Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и испытание препаратов пролонгированного действия рекомбинантного соматотропного гормона свиньи и сурфагона

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка и испытание препаратов пролонгированного действия рекомбинантного соматотропного гормона свиньи и сурфагона"

На правах рукописи

Колоскова Елена Михайловна

РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ ПРЕПАРАТОВ ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО СОМАТОТРОПНОГО ГОРМОНА СВИНЬИ

И СУРФАГОНА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Боровск 1997

Работа выполнена в лаборатории иммунобиотехнологии Всероссийског научно-исследовательского института физиологии, биохимии и питани сельскохозяйственных животных.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

В.А. Галочкин Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Ю.Н. Шамберев, доктор биологических наук, профессор И.К.Медведев Ведущее учреждение - Всероссийский институт животноводства

Защита диссертации состоится " % Ь " 1997 г. н;

заседании Диссертационного Совета Д 020,17.01 при Всероссийски

научно-исследовательском институте физиологии,биохимии и питана сельскохозяйственных животных.

Адрес института: 249010, г. Боровск-3, Калужская область,

ВНИИФБиП с/х животных

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан " % Ъ " лЛсиХ 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат сельскохозяйственных наук Г. В. Дворянчикова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Для профилактики заболеваний, лечения и имуляции продуктивности традиционные схеыы многократного инъеци-вания животных дороги, трудоемки и стрессогенны. Использование гпаратов пролонгированного действия (ППД) значительно более кнологично.

Подавляющее большинство ведущихся в мире разработок по созданию Д решает медицинские аспекты их применения. Но в связи с резко эрастающим внедрением белковых и пептидных препаратов генноинже-эного и химического синтеза в ветеринарию и животноводство *буется создание пролонгированных форм этих биологически активных цеств (БАВ). В настоящее время детально исследовано влияние дельного введения свиного и бычьего рекомбинантных соматотропных змонов (рСТГс и рСТГб) на обмен веществ и продуктивность животных га1п М.Л. е1 а1., 1993 ; Кольчик В.А. и др., 1994). Во многих >анах применяют пролонгированные формы рСТГб американских фирм жсанто" и "Эли Лилли", длительность действия однократной инъекции ?орых достигает 14 и 28 суток соответственно. Но пролонгированные >мы рСТГс, приготовленные по аналогичной технологии, неэффективны, :мотря на то, что оба гормона близки по основным физико-химическим >йствам. Из колоссального количества запатентованных разработок до : пор нет надежного ППД рСТГс, что резко ограничивает возможность > использования.

Гипоталамические пептиды, в частности, гонадолиберин и его [тетические аналоги, в силу видонеспецифичности и значимости |иологической роли, широко примененяются как в медицине, так и в ютноводстве. Манипулируя уровнем содержания этого регуляторного [тида в организме, можно целенаправленно воздействовать на производительную функцию человека и животных, нормализуя, мулируя или угнетая ее. ППД этого релизинг-фактора для животно-ства также отсутствует.

Цели и задачи исследований: Одной из целей настоящей работы мы сматриваем необходимость накопления опыта для разработки ППД рСТГс :урфагона, а также многочисленных других биологически активных еств белковой и небелковой природы, потребность в которых будет тоянно возрастать. Перспективны и имеют самостоятельный научный ерес и практическую значимость работы по созданию высокоэффектив-вакцин пролонгированного действия, способных вызывать более

длительный и выраженный антительный эффект, чем при иммунизацк традиционными способами. Разработка матриц-носителей, как основнь компонентов пролонгирующих систем, при более широком взгляде н проблему, позволит создавать и гранулированные сорбенты различног назначения, и латексы, и активировать иммунологические планшеты дл тест-систем имыуноферментного анализа. Данную работу мы посвятил попытке создания, характеристики и первичной апробации ППД рСТГс сурфагона, поэтапно решая следующие задачи:

1. Из отечественных биосовместимых, биодеградируемых материале (полимерных соединений и низкомолекулярных полимериэующихся веществ изготовить матрицы-носители, микросферы (МС) и/или микрокапсулы (МК) удобные для парентерального введения животным обычной инъекцией способные удерживать иммобилизованные в них указанные БАВ; высвобож дать их с различной скоростью в заданном временном отрезке.

2. На основе модельных соединений, сходных по ряду физнко химических характеристик с выбранными для .пролонгирования БАВ отобрать лучшие образцы матриц и в экспериментах in vitro количес твенно оценить динамику выделения иммобилизованных в них модельны веществ.

3. В опытах in vitro количественно описать кинетику выделени рСТГс и сурфагона из наиболее подходящих матриц.

4. Разработать средуноситель для парентерального введения МС высокой степенью гомогенности и стойкости; достаточной вязкостью дл поддержания микрочастиц в суспендированном состоянии; хороше шприцуемостыо; биосовместимостью с организмом животного; самостоя тельным пролонгирующим эффектом.

5. В экспериментах на лабораторных животных оценить носители и М< по скорости и степени их деградации в организме и влиянию н прилегающие ткани.

6. Разработать дозы и схемы введения полученных ППД рСТГс i сурфагона на животных.

1. Оценить в опытах на животных эффективность полученных препаратов, основываясь на биохимических, физиологических и зоотехнически: показателях.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервьк показана возможность создания ППД на основе поли-Ы-винилкапролак тайных (ПВК) термогелей ППД БАВ белковой и пептидной природы Полу^рны полиакриламидные (ПААГ) микросферы с различными высокомолекулярными наполнителями, универсальные для создания пролонгиро-

анных форм как низко-, так и высокомолекулярных БАВ пептидной рироды. Предпринята успешная попытка создания масляных носителей с амополимеризующейся и биодеградируемой поверхностью в условиях рганизма. Усовершенствованы способы получения микросфер, позволяющие ущественно снизить их размер.

В экспериментах на лабораторных н с/х животных на примере 17ААГ МС оказана возможность создания для сурфагона и рСТГс ППД, способных оддерживать достаточно высокую концентрацию гормонов и вы-зывать оответствующие метаболические изменения на протяжении 2-х недель.

Приобретенные звания послужат основой для создания удобных в (рименении ППД БАВ различных спектров действия. Созданные ППД рСТГс I сурфагона могут быть предложены для применения в практике.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы (сложены на 2-й Международной конференции "Актуальные проблемы ¡иологии в животноводстве" (Боровск, 1995); на совместном заседании >тделов биотехнологии, питания и регуляции метаболизма и проективности животных ВНИИФБиП с/х животных (Боровск, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 1бзора литературы, собственных исследований и их обсуждения, включения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 164 :траницах машинописного текста, содержит 13 рисунков, 4 фотографии 1 13 таблиц. Список литературы - 244 источника, в т.ч. на иностранных языках - 175.

Положения, выносимые на защиту:

1. На основе отечественных материалов возможно создание ППД рСТГс i сурфагона, работающих на протяжении 2-х недель и более.

2. Микросферы на основе ПААГ способны выделять иммобилизованные сурфагон и рСТГс с различной скоростью в зависимости от химической природы молекул-наполнителей и степени сшивки геля.

3. Скорость выделения иммобилизованного в целлюлозных микросферах рСТГс и сурфагона зависит от соотношения растворимых и нерастворимых компонентов матрицы, метода приготовления ыикросфер и химической природы конкретных биологически активных веществ.

4. Созданные ППД сурфагона при проверенных схемах введения животным способны угнетать половую функцию как самцов, так и самок, вызывая снижение концентрации половых стероидных гормонов, позволяя улучшить зоотехнические показатели.

5. Разработанные ППД рСТГс способны при однократной инъекции

поддерживать повышенную концентрацию гормона в крови свиней в течени 2-х недель и вызывать изменения в обмене веществ, сходные с таковым при ежедневных инъекциях.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ,

2.1. Материалы и методы изготовления иикросфер

Для изготовления ПААГ МС использовали акриламид, метиленбисак-риламид (НПФ "Мобитек"), тетраметилэтилендиамин ("Реанал"), персульфат аммония ("Реахим"). Формирование МС осуществляли методок эмульсионной полимеризации (Войшвилло Н.Е. и др., 1978). В качестве внешней фазы использовали растительное рафинированное масло с добавкой 1-1.5% эмульгатора Span 85 ("Sigma").

Альбуминовые МС готовили из бычьего или свиного сывороточного альбумина (БСА и ССА) (НПФ "Мобитек") по способу Yapel A.F. (1985) в нашей модификации.

Для изготовления целлюлозных МС использовали ацетилцеллюлозу (АЦ) и ацетилфталилцеллюлозу (АФЦ), растворимую при рН выше 7 (ВИИСП, Г.Владимир). МС получали методом выпаривания растворителя (Солодовник В.Д.,1980) и методом двойного эмульгирования (Лебеденко В.Я. и др., 1980). Изготавливали МС с различным соотношением АЦ/АФЦ компонентов.

Для получения лолиэтилцнанахрилатиых (ПЭЦА) МС использовали свойство алкклцианакрилатов полимеризоваться в присутствии элек-трондонорных частиц. МС получали методом выпаривания растворителя, а МК - методом межфазной полимеризации (Lenaerts F. et al. , 1990).

Полн-Н-виннлкапралактаиные (ПВК) МС готовили из нового отечественного полимера, любезно предоставленного сотрудниками Московского Института Тонких Химических Технологий, стабилизацией эмульсии полимера фенольными соединениями, внесенными во внешнюю фазу.

Размер МС или МК. зависел от скорости перемешивания эмульсии и эмульгатора, используемого во внешней фазе. Проблему уменьшения размеров частиц до 50 мкм удалось решить предварительном многократным, интенсивным встряхивание двухфазной системы.

Метод двойного эмульгирования для иммобилизации рСТГс в целлюлозных МС оказался неудачным: наряду с многоядерными и одинарными МС в смеси присутствовало большое количество инвертированных частиц, содержащих БАВ на поверхности, а также полимерных пленок и свободного БАВ, вышедшего из МС, разрушенных в результате интенсивного перемешивания. Процент БАБ, заключенного в полимерное покрытие, не превышал 40-50. Размер МС составлял 20-1000 мкм.

ПЭЦА МС отличались очень мелкими (до 5 мкм) размерами, ПЭЦА-шкрокапсулы - 15-20 мкм, обладали эластичной оболочкой, толщина :оторой зависела от количества введенного в реакцию мономера.

2.2. Материалы и методы приготовления носителей для микросфер.

В качестве основы брали пищевые рафинированные растительные масла

[ медицинское вазелиновое масло. Предпочтение было отдано смесям на >снове растительных масел с загустителями: а) пчелиный воск в ^отношениях от 85:15 до 95:5 Ж; б) моностеарат алюминия (mStAl) в :оотношении от 90:10 до 95:5 %. Полученные носители отличались щнородностью, стабильностью, достаточной вязкостью, хорошей шрицуемостью.

Основываясь на свойствах зтилцианакрилата (ЭЦА), была предпринята юпытка получения носителя, способного при контактах с тканями и :идкостями организма спонтанно образовывать биодеградируемую олимерную оболочку, который получали на основе масел с воском или iStAl. Недостатком такого носителя является низкая стабильность: за недели хранения при комнатной температуре ЭЦА частично поли-¡еризовался внутри масла и его последующая способность к пленко-бразованию при контакте с жидкостью уменьшалась.

2.3. Растворимость и стабильность рекомбинантного свиного сома— тотропного гормона в процессе приготовления микросфер.

Использованная нами цинковая соль рСТГс американской фирмы Pitman ioore обладает чрезвычайно низкой растворимостью и склонностью к ыстрому образованию биологически неактивных димеров и более крупных грегатов.

Для приготовления ПААГ МС и ПЭЦА МК необходимо использовать гысококонцентрировавнные растворы (до 10%) гормона, приготовленные . использованием хаотропных агентов. 0.2 М Трис-НС1, рН 7.4 с 30% ргинин-HCl дает возможность получения 10% растворов этого белка, .криламид оказывает аналогичное мочевине и аргинину влияние на астворимость рСТГс. При определении иммунологической активности оматотропина, экстрагированного из гомогенатов ПААГ МС, она оответствовала 90-95% исходного количества. Добавление низко-юлекулярных Сахаров, глицерина до 20%, декстрана до 10% (w/v) :табилизировало растворы в течение длительного времени без значительных потерь активности гормона при 37°С (Blum A. et al., 1986).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Опыты in vitro по выделению иммобилизованных веществ

Опыты in vitro по определению длительности выделения иммобилизованных в МС веществ проводили в 0.05 М ФСБ, рН 7.4 с 0.05% NaNj Навеску МС помещали в диализный мешок с размером пор до б кДа дл изучения выделения низкомолекулярных веществ (бромфенолового синег (БФС) и сурфагона), или в диализный мешок, пропускающий молекул! свыше 70 кДа (для рСТГс и гемоглобина). О скорости выделения вещест. судили по изменению их концентраций в буфере, измерявшихся различным) методами в зависимости от состава МС, физико-химических свойст] материала матрицы и выделяемого соединения.

Контролем служил процесс диализа неиммобилизованного вещества.

3.1.1. Динамика выделения из полиакриламидных микросфер.

Определяли влияние плотности, степени сшивки матрицы ПААГ МС i высокомолекулярных наполнителей на скорость высвобождения низкомолекулярных веществ. Готовили МС следующих соотношений Т/С: 40/5, 40/10, 40/20, 25/10, 25/5, а также 25/5, содержащих 20% декстрана 701 (w/v, "Merck"), 25/5, содержащих 10% ПВП м.м. 10000 Да ("Sigma") i качестве высокомолекулярного наполнителя. Нагрузка БФС составляла I мг на 1 мл общего объема МС. За выделением красителя следили п< изменению оптической плотности при длине волны 492 нм.

Для сурфагона были приготовлены ПААГ МС следующего состава: 25/5/10% ПВП (10 000 Да); 25/5/10% ПВК (100 000 Да); 25/5/2% альгинат натрия; 25/5/2% гепаринат; 25/5/5% БСА.

Концентрацию выделившегося пептида определяли по калибровочному графику, построенному для сурфагона. Оптическую плотность измеряли при длине волны 280 нм.

Если процесс диализа навески низкоыолекулярных веществ заканчивался в среднем за 5-8 часов, то иммобилизация БФС в ПААГ МС (Рис.1) способствовала растяжению сроков выделения красителя до 48 часов с более. Скорости диффузии красителя практически in' зависели от размера пор геля: менее, чем за 10 часов высвобождалось более 50% исходного его количества. Совместная иммобилизация БФС с высокомолекулярными наполнителями (Рис.2) продлевала выделение красителя из матрицы. Если из ПААГ МС 25/5 50% БФС высвободилось менее, чем за 10 часов, тс совместная иммобилизация с высокомолекулярными декстраном или поливинилпирролидоном (ПВП) существенно замедляла диффузию. Так как ни декстран, ни ПВП в растворах не образуют с БФС прочных химических связей, то изменение скорости диффузии вещества мы связываем с уменьшением свободного внутреннего объема геля за счет высокой концентрации наполнителя, неспособного при данных параметрах матрицы

¡ффундироцать из нее. С увеличением количества наполнителя уменьшатся свободный объем геля и коэффициент диффузии иммобилизованного :щества.

!с.1. Динамика выделения БФС из ПААГ МС в зависимости от плотности матрицы и степени ее сшивки.

О 5 10 24 48 72

1С.2. Динамика выделения БФС из ПААГ МС при совместной иммобилизации с высокомолекулярными наполнителями.

%

50

К - диализ

1 - 25/5/10 ПВП 40 КДа

2 - 25/5/10 ПВК 100 КДа

3 - 25/5/2 альгинат натрия

4 - 25/5/2 гепаринат

5 - 25/5/5 ЧСА

0

2 3 4 5 6 7 8

10 сутки

Рис.3. Динамика выделения сурфагона из ПААГ МС при совместной иммобилизации с высокомолекулярными наполнителями.

Более ощутимый эффект достигается при совместной иммобилизац низкомолекулярного вещества с полимерами, способными вступать с н в химические взаимодействия (Рис.3). Если диализ сурфагона заканчив ется менее, чем за сутки, то его иммобилизация в ПААГ МС 25. совместно с 10S ПВП позволила выделиться за этот период мен половины пептида, а полное высвобождение пептида произошло за суток. Замена ПВП таким же количеством ПВК, склонным вступать гидрофобные взаимодействия с соединениями белковой природы (Mai квичева Е.А. и др.,1994), сделала этот процесс еще более продолж! тельным. Введение в состав МС полианионов резко замедлило выделеш пептида: кривая стала более пологой, половина исходного количест! иммобилизованного вещества поступила в раствор за двое суток. Процес высвобождения оставшегося количества пептида длился еще неделю почти равномерной скоростью, причем если кривые сначала практическ совпадали, то последнюю семь дней линия выделения из МС с альгинатс натрия шла ниже, чем с гепаринатом. При совместной иммобилизаци сурфагона с альбумином речь может идти о совокупности всех возможны химических контактов: высвобождение пептида протекало равномернее но не дольше, чем в. двух последних примерах.

3.1.2. Динамика выделения низкомолекулярных веществ из альбуминовых микросфер.

Выясняли влияние концентрации альбумина и степени его сшивки •лютаровым альдегидом (ГА) на скорость выделения низкомолекулярных 1еществ. Кривая выделения БФС (Рис.4) на всем протяжении эксперимента ¡мела почти одинаковый наклон, что свидетельствует о равномерности юступления красителя в раствор. Эксперимент длительностью 12 суток юдтвердил зависимость скорости выделения БФС от плотности матрицы I степени ее сшивки: изменение концентрации альбумина с 20 до 30% при >дном и том же количестве ГА (1%) делает матрицу менее жесткой и, ¡ледовательно, ее поры более эластичными. Скорость выделения БФС в таких МС была выше. Увеличение количества ГА до 3%, при одной и той се концентрации альбумина, наоборот, жестко закрепляет матрицу, ^меньшая скорость диффузии иммобилизованного вещества.

Подобные результаты получены и для сурфагона, иммобилизованного 5 аналогичных матрицах (Рис.5). Однако, несмотря на большую, чем у 5ФС, молекулярную массу, скорость выделения пептида была выше. Так, 50/1 МС за 12 суток освободили более половины исходного количества тептида, тогда как за этот же срок выделилось всего 30% красителя, {арактер выделения двух ниэкомолекулярных веществ существенно Различался. Если скорость выхода БФС была практически линейна на 1ротяжении всего эксперимента, то для сурфагона, высокая вначале, :корость выделения замедлилась спустя 2 суток.

%

30

20

10

0

диализ

БСА/ГА 20/3 БСА/ГА 20/1 БСА/ГА 30/1

0

2

4

6

8

10

сутки

Рис.4. Динамика выделения БФС из БСА МС различной плотности и степени сшивки глютаровым альдегидом.

Сравнение динамики высвобождения разных веществ из матриц одинакового состава наглядно демонстрирует индивидуальную специфику каждого случая иммобилизации.

Рис.5. Динамика выделения сурфагона из альбуминовых микросфер

различной плотности и степени сшивки глютаровым альдегидом.

3.1.3. Динамика выделения сурфагона из полн-Н-винилкапролактаы-ных гидрогелей

Основываясь на интереснейших свойствах растворов поливинилкап-ролактамов и его сополимеров образовывать гели при физиологических условиях, проверяли динамику выделения при 3 7° С (Рис.6). В качестве стабилизаторов испытывали БСА и декстран сульфат (ДС) в препаратах следующего состава: 1) раствор полимера + сурфагон; 2) раствор полимера + БСА + сурфагон; 3) раствор полимера + ДС + сурфагон. Для работы брали сополимер винилкапролактама с виниловым спиртом (85:15%) молекулярной массы 200000 Да. Концентрация полимера в растворе была 10%, высокомолекулярных наполнителей - 5%, сурфагона - 1%. К каждому препарату делали контроль аналогичного состава, не содержащий сурфагон.

Для полного выделения пептида из раствора 1 понадобилось 3 суток: за первые сутки высвободилось более 50%. Совместная иммобилизация с БСА привела к более длительному выделению сурфагона (35% за первые сутки, 70% за трое суток). Использование ДС еще более замедлило процесс выделения пептида (20-25% за сутки): к концу 3-х суток

юловина его исходного количества осталась не израсходованной.

'ис.б. Динамика выделения сурфагона из поли-И-винилкапролак-тамных термогелей при 37° С. 1 - ПВК; 2 - ПВК + БСА; 3- ПВК + ДС.

Полученные результаты можно объяснить слабым прямым вэаимодей-:твием сурфагона с испытуемым сополимером, тогда как высокомолеку-тярные стабилизаторы, связываясь с ПВК, сорбируют на себе пептид, :корость выделения которого определяется силой его взаимодействия со :табилизатором-наполнителем.

3_. 2. Опыты in vivo по оценке ПЧД рСТГс

Для широкого использования рСТГс в практике необходима разработка эго новых пролонгированных форм, поскольку специфические свойства гормона абсолютно исключают копирование пролонгированных форм, существующих для рСТГб.

Целью ряда экспериментов, проведенных в условиях вивария ВНИИФБиП :/х животных, было испытание действия исходного кристаллического рСТГс и "растворимого" гормона, полученного лиофилизацией раствора рСТГс: аргинин*НС1 (1:3, w/w), суспендированных в носителе - масло:4% nStAl. Препараты инъецировали подкожно в заушную область шеи подсвинкам живой массой 40 кг, разделенным на две группы (по 3 головы в каждой) (Таб.1). Каждому животному обеих групп вводили по 100 мг рСТГс однократно в общем объеме носителя 2 мл. Животным 1-й группы инъецировали кристаллический гормон, суспендированный в носителе вазелиновое масло:4% mStAl, животным 2-й группы - лиофилизированный состав в том же носителе. Кровь брали перед инъекцией и ежедневно после нее для определения концентрации СТГ методом ИФА (Галочкин В.А. и др., 1991).

У животных 1-й группы концентрация СТГ в крови практически не изменялась, но у животных 2-й группы резко повысилась на 3-й день

Концентрация сомаготропина в крови подсвинков после введения масляных суспензий гпрСТГс различной растворимости.

г р У п п ы концентрация соматотропина, нг/мл

Взятия крови, сутки

0 1 2 3 4 5 6 7 8

1 1.1 + 0.3 1 .5± 0.5 3.5 + 0.6 2. 2± 0.4 1 .8± 0.6 1 .2± 0.4 0.б± 0. 1 0. 7± 0.3 0.5 + 0.2

2 1.0 + 0.3 1.1 + 0.2 2 . 2 + 0.3 15. 0 ±6.0 20. 0± 10 .0 9.8+ 0.7 3.0 + 0.6 1 .3± 0.4 0.9 + 0.3

и вернулась к базальному уровню только на 7-е сутки. Полученные результаты свидетельствуют о неэффективности гормона, введенного в исходной кристаллической форме. Использование в ППД рСТГс, лиофи-лизированного из раствора с аргинином более эффективно.

Поиск более эффективно работающих форм рСТГс был продолжен в следующих вариантах (Таб.2): 1) суспензия кристаллического рСТГс; 2) эмульсия раствора рСТГс (30% аргинин, 1% сульфозтилцеллюлоза, 0.2 М Трис-НС1 буфер, рН 7.8); 3) лиофилизированный раствор рСТГс с аргинином. Во всех 3-х группах носитель - соевое масло с 4% ш51А1. Препарат вводили подкожно из расчета 40 мг гормона на голову. Кровь брали из ушной вены перед инъекцией и ежедневно после инъекции. Животным первой группы вводили состав 1, второй - состав 2, третьей -3. В каждой группе было по 3 взрослых кролика.

Результаты, полученные на кроликах, еще раз подтвердили неэффективность кристаллической формы рСТГс. После введения эмульсии раствора рСТГс в носителе, повышенная концентрация гормона сохранялась на протяжении двух недель. Гормон растворяли с сульфоэтил-целлюлозой - полианионом, взаимодействующим с электронакцепторными аминокислотными группами, дополнительно стабилизирущим белок в растворе. Эффективность эмульсии рСТГс в проведенном эксперименте была сравнимой с действием, оказываемым ведением суспензии лиофи-лизата рСТГс с аргинином. Полученные на кроликах результаты по эффективности эмульсий рСТГс в дальнейшем проверили экспериментах на свиньях.

Динамика изменения концентрации рСТГс в крови кроликов после введения его препаратов пролонгированного действия

г р У п п ы Концентрация свиного соматотропина, нг/мл

Взятия крови, сутки

0 1 2 3 4 5 8 9 14

1 0.2 + 0.1 1 . 2* 0. 1 0. 6± 0. 1 0.3* 0.05 0.4* 0.2 0.3* 0.1 0. 1 + 0.05 0.2;* 0.1 0. 3±_ 0.1

2 0 .1± 0.03 1 . 5* 0. 1 1 . 1± 0.05 1.1* 0.2 0.9± 0.2 0. 8± 0. 1 1 . 4* 0.2 1.3* 0.3 1 .8± 0.2

3 0.5± 0.05 1.б± 0.2 1 .0± 0.1 - - 1 .5± 0.2 1 .4* 0.3 - -

Сравнивали также эффективность введения в масляный носитель ■илцианакрилата, модификации кристаллического рСТГс лиофили?ацией о растворов с некоторыми низко- и высокомолекулярными веществами иммобилизации гормона в ПААГ МС (Таб.3).

Таблица 3

Динамика изменения концентрации соматотропина в крови свиней после введения ППД на основе лиофилизированных препаратов

рСТГс.

группы концентрация соматотропина, нг/мл

Взятия крови, сутки

0 1 2 3 5 7 9

1 0.7 + 0.3 23.0+ 2.0 6.3± 0.4 3 .0+ 0.8 0 . 5± 0. 1 0.4± 0.2 0.5.+ 0.3

2 0.4 + 0.2 18.0 + 2.0 4.0.+ 0.3 3. 2± 0.3 2.0+ 0.2 1 .1± 0.3 0.9+. 0.2

3 0.7 + 0.2 16.0 + 1 .0 4.3 + 0.3 3. 1 + 0.3 1. 4± 0.2 1.7± 0.3 1 .5+ 0.2

4 0.5+ 0.1 18 ,0± 2.0 3 ,5± 0.5 0. 7+. 0.2 1.4 + 0.5 1.0* 0.3 0.5

Были подготовлены четыре опытные группы свиней (по 3 животных в

каждой), которым вводили следующие составы:

1. Суспензия лиофилизированного рСТГс/аргинин-НС1 (l:3,w/w) в

носителе соевое масло/10% воск.

2. Суспензия лиофилизированного рСТГс/аргинин-НС 1 (1:3,w/w) в

носителе соевое масло/10% воск/4% этилцианакрилат (w/w/w).

3. рСТГс, иммобилизованный в ПААГ МС (25/2.7, лиофилизированы),

суспендированных в носителе соевое масло/4% mStAl.

4. Суспензия лиофилизированного раствора полиакриламид (500000

Да)/аргинин-НС1/рСТГс (1:3:1, w/w/w) в носителе соевое масло/4% mStAl.

Введение полимеризующихся добавок в носитель позволило продлить действие ППД до 9 суток. При введении рСТГс в ПААГ МС, на протяжении последних 4-х суток концентрация гормона держалась на уровне, в два раза превышающем базальный. Сравнение результатов, полученных на животных 3-й и 4-й опытных групп, показало эффективность иммобилизации БАВ в жесткой матрице ПАА геля.

3.2.1. Изучение эффективности действия ППД рСТГс на метаболические процессы у боровков.

В экспериментах на подсвинках-боровках, проведенных совместно с американской фирмой "Pitman Moore", проверяли действие различных ППД рСТГс на основе водно-масляной эмульсии гормона и гормона, иммобилизованного в ПААГ МС, в разных носителях. Целью эксперимента было: 1) проверить эффективность иммобилизации рСТГс в ПААГ МС, как одного из способов пролонгирования, по сравнению с водно-мас-ляными эмульсиями, 2) проверить эффективность масляных носителей с различными загущающими агентами.

Были выбраны две масляные фазы-носители: носитель 1 - соевое масло/10% моностеарата алюминия, носитель 2 - соевое масло/16% пчелиного воска. Подготовлены два состава рСТГс: 1 - ПААГ МС со стабилизирующими добавками; 2 - стабилизированный раствор рСТГс. Сформированы 4 опытных и 2 контрольных группы животных, которым вводили: 1-1 опытная группа - состав 1 в носителе 1; 1-2 - состав 1 в носителе 2; 2-1 - состав 2 в носителе 1; 2-2 - состав 2 в носителе 2.

Формы 1-1 и 1-2 готовили равномерным перемешиванием МС в масляной основе. Формы 2-1 и 2-2 готовили с получением мелкой и устойчивой эмульсии. Каждому животному из всех опытных групп однократно вводили по 100 мг рСТГс в соответствующей форме.

Были сформированы две контрольные группы животных: К.+ - группа

положительного контроля (каждому животному ежедневно инъецировали по 3 мг рСТГс в растворе буфера); К- - группа отрицательного контроля интактных животных. В каждой опытной и контрольной группе было по 5 боровков-аналогов по породе, возрасту, полу с живой массой 40 кг. Боровков кормили стандартным рационом, сбалансированным по всем питательным и биологически активным веществам. Содержание животных -групповое, по 5 голов в клетке.

Основными биохимическими критериями эффективности действия рСТГс были выбраны: содержание неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК) в крови, как показатель, характеризующий соотношение процессов липолиза и липогенеза, и уровень азота мочевины крови, интегрирование отражающий соотношение скоростей протекания процессов биосинтеза и деградации белков.

Уровень соматотропина в сыворотке определяли методом радиоиммунологического анализа. Концентрацию мочевины и уровень неэстерифицированных жирных кистот определяли на биохимическом анализаторе крови фирмы Boehringer Mannheim/Hitachi. Статистическую обработку полученных данных проводили по Стьюденту (Плохинский, 1978).

У животных всех опытных групп в первые двое суток после инъекции наблюдали резкий выброс в кровь соматотропина (Таб.5), уровень которого снижался к 5-м суткам, но оставался повышенным у животных 1-2 опытной группы в течение двух недель. При ежедневном введении раствора гормона (К+ группа) его концентрация, как было установлено ранее [неопубликованные лабораторные данные], снижалась до физиологической нормы менее чем за 16 часов. Поэтому в образцах срови, взятых перед введением очередной дозы гормона, его уровень :оответствовал базальному.

В результате повышения в крови уровня соматотропина изменялись метаболические процессы в организме опытных и К+ животных (Таб. 6,7). Увеличение синтеза белков подтвердилось падением концентрации азота <очевины. Резкое уменьшение уровня азота мочевины крови почти 5четверо по сравнению с базальными значениями сразу после инъекции 1ПД сопровождалось его постепенным повышением до исходного содержания (К-) в течение 7 суток для животных 2-2 группы и на протяжении почти 14 суток для боровков других опытных групп. У животных 1-2 опытной -руппы этот показатель в течение недели держался ниже значений К+ группы и к концу двухнедельного отрезка времени еще не достигал значений К- группы. Ежедневные инъекции соматотропина животным К+ триводили к почти двукратному падению уровня азота мочевины,

сохранившемуся на протяжении всех двух учетных недель. Высоким концентрациям соматотропина соответствовали низкие значения азота мочевины.

Таблица 5

Концентрация соматотропина в крови боровков контрольных и опытных групп

г р У п п ы концентрация, нг/мл

Взятия крови, сутки

0 1 2 3 5 7 9 12 14

К+ 2.0 +0.2 1.9 ¿0.3 2.3 ±0.3 2 . 1 ±0.4 1.0 ±0.2 2.3 10. 4 2.9 ±0.7 1.8 ±0.3 1.9 ¿0.2

К- 1 .8 + 0.3 1.7 10.2 2.2 +0.4 1 .3 10. 3 2.5 +0.6 2.4 ±0. 3 2.0 1:0.2 2.3 ±0.2 2.3 ±0.4

1-1 1 .9 + 0 . 3 37.0* 18.2 12. 1 1 +2.9 7 .5 1 11.8 4.52 ±1.2 3. 2 ±0.6 4.8' +0.5 1.1 ±0.2 1.3 ¿0.3

1-2 1.7 ¿0.4 35 .4 1 17 .7 21.9 1 14.2 17 .9 ' ±3 . 5 9 .0 1 ±0.9 5.5 ' +0.4 6.1' ±0.8 4 .5 1 ±0.6 3.45+0.7

2-1 2.2 ±0.5 20 .9 1 ¿4.4 11.0 ' 12.5 9.0 ' + 1.8 7.1 ' + 1 .6 3.0 ±0.5 2.8 ±0.6 1 .8 ±0.4 0.9 ±0.2

2-2 1. 8 +0.3 22 .5 1 15 .0 10.8 { + 3.3 8.6 1 12.0 6.5 < + 1 • 7 4.12 10 .8 2.5 ±0.4 2.5 ±0.5 1 .9 ±0.6

1 - Р < 0.01, 2 - Р < 0.05, относительно величин К- группы

за те же сутки

Судя по результатам концентрации обоих показателей, поддержание

соматотропина в крови на уровне 7-10 нг/мл является оптимальным для достижения и сохранения требуемого физиологического действия -понижение концентрации мочевины в крови и повышение содержания неэстерифицированных жирных кислот.

У животных К+ группы ежедневное введение соматотропина повлекло за собой увеличение содержания неэстерифицированных жирных кислот в среднем в два раза относительно исходного уровня. У животных опытных групп повышение концентрации НЭЖК наблюдали на протяжении 3-х суток в группе 2-1, и до конца эксперимента в группе 1-2.

Уровень азота мочевины в крови боровков контрольных и опытных групп

г р У п п ы концентрация, мг/100 мл

Взятия крови, сутки

0 1 2 3 4 5 7 9 12 14

К+ 17.4 ¿2.5 12.Г ±1 .7 12 .0 ' ±2.0 11.3' +2.6 11.2' ±1.9 10.8' ±2.1 10.7' ±2.7 10.4' ±2.1 10.7' ±2.6 10.9' ±2 . 1

к- 17.6 ¿2.9 17.8 ±4.2 17.4 + 3 . 1 16.9 ±3 . 3 16. 4 ±2. 1 16.8 +2.9 16.8 ±3.3 17.6 ±2.9 17.6 ±2.6 17.7 ±2.7

1-1 18.2 ±1.6 6.4' + 1 .2 5.б' ±1 .3 7.8' ±1.2 9. 3 ' ±2.0 11.7' + 3.0 14.0 ±2.9 15.6 + 2.5 16.3 ±3.6 17.7 ±3.2

1-2 18.8 + 0.6 б .4 ' ±1 .1 5.7' ±1.8 5.7' ±0.6 5.5' + 1 . 3 6.4' ±2.0 10.2' ±2.0 12.6' ±1.7 16. 1 + 2.3 14.02 ±2.0

2-1 16.7 ±1.3 5.7' ±0.3 9.8' ±0.7 11 .б' ±1.3 13.5' ±1 . 2 14.0 + 1.9 14.4 + 1.5 12.5 ±1.1 15.9 ±0.7 18.1 ±1.3

2-2 16.9 + 1.1 6.71 ±1.1 10.2' ±0.2 12. О2 ±1.4 13.4 ±0.7 15 . 9 ±1.4 18.1 ±0.5 16.6 ±1.3 19.4 ±0.2 18.5 ±0.9

1 - Р < 0.05, 2 - Р < 0.1, относительно величин К- группы

за те же сутки

Высокие значения концентрации НЭЖК соответствовали повышенному уровню соматотропина и низким значениям азота мочевины в крови опытных животных. Полученные данные убедительно свидетельствуют об усилении процессов липолиза в организме животных, вызванных высоким содержанием соматотропина.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о принципиальной возможности применения как эмульсионных ППД рСТГс, так и ППД на основе ПААГ МС.

Сравнение действия водно-масляной эмульсии с ПААГ МС, суспендированными в том же носителе, говорит о преимуществе микросфер, значительно продлевающих выделение гормона. Сопоставление пролонгирующих свойств использованных нами носителей заставляет отдать предпочтение составу соевое масло: воск (84:16%). Таким образом, предложенный нами ППД рСТГс на основе ПААГ МС 15-20% в носителе соевое масло:воск эффективно работал 14 суток.

Содержание неэстерифицированных жирных кислот в крови контрольных и опытных животных

г р У п п ы концентрация, мг%

Взятия крови, сутки

0 3 4 5 7 9 12 14

К+ 0.05 +0.01 0. 06 ±0.02 0.06 +0.02 0 .07 + 0 .02 0.10 ±0.05 0.09 ±0.05 0.09 ±0.04 0.09 ±0.03

К- 0.06 ±0.01 0. 05 ±0.01 0.05 ±0.01 0 .06 ±0.01 0.08 ±0.04 0.09 ±0.03 0.08 ±0.04 0.05 ±0.01

1-1 0.05 ¿0.01 0. 15 1 ±0. 06 0.08г +0.03 0 .05 + 0 .01 0.05 +0.01 0.05 ±0.01 0.06 Í0.02 0.09 ±0 . 02

1-2 0 .05 ±0.01 0. 17 ' ±0. 07 0.15' ±0.08 0.14' ±0 .03 0. 10 ±0.02 0.07 ¿0.03 0.08 ±0.03 0.07 ±0.01

2-1 0 .06 ¿0.02 0.082 ±0. 03 0.08г ¿0.02 0.06 ¿0 .01 0.09 ±0.02 0.06 ¿0.01 0.06 ±0.01 0.05 ±0.01

2-2 0 .05 + 0.01 0. 07 ¿0.01 0.04 ±0.01 0.07 ±0 .02 0.08 ±0.03 0.07 ¿0.01 0.08 +0.02 0.05 + 0.01

1 - Р < 0.02, 2 - Р < 0.1, относительно величин К- группы

за те же сутки

3.3. Опыты iá vivo по оценке ППД сурфагона

Для исследования действия ППД сурфагона на состояние половых органов и уровень половых гормонов крыс-самцов были испытаны 4 типа микросфер с иммобилизованным пептидом: 1) АЦ/АФЦ 1:1 (w/w); 2) АЦ/АФЦ 3:1; 3) ПЭЦА; 4) БСА/ГА/ЭЦА 20/1/10. Все типы микросфер содержали по 1% сурфагона (w/w).

В качестве основы для поддержания МС в суспендированном состоянии и инъецирования брали водный раствор 1% гидроксиэтилцеллюлозы с 4% Декстрана 70Т и 0.85% NaCl.

Опыт проводили в Кардиологическом Медицинском Центре АМН РФ на пяти группах взрослых крыс-самцов средним весом 250 г. Физиологическая доза препарата для достижения необходимого эффекта составляла 2.5 мкг/сутки на крысу (Сюткин Е.А. и др., 1986). Однократная

нъецируемая доза, исходя из предполагаемого срока действия 10-14 уток, составляла 25 мкг пептида на одно животное. Инъекции осу-ествляли подкожно, трижды, с двухнедельными интервалами. Животным онтрольной группы вводили плацебо. Крыс до и во время эксперимента одержали на стандартном рационе. Убой животных проводили через б уток после третьей инъекции. У крыс брали кровь для определения энцентрации тестостерона, семенники и предстательную железу для звешивания. Содержание тестостерона определяли методом радиоиммун-эго анализа с помощью стандартных наборов (Таб.8).

У животных всех опытных групп к концу эксперимента произошло гшжение средней массы семенников на 17-30% по сравнению с интактными рысами. У крыс первых трех опытных групп наблюдали снижение знцентрации тестостерона и уменьшение массы предстательной железы, лтературные данные говорят о снижении массы половых органов и ченьшении концентрации половых гормонов под влиянием действующих тительное время повышенных концентраций гонадолиберина или его лнтетических аналогов в крови (Ригг В..Т.А. е1 а1, 1985). Наши ре-рльтаты, полученные для животных первых трех опытных групп, нахо-атся в соответствии с литературой, свидетельствуя об эффективности аботы предложенных ППД.

Таблица 8

Вес семенников, предстательной железы и концентрация тестостерона в крови крыс-самцов после курса обработки ППД сурфагона.

г р У п средняя масса семенников средняя масса простаты средняя концентрация тестостерона

п п ы мг % мг % нг/мл %

1 б 1.65±0.3 4 ' 70 - 80 1.07+0.46 85

2 б - 80 0 . 39*0.06 2 76 0.8210.19 ' 66

3 б 1 .82+0.18' 78 0 .35^-0. 08г 78 0.79±0.07 ' 64

4 5 1.95+0.222 83 0.45*0.06 100 1.35*0.37 107

К 7 2.34+0 . 19 100 0.4б±0.10 100 1.26*0. 15 100

1 - Р < 0.02, 2 - Р < 0.2 относительно контрольной группы

Не исключено, что спустя несколько суток после введения препарата 4 происходил выброс гормона, активирующий половую систему жи-вотных, который затем сопровождался более длительным и умеренным выделением сурфагона, что приводило к уменьшению веса семенников и секреции тестостерона. Следующая инъекция снова запускала эту вол-ну и, уменьшившиеся в массе, но не потерявшие способность к стероидогенезу, семенники вновь вырабатывали тестостерон. Нет гарантии, что проведенный в другие сроки убой животных не дал бы результат, сходный с таковым для других опытных групп.

Необходимо отметить, что изменения в результате введения того или иного ППД не являются максимально возможными при принятой нами схеме инъецирования: применив другую схему введения препаратов, вероятно, мы могли получить иной результат.

В экспериментах на половозрелых свинках с целью подавления их репродуктивной функции для повышения мясной продуктивности животных на откорме, проведенных совместно с НИИ животноводства Литвы, проверяли эффективность ППД сурфагона на основе ПААГ МС состава: АА/МБА 30/5 %, альгинат натрия - 2%, сурфагон - 1% от общего веса микросфер, в носителе медицинское вазелиновое масло: 10% воска ) . Были отобраны свинки средней массой 60 кг: три группы по 15 голов в каждой. Свинки находились на групповом содержании со стандартным рационом кормления и групповым учетом поедаемости кормов.

Животным первой группы препарат вводили двукратно с промежутком 14 дней, животным второй группы - трижды через 10 суток. Пре-парат инъецировали подкожно в заушную область шеи, независимо от фазы полового цикла свинок. Контрольной группе препарат не вводили. После последней инъекции свинок наблюдали еще 2 месяца: следили за наступлением охоты, учитывали привесы и затраты корма (Таб.9).

За первый месяц эксперимента среднесуточный прирост живой массы свинок первой опытной группы был выше, чем у животных контрольной группы (618+18 г) на 130 г, а у второй - на 100 г. За последующих 2 месяца наблюдения ежесуточные привесы свинок всех групп были примерно на одинаковом уровне. За время опыта свинками 1-й группы было затрачено меньшее количество кормов с большей эффективностью. Эффективность оплаты корма животными 2-й опытной группы практически не отличалась от таковой у свинок контрольной группы.

Влияние пролонгированных препаратов сурфагона на потребление свинками кормов за время опыта (3 месяца)

группы потреблено корма на одну голову за опыт, кг затрачено корм, ед. на получение 1 кг привеса затраты кормовых единиц за опыт

1 258 4.21 283

2 271 4 .35 298

к 264 4.67 295

Наблюдение за состоянием охоты показало, что после первой ъекции свинки обеих опытных групп пришли в охоту практически нхронно через 3-5 суток: первичный выброс сурфагона привел к зникновению охоты у большинства опытных животных. Произошла исываемая в литературе синхронизация овуляции (Карамышев А. и ., 1994) аналогом гонадолиберина. Ни одна из свинок, пришедших в оту после первой инъекции, после 2-й и 3-й инъекции больше не □являла ее признаков, но 2 и 3 животных соответственно из 1-й и 2-й упп, не пришедшие в охоту после первой инъекции, после второй эявили ее признаки. Через 3 месяца после начала эксперимента в эту пришли б животных из опытных групп. У свинок контрольной группы эта была регулярной.

Сравнивая эффективность различных схем применения препарата можно гдложить для практического использования: с целью синхронизации эты свинок на животноводческих комплексах применять однократную ьекцию проверенного в данном эксперименте ППД; для повышения свесов свинок и выбракованных свиноматок в откормочный период шенять двукратные инъекции с интервалом 2 недели.

Выводы

1. Освоены и разработаны методы получения микросфер размером от :кольких единиц до нескольких сотен микрометров из полиакрила-;ного геля, производных целлюлозы, сывороточного альбумина, шцианакрилата и нового отечественного полимера - поли-Л-винил-1ролактама. Показано отсутствие отрицательных влияний созданных ППД ткани, прилегающие к месту инъекции. Изучена скорость рассасывания :ителей и физическое состояние микросфер через различные отрезки

времени после введения.

2. В экспериментах in vitro и in vivo показана принципиальная возможность регулирования скорости выделения низко- и высокомолекулярных БАВ из ПААГ микросфер при совместной их иммобилизации с молекулами-наполнителями различной химической природы.

3. Впервые предпринята успешная попытка создания масляного самополимеризующегося депо с включением этилцианакрилага, работающего в течение 9 суток, способного на месте введения в организм в физиологических условиях спонтанно образовывать вокруг себя биосовместимую, биодеградируемую полимерную пленку, возобновляющуюся по мере деградации ее поверхностного слоя.

4. Отработаны условия, в которых раствор рСТГс способен сохранять свою биологическую активность в течение длительного времени при достаточно высоких концентрациях гормона.

5. Разработанный ППД рСТГс на основе ПААГ микросфер в носителе растительное масло:воск обеспечивает поддержание в крови животных повышенной концентрации гормона роста в течение 2-х недель, обусловливающую усиление процессов липолиза и протеосинтеза.

6. Препарат пролонгированного действия сурфагона, иммобилизованного в ПААГ микросферах вызывает: при однократной инъекции -синхронизацию охоты у свинок; при 2-х или 3-х кратных инъекциях с интервалами 10-15 суток - угнетение половой функции свинок, улучшение усваиваемости корма и увеличение среднесуточного привеса.

7. Поли-Л-винилкапролактам и его сополимеры являются перспективным материалом для создания простых в изготовлении и удобных для применения на практике ППД БАВ различной химической природы.

8. Информация, полученная в процессе работы с низко- и высокомолекулярными модельными соединениями и результаты испытания пролонгированных форм рСТГс и сурфагона могут быть положены в основу создания широкой серии новых ППД БАВ как белковой, так и небелковой природы для нужд животноводства.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Галочкин В.А., Эрнст Л.К., Колоскова Е.М. и др. Иммунобио-зхнологический подход к регуляции репродуктивной функции, обмена гществ и продуктивности животных. // Сельскохозяйственная биология.

1994. - N2. - С.3-19

2. Колоскова Е.М., Галочкин В.А. Испытание пролонгированных форм виного соматотропина. // Проблемы физиологии, биохимии, биотехнологи

питания с/х животных. Отчет ВНИИФБиП с/х жив. - 1994. - с.186

3. Колоскова Е.М., Кривошеев О.Н., Галочкин В.А. и др. Влияние ролонгированных форм сурфагона на репродуктивные органы и концен-рацию тестостерона в крови крыс-самцов. // Там же, С.188

4. Колоскова Е.М. Динамика выделения ниэкомолекулярных веществ из х пролонгированных форм в условиях in vitro. // Там же, С.189

5. Колоскова Е.М. Кинетика выделения низкомолекулярных веществ, «мобилизованных в полиакриламидных и альбуминовых микросферах. // ктуальные проблемы в животноводстве. Тез. докл. 2-ой Международной онференции, Боровск. - 1995. - С.134-135

6. Колоскова Е.М. Сравнительная оценка действия пролонгированных орм рекомбинантного гормона роста свиней. // Там же,

.135-136

7. Колоскова Е.М., Кривошеев О.Н., Набатчикова H.A. Испытание ролонгированных форм сурфагона в опытах на крысах-самцах. //

ам же, С.136