирование системы синтеза гемоглобина (транскрипция генов, процессинг мРНК, перенос её в лояисомы, трансляция и сборка белка). Оба механизма ответственны за реализацию программы специализации и в норме представляются тесно сцепленными, координирование или, по крайней мере, параллельно действующими. Однако, при резервном эритропоэзе возникает их рассогласованость и существенную роль, при этом, играет механизм гиперрепликации ДНК, который/ получив сигнал о необходимости ускорения процессов специализации, обеспечивает, на основе удвоенного содержания ДНК в ядрах, ускорение цитоморфологической дифференцировки путем сокращения ряда стадий развития эритробластов. Но процесс синтеза гемоглобина не ускоряется, следовательно, эти механизмы автономны и регулируются разными факторами. Главная же особенность работы механизма гиперрепликации ДНК при анемии заключается в том, что опосредовано решается и вторая задача: при очевидном дефиците гемоглобина в клетках, в крови в целом он быстро повышается в связи с нарастанием численности вполне арелык, функционально дееспособных, гемоглобин содержащих клеток.

Рис 17. Распределение ретикулоцитов голубей, при анемии по содержанию ДНК (а), общего белка (6} и гемоглобина (в)

БР - базофильные

ретикулоциты, ПР - полихро-матофильные ретикулоциты, ОР - ортохромные ретикулоциты.

I, II и III, - 5,6 и 77,5 сут. после анемизации соответственно. Остальные обозначения те же,ч то и на рис. 16.

LCb.

»ж«»»'« я.«»а> £"Ч>'а

Вместе с тем при сильной анемии был выявлен и другой путь образования эритроцитов, при котором в полихроматофильных и ортохромных ретикулоцитах, уже прошедших к началу анемии первые этапы специализации и утративших способность к делению, происходит ограниченное увеличение количества ДНК до 130 % от диплоидного (гипердиплоидия), но которого оказывается достаточно для накопления повышенного количества гемоглобина в этих клетках. Однако, этот путь развития при сильной анемии выражен значительно слабее, чем резервный эритропоэз (рис 17).

Полученные данные свидетельствуют, что столь лабильная система, как эритропоэз, имеет несколько вариантов реализации программы дафферренцироахи и специализации, проявляющихся в разной степени в зависимости от условий. Это показано в экспериментах с разными режимами анемизации. При умеренней анемии вклад резервного эритропоэза сильно уменьшается. Доминирующей, незрелой формой, появляющейся в крови при этом, становятся полихроматофильные ретикулоциты, количество которых на 6-е сутки составляет более 50% популяции, состоящей из 2с (60%), 4с (30%) и Н2 клеток (10%).При слабой анемии резервный эритропоэз не выражен: максимальное количество базофильных форм приходится на пик анемии и не превышает 3% и только половина из них содержит 4с ДНК (рис 18). Отсюда следует, что при слабой анемии часть эритроцитов развивается из полихроматофильных и ортохромных ретикулоцитов.

Таким образом, при анемии, помимо нормального, имеют место выраженные в разной степени в зависимости от остроты анемии, еще три вида эритропоэза:

Рис 18. Схема образования эритроцитов в норме (а), при острой (О), умеренной (в) и слабой (г) анемиях.

Заштрихованные участки - костный мозг, светлые - периферическая кровь. Ширина стрелок характеризует относительный вклад каждого из способов образования эритроцитов; оз Оазофильные, оэ - ортохромные эритробласты; бэ (4с)....ор (2с) - клетки, развивающиеся по программе резервного эритропоэза

По оси абсцисс - время после начала анемизации, сут. по оси ординат - количество клеток в 1 мм3х 106. Э - эритроциты, ор -ортохромные, пр - полихромато-фильные, бр - базофильные рети-кулоциты.

"•'ш'ч чт I >ш1 •> •,!!> ч» ■ ■ ■ ■. -V.

-.---------щ-----------\

4 1 шг—7

~на 5Ш-¡ЙЙГ"

1. Резервный эритропоэз, прямыми костномозговыми предшественниками которого являются базофильные эритробласты, блокированные в вг-фазе митотического цикла. Он вносит основной вклад в процесс образования эритроцитов при острой анемии;

2. Эритропоэз, костномозговыми предшественниками которого являются полихроматофильные эритробласты. При этом клетки выходят в кровь на любой стадии цикла и превращаются в Н2с и 4с ретикулоциты. Он является основным при умеренной анемии;

3. Эритропоэз,костномозговыми предшественниками которого являются ортохромные эритробласты. Его отличие от нормального заключается в том, что эти клетки становятся активно размножающейся формой в костном мозге. Этот эритропоэз не играет заметной роли при острой анемии, его вклад невелик и при умеренной анемии, но он является одним из основных путей образования эритроцитов при слабой анемии. Заметим, что при всех режимах анемии в кровь выходят также клетки,

развивающиеся обычным путем, их вклад всегда одинаков и составляет около 20% всех клеток. Таким образом, можно полагать, чти система регуляции восстанови тельных процессов при анемии, в зависимости от ее остроты, запускает популяционные и внутриклеточные механизмы, существенно различающиеся по характеру деятельности и конечному результату, среди которых наиболее значительную роль играют механизмы гиперрепликации ДНК, обеспечивающие быстрое восстановление содержание гемоглобина в. крош.

Глава VII

Влияние гемина на процессы клеточной дифференцировки при резервном

эритропоэзе у птиц

Как было показано, при резервном эритропоэзе не происходит адекватного стимулирования синтеза гемоглобина. Предполагая, что основной причиной его дефицита в эритроцитах, развившихся при острой анемии, может быть нехватка железа в организме, в котором за короткое время должно синтезироваться намного больше гемоглобина, чем в норме, мы на пике анемии ввели гемин для его восполнения. Основой для этих предположений послужили известные данные о том, что гемин стимулирует синтез глобина на полисомах (М. L London et al., 1976, Gross M.,1980).

Однако, результаты наших исследований показали, что введение гемина в первую очередь еще более ускоряет морфологическую дифференцировку эригроидных клеток. Уже к 8-9-м суткам анемии процесс созревания клеток резервного эритропоэза в подопытной группе близок к окончанию, в то время как в контроле он завершается лишь к 10-м суткам. При сопоставлении численности зрелых клеток в обеих группах видно, что количество их на 7-е сутки в 5, на 8-е в 3 и на 9-е в 2 раза больше в опыте, чем в контроле, и на 9-е сутки у птиц, получавших гемин, картина крови уже близка к норме, тогда как в контроле имеется еще значительное число незрелых форм, (рис 19).

Рис 19. Темпы прохождения эритроидными клетками

последовательных стадий развития в контроле и под действием гемина.

По вертикали - прирост доли клеток данной стадии развития за 1 сут %.

БЭ - стадия базального эритробласта. БР, ПР и ОР -стадии базофильного,

полихроматофильного и

ортохромного ретикулоцитов.

Светлые столбики - контроль, темные столбики - опыт. Цифры над диаграммами - время начала анемизации, сут.

Из представленных данных видно, что введение гемина во много раз ускоряет процесс морфологической дифференцировки эритроидной анемии. Как было показано ранее, клетки, развивающиеся по

программе резервного ретикулоцита. Митозы сутки анемии (рис 20) о.ч\-

¡и

а

0.1

эритропоэза, делятся на стадии ортохромного появляются в начале 6-х, и исчезают на 8-е

Рис 20. Митотическая активность эритроидных клеток в контроле (1) и под действием гемина (2). По оси абсцисс - время после начала анемизации, сут. по оси ординат - митотический индекс, %. Стрелкой обозначен момент введения гемина.

В присутствии гемина не только смещается начало появления митозов на более ранние сроки анемии, но и сокращается время, в течение которого они наблюдаются: митозы появляются на 5-е сутки, уже через 2 часа их количество достигает максимума, а через 8 часов все клетки завершают деление. Причем в отличие от контроля клетки делятся не только на стадии ортохромного, но и на стадиях полихроматофильного и базофилького ретикулоцитов.

А

1а:

а

Л

.5

Ю 51-

4

е

то *

Л

Д.

«

чд во по ад ю по

Рис 21. Гистограммы распределения зрелых эритроцитов по содержанию гемоглобина.

По оси абсцисс - количество гемоглобина, по оси ординат количество клеток.

А - контроль, б - действие гемина. Цифры справа - время после начала анемизации, сут.

Гистограммы распределения зрелых эритроцитов по содержанию гемоглобина (рис.21) в присутствии гемина почти на всех сроках анемии смещены в сторону большего его содержания, причем различия наиболее существенны на 5-6-е и 9-10-е сутки. Значит в присутствии гемина стимулируется и накопление гемоглобина в значительной части эритроидных клеток, при анемии. Позже в ряде работ (Ропка Н. et а1.., 1985, Кхпшга Н. et а1., 1986, Сагг1ск Ь.М., 1987) было подтверждено, что гемин является биологически активным веществом и уровень его содержания в крови является важным фактором не только регуляции синтеза гемоглобина посредством ингибирования или стимулирования утилизации железа из трансферина, но и, что очень важно, действует на скорость эритропоэза.

В связи с изложенным, механизм воздействия гемина представляется следующим образом. Известно, что деятельность механизмов дифференцировки и синтеза специфических белков, в том числе и гемоглобина, альтернативна в принципе, однако в норме, когда скорость, время размножения и темп дифференцировки эритроидных клеток идут по обычной программе, последняя реализуется последовательно и антагонизм не проявляется так сильно, как при резервном эритропоэзе, когда они ускоряются и смещаются во времени, жестко ' лимитируя процесс гемоглобинизации. Содержание гемина в крови, являясь важным фактором синтеза гема посредством ингибирования или стимулирования утилизации железа из трансферина и синтеза протопорфина, определяет скорость эритропоэа. Следовательно при резервном эритропоэзе недостаток железа может явиться лимитирующим фактором.* Процесс гемоглобинизации в присутствии "гемина ускоряется и тленно это играет роль стимула к ускорению морфологической дифференцировки и к смещению периода размножения клеток на ранние сроки анемии и вовлечения в митотический цикл более ранних форм: полихромагофильных и базофильных ретикулоцитов, чего не наблюдалось в контроле.

Таким образом, существует сложная система регуляции процесса дифференцировки при анемии, включающая разные варианты гиперрепликации, к определяющая различные пути образования эритроцитов. Каждый из них характеризуется особым сочетанием пролиферации клеток, гиперрепликации ДНК и цитодифференцировки.Действие этих механизмов не проявляется при нормальном эритропоэзе, но приобретает важное значение в экстремальных условиях анемии.

Глава VIII

Гиперрепликация ДНК в первичном эритропоззе у птиц

В связи с результатами, полученными нами на молели индуцированной анемии у взрослых птиц, представлялось интересным исследование эмбрионального эритропоэза у птиц, который также протекает в "жестких" условиях гипоксии при высокой скорости процессов цито-дифференцировки и размножения клеток зародыша, обусловливающих быстрое нарастание массы и необходимость обеспечения кислородом непрерывно увеличивающегося числа клеток. Мы исследовали первичный эритропоэз у кур (ПЭК) в период желточного кроветворения со 2-х по 8-е сутки эмбриогенеза. Для цитоморфологического анализа и определения состава популяции ПЭК, мазки фиксировали в ЭУФ и окрашивали растворами Май-Грюнвальда и Гимза по Паппенгейму. На этих же препаратах измеряли площади цитоплазмы и ядра, и подсчитывали число митозов. Для цитохимических исследований препараты окрашивали фуксином по Фельгену и нафтоловым желтым S. Измерения проводили на сканирующем микроскопе-фотометре SMP 05 ¡OPTON). Одновременно с определением интегральных значений оптиической плотности ДНК-фуксина использовали метод топограмного анализа распределения ДНК в ядре и вычисляли коэффициент рельефности, характеризующий плотность упаковки хроматина в ядре (Папаян Г. В. и др., 1982). Полученные сканограммы распределения ДНК в первичных эритроидных клетках позволили точно измерить количество ДНК в основном и дополнительном ядрах, в мета-, тело-, анафазных группах хромосом и в экс-трахромсомных глыбках. Часть препаратов исследовали с помощью телевизионного анализатора изображений (IBAS), (OPTON). В обоих случаях были получены идентичные результаты.

Эмбриональный эритропоэз у птиц изучается давно (см. Ringerts, Boland, 1974), однако сведения о кинетике синтеза и содержания ДНК в первичных эритроидных клетках в связи с их диффе-ренцировкой и специализацией ограничиваются лишь фрагментарными данными. Наши исследо вания показали, что пути развития первичных эритроидных клеток (ПЭК) также описаны не полно. Известно, что ПЭК у эмбрионов кур дифференцируются в эритроциты в течение 5 суток, проходя параллельно 6 туров делений и стадии проз ритробласта, ба-зофильного, полихроматофильного и ортохромного эритробластов. Нами же выявлен и другой укороченный путь, когда клетки на стадиях про-эритробласта и базофильного эритробласта перестают делиться и, минуя остальные стадии, превращаются в ретикулоциты тер минально дифференцированные клетки с высоким содержанием гемоглобина и четко отличающиеся от эритроцитов. Появившись в крови на 2-е суток раньше последних, они сохраняются в крови длительное время и исчезают одновременно с первичными эритроцитами. Анализ распределения клеток по содержанию ДНК в их ядрах показал, что около 50% ретику-лоцитов в течение всего периода функционирования ПЭК содержат 4с ДНК (рис.22).

M К, Ц9 M ** Л» W 14 w i

Рис 22. Распределение первичных эритроидных клеток эмбрионов кур по содержанию ДНК (а), гемоглобина (б) и суммарного белка (в).

По осям абсцисс - количество вещества, уел ед; по осям ординат - число клеток. Зачерненные участки гистограмм соответствуют числу клеток с акцессорными ядрами. К- контроль (эритроциты взрослого животного); эб - эритробласты, рц - ретикулоциты, эц - эритроциты, Римскими цифрами обозначен возраст эмбрионов, сут.

Следовательно, примерно половина зритробластов, идущих по этому пути, необратимо блокируется в вг-фазе клеточного цикла. При этом, в2-блок не определяет направления дифференцировки, так как по ускоренному пути идут и 2с клетки. Принципиально же важно то. что клетки могут выходить из цикла в дифференцировку в постсинтетической его фазе, обладая преимуществом по сравнению с диплоидными клетками, по содержанию общего белка и гемоглобина, а большая их численность способствует обеспечению быстро растущих тканей зародыша кислородом. Цитофотометрическое исследование ПЭК показада, что в них, в отличие от клеток дефинитивного эритропоэза, синтезируется и накапливается гемоглобин, начиная с ранних эритробласти-ческих стадий, и в ретикулоцитах, и в эритроцитах содержится в 10 раз больше гемоглобина, чем в их аналогах у взрослых кур. Вместе с тем, во столько же раз ниже численность этих клеток в пересчете на грамм веса ткани. Это свидетельствует о том, что процесс гемогло-бинизации ПЭК намного напряженнее, чем клеток дефинитивного эритропоэза, а существенный вклад в повышение титра гемоглобина в крови ранних зародышей вносит накопление дополнительного количества гемоглобина в 4с ретикулоцитах, которые можно обнаружить вплоть

до 7х суток, когда ПЭК начинают элиминировать. Наряду с 4с ретику-лоцитами, на всех стадиях развития ПЭК обнаружено большое число клеток, содержащих Н2с ДНК, что обусловлено синтезом в вышедших из цикла клетках экстрахромоссмной ДНК, локализующейся в акцессорных ядрах (рис.23!.

Щ

г

Р< riiïi" «И» îv--* *•

| ¡'¿UV" икншвяж!

Рис 23. Примеры дифференциального изменения количества ДНК-фуксина в основном и акцессорном ядрах, в группах митотических хромосом и экстра-хромосомном материале на микроскопе-фотометре SMP 05 (а-г) и анализаторе изображений IBAS (д-з)

а - ядро 2с-эритроцита, б - ядро 2с-эритроцита с акцессорным ядром, в - то же с двумя акцессорными ядрами, г - телофаза с двумя экстрахроматиновымк глыбками; в протоколах указаны значения количества ДНК (Е! и другие данные измерений, д - (2с-ь2с) - анафаза, е - 2с-ретикулоцит с акцессорным ядром, ж - 4с-метафаза с эксрахро-матиновой глыбкой, з - (2с+2с) телофаза с эксрахроматиновой глыб-кой. В светлых прямоугольниках указаны значения количества ДНК, уел ед.

Акцессорные ядра (АЯ) были обнаружены давно (Davson, 1936), но их образование связывалось с фрагментацией основного ядра (Ringerts, Boland, 1974),. Нами впервые установлено, что АЯ формируются в ПЭК уже на стадии проэритробласта. Хроматин АЯ не уча ствует в процессе митоза, а в виде глыбок переходит в дочерние клет ки. При этом, в группах мета-, тело- и анафазных хромосом содержится строго соответствующее им количество 2с или 4с ДНК, о чем свидетельствуют данные, полученные с помощью дифференциальной фотометрии ДНК в клетках, имеющих АЯ или экстрахромосомные глыбки хроматина. Содержа ние ДНК в них варьирует от 2% до 80% ее количества в основных ядрах. Численность клеток, содержащих АЯ, увеличивается в процессе эритропоэза и к концу его достигает 50% всей популяции. На гистограммах вид но, что такие клетки встречаются и среди делящихся, и среди не делящихся ПЭК, причем их количество особенно велико во фракциях ретикулоцитов и эритроцитов. Важно отметить, что среди них обнаружено небольшое число клеток, не имеющих акцессорных ядер, но с гипердиплоидным содержанием ДНК. В этих клетках, как и в клетках с АЯ, всегда досто верно больше гемоглобина, чем в диплоидных. Это дает основание пола гать, что накопление дополнительной ДНК тесно связано с гемоглобинизацией ПЭК. Ее образование вероятно обусловлено амплификацией глобиновых генов. Из наших данных следует, что действие механизмов регуляции в первичном эритропоэзе направлено на сокращение сроков гемоглобиниза-

ции клеток. Ввиду напряженности совмещенных во времени процессов пролиферации, дифференцировки и функционирования ПЭК, наблюдается выраженная гиперрепликация ДНК. При этом одновременно реализуются два способа гиперрепликации: удвоение ее количества в результате необратимого блока в Сг фазе и накопление ДНК в виде гипердиплоидии, а также в виде АЯ, наблюдающихся во всех ПЕК.

Таким образом, сравнивая механизмы гиперрепликации ДНК при анемии и в первичном эритропоэзе у птиц, можно сделать вывод, что, будучи закономерными для первичного эритропоэза, у взрослых птиц они носят рекапигуляционный характер и, следовательно, закреплены в геноме клетки эволюцией. Их проявление при анемии обусловлено экстремальными условиями.

Глава IX

Гиперрепликация ДНК при острой анемии у крыс.

В связи с изложенными выше результатами исследований, проведенных на эритроидных клетках птиц, особенностью которых является сохранение ядер до стадии эритроцита включительно, у нас возник вопрос: специфичны ли проявления гиперрепликации ДНК лишь для эритроидных клеток птиц или они могут проявляться при анемии и в эритропоэзе млекопитающих, для которых характерна элиминация ядер после завершения бластических стадий развития? Для разрешения этого вопроса мы индуцировали острую форму анемии у крыс. С этой целью беспородным белым крысам весом 140-150 I' в течение 3-х суток вводили внутримыиечно фенилгидразин из расчета 50, 33 и 16 мг/кг веса гела, при этом к концу 3-х суток после инъекций около 40% животных погибало. Контролем служили клетки эритроидных популяций периферической крови и костного мозга интактных крыс, содержащихся в аналогичных условиях. Проводили популяционный и морфометрический анализ эритроидных клеток, подсчитывали число митозов и количество разрушенных под действием фенилгидразина клеток и проводили морфометрический и количественный цитохимический анализ.

Введение фенилгидразина в больших дозах вызывает резкое изменение состава популяции эритроидных клеток костного мозга и периферической крови, что наиболее сильно проявляется на 4-е сутки (пик анемии). Более, чем в 2,5 раза возрастает число проэритробластов и базофильных эритробластов. Если учесть, что митотическая активность ранних эритробластов возрастает не настолько, чтобы в полном объеме обеспечить нарастание их пула, -она лишь в 1,5 раза выше митотической активности клеток у интактных крыс, то можно придти к выводу, что в условиях острой анемии у крыс не только активируется пролиферация ранних бластов, но и возрастает доля гемопоэтических стволовых клеток, дифференцирующихся по пути эритропоэза. Изменения в численности клеток более поздних эритробластических стадий

(полихроматофильных и ортохромных эритробластов), не существенны. На пике анемии доля ортохромзшх эритробластов в популяции становится даже в 1,5 раза меньше чем у интактных крыс, но при этом в 3 раза увеличивается объем фракции ретикулоцитов (табл. 1)

Таблица 1

Изменение состав популяции эритроидных клеток костного мозга при острой анемии, %; X .1

Стадии разв. Эритр. клеток Контроль Сроки после начала инъекций, сут

4 5 6 7 8

Целящиеся ЭБ 1.2±0Л 1.9+0.1 2.3+0.2 1.9+0.1 1.7+0.2 1.3+0.1

ПЭБ 1.9+0. 5.6+0.3 5.7±0.3 3.3±0.2 3.210.2 3.0+0.2

БЭ 6.3±0.3 15.9+1.5 12.0±1.0 13.0+1.0 11.110.9 10.4+0.8

ПхЭБ 10.6+0.3 14.2+1.2 16.0±1.3 18.Ш.З 17.511.2 10.611.1

ОхЭБ 9.2±0 . 3 5.8+0.2 12.5+1.0 13.011.0 9.510.4 7.1+0.7

РЦ 11.2±0.6 30.1+1.8 27.5±1.7 32.012.0 35.1+2.1 4 0.212.0

ЭЦ 59.5+3.0 26.5±1.5 24.0±1.3 28.711.7 21.911.1 27.4+1.6

Примечание: В данной таблице и таблицах 2 и 3 приняты следующие аббревиатуры: ПЭБ - проэритробласты, ЭБ - зритробласты, БЭ - Оазофильный эртробласт, ПхЭБ - полихроматофильных эритробласт, ОхЭБ - ортохромный эритробласт, РЦ - ретикулоцит, ЭЦ - эритроцит.

Это свидетельствует о том, что темпы специализации эритроидных клеток возрастают и полихроматофильные и, в особенности, ортохромные зритробласты быстро превращаются в регикулоциты - клетки, завершившие процесс гемоглобинизации. Интересно, что доля эритроцитов в костном мозге подопытных крыс, при этом, вдвое ниже, следовательно, почти все вновь образовавшиеся ретикулоциты быстро превращаются в эритроциты и выводятся в кровь. Это подтверждается данными анализа структуры популяции, показавшего, что объем фракции эритроцитов в крови непрерывно возрастает, увеличиваясь за 5 суток более, чем втрое, достигает к 8-м сут. 77,4 % популяции (табл. 2). Следующей по численности является фракция ретикулоцитов, объем которой повышается до 6-х сут. и составляет более четверти всех клеток популяции. Следовательно, ретикулоциты, отсутствующие в крови в норме, в условиях анемии вносят существенный вклад в гемоглобинизации крови. Острая форма анемии приводит к выбросу в кровь и {Эластических форм, однако, это явление выражено слабо и вклад их в восстановление численности эритроидных клеток в крови у крыс в отличие от птиц незначителен. Однако, у них эволюционно закрепились иные способы компенсации нарушений гомеостазэ гемоглобина в крови. Один из них, связанный с интенсификацией процессов пролиферации и специализации и переключением части гемопоэтических клеток на путь эритропоэза, рассмотрен выше. Очевидно, что при этом используются те же механизмы регуляции эритропоэза, что и в норме, но работающие в ускоренном темпе. Наряду с ним у млекопитающих при анемии включаются компенсаторные-механизмы, деятельность которых в норме у взрослых животных Не

проявляется. К ним относятся механизмы микро- и макроцитоза. Последний был описан ранее (Alpen, Granmore, 1959; Stohlman et al.,1968). Согласно их данным последнее деление на стадии эритробласта при анемии может быть пропущено и в результате образуются крупные клетки, теряющие вскоре ядра и в виде макроцитов появляющиеся в крови. Позже это явление было исследовано на примере фенилгидраэиновой анемии у крыс (Кульминская, Газарян, 1980).

Таблица 2.

Изменения состава популяции эритроидных клеток периферической крови при острой анемии, %; X + 5л

Фракции эритроидн. клеток Контроль Сроки после начала инъекций, сут

4 5 6 7 8

БЭ - 0.810.04 0.6+0.02 0.5+0.02 0.3+0.01 0.1+0.01

ПхЭБ - 0.4+0.01 0.5+0.03 0.3+0.01 0.3+0.01 0.310.01

ОхЭБ - 0.4±0.02 0.4+0.02 0.5+0.02 0.4+0.01 0.5+0.02

РЦ, ИЗ них - 9.4±0.4 15.0+0.6 28.3+0.9 26.9+0.8 18.3+0.6

Нормальные - 21.3+0.7 4 0.0+1.4 49.5+1.6 64.9+2.5 70.3+2.6

Макроциты - 68.1+2.7 46.7+1.4 45.9+1.5 31.6+1.0 29.7+0.9

Микроциты - То. 6+0 .5 13.3+0.5 4.6+0.4 3.5+0.2 -

Разруш:. РЦ - 1.2±0.04 0.9±0.04 0.510.03 - -

ЭЦ, иэ них 100.0+0.0 23.8+0.7 42.8+1.4 55.7+2.1 64.512.4 77.412.8

Нормальные 100.0+0.0 12.6+0.4 12.5+0.4 50.1±1.9 67.012.5 76.2+2.7

Макроциты - 3.4±0.09 21.5+0.8 27.610.7 21.210.6 19.3+0.5

Микроциты - 84.0+3.1 66.0+2.5 22.3+0.8 11.8+0.4 4.5+0.9

Разруш. ЭЦ - 64.0+2.3 40.8+1.3 15.210.5 7.6+0.2 3.8+0.1

Было подтверждено образование значительного числа макроцитов в костном мозге и авторы пришли к выводу, что макроцитоз при анемии у млекопитающих является рудиментарным проявлением резервного эритропоэза, проявляющегося в полной мере только у форм с ядерными эритроцитами. Наряду с макроцитами, в крови млекопитающих при анемии были обнаружены и микроэритроциты, что по мнению ряда авторов должно свидетельствовать об "истощении костного мозга" (Гольдберг, Левина, 1969). По нашим данным при анемии и макроциты, и микроциты появляются в костном мозге на ранних бластических стадиях и составляют значительную долю в каждой из фракций. Даже на стадии проэритробласта нами обнаружены и крупные, и мелкие клетки, которые формируются не перед выходом в кровь, как это следует из литературных данных, приведенных выше, а намного раньше. При этом, доля фракций макро- и микроцитов меняется в зависимости от времени после начала инъекций. В наших опытах на модели острой анемии, на пике которой около 40% крыс погибало, показано, что на 4-е сутки, 85% эритроидных клеток периферической крови составляют микроциты. Начиная со следующих суток их численность быстро снижается и к В-. м суткам сокращается до 9%, параллельно со столь же быстрым

а

5 6 7 8

5 6 7

6 7

5 6 7

Рве. 24 (столбики 1 н 2). Квветика изменений численности кяеток разных фракций в костном мозге (1) я периферической крова (2) крыс в процессе восстаноюгения эритроиа при острой анемии.

По оси абсцисс: время после первой инъекции февиягнвразяна (сутки); во оси ординат: суммарная численность клеток на разных стадиях развития (%). а - делящиеся клеше, Ь -эршробдасш, с - вормоцвты, d - мгкроцгхы, с - иикрощпы.

Рве. 25 (столбах 3). Вклад клеток разных фракций в суммарное содержание гемошобнда крова крыс в процессе восстановления эрирона при острой анемии. По оси ординат, количество гемоглобина, остальное как на рис.24.

взрастанием числа макроцитов и нормальных эритроцитов. Аналогичная фтина наблюдается и в периферической крови, за исключением того, что, ;ли в костном мозге фракция эритроцитов составляет на 8-е сут. 27%, то крови ее объем к этому времени достигает 77 %,и все они представлены зрмальными эритроцитами (рис 24, 1 и 2) . Некоторые авторы [Гольдберг, )льдберг, 1980; Павлов, Морщакова, 1987) считают, что подобное )четание процессов макро- и микроцитоза свидетельствует о большой »напряженности процесса регенерации. По нашим данным это касается ¡кроцитоза. В опытах А. С. Кульминской и К. Г. Газаряна (1980) дозы шилгидразина были в 2,5 раза меньше, чем в наших экспериментах, ;трота анемии также была менее выражена и при интенсивном образовании исроцитов,микроциты в костном мозге и крови, практически, отсутствова-!. По нашим же данным образование макро- и микроцитов начинается повременно еще до пика анемии, о чем свидетельствует их наличие во >акциях ретикуло- и эритроцитов уже на 4-е сутки, однако темпы их >рмирования различны. Развитие клеток по линии нормогенеза идет с 5ычной скоростью размножения и созревания, соответствующей скорости >итропоэза у млекопитающих, и длится 120 часов. Микроциты образуются ) базофильных эритробластов и развиваются намного быстрее. Ускорение юисходит за счет выпадения стадии поли- и ортохромного эритробластов сокращения продолжительности стадии ретикулоцита. В результате, Iкопив намного меньше гемоглобина, чем нормоциты, но достигнув высокой [сленности, на пике анемии микроциты практически в полном объеме геодят в кровь и вносят на 4-е сутки наибольший вклад в ее гемоглоби-[зацию (рис.25). В дальнейшем их число резко снижается, они теряют юе значение и на смену микроцитозу приходит макроцитоз. Макроциты :рут начало от проэритробластов и з их формировании участвуют механиз-1 гиперрепликации ДНК путем блокирования клеток в 5 и ^ фазах (табл. . Так, на 4-е сутки среди макроэритробластов 20% представлены 2с [етками, что в 2,5 раза меньше, чем в норме, и более 60% составляют щтезирующие ДНК клетки, в результате чего образуются внецикловые [етки, содержащие примерно в 1,5 раза больше гемоглобина, чем нормоци-[. При этом программа макроцитоза реализуется по крайней мере в ■лтора раза быстрее, чем программа нормогенеза, благодаря тому, что: макропроэритробласты, пройдя 1-й тур делений и войдя во 2-й не вершают его митозом и выходят из цикла в Б или бг фазах; б) исключа-'ся деления макроцитов и на эритробластических стадиях; в) макробласты повышенным содержанием ДНК выходят на завершающие стадии созревания, копив намного больше гемоглобина, чем нормобласты. Так, нами показа-|, что при острой анемии у крыс включается и механизм микроцитоза, за 'роткий срок восстанавливающий численность клеток крови, и макроцито-., сходный с механизмом резервного эритрспоэза. Отсюда следует вывод, ■о, в отличие от птиц, у которых при острой анемии обе эти функции рут на себя блокированные в постсинтетической фазе Оазофильные итробласты, у млекопитающих - это две независимые друг от друга ■ограммы, реализацией которых управляют разные механизмы регуляции, ятельность их проявляется лишь в экстремальных условиях анемии, в висимости от степени ее остроты.

Таким образом, представленные данные характеризуют различия в реак-ях эритроидных систем у птиц и млекопитающих в ответ на экстеремаль-:е условия, возникающие при анемии. Результаты предпринятого нами ализа позволяют утверждать, что изменения, происходящие в поведении еток эритроидного ряда в этих условиях обусловливаются в первую

Таблица :

Размеры (мкм2), плоидносгь (с) и доля макроцитов данной плоидности (%) в каждой из стадий развития.

Классы Сроки после начала инъекций (сут) и стадии развития

плоид-

ности Норма IV ______ . VI - VII VIII

Проэритробласты

2с 140.2+9 5 181.2+9. 180.6±9.9 185.4+9.5 - 227.8+9.

51.4% 20.0% 33.4% 50.0% 0 50.0%

Н2с 159.9±7. 1 190.5+8.] 278.218.7 237.9+8.1 174.915 2 297.4+7.

27.0% 62.5% 33.3% 50.0% 40.0% 50.0%

4с 280.1±6. 3 232.2+5.3 292.1+5.2 - 281.716. 5 -

21.6% 25.0% 33.3% 0 60.0 0

Базофильные зритробласты

2с 118.8+8.9 153.1+8.2 156.318.2 160.1+7.2 159.4+8. 1 -

54.84 50.0% 34.0% 12.5% 33.4% 0

Н2с 138.3+6. 8 - 166.3+5.9 160.616.9 - 173.015.

25.8% 0 66.0% 50.0% 0 33. 0%

4с 147.5+9. 3 167.3±5, - 184.718.8 188.4+7. 8 170.316.

, 19.4% 50.0% 0 37,5% 66.6% 66.0%

Полихроматофильные зритробласты

2с 123.1+7. 8 147.7+8.1 СП со Г-1 147.4+8.5 145.515. 2 144.4+9.

100.0% 16.1% 50.0% 23.1% 100.0% 100.0%

2Нс - 158.616.6 157.3%±7.0 154.6+5.1 - -

0 66.6% 40. 0% 76.9% 0 0

4с - 252.6±6.5 247.2+7.7 - - -

0 16.7% 10.0% 0 0 0

Ортохромные эритробласты

2с 118.3±7. 8 - 145.615.3 160.316.2 146.717. 9 144.9+8.!

100.0% 0 33.4 25.0% 100.0% 100.0%

Н2с - 160.7+8.9 150.9+9.9 165.318.5 - -

0 100.0% 66.6% 75.0% 0 0

Ретикулоциты

114.3+7 в|хб5 . 2+9. 2 141.319.1 143.2+9.1 145.9+8. 1 137.5+9.1

Эритроциты

110 .2+5. 8 161.5+9.1 157.317.9 151.718.8 148.619. 9 147.2+7.:

очередь внешними по отношению к клеткам факторами. Сам характе изменений определяется внутриклеточными факторами, а именно тем которые воздействуют на геном: включают механизмы гиперрепликации ДНК регулируют процесс пролиферации, скорость морфологической дифференци ровки, синтеза и накопления гемоглобина. Вместе с тем они еще ра свидетельствуют в пользу неоднократно высказанного нами предположения высокой степени гибкости этих механизмов и в том числе механизм, гиперрепликации ДНК. Она избирает пути восстановления нормальног состояния и функционирования клеточных систем, наиболее соответствуют«! возможностям клеток, сложившимся в процессе эволюции вида и само клеточной системы, и в то же время адекватные потерям, понесенным о повреждающих факторов, как это наблюдалось и для других рассмотрении ранее популяций.

выводы

1. Усовершенствованы методы количественного цитохими-ческого анализа содержания ДНК в ядрах клеток и разработаны методы объективной оценки распределения ДНК и других веществ в объекте; создано программное обеспечение компьютерного многопараметрического анализа изображений, получаемых при сканировании микрообъектов, и в практике использован комплекс этих методов для анализа количества и распределения ДНК в ядрах клеток, а также для исследования любых клеточных структур и веществ.

2. Показано, что в процессе развития экспериментального острого панкреатита у крыс происходят значительные перестройки в деятельности внутриклеточных и популяционных механизмов регуляции, проявляющиеся на первом этапе панкреатита в активации синтеза и накопления РНК, и интенсификации экзокринной функции панкреацитов. На втором этапе включение популяционных механизмов регуляции пролиферации и метаболизма способствует дальнейшей адаптации панкреацитов и популяции в целом к изменившимся условиям. Вследствие запуска резервной программы гиперрелликации ДНК формируется значительное число полиплоидных одно- и двуядерных клеток, более устойчивых к вредному воздействию панкреатогенных токсинов, чем диплоидные. В результате развития адаптационного процесса панкреатит переходит в хроническую форму.

3. С развитием панкреатита тесно связаны морфа-функциональные изменения и в популяции гепатоцитов, отражающие двухэталный процесс защитно-реактивной активации клеток,- согласующийся по времени и характеру проявления с таковым в популяции панкреацитов. В повышении эффективности защитных функций гепатоцитов большую роль играет гиперрепликация ДНК, реализуемая путем образования полиплоидных клеток.

4. Показано, что использование тиосульфата натрия в качестве биологически активного вещества стимулирует функциональную активность панкреацитов, и гепатоцитов способствуя дестабилизации сложившегося в результате адаптации динамического равновесия этих клеточных популяции и препятствует переходу панкреатита в хроническую стадию.

5. Обнаружено проявление гиперрепликации ДНК в популяциях макрофагов селезенки и лимфоузлов интактных мышей и выявлена зависимость между накоплением повышенного количества ДНК и фагоцитарной активностью этих клеток. При канцерогенезе численность гипердиплоидных макрофагов в селезенке и лимфоузлах уменьшается в связи с миграцией этих клеток в опухоль, введение же ретиноидов приводит к восстановлению их количества в селезенке и лимфоузлах.

6. В зависимости от остроты экспериментально вызванной анемии у птиц проявляются разные формы гиперрепликации ДНК, направленные на восстановление эритрона. При сильной анемии запускается механизм резервного эритропоэза, характеризующийся удвоением количества ДНК в части базофильных эритробластов путем временного блока в фазе, и направленного на восполнение численности клеток и содержание гемоглобина в крови. При слабой анемии основной формой гиперрепликации ДНК является формирование гипердиплоидкы^ эритроцитов, содержащих, повышенное количество гемоглобина.

о

7. Введение гемина при сильной анемии у птиц не вносит принципиальных изменений в генетически закрепленные резервные программы эритропоэза, реализация которых уже индуцирована экстремальными условиями дефицита в крови гемоглобина. Он стимулирует уже ускоренные процессы размножения компетентных клеток и их морфологической дифференцировки и ослабляя, таким образом, остроту анемии, оказывает не столь выраженное влияние на скорость синтеза гемоглобина, как морфологическую дифференцировку, в результате чего разрыв между темпами этих двух процессов, протекающих в норме синхронно, еще более увеличивается; это свидетельствует что они регулируются различными механизмами, а синхронность их функционирования в норме обусловлена соответствием программы эритропоэза условиям ее реализации.

8. Подтверждено предположение, что при анемии происходит рекапитуляция наследственно закрепленных программ резервных механизмов регуляции эритропоэза, появляющихся в первичном эритропоэзе у птиц в норме. Выявленные при этом, купированные пути развития эритроидных клеток, обусловленны теми же механизмами гиперрепликации ДНК - блоком в в2 фазе и образованием гипердиплоидных клеток, содержащих экстрахромосомную ДНК, и сопровождающуюся соответствующим повышением содержания гемоглобина в эритроцитах.

9. Острая анемия у крыс приводит к кардинальным перестройкам в кроветворении в результате запуска механизмов микро и макроцитоза, не функционирующих в норме и обусловливающих ускоренную регенерацию эритроидной популяции и гемоглобинизацию крови после криза анемии. Микроциты, образующиеся в большом количестве, играют важную роль в восполнении численности эритроцитов крови. Формирование же макроцитов, развивающихся несколько медленнее микроцитов, но накапливающих намного больше гемоглобина, обусловлено гиперрепликацией ДНК путем блока в синтетической и постсинтетической фазах клеточного цикла и направлено, в первую очередь, на восстановление содержания гемоглобина в крови.

10. Исследования, проведенные нами на модельных клеточных системах в экстремальных условиях, установили роль, место и значение гиперреликации ДНК, как резервного механизма восстановления гомеостаза клеточных популяций в этих условиях, и подтвердили общебиологическую значимость этого фундаментального явления.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

.Корвин-Павловская Е. Г., Каралова Е. М., Кульминская А. С. Синтез ДНК, общего белка и гемоглобина в клетках эритроидного ряда при анемии у голубей. /Материалы 11 Всосоюзн. симп. по сомат. полиплоид., Ереван, 1977, с. 54-56.

. Корвин-Павловская Е. Г., Каралова Е. М., Кульминская А. С., Магакян Ю. А., Газарян К. Г. «Внециклоаьгй синтез» ДНК, накопление общего белка и гемоглобина в клетках эритроидного ряда при анемии у голубей. / Цитология, 1978, г 20, N 9, с 10161026.

.Магакян Ю. А., Корвин-Павловская Е. Г., Каралова Е. М., Газарян К. Г. О зависимостях между степенью конденсации хроматина в ядрах, апуринизацией и деполимеризацией ДНК кислотном гидролизе, связыванием основного фуксина с ее альдегидными группами и выраженностью ошибки распределения при цитофотометрии комплекса ДНК-фуксин. Материалы научн. конф. по вопр. мол-кл. биологии, Ереван, 1979, с 50-52.

. Каралова Е. М., Хачикян Р. Э., Аветисян А. С., Магакян Ю, А О возможности использования кислотного гидролиза и реакции Фельгена для исследования состояния хроматина. /VII Всесоюзн. симп. по структ и функци клет ядра, тез докл., Харьков: Из-во Харьк. ун-та, 1980, с 75.

. Каралова Е. М., Хачикян Р. Э., Аветисян А. С., Магакян Ю. А. Об интенсивности реакции Фельгена зависимости от способа и продолжительности фиксации. /Цитология, 1980, т 22, N 9, с 10461053.

.Магакян ¡0. А., Каралова Е. М., Хачикян Р. Э., Аветисян А. С. Влияние температуры гидролизующего раствора, концентрации кислоты и продолжительности гидролиза на интенсивность реакции Фельгена. /Цитология 1980, т 22, N 9, с 1054-1066.

.Корвин-Павловская Е. Г., Каралова Е. М., Кульминская А. С., Магакян Ю. А., Газарян К. Г. О независимости процессов накопления гемоглобина и морфологической дифференцировки эритроидных клеток у птиц. /Цитология, 1980, т 22, N 12, с 14131412.

. Котельников В. М., Каралова Е. М., Литинская Л. Л., Магакян Ю. А. О возможности сохранения структуры и количества ДНК в ядрах различных клеток при кислотном гидролизе. /Вкл. Эксперим. Биологии и мед., 1981, т 91, N 2, с 248-251.

. Аветисян А. С., Каралова Е. М., Хачикян Р. Э., Магакян ¡0. А. Влияние способа и времени фиксации на интенсивность реакции Фельгена в ядрах клетки печени пр их полиплоидизации. /VI Всесоюзное совещание эмбриологов, тезисы докладов. М 1981, с 4.

Каралова Е. М., Корвин-Павловская Е. Г., Кульминская А. С., Магакян Ю. А., Газарян К. Г. Содержание ДНК, суммарного белка и гемоглобина в процессе дифференцировки и морфо-функциональной специализации эритроцитов в эмбриогенезе кур. / VI Всесоюзное совещание эмбриологов, тезисы докладов. М 1981, с 75.

Хачикян Р. Э., Аветисян А. С., Каралова Е. М., Магакян ¡0. А. Изменения в структуре хроматина при полиплоидизации гепатоцитов.

/VI Всесоюзное совещание эмбриологов, тезисы докладов. М 1981, 191.

12. Кар&лова Е. И., Магакян ¡0. А. О транскрипционной активное генома эритроидных клеток в связи с гиперрепликацией ДНК (i примере первичного эритропоэза у кур). /IV Двусторонной си; ССР-ФРГ, Ереван: «Наука», 1981, с 75.

13. Магакян Ю. А., Каралова Е. М. Гиперрепликация ДНК транскрипция генома эукариот в процессе дифференцировки. /. Двусторонной симп ССР-ФРГ, Ереван: «Наука», 1981, с 75.

14. Кульминская А. С., Каралова Е. М., Корвии-Павловская Е. Г Магакян Ю. А., Газарян К. Г. Влияние гемина на процесс клеточной дифференцировки при резервном эритропоэзе у голубе£ /Цитология, 1982, т 24, N 9, с 1028-1034.

15. Папзян Г. В., Магакян Ю. А., Агроскин Л. С., Каралова Е. f Исполльзование данных сканирующей цитофотометрии для анали: распределения поглощения вещества в клетках. /Цитология, 1982, 24, N 11, с 1360-1366.

16. Корвин-Павловская Е. Г., Каралова Е. М., Кульминская А. С. Магакян Ю. А., Газарян К. Г. Характеристика путе дифференцировки эритроидных клеток птиц в условиях анемш /Цитология, 1983, т 25, N 2, с 148-155.

17. Аветисян А. С., Каралова Е. М., Магакян Ю. А. Различия устойчивости хроматина клеток семенника и печени к кислотно*-гидролизу в связи со степенью конденсации. /Материалы научне конф. «Вопросы мол-кл биол.», Ереван, 1983, с 21-22.

18. Габриэлян Н. А., Каралова Е. М., Каыаян А. С.,Магакян Ю. ? Изменения в распределении ацинарных клеток по содержанию в v ядрах ДНК при экспериментальном панкреонекрозе и регенерации /Материалы научной конф. «Вопросы мол-кл биол.», Ереван, 1983, 23-24.

19. Каралова Е. М., Магакян Ю. А. Экстрахромосомная ДНК первичном эритропоэзе у куриных эмбрионов. /Материалы научне конф. «Вопросы мол-кл Оиол.», Ереван, 1983, с 24-25.

20. Аветисян А. С., Каралова Е. М., Магакян Ю. А. Исследовани различий в структуре хроматина ядер разных типов клеток по ег отношению к Фельгеновскому гидролизу. Кластерный анализ кривы гидролиза. /VIII Всесоюзн. симп. по структ и функци клет ядра тез докл., Пущино, 1984, с 4-6.

21. Магякян Ю. А., Каралова Е. М. Экстрахромосомная ДНК в ядра дифференцирующихся эмбриональных клеток. . /VIII Всесоюзн. симп по структ и функци клет ядра, тез докл., Пущино, 1984,с 19.

22. Аветисян А. С., Каралова Е. М., Магакян Ю. А. Гистограмм распределения вещества в объекте, как метод исследовани структуры хроматина. /В сб Автоматизация цитологически исследований, Киев, «Наукова думка», 1985, с 4-5.

23. Каралова Е. М., Магакян Ю. А. Использование сканирующе цитофотометрии и топограмного анализа для изучения особенносте распределения и количества ДНК в ядрах дифферениирующихс клеток. /В сб Автоматизация цитологических исследований, Киев «Наукова думка», 1985, с 51-52.

24. Магакян Ю. А., Каралова Е. М. Анализ распределени поглощающего вещества и текстуры цитологических объектов помощью сканирующей цитофотметрии. /В сб Автоматизаци

цитологических исследований, Киев, «Наукова думка», 1985, с 8182.

25. Каралова Е. М., Корвин-Павловская Е. Г., Кульминская А. С., Магакян Ю. А., Газарян К. Г. Пути дифференцировки первичных эритроидных клеток у кур. /Цитология, 1985, т 27, N6 с 656-662.

26. Каралова Е. М., Газарян К. Г., Магакян Ю. А. Синтез и содержание ДНК, накопление суммарного белка и гемоглобина в процессе дифференцировки первичных эритроидных клеток у кур. . /Цитология, 1985, т 27, N6 с 663-669.

27. Магакян Ю. А., Каралова Е. М., Аветисян А. С. Влияние качества красителя и способов приготовления реактива Шиффа на интенсивность окрашивания и спектры поглощения ДНК-фуксина при проведении реакции Фельгена. /Цитология, 1985, т 27, N9 с 10781085.

28. Магакян Ю. А., Каралова Е. М. Акцессорные ядра в ервичных эритроидных клетках эмбрионов кур и кинетика их образования в связи с синтезом и накоплением дополнительной ДНК. /Цитология, 1985, т 27, N10 с 1137-1144.

29. Магакян Ю. А., Каралова Е. М., Наджарян Н. У. Гиперрепликация ДНК в развитии клеточных субполуляций. /Тез. Докл. Респ. Конф. «Макромолекулы и функционирование клетки», Ереван , 1986, с 27.

30. Каралова Е. М., Аброян Л. О., Магакян Ю. А. Образование акцессорных ядер как проявление гиперрепликации ДНК в первичных эритроидных клетках. Тез. Докл. IX Всес. Симпозиума «Структура и функция клеточного ядра.», Черноголовка, М., 1987, с 16.

31. Gazaryan К. G., Magakyan Yu. A. Karalova Е. M. Avian primary erythropoiesis: accessory patthways of erythrocyte maturation in chick yolk sack. /Biomed. Biochim. Acta, 1987, v 16, p 136-140.

32. Капанцян А. Л., Каралова E. M., Магакян Ю. А. Коэффициент взаиморасположения частиц и его использование при количественном анализе распределения вещества в клетках. /Цитология, 1988, т 30, N 30, с 361-366.

Î3. Каралова Е. М., Аброян Л. О., Араратян П. А., Магакян Ю. А. Гиперрепликация ДНК, степень ее выраженности и способы реализации в первичном эритропоэзе птиц и млекопитающих. /В сб. «Проблемы биол. развития», Тбилиси, Из-во ТГУ, 1989, с 21-22.

¡4. Магакян Ю. А. Каралова Е. М. Цитофотометрия ДНК (моногр., ред. акад. Галояна А. А.) Из-во Арм. ССР, 1989, 202 с.

Î5. Аветисян А. С., Каралова Е. М., Магакян Ю. А. Классификация ядер разных типов клеток по структуре хроматина методом иерархического многомерного кластер-анализа. /Сборник научных трудов «Автоматизация цитологических исследований» Киев, «Наукова думка», 1990, с 4-6.

16. Каралова Б. М., Бахшинян М. 3., Магакян Ю. А. Синтез и содержание ДНК в ядрах макрофагов в корме, при экспирементальиом канцерогенезе и при введении животным ретиноидов. / Цитология, 1990, т 32, N1, с 47-53.

17. Каралова Е. М., Канаян А. С., Араратян JT. А,, Габриэлян Н. А., Магакян Ю. А. Морфофункциональные изменения экзокринных панкреацитов при остром экспериментальном панкреатите у крыс. / Цитология, 1990, т 32, N4, с 337-342.

8. Каралова Е. М., Канаян А. С., Араратян Л. А., Габриэлян Н. А., Магакян Ю. А.Изменения содержания нуклеиновых кислот и

суммарного белка в экзокринных панкреацитах и состава и> популяции при экспериментальном остром панкреатите. Цитология, 1990, т 32, N9, с 893-898.

39. Каралова Е. М., Канаян А. С., Араратян Л. А., Габриэлян Н. А., Магакян Ю. А. Цитологическое исследование действия тиосульфата натрия на процесс индуцирования острого панкреатите у крыс / Цитология, 1990, т 32, N12, с 1205-1211.

40. Каралова Е. М., Капанцян А. Л., Магакян Ю. А. Использование методов анализа изображений микрообъектов - для выявления р объективной оценки патологических изменений в клетках. /Тезись науч конф. «Морфометря и мат. модел. В медико-биологически; исследованиях.», Харьков, 1990, с 94.

41. Аветисян А. С., Каралова Е. М., Магакян Ю. А. Многомерньк иерархический кластер-анализ как метод систематизацт параметрических характеристик клеток. /Тезисы науч конф. «Морфометря и мат. модел. В медико-биологкчески: исследованиях.», Харьков, 1990, с 5

42. Капанцян А. Л., Каралова Е. М., Магакян Ю. А. Програмно< обеспечение многопараметрического анализа морфофункциональног< состояния клеток. /Тезисы науч конф, «Морфометря и мат. модел. 1 медико-биологических исследованиях.», Харьков, 1990, с 93.

43. Магакян Ю. А., Каралова Е. М. Гиперрепликация ДНК npi цитодифференцировке и развитии клеточных популяций. Часть Т. Гиперрепликация ДНК в экстремальных условиях, (монография, pej акад. Н. Г. Хрущева]. Серия: Итоги науки и техники. Из-в< ВНИИГИ, АН СССР, Москва, 1991, т 16, С 241.

44. Каралова Е. М., Капанцян А. Л., Магакян Ю. А. Использовани! данных сканирующей цитофотометрии и анализа изображена микрообъектов дял выявления и объективной оценки распределена нуклеиновых кислот и белков в ядре и анализа структур! хроматина. /Цитология, 1991, т 33, N9, с 73-74.

45. Каралова Е. М., Капанцян А. Л., Магакян Ю. А Многопараметрический анализ изображений микрообъектов i «паспортизация» клеток /Цитология, 1991, т 33, N9, с 84-85.

46. Магакян Ю. А., Каралова Е. М., Аброян Л. О. Изменения составе популяции, темпах пролиферации и специализации клето эритроидного ряда крыс при экспирементальной анемии. /Цитология 1993, т 35, N8, с 817-824.

47. Акопян Л. А., Каралова Е. М., Канаян А. С., Габриэлян Н. А. Магакян Ю. А. Морфофункциональные изменения гепатоцитов пр экспериментальном остром панкреатите у крыс. /Цитология, 1994, 36, N8, с 829-836.

48. Кущ А. А., Шумай Е. П., Глухова Л. А., Аветисян А. С. Капанцян А. Л., Каралова Е. М., Магакян Ю. А Иммунофотометрический и цитогенетический анализ клеток Т лимфобластных линий при экспериментальной ВИЧ-инфекции. /Вопр вирусологии, 1994, т 39, 8 2, с 77-80.

4 9. Yu. A. Magakian, Е. М. Karalova, A. L. Kapantsian, A. S Avetisian. Multiparametric analisis of the microojects images i the immunocytophotometric investigation of quantity and th distribution of the HIV proteins in the infected limphccytes i vitro. /World of microstructure. 1996, N1, p 41.

51. Магакян Ю. А., Каралова Е. М., Акопян Л. А., Габриэлян Н. А., Канаян А. С. Изменения в содержании ДНК, плоидности и составе популяции гепатоцитов при экспериментальном остром панкреатите у крыс. /Биол. ж. Армении, 1996, т 49, N 3-4, с 145-148.

52. Магакян ¡0. А., Каралова Е. М., Аброян Л. О., Карапетян С. А. Изменения в кинетике содержания гемоглобина, суммарного белка и ДНК в эритроидных клетках крыс при экспериментальной анемии. I Периферическая кровь. /Цитология, 1997, т 39, N8, с 705-710.

53. Магакян Ю. А., Каралова Е. М., Аброян Л. О., Карапетян С. А. Изменения в кинетике содержания гемоглобина, суммарного белка и ДНК в эритроидных клетках крыс при экспериментальной анемии. II Костный мозг. /Цитология, 1997, т 39, N8, с 711-718.

54. Каралова Е. М., Акопян Л. А., Габриэлян Н. А., Канаян А. С. Магакян Ю. А. Цитологическое исследование действия тиосульфата натрия на функциональное состояние гепатоцитов при экспериментальном остром панкреатите у крыс. /Биол. ж. Армении, 1997, т 50, N 1-2, с 41-45.

55. Магакян Ю. А., Каралова Е. М., Акопян Л. А., Габриэлян Н. А., Канаян А. С. О взаимоотношениях между популяциями гепатоцитов и экзокринных панкреатитов в процессе экспериментального' острого панкреатита у крыс при воздействии на них тиосульфатом натрия. /Биол. ж. Армении, 1997, т 50, N 1-2, с 46-52.

56. Магакян Ю. А., Каралова Е. М-, Капанцян А. Д., Кешишян А. П. Дифференциальное сканирование как прецизионный метод количественного анализа веществ и микроструктур клетки. /Материалы конференции «Электронная ыикроскопия-97». 1997, с65". Ереван.

57. Каралова Е. М. Дополнительная ядерная ДНК и дрожжевая дс-РВК, как независимые эндогенный и экзогенный стмуляторы восстановления эритрона при анемии. /Материалы конференции, посвященной 30-летию основания НАН РА, 1997, с 35. Ереван

Ц1ГФПФЦ<И«Р

d'uiúuiGui!¡uili[ig IjhGuuipuiGmpjuiG qiluuiijnp luQqJipGbptig líbliG t huiGqtiuuiGni f.mljuiplimn pjJijúbpíi buitiuiliiupqbpji qiupqiugtfuiü hi tibGuiuqnp&niGhmpjuiG tpupquiilnpiSw i51,)ijmCJiqdDbpti piugiubuijwnitÎE Gnpiliujruii, iqiupninqliuijmü bi tpuinpbúuii ujiujiSujúGbpiuü Ujq {uQimfi imöüiuö huiúuip ljmwuipijmiS bß hpljm hJiúGuipuJp uipnghuCbp[i, ujjG I ujprnji.lilipmgjiiujji bt гфЗДЛрЬйдйшй tjmpqiui|nptïui(i Cbpp^guijfifi, щпирицщд^пй I huiiSurtjuipquyP iIbfuu)ü|iqiiGbp[i hbinuiqnumipjniGütip, npníig huipuipbpuiljgnipjmG прп;фш5 t pjjijiúbpji qUCbuiJili uiiquipuiinji qtipimiGbnipjiuip: Uji} hhmuiqnuiiupjmGGbp Ijiupbuip оц1л1) t hiuGqJutuGnitf niumöGiuuJipniöp T-"bí9"-ji ршйш^ш^шй hi Ipumugilui&puijJi i)imJm|umpjmlÍQt.pti, bi mmujJiQ hhpp]iG Срш hfiu{bpnbimJiI}mg^j)i, npiqbu tpumphiSu ujuijiSuiGGbpniiS qtGbin¡il|UitiUjá hiuiîuiliiupqji hniuuiiJimpjiufi piupüpuigiSuiG ujuihbumuijh iíb[umü¡iqtífi, bi nbqtiübpiugfiuijji iqpngbuGbpnuS Ёрш nifibgui¡> qbpfi: -<hßg aiju |uGi)p{i pnfi lîuiûli t uhJjuh uyluuiunuGpii, np Jipuiqnpöilbl t j>uiQiuIjui1¡ui!j pjjuiEiiúfiuijfi I

Ö2qpjim liJilipnuinbljmpn^ninnöhinjifimjii ^шйшОшЦш^д líbpn^üb-pji oqmuiqnpóúuiúp, }\G¿ hi IjUJÜlunpiyUt t miJjmtGbpti opjb^in¡iij[nipjtiiQ¡i ps{i2GbpnuS 1Л>(3--]1 ujiüpbqji ni t)nimuiljúiu GnijGJjuIi-Giluiquiqmjfi (JiniJuiJuaipjniGtthiiji ijbpuipbpjuit, opJiGuilj' qb&bpji шйцйхфЭДшдриу l|ui!Í 'l"bß-|i uimuijbi {uii^np umiuQá}iú hunnijiuölitip}i puiqtíuiljfi nbmjil¡mgtiuijli tfuiduiGuil hi pniji t unity ишшСиц hjiúüuiilnpijujó uiuiinlibpiugmií hnúbnumuiq¡i hiutfuiliuipq ¡-.üpüiiiujiiitiLquiGiIuiG liuiiS i[bpuil{iJuGqûiiuiG qnpdnuS pjfijGbpnuS bi unspniipiuljui ирицшцшд^иШЬрш! qbGhmJiljaphG uiiSpuiqpiJiuü ujnwhGgliuijji JipiuIjiuGuigiîmG ¿b? GpuiG qbpji i[bpuipbpjuii:

•¿.luinmlj Й2шЭДш0 ifmpàujpujpuiljujû línrjbLGbpfi 9ПЧ9 t mp^L l-lifcí-

hjiu[bpnbuj(lil{ujg{iuij[i iíb[umü[iqil{i lihGuuipuiGuilnuG ö^niGmpjniGp, np uipmuihujjmi]iuii P2SÍ1 qliGbuiJili'ailiiuti GjmpJi puiqiíiuujiuuiIjúuiG óbip}t puiqúuiqtuGnipjuítfp, GpiuGi lupimuhuijiniliu&mpjuiG uium}i6iuGni¡, ljiu]ui|iuü pjgiujfiG hiuiîuiljuipqji [иш[иии1ш ¡unpnipjniG}ig hi фпрйшршрш^шС ¿ршфйшЩ! ujmipjtiiGJig, JiGíujhu Giuhi p?b2Gbp¡ ц^ффЬрЬБдйшб ni iSuniGiuqJunbg-tfuiG шшррЬр nirjjiüUiifi umuiguigöuiG püipuGinljnipjLiitíp, n твдфи^ t tltpuJljmGqSSujG ujpngbuGtpfi uiptuquigiîujGp:

íiuiguihuijun}t¡L t GuifuüuiljuiG tpjimpnfiii pjtiîObpfi ^ффЬрЬйдйшй uinuiijbi Ijjifiiuï âbi, puiG hiujuiGfi hp ií|iG¿ uijrfiS, np iqmjiîmGiu^npiJ1'1^ t 'Vbtb-Ji hJiujbpcbuj'JiljujgJmjmJ t Giquiuuimi! t jmpmhiuuinili uujjim uiljnig GUpj! uipuiq IjnimmljiîuiCp:

Snyg t uipijuii, np uiji} p2li2Ûbpnii$, hbuiuJimbquijliC ifmt[mií uipqLpSuiG hbt qmqpGpiug, шЬц!» t niGbGniú tpuuipujppnünunüuijJiG '1-Ы<>-{1 uJiOpbq ni Цттш^тй, п inljuiiliqiugilmö t iuUgbunpiuj|iG tinp[iqGUpnuî, hi jiGjß l[nptiiimg{ímj¡i i5U? t qmüi}niú iuj; P2|ijfibprmi lîbà puiGmljiiipjmiîp hhiSnqpipJiGli ípnmuilpíutG hbin:

ЧЬр^шцЬи uiiqiagnigiihi t, np ЧЪГ<>-[1 h}iujbpntu[iJiliuig(iiuû hiuGiiliumGnii t pïgji b шйрт^ш^шй iqnmuuwgjiiujti qbGbm}iliiul{uiG hiuiîiuliwpqt hni-uiuijuiipjmG ршрйршдйш iqnilibuiniujlifi iíb[umG[iqú GpuiCg цшрпцк)^ 1иш1шпйшС цЬцртй hi ípuuiphdui uiuijiîuiGGbpntiî:

«