Разработка и оценка информативности нового способа детекции Ascaris lumbricoides при паразитарных заболеваниях у детей

Фархутдинова, Алсу Мансафовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и оценка информативности нового способа детекции Ascaris lumbricoides при паразитарных заболеваниях у детей
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка и оценка информативности нового способа детекции Ascaris lumbricoides при паразитарных заболеваниях у детей"

ФАРХУТДИНОВА АЛСУ МАНСАФОВНА

РАЗРАБОТКА И ОЦЕНКА ИНФОРМАТИВНОСТИ НОВОГО СПОСОБА ДЕТЕКЦИИ ASCARIS LUMBRICOIDES ПРИ ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ У ДЕТЕЙ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

005059167

Работа выполнена на кафедре фундаментальной и прикладной микробиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

Мявзютов Айрат Радикович

Официальные оппоненты:

Миронов Андрей Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Российской Федерации, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии;

Чемерис Алексей Викторович, доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, заместитель директора по научной работе. Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Защита состоится 6 июня 2013 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

Автореферат разослан «30» апреля 2013 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По данным ВОЗ (2012), аскаридозом в мире ежегодно инфицируется от 1 до 1,5 млрд. человек, большинство из которых составляют дети дошкольного и школьного возраста. В Российской Федерации ежегодно регистрируется несколько десятков новых случаев инфицирования указанной инвазией (Романенко H.A., Семенова Т.А., 2007), что определяет её актуальность.

Одним из наиболее эффективных способов борьбы с гельминтозами является ранняя диагностика. Однако применяемые в настоящее время методы имеют низкую чувствительность и специфичность. Информативность овоскопии недостаточна даже после предварительного обогащения проб, в особенности у больных с низкой интенсивностью инвазии или на поздних стадиях заболевания. Яйца гельминта могут не обнаруживаться при одновременном паразитиро-вании особей одного пола (3-5%), неполовозрелых или старых самок (Романенко H.A. с соавт., 2008). Проблематична диагностика аскаридоза в раннюю миграционную фазу заболевания, когда специфическая терапия наиболее эффективна и существенно снижается риск осложнений заболевания. В связи с этим предложены рентгенологическая идентификация эозинофильных инфильтратов, мигрирующих в легочной ткани, ряд иммунологических методов, однако, отношение к результатам их практическог о применении со стороны профессионального сообщества пока достаточно разноречиво (Горохов В.В. с соавт., 2008).

В контексте вышеуказанного достаточно перспективным представляется разработка способов диагностики Ascaris lumbricoides на основании молеку-лярно-генетических методов, в частности полимеразной цепной реакции, характеризующиеся исключительно высокой чувствительностью и специфичностью. При этом существенно могут быть снижены временные затраты и появляется возможность экспресс-детекции аскарид как в различных клинических образцах, так и во внешней среде.

Целью исследования является конструирование тест-системы для детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале и сравнительная оценка информативности её практического применения для повышения эффективности лабораторной диагностики аскаридоза у детей на ранних стадиях заболевания.

Задачи исследования:

1. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК Ascaris lumbricoides, представленных в GenBank/DDBJ,flnfl выявления фрагментов, применимых в качестве ДНК-мишени и конструирования на этой основе тест-системы для их детекции методом ПЦР.

2. Разработка опытного образца гест-системы для полимеразной цепной реакции Ascaris lumbricoides в исследуемом материале.

3. Эпидемиологический анализ заболеваемости аскаридозом в Республике Башкортостан и обоснование выбора оптимальной возрастной группы обследуемых для адекватной сравнительной оценки информативности разработанной тест-системы и существующих способов прямого обнаружения Ascaris lumbricoides.

4. Сравнительная оценка информативности разработанной тест-системы для обнаружения Ascaris lumbricoides в клиническом материале (фекалии) и в объектах окружающей среды (почва, вода).

5. Составление практических рекомендаций по применению созданной тест системы для диагностики аскаридозной инвазии и санитарно-паразитологического контроля объектов внешней среды на Ascaris lumbricoides.

Научная новизна. Впервые был проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 18S рРНК Ascaris lumbricoides, Diphyllo-bolhrium latum, Clonorchis sinensis, Echinococcus granulosus, Fasciola hepatica, Hymenolepis diminula, Hymenolepis nana, Necator americanus, Opisthorchis viver-rini, Paragonimus westermani, Slrongyloides stercoralis, Taenia solium, Trichinella spiralis. При этом были выявлены уникальные последовательности гена 18S рРНК Ascaris lumbricoides, не имевшие гомологии с нуклеотидными последовательностями указанных гельминтов, к которым были подобраны праймеры AscarFor и AscarRev для высокоспецифичной детекции и идентификации Ascaris lumbricoides в исследуемом материале на разных стадиях их развития.

фрагментов в различных клинических образцах от пациентов с различными клиническими вариантами аскаридоза, а также - в образцах объектов внешней среды.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований предложена диагностическая система, обеспечивающая лабораторную диагностику аскаридоза на ранних стадиях заболевания, при которых специфическая детекция Ascaris lumbricoides рутинными методами проблематична.

Проведена сравнительная характеристика информативности способа специфической детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания, определены основные показания к практическому использованию с учетом существующих методов лабораторной диагностики и накопленного при их использовании опыта.

Предложен алгоритм ранней лабораторной диагностики аскаридоза, обеспечивающий максимум диагностических данных при минимуме материальных и временных затрат.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаггы выполненной работы послужили основой для разработки патента на изобретение. Получен патент на изобретение РФ № 2424525 от 20.07.2011 на «Способ специфической детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания».

Результаты исследований внедрены в учебный процесс и используются в учебной работе на кафедре фундаментальной и прикладной микробиологии, кафедре лабораторной диагностики института последипломного образования и на кафедре эпидемиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Праймеры к фрагменту гена 18S рРНК Ascaris lumbricoides обеспечивают надежную специфическую амплификацию ДНК Ascaris lumbricoides размером 489 пн при исследовании тотальной ДНК, выделенной из клинического материала (кал, отделяемое слизистых, кровь) и из объектов внешней среды.

2. Обоснована группа больных с аскаридозной инвазией, инфицированность в которой характеризовалась наибольшими значениями, для адекватной срав-

нительной оценки информативности новых методов лабораторной диагностики аскаридоза, в том числе в будущих разработках.

3. «Способ специфической детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания» (патент РФ № 2424525 от 20.07.2011) по информативности превосходит наиболее широко применяемый в настоящее время метод овоскопии и может использоваться для раннего обнаружения не только яиц Ascaris lumbricoides, но и их личинок в клиническом материале вне зависимости от формы и фазы заболевания.

4. Выявление аскариды с помощью ПЦР — может быть включено в официальный перечень методов диагностики аскаридоза и методов санитарно-паразитологического контроля состояния объектов внешней среды (почвы, вода), что позволит оптимизировать диагностическую подсистему эпидемиологического надзора за данной инвазией.

Апробация работы. Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры фундаментальной и прикладной микробиологии, кафедры эпидемиологии и кафедры лабораторной диагностики института последипломного образования ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, протокол №11 от 29 июня 2012 г.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на «Национальных лабораторных днях» (Москва, 2008); II Конгрессе педиатров стран СНГ «Ребенок и общество: проблемы здоровья, развития и питания» (Астана, 2010); 73-й итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2008), II Международной студенческой научной конференции с участием молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2010).

Публикации. Основные материалы диссертации в полном объеме отражены в 5 публикациях, в том числе в 3 рецензируемых изданиях, 1 статья - в другом издании, 1 - в материалах конференций, 1 — патент на изобретение РФ (№2424525 от 20.07.2011 «Способ специфической детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания»).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введе-

ние, обзор литературы, глава «Материалы и методы исследования», 5 глав собственных исследований, заключение, выводы. Список литературы содержит 220 источников, в том числе 111 отечественных и 109 зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследовании. Поиск нуклеотидных последовательностей Ascaris lumbricoides и ряда других гельминтов осуществляли в международном банке Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Их выравнивание и сравнительный анализ осуществляли с помощью компьютерной программы Megalign из пакета программ Lasergene (DNASTAR, США), подбор праймеров и предварительный подбор условий амплификации - при использовании программы PrimerSelect пакета программ DNAStar (Lasergene, США), любезно предоставленного ФГБУН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН.

Молекулярно генетические методы исследований. Для выделения контрольной ДНК Ascaris lumbricoides использовали метод Грэхэма (Graham G., 1978) с некоторыми модификациями. Фрагмент червя растирали в ступке после охлаждения жидким азотом, добавляли 10 мл буфера (100 мМ трис-HCl, pH 8,5, 20 мМ ЭДТА, 15% раствор сахарозы и 5 мг/мл лизоцима). Инкубировали 15 мин при 0°С, добавляли 10 мл лизирующего раствора (2%-ный додецилсульфат натрия) и 10 мг/мл протеиназы К, инкубировали 2 ч при 55°С. К раствору добавляли равный объем смеси 80% свежеперегнанного фенола (pH 8,0), хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 25:24:1. Центрифугировали, к супернатанту добавляли 2 объема охлажденного 96% этилового сиирта. ДНК осаждали центрифугированием, промывали 70% спиртом, затем растворяли в ТЕ буфере (1 мМ EDTA, 10 мМ TRIS-HC1 pH 8.0).

Для получения ДНК из клинического материала также использовали модификацию Boom R. (1990). В пробирку с 300 мкл лизирующего раствора (5М гуа-нидинтиоционат, 1% Triton Х100) вносили 1 г фекалий или смыва мазка. Перемешивали и прогревали 5 мин при 65°С. Центрифугировали 2 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость ресуспендировали в 25 мкл сорбента (Si02), дважды перемешивали и осаждали сорбент центрифугированием при 8 тыс. об/мин в течение 30 с. Далее в пробирку с сорбентом добавляли 300 мкл раствора

для отмывки (5М гуанидинтиоционат), ресуспендировапи сорбент на вортексе и осаждали центрифугированием при 8 тыс. об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. После удаления надосадочной жидкости добавляли 950 мкл раствора дня отмывки (70% этиловый спирт), перемешивали на вортексе до полного ресуспенди-рования сорбента, центрифугировали 30 с при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Удаляли надосадочную жидкость. Подсушивали сорбент при 65°С 5-10 мин. Добавляли 50 мкл ТЕ-буфера (1 мМ ЕБТА, 10 мМ ТЯ1Б-НС1 рН 8.0) для элюции ДНК, перемешивали и инкубировали при температуре 65°С 5 мин с периодическим встряхиванием на вортексе. Сорбент осаждали центрифугированием при 12 тыс. об/мин 1 мин на микроцентрифуге. ДНК хранили при -18°С до 6 месяцев.

Амплификацию ДНК проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК Технология, Россия). Электофорез проводили при постоянном напряжении 150 В после 5-минутного преэлектрофореза с последующей детекцией результатов проводили путем окрашивания агарозного геля бромистым этидием в течение 10 минут и визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Продукт амплификации размером 489 пн обнаруживается в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета. Документирование результатов проводилось с использованием программы «Вю1ез1-0»).

Объекты исследования. Оценку информативности методов осуществляли на клинических образцах 209 детей с аскаридозом (кишечная стадия), госпитализированных в ГБУЗ Республиканская детская клиническая больница г. Уфы с 2006 по 2009 гг. после получения информированного согласия родителей на их проведение. Контрольную группу составили 80 практически здоровых детей, у которых отсутствовали анамнестические, эпидемиологические, клинические и лабораторные данные за аскаридоз. Предварительно клинические образцы фекалий обследованных из группы наблюдения и контрольной исследовали традиционным в паразитологии методом микроскопии нативных препаратов (7x40) толстого мазка фекалий по Като после предварительного их обогащения по Фюллеборну или Капантарян (Куропатенко М.В., 2005) для последующего исследования методом ПЦР.

Сравнительная характеристика по возрастному составу различных групп населения с РБ применением нового метода исследования. Ретро-

спективно эпидемиологические особенности аскаридозной инвазии среди различных групп населения РБ анализировали по данным отчетной формы № 2 «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях» за период с 2007 по 2011 гг. Всего в работу была включена информация о 1547 случаях аскаридоза, из них 941 случаев были связаны с детьми 0-14 лет, и 606 случаев - лицами старше 15 лет (взрослыми). Сведения о возрастном составе населения РБ за анализируемый период были получены из ТОФС Государственной статистики по Республике Башкортостан. При этом определялись величины показателей заболеваемости аскаридозом, собственные ошибки показателей.

Статистическая обработка результатов. Сравнительный анализ информативности методов детекции Ascaris lumbricoides осуществляли на основании оценки специфичности, чувствительности и диагностической эффективности по формулам Банержи А. (Банержи А., 2007). Статистическую достоверность отличия от равномерного распределения по данным таблицы рассчитывали по критерию х2 с поправкой Йетса и по уровню его значимости (Реброва О.Ю., 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В патогенезе аскаридоза выделяют 2 основные фазы: раннюю - миграционную (личиночную) и позднюю - кишечную. Среди них наиболее патогенетически значимой является ранняя стадия, которая сопровождается сенсибилизацией макроорганизма продуктами жизнедеятельности личинок Ascaris lumbricoides в процессе их миграции. Основным презентируемым гельминтом антигенным комплексом являются молекулы гликопротеина ES - 62, содержащего фосфорилхолин. Однако сила иммунного ответа, впрочем, как степень и тяжесть тканевых повреждений во-многом определяются количеством одновременно мигрирующих личинок Ascaris lumbricoides и особенностями иммунного статуса (сенсибилизация макроорганизма, возрастные, профессиональные и другие) конкретного пациента. В силу указанного выявление специфических иммуноглобулинов с помощью иммуноферментного метода (ИФА) не всегда является достаточно информативным.

В этой связи наиболее перспективной представляется высокочувствительная детекция видоспецифических фрагментов нуклеиновых кислот возбу-

дителя при использовании молекулярно-генетических методов, поскольку позволяет выявлять специфические фрагменты даже мертвых особей гельминта вне зависимости от фазы его развития. Учитывая очевидность указанного на начальных этапах исследования нами был проведен поиск такого рода разработок на основании анализа соответствующих литературных данных. Указанное было блестяще подтверждено в работах Ishiwata К. et al. (2004) в ходе сиквенса рибосомальной ДНК, однако, для этих целей использовался гомогенат исследуемой печеночной ткани, что для широкого использования в лабораторной диагностике неприменимо. В связи с вышеуказанным перед нами встала задача создания такой диагностической системы, которая бы совместила чувствительность ПЦР, специфичность ИФА и неинвазивность овоскопии.

Сравнительный анализ первичных структур генов. На первом этапе исследования нами был проведен анализ нукпеотидных последовательностей Ascaris lumbricoides, представленных в международном банке Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov') и принято решение остановить свой выбор для подбора праймеров на рРНК, поскольку указанные молекулы обнаруживаются у всех клеточных форм жизни, они эволюционируют в результате спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью и накапливающихся достаточно медленно, а потому их первичная структура в целом характеризуется высокой консервативностью и видоспецифическими отличиями рибосомальных генов.

Поскольку в ограниченных временных рамках диссертационного исследования, целью которого являлось конструирование тест-системы для ПЦР, получение положительной контрольной ДНК гельминтов других видов было достаточно проблематичным, нами с помощью компьютерной программы Megalign из пакета программ Lasergene (DNASTAR, США) был проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 18S рРНК Ascaris lumbricoides, Diphyllobothrium latum,Clonorchis sinensis, Echinococcus granulosus, Fasciola hepático, Hymenolepis diminuta, Hymenolepis nana, Necator americanus, Opistorchis viverrini, Paragonimus westermani, Strongyloides stercoral, Taenia solium, Trichinella spiralis. В ходе компьютерного выравнивания и сравнительной структурной оценки представленных в банке генов нуклеотидных последовательностей выявлены участки гена 18S рРНК Ascaris

lumbricoides, не имевшие гомологии с последовательностями сравниваемых генов указанных гельминтов, к которым при использовании программы PrimerSelect пакета программ DNAStar (Lasergene, США) (любезно предоставленного ФГБУН Институт биохимии и генетики УНЦ РАН) было подобрано несколько пар праймеров. Особое внимание при этом было уделено соответствию 3' концевых участков праймеров уникальным последовательностям ам-плифицируемых фрагментов, что является необходимым условием специфичной ПЦР. Однако для дальнейших исследований была отобрана лишь одна пара AscarFor и AscarRev (Патент РФ № 2424525 от 20.07.2011), которая обеспечивала надежную наработку ампликонов 489 пн гена 1 SSpPHK Ascaris lumbricoides.

Проверка работоспособности сконструированной системы. Работа изначально проводилась на контрольной ДНК зрелой особи Ascaris lumbricoides, для выделения которой использовался метод Грэхэма (Graham G., 1978) с некоторыми модификациями, что позволило нам получить контрольную ДНК Ascaris lumbricoides в достаточном количестве и необходимого качества. Для этого была определена её исходная концентрация в контрольном образце, которая составила 66 нг/мкл.

В дальнейшем раствор контрольной ДНК Ascaris lumbricoides использовали в серии экспериментов для опытной отработки оптимального режима амплификации. В результате проведенных исследований был выбран следующий: начальная денатурация — 94° С (2 мин); 10 циклов, включая денатурацию при 94° С - 10 сек, отжиг праймеров и синтез ДНК при 65° С — 1 мин; 20 циклов, включая денатурацию при 94° С - 10 сек., отжиг праймеров при 61° С - 50 сек, синтез ДНК при 72° С - 30 сек. Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 1% агарозном геле и после окрашивания бромидом этидия (10 мин.) при постоянном напряжении 150 В с 5-минутным преэлектро-форезом. В качестве электролита для электрофореза оптимальным оказался 0,5 X боратный буфер (0,089 M трисНС1, рН=7,9; 0,089 M борная кислота, 0,002 ЭДТА, рН=8,0). В результате в ходе визуализации в ультрафиолете констатировалась надежная амплификации фрагментов размером 489 пн.

Чувствительность разработки. Для оценки чувствительности разработки в дальнейшем был приготовлен ряд 10-кратных серийных разведений контроль-

ной ДНК Ascaris lumbricoides: 10"', 10"2, 10"3, 10"4 и 10"5, по 1 мкл каждого исследовали методом полимеразной цепной реакции в приведенном выше режиме. Каждую серию опытов повторили 5 раз. В результате проведенных исследований положительные результаты ПЦР были получены с разведениями КГ1, 10"2, 103, 10ц, что составляло, по нашим расчетам, минимально детектируемую концентрацию контрольной ДНК Ascaris lumbricoides 6,6 пкг/мкл или примерно соответствовало количеству тотальной ДНК в 5-8 клетках 1 особи Ascaris lumbricoides.

Специфичность подобранной пары праймеров была оценена двумя способами: посредством компьютерного сравнительного выравнивания известных нук-леотидных последовательностей наиболее распространённых в нашей стране гельминтов и опытным путем при исследовании образцов, содержащих в своем составе кроме контрольной ДНК, также ДНК других организмов, в том числе человека, Enterobius vermicularis, Giardia lamblia и E. coli, которые могут встречаться в клинических образцах. При проведении ПЦР с данными образцами на форе-грамме обнаруживалась только одна полоса, соответствующая по размеру ожидаемому продукту амплификации (489 пн) фрагмента гена 18S рРНК Ascaris lumbricoides.

В связи с тем, что использованный нами при выделении контрольной ДНК Ascaris lumbricoides метод Грэхэма (Graham G., 1978) отличается трудоемкостью и не стандартизировал, а в клинических образцах, как правило, присутст-вовуют ингибиторы ПЦР (Мавзютов А.Р. с соавт., 2003), нами была проведена сравнительная оценка эффективности нескольких стандартных коммерческих систем для выделения ДНК, которые могли обеспечить эффективность диагностики аскаридоза. В частности были выбраны наиболее широко представленные на отечественном рынке наборы «ДНК сорб А» («Интерлабсерис», Россия), «ПРОБА-НК» («ДНК-технология», Россия) и «ДНК экспресс» («Литех», Россия).

Для этого в качестве образцов были использованы образцы кала пациентов, содержание в которых яиц Ascaris lumbricoides было подтверждено методом овоскопии после предварительного его обогащении по Калантарян, Фюллебор-ну и др. При использовании для выделения ДНК из 4 образцов кала, заведомо содержащих яйца Ascaris lumbricoides, набора «ПРОБА-НК» искомые амплико-

ны были выявлены в 2, при использовании наборов «ДНК сорб А» искомые продукты ПЦР обнаружены во всех 4 положительных контрольных образцах кала, тогда как при использовании для выделения набора «ДНК экспресс» искомые ампликоны выявить не удалось. Таким образом применительно к ПЦР в кале фрагментов ДНК Ascaris lumbricoides наилучшие результаты были получены при использовании для выделения ДНК наборов «ДНК сорб А» («Интерлабсе-рис», Россия). В ходе дальнейших испытаний наборов для выделения нуклеиновых кислот непосредственно в нативном клиническом материале нами были получены аналогичные результаты (рис. 1).

Рис. 1. Сравнительная оценка эффективности нескольких стандартных наборов

для выделения нуклеиновых кислот (НК) из клинических образцов Примечание: треки 19-34 и 35-51 - ДНК выделена набором «ДНК сорб А» («Ин-терлабсервис», Россия); треки 3-17 - ДНК выделена набором «ПРОБА-НК» («ДНК-технология», Россия); треки 52-60 - ДНК выделена набором «ДНК экспресс» («Литех», Россия); треки 1,2- отрицательный контроль; 18,43, 45 - положительный контроль.

Уровень заболеваемости детского населения РБ. Для обоснования наиболее адекватной возрастной группы обследуемых аскаридозом, необходимой для сравнительной оценки информативности новых методов лабораторной диагностики при данной патологии, проанализирована эпидемиологическая ситуация по исследуемой инвазии в РБ за 2007-2011 гг. На долю аскаридоза

в структуре нематодозов, составлявшей в РБ 62,4% от всех паразитозов, 9% приходилась на инвазию Ascaris lumbricoides. При этом средний показатель заболеваемости по республике исследуемой инвазии за анализируемый период составил 7,6+0,4 °/00оо 0,4 на 100 гыс. населения с наиболее активным вовлечением в эпидемический процесс по аскаридозу детей в возрасте 0-14 лет (27,7±2,0°/00оо), которые в чем более 7 раз, превосходили по его интенсивности у лиц старше 15 лет (3,6±0,3°/оооо) (рис. 2).

Среди детского населения максимальные исходные уровни заболеваемости аскаридозом выявлялись у детей в возрасте 1-2 и 3-6-ти лет (38,9 ± 6,0 °/оооо и 45,5±5,0 7оооо), что явилось объективным основанием объединения их в когорту детей 1--6-ти летнего возраста (рис. 3).

0/0000

30 -25 ~ 20 15 H 10 5 0

27,7

7,6

•^'■-'ХХМ

3,6

дети

взрослые

Рис. 2. Заболеваемость аскаридозом среди различных групп населения Республики Башкортостан в 2007-2011 гг.

Обобщенный показатель заболеваемости исследуемой патологии в данной группе (45,2 ± 5,2 "/«юо) более двух раз превосходил аналогичное значение, регистрируемое у школьников 7-14 лет (19,0 ± 1,1 °/00оо). Однако эти данные не согласуются с существующими представлениями о наибольшей пораженное™ аскаридозом детей 7-14 лет и указывают на значительный сдвиг заболеваемости на младшие возрастные группы (1-6 лет), на долю которых приходилось 74% от общего числа детей заболевших исследуемой инвазией. Вместе с тем указанное послужило обоснованием необходимости проведения исследований

по оценке эффективности нашей разработки на подобной группе больных, представленной детьми с подозрением на аскаридоз в возрасте 1-6 лет. При этом результаты сравнивались с таковыми, полученными у детей 7-14 и взрослых старше 15 лет с клиническими признаками исследуемой инвазии, а также на одноименных когортах здоровых лиц.

Для комплексной оценки диагностической эффективности разработанного метода «Способа специфической детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания» (патент РФ № 2424525 от 20.07.2011) нами был проведен ряд исследований, направленных на определение чувствительности, специфичности, прогностической ценности положительного и прогностической ценности отрицательного результатов по сравнению с наиболее широко применяемым в настоящее время методом микроскопии.

§5

IVN

\/Ч/ VÎNÎ

чл/:

1-2

7-14

Рис. 3. Заболеваемость аскаридозом в отдельных возрастных группах детского населения Республики Башкортостан в 2006-2011 гг.

Необходимо отметить, что при сравнительной оценке информативности нашей разработки иммуноферментный метод сознательно не использовался, поскольку он ориентирован на детекцию специфических иммуноглобулинов различных классов и в большей степени отражает интенсивность специфического иммунного ответа, что, безусловно, также имеет значение при диагностике. Тогда

как наша разработка предназначалась для выявления специфических компонентов самого паразита в клиническом материале, чему по диагностической направленности в большей степени соответствовала овоскопия, которая, к тому же, в настоящее время применяется наиболее широко. Для того чтобы сравнение носило максимально корректный характер в качестве основного исследуемого материала использовали образцы фекалий, исследуемые и при овоскопии. Кроме того исследование крови оправдано лишь на протяжении достаточно короткой фазы миграции личинок, зафиксировать время начала и окончания которой для взятия крови не представляется возможным. Тогда как, учитывая высочайшую чувствительность ПЦР и исходя из того, что клеточный детрит фекалий может содержать стабильные молекулы ДНК паразита вне зависимости от стадии его развития, в фекалиях вероятность их специфической детекции бьша наиболее высока.

Чувствительность метода определяли, как процент положительных в ПЦР образцов фекалий, полученных от пациентов с микроскопически потдвержден-ным диагнозом аскаридоз по формуле ЧТ= ИП х 100%/ (ИП+ЛО). Специфичность определяли как процент отрицательных образцов фекалий, полученных от здоровых, которые признаны здоровыми в результате применения нашей разработки, от общего количества здоровых проверенных с помощью данного метода диагностики по формуле СП= ИО х 100% / (ИО+ЛП).

Прогностическая ценность положительного результата (вероятность заболевания при положительном результате ПЦР) определяли как процент образцов фекалий больных с микроскопическим (МК) выявлением Ascaris lumbricoides, подтвержденным с положительным результатом ПЦР по формуле: ПЦП=ИП х 100%(ИП +ЛП), а прогностическую ценность отрицательного результата- по формуле ПЦО= ИО х 100%/ (ИО+ЛО).

При сравнительной оценке информативности обнаружения Ascaris lumbricoides в фекалиях больных методами микроскопии и ПЦР было установлено, что ПЦР-детекция указанных паразитов обеспечивала чувствительность исследования - 93,8%, специфичность - 100%, прогностическую ценность положительного результата - 100% и прогностическую ценность отрицательного - 86% (табл. 1).

Таблица 1

Информативность МК и ПЦР при лабораторной диагностике аскаридоза _на ранней кишечной стадии

4-х польная таблица

Метод результат больные (п=209) группа сравнения (п=80) чс, % СП,% ДЭ,% ПЦ+ ,% ПЦ-, % РР, % КА х2 Р

МК + 124 (ИПр) -ш- 10 (ЛП) 59,3 87,5 64,9 93,9 75,7 37,7 10,2 49,2 0,001

- 85 (ЛО) 70 (ИО)

ПЦР + 196 (ИПр) *** +++ 0(ЛП) 93,8 100,0 89,3 100,0 86,0 71,6 72,8 228,9 <0,001

- 13 (ЛО) 80 (ИО)

Примечание: показатель рассчитан с поправкой Йетса.

Учитывая, что основными факторами передачи Ascaris lumbricoides являются объекты внешней среды (почва, вода), обсеменяемые сточными водами, а также фекалиями диких и домашних животных, нами была проведена серия (Лысенко АЛ., 2005) исследований образцов почвы и воды, искусственно конггаминиро-ванных яйцами Ascaris lumbricoides. Для оценки параметров чувствительности и специфичности разработанной нами тест-системы указанные обсемененные образцы параллельно исследовались методами копроовоскопии (табл. 2,3).

В результате проведенных исследований было установлено, что показатель «разности риска» микроскопии состав™ лишь 11,1%. Это свидетельствует о низкой прогностической значимости результата микроскопии, а низкий коэффициент (1,7%) - о слабой связи между прогнозом и исходом исследования. Тогда ПЦР-детекция яиц Ascaris lumbricoides в почве характеризовалась чувствительностью 79,8%, специфичностью - 90%, прогностической ценностью положительного - 93,4% и прогностической ценностью отрицательного результатов - 71,4% (табл. 2).

Лабораторное исследование искусственно обсемененных образцов воды яйцами аскарид также показало, что овоскопия уступала по чувствительности и специфичности методу ПЦР. Высокий показатель «разности риска» ПЦР свидетельствовал о его высокой прогностической значимости результата, полученно-

го данным методом, а высокий коэффициент асимметрии свидетельствовал о значительной связи между прогнозом и исходом исследования (табл. 3).

Таблица 2

Информативность методов лабораторной детекции яиц Ascaris lumbricoides в почве

4-х польная таблица

M ет од результат образцы почвы содержащие яйца аскарид (п=89) контрольные образцы почвы (п=50) чс, % СП, % ДЭ, % пц +, % ПЦ- РР, % КА х2 Р

M + 29(ИПр)++ 28(ЛП) 32,6 44,0 36,7 51,0 26,8 22,0 0,36 6,32 0,0071

К - бО(ЛО) 22(ИО)

П ц + 71(ИПр) *** +++ 5(ЛГ1) 79,8 90,0 83,5 93,4 71,4 64,9 35,5 60,1 <0,001

р - 18(JIO) 45(ИО)

Примечание: показатель рассчитан с поправкой Йстса.

Таблица 3

Информативность методов лабораторной детекции яиц Ascaris lumbricoides в воде

4-х польная таблица

образцы

Метод результат воды содержащие яйца аскарид (п=69) контрольные образцы воды (п=24) чс, % СП, % ДЭ, % пц +,% пц РР, % КА х2 Р

МК + 49(ИПр) 14(ЛП) 71,1 41,6 63,5 77,8 33,3 11,1 1,7 0,79 >0,05

- 20(ЛО) Ю(ИО)

ПЦР + 58(ИПр)* +++ 2(ЛП) 84,0 91,7 86 96,6 66,6 63,3 58,0 41,4 0,001

- 11 (Л О) 22(ИО)

Примечание: локазатель х рассчитан с поправкой Иетса.

В результате проведенных исследований кала методом ПЦР с использованием нашей разработки специфические фрагменты ДНК Ascaris lumbricoides были выявлены в 196 случаях (93,8%) из 209 образцов от детей с диагнозом аскаридоз.

В 13 случаях (6,2%) ПЦР дала отрицательный результат. При исследовании 80 образцов фекалий здоровых детей все полученные результаты были отрицательными.

Учитывая, что информативность выявления полимеразной цветной реакцией Ascaris lumbricoides, установленная в ходе наших исследований, оказалась существенно выше, что могло внести изменения в существующие представления о симптоматике аскаридоза, нами были дополнительно проанализированы клинические особенности этого заболевания у обследованных детей.

Рис. 4. Наличие сопутствующих заболеваний у пациентов основной группы 1 и контрольной группы 2

В частности среди детей с подтвержденным методом ПЦР диагнозом аскаридоз девочки составили - 115 случаев (55,02%), мальчики - 94 (44,8%). Кишечный период болезни характеризовался симптомами общей интоксикации. Из жалоб преобладали указания на слабость, головную боль и субфебрильную температуру (табл. 5). Наиболее часто основному заболеванию сопутствовали аллергические высыпания на коже различной локализации, контактный и атонический дерматит, зуд кожи. Отмечены сухой кашель и приступы бронхиальной астма. Однако доминирующими и наиболее разнообразными были дипепсические явления в виде неустойчивого стула, наличия непереваренных остатков пищи в испражнениях, вздутие и урчание живота, запоры. Отмечался болевой абдоминальный синдром, нарушения, тошнота, горечь во рту. Со стороны кожных по-

кровов имели место зуд и/или покраснение в области заднего прохода (анальная экскориация), выпадение волос, ломкость ногтей. Констатировались увеличение печени и лимфатических узлов. В каждом 3 случае аскаридоза у детей лабора-торно выявлялись снижение уровня гемоглобина, железодефицитная анемии. В результате проведенных исследований были получены новые необходимые педиатру данные о клинических особенностях ранней кишечной стадии аскаридоза у детей, когда лабораторная диагностика при использовании существующих методов наименее эффективна.

Таблица 5

Клинические симптомы аскаридоза в кишечном периоде болезни

Клинические симптомы п % М/п % Д/п %

Слабость 115 55,0 35 16,0 80 69,5

Головная боль 19 9,0 4 1,0 15 78,9

Лихорадка (субфебрильная) 15 7,0 2 0,96 13 86,6

Нарушение сна и 5,0 5 2,4 6 54,5

Аллергический синдром 78 37,0 22 10,5 56 71,0

Сухой кашель 25 11,0 15 7,1 10 40,0

Дисфункция ЖК'Г 82 39,0 40 19,1 42 51,2

Запоры 16 7,0 7 3,3 9 56,2

Неустойчивый стул 26 12,0 15 7,1 11 42,3

Боль в животе 94 44,9 42 20,0 52 55,3

Нарушение аппетита 22 10,0 7 3,3 15 68,1

Тошнота, горечь во рту 16 7,0 5 2,4 11 68,7

Анальный зуд 11 5,0 9 4,3 2 i 8,1

Выпадение волос 12 5,7 3 1,4 9 75,0

Увеличение печени 16 7,0 7 3,3 9 56,2

Увеличение лимфоузлов 12 5,7 4 1,0 8 66,6

Ломкость ноггей 12 5,7 2 0,96 10 83,3

Таким образом, ПЦР существенно повышает эффективность ранней лабораторной диагностики аскаридоза и может использоваться для обнаружения Ascaris lumbricoides в объектах внешней среды (почвы, вода) при осуществлении мероприятий по саиитарно-паразитологическому контролю за их санитарным состоянием, что позволяет оптимизировать диагностическую подсистему эпидемиологического надзора за данной инвазией в целом.

выводы

1. Амплификация фрагмента 18S рРНК Ascaris lumbricoides обеспечивает специфическую детекцию Ascaris lumbricoides в клиническом материале у пациентов на различных стадиях заболевания и может использоваться в качестве соответствующего способа диагностики аскаридоза.

2. В отличие от клинико-эпидемиологического, иммунологического и микроскопического методов, полимеразная цепная реакция Ascaris lumbricoides позволяет выявлять и идентифицировать паразитов в клиническом материале в концентрации минимум — 5-8 клеток особи Ascaris lumbricoides в образце.

3. В формировании заболеваемости аскаридозом наиболее интенсивно участвует детское население с максимально равным вовлечением в эпидемический процесс детей в возрасте 1-2 и 3-6 лет с кишечной стадией инвазии. У детей больных аскаридозом, диагносцированным при использовании ПЦР, основными клиническими проявлениями кишечной стадии являлись: общей интоксикация, слабость - 115 (55%), поражение желудочно-кишечного тракта 82 -(39%) и аллергический синдром - 78 (37%).

4. «Способ специфической детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания» (патент РФ № 2424525 от 20.07.2011) информативен в различные фазы заболевания (ранний период, хро-низация), что подтверждается чувствительностью исследования 93,8% и специфичностью - 100%. Результаты исследования надежно коррелируют с данными применяемых методов и обеспечивают однозначность их интерпретации.

5. Полимеразная цепная реакция может быть использована для санитар-но-паразитологического контроля за санитарным состоянием объектов внешней среды (почва, вода).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. На основании проведенных исследований предложена диагностическая система, обеспечивающая лабораторную диагностику аскаридоза на ранних стадиях заболевания, при которых специфическая детекция Ascaris lumbricoides рутинными методами проблематична.

2. Способ специфической детекции Ascaris lumbricoides обеспечивает выявление гельминта в клиническом материале вне зависимости от фазы его развития и получение максимума диагностических данных при минимуме материальных и временных затрат в связи с "чем может использоваться для ранней лабораторной диагностики аскаридоза.

3. Диагностическая подсистема эпидемиологического надзора за аскаридозом может быть существенно оптимизирована благодаря внедрению прямого обнаружения в объектах внешней среды Ascaris lumbricoides методом ПЦР.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Баймнев Лн.Х. Разработка тест-системы для детекции Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Giardia lamblia на основе молекулярно-генетических методов / Баймиев Ан.Х., Мирсаяпова И.А., Фархутдинова A.M., Мавзютов А.Р., Валишин Д.А. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - № 9. - С. 52-53.

2. Мирсаяпова И.А. Разработка и испытание новых диагностических тестов для обнаружения Ascaris lumbricoides, Enterobius lamblia на основе применения моле-кулярно-генетических методов / Мирсаяпова И.А., Фархутдинова А.М., Баймиев А.Х., Акбашева А.О. // Вопросы теоретической и практической медицины: материалы 73-й итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых. Уфа: Изд-во БГМУ. - 2008. - Т. 1. - С. 228.

3. Фархутдинова А.М. Молекулярно-генетическая детекция гельминтов в клиническом материале / Фархутдинова A.M., Мирсаяпова И.А., Баймиев А.Х., Янбарисова Э.А., Баймиев А.Х., Мавзютов А.Р. // Вопросы практической педиатрии. - 2010. - Т. 5, № 3 - С. 39-40.

4. Шангареева Р.Х. Биоценоз кишечника детей с эхинококкозом и парази-тоценотическое сообщество с лямблиозом / Шангареева Р.Х., Очилова P.A., Фархутдинова A.M. // Фундаментальные исследования. -2011. -№ 7. - С. 159-162.

5. Янбарисова Э.А.Разработка способом молекулярной детекции гельминтов в клиническом материале на разных стадиях их развития / Янбарисова Э.А., Мирсаяпова И.А., Фархутдинова A.M., Баймиев А.Х., Мавзютов А.Р. // Клинические и теоретические аспекты современной медицины. - 2010. - С. 82-83.

Изобретения

1. Способ специфической детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания: пат. 2424525 РФ / Мавзютов А.Р., Баймиев А.Х., Мирсаяпова И.А., Фархутдинова A.M., Янбарисова Э.А.; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО Башк. Гос. Мед. ун-т. - опубл. от 20.07.2011. - Бюл. № 20.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразиая цепная реакция

МК - метод микроскопии (овоскопия)

ИФА - иммуноферментный анализ

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ЛГГУ - лечебно-прафилактическое учреждение

ГБУЗ РДКБ - Республиканская детская клиническая больница

РБ - Республика Башкортостан

Издательская лицензия № 06788 от 01J 1.2001 г. ООО «Издательство «Здравоохранение Башкортостана» 450000, РБ, г. Уфа, а/я 1293, тел. (347) 250-81-20, тел./факс (347) 250-13-82.

Подписано в печать 30.04.2013 г. Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ № 774.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фархутдинова, Алсу Мансафовна, Москва

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04 2 01 3 5 781 3 ^а пРавах рукописи

ФАРХУТДИНОВА Алсу Мансафовна

03.01.06 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.м.н., профессор А.Р. Мавзютов

Москва-2013

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Абс. - абсолютный показатель

ГБУЗ РДКБ - Республиканская детская клиническая больница

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДЭ - диагностическая эффективность

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота

ПЦ «+» - прогностическая ценность положительного результата

ПЦ «-» - прогностическая ценность отрицательного результата

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЛПУ - лечебно-прафилактическое учреждение

ИО - истинно-отрицательный результат

ИП - истинно-положительный результат

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛО - ложноотрицательный результат

ЛП - ложноположительный результат

РБ - Республика Башкортостан

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................4

ГЛАВА 1. Методология диагностики аскаридоза (обзор литературы). 10

1.1. Современные представления об эпидемиологии, патогенезе и клинике аскаридоза............................ . Ю

1.2. Характеристика существующих методов диагностики аскаридоза 21

1.3. Перспективные методы диагностики аскаридоза. Метод молекулярной диагностики..........................................................26

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования..........................32

2.1. Методология конструирования диагностической системы..........32

2.2. Характеристика методов, использованных для специфической детекции Ascaris lumbricoides............................................34

2.3. Методы статистической обработки полученных данных............38

ГЛАВА 3. Разработка тест-системы для ПНР детекции Ascaris lumbricoides. 42 ГЛАВА 4. Обоснование выбора оптимальной возрастной группы обследуемых для сравнительной оценки информативности разработанной

тест-системы 50 ГЛАВА 5. Сравнительная оценка информативности лабораторных методов исследований, применяемых для обнаружения Ascaris

lumbricoides..................................................................58

5.1. Информативность при исследовании клинического материала. ... 58

5.2. Экспериментальные исследования с образцами почвы и воды ... 64 ГЛАВА 6. Клинические особенности подтвержденного методом ПЦР

аскаридоза у детей............................................................70

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................78

ВЫВОДЫ....................................................................87

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ....................................88

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................89

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одной из основных составляющих состояния здоровья детского населения и взрослых являются протозоонозы и гельминто-зы, на долю которых приходится 99% всех паразитарных заболеваний [59]. По данным Комитета экспертов ВОЗ (2012), аскаридозом в мире ежегодно инфицируется свыше 1 млрд. человек, большинство из которых составляют дети дошкольного и школьного возраста. В Российской Федерации в 2004 году было зарегистрировано 66548 [85] человек. Особое значение при этом приобретают связанные с заболеванием осложнения (задержка физического развития, эпи-лептиформные состояния, токсико-аллергические реакции, а в тяжелых случаях - непроходимость кишечника и даже смерть от асфиксии) у детей.

Несмотря на продолжительный период внимания исследователей к указанной проблеме, реальных успехов в области лечения достичь не удалось. В этой связи наиболее эффективным способом борьбы с данной инвазией во всем мире считают раннюю диагностику заболевания. Однако общепризнанным фактом остается низкая чувствительность и специфичность применяемых в настоящее время методов (методов Като и Миура, методы обогащения (по Фюллеборну, Калантарян или Красильникову), информативных при овоскопии предварительно обогащенных проб больных с низкой интенсивностью инвазии или при диагностике поздних (хронических) стадий заболевания. Причем, даже у больных аскаридозом яйца гельминта не обнаруживаются при паразитировании особей одного пола (3-5%), неполовозрелых самок и старых самок, а также в ряде других случаев.

Ещё большей проблемой является диагностика аскаридоза в период ранней миграционной фазы заболевания, когда это наиболее востребовано клиницистами, поскольку позволяет начать специфическую терапию до появления осложнений заболевания. Для этого предложены рентгенологическая иденти-

фикация эозинофильных инфильтратов, мигрирующих в легочной ткани, а также иммунологические методы, однако, отношение к результатам их практического применения со стороны профессионального сообщества пока достаточно разноречивы [16].

В контексте вышеуказанного достаточно перспективным направлением представляется разработка способов диагностики аскаридоза на основании мо-лекулярно-генетических методов, в частности полимеразной цепной реакции, поскольку её отличает исключительно высокая чувствительность и специфичность, а с учетом небольших временных затрат, возможность использования в качестве экспресс-метода для детекции аскарид в различных клинических образцах и во внешней среде.

Задачи исследования:

1. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК Ascaris lumbricoides, представленных в GenBank/DDBJ для выявления фрагментов, применимых в качестве ДНК-мишени и конструирования на этой основе тест-системы для их детекции методом ПЦР.

2. Разработка опытного образца тест-системы для полимеразной цепной реакции Ascaris lumbricoides в исследуемом материале.

5. Составление практических рекомендаций по применению созданной тест-системы для диагностики аскаридозной инвазии и санитарно-паразитологического контроля объектов внешней среды на Ascaris lumbricoides.

Научная новизна. Впервые был проведен сравнительный анализ нук-леотидных последовательностей генов 18S рРНК Ascaris lumbricoides, Diphyl-lobothrium latum, Clonorchis sinensis, Echinococcus granulosus, Fasciola hepatica, Hymenolepis diminuta, Hymenolepis nana, Necator americanus, Opisthorchis viver-rini, Paragonimus westermani, Strongyloides stercoralis, Taenia solium, Trichinella spiralis. При этом были выявлены уникальные последовательности гена 18S рРНК Ascaris lumbricoides, не имевшие гомологии с нуклеотидными последовательностями указанных гельминтов, к которым были подобраны праймеры AscarFor и AscarRev для высокоспецифичной детекции и идентификации Ascaris lumbricoides на разных стадиях их развития.

Впервые создана тест-система для ранней диагностики кишечной стадии аскаридоза, основанная на обнаружении фрагментов гена 18S рРНК Ascaris lumbricoides. Обоснованы оптимальные условия для амплификации искомых фрагментов в различных клинических образцах от пациентов с различными клиническими вариантами аскаридоза, а также - в образцах объектов внешней среды.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты выполненной работы послужили основой патента на изобретение. Получен патент на изобретение РФ № 2424525 от 20.07.2011 на «Способ специфической детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Праймеры к фрагменту гена 18S рРНК Ascaris lumbricoides обеспечивают надежную специфическую амплификацию ампликонов Ascaris lumbricoides размером 489 пн при исследовании тотальной ДНК, выделенной из клинического материала (кал, отделяемое слизистых, кровь) и из объектов внешней среды.

2. Обоснована группа больных с аскаридозной инвазией, инфицирован-ность в которой характеризовалась наибольшими значениями, для адекватной сравнительной оценки информативности новых методов лабораторной диагностики аскаридоза, в том числе в будущих разработках.

lumbricoides (личинки, яйца) в клиническом материале вне зависимости от формы и фазы заболевания.

4. Выявление Ascaris lumbricoides с помощью ПЦР - может быть включена в официальный перечень методов диагностики аскаридоза и методов санитар-но-паразитологического контроля состояния объектов внешней среды (почва, вода), что позволит оптимизировать диагностическую подсистему эпидемиологического надзора за данной инвазией.

Апробация работы. Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры фундаментальной и прикладной микробиологии и кафедры лабораторной диагностики института последипломного образования ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, протокол№11 от 29 июня 2012 г.

Публикации. Основные материалы диссертации в полном объеме отражены в 5 публикациях, в том числе в 3 рецензируемых изданиях, 1 статья - в другом издании, 1 - в материалах конференций. Получен патент на изобретение РФ (№ 2424525 от 20.07.2011 «Способ специфической детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания»).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, глава «Материалы и методы исследования», 5 глав

собственных исследований, заключение, выводы. Список литературы включает 220 источников, в том числе 111 отечественных и 109 зарубежных авторов.

Вклад автора. Диссертация представляет собой обобщение результатов исследований, полученных автором лично. Отдельные эксперименты выполнены совместно с сотрудниками ООО ИЦ «Лаборатория» (директор В.Р. Мав-зютов) при непосредственном участии автора.

ГЛАВА 1. МЕТОДОЛОГИЯ ДИАГНОСТИКИ АСКАРИДОЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ ЭПИДЕМИОЛОГИИ, ПАТОГЕНЕЗЕ И КЛИНИКЕ АСКАРИДОЗА

Аскаридоз - геогельминтоз человека, вызываемый Ascaris lumbricoides, характеризуется аллергическим синдромом в ранней фазе, нарушением функций желудочно-кишечного тракта в поздней стадии. Аскаридоз известен со времен глубокой древности. Термин ascaridos ввел Гиппократ.

Гельминтоз широко распространен во влажных зонах умеренного, субтропического и тропического поясов, редко регистрируется в сухих степях, отсутствует в зоне вечной мерзлоты, высокогорья и пустынь. По данным комитета экспертов ВОЗ (2012), аскаридозом в мире ежегодно болеют от 1 до 1,5 млрд. человек, большинство из которых составляют дети дошкольного и школьного возраста [22, 134, 211]. Среди всех известных гельминтозов аскаридоз относится к числу наиболее распространённых паразитарных заболеваний [16, 56, 69, 93, 163]. В Африке и Юго-Восточной Азии аскаридозом поражено практически все население [92]. По данным Центра здоровья совместно с медицинскими университетами Исламской Республики Иран при обследовании 53995 человек в возрасте от 2 лет на долю Ascaris lumbricoides пришлось 1,5% из общего числа проведенных анализов [163].

В Российской Федерации ежегодно регистрируется около 1 млн. больных паразитарными болезнями, более 40 тыс. из них - дети (201 на 100 тыс. детского населения), и это число увеличивается. По экспертным оценкам истинное количество их может достигать 20 млн. человек, а больных нематодами

выявляется более 2 млн. [16, 67, 72, 79]. В 2004 году, в Российской Федерации, было зарегистрировано 66 548 случаев заболевания аскаридозом, что составляет более 25% от общего числа всех больных гельминтозами [11].

В странах ближнего зарубежья по данным медицинской статистики также отмечается рост числа паразитарных заболеваний, это связывают с низком уровнем благосостояния населения этих стран, а также климатическими условиями, благоприятными для распространения данной нозологии [5, 108]. Так, заболеваемость аскаридозом в Республике Кыргызстан с 2002 г. по 2007 г. выросла с 67,5 до 159,9 (на 100 тыс. населения), чему способствовали особые климатические условия этого региона. В течение года наблюдалось повышение заболеваемости аскаридозом в летне-осенний период. Максимальное выявление инвазированных путем исследований фекалий приходится на ноябрь-декабрь после окончания относительно теплого времени года, соответствующего периоду заражения аскаридами (апрель-октябрь) [106].

По данным Центра Госсанэпиднадзора в Республике Башкортостан за последние пять лет на долю больных аскаридозом приходится от 3,1 до 4,2% всех случаев больных гельминтозами. В течение 2003-2006 гг. в научно-исследовательской лаборатории «БиоЛаб» кафедры биологии Башкирского государственного медицинского университета проводилось обследование населения РБ на пораженность паразитарными болезнями с применением формалин - эфирного метода исследования фекалий. Из числа обследованных (1458 человек) аскаридоз выявлен в 3,9% случаев [61].

В формировании очагов инвазии основную роль играют неблагоприятные санитарно-бытовые условия [86], исследователи считают почву главным фактором передачи возбудителей аскаридоза. В сельских местностях, где все туалеты выгребного типа, санитарная культура низкая, домовладения неблагоприятно устроенные и обсемененность яйцами гельминтов выше, чем в городах [60, 85].

На долю инфицированных детей приходится 70% всех зарегистрированных случаев аскаридоза, заражение ребенка нематодами происходит фе-

кально-оральным путем (через рот) при непосредственном контакте с землей, песком (на даче, в песочнице), через загрязненные предметы (игрушки, одежду, обувь, постельное белье, пол), при употреблении в пищу растительную продукцию непосредственно с грядок, огородов (ягоды, овощи, фрукты), посредством насекомых (мух, тараканов, муравьев), при контактах с животными (собаки, кошки) [38].

Эпидемиологической особенностью аскаридоза является то, что это классический геогельмитоз, т.к. основным фактором передачи заболевания является земля. При попадании яиц в почву с фекалиями человека начинается их жизненный цикл, продолжительность которого зависит от температуры и влажности окружающей среды. В зоне умеренного климата сезон заражения длится до семи месяцев с апреля по октябрь, в условиях теплого влажного климата - круглый год [97, 114]. По данным литературы считается, что более благоприятны для развития аскариды почвы глинистые, черноземные и илистые, �

Информация о работе

Фархутдинова, Алсу Мансафовна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка и оценка информативности нового способа детекции Ascaris lumbricoides при паразитарных заболеваниях у детей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы