Разработка и применение методов молекулярной биологии для выявления возбудителей бактериальных респираторных инфекций крупного рогатого скота

Шибаев, Михаил Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Разработка и применение методов молекулярной биологии для выявления возбудителей бактериальных респираторных инфекций крупного рогатого скота
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение методов молекулярной биологии для выявления возбудителей бактериальных респираторных инфекций крупного рогатого скота"

На правах рукописи 004605106

ШИБАЕВ Михаил Александрович

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ИНФЕКЦИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 7 ИЮН 2010

ВЛАДИМИР - 2010

004605106

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»)

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор

МИЩЕНКО Владимир Александрович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

РУСАЛЕЕВ Владимир Сергеевич ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир

доктор ветеринарных наук, профессор СУББОТИН Владимир Викторович ГНУ «Всероссийский научно -исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» (ГНУ «ВИЭВ»), г. Москва

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский

институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГНУ ВНИИВВиМ), г. Покров Владимирской области

Защита состоится «15» июня 2010 г. в 14м часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГУ «ВНИИЗЖ».

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и на сайте: ЬКр/Ллллм.агпаЬ.ги.

Автореферат разослан « ^^ » ^■СОиЯ^ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент

А.П. Пономарёв

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В условиях новых технологий ведения животноводства существенное влияние на эпизоотическую ситуацию оказывают смешанные инфекции респираторного тракта КРС. По широте распространения и смертности респираторные болезни телят превалируют над всеми остальными заболеваниями молодняка [О. Гамелин, 2002; В.А. Мищенко, 2003; G.D. Snowder, 2006].

Массовые респираторные болезни молодняка КРС являются комплексными многофакторными синдромами, возникающими на фоне взаимодействия различных инфекционных агентов, изменения иммунного статуса, физических и экологических факторов [В.П. Урбан, 1984; P.M. Cusack, 2003; S.W. Martin, 1981]. Основная роль в развитии смешанных респираторных инфекций телят принадлежит вирусам (парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, коронавирусу, респираторно-синцитиальной инфекции и др.) и бактериям (пренеде всего Pasteurella multocida (P. multocida), Mannheimia haemolytica (M. haemolytica), а также Chlamydophila pecorum (Chi. pecorum) и Mycoplasma bovis (M. bovis) [B.H. Сюрин, 1998; А.Н. Куриленко, 2005; D.F. Twomey, 2006; T. Autioa, 2007; J.A. Rice, 2007].

Сходство в течении заболевания, вызванного различными возбудителями, обуславливает необходимость применения методов лабораторной диагностики данных инфекций. Разработанные ранее методы прямой и ретроспективной диагностики заболеваний, вызываемых М. haemolytica, P. multocida, Chi. pecorum и M. bovis не всегда позволяют надёжно идентифицировать инфекционные агенты. Таким образом, представляется актуальным усовершенствование методов выявления вышеуказанных микроорганизмов, основанных на применении методов молекулярной биологии, что приобретает особую важность в связи изменениями классификации М. haemolytica и Chi. pecorum [K.D.E. Everett, 1999; О. Angen, 1999]. Кроме того, исследования, направленные на уточнение распространённости названных возбудителей на территории РФ, будут способствовать успешному проведению противоэпизоотических и профилактических мероприятий.

Выяснение этиологической структуры респираторных заболеваний молодняка КРС и оценка вклада отдельных возбудителей невозможна без применения методов аналитической эпизоотологии [С.А. Дудников, 2004; M. Thrusfield, 1995].

Цепь и задачи исследования. Цель исследований заключалась в разработке методов выявления генома P. multocida, M. haemolytica, Chi. pecorum и M. bovis методом ПЦР и нукпеотидного секвенирования и оценке с их помощью превалентности данных возбудителей в популяции телят 0,5 - 7,0 месячного возраста в хозяйствах ЦФО РФ. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- разработать метод выявления генома Р. multocida и М. haemolytica на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования;

- разработать метод выявления генома Chi. ресогит на основе ПЦР;

- разработать метод для выявления генома М. bovis на основе ПЦР;

- с использованием разработанных методов оценить превалентность Р. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит и М. bovis в популяции телят 0,5 - 7,0 месячного возраста в хозяйствах ЦФО РФ;

- оценить связь выявления Р. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит и М. bovis с респираторной патологией телят, используя метод факторного анализа по Ротману [K.J. Rothman, 1976].

Научная новизна исследования. С помощью метода мультиплексной ПЦР и секвенирования разработан способ идентификации геномов М. haemolytica и Р. multocida с последующей их дифференциацией в соответствии с современной таксономией Pasteurellaceae.

Сконструированы системы праймеров и разработаны методы идентификации Chi. ресогит и М. bovis на основе метода ПЦР.

Определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов sodA и IktD изолятов М. haemolytica, выявленных в пробах патологического материала на территории РФ в течение 2006-2009 гг.

Впервые в популяции КРС в хозяйствах РФ выявлена циркуляция Chi. ресогит. Определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена отрА изолятов Chi. ресогит, выявленных в пробах патологического материала от КРС на территории РФ в течение 2006-2009 гг. Изучены вероятные филогенетические отношения между изолятами, выявленными на территории РФ, и изолятами Chi. ресогит, имеющимися в базе данных GenBank.

Впервые определены показатели стадной и индивидуальной превалентности Р. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит и М. bovis на репрезентативной выборке КРС в возрасте 0,5 - 7,0 месяцев в хозяйствах ЦФО РФ.

Впервые с использованием факторного анализа и общей модели факторного взаимодействия установлена достоверность различий в частоте выявления Р. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит и М. bovis у здоровых телят и телят с респираторной патологией в хозяйствах РФ.

Практическая значимость исследования. В результате проведённых исследований разработаны:

- «Методические рекомендации по нуклеотидному секвенированию генома бактерий рода Mannheimia с целью определения их видовой принадлежности». Данная методика позволяет выявлять и дифференцировать М. haemolytica и Р. multocida в патологических и культуральных бактериосодержащих материалах (2007 г.).

- «Методические рекомендации по индикации генома Chlamydophila ресогит методом полимеразной цепной реакции» (2009 г.).

- «Методические рекомендации по индикации генома Mycoplasma bovis методом полимеразной цепной реакции» (2009 г.).

Данные методические рекомендации прошли комиссионные испытания, рассмотрены и одобрены учёным советом, утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ» и рекомендованы для использования в лабораториях при проведении диагностических исследований.

Результаты изучения превалентности и оценки связи выявления P. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит и М. bovis с респираторной патологией в изучаемой популяции КРС с использованием факторного анализа и общей модели факторного взаимодействия имеют как теоретическую, так и практическую значимость, поскольку дают возможность расширить знания о роли изучаемых возбудителей в респираторной патологии молодняка КРС, и в дальнейшем могут быть использованы при разработке комплекса научно-обоснованных мер борьбы и профилактики смешанных респираторных инфекций КРС.

Основные положения, выносимые на защиту:

- метод идентификации и дифференциации М. haemolytica и P. multocida методом мультиплексной ПЦР и нуклеотидного секвенирования;

- метод выявления генома Chi. ресогит на основе амплификации фрагмента гена отрА\

- метод выявления генома М. bovis на основе амплификации фрагмента гена uvrC\ -результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена отрА изолятов Chi. ресогит, выявленных в РФ в 2006-2009 гг.; -результаты исследования по оценке превалентности P. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит и М. bovis в популяции телят 0,5 - 7,0 месячного возраста в ЦФО РФ; -результаты факторного анализа по Ротману и анализа общей модели факторного взаимодействия P. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит, М. bovis и их ассоциаций у телят с респираторной патологией в хозяйствах ЦФО РФ.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Нуклеотидное секвенирование осуществлялось сотрудниками лаборатории диагностики вирусных болезней птиц ФГУ «ВНИИЗЖ». Исследования по диссертационной работе выполнены в 2006-2009 гг. в ФГУ «ВНИИЗЖ».

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах научных конференций: «Диагностика профилактика и лечение болезней животных» (г. Новосибирск, 2008 г.), «Достижения молодых учёных в ветеринарную практику», посвящённая 50-летию создания ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2008 г.), «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» посвященная 70-летию со дня рождения члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. (г. Покров, 2009 г.), а также на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2006- 2010 гг.

Публикация научных исследований. По теме научных исследований опубликовано 5 научных работ в журналах и материалах научных конференций, три из них - в журнале «Ветеринарная патология», рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 165 страницах компьютерного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 262 источника, в том числе 222 зарубежных. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 22 таблицами.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы

Биологические материалы. Перечень и характеристики контрольных штаммов и изолятов микроорганизмов, использованных в работе, приведён в табл. 1.

Таблица 1

Характеристика контрольных штаммов и изолятов микроорганизмов

Na Вид Штамм/изолят Материал Источник

1 M. haemotytica ATCC Na 29698 Частично очищенная и инактивированная клеточная суспензия Американская коллекция типовых культур (АТСС)

2 M. haemotytica АТСС № 29696

3 P. multocida subsp. multocida ATCC № 15742

4 P. multocida серовариант A: 1 № 11039 лаборатория микробиологии кормов и продуктов питания ФГУ «ВНИИЗЖ»

5 P. multocida серовариант B:6 №656

6 P. multocida серовариант D:3 № 9

7 Chi. pecorum calf/Yaroslavl/2/2006 получены в ходе собственных исследований

6 Chi. pecorum calf/N.Novgorod/1/206

9 Chi. pecorum calf/lrfcutsk/1/2007

10 M. bovis M9404 лаборатория диагностики вирусных болезней птиц ФГУ «ВНИИЗЖ»

Химические реагенты. В работе использованы химические реактивы производства "Promega" (США), "Sigma" (США), "Serva" (Германия), "Esso" (Франция), а также отечественные реактивы марки о.с.ч.

2.2. Методы

Выделение суммарной ДНК. Суммарную ДНК из культуральной бактериосодержащей суспензии и патологического материала от животных выделяли с помощью набора реагентов для выделения ДНК, в соответствии с инструкцией производителя (ООО «Компания Биоком», г. Москва).

Мультиплексную ПЦР для индикации и дифференциации серогрупп А, В, D, Е и F P. multocida выполняли согласно протоколу изложенному в Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals [Paris: OIE, 2008].

Очистку продуктов ПЦР проводили с помощью набора реактивов «Wizard® PCR Preps DNA Purification System» (Promega) согласно методике производителя.

Секвенирование продуктов ПЦР осуществлялось на автоматическом секвенаторе «ABI Prism 3100» (Applied Biosystems, США).

Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот проводили с помощью пакета программ BioEdit версия 7.0.5.2, 2005. Выбор праймеров осуществляли с помощью программы OLIGO версия 4.0, а филогенетический анализ - с помощью алгоритма NJ в реализации пакета MEGA версия 4.0.

Формирование выборки. Для изучения широты распространения М. haemolytica, Р. multocida, Chi. ресогит и М. bovis в популяции КРС был проведён отбор проб мазков из носа у телят. Определение требуемого объёма выборки осуществляли, исходя из 95% уровня достоверности и 10% превалентности [Cannon & Roe 1982] M.haemolytica, P.multocida, Chl.pecorum и M.bovis в популяции КРС ЦФО.

Методы анализа данных. Обработка данных, полученных в ходе инструментального учёта результатов применённых тестов проводилась с использованием программного обеспечения STATISTICA 6,0 (StatSoft, Inc, 2001).

С применением эпизоотологических аналитических методов вероятностного расчёта, использующих матрицу 2x2, были оценены эпидемические критерии ассоциации результатов диагностического теста (ПЦР) и клинических признаков поражения респираторного тракта в обследуемых хозяйствах по показателям: хи -квадрат (х2) и соотношение шансов (OR) [С.А. Дудников, 2004]. Для количественной и качественной оценки ассоциативной инфекции респираторного тракта молодняка КРС использовали факторный анализ по Ротману с последующим построением общей модели факторного взаимодействия в форме диаграмм Венна.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка метода идентификации и дифференциации геномов М. haemolytica и P. multocida с помощью ПЦР и нуклеотидного секвенирования

Одной из преград при разработке ПЦР для выявления М. haemolytica является

сложность её дифференцирования от других видов рода Mannheimia, нукпеотидные последовательности генов которых обладают высокой степенью сходства с аналогичными генами М. haemolytica. Анализ нукпеотидных последовательностей генов оперона IktCABD показал, что ген IktC является высоко консервативным у всех представителей рода Mannheimia, что позволило использовать его для выбора родо-специфических праймеров. В результате сконструированы праймеры TOX-F1 и ТОХ-R1, фланкирующие фрагмент гена IktC (табл. 2).

Таблица 2

Праймеры для амплификации и секвенирования фрагментов генов IktC, sodA и

IktD М. haemolytica и амплификации гена КМТ1 P. multocida

Название праймера Первичная структура праймера Ген

ТОХ F-1 5'-TGATTCCTGCAATTGAAAATGAACAATATA-3' IktC

TOX R-1 5'-GCCGTTTCTTCTTACATTTTAGCCCA-3'

SODA-F 5'-TTCGATGCTAAAACAATGGAAATCC-3' sodA

SODA-R 5'-AAGACTAAAATCGGATAGCCTGAAACG-3'

LKTD-F 5'-TTTAAAGATTCATCGGAAGAAGATCGA-3' IktD

LKTD-R 5'-CGTTCACCGGTTTTGATTTCAGC-3'

PM-SV-F 5-AATTGAG111TATGCCACTTGAAATGG-3' KMT1

PM-SV-R 5'-TGGCCATAAGAAACGTAACTCAACAT-3'

Тем не менее, ген 1МС не несет генетической информации о видовых отличиях представителей рода МаппЬеша.

Для дифференциации М. Ьаето1уНса от наиболее генетически близкого к нему вида - М. д!исо$Ша были сконструированы специфичные для рода МаппЬеЫа праймеры ИСГО-Я и иСПЗ^, фланкирующие фрагмент гена /МО (табл. 2).

Для дифференциации М. haemolytica и М. glucosida от других представителей рода Mannheimia, был выбран ген sodA. В результате были сконструированы праймеры - SODA-F и SODA-R, также специфичные для рода Mannheimia (табл. 2).

Для специфической индикации генома P. multocida был выбран ген КМТ1 -уникальный для данного вида. В результате нами была сконструирована пара праймеров (PM-SV-F и PM-SV-R), которые были использованы в ПЦР (табл. 2).

Для оптимизации метода были использованы референтные штаммы М. haemolytica и P. multocida (табл. 1). В оптимизированном варианте схему анализа можно представить следующим образом:

Этап 1: постановка ПЦР с праймерами ТОХ F-1/TOX R-1 и PM-SV-F/PM-SV-R в варианте мультиплекс для выявления и дифференциации геномов микроорганизмов рода Mannheimia и вида P. multocida. При проведении ПЦР амплифицируются фрагменты ДНК генов IktC и КМТ1, размер которых составляет 202 п. н. для микроорганизмов рода Mannheimia и 272 п. н. - P. multocida (рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР для выявления геномов P. multocida и микроорганизмов рода Mannheimia.

Обозначения дорожек: М - маркер молекулярных весов ДНК pUS Mix Marker, 8 (стрелками обозначены длины фрагментов п.н.); 1- вода (отрицательный контроль ПЦР): 2 - проба содержащая М. haemolytica и P. multocida одновременно; 3 - P. multocida, 4 - М. haemolytica.

Этап 2: при наличии на первом этапе положительной реакции на род Mannheimia проводят ПЦР (с использованием выделенной ДНК) и секвенирование продуктов с праймерами на ген sodA для дифференциации М. haemolytica и М. glucosida от других представителей рода. Размер продуктов амплификации в этой реакции составляет 446 п. н. (рис. 2).

Этап 3: если первичная структура ампликона указывает на наличие в исследуемом материале М. haemolytica или М. glucosida, проводят еще одну ПЦР и секвенирование продуктов с праймерами на ген IktD для дифференциации М. haemolytica и М. glucosida. Продукты амплификации имели длину 848 п. н. (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагментов генов IktC, sodA и IktD М. haemolytica.

Обозначения: М - маркер молекулярных весов ДНК pUS Mix Marker, 8 (стрелками обозначены длины фрагментов п. н.); 1 - вода (отрицательный контроль ПЦР): 2- продукт ПЦР гена IktD 3- продукт ПЦР гена sodA; 4- продукт ПЦР гена iktC\

Для подтверждения специфичности разработанного нами метода его проверили на биологических материалах содержащих как М. haemolytica и

P. multocida, так и гетерологичные микроорганизмы (Ornithobacterium rhinotracheale, Actinobacillus pleuropneumonias, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, M. bovis, Acholeplasma granularum, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Chi. pecorum и др.). При этом во всех образцах, содержащих M.haemolytica, выявляли геном данного микроорганизма, а в образцах содержащих P.multocida -геном этой бактерии. Неспецифической реакции не наблюдали, что подтвердило специфичность метода. При определении аналитической чувствительности метода установлено, что разработанный метод способен выявлять М. haemolytica в концентрации 102 КОЕ/мл, а P. multocida - 101 КОЕ/мл.

С использованием разработанного метода в 2007 - 2009 гг. были проведены исследования 2081 пробы патологического материала от КРС, поступившего из 42 регионов РФ. Геном М. haemolytica выявлен в 132 пробах.

В результате проведённого филогенетического анализа фрагмента гена sodA у представленных в GenBank и выявленных в настоящем исследовании штаммов и изолятов М. haemolytica установлено, что их генетическая гомология составила 99,8100%. Филогенетический анализ по гену IktD выявил, что нуклеотидные последовательности почти всех исследованных штаммов и изолятов М. haemolytica идентичны как между собой, так и с представленными в GenBank.

3.2. Разработка метода индикации генома Chi. pecorum с использованием ПЦР

Проведённый анализ данных о нуклеотидных последовательностях генов всех

видов семейства Chlamydiaceae, депонированных в базе данных GenBank показал, что ген отрА содержит наибольшее количество информации о видовых и типовых отличиях отличиях хламидий. В результате было сконструировано два специфичных для Chi. pecorum праймера PECF-2: 5 '- GCAATCTAAACCTCGCGTTCAAGAA-3' и PECR-4: 5' - TCAAGTAAAGTTGCTCCCAT(A/G)GAAA -3' фланкирующих III и IV вариабельные домены гена отрА. При оптимизации метода были использованы полевые изоляты Chi pecorum, ранее нами охарактеризованные по гену 16S rRNA согласно схеме Everett с соавт. (1999) (табл. 1).

При проведении ПЦР амплифицируется фрагмент гена отрА Chi. pecorum, размер которого составляет 461 п. н. (рис. 3).

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента гена отрА Chi. pecorum.

Обозначения дорожек: М - маркер молекулярных весов ДНК pUS Mix Marker, 8 (стрелками обозначены длины фрагментов п.н.); 1 - вода (отрицательный контроль ПЦР); 2, 3, 4. 5 -изоляты Chi.pecorum: calf/Yaroslavl/2/2006, calf/N.Novgorod/1/2006, calf/lrkutsk/1/2007 и calf/S.Petersburg/1/2007, соответственно.

Для подтверждения специфичности разработанного метода исследовали

биологические материалы, содержащие как Chi. pecorum (табл. 1), так и

гетерологичные микроорганизмы (Chlamydia abortus, Chlamydophila psittaci, M. bovis, Acholeplasma laidlawii, M. haemolytica, P. multocida, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Campylobacter jejuni, и др.). Во всех образцах биологического материала содержащих геном Chi. ресогит выявляли его присутствие. В то время как в пробах содержащих гетерологичные микроорганизмы, геном Chi. ресогит не выявляли. Для всех полученных ампликонов определили первичную структуру и проанализировали с помощью программы BLAST. При этом неспецифической реакции не наблюдали, что подтвердило специфичность метода.

С использованием разработанного метода в 2006-2009 гг. нами были проведены исследования 945 проб патологического материала от КРС из различных регионов РФ. Из них геном Chi. ресогит выявили в 87 образцах.

Для 55 выявленных изолятов были определены нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные последовательности фрагмента гена отрА. Проведённый филогенетический анализ показал, что популяция Chi. ресогит в РФ, характеризуется высокой генетической гетерогенностью. Уровень сходства между изолятами составил от 69 до 100 % по нуклеотидным и от 71 до 100% по аминокислотным последовательностям. При этом, некоторые изоляты, выявленные в РФ, показали 100%-ую генетическую гомологию с изолятами, выявленными в Германии, Великобритании, США, Австрии и Франции в 1989-1993 гг. (рис. 4).

Рис. 4. Дендрограмма: положение изолятов, выявленных в РФ по отношению к изолятам Chi. ресогит последовательности которых опубликованы в GenBank.

группа штаммов и изолятов имеющих идентичные нуклеотидные последовательности.

Данные факты, возможно, являются следствием импорта КРС, а также указывает на то, что они, вероятно, относительно медленно эволюционировали в

сходных условиях. Также, не менее важным и эпизоотически значимым результатом нашего исследования было то, что в большинстве хозяйств (83 %) регистрировали одновременное присутствие нескольких различных генетических форм Chi. ресогит.

Представляют интерес изоляты calf/Moskow/1 b/2008 и calf/Moskow/2a/2008, выявленные от телят с патологией респираторного тракта. Данные изоляты идентичны изоляту L71 Chi. ресогит выделенному от дикого кабана с признаками полиартрита в Австрии и изолятам выделенным из фекалий коз во Франции. Данные факты, могут свидетельствовать об отсутствии специфичности для хозяина, межвидового барьера и строгого тканевого тропизма при инфекции Chi. ресогит.

3.3. Разработка метода индикации генома М. bovis с использованием ПЦР

В результате проведённого анализа известных данных о нуклеотидных последовательностях генома М. bovis и других видов семейства Mycoplasmataceae, установлено, что ген uvrC высоко консервативен для М. bovis и обладает достаточной дискриминирующей способностью между видами микоплазм. В результате была сконструирована пара специфических праймеров MBUVRC-F: 5'-TAGACAAAGCTAGTAATATGCTTGATTCCT-3' и UVRC-R1 5'-CAATAACAGGGATGTTTATATTAAGCGT-3' фланкирующих фрагмент гена uvrC М. bovis. Для оптимизации разрабатываемого метода был использован штамм М 9404 М. bovis (табл. 1). При проведении ПЦР амплифицируется фрагмент гена uvrC М. bovis, размером 351 п. н. (рис. 5).

-404 331

Рис.5. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента гена uvrC М. bovis.

Обозначения дорожек: М - маркер молекулярных весов ДНК pUS Mix Marker, 8 (стрелками обозначены длины фрагментов п.н.); №1 - вода (отрицательный контроль ПЦР): 2 - М bovis штамм М9412; 3, 4 - полевые изоляты М. bovis.

Для подтверждения специфичности разработанного метода его проверили на биологическом материале, содержащем как М. bovis (табл. 1), так и гетерологичные микроорганизмы (Mycoplasma mycoides subsp. mycoides, Mycoplasma mycoides subsp. capri, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma iowae, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma meleagridis, Mycoplasma gallinarum, Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominis, Acholeplasma laidlawii, Acholeplasma granularum, M. haemolytica, P. multocida, Escherichia coli, Chi. ресогит и др.). При этом геном М. bovis выявляли только в образцах содержащих М. bovis, секвенирование ампликонов подтвердило высокую специфичность метода.

Определили относительную аналитическую чувствительность. В качестве альтернативного был выбран метод идентификации М. bovis с помощью ПЦР разработанный Subramaniam с соавт. (1998). Установлено что, аналитическая

чувствительность разработанного нами метода в 1000 раз выше таковой у метода, предложенного Subramaniam с соавт. (1998).

С использованием разработанного метода в 2008 - 2009 гг. были проведены исследования 574 проб различного патологического материала от КРС из 25 регионов РФ, из них геном М. bovis выявили в 35 образцах.

Для 20 случаев выявления генома М. bovis в патологическом материале от КРС была определена первичная структура амплифицированного в ПЦР фрагмента гена uvrC. Проведённый филогенетический анализ показал 100% генетическую гомологию нукпеотидных последовательностей изолятов, выявленных в настоящем исследовании, с опубликованными последовательностями.

3.4. Индивидуальная и стадная превалентность М. haemotytica, P. multocida, Chi. pecorum и М. bovis в популяции КРС ЦФО РФ

Для изучения превалентности М. haemotytica, P. multocida, Chi. pecorum и

М. bovis в популяции КРС в возрасте 0,5 - 7,0 месяцев ЦФО РФ было проведено выборочное исследование. В выборку вошли 13 животноводческих хозяйств (N=13) семи областей ЦФО (Московская, Владимирская, Тамбовская, Брянская, Белгородская, Тверская, Костромская). Образцы мазков отбирались из носовой полости телят с клиническими признаками поражения респираторного тракта на момент отбора проб (ni= 15), и у животных без соответствующих признаков (п2=15) из каждого обследуемого хозяйства (N=13). В результате отобрано и исследовано с использованием разработанных тест - систем 390 проб на наличие генома М. haemolytica, Р. multocida, Chi. pecorum и М. bovis, (табл. 3).

Таблица 3

Превалентность изучаемых микроорганизмов в популяции КРС ЦФО РФ

№ Хозяй ства Область ЦФО Число отобранных проб Количество положительных проб по результатам ПЦР

P. muftocida' М. haemolytica Cht. pecorum М. bovis

1 Белгородская 30 27 10 6 0

2 30 19 11 7 6

3 Брянская 30 27 0 4 0

4 30 18 0 5 0

5 Владимирская 30 26 18 5 0

6 30 29 6 8 0

7 Костромская 30 13 6 16 0

8 30 16 4 5 0

9 Московская 30 8 4 8 0

10 30 11 2 7 0

11 Тверская 30 10 9 0 2

12 30 20 8 6 4

13 Тамбовская 30 17 13 4 2

Исследованных проб/ иг иих положительно 390 390/241 390/91 390/81 390/14

Индивидуальная превалентность,% 61,8 23,33 22,7 3,59

Обследованных хозяйств/ из них положительно 13/13 13/11 13/12 13/4

Стадная превалентность, % 100 64,61 92,3 30,8

Примечание: Все изоляты P. multocida, выявленные в настоящем исследовании, относятся к серогруппе А. Ни одной пробы, содержащей представителей серогрупп В, D, Е или F, нами не выявлено (мнимая превалентность исследования <10 %).

Таким образом, из представленных в табл. 8 данных можно заключить что из числа изучаемых микроорганизмов в исследуемой популяции КРС ЦФО РФ

наиболее широкое распространение имеет Р. multocida серовариант А (показатель стадной превалентности 100%, при 61,1% индивидуальной превалентности). Для M.haemolytica и Chl.pecorum так же были получены достаточно высокие значения как стадной (84,61% и 92,3%, соответственно) так и индивидуальной (23,33% и 22,7%) превалентности. В то же время, лишь в 30% хозяйств выборки была выявлена М. bovis, а индивидуальная превалентность при этом составила всего 3,59%.

3.5. Модель факторного взаимодействия Р. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит и М. bovis

Оценка взаимосвязи клинических проявлений заболевания и

инфицирования телят Р. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит, и М. bovis. По

результатам выявления четырёх вышеуказанных возбудителей у телят с учётом клинических проявлений заболевания становится возможным построение матрицы 2X2 для двух дихотомических признаков: заболевание и позитивность (выявление одного и/или более возбудителей по которым вели исследование) (табл. 4).

Таблица 4

Матрица 2X2 двух дихотомических признаков: заболевание и

инфицированность

Признаки Заболевание Всего:

+ -

Позктивностъ ♦ 155 133 » 288

40 62 " 102

Всего: 195 195 390

Как видно из табл. 4, группа телят с респираторной патологией достоверно отличается по числу животных, от которых были выделены интересующие нас возбудители, от группы условно здоровых телят (х2= 5,85, Х2(1.оэ5) = 3,84, Р = 98,5%).

В результате можно заключить, что в популяции телят (N = 390) имеет место широкая циркуляция М. haemolytica, Р. multocida, Chi. ресогит и М. bovis и их ассоциаций - 73,9%. Среди телят с клиническими признаками респираторного заболевания (N=195) циркуляция вышеуказанных возбудителей достоверно выше -79,5% (76,7 - 82,4%); среди условно здоровых телят (N=195) имеет место массовое носительство указанных возбудителей - 68,2% (64,9-71,5). Соотношение шансов выявления возбудителя в группе с респираторными поражениями - 1,81, что свидетельствует о практически двукратном превышении шансов обнаружения интересующих нас возбудителей у клинически больных телят.

Факторные взаимодействия в группе животных позитивных по оцениваемым инфектантам(M.haemolytica, Р.multocida, Chl.pecorum и M.bovis). В основу нашего анализа положена концепция K.J. Rothman оценки

мультифакторного взаимодействия причинных переменных, чтобы выявить

определяющие факторы и/или их ассоциации (табл. 5).

По результатам комбинаторики получили 15 групп: 4 - воздействие первичных базовых факторов (Р. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит, М. bovis), 6 - парных взаимодействий, 4 - тройных, и 1 взаимодействие всех четырёх первичных

факторов. Абсолютно не значимыми оказалось два взаимодействия: один вторичный (С/7/, ресогит и М. bovis) и один третичный (Chi. ресогит, М. bovis и М. haemolytica).

Таблица 5

Модель: базовые факторы и их взаимодействия_

Возбудители Первичные/базовые факторы (п,3 4)

Р. muttodda (P.m.) M. haemolytica (M.h.) Chi ресогит (Chi.р.) M. bovis (Mb.)

Позитивные 137 21 13 3

Из них больные 63 12 7 2

% от позитивных 47,57% 7,29% 4,51% 1,04%

% от заболевших 32,31% 6,15% 3,59% 1,03%

Парные взаимодействия (па= 6)

P.mJM.h. P.mJChl.p. P.m./M.b. Chl-p/M.h M.b./M.h. Chl.p./M.b.

Позитивные 37 41 2 6 4 0

Из них больные 20 22 2 5 4 0

% от позитивных 12,85% 14,24% 0,69% 2,08% 1,39% 0,00%

% от заболевших 10,26% 11,28% 1,03% 2,56% 2,05% 0,00%

Тройные взаимодействия {п.- 4)

P.mJM.h./Chl.p. P.mJM.hJM.b. P.mJM.bJChl.p. M.h./Chl.p./M.b.

Позитивные 19 3 1 0

Из них больные 15 2 1 0

% от позитивных 6,60% 1,04% 0,35% 0,00%

% от заболевших 7,69% 1,03% 0,51% 0,00%

Четвертичное взаимодействие (п4> 1)

P.mJM.hJM.b./Chl.p.

Позитивные 1

Из них больные О

% от позитивных 0.35%

% от заболевших 0,00%

Далее, используя данные табл. 5, анализировали вклад факторов/ассоциаций в инфицирование телят. В результате ранжирования по 288 головам выявленных инфицированных животных - определяющими являются четыре фактора (Р. multocida, М. haemolytica, Р. multocida и Chl.pecorum, P.multocida и M.haemolytica), именно они обеспечивают более 80% эффекта, остальные факторы и их ассоциации малозначимы - их вклад в общий эффект менее 20%. При этом, 60,4% всех случаев инфицирования обусловлен моноинфекциями (Р. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит, М. bovis) и лишь 39,6% может быть атрибутировано полиинфекциями. Самый значительный вклад обусловлен моноинфекцией Р. multocida (47,6%).

Количественная оценка вклада факторов и взаимодействий в заболеваемость в группе клинически больных животных. Используя данные, приведённые в табл. 5, проведено ранжирование вклада факторов/ассоциаций в клинически выявляемые признаки респираторных расстройств у телят. В результате выявили, что изученные нами возбудители/ассоциации способны объяснять только 79,5% эффекта - возникновение респираторных расстройств у телят. Более 20% случаев заболевания не находят объяснения в рамках изучаемых возбудителей, что заставляет говорить о неизвестных составляющих заболевания.

Построение общей модели респираторной патологии телят. Провели расчёт вклада факторов (возбудителей) (табл. 5), суммируя значения для каждого фактора и его взаимодействий в зоне основного эффекта (79,5%) с последующим преобразованием параметров в проценты. Получены следующие результаты: Р. multocida - 51,2%; М. haemolytica - 23,8%; Chi. ресогит - 20,5%; М. bovis - 4,5%. (рис. 6).

Рис. 6. Диаграмма Венна: респираторные расстройства у телят (п=195) и частота выявления изучаемых инфекционных агентов.

Как представлено на рис. 6, основными факторами (из числа изучаемых) в

респираторной патологии популяции КРС в возрасте 0,5 - 7,0 месяцев ЦФО РФ

являются Р. multocida и её ассоциация с Chi. ресогит и М. haemolytica. Роль М. bovis

и других ассоциаций существенно ниже.

4. Выводы

1. Разработан метод идентификации и дифференциации геномов М. haemolytica и Р. multocida в биологических материалах методом мультиплексной ПЦР и нуклеотидного секвенирования, который способен выявлять М. haemolytica и Р. multocida в концентрациях 102 и 101 КОЕ/мл, соответственно.

2. Разработан метод идентификации генома Chi. ресогит в биологических материалах от животных на основе ПЦР.

3. Разработан метод идентификации генома М. bovis в биологических материалах от животных на основе ПЦР.

4. Впервые выявлена циркуляция Chi. ресогит в популяции КРС на территории РФ. Установлено, что популяция Chi. ресогит характеризуется высокой генетической гетерогенностью, уровень сходства между изолятами составил 69-100% по нуклеотидным и 71-100% по аминокислотным последовательностям гена отрА.

5. Установлено, что стадная превалентность Р. multocida серогруппа А, М. haemolytica и Chi. ресогит в популяции КРС в возрасте 0,5 - 7,0 месяцев ЦФО РФ составила 100%, 84,61% и 91,1% соответственно, при показателях индивидуальной превалентности 61,1%, 23,3% и 22,7% соответственно. М. bovis выявлена у телят 30% хозяйств ЦФО РФ, при показателе индивидуальной превалентности 3,59%.

6. Установлено, что 60,4% всех случаев инфицирования телят обусловлено моноинфекциями (Р. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит, М. bovis) и 39,6% случаев может быть атрибутировано полиинфекциями. При этом самый значительный вклад в инфицированность обусловлен Р. multocida (47,5%).

7. Установлена достоверность различий в частоте выявления Р. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит и М. bovis у здоровых телят и телят с респираторной патологией.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

- «Методические рекомендации по нуклеотидному секвенированию генома бактерий рода Mannheimia с целью определения их видовой принадлежности». Данная методика позволяет выявлять и дифференцировать М. haemolytica и P. multocida в патологических и культуральных бактериосодержащих материалах (2007 г.).

- «Методические рекомендации по индикации генома Mycoplasma bovis методом полимеразной цепной реакции» (2009 г.).

Результаты изучения превалентности и оценки связи выявления P. multocida, М. haemolytica, Chi. ресогит и М. bovis с респираторной патологией в изучаемой популяции КРС с использованием факторного анализа и общей модели факторного взаимодействия могут быть использованы при разработке комплекса научно-обоснованных мер борьбы и профилактики респираторных инфекций КРС.

6. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Шибаев М.А. Разработка метода выявления Mannheimia haemolytica с помощью полимеразной цепной реакции и нуклеотидного секвенирования II Ветеринарная патология. - 2007. - № 4. - С.95-99.

2. Шибаев М.А., Дудников С.А., Прохватилова Л.Б. Выявление Chlamydophila ресогит с помощью полимеразной цепной реакции: генетическое разнообразие и распространение // Ветеринарная патология. - 2009. - № 3. - С.56-63.

3. Шибаев М.А., Дудников С.А., Прохватилова Л.Б., Выявление Pasteurella multocida у КРС в Центральном федеральном округе: клинико-эпизоотологическая оценка // Ветеринарная патология. - 2009. - № 4. - С.50-56.

4. Разработка метода выявления и видовой дифференциации возбудителей хламидиоза КРС на основе ПЦР / Шибаев М. А., Чупин С. А., Прохватилова Л. Б., Мищенко В. А. II Диагностика, профилактика и лечение болезней животных: Сборник научных Трудов. Россельхозакадемия. Сибирское отделение ИЭВСиДВ. -Новосибирск, 2008. - С. 77-80.

5. Шибаев М.А., Прохватилова Л.Б. Mycoplasma bovis. Индикация и распространённость в хозяйствах Российской Федерации // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: Международная научно-практическая конференция молодых учёных. - Покров, 2009. - С. 182-186.

Подписано в печать 11.05.2010 г. Заказ № 4 Формат 60x90/16. Усл. печ. л.1. Тираж 90 экз. Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Шибаев, Михаил Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Этиопатогенез смешанных респираторных заболеваний молодняка крупного рогатого скота.

1.2. Роль отдельных бактериальных агентов в респираторной патологии молодняка крупного рогатого скота.

1.2.1. Таксономия и структура P. multocida, клинико-эпидемиологические собенности инфекции.

1.2.2. Таксономия и структураM.haemolytica, клинико-эпидемиологические особенности инфекции.

1.2.3. Таксономия и структура Chl.pecorum, клинико-эпидемиологические особенности инфекции.

1.2.4. Таксономия и структура М. bovis, клинико-эпидемиологические особенности инфекции.

1.3. Диагностика смешанных инфекций респираторного тракта молодняка крупного рогатого скота.

1.3.1. Диагностика пастереллёза, вызываемого P.multocida.

1.3.2. Диагностика маннхеймиоза, вызываемого M.haemolytica.

1.3.3. Диагностика хламидиоза, вызываемого Chl.pecorum.

1.3.4. Диагностика микоплазмоза, вызываемого М. bovis.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Разработка и применение методов молекулярной биологии для выявления возбудителей бактериальных респираторных инфекций крупного рогатого скота"

Актуальность темы. В последние годы в РФ стала актуальной проблема интенсивного производства животноводческой продукции и снижения её себестоимости. Решение данного вопроса неразрывно связано со специализацией, концентрацией поголовья и внедрением новых индустриальных технологий в скотоводческих хозяйствах. Однако, изменения технологии содержания существенно изменило среду обитания животных и ограничило многие естественные жизненные потребности, что сказалось на их устойчивости к различным инфекциям. В данных условиях существенное влияние на эпизоотическую ситуацию оказывают, прежде всего, ассоциативные и смешанные инфекции респираторного тракта крупного рогатого скота, обусловленные возбудителями с невысокой вирулентностью, которые занимают основную часть в патологии молодняка, и являются одной из сложных и актуальных проблем ветеринарной науки [3,8,22,23,109].

По широте распространения и летальности респираторные болезни у телят превалируют над всеми остальными заболеваниями молодняка [60,61].

Массовые респираторные заболевания молодняка КРС являются комлексными многофакторными синдромами, возникающими на фоне взаимодействия различных инфекционных агентов, изменения иммунного статуса животных, физических и экологических факторов [32,88,129,240]. Общепризнано, что основная роль в развитии смешанных респираторных инфекций телят принадлежит вирусам (парагриппа-3 КРС, инфекционного ринотрахеита КРС, респираторно-синцитиальной инфекции КРС, вирусной диареи КРС, коронавирусу КРС и др.) и бактериям (прежде всего Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica,), а так же Chlamydophila pecorum и Mycoplasma bovis.[6,14,16,18,20,23,29,32,43,117,124,175,191,218].

Характерным для респираторных инфекций КРС является сходство характеристик эпизоотического процесса, малая специфичность клинических и патологоанатомических признаков заболевания, а также наличие латентной и персистентной формы инфекционного процесса [111]. В таких случаях для точного анализа сложившейся эпизоотической ситуации, выяснения этиологических причин заболевания и успешного проведения противоэпизоотических, профилактических и лечебных мероприятий необходимо применение специфичных методов лабораторной диагностики данных заболеваний. Ранее разработанные методы прямой и ретроспективной диагностики заболеваний, вызываемых M.haemolytica, P.multocida, Chl.pecorum и M.bovis не всегда позволяют надёжно идентифицировать инфекционные агенты. Решение проблемы может быть найдено в использовании методов молекулярной биологии, в частности, полимеразной цепной реакции и нуклеотидного секвенирования. Кроме этого, разработка и применение этих методов для диагностики бактериальных инфекций стало важным в связи с изменениями классификации и таксономического положения M.haemolytica и Chl.pecorum, в основу которых положены принципы и подходы современной геносистематики [122,241].

Таким образом, в соответствии с эпизоотологической важностью и необходимостью усовершенствования методов лабораторной диагностики P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis представляется актуальным разработка молекулярно-биологических методов их идентификации и дифференциации.

Несмотря на то, что P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis широко распространены в стадах КРС многих стран мира, исследования, посвященные изучению распространённости данных возбудителей в РФ до сих пор немногочисленны. Поэтому актуальны исследования, направленные на уточнение распростанённости вышеуказанных возбудителей на территории РФ, путём проведения скрининговых и мониторинговых исследований.

Выяснение этиологической структуры респираторных заболеваний молодняка КРС и количественная оценка вклада отдельных возбудителей невозможна в рамках описательной эпизоотологии, учитывая высокую вероятность участия нескольких болезнетворных агентов, поэтому требует применения методов аналитической эпизоотологии [4,7,12,13,17,40,131,253]. Цель и задачи исследования. Цель исследований заключалась в разработке методов выявления генома P.multocida, М.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis методом ПЦР и нуклеотидного секвенирования и оценке с их помощью превалентности данных возбудителей в популяции телят 0,5 — 7 месячного возраста в хозяйствах ЦФО РФ.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- разработать метод выявления генома P.multocida и M.haemolytica на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования;

- разработать метод выявления генома Chl.pecorum на основе ПЦР;

- разработать метод для выявления генома M.bovis на основе ПЦР;

- с использованием разработанных методов оценить превалентность P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis в популяции телят 0,5 — 7 месячного возраста в хозяйствах ЦФО РФ;

- оценить связь выявления P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis с респираторной патологией телят, используя метод факторного анализа по Ротману [K.J. Rothman, 1976].

Научная новизна исследования. С помощью метода мультиплексной ПЦР и секвенирования разработан способ идентификации геномов M.haemolytica и P.multocida с последующей их дифференциацией в соответствии с современной таксономией Pasteurellaceae.

Сконструированы системы праймеров и разработаны методы идентификации Chl.pecorum и M.bovis на основе метода ПЦР.

Определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов sodA и IktD изолятов M.haemolytica, выявленных в пробах патологического материала на территории РФ в течение 2006-2009гг.

Впервые в популяции КРС в хозяйствах РФ выявлена циркуляция СМ. ресогит. Определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена отрА изолятов Chl.pecorum, выявленных в пробах патологического материала от КРС на территории РФ в течение 2006-2009 гг. Изучены вероятные филогенетические отношения между изолятами, выявленными на территории РФ, и изолятами Chl.pecorum, имеющимися в базе данных GenBank.

Впервые определены показатели стадной и индивидуальной превалентности P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis на репрезентативной выборке КРС в возрасте 0,5 - 7 месяцев в хозяйствах ЦФО РФ.

Впервые с использованием факторного анализа и общей модели факторного взаимодействия установлена достоверность различий в частоте выявления P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis у здоровых телят и телят с респираторной патологией в хозяйствах РФ.

Практическая значимость исследования. В результате проведённых исследований разработаны:

- «Методические рекомендации по нуклеотидному секвенированию генома бактерий рода Mannheimia с целью определения их видовой принадлежности». Данная методика позволяет выявлять и дифференцировать M.haemolytica и P.multocida в патологических и культуральных бактериосодержащих материалах (2007г.).

- «Методические рекомендации по индикации генома Chlamydophila ресогит методом полимеразной цепной реакции» (2009г.).

- «Методические рекомендации по индикации генома Mycoplasma bovis методом полимеразной цепной реакции» (2009г.).

Результаты изучения превалентности и оценки связи выявления P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis с респираторной патологией в изучаемой популяции КРС с использованием факторного I анализа и общей модели факторного взаимодействия имеют как теоретическую, так и практическую значимость, поскольку дают возможность расширить знания о роли изучаемых возбудителей в респираторной патологии молодняка КРС, и в дальнейшем могут быть использованы при разработке комплекса научно-обоснованных мер борьбы и профилактики смешанных респираторных инфекций КРС.

Основные положения, выносимые на защиту:

- метод идентификации и дифференциации M.haemolytica и P.multocida методом мультиплексной ПЦР и нуклеотидного секвенирования;

- метод выявления генома Chl.pecorum на основе амплификации фрагмента гена отрА;

- метод выявления генома М. bovis на основе амплификации фрагмента гена uvrC;

-результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена отрА изолятов Chl.pecorum, выявленных в РФ в 2006-2009гг.;

-результаты исследования по оценке превалентности P.midtocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis в популяции телят 0,5 - 7 месячного возраста в ЦФО РФ;

-результаты факторного анализа по Ротману и анализа общей модели факторного взаимодействия P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum, M.bovis и их ассоциаций у телят с респираторной патологией в хозяйствах ЦФО РФ.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах научных конференций: «Диагностика профилактика и лечение болезней животных» (г. Новосибирск, 2008г.), «Достижения молодых учёных в ветеринарную практику», посвящённая 50-летию создания ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2008г.), «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» посвященная 70-летию со дня рождения члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. (г. Покров, 2009г.), а также на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2006- 2010гг.

Публикация научных исследований. По теме научных исследований опубликовано 5 научных работ в журналах и материалах научных конференций, три из них — в журнале «Ветеринарная патология», рекомендованном ВАК РФ.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Шибаев, Михаил Александрович

4. ВЫВОДЫ

1. Разработан метод идентификации и дифференциации геномов M.haemolytica и P.multocida в биологических материалах методом мультиплексной ПЦР и нуклеотидного секвенирования, который способен выявлять M.haemolytica и P.multocida в концентрациях 10 и 101 КОЕ/мл, соответственно.

2. Разработан метод идентификации генома Chl.pecorum в биологических материалах от животных на основе ПЦР.

3. Разработан метод идентификации генома M.bovis в биологических материалах от животных на основе ПЦР.

4. Впервые выявлена циркуляция Chl.pecorum в популяции КРС на территории РФ. Установлено, что популяция Chl.pecorum характеризуется высокой генетической гетерогенностью, уровень сходства между изолятами составил 69-100% по нуклеотидным и 71-100% по аминокислотным последовательностям гена отрА.

5. Установлено, что стадная превалентность P.multocida серогруппа А, M.haemolytica и Chl.pecorum в популяции КРС в возрасте 0,5 - 7 месяцев ЦФО РФ составила 100%), 84,61% и 91,1% соответственно, при показателях индивидуальной превалентности 61,1%, 23,3% и 22,7% соответственно. M.bovis выявлена у телят 30% хозяйств ЦФО РФ, при показателе индивидуальной превалентности 3,59%.

6. Установлено, что 60,4% всех случаев инфицирования телят обусловлено моноинфекциями {P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum, M.bovis) и 39,6% случаев может быть атрибутировано полиинфекциями. При этом самый значительный вклад в инфицированность обусловлен P.multocida (47,5%).

7. Установлена достоверность различий в частоте выявления P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis у здоровых телят и телят с респираторной патологией.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

- «Методические рекомендации по нуклеотидному секвенированию генома бактерий рода Mannheimia с целью определения их видовой принадлежности». Данная методика позволяет выявлять и дифференцировать M.haemolytica и P.multocida в патологических и культуральных бактериосодержащих материалах (2007г.).

- «Методические рекомендации по индикации генома Chlamydophila pecorum методом полимеразной цепной реакции» (2009г.).

- «Методические рекомендации по индикации генома Mycoplasma bovis методом полимеразной цепной реакции» (2009г.).

Результаты изучения превалентности и оценки связи выявления P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis с респираторной патологией в изучаемой популяции КРС с использованием факторного анализа и общей модели факторного взаимодействия могут быть использованы при разработке комплекса научно-обоснованных мер борьбы и профилактики респираторных инфекций КРС.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Шибаев, Михаил Александрович, Владимир

1. Алиева Б.Н., Ахмедова А.Г., Алиева Н.А. Этиологическая роль хламидий в респираторных заболеваниях телят // Республиканская научная конференция молодых учёных: Тезисы докладов М., 1983. -С. 16-17.

2. Багдонас И.И., Лабутинас А.Б. Изучение экспериментальной пневмонии телят, заражённых возбудителем группы хламидий // Тр. Литовского НИИВ.- Вильнюс, 1976. С. 5-14.

3. Бароян О.В. Эпидемиология: Вчера, сегодня, завтра. М.: Медицина, 1985.-52 с.

4. Беляков В.Д. Эпидемический процесс (теория и метод изучения). -Ленинград: Медицина, 1964. 244 с.

5. Борхсениус С.Н., Чернова О.А., Чернов В.М. Взаимодействие микоплазм с иммунной системой животных и человека // Цитология. -2001. Т. 43, № 3. - С. 219-243.

6. Вирусные болезни животных./ В.Н. С юрин, А.Я. Самуйленк о, Б.В. Соловьёв, Н.Ф. Фомина.- М: ВНИТИБП, 1998. 464с.

7. Власов В.В. Эпидемиология: учебное пособие /2-е изд., испр. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 406 с.

8. Гамелин О. Актуальность инфекционных респираторных заболеваний у крупного рогатого скота // Ветеринар.- 2002. № 6. - С. 9-12.

9. Гафаров Х.З. Выделение вируса из группы пситтакоза-лимфогранулёмы, от телят больных бронхопневмонией // Учёные записки КВИ.- Казань, 1969. № 104 - С. 47.

10. Ю.Геведзе В.И, Соколов С.Г. Методические рекомендации по диагностике пастереллезов сельскохозяйственных животных.— Минск, 1987.— 18с.

11. П.Геведзе В.И., Соколов С.Г. Пастереллез крупного рогатого скота // Современные проблемы профилактики зоонозных болезней и пути их решения. Минск, 1987.-С.145-146.

12. Дудников С.А. Количественная эпизоотология: основы прикладной эпидемиологии и биостатистики. Владимир: Демиург, 2004. - 460 с.

13. Дудников С.А. Эпизоотологическая методология. Отбор проб при эпизоотологических исследованиях (биометрический подход к планированию отбора проб для исследования). Владимир: ОКНИИ и МС, 2002. - 56 с.

14. Инфекционная патология животных: в 2т. Т.2. / под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина. М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - 807 с.

15. Использование полимеразной цепной реакции для определения видов хламидий / И.Л. Обухов, Г.А. Шипулин, К.Н. Груздев, А.Н. Панин // Докл. РАСХН, 1997. № 1.- С. 44-45.

16. Куриленко А.Н., Крупальник B.JI., Пименов Н.В. Бактериальные и вирусные болезни молодняка сельскохозяйственных животных. М.: Колосс, 2005.-296 с.

17. Лисенков А.Н. Математические методы планирования многофакторных медико-биологических экспериментов. М.: Медицина, 1979. - 343 с.

18. Масимов Н.А. Этиологическое и эпизоотологическое значение пастерелл при смешанных респираторных инфекциях крупного рогатого скота: Автореферат диссертации доктора вет. наук. — Покров, 1998. 44с.

19. Методические указания №22-7/82 по лабораторной диагностике пастереллёзов животных и птиц. Министерство сельского хозяйства Российской Федерации (Минсельхоз России): Главветуправление, 1992.

20. Микоплазмы в патологии животных / Г.Ф. Коромыслов, Я. Мессарош, JI. Штипкович и др. М: Агропромиздат., 1987. - 256 с.

21. Митрофанов П.М., Семёнов В.А., Хамадеев Р.Х. Хламидиоз крупного рогатого скота и меры борьбы с ним: методические рекомендации. -Чебоксары, 2001. 54 с.

22. Мищенко В.А. Проблема респираторных смешанных инфекций молодняка КРС // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных. Материалы международной научной конференции, посвящённой 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ».- Владимир, 2003.- С. 73-77.

23. Мозгис В.Я. Диарейные и респираторные заболевания телят, вызываемые условно — патогенными микроорганизмами. Рига: Зинатне, 1993.-176 с.

24. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ. / под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир, 1999. - 558 с.

25. Обухов И.Л. Свойства и цикл развития хламидий. Взаимодействие с клеткой хозяином // Сельскохозяйственная биология. - 1999. - N 4. -С. 12-27.

26. Обухов И.Л., Шипулин Г.А., Груздев К.Н. Молекулярно-генетический подход в диагностике хламидиозов животных и птиц на основе полимеразной цепной реакции // Сельскохозяйственная биология. -1996. -№ 4.-С. 10-18.

27. Саморегуляция паразитарных систем / В.Д. Беляков, Д.Б. Голубев, Г.Д. Каминский, В.В. Тец JL: Медицина, 1987 - 239 с.

28. Селивёрстов В.В. Пастереллёзы животных // Ветеринария. 2003. - № 10.-С. 3-5.

29. Сосницкий А.И., Стегний Б.Т., Апатенко В.М. Пастереллёзные инфекции факторного и классического типа в составе паразитоценоза телят и поросят // Ветеринарный консультант. — 2007. № 13. - С. 1-5.

30. Стрельченя И.И. Изучение определяющей роли серовариантов Pasteurella multocida, выделенных от телят в инфекционной патологии

31. Эпизоотология, иммунология, фармакология и санитария. — 2006. -№ 2. С. 32-34.

32. Труды Федерального центра охраны здоровья животных. Т. 5. — Владимир: Транзит-ИКС, 2007. 456 с.

33. Урбан В.П., Найманов И.Л. Болезни молодняка в промышленном животноводстве.-М.: Колос, 1984. — 207с.

34. Хазипов Н.З., Гафаров Х.З., Хамадеев Р.Х. Хламидиозы крупного рогатого скота и меры борьбы с ними. Казань: Тат.книгоиздат, 1980. - 100с.

35. Хазипов Н.З., Гафаров Х.З., Шафикова Р.А. Хламидиозы сельскохозяйственных животных.- М.: Колос, 1984. 223 с.

36. Хана А.А. Выделение и иммунофлуоресцентная идентификация хламидий у телят при бронхопневмонии // Тр. МВА. 1957. Т.41. - С. 79.

37. Черкасский Б.Л. Системный подход в эпидемиологии. М., 1988 -288 с.

38. Шимко В.В. Пастереллёз молодняка крупного рогатого скота: монография. Аналит. обзор: Белнаучцентинформмаркетинг АПК, 2000. - 40 с.

39. A clinically silent respiratory infection with Chlamydophila spp. in calves is associated with airway obstruction and pulmonary inflammation / J. Jaegera, E. Liebler-Tenorioa, N. Kirschvinkc, et al. // Vet. Res. 2007. -Vol. 38.-P. 711-728.

40. A multiplex polymerase chain reaction assay for the identification of Mannheimia haemolytica, Mannheimia glucosida and Mannheimia ruminalis / T.W. Alexander, S.R. Cook, L.J. Yanke et al. // Vet. Microbiol.-2008.-Vol. 130, Iss. 1-2.-P. 165-175

41. An investigation into the role of Chlamydophila spp. in bovine upper respiratory tract disease / D.F. Twomey, P.C. Griffiths, M.W. Horigan et al. // Vet. J. 2006. - Vol. 171. - P. 574 - 576.

42. Analyses of the Genomes of Chlamydial Isolates from Ruminants and Pigs Support the Adoption of the New Species Chlamydia pecorum / I.E. Anderson, S.I.F. Baxter, S. Dunbar et al. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1/996. -Vol. 46, N 1, - P. 245-251.

43. Angen 0., Ahrens P., Bisgaard M. Phenotypic and genotypic characterization of Mannheimia (Pasteurella) haemolytica-like strains isolated from diseased animals in Denmark // Vet. Microbiol.- 2002. — Vol. 84, N 1-2.-P. 103-114.

44. Antigen heterogeneity among isolates of Mycoplasma bovis is generated by high-frequency variation of diverse membrane surface proteins / R. Rosengarten, A. Behrens, A. Stetefeld et al. // Infect. Immun. 1994. -Vol. 62.-P. 5066- 5074.

45. Application of an indirect ELISA to milk samples to identify cows with Mycoplasma bovis mastitis / WJ. Byrne, H.J. Ball, N. Brice et al. // Vet. Rec. 2000. - Vol. 146. - P. 368-369.

46. Association of bovine respiratory disease with clinical status and acute phase proteins in calves / S. Nikunen, H. Hartel, T. Orro, et al. // Сотр. Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 2007. - Vol. 30, Iss. 3.-P. 143-151.

47. Association of seroconversion with isolation of agents in transtracheal wash fluids collected From pneumonic calves less than three months of age / A-M.K. Virtala, Y.T. Grohn, G.D. Mechor et al. // The Bov. Pract. -2000.-Vol. 34.-P. 77-80.

48. Ayling R.D., Nicholas R.A., Johansson K.E. Application of the polymerase chain reaction for the routine identification of Mycoplasma bovis // Vet. Rec.- 1997.-Vol. 141.-P. 307-308.

49. Ball H.J., Findlay D. Diagnostic applications of monoclonal antibody-based sandwich ELISAs / Mycoplasma Protocols // ad. R.J. Miles, R.A.J. Nicholas Totowa, USA, 1998. - P. 127-132.

50. Barnes R.C. Laboratory Diagnosis of Human Chlamydial Infections // Clin. Microbiol. Rev. 1989. - Vol. 2, N 2. - P. 119-136.

51. Behrens A., Heller M., Kirchhoff H. A family of phase- and size-variant membrane surface lipoprotein antigens (Vsps) of Mycoplasma bovis // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - P. 5075-5084.

52. Biberstein E.L. Biotiping and serotyping Pasteurella haemolytica / ad. T. Bergan, J.R. Norris // Metods in Microbiology London.: Academic Press, 1978.-P. 253-269.

53. Bovine respiratory disease in feedlot cattle: Environmental, genetic, and economic factors / G.D. Snowder, L.D. Van Vleck, L.V. Cundiff, G.L. Bennett//J. Anim. Sci. 2006. - Vol. 84. -P. 1999-2008.

54. Boyce J.D., Adler B. How does Pasteurella multocida respond to the host environment? // Current Opinion in Microbiology. 2006. - Vol. 9. — P. 117-122.

55. Воусе J.D., Chung J.Y., Adler B. Genetic organisation of the capsule biosynthetic locus of Pasteurella multocida M1404 (B:2) // Vet. Microbiol. 2000. - Vol. 72, Iss. 1-2. - P. 121-134

56. Boyce J.D., Chung J.Y., Adler B. Pasteurella multocida capsule: composition, function and genetics // J. Biotechnology. 2000. — Vol. 83, Iss. 1-2.-P. 153-160.

57. Brogden KA., Packer R.A. Comparison of Pasteurella multocida serotyping systems //Am. J. Vet. Res. 1979.- Vol. 40. - P. 1332- 1335.

58. Buchvarova Y., Vesselinova A. On the aetiopathogenesis of mycoplasma pneumonia in calves // Archiv fur Experimentelle Veterinarmedizin. -1989. Vol. 43. - P. 685-689.

59. Bush R.M., Everett K.D. Molecular evolution of the Chlamydiaceae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - Vol. 51. - P. 203-220.

60. Candidate vaccine antigens and genes in Pasteurella multocida / B. Adler, D. Bulach, J. Chung et al. // Journal of Biotechnology. 1999. - Vol. 73. -P. 83 -90.

61. Cardella M.A., Adviento M.A., Nervig R.M. Vaccination studies against experimental bovine Pasteurella pneumonia // Can. J. Vet. Res. 1987. — Vol. 51,N2.-P. 204-211.

62. Carter G. Studies on P. multocida. A haemagglutination test for the identifying of serological types // Am. J. Vet. Res. — 1955. Vol. 16. - P. 481 -484.

63. Caswell J.L., Archambault M. Mycoplasma bovis pneumonia in cattle // Anim. Health. Res. Rev. -2007. -Vol. 8, N2. -P. 161-186.

64. Cellular inflammatory response in the lungs of calves exposed to bovine viral diarrhea virus, Mycoplasma bovis, and Pasteurella haemolytica / A. Lopez, M.G. Maxie, L. Ruhnke et al. // Am. J. Vet. Res. 1986. - Vol. 47.-P. 1283-1286.

65. Chlamydia, Intracelular Biology, Pathogenesis, and Immunity. -Washington DC: American Society for Microbiology Press, 1999. 313 p.

66. Christensen J.P., Bisgaard M. non cholera // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. -2000.-Vol. 19.-P. 626-637.

67. Chung J.Y., Zhang Y., Adler B. The capsule biosynthetic locus of Pasteurella multocida A:1 // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - Vol. 166, N 2.-P. 289-296.

68. Clarkson M.J., Philips H.L. Isolation of faecal chlamydiae from sheep in Britain and their characterisation by cultural properties // Vet. J. 1997. -Vol. 153, N3.-P. 307-311.

69. Clinical and pathologic studies of experimentally induced Pasteurella haemolytica pneumonia in calves / J.G. Vestweber, R.D. Klemm, H.W. Leipold et al. //Am. J. Vet. Res. 1990. - Vol. 51, N 11. - P. 1792-1798.

70. Coinfection with bovine viral diarrhea virus and Mycoplasma bovis in feedlot cattle with chronic pneumonia / F.M. Shahriar, E.G. Clark, E. Janzen et al. // Can. Vet. J. 2002. - Vol. 43, N 11. - P. 863-868.

71. Comparison of five tests for the detection of antibodies against chlamydial (enzootic) abortion of ewes / G.E. Jones, J.C. Low, J. Machell et al. // Vet. Rec.- 1997.-Vol. 141.-P. 164-168.

72. Comparison of various diagnostic methods for the detection of M. bovis / K. Sachse, H. Pfuetzner, H. Hotzel et al. // Rev. Sci. Tech. 1993. - Vol. 12, N2.-P. 571-580.

73. Complete genomic sequence of Pasteurella multocida, Pm70 / B.J. May, Q. Zhang, L.L. Li et al. // PNAS. 2001. - Vol. 98, N 6. - P. 3460-3465.

74. Confer A.W. Immunogens of Pasteurella // Vet. Microbiol. 1993. - Vol. 37, N3-4.-P. 353-368.

75. Conservation of the uvrC gene sequence in Mycoplasma bovis and its use in routine PCR diagnosis / A. Thomas, I. Dizier, A. Linden et al. // The Veterinary Journal. 2004. - Vol. 168. - P. 100-102.

76. Coronavirus and pasteurella infections in bovine shipping fever pneumonia and Evans' criteria for causation / J. Storz, X. Lin, C.W. Purdy et al. // J. Clin. Microbiol. -2000. Vol. 38. - P. 3291-3298.

77. Crossprotection studies with Pasteurella multocida bacterins prepared from bacteria propagated in iron-depleted medium / J.R. Glisson, M.D. Contreras, I.H.N. Cheng, C. Wang // Avian. Dis. 1993. - Vol. 37. - P. 1074-1079.

78. Cusack P.M., Mc Meniman N., Lean I.J. The medicine and epidemiology of bovine respiratory disease in feedlots // Aust. Vet. J. — 2003. — Vol. 81, N8.-P. 480-487.

79. Dabo S.M., Confer A.W., Murphy G.L. Outer membrane proteins of bovine Pasteurella multocida serogroup A isolates // Vet. Microbiology. — 1997. Vol. 54, Iss. 2. - P. 167-183

80. Dabo S.M., Taylor J.D., Confer A.W. Pasteurella multocida and bovine respiratory disease // Anim. Health Res. Rev. 2007.- Vol. 8. - P. 129150.

81. Davies R.L., Campbell S., Whittam T.S. Mosaic structure and molecular evolution of the leukotoxin operon (lktCABD) in Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Mannheimia glucosida, and Pasteurella trehalosi // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - P. 266-277.

82. De Alwis M.C.L. Haemorrhagic septicaemia a general review // Br. Vet. J. - 1992. - N 148. - P. 99-112.

83. De Jong M.F. Progressive and nonprogressive atrophic rhinitis / Diseases of Swine, eighth ed. In: Straw, B.E., D'Allaire, S., Mengeling, W.L., Taylor, D.J. (Eds.). Iowa, Iowa State University Press, Ames, 1999. - P. 355-384.

84. Demkin V.V., Zimin A.L. A new amplification target for PCR-RELP detection and identification of Chlamydiaceae species // Arh. Microbiol. — 2005.-Vol. 183.-P. 169-175.

85. Detection of Mycoplasma bovis specific IgG in bovine serum by enzyme-linked immunosorbent assay / J.T. Boothby, D.E. Jasper, M.H. Rollins, C.B. Thomas // Am. J. Vet. Res. 1981. - Vol. 42. - P. 1242-1247.

86. Detection of mycoplasma in mastitic milk by PCR analysis and culture method / K. Hirose, Y. Kawasaki, K. Kotani et al. // J. Vet. Med. Sci. -2001.-Vol. 63.-P. 691-693.

87. Detection of tetracycline-resistant and susceptible Pasteurellaceae in the nasopharynx of loose group-housed calves / B. Carty, A. Decostere, S. Schwars et al. // Veterinary Research Communications. 2006. - Vol. 30. -P. 707-715.

88. Development of a rapid real-time PCR assay for detection and quantification of four familiar species of Chlamydiaceae / J.M. Yang, H.X. Liu, Y.X. Hao et al. // J. Clin. Virol. 2006. - Vol. 36, N 1. - P. 79-81.

89. Development of PCR assays for species-and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates / K.M. Townsend, AJ. Frost, C.W. Lee et al. // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P. 10961100.

90. Diagnostic and typing options for investigating diseases associated with Pasteurella multocida / F. Dziva, A.P. Muhairwa, M. Bisgaard, H. Christensen. // Vet. Microbiology. 2008. - Vol. 128. - P. 1-22.

91. Differentiation of Chlamydia psittaci and C. pecorum Strains by Species-Specific PCR / N. Sheehy, В. Markey, M. Gleeson, P.J. Quinn // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34, N 12. - P. 3175-3179.

92. Divergent activity and function of superoxide dismutases in Pasteurella haemolytica serotypes A1 and A2 and Pasteurella trehalosi serotype T10 / H.A. Rowe, D.P. Knox, I.R. Poxton, W. Donachie // FEMS Microbiol. Lett.-1997.-Vol. 150, N2.-P. 197-202.

93. DNA sequence of the Pasteurella haemolytica leukotoxin gene cluster / S.K. Highlander, M. Chidambaram, M.J. Engler, G.M. Weinstock // DNA. 1989.-Vol. 8.-P. 15-28.

94. Dungworth D.L., The respiratory system, /ad. K.V.F. Jubb, P.G. Kennedy, N. Palmer // Pathology of Domestic Animals. Chlamydial Diseases. San Diego, 1993. - Vol. 3. - P. 664-665.

95. Dybvig K., Voelker L.L. Molecular biology of mycoplasmas // Annu. Rev. Microbiol. 1996. - Vol. 50. - P. 25-57.

96. Edwards A.J. Respiratory diseases of feedlot cattle in the central USA // Bovine Pract. 1996. - Vol. 30. - P. 5-7.

97. Effect of stress on viral-bacterial synergy in bovine respiratory disease: novel mechanisms to regulate inflammation / P.D. Hodgsonl, P. Aich, A. Manuja et al. // Comparative and Functional Genomics. 2005. -Vol. 6.-P. 244-250.

98. Effect of vaccination with live or killed Pasteurella haemolytica on resistance to experimental bovine pneumonic pasteurellosis / A.W. Confer, R.J. Panciera, R.W. Fulton et al. // Am. J. Vet. Res. 1985. - Vol. 46, N 2. p. 342-347.

99. Epidemiologic and pathologic characteristics of respiratory tract disease in dairy heifers during the first three months of life / A.M. Virtala,

100. G.D. Mechor, Y.T. Grohn et al. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1996. - Vol.i208.-P. 2035-2042.

101. Epidemiological study of enzootic pneumonia in dairy calves in Saskatchewan / J. Van Donkersgoed, C.S. Ribble, L.G. Boyer, H.G. Townsend // Can. J. Vet. Res. 1993. - Vol. 57, N 4. - P. 247-254.

102. Epidemiological study of risk factors associated with Mycoplasma bovis infections in fattening calves / R. Tschopp, P. Bonnemain, J. Nicolet, A. Burnens // Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. — 2001. — Vol. 143. — P. 461-467.

103. Ern0 H., Stipkovits L. Bovine mycoplasmas: cultural and biochemical studies I. // Acta. Vet. Scand. 1973. - Vol. 14. - P. 436-449. '

104. Erno H., Stipkovits L. Bovine mycoplasmas: cultural and biochemical studies. II. // Acta. Vet. Scand. 1973. - Vol. 14. - P. 450-463.

105. Etiology of respiratory disease in non-vaccinated, non-medicated calves in rearing herds / Autioa Т., Pohjanvirta Т., Holopainen R. et al. // Veterinary Microbiology. 2007. - Vol. 119, Iss. 2-4. - P. 256-265.

106. Evaluation of PCR systems for the identification and differentiation of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis: A collaborative trial / J.B. Bashiruddin, J. Frey, M.H. Konigsson et al. // The Veterinary Journal. -2005. Vol. 169. - P. 268-275.

107. Everett K.D.E. Chlamydia and Chlamydiales: more than meets the eye // Vet. Microbiol. 2000. - Vol. 75. - P. 109-126.

108. Everett K.D.E., Andersen A.A. Identification of nine species of the Chlamydiaceae using PCRmRFLP // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. - Vol. 49.-P. 803-813.

109. Everett K.D.E., Andersen A.A. The Ribosomal Intergenic Spacer and Domain I of the 23 s rRNA Gene Are Phylogenetic Markers for Chlamydia spp. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - Vol. 47, N 2. - P. 461-473.

110. Evolutionary relationships among members of the genus Chlamydia based on 16S ribosomal DNA analysis / B. Pettersson, A. Andersson, T. Leitner et al. // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179, N 13. - P. 4195-4205.

111. Ewers C, Liibke-Becker A., Wieler L.H. Mannheimia haemolytica and the pathogenesis of enzootic bronchopneumonia // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 2004. - Vol. 117, N3-4.-P. 97-115.

112. Experimental induction of pneumonic pasteurellosis in calves by intratracheal infection with Pasteurella multocida biotype A:3 / A. Dowling, J.C. Hodgson, A. Schock. et al. // Res. Vet. Sci. 2002. - Vol. 73.-P. 37-44.

113. Experimental infection of calves with Pasteurella multocida Serovar A: 3 isolated in Japan / K. Ishiguro, T. Kitajima, S. Kubota et al. // J. Vet. Med. Sci.-2005.- Vol. 67, N8.-P. 817-819.

114. Experimental production of bovine pneumonic pasteurellosis / H.A. Gibbs, E.M. Allan, A. Wiseman, I.E. Selman // Res. Vet. Sci. 1984. -Vol. 37,N2.-P. 154-166.

115. Extended repertoire of genes encoding variable surface lipoproteins in Mycoplasma bovis strains / S. Nussbaum, I. Lysnyansky, K. Sachse et al. // Infection and Immunity 2002. - Vol. 70. - P. 2220-2225.

116. Factors assotiated with morbidity and mortality in feedlot calves: The Bruce County beef project, year two / S.W. Martin, A.H. Meek, D.G. Davis et al. // Can. J. Сотр. Med. -1981.-Vol. 38. P. 377-388.

117. Fatal peritonitis caused by Pasteurella multocida capsular type F in calves / Carty В., Chiers K., Schwars S. et al. // Journal of Clinical Microbiology. 2005. - N 43. - P. 1480-1483.

118. Fletcher R.H., Fletcher S.W., Wagner E.H. Clinical epidemiology. — ' London: Williams and Wilkins, 1996. — 276 p.

119. Fox M.L., Thomoson R.G., Magwood S.E. Pasteurella haemolytica in cattle: serotypes, producti(m of b-galactosidase and antibacterial sensitivity //Can. J. Сотр. Med. 1971.-Vol. 35.-P. 313-317.

120. Frank G.H., Smith P.C. Prevalence of Pasteurella haemolytica in transported calves // Am. J. Vet. Res. 1983. - Vol. 44.- P. 981-985.

121. Fukushi H., Hirai K. Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia Strains Derived from Ruminants // Int. J. Syst. Bacteriol. —1992. Vol. 42, N 2. - P. 306-308.1. J !

122. Fukushi H., Hirai K. Restriction Fragment Length Polymorphisms of rRNA as Genetic Markers To Differentiate Chlamydia spp. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. - Vol. 43, N 3. - P. 613-617.

123. Gatewood D.M., Fenwick B.W., Chengappa M.M. Growth-condition dependent expression of Pasteurella haemolytica Al outer membrane proteins, capsule, and leukotoxin // Vet. Microbiol. 1994. — Vol. 41. — P. 221-233.

124. Genetic organization of Pasteurella multocida cap Loci and development of a multiplex capsular PCR typing system / K.M. Townsend, J.D. Boyce, J.Y. Chung et al. // . J.Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 924-929

125. Genetic variation among Mycoplasma agalactiae isolates detected by the variant surface lipoprotein gene of (vspA) Mycoplasma bovis / R. Flitman-Tene, S. Levisohn, R. Rosenbusch et al. // FEMS Microbiology Letters-1997.-Vol. 156.-P. 123-128.

126. Genome sequence of Chlamydophila caviae (Chlamydia psittaci GPIC): examining the role of niche-specific genes in the evolution of the

127. Chlamydiaceae / T.D. Read, G.S. Myers, R.C. Brunham et al. // Nucleic Acids Res. 2003 - Vol. 31, N 8. - P. 2134-2147.

128. Genome sequences of Chlamydia trachomatis MoPn and Chlamydia pneumoniae AR39 / T.D. Read, R.C. Brunham, C. Shen et al. // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol. 28. - P. 1397-1406.

129. Ghadersohi A., Coelen R.J., Hirst R. G. Development of a specific DNA probe and PCR for the detection of Mycoplasma bovis // Vet. Microbiol. 1997. - Vol. 56. - P. 87-98.

130. Gourlay R.N., Houghton S.B. Experimental pneumonia in conventionally reared and gnotobiotic calves by dual infection with Mycoplasma bovis and Pasteurella haemolytica // Res. Vet. Sci. 1985. — Vol. 38.-P. 377-382.

131. Gourlay R.N., Thomas L.H., Wyld S.G. Experimental Pasteurella multocida pneumonia in calves // Res. Vet. Sci. 1989.- Vol. 47. - P. 185189.

132. Griffiths E., Ventresca M.S., Gupta R.S. BLAST screening of chlamydial genomes to identify signature proteins that are unique for the Chlamydiales, Chlamydiaceae, Chlamydophila and Chlamydia groups of species // BMC Genomics. 2006. - Vol. 7. - P. 14.

133. Hammerschlag M.R. The intracellular life of Chlamydiae // Semin. Pedatr. Infect. Dis. 2002. - Vol. 13, N 4. - P. 239-248.

134. Hayman В., Hirst R. Development of a semi-nested PCR for the improved detection of Mycoplasma bovis from bovine milk and mucosal samples // Vet. Microbiol. 2003. - Vol. 91. - P. 91-100.

135. Heddleston, K.L, Gallagher J.E., Rebers P.A. Fowl cholera: gel diffusion precipitin test for serotyping Pasteruella multocida from avian species // Avian Dis. 1972. - Vol. 16, N 4. - P. 925 - 936.

136. High Prevalence of Natural Chlamydophila Species Infection in Calves / J.B. Jee, F.J. Degraves, T.Y. Kim et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. -Vol. 42, N. 12. - P. 5664 - 5672.

137. Highlander S.K. Molecular genetic analysis of virulence in Mannheimia (Pasteurella) haemolytica // Front. Biosci. 2001. - Vol. 6. — P. 1128-1150.

138. Hirsh D.C., Zee YC. Veterinary Microbiology Boston, MA: Blackwell Scientific Publications, 1999. - 479 p.

139. Hunt M.L., B. Adlera, K.M. Townsend The molecular biology of Pasteurella multocida // Vet. Microbiol. 2000. - Vol. 72. - P. 3 - 25.

140. Identification and characterisation of coding tandem repeat variants in incA gene of Chlamydophila pecorum / K.Y. Mohamad, A. Rekiki, G. Myers et al. // Vet. Res. 2008. - Vol. 39, N 6. - P. 56.

141. Ikeda J.S., Hirsh D.C. Antigenically related iron-regulated outer membrane proteins produced by different somatic serotypes of Pasteurella multocida // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56, N 9. - P. 2499-2502.

142. Immune responses to Mycoplasma bovis vaccination and experimental infection in the bovine mammary gland / J.T. Boothby, C.E. Schore, D.E. Jasper et al. // Can. J. Vet. Res. 1988. - Vol. 52, N 3. - P. 355-359.

143. Impact of latent infections with Chlamydophila species in young cattle / P. Reinhold, J. Jaeger, E. Liebler-Tenorio et al. // Vet. J. 2008. - Vol. 175.-P. 202-211.

144. In vitro amplification of the 16S rRNA genes from Mycoplasma bovis and Mycoplasma agalactiae by PCR / Y.R. Chavez Gonzalez, B.C. Ros, G. Bolske et al. //Vet. Microbiol. 1995. - Vol. 47. - P. 183-190.

145. In vivo production of neuraminidase by Pasteurella haemolytica in market stressed cattle after natural infection / D.C. Straus, C.W. Purdy, R.W. Loan et al. // Curr. Microbiol. 1998. - Vol. 37. - P. 240-244.

146. Investigation of Chlamydophila spp. in dairy cows with reproductive disorders / A.C. Godin, C. Bjorkman, S. Englund et al. // Acta Veterinaria Scandinavica. -2008. Vol. 20, N 1. - P. 39

147. Investigations on the species specificity of Mannheimia (Pasteurella) haemolytica serotyping / O. Angen, M. Quirie, W. Donachie, M. Bisgaard // Vet. Microbiol. 1999. - Vol. 65, N 4. - P. 283-290.

148. Isolation and characterization of a new succinic acid-producing bacterium, Mannheimia succiniciproducensMBEL55E, from bovine rumen / P.C. Lee, S.Y. Lee, S.H. Hong, H.N. Chang // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - Vol. 58, N 5. - P. 663-668.

149. Isolation of Mycoplasma bovis from bovine clinical samples in the Republic of Ireland / W.J. Byrne, R. McCormack, N. Brice et al. // Vet. Rec. 2001. -Vol. 148.-P. 331-333.

150. Isolation of Mycoplasma species from the lower respiratory tract of healthy cattle and cattle with respiratory disease in Belgium / A. Thomas, I. Dizier, A. Trolin et al. // Vet. Rec. 2002 - Vol. 151, Iss. 16. - P. 472476.

151. Jaramillo M.L., Zenteno E., Trigo FJ. Mechanisms of pathogenicity and adhesion in Pasteurella haemolytica // Rev. Latinoam. Microbiol. — 1999.-Vol. 41, N2.-P. 105-116.

152. Kaltenbock В., Schmeer N., Schneider R. Evidence for numerous ompl alleles of porcine Chlamydia trachomatis and novel chlamydial species obtained by PCR // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35, N 7. - P. 1835-1841.

153. Kaltenboeck В., Kousoulas K.G., Storz J. Structures of and alleleic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompA) genes of the four chlamydial species // J. Bacteriol. 1993. — Vol. 175.-P. 487-502.

154. Konigsson H., Pettersson M.B., Johansson K.-E. Intraspecific variation in the 16S rRNA genes of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis strains // Vet. Microbiol. 2002. - Vol. 85. - P. 209-220.

155. Kosma P. Chlamydial lipopolysaccharide Biochimica et Biophysica // Acta (BBA) Molecular Basis of Disease. - 1999. - Vol. 1455, Iss. 2-3. -P. 387-402.

156. Lauerman L.H. Mycoplasmas of the bovine respiratory tract // Mycoplasmosis in Animals: Laboratory diagnosis / ad. H.W. Whitford, R.F. Rosenbusch, L.H. Lauerman Ames, Iowa, 1994. - P. 50-56.

157. Lee J., Kim Y.B., Kwon M. Outer Membrane Protein H for Protective Immunity Against Pasteurella multocida // The Journal of Microbiology. —2007. Vol. 45, N. 2. - P. 179-184.

158. Lipase activity from strains of Pasteurella multocida / J. Pratt, J.D. Cooley, C.W. Purdy, D.C. Straus // Curr. Microbiol. 2000. - Vol. 40, N 5.-P. 306-309.

159. Longbottom D., Coulter L.J. Animal chlamydioses and zoonotic implications // J. Сотр. Path. 2003. - Vol. 128. - P. 217-244.

160. Lysnyansky I., Ron Y., Yogev D. Juxtaposition of an active promoter to vsp genes via site-specific DNA inversions generates antigenic variation in Mycoplasma bovis//J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183.-P. 5698-5708.

161. Mannheimia haemolytica and bovine respiratory disease: Review / J.A. Rice, L. Carrasco-Medina, D.C. Hodgins, P.E. Shewen // Anim. Health. Res. Rev.-2007.-Vol. 8, N2.-P. 117-128.

162. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals2008. Paris: OIE, 2008. - P. 739 - 751.

163. Markey B.K., McNulty M.S., Todd D. Comparison of serological tests for the diagnosis of Chlamydia psittaci infection of sheep // Vet. Microbiol. 1993. - Vol. 36. - P. 233-252.

164. Martin S.W. Vaccination; is it effective in preventing respiratory disease or influencing weight gains in feedlot calves // Can. Vet. J. — 1983. -Vol. 24.-P. 10-19.

165. Maternally and naturally acquired antibodies to Mannheimia haemolytica and Pasteurella multocida in beef calves / M.E. Prado, T.M. Prado, M. Payton, A.W. Confer // Vet. Immunol. Immunpathol. 2006. -Vol. 111.-P. 301-307.

166. Mattsson J.G., Guss В., Johansson K.E. The phylogeny of Mycoplasma bovis as determined by sequence analysis of the 16S rRNA gene // FEMS Microbiol: Lett. 1994. - Vol. 115. - P. 325-328.

167. Miflin J.K., Blackall P.J. Development of a 23S rRNA-based PCR assay for the identification of Pasteurella multocida // Lett. Appl. Microbiol. 2001. - Vol. 33. -P. 216-221.

168. Molecular typing of Mannheimia (Pasteurella) haemolytica serotype Al isolates from cattle in Japan / K. Katsuda, M. Kohmoto, K. Kawashima et al. //Epidemiol. Infect. 2003. - Vol. 131, N 2. - P. 939-946.

169. Mosier D.A., Confer A.W., Panciera R.J. The evolution of vaccines for bovine pneumonic pasteurellosis // Res. Vet. Sci. 1989. — Vol. 47, N 1. — P. 1-10.

170. Mycoplasma bovis infections in gnotobiotic calves and combined infection with respiratory syncytial virus / L.H. Thomas, C.J. Howard, E.J. Stott, K.A. Parsons //Vet. Path. 1986. - Vol. 23. - P. 571-578.

171. Mycoplasma infection of calves. Experimental infection of calves with Mycoplasma bovis / H. Pfutzner, P. Kielstein, J. Martin, D. Schimmel // Archiv fur experimented Veterinarmedizin. 1983. - Vol. 37, N 3. - P. 445-451.

172. Mycoplasma infections in growing cattle / R.A.J. Nicholas, S. Baker, R.D. Ayling, L. Stipkovits // Cattle Practice. 2000. - Vol. 8. - P. 115118.

173. Namioka S., Murata M. Serological studies on Pasteurella multocida. I. A simplified method for capsule typing of the organism // Cornell Vet. -1961.-Vol. 51.-P. 498-507.

174. Namioka S., Murata, M. Serological studies on Pasteurella multocida. III. О antigenic analysis of cultures isolated from various animals // Cornell Vet. 1961.-Vol. 51.-P. 522-528.

175. Newson I.E., Cross F. Some bipolar organisms found in pneumonia in sheep // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1932. - Vol. 80. - P. 711-719.

176. Nicholas R.A., Ayling R.D. Mycoplasma bovis: disease, diagnosis, and control // Res. Vet. Sci. 2003. - Vol. 74. - P. 105-112.

177. Nicholas R.A.J. The other M. bovis: Mycoplasma bovis // State Veterinary Journal. 1997. - Vol. 7. - P. 3-5.

178. Occurrence of copper, zinc.-cofactored superoxide dismutase in Pasteurella haemolytica and its serotype distribution / F.A. Lainson, N. Thomson, H.A. Rowe [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - Vol. 142, N l. -P. 11-17.

179. OmpA and antigenic diversity of bovine Chlamydophila pecorum strains / B. Kaltenboeck, E. Heinen, R. Schneider et al. // Vet. Microbiol. -2009.-Vol. 135.-P. 175-180.

180. Pasteurella multocida detection by 50 Taq nuclease assay: a new tool for use in diagnosing fowl cholera / B.G. Corney, I.S. Diallo, L.L. Wright et al. // J. Microbiol. Methods. 2007. - Vol. 69. - P. 376-380.

181. Pathological and immunohistochemical studies of natural and experimental Mycoplasma bovis pneumonia in calves / F. Rodriguez, D.G. Bryson, H.J. Ball, F. Forster // J. Сотр. Pathol. 1996. - Vol. 115, N 2. -P. 151-162.

182. Pathological and microbiological studies on pneumonic lungs from Danish calves / C. Tegtmeier, A. Uttenthal, N.F. Friis et al. // J. Vet. Med. B. 1999. - Vol. 46. - P. 693-700.

183. PCR Detection and Molecular Identification of Chlamydiaceae Species / J.C. Hartley, S. Kaye, S. Stevenson et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. -Vol. 39, N 9. - P. 3072-3079.

184. Pettersson В., Uhlen M., Johansson K.E. Phylogeny of some mycoplasmas from ruminants based on 16S rRNA sequences and definition of a new cluster within the hominis group // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. -Vol. 46, N4.-P. 1093-1098.

185. Pfutzner H. Epizootiology of the Mycoplasma bovis infection of cattle // Zentralblatt fur Bakteriologie. 1990. - Suppl. 20. - P. 394-399.

186. Pfutzner H., Sachse K. Mycoplasma bovis as an agent of mastitis, pneumonia, arthritis and genital disorders // Scientific and Technical Review. Offices International Des Epizooties. 1996. - Vol. 15. - P. 1477— 1494.

187. Philips H.L., Clarkson M.J. Spontaneous Change from Overt to Covert Infection of Chlamydia pecorum in Cycloheximide-Treated Mouse McCoy Cells // Infection and immunity. 1995. - Vol. 63, N 9. - P. 3729-3730.

188. Pneumonic pasteurellosis induced experimentally in gnotobiotic and conventional calves inoculated with Pasteurella haemolytica / J.G. Vestweber, R.D. Klemm, H. W. Leipold, D.E. Johnson // Am. J. Vet. Res. -1990.-Vol. 51, N 11. — P. 1799-1805.

189. Poumarat F., Solsona M., Boldini M. Genomic, protein and antigenic variability of mycoplasma bovis // Vet. Microbiol. 1994. - Vol. 40. - P. 305-321.

190. Poveda J.B., Nicholas R., Serological identification of mycoplasmas by growth and metabolism inhibition tests // Methods Mol Biol.- 1998. — Vol. 104. P. 105-111.

191. Preliminary phylogenetic identification of virulent Chlamydophila pecorum strains / K.Y. Mohamad, S.M. Roche, G. Myers et al. // Infection, Genetics and Evolution. 2008. - Vol. 8, Iss. 6. - P. 764-771.

192. Proposed minimal standards for the description of genera, species and subspecies of the Pasteurellaceae / H. Christensen, P. Kuhnert, H.J. Busse et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. - Vol. 57. - P. 166-178.

193. Pulmonary response to intratracheal challenge with Pasteurella haemolytica and Pasteurella multocida / T.R. Ames, R.J. Markham, J. Opuda-Asibo et al. // Can. J. Сотр. Med. 1985. - Vol. 49, N 4. - P. 395-400.

194. Quirie M., Donachie W., Gilmour N.J. Serotypes of Pasteurella haemolytica from cattle // Vet. Rec. 1986. - Vol. 119. - P. 93-94.

195. Rapid and Accurate Identification of Human Isolates of Pasteurella and Related Species by Sequencing the sodA Gene / A.-L. Gautier, D.

196. Dubois, F. Escande, et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43, N 5. -P.2307-2314.

197. Razin S., Yogev D., Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 10941156.

198. Reclassification of Pasteurella. trehalosi as Bibersteinia trehalosi gen. nov., comb. nov. / P.J. Blackall, A.M. Bojesen, H. Christensen, M. Bisgaard // Int. J. Syst. Evolut. Microbiol. 2007. - Vol. 57. - P. 666-674

199. Recombinant 35-kDa inclusion membrane protein IncA as a candidate antigen for serodiagnosis of Chlamydophila pecorum / K.Y. Mohamad, A. Rekiki, M. Berri, A. Rodolakis // Vet. Microbiol. 2009. - (Article in Press)

200. Reggiardo C. Role of bovine viral diarrhea in shipping fever of feedlot cattle. Case studies and diagnostic considerations // Proc. Am. Assoc. Vet. Lab. Diag. 1979. - Vol. 2. - P. 315-320.

201. Respiratory disease in calves: Microbiological investigations on trans-tracheally aspirated bronchoalveolar fluid and acute phase protein response / O.Angen, J. Thomsen, L. Erik-Larsen et al. // Vet. Microbiology 2009. -Vol. 137.-P. 165-171.

202. Rimler R.B., Rhoades K.R. Pasteurella multocida // Pasteurella and pasteurellosis: Academic Press Limited.- United Kingdom, London, 1989.-P. 37-73.

203. Rothman K.J., Greenland S. Causation and causal inference in epidemiology // Am.J.Publ. Health. 2005. - Vol. 95, N. si. - P. 144-150.

204. Serotype 2-specific antigens from ruminant strains of Chlamydia pecorum detected by monoclonal antibodies / J. Salinas, A. Souriau, C. De Sa et al. // Сотр. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 1996. - Vol. 19, N 2. - P. 155-161.

205. Serotyping of Mannheimia (Pasteurella) haemolytica isolates from the upper Midwest United States / G.M. Al-Ghamdi, T.R. Ames, J.C. Baker et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 2000. - Vol. 12, N 6. - P. 576-578.

206. Serotyping of Mannheimia haemolytica isolates from bovine pneumonia: 1987-2006 / K. Katsuda, M. Kamiyama, M. Kohmoto et al. //Vet. J.-2008.-Vol. 178, Iss. l.-P. 146-148.

207. Shewen P.E., Conlon J.A. Pasteurella / In Pathogenesis of bacterial infections in animals.: 2nd edition, С L. Gyles, C.O. Thoen (eds.).- Iowa, Iowa State University Press, Ames, 1993. P. 216-225.

208. Shewen P.E., Sharp A., Wilkie B.N. Efficacy testing a Pasteurella haemolytica extract vaccine // Vet. Med. 1988. - Vol. 83. - P. 10781083.

209. Shipping fever pneumonia in yearling feedlot cattle / R. Jensen, R.E. Pierson, Braddy P.M. et al. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1976. - Vol. 169. - P. 500-506.

210. Shoo M.K. Experimental bovine pneumonic pasteurellosis: a review // Vet. Rec.-1989.-Vol. 124, N6.-P. 141-144.

211. Smith G.R. The characteristics of two types of Pasteurella haemolytica associated with different pathological conditions of sheep // J. Pathol. Bacteriol. 1961. - Vol. 81. - P. 431-440.

212. Species identification of Mycoplasma bovis and Mycoplasma agalactiae based on the uvrC genes by PCR / S. Subramaniam, D. Bergonier, F. Poumarat et al. // Mol. Cell. Probes. 1998. - Vol. 12. - P. 161-169.

213. Species specificity of Pasteurella haemolytica serotyping / 0. Angen, M. Quirie, W. Donachie, M. Bisgaard // Vet. Microbiol. 1999. - Vol. 65. -P. 283-290.

214. Stable markers of oxidant damage to proteins and their application in the study of human disease / M.J. Davies, S. Fu, H. Wang, R.T. Dean // Free Radic. Biol. Med. 1999. - Vol. 27. - P. 1151- 1163.

215. Strathdee C.A., Lo R.Y. Regulation of expression of the Pasteurella haemolytica leukotoxin determinant // J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171. - P. 5955-5962.

216. Subramaniam S., Clayton K.L., Aruna A. Immune evasion by pathogens of bovine respiratory disease complex. Animal health research reviews. // Conference of Research Workers in Animal Diseases. — 2007. — Vol. 8, N2.-P. 215-229.

217. Tenk M. Examination of Mycoplasma bovis infection in cattle: Doctoral Thesis. — Budapest, 2005. p. 70.

218. Ter Laak E.A., Noordergraaf J.H., Boomsluiter E. The nasal mycoplasmal flora of healthy calves and cows // J. Vet. Med. Ser. B. -1992. Vol. 39. - P. 610-616.

219. Ter Laak E.A., Noordergraaf J.H., Dieltjes R.P.J.W. Prevalence of mycoplasmas in the respiratory tracts of pneumonic calves // J. Vet. Med. Ser. B. 1992. - Vol. 39. - P. 553-562.

220. The Genome Sequence of Mannheimia haemolytica Al: Insights into Virulence, Natural Competence, and Pasteurellaceae Phylogeny / J. Gioia, X. Qin, H. Jiang et al. // J. Bacteriology. 2006. - Vol. 188, N 20. - P. 7257-7266.

221. The microbial flora of the respiratory tract in feedlot calves: associations between nasopharyngeal and bronchoalveolar lavage cultures /

222. J.W. Allen, L. Viel, K.G. Bateman et al. // Can. J. Vet. Res. — 1991. — Vol. 55, N4.-P. 341-346.

223. The NCBI taxonomy browser on line. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/ Browser/wwwtax.cgi (дата обращения: 4.02.2006)

224. The outer membrane of Pasteurella multocida A:3 protects rabbits against homologous challenge / Y.S. Lu, W.C. Lai, S.P. Pakes, C. Stefanu //Infect. Immun.- 1991.-Vol. 59.-P. 4517-4523.

225. The use of the enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) in serological diagnosis of Mycoplasma bovis in dairy cattle / I J. Uhaa, H.P. Riemann, M.C. Thurmond, C.E. Franti // Vet. Res. Commun. 1990. -Vol. 14.-P. 279-285.

226. The vsp locus of Mycoplasma bovis: gene organization and structural features / I. Lysnyansky, K. Sachse, R. Rosenbusch, et al. // J. Bacterid. 1999.-Vol. 181.-P. 5734-5741.

227. Thomson R.G., Benson M.L., Savan M. Pneumonic pasteurellosis of cattle: microbiology and immunology // Can. J. Сотр. Med. 1969. - Vol. 33.-P. 194-206.

228. Thorlarkson В., Martin W., Peters D. A field trial to evaluate the efficacy of a commercial Pasteurella haemolytica bacterial extract in preventing Bovine Respiratory Disease // Can. J. Vet. Res. 1990. - Vol. 31.-P. 573-579.

229. Thrusfield M. Veterinary epidemiology. . Berlin: Plackwell Sciennce, 1995.-479 p.

230. Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated from different hosts with various disease status / C. Ewers, A. Lubke-Becker, A. Bethe et al. // Vet. Microbiol. 2006. - Vol. 114. - P. 304-317.

231. Vogel J.G., Parrott C. Mortality survey in feed yards: the incidence of death from digestive, respiratory and other causes in feedyards on the Great plains // Сотр. Cont. Ed. Prac. Vet. -1994. Vol. - P. 227-234.

232. Ward M.E. The immunobiology and immunopathology of chlamydial infections //APMIS.- 1995. -Vol. 103, N 11.-P. 769-796.

233. Willeberg P. Animal disease information processing: epidemiologic analyses of the feline urological sundrome // Acta Vet. Scand. Suppl. — 1977. Vol. 64.-P. 1-48.

234. Wound infection with Neisseria weaveri and a novel subspecies of pasteurella multocida in a child who sustained a tiger bite/ Capitini C.M., Herrero I.A., Patel R. et al. //Clin. Infect. Dis. 2002.- Vol. 34, N 12. - P. 74-76.

235. Wray C., Thompson D.A. Serotypes of Pasteurella haemolytica isolated from calves//Br. Vet. J. 1971. - Vol. 127.-P. 56-57.

236. Younan M., Fodor L. Characterization of a new Pasteurella haemolytica serotype (A17) // Res. Vet. Sci. 1995. - Vol. 58, Iss. 1. - P. 98.

237. Zecchinon L., Fett Т., Desmecht D. How Mannheimia haemolytica defeats host defence through a kiss of death mechanism // Vet. Res. 2005. -Vol. 36,N2.-P. 133-156.

Информация о работе

Шибаев, Михаил Александрович
кандидата ветеринарных наук
Владимир, 2010
ВАК 06.02.02

Диссертация

Разработка и применение методов молекулярной биологии для выявления возбудителей бактериальных респираторных инфекций крупного рогатого скота - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы