Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени

Малеев, Григорий Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени"

МАЛЕЕВ Григорий Владимирович

□034Э270В

РАЗРАБОТКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ДНК-ЗОНДОВ ДЛЯ ЛИГАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 2009

003492706

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физиологически активных веществ РАН Научный руководитель доктор химических наук

Балакнн Константин Валерьевич

Научный консультант Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович доктор биологических наук, доцент Баймиев Алексей Ханифович доктор биологических наук, Белявский Александр Вадимович Химический Факульет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится декабря 2009 г. в /Л&Ь часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН и на сайте ИБГ УНЦ РАН http://ibg.anrb.ru/dissov.html. e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан " _2009 г,

Ученый секретарь Объединенного диссертационного совета, к.б.н.

Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Передовые достижения в области ДНК- и РНК-диагностики в настоящее время в значительной мере связаны с разработкой методов детекции продуктов полимеразной и лигазной цепных реакций в режиме реального времени (ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ). Главными их достоинствами являются возможность более точного количественного определения детектируемого генетического материала в образцах, а также снижение риска ложнопозитивных результатов вследствие контаминации. Последнее обстоятельство особенно важно при проведении массовых анализов, при которых непросто обеспечить стерильные условия, необходимые для манипуляций с генным материалом. Преобладающие в настоящее время варианты ПЦР-РВ в основном связаны с использованием гибри-дизационных зондов или сложных праймерных структур, отличающихся высокой стоимостью и способных тормозить ход реакций. Очевидным ресурсом, в ряде случаев способным заменить ПЦР, является лигазная цепная реакция [Вагапу, 1991]. Определенные трудности в детекции целевых продуктов ЛЦР привели к тому, что ЛЦР оказалась незаслуженно недооцененной, несмотря на значительное число работ, демонстрирующих более высокую чувствительность этой реакции по сравнению с ПЦР при диагностике инфекционных патогенов. Можно отметить ряд положительных особенностей метода ЛЦР-РВ по сравнению с классической методикой, а также методом ПЦР. Во-первых, это простота детекции результатов, не требующей электрофоретического разделения сложных смесей. Во-вторых, для ЛЦР достаточно "обломков" молекул ДНК или РНК размером всего около 40 звеньев, что очень важно, так как из материала, доступного для анализа (биопсийные препараты, следы крови, продукты питания и пр.), не всегда удается выделить нуклеиновые кислоты крупного размера. Учитывая сказанное, работы по созданию улучшенных гибридизационных зондов, а также усовершенствование подходов к детекции специфических фрагментов ДНК и РНК при помощи метода ЛЦР являются высокоаюуальными. Цель и задачи исследования. Целью работы является разработка новых флуоресцентных ДНК-зондов и разработка на их основе новых методов детекции ДНК и РНК при помощи ЛЦР в режиме реального времени.

В задачи исследования входило:

1. Разработать новый вариант ЛЦР-РВ, основанный на детекции результатов за счет свечения специфичного к двуцепочечной ДНК красителя SYBR Green I.

2. Разработать новые олигонуклеотидные зонды на базе полициклических ароматических флуорофоров пирена и перилена, чувствительных к молекулярному микроокружению и основанных на эффектах эксимерной флуоресценции и изменения анизотропии флуоресценции.

3. Разработать новые схемы детекции продуктов ЛЦР-РВ, основанные на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

4. Оптимизировать условия проведения новых разработанных вариантов ЛЦР-РВ в отношении количества реагентов, состава реакционных смесей, времени и температуры реакций, используемых ферментов.

5. Испытать новые варианты ЛЦР-РВ для решения ряда актуальных практических задач в области молекулярной биологии.

Научная новизна. Разработан дизайн и проведён синтез новых флуоресцентных олигонуклеотидных зондов для ЛЦР. Разработаны новые методы детекции ДНК и РНК при помощи ЛЦР-РВ. Показана возможность эффективной детекции следовых количеств ДНК и РНК с использованием новых методов флуоресцентной детекции в растворе. Предложены оптимальные системы детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени, которые далее применены для решения практически важных задач в молекулярно-генетических исследованиях и при анализе продуктов с генетически-модифицированными компонентами.

Практическая значимость работы. Расширен спектр методов высокочувствительной детекции специфичных последовательностей ДНК и/или РНК при помощи ЛЦР-РВ. Показана возможность их использования как для фундаментальных, так и прикладных целей, в том числе, для анализа биоспецифических взаимодействий нуклеиновых кислот, для проведения ДНК- и РНК-диагностики в медицине, ветеринарии, санитарно-эпидемиологических исследованиях, криминалистике, пищевой промышленности, для обнаружения возбудителей опасных инфекций, генетической идентификации личности, выявления продуктов питания из генетически модифицированных организмов, определения качества сырья и т.д. Апробация работы и публикации. По материалам данной диссертации опубликовано 5 научных статьей, в том числе, в журналах из Перечня ВАК - 4, 3 заявки

на патент (одна международная и две российских) и 8 тезисов докладов научных конференций. Результаты работы были доложены на научной сессии к 100-летию со дня рождения проф. H.A. Преображенского (Москва, 1996), всероссийской конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоёмким технологиям» (Пущино, 2001), третьем съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004), втором съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2004), третьем съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005), международном конгрессе «Тенденции в химии нуклеиновых кислот» (Москва, 2000), международном симпозиуме «Трансгенные растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2004), 2-ой международной конференции "Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда" (Пущино, 2005).

Структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 123 страницах, включает 8 схем, 40 рисунков и 10 таблиц. Список литературы включает 156 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Литературный обзор на тему «Лигазная цепная реакция и методы флуоресцентной детекции нуклеиновых кислот» (Глава 1) состоит из двух частей. В первой обсуждаются теоретические и практические аспекты использования ЛЦР для детекции нуклеиновых кислот, включая многочисленные примеры применения ЛЦР в клинических исследованиях, а также достоинства и типичные ограничения метода ЛЦР по сравнению с ПЦР. Во второй части рассмотрены базовые аспекты методов флуоресцентной детекции нуклеиновых кислот. Основное внимание уделено методам прямого проявления и системам, основанным на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), с которыми связана основная часть диссертационной работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

2. Разработка систем детекции продуктов ЛЦР на основе флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов (Глава 2)

2.1. Олигонуклеотидные зонды на основе полициклических ароматических угледоводородов

2.1.1. Пиреновый бифлуорофор с эксимерной флуоресценцией. Тетрацикличе-ский углеводород пирен интересен своей высокой чувствительностью к молекулярному микроокружению, которое способно изменять параметры его флуоресценции. Кроме того, пространственно сближенные пиреновые молекулы проявляют особый вид флуоресценции - эксимерную (от англ. excimer - excited dimer), которая также чувствительна к микроокружению. Имеются весомые теоретические предпосылки для предположения, что эксимерная флуоресценция может изменяться в зависимости от того, присоединена пиреновая бифлуорофорная система к одноцепочечному олигодезоксирибонуклеотиду (ОДН) или к дуплексной нуклеиновой кислоте. Практическая реализация этой возможности может лечь в основу детекции в реальном времени основных продуктов ПЦР и ЛЦР - накапливающейся в ходе реакции дуплексной ДНК. Для проверки этой гипотезы был синтезирован пиреновый бифлуорофор (BPF) 2.1 (Схема 1), а также его активированное производное 2.2 - соответствующий пентафторфениловый эфир, способный к образованию амидной связи. Для синтеза олигонуклеотидного коньюгата с BPF была разработана схема, позволяющая присоединить его по 5'-концу олигонуклеотида (Схема 1). Мечение олигонуклеотида dON2.3, представляющего собой обратный универсальный праймер для секвенирования в системе бактериофага М13, было проведено на твердой фазе. Меченый олигомер был использован для изучения влияния гибридизации коньюгата с комплементарной последовательностью dON2.3 на флуоресценцию метки.

Полученные данные по флуоресценции (Рис. 1) позволяют сделать вывод о том, что в данном случае имеет место сильное взаимодействие метки с одноцепочечной ДНК, препятствующее образованию эксимера и появлению соответствующего эксимерного флуоресцентного сигнала в районе 460-480 нм. При образовании дуплекса или в присутствии метанола взаимодействие бифлуорофора с ДНК уменьшается, и проявляется эксимерная флуоресценция. Можно сделать вывод, что разработанный зонд в описанных условиях является умеренно чувствительным к образованию ДНК-дуплекса, что потенциально может быть использовано при детекции продуктов ПЦР и ЛЦР. Следует, однако, отметить, что достигнутые различия флуоресцентных сигналов для одноцепочечного ОДН и соответствующего дуплекса является недостаточными для использования в практических диагностических задачах, а разработанная система в описанном виде может быть использована в первую очередь как инструмент для тео-

ретических исследований в области анализа биоспецифических взаимодействий, структуры и биологической роли нуклеиновых кислот.

£__3'

НО-| САвбАААСАОСТАТбАС |

аоыг.1

1. СМ/ИМИА

2. 2.2 ПГФ

3. водн. N143

2.1 Я = Н

ВРР-

ВРЯ

^-^.О-САввАААСАССТАТвАС сюыгг

бТССТТТОТСЙАТАСАЭ а0Ы2.3

,^о-СА(ЗвАААСА6СТАТСАС3 о

сЮМ2.2 х сГОЫ2.3

СТССТТТбТСвАТАСАе

Схема 1. Получение олигонуклеотидного зонда с пиреновьм бифлуорофором, а также соответствующей дуплексной ДНК.

Рис. 1. Спектры флуоресценции: дуплекса (Ю№.2хсЮШ.З в воде (1), олигонук-леотида (ЮШ.2 в воде (2) и в 25% водн. метаноле (3), дуплекса <ЮШ.2х(1(Ж2.3 в 25% водн. метаноле (4). Концентрация соединений 2-10^ М.

2.1.2 Зонды на основе псевдонуклеозидного пиренсодержащего флуорофора

Наиболее удобными реагентами для внедрения модифицированных структурных единиц в синтетические олигонуклеотиды являются амидофосфитные реагенты,

являющиеся основными реагентами в ДНК-синтезаторах. Был разработан метод синтеза пиренсодержащего псевдонуклеозида, а также соответствующих амидо-фосфитного реагента 23 и твердофазного носителя 2.4 (Рис. 2). Последний позволяет вводить остаток пирена в З'-конец олигонуклеотида, тогда как амидофосфит-ный реагент позволяет вводить любое число пиреновых псевдонуклеозидных единиц в любое другое положение олигонуклеотида, включая 5'-терминальное.

Рис. 2. Реагенты для введения пиреновой псевдонуклеозидной единицы (РгЬ) в состав олигонуклеотидов в ходе автоматического синтеза, а также фрагмент олигонуклеотида, содержащего в срединных положениях фрагменты РгЬ.

При помощи указанных реагентов возможно введение пиреновых остатков в любые положения синтетических олигонуклеотидных зондов, что позволяет создать различные системы детекции дуплексообразования. В настоящей работе был получен ряд олигонуклеотидных зондов (табл. 1). На их основе были получены несколько олигонуклеотидных дуплексных конъюгатов, схематически изображенных на рис. 3. Каждый из этих конъюгатов моделирует систему детекции дуплексообразования в растворе, потенциально пригодную для детекции продуктов ПЦР и ЛЦР, в том числе в режиме реального времени. Было выяснено, что флуоресценция практически каждого из полученных олигонуклеотидных зондов обладает чувствительностью к дуплексообразованшо.

Таблица 1.

Код ОДН Последовательность 5-3' Длина ОДН

ёОМ2.4 АТСТССАОСАТССССРхЬ 16

(ЮК2.5 РгЬСССААООТТООАСАС 16

<Ю№.б М^ССААСОТТСЮАСАС 15

ДОГОЛ аТОТССААССТТШСОСООАТССТООАСАТ 30

АСАСТОТОТСТСТСА.ЛОТСТ(РгЬ); 22

АСАСТТСАСАСАСАСАСТСТ 20

сЮГОЛО (Р1'Ь),АОАС'1ТОАСАОАСАСАСтТСТ 22

dON2.ll (ПЬ),АОАСТТСАСАОАСАСАСТОТ 23

dON2.12 АСАСТСТОТСТСТСААОТСТ 20

dON2.13 АТСТССАООАТСССС(РгЬ)5 20

dON2.14 вСССтАТССТСКтАСАТ 15

dON2.15 АССАТСССС(РгЬ)2ТТ(Р1-Ь),СССААОСТТ 24

dON2Л6 АТОТСС(Р1Ь),ОАТСССС 15

dON2.17 СССОАТС(РгЬ)2ССАСАТ 15

ИМИ 1)1111)1

^ Л Н 11

(2.4Н2.5)-(2.7)

I I I I I II Г'11 ГГТП I ^11 Н I I II 1 I II I (2.4). (2.«)-(2.7)

I I I I I) I I II I I I I I I I I Н (2-8)-(2.9)

Ч I I I I I I I И I I I I I ГТТГ^ (2.8М2.10)

I I I I I I I II I II II I II I I I

(2.н)-а.12)

одноцепочечная ДНК

1111 1111 Г I I I I I I ) I I I 1 I I I ) ¿тр-о (2.7).(2.13)

ТТТЧ I I I I I м I I I I

со>

(2.13)-(2.14)

>>-^.аХттттттт^ т 1111

(2.7). (2.15)

н I я г??п 111 н

(2.14)-(2.16)

I Н I I

пх

(2.16).(2.17)

двухцепочечная ДНК

О ППНЕ (РхЬ")

Рис. 3. Схематические изображения исследованных ДНК-дуплексов, включающих олигонуклеотидные зонды с фрагментом РгЬ.

Наиболее интересные и практически значимые результаты получены в случае использования олигонуклеотидных зондов с1(Ж2.16 и dON2.1T (Рис. 4). При образо-

вании дуплексов с комплементарными последовательностями наблюдается появление выраженного эксимерного сигнала, который отсутствует в исходных одно-цепочечных олигомерах. Этот результат позволил предложить описанную далее схему детекции продуктов ЛЦР-РВ.

500 им

Рис. 4 Спектры флуоресценции модифицированных олигонуклеотидов и дуплексов: олигомер 2.16 (1), дуплекс (2.16)(2.14) (2), дуплекс (2.16)(2.17) (3).

2.13. тЕТ-системы при внедрении пнрена и перилена в комплементарные олигонуклеотиды

Из исходного перилена 2.5 был синтезирован удобный реагент 2.6 для внедрения перилена в 5'-положение синтетических олигонуклеотидов (Схема 2).

РМТ^СГСАТСССОАССС'Н ЮЦКЗС| <Ю№.18

1.Н+

2.СШ/ГОГОА

3. 2.6

4. водя. 1Шз

? Г зг

.хч^^ч^^-СТСАТССГОАХС

! .1 лпкт^ «л

<Ю№.19

ОССГГСООСАТйАС

" «югало

"Г

? .г

.о-ОТСАТСССОАССС С^ЛССЮСТССС

Схема 2. Получение 5'-терминально меченых периленом олигонуклеотидов с использованием реагента 2.6.

С использованием реагента 2.6 был осуществлен удобный метод внедрения пери-леновой метки в 5'-терминальное положение синтетических олигонуклеотидов, а также соответствующих ДНК-дуплексов (Схема 2). Было затем выяснено, что флуоресценция перилена практически не зависит от дуплексообразования, что соответствует теоретическим представлениям о «быстром» характере флуоресцентной эмиссии перилена, нечувствительной к молекулярному микроокружению. Еще одна эффективная стратегия внедрения перилена в синтетические олигонук-леотиды, в 3'-терминальное положение, связана с использованием реагента 2.7 (Рис. 5а), представляющего собой твердофазный носитель для олигонуклеотидно-го синтеза, содержащий молекулу перилена. Этот подход был использован в настоящей работе для синтеза ряда З'-периленмодифицированных ДНК-олигомеров.

Рис. 5. (а) Реагент для введения периленового флуорофора в 3'-терминальное положение синтетических олигонуклеотидов. (б) Изменение анизотропии флуоресценции периленового флуорофора при образовании ДНК-дуплекса (кривая 1). Кривая 2 - контроль (некомплементарный олигонуклеотид).

Реагент 2.7 может быть использован для создания эффективного ДНК-зонда. Принцип этого ДНК-зонда, способного дискриминировать одно- и двуцепочечную ДНК, основан на способности перилена изменять анизотропию своей флуоресценции в зависимости от молекулярного микроокружения. Для проверки этого предположения были синтезированы олигомеры: 5' ТТАСССТТТССТ-Рг1* (<1(Ж2.21) 5' АССАСОАААСССТАА (с!(Ш2.22) *Рг1 - периленовая метка на основе реагента 2.7.

При гибридизации перилен-модифицированного олигомера (ЮШ.21 с комплементарным (КЖ2.22 подвижность периленового флуорофора оказывалась закономерно сниженной, что находит свое отражение в повышении анизотропии его

флуоресценции. Анизотропия отражает меру поляризованное™ флуоресцентной эмиссии при возбуждении поляризованным светом. Рис. 56 демонстрирует, что при увеличении содержания в растворе перилен-модифицированного олигомера комплементарной последовательности суммарная анизотропия флуоресценции растет, свидетельствуя об образовании дуплексной ДНК. Как показано далее, этот принцип может бьггь использован в разработке ДНК-зондов для ЛЦР-РВ. Несмотря на обнаруженную нами нечувствительность флуоресцентной эмиссии перилена к дуплексообразованию, перилен-модифицированные олигонуклеотиды могут также служить ценными молекулярными зондами, работающими на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции. Теоретически весьма удобной парой для перилена является пирен, ввиду того, что максимум флуоресцентной эмиссии пирена практически совпадает с максимумом возбуждения перилена, тогда как в области эмиссии перилена флуоресценция пирена близка к нулю. Методы введения пиреновой и периленовой меток, описанные в этом и предыдущем разделах, были использованы для синтеза З'-пиренсодержащего и 5'-периленсодержащего олигонуклеотидов (Рис. 6) и соответствующего дуплекса, Как показано далее, эта система может быть использована для детекции продуктов ЛЦР-РВ по принципу FRET. В результирующей двухцепочечной ДНК (дц-ДНК) пиреновый и периленовый остатки оказываются сближенными, что приводит к эффективному резонансному переносу энергии флуоресценции. Это выражается в том, что интенсивность флуоресценции перилена нарастает в процессе ЛЦР.

Рис. 6. FRET-конструкция на основе пирена и перилена.

2.2. Олигонуклеотидные зонды на основе флуоресцеиновых и родаминовых красителей

Олигонуклеотидные зонды на основе флуоресцеиновых и родаминовых красителей занимают главенствующее место в различных вариациях FRET-анализа. Этому способствуют высокий квантовый выход этих флуорофоров, совместимые для оптимального FRET полосы поглощения и эмиссии, коммерческая доступность

у dON2.19

5'gtcatgccgaccc 3' 3.càctàcggctggg с.

n dON2.21

самых разнообразных реагентов для внедрения этих флуорофоров в различные положения олигонуклеотидов, хорошо исследованное поведение этой системы в различных экспериментальных условиях. В силу указанных причин в рамках настоящей диссертационной работы были проведены детальные исследования этой флуорофорной пары в качестве основы для системы детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени. В работе были использованы флуорофоры FAM (кар-боксифлуоресцеин) в качестве донора, а также ROX (карбоксиродамин) и TAMRA (тетраметилродамин) в качестве акцепторов. Флуорофоры вводились в синтетические олигонуклеотиды при помощи коммерчески доступных амидофосфитных реагентов на основе нуклеозидов. Соответствующие молекулярные конструкции для FRET-анализа представлены в главе 3 диссертационной работы.

3. Новые методы детекции ДНК и РНК при помощи ЛЦР в режиме реального времени (Глава 3)

3.1. ЛЦР-РВ, основанная на детекции двуцепочечной ДНК при помощи красителя SYBR Green I

Первый из разработанных подходов к детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени заключается в использовании специфичного к двуцепочечной ДНК красителя SYBR Green I. Принцип детекции представлен на схеме 3.

"УГ Ж 1

I || I денатурация

SYBR Green I I коротких дуплексов

момент регистрации флуоресценции

денатурация длинных дуплексов

отжиг и начало 2 нового цикла

Схема 3. Схема протекания ЛЦР-РВ с детекцией ампликонов с помощью интерка-лирующего красителя SYBR Green I.

Сущность разработанного подхода заключается в том, что детекция целевых продуктов ЛЦР ведется непрерывно в ходе самой реакции амплификации в ДНК-

амплификаторе, оснащенном оптическим модулем. Нарастание количества целевых продуктов ЛЦР регистрируется по интенсивности свечения интеркалирующе-го красителя SYBR Green I, который флуоресцирует только в комплексе с дц-ДНК. Поскольку в ходе ЛЦР образуется два типа дц-ДНК, представляющих собой дуплексы исходных олигонуклеотидов и их пролигировавший вариант, состоящий из этих обоих дуплексов и имеющий таким образом увеличенный размер, то температуры плавления одинарных и двойного дуплексов будут различаться. Регистрация свечения красителя SYBR Green I в комплексе с дц-ДНК при температуре, при которой одинарные дуплексы денатурируют и перестают светиться, а двойной дуплекс сохраняет свою двуцепочечную структуру, позволяет производить детекцию накопления только целевого продукта ЛЦР. Появление и усиление флуоресценции в процессе амплификации свидетельствуют об образовании целевого продукта (Рис. 7). В разработанной реакции для лигирования был использован фермент НАД-зависимая ДНК лигаза.

Циклы

Рис. 7. Кривые роста флуоресценции в варианте ЛЦР-РВ с детекцией продуктов с помощью красителя SYBR Green I. Кривые 1-3 соответствуют разным образцам ДНК, кривая 4 - отрицательный контроль (без матричной ДНК).

Описанная схема детекции продуктов ЛЦР-РВ отличается .простотой и достаточно высокой надежностью. Для ее реализации не требуется использования предварительно модифицированных олигонуклеотидов. С помощью этого подхода можно решать большинство практических медико-диагностических задач по методу ЛЦР-РВ. Определенным недостатком является относительно низкая чувствительность детекции при помощи флуорофора SYBR Green I. Как следствие, для накопления флуоресцентного сигнала, достаточного для надежной детекции целевых продук-

тов, требуется довольно большое число циклов амплификации, что увеличивает время анализа, а также может приводить к появлению побочных продуктов, затрудняющих интерпретацию результатов.

3.2. Схема детекции продуктов ЛЦР, основанная на эффекте эксимерной флуоресценции

Выше (раздел 2.1.2) было показано, что одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие в середине цепи два подряд пиренилбутацциольных фрагмента, при гибридизации с комплементарной последовательностью способны проявлять эк-симерную флуоресценцию при 460-470 нм, существенно отличающуюся от обычной мономерной флуоресценции пирена, которой обладают исходные одноцепочечные олигомеры. С использованием подобных олйгонуклеотидов возможно осуществление новой схемы детекции продуктов ЛЦР-РВ (Схема 4). Реализуемость этой схемы была показана в ходе модельных экспериментов.

дв« соседних пмреновых псевдонуклеозидных единицы

—00-

-ОО—з

-3'

-5'

отжиг и лигированме

iVTQQT

Uffil

llllllll

шз

непомерная флуоресценция (410-420 нм)

денатурата коротких дуплексов

эксимерная флуоресценция (450-170 ни)

-nopi 11 i;i 1111111 ■

Схема 4. Схема ЛЦР-РВ на основе эффекта возникновения эксимерной флуоресценции сближенных пиреновых флуорофоров.

3.3. Схема детекции продуктов ЛЦР, основанная на эффекте изменения анизотропии флуоресценции

Выше (раздел 2.1.3) было показано, что олигонуклеотид, содержащий в 3'-терминальном положении молекулу перилена, при гибридизации с комплементарной последовательностью способен изменять поляризацию своей флуоресценции, что позволяет отличать одно- и двуцепочечные ДНК. Увеличение поляризации пе-риленовой флуоресценции хорошо согласуется с уменьшением подвижности флуорофора после образования дц-ДНК. В результате после получения кванта по-

ляризованного возбуждающего света молекула перилена не успевает существенно изменить свое положение в пространстве до момента флуоресцентной эмиссии, которая также становится поляризованной. С использованием подобных олиго-нуклеотидов возможна реализация новой схемы детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени (Схема 5). Принципиальная реализуемость этой схемы была показана в ходе модельных экспериментов.

.5'

' .г "Л-3--Г3' -1г

[Ь-5- Qi-5- -3_5- ; Г'

отжиг и пигирование

qI ИМ III у днпиммнпш;; S3J 111 И IIJ

денатурация коротких дуплексов

Лшжйшш!.'

♦ неполяризованная поляриювамная

-Г флуоресценция ' флуоресценция

Схема 5. Схема ЛЦР-РВ на основе эффекта поляризации флуоресценции периле-нового флуорофора.

3.4. Схемы детекции продуктов ЛЦР, основанные на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции

3.4.1. FRET между полициклическими ароматическими флуорофорами

Выше (раздел 2.1.3) описаны олигонуклеотидные зонды на основе пиренового и периленового флуорофоров, которые позволяют создать систему флуоресцентной детекции по принципу FRET-анализа. Схема эксперимента (Схема 6) предполагает использование в качестве праймера 1 синтетического ДНК-олигомера, меченого по 5'-концу остатком перилена, а в качестве праймера 4 - олигонуклеотида, содержащего на 3'-конце остаток пирена. Сближенное расположение этих флуорофоров в соседних комплементарных цепях ДНК позволяет осуществить безызлу-чательный резонансный перенос энергии флуоресценции с пирена на перилен. Таким образом, эмиссия перилена, образующаяся при возбуждении на длине волны пирена, позволяет проследить накопление целевого двойного дуплекса при температуре, при которой короткие дуплексы оказываются денатурированными.

А\' А/Г~1-3--Г3' 2 У

„/4 5 DvJ__3_$. 1 5

5'-У

! отжиг и нитрование

} 111 и 1111I \

D 4 D

ш; ;ininin

> . J

денатурация коротких дуплексов

Ач 1 ^

NJ-з'

^¿/4-5 ^Ь7

II 11111 II,,,, у

Схема 6. Схема ЛЦР-РВ с детекцией ампликонов с помощью FRET-системы пи-рен-перилен. D - донорный флуорофор пирен, А - акцепторный флуорофор пери-лен. 1/4 и 2/3 - одиночные дуплексы, 1/4+2/3 - двойные дуплексы, представляющие собой целевой продукт. Точками показано место лигирования. Волнистой линией показан безызлучательный перенос энергии флуоресценции.

Практическая реализуемость данной схемы детекции была показана с использованием модельных ДНК-олигонуклеотидов в ходе экспериментов, продемонстрировавших выраженный эффект FRET в подобных молекулярных конструкциях. 3.4.2. ЛЦР-РВ, основанная на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции между красителями FAM и ROX

Принцип ЛЦР-РВ с детекцией целевых продуктов с помощью FRET-эффекта использованием пары FAM-ROX представлен на схеме 7. Для реализации этой схемы необходимо, чтобы пара соседних олигонуклеотидов (1 и 2 или 3 и 4) несли соответствующие флуоресцентные красители, составляющие пару донор/акцептор. В результате лигирования они становятся единой цепочкой ДНК, и перенос энергии можно детектировать на стадии денатурации, когда ампликоны представлены в виде одноцепочечных молекул. Особенностью такой схемы детекции, отличающей ее от вышеописанной схемы с переносом энергии флуоресценции от пирена к перилену, является то, что флуорофоры, образующие FRET-napy, находятся на одной цепи ДНК, а не на разных.

Схема 7. Схема ЛЦР-РВ с детекцией ампликонов с помощью FRET-сигнала. D -донорный краситель, А - акцепторный краситель. 1/4 и 2/3 - одиночные дуплексы, 1/4+2/3 - двойные дуплексы, представляющие собой целевой продукт. Точками показано произошедшее лигирование. Волнистой линией показан безызлучатель-ный перенос энергии флуоресценции.

Регистрация роста флуоресценции в данном варианте с FRET (Рис. 8) велась при температуре, при которой происходила денатурация как одиночных дуплексов (неизбежно образующихся в каждом цикле), так и двойных дуплексов. Это исключало вероятность возникновения сигнала в результате простого отжига соседних олигонуклеотидов на мишени, не сопровождающегося литерованием ввиду неспаривания нуклеотидов в месте образования ника, поскольку одним из главных предназначений ЛЦР является детекция однонуклеотидного полиморфизма в месте лигирования. Определение температур плавления одиночных и двойного дуплексов проводилось предварительно в экспериментах с немеченными олигонукле-отидами и с применением интеркалирующего красителя SYBR Green I. К настоящему времени описанная FRET-система является самым эффективным из разработанных нами подходов к детекции ЛЦР в режиме реального времени. Важным его достоинством является тот факт, что система флуоресцентных красителей FAM-ROX обладает большей чувствительностью, чем краситель SYBR Green I, а также чем полициклические ароматические углеводороды. Как следствие, детекция нарабатывающихся количеств продукта ЛЦР идет быстрее (рис. 8). Так, для реакции с указанной FRET-парой достаточно 20-22 циклов, что значительно сокращает время анализа. Еще одной положительной особенностью донорно-акцепторной пары FAM-ROX является достаточно большие расстояния, на которых эффективно детектируется FRET-взаимодействие. Так, радиус Ферстера (расстояние, на котором эффективность FRET составляет 50%) для этой пары составляет примерно 50 А. На практике

это означает, что эта пара будет работать как FRET-система, если эти флуорофоры будут разделены расстоянием 25-75 А. Для сравнения, пара пирен-перилен работает на расстояниях, не превышающих 25-30 А. FRET-сисгема, описанная в данной работе, может быть легко модифицирована, вплоть до варианта с одновременной мульти-цветной детекцией различных последовательностей в одном образце.

0 2 1 6 9 10 12 И 16 1S 20 22 21 26 ЦИКЛЫ

Рис. 8. Сводный график роста флуоресценции в ЛЦР-РВ, основанной на FRET-эффекте (кривые 3,4) в сравнении с детекцией продуктов ЛЦР-РВ, основанной на красителе SYBR Green I (кривые 1,2). Кривая 5 - контроль без детектируемой матрицы.

Указанные обстоятельства позволяют рекомендовать разработанный и описанный здесь метод в качестве эффективного современного подхода, пригодного для использования как в научных исследованиях, так и в рутинных медико-диагностических экспериментах. Использованный метод был успешно использован для решения ряда практических задач в области молекулярной биологии. 3.5. Оптимизация условий ЛЦР-РВ

Важным моментом во всех реализованных в настоящей работе схем ЛЦР-РВ является подбор концентрации матрицы и праймеров. Избыточная концентрация матрицы, применяемая в модельных экспериментах, приводит к ухудшению разрешающей способности ЛЦР. При высоких концентрациях праймеров стимулируется образование димерных продуктов, приводящих к регистрации ложного сигнала в образцах, не содержащих искомой матрицы. С помощью варьирования концентраций матрицы и праймеров во всех случаях нам удалось подобрать их оптимальное соотношение. Для биологических препаратов это 10 нг/мкл ДНК/РНК, а для праймеров - 0,15-0,3 пмоль/мкл. В модельных экспериментах с плазмидной

ДНК или синтетической матрицей требуется очень высокая степень их разведения вследствие высокой концентрации искомой мишени.

Определенную проблему при проведении ЛЦР представляет собой нематричное дотирование по тупым концам формирующихся в каждом цикле одиночных дуплексов, бороться с которым предлагалось различными способами, включая добавление в реакционную смесь высоких концентраций ЫаС1 или конструирования олигонуклеотидов, исключающих лигирование по тупым концам и при этом требующих достройку недостающих нуклеотидов с помощью ДНК полимеразы. Оба варианта не лишены недостатков, заключающихся в том, что ИаС! в заметной степени ингибирует любое лигирование, включая таковое в никах, а использование ДНК полимеразы предполагает, что она должна быть лишена экзонуклеазных активностей и помимо этого не обладать еще и смещающей цепь-активностью, что делает такое сочетание условий почти невозможным для этого типа ферментов.

циклы амплификации

Рис. 9. Кривые роста флуоресценции при проведении ЛЦР-РВ, основанной на использовании эффекта FRET (система FAM-ROX) в присутствии 5 фг (~1000 копий) рекомбинантной плазмиды pcDNA-3S и различных концентраций LiCl: 1. 50 мМ LiCl; 2.100 мМ LiCl; 3. контроль (50 мМ LiCl и отсутствие матричной ДНК).

Предложенное нами использование LiCl показало, что этот реагент, благодаря некоторым своим химическим особенностям, может быть применен для ингибирова-ния лигирования по тупым концам, позволяя, тем не менее, произойти лигирова-нию в никах. Была испытана целая серия концентраций LiCl, от 10 до 100 мМ. Оптимальной оказалась концентрация LiCl 50 мМ, позволяющая протекать лигирова-нию в никах, но сильно ингибирующая лигирование по тупым концах! (Рис. 9). Детекция молекул РНК в ходе разработанных нами вариантов ЛЦР-РВ становится возможной в результате проведения предварительного этапа в виде построения так называемой кДНК по цепи РНК с помощью обратной транскриптазы. Один из оли-

гонуклеотидов отжигается на РНК и выступает в качестве праймера для построения комплементарной цепи ДНК, которая и будет затем служить матрицей для отжига и лигирования. Однако нами было показано, что этап обратной транскрипции можно и исключить. Способность некоторых ДНК-лигаз осуществлять реакцию лигирования при использовании в качестве матрицы молекулы РНК позволяет инициировать лигазную цепную реакцию непосредственно на РНК-матрице.

4. Экспериментальная часть (Глава 41 содержит описание реактивов и материалов, а также экспериментальных методов, разработанных и использованных в диссертационной работе.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый вариант ЛЦР-РВ, основанный на детекции результатов за счет свечения специфичного к дц-ДНК красителя SYBR Green I, регистрируемого при температуре, при которой одиночные дуплексы, образующиеся в каждом цикле, плавятся, а двойной, представляющий собой целевой продукт - еще нет.

2. Разработан новый, специфичный, чувствительный и универсальный вариант ЛЦР-РВ, основанный на регистрации1 сигнала присоединенного к одному олиго-нуклеотиду красителя-акцептора родаминового ряда после безызлучательного переноса на него резонансной энергии красителя-донора флуоресцеинового ряда, причём указанные флуорофоры входят в состав разных олигонуклеотидных прай-меров, которые в результате лигирования термостабильной ДНК лигазой становятся единой молекулой.

3. Разработаны новые олигонуклеотидные зонды на основе псевдонуклеозидного пиренсодержащего флуорофора, которые при гибридизации с комплементарной последовательностью способны проявлять эксимерную флуоресценцию при 460470 нм, существенно отличающуюся от обычной мономерной флуоресценции пи-ренового флуорофора. С использованием подобных зондов реализована новая схема детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени.

4. Показана реализуемость новых перспективных принципов детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени, основанных на эффектах поляризации флуоресценции. Продемонстрирована возможность реализации новой схемы детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени по изменению анизотропии флуоресценции в амплификате, служащей мерой поляризованности флуоресцентной эмиссии.

5. Разработаны принципиально новые схемы FRET-анализа с использованием полициклических ароматических флуорофоров, пригодные для детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени.

6. Оптимизированы условия проведения новых вариантов ЛЦР-РВ в отношении количества реагентов, состава реакционных смесей, времени и температуры реакций, используемых ферментов.

7. Показано, что разработанные варианты ЛЦР-РВ могут быть успешно использованы для решения ряда практических задач в области молекулярной биологии.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Малеев, Г.В. Новый реагент для мечения биомолекул - активированное производное пиренового бихромофора с эксимерной флуоресценцией / КВ. Балакин, В А. Коршун, ГВ. Малеев и др. //Биоорган. химия.-1997.-Т. 23 (№1).-С. 33-41.

2. Maleev, G.V. Conjugates of oligonucleotides with polyaromatic fluorophores as promising DNA probes / К. V. Balakin, V. A Korshun, G.V. Maleev et aL II Biosens. Bioelectron. -1998.-V.13.-P. 771-778.

3. Малеев, Г.В. Методы флюоресцентной детекции и их применение в микробиологии / Малеев, Г.В., Гинцбург, АЛ. // Мол. ген. микробиол. вирусол. - 2004. -Т. 3. - С. ЗСИО.

4. Малеев, Г.В. / Лигазная цепная реакция. Теория, практическое применение и перспективы // Вестн. Росс. Акад. Мед Наук. -2005. -Т. 2. -С. 4044.

5. Малеев, Г.В. ПЦР, ЛЦР и ЩР - цепные реакции нуклеиновых кислот в режиме реального времени / A.B. Чемерис, Ю.М. Никоноров, ГВ. Малеев и др. Н Весгаик биотехн. физ.-хим. биол. 2005. -Т. 1, №2. -С. 5-14.

6. Малеев, Г.В. Новое акшвированное производное пиренового бифлуорофора - синтез и использование для введения олигонуклеотвды метай с эксимерной флуоресценцией / ИА Прохоренко, КВ. Балакин, ГБ. Малеев и др. // Тезисы докладов научной сессии к 100-лето со дня рождения проф. НА Преображенского, Москва, 21-22 октября 1996 г.-С. 96.

7. Maleev, G.V., Balakin, K.V. / New double dye-labeled oligodeoxynlxaiucleotide probes and their application in detection of PCR products // Proc. Internat. Congress 'Trends in nucleic acids chemistiy", Moscow, November 20-26,2000. -P. 54.

8. Средин, Ю.Г. Разработка и производство нового прибора для синтеза природных и модифицированных ДНК/РНК олигонуклеотадов / ЮГ.Срецин, C.B. Власов, Е.В. Горяев, ГБ. Малеев II Тезисы докладов конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоёмким технологиям», Пущино, 24-26 октября 2001 г. -С. 100.

9. Малеев, Г.В. Детекдая специфичных фрагментов ДНК в молекулярногенегических исследованиях и при анализе продуктов на ГМО. Новое в реал-тайм ДНК амплификации / A.B. Чемерис, Ю.М. Никоноров, Г.В. Малеев и др. Н Тезисы докладов Третьего съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генешка в XXI веке: современное состояние и перспективы развития", Москва, 6-12 июня 2004 г. - С. 482.

10. Малеев, Г.В. Лигазная цепная реакция в режиме реального времени - новая жизнь строй реакции и ее применение для детекции специфических фрагментов ДНК или РНК / A.B. Чемерис, ЮМ Никоноров, ГВ. Малеев и др. И Тезисы докладов Второго съезда Общества биотехнологов России, Москва, 2004 г. - С. 15-16.

11. Малеев, Г.В. Лигазная цепная реакция в реальном времени и ее использование для детекции ГМИ / AB. Чемерис, ЮМ. Никоноров, ГВ. Малеев и др. // Тезисы докладов Международного симпозиума «Трансгенные растеши и проблемы биобезопасносги», Москва, 2004 г. -С. 112.

12. Малеев, Г.В. Новые методы улучшенной детекции специфичных фрагментов ДНК и РНК в режиме реального времени с помощью цепных реакций нуклеиновых кислот -полимеразной (ПЦР), лигазной (ЛЦР) и шбрвдизационной (ГЦР) / AB. Чемерис, ЮМ Никоноров, Г.В. Малеев и др. // Тезисы докладов Третьего съезда Общества биотехнологов России, Москва, 2005 г. - С. 19-20.

13. Малеев, Г.В. Лигазная цепная реакция в реальном времени как альтернатива ПЦР в ДНК-диапюсгике. Новая жизнь старой реакции / АБ. Чемерис, ЮМ Никоноров, Г.В. Малеев и др. П Тезисы докладов 2-ой Международной конференции "Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда", Пущино, 10-13 мая 2005 г. - С. 111-113.

14. US Patent Appl. № 2007/0117125 Al, 24.052007. Novel methods of amplifying DNA or RNA with real-time PCR / ChemerisA-V., NikonorovYuM, RomanenkovaM.L., ChemerisD-A, GarafutdinovRJl., MagazovaRA, MaleevG.V, VakhitovVA, VasilovR.G.

15. Опубликованная заявка на патент РФ Xa 2005132940 с приоритетом от 01.03.2006 г. (Бюлл. от 27.11.2007 г.). Способ детекции специфических фрашенгов Д НК или РНК с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени / Чемерис A.B., Никоноров Ю.М., Малеев Г.В. и др.

16. Опубликованная заявка на патент РФ № 2003127702 с приоритетом от 15.09.2003 г. (Бюлл. от 04.10.2005 г.). Способ амплификации с помощью лигазной цепной реакции специфических фрагментов ДНК или РНК и их детекция в режиме реального времени / Чемерис А.В, Никоноров Ю.М., Малеев Г.В. и др.

Подписано в печать: 18.11.2009

Заказ № 3184 Тираж - 150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ni

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малеев, Григорий Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Лигазная цепная реакция и методы 8 флуоресцентной детекции нуклеиновых кислот

1.1. Лигазная цепная реакция для детекции нуклеиновых кислот

1.1.1. Теоретические основы метода ЛЦР

1.1.2. Практическое применение ЛЦР

1.1.3. Проблемы метода ЛЦР в сравнении с методом ПЦР

1.2. Флуоресцентные методы детекции нуклеиновых кислот

1.2.1. Флуоресцентные методы детекции. Базовые сведения

1.2.2. Методы прямого проявления

1.2.3. Системы детекции, основанные на резонансном переносе 38 энергии флуоресценции

Глава 2. Разработка систем детекции продуктов ЛЦР на основе 47 флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов

2.1 Олигонуклеотидные зонды на основе полициклических 48 ароматических угледоводородов

2.1.1. Пиреновый бифлуорофор с эксимерной флуоресценцией

2.1.2. Зонды на основе псевдонуклеозидного пиренсодержащего 52 флуорофора

2.1.3. FRET-системы при внедрении пирена и перилена в 59 комплементарные олигонуклеотиды

2.2. Олигонуклеотидные зонды на основе флуоресцеиновых и 64 родаминовых красителей

Глава 3. Новые методы детекции;ДНК и РНК при помощи ЛЦР в режиме, 65 реального времени

3.1. ПЦР и ЛЦР в режиме реального времени: особенности и сферы 65 использования

3.2. Лигазная цепная реакция в режиме реального1 времени:, основные 67 принципы . •

3.3. ЛЦР-РВ, основанная! на- детекции» двуцепочечной ДНК при 71 помощи красителя SYBR Green I.

3.4. Схема детекции продуктов ЛЦР, основанная на эффекте 74 эксимерной флуоресценции

3.5. Схема детекции продуктов ЛЦР, основанная на эффекте 77 изменения анизотропии флуоресценции

3.6. Схемы детекции продуктов ЛЦР, основанные на эффекте 81 резонансного переноса энергии флуоресценции

3.6.1. FRET между полициклическими ароматическими 81 флуорофорами

3.6.2. ЛЦР-РВ, основанная на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции между красителями FAM и ROX

3.7. Оптимизация условий ЛЦР-РВ

3.8. Детекция молекул РНК при помощи ЛЦР-РВ

3.9. Использование разработанных вариантов ЛЦР-РВ в 90 молекулярно-генетических исследованиях

Глава 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1 Реактивы и материалы

4.2. Экспериментальные методы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени"

Решение проблемы эффективной диагностики различных заболеваний относится к числу приоритетных задач мирового и отечественного здравоохранения. В настоящее время системы здравоохранения России и других стран испытывают насущную потребность в развитии и широком использовании систем диагностики, сочетающих высокую эффективность измерений, точность, универсальность, простоту проведения анализа, дешевизну. Приоритетные области применения подобных систем — это диагностика широкого ряда инфекционных заболеваний, по-прежнему являющихся «убийцами номер один» в мире.

Лигазная цепная реакция (ЛЦР) является одним из перспективных методов клинической диагностики, интенсивно развиваемым на практике в последние полтора десятилетия. По своей чувствительности и точности анализа ЛЦР во многих случаях продемонстрировала свое превосходство не только над классическими методами микробиологического анализа, такими как выращивание культур клеток, иммунохимический анализ, но также и над современными вариантами ПЦР-диагностики (ПЦР - полимеразная цепная реакция).

Целью работы является разработка методов синтеза новых флуоресцентных олигонуклеотидных зоднов для ЛЦР и разработка на их основе, новых методов детекции ДНК и РНК при помощи ЛЦР в режиме реального времени. В задачи исследования входило:

1. Разработать новый вариант ЛЦР-РВ, основанный на детекции результатов за счет свечения специфичного к двуцепочечной ДНК красителя SYBR Green I: 2. Разработать новые олигонуклеотидные зонды, на базе полициклических ароматических • флуорофоров пирена и перилена, чувствительных к молекулярному микроокружению и основанных на эффектах эксимерной флуоресценции и изменения анизотропии флуоресценции.

Научная новизна работы заключается в следующем: Разработан дизайн и проведён синтез новых флуоресцентных олигонуклеотидных зондов для ЛЦР. Разработаны новые методы детекции ДНК и РНК при помощи ЛЦР-РВ. Показана возможность эффективной детекции следовых количеств ДНК и РНК с использованием новых методов флуоресцентной детекции в растворе. Предложены оптимальные системы детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени, которые далее применены для решения практически важных задач в молекулярно-биологических исследованиях и при анализе продуктов с генетически-модифицированными компонентами.

В результате проведенных исследований показана возможность эффективной детекции следовых количеств ДНК и РНК с использованием новых методов флуорецсентной детекции в растворе. Всего синтезировано более 20 различных олигонуклеотидных зондов для ЛЦР. Были обнаружены оптимальные системы детекции, которые были применены для решения практически важных задач в сфере детекции специфичных фрагментов ДНК в молекулярно-генетических исследованиях и при анализе продуктов с генетически-модифицированными компонентами. Результаты настоящего исследования могут быть использованы при проведении ДНК-диагностики в медицине, ветеринарии, санитарно-эпидемиологических исследованиях, криминалистике, пищевой промышленности для обнаружения возбудителей опасных инфекций, генетической идентификации личности, выявления продуктов питания из генетически модифицированных организмов, определения качества сырья и т.д.

По материалам данной диссертации опубликовано 5 научных статьей (в том числе в журналах из перечня ВАК — 4), 3 заявки на патент (одна международная и две российских) и 8 тезисов докладов научных конференций. Результаты работы были доложены на научной сессии к 100-летию со дня рождения проф. Н.А. Преображенского (Москва, 21-22 октября 1996), Российском съезде медицинских генетиков (Курск, 17-19 мая 2000 г.), конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоёмким технологиям» (Пущино, 24-26 октября 2001), третьем съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва. 6-12 июня 2004), втором съезде Общества биотехнологов России (Москва 2004), третьем съезде Общества биотехнологов России (Москва 2005), международном конгрессе «Тенденции в химии нуклеиновых кислот» (Москва, 20-26 ноября 2000), международном симпозиуме «Трансгенные растения и проблемы биобезопасности» (Москва 2004), 2-ой международной конференции "Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда" (Пущино, 10-13 мая 2005).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Малеев, Григорий Владимирович

выводы

2. Разработан новый, специфичный, чувствительный и универсальный вариант ЛЦР-РВ, основанный на регистрации сигнала присоединенного к одному олигонуклеотиду красителя-акцептора родаминового ряда после безызлучательного переноса на него резонансной энергии красителя-донора флуоресцеинового ряда, причём указанные флуорофоры входят в состав разных олигонуклеотидных праймеров, которые в результате лигирования термостабильной ДНК лигазой становятся единой молекулой.

3. Разработаны новые олигонуклеотидные зонды на основе псевдонуклеозидного пиренсодержащего флуорофора, которые при гибридизации с комплементарной последовательностью способны проявлять эксимерную флуоресценцию при 460-470 нм, существенно отличающуюся от обычной мономерной флуоресценции пиренового флуорофора. С использованием подобных зондов реализована новая схема детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени.

103

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная вниманию глубокоуважаемой читательской аудитории работа выполнялась в течение последних 10-12 лет в нескольких крупных отечественных научных центрах. Эта работа развивалась и прогрессировала от попыток получения новых флуоресцентных меток, чувствительных к молекулярному микроокружению; переходила затем к современным методам гибридизационного анализа нуклеотидных последовательностей; финальные ее аккорды связаны с применением полученных результатов для создания действенного инструмента высокоэффективной РНК- и ДНК-диагностики на базе лигазной цепной реакции. Главной целью диссертации, какой она видится в настоящее время ее автору, является попытка «синтеза» в широком смысле, как в теоретическом, так и прикладном аспекте, нескольких современных научных дисциплин на стыке молекулярной биологии, молекулярной генетики и биоорганической химии. Главным ее результатом, отраженным в трудах российских и международных конференций, журнальных публикациях, обзорах и патентах, является создание динамичной исследовательской платформы, включающей как развитые медико-диагностические методики, так и передовые идеи на стадии первичных исследований.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю признательность всем своим коллегам, принявшим активное участие в планировании исследований, на разных экспериментальных этапах и в теоретическом обсуждении результатов.

Автор благодарен всем своим руководителям, при непосредственном содействии которых выполнялась работа: значительная часть работ была проведена в ИБХ РАН, в лаборатории генетической инженерии нуклеиновых кислот под руководством Проф. Ю.А. Берлина и к.х.н. В.А. Коршуна; далее ее продолжение связано с непосредственным участием в исследованиях под руководством Проф. Р.Ш. Бибилашвили (Институт экспериментальной

101 кардиологии РКНПК МЗ РФ); Ю.Г.Средина («Биоссет»), Акад. A.JI. Гинцбурга (Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).

Автор благодарен научному консультанту Проф. А.В. Чемерису (Институт биохимии и генетики УНЦ РАН) за многолетнее научное сотрудничество и жизненный оптимизм.

Автор бесконечно благодарен научному руководителю настоящей работы - д.х.н. К.В.Балакину (в настоящее время - ИФАВ РАН) за непосредственное руководство представленной научной тематикой, начиная от курсовой работы (1995 год) до настоящей кандидатской диссертации, а также за многолетнее научное и практическое сотрудничество.

Автор признателен коллективу ИБГ УНЦ РАН; коллективу лаборатории научно-информационных технологий в медицинской химии ИФАВ РАН; коллективу лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН; коллективу лаборатории химии нуклеиновых кислот ИБХ РАН за помощь в работе.

Автор благодарен В.М. Демьянович (МГУ), И.Н.Шишкиной (МГУ), JI.B. Снегур (ИНЭОС РАН), И.В.Сергееву (ГНЦ Институт иммунологии ФМБА), К.Е.Воюшину (Институт канцерогенеза РАМН), Е.А.Асеевой (Гематологический научный центр РАМН), А.А. Луговскому (Biogen Inc, США), А.В.Кривцову (Harvard medical school, Бостон, США), А.А.Смирнову («Хеликон»), А.В.Кузубову («Синтол»), М.А. Ануфриеву («Bio-Rad»), А.В.Петрову («Мастерклон»), А.Л.Зимину, К.А.Ярову, Н.Е.Кирюшину, И.А.Лапшову, С.Г.Фарману, В.В.Лысакову, Ш.А.Фазаилову, Р.Х.Кашапову, А.Ю.Батлуцкому за постоянную дружескую поддержку и позитивное влияние на автора; А.В. Белову и Е.Ю.Сидоровой за помощь в вёрстке текста работы и создании иллюстраций.

Автор также выражает бесконечную признательность своим родителям, родственникам и супруге, помощь и поддержка которых на всех этапах данной работы оказала решающую роль в ее реализации.

102

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малеев, Григорий Владимирович, Черноголовка

1. Landegren, U., Kaiser, R., Sanders, J., Hood, L. / A ligase-mediated gene detection technique// Science. - 1988. -V. 241. - P. 1077-1080.

2. Barany, F. / The ligase chain reaction in a PCR world // PCR Methods Applic. -1991.-V. l.-P. 5-16.

3. Barany, F. / Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 189-193.

4. Reyes, A.A., Carrera, P., Cardillo, E., Ugozzoli, L., Lowery, J.D., Lin, C.-I P., Go, M., Ferrari, M., Wallace, R.B. / Ligase chain reaction assay for human mutations: the Sickle Cell by LCR assay // Clin. Chem. 1997. Vol.43 - P.40-44.

5. Kim, J., Lee, H. J. / Rapid Discriminatory Detection of Genes Coding for SHV p-Lactamases by Ligase Chain Reaction // Antimicr. Agents Chemother. -2000.-V. 44-P. 1860-1864.

6. Osiowy, C. Sensitive detection of HBsAg mutants by a gap ligase chain reaction assay // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40 - P.2566-2571.

7. Bi, W., Stambrook, P.J. / CCR: a rapid and simple approach for mutation detection // Nucl. Acids Res. 1997. - V. 25 - P.2949-2951.

8. Quinn, Т. C., Cates, W. // Epidemiology of sexually transmitted diseases in the 1990's. 1992. Vol. P. 1-37. In Т. C. Quinn (ed.), Advances in host defense mechanisms, V. 8. Raven Press, New York, N.Y.

9. Butt, A., McCartney, R., Walker, A., Scoular, A. / Economic advantages of ligase chain reaction for diagnosis of genital Chlamydia trachomatis infection in GUM clinic attenders // Sex. Transm. Inf. 2001. - V. 77 - P. 227-228.

10. Waites, K.B., Smith, K.R., Crum, M.A., Hockett, R.D., Wells, A.H., Hook, E.W. / Detection of Chlamydia trachomatis endocervical infections by ligase chain reaction versus ACCESS Chlamydia antigen assay // J. Clin. Microbiol. -1999.-V. 37-P. 3072-3073.

11. Winter, A. J., Gilleran, G., Eastick, K., Ross, J.D.C. / Comparison of a ligase chain reaction-based assay and cell culture for detection of pharyngeal carriage of Chlamydia trachomatis // J. Clin. Microbiol. 2000. -V-. 38 - P. 3502-3504.

12. Deguchi, Т., Yasuda, M., Uno, M., Tada, K., Iwata, H., Komeda, H., Maeda, S.-I., Latila, V., Saito, I., Kawada, Y. / Comparison among performances of a ligase chain reaction-based assay and two enzyme immunoassays in detecting

13. Chlamydia trachomatis in urine specimens from men with nongonococcal urethritis // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34 - P. 1708-1710.

14. Kacena, K.A., Quinn, S.B., Hartmann, S.C., Quinn, T.C., Gaydos, C.A. / Pooling of Urine Samples for Screening for Neisseria gonorrhoeae by Ligase Chain Reaction: Accuracy and Application // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36 -P. 3624-3628.

15. Ching, S., Lee, H., Hook, E.W., Jacobs, M.R., Zenilman, J. / Ligase chain reaction for detection of Neisseria gonorrhoeae in urogenital swabs // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33 - P. 3111-3114.

16. Hook, E.W., Ching S.F., Stephens, J., Hardy, K.F., Smith, K.R., Lee, H.H. / Diagnosis of Neisseria gonorrhoeae infections in women by using the ligase chain reaction on patient-obtained vaginal swabs // J. Clin. Microbiol. 1997. -V. 35-P. 2129-2132.

17. Young, H., Manavi, K., McMillan, A. / Evaluation of ligase chain reaction for the non-cultural detection of rectal and pharyngeal gonorrhoea in men who have sex with men // Sex. Transm. Infect. 2003. - V. 79 - P. 484-486.

18. Stary, A., Ching, S.F., Teodorowicz, L., Lee, H. / Comparison of ligase chain reaction and culture for detection of Neisseria gonorrhoeae in genital and extragenital specimens // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35 - P. 239-242.

19. Heifets, L.B., Good, R.C. // Current laboratory methods for the diagnosis of tuberculosis, 1994. P.85-110. In B. R. Bloom (ed.), Tuberculosis: pathogenesis, protection, and control. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

20. O'Connor, T.M., Sheehan, S., Cryan, В., Brennan, N., Bredin, C.P. / The ligase chain reaction as a primary screening tool for the detection of culture positive tuberculosis // Thorax 2000. V. 55 - P. 955-957.

21. Lindbraten, A., Gaustad, P., Hovig, В., Tonjum, T. / Direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in clinical samples from patients in Norway by ligase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35 - P. 3248-3253.

22. Moore, D.F., Curry, J.I. / Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum sediments by ligase chain reaction // J. Clin. Microbiol.-1998.-V. 36-P. 1028-1031.

23. Tortoli, E., Lavinia, F., Simonetti, M.T. / Early detection of Mycobacterium tuberculosis in BACTEC cultures by ligase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36 - P. 2791-2792.

24. Shetty, N., Shemko, M., Holton, J., Scott, G.M. / Is the detection of Mycobacterium tuberculosis DNA by ligase chain reaction worth the cost: experiences from an inner London teaching hospital // J. Clin. Pathol. 2000. V. 53 - P. 924-928.

25. Kissin, D.M., Holman, S., Minkoff, H.L., DeMeo, L., McCormack, W.M., DeHovitz, J.A. / Epidemiology and natural history of ligase chain reaction detected chlamydial and gonococcal infections // Sex. Transm. Infect. 2002. V. 78-P. 208-209.

26. Blocker, M.E., Krysiak, R.G., Behets, F., Cohen, M.S. Hobbs, M.M. / Quantification of Chlamydia trachomatis elementary bodies in urine by ligase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40 - P. 3631-3634.

27. Bachmann, L.H., Desmond, R.A., Stephens, J., Hughes, A., Hook, E.W. /

28. Duration of Persistence of Gonococcal DNA Detected by Ligase Chain

29. Reaction in Men and Women following Recommended Therapy for111

30. Uncomplicated Gonorrhea // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40 - P. 3596-3601.

31. Loeffelholz, M.J., Jirsa, S.J., Teske, R.K., Woods, J.N. / Effect of endocervical specimen adequacy on ligase chain reaction detection of Chlamydia trachomatis // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39 - P. 3838-3841.

32. Nikkari, S., Puolakkainen, M., Yli-Kerttula, U., Luukkainen, R., Lehtonen, O.-P., Toivanen, P. / Ligase chain reaction in detection of Chlamydia DNA in synovial fluid cells // Brit. J. Rheumat. 1997. V. 36 - P. 763-765.

33. Notomi, Т., Ikeda, Y., Okadome, A., Nagayama, A. / The inhibitory effect of phosphate on the ligase chain reaction used for detecting Chlamydia trachomatis // J. Clin. Pathol. 1998. V. 51 - P. 306-308.

34. Landegren, U. / Molecular mechanics of nucleic acid sequence amplification // Trends Genet. 1993. - V. 9. - P.199-204.

35. Kalin, I., Shephard, S., Candrian, U. / Evaluation of the ligase chain reaction (LCR) for the detection of point mutations // Mutat. Res. 1992. - V. 283. - P. 119-123.

36. Southern, E.M. // Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - V. 98. - P.503-517.

37. Brand, L., Johnson, M.L. Fluorescence Spectroscopy (Methods in Enzymology, Volume 278) // Academic Press. 1997.

38. Lakowicz, J.R. / Principles of Fluorescence Spectroscopy, Second Edition // Plenum Publishing. -1999.

39. Sharma, A., Schulman, S.G. / Introduction to Fluorescence Spectroscopy // John Wiley and Sons. 1999.

40. Малеев, Г.В., Гинцбург, A.JI. / Методы флюоресцентной детекции и их применение в микробиологии // Мол. ген. микробиол. вирусол. 2004. -Т. З.-С. 30-40.

41. Millard, P.J., Roth, B.L., Kim, С.Н. / Fluorescence-Based Methods for Microbiol Characterization and Viability Assessment // Biotechnol. Intl. -1997.-V. l.-P. 291.

42. Lloyd, D., Hayes, A.J. / Vigour, Vitality and Viability of Microorganisms // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 133. - P. 1.

43. Burgess, S.M., Delannoy, M., Jensen, R.E. / MMM1 Encodes a Mitochondrial Outer Membrane Protein Essential for Establishing and Maintaining the Structure of Yeast Mitochondria // J. Cell. Biol. 1994. - V. 126. - P. 1375-1391.

44. Mazzoni, C., Zarov, P., Rambourg, A., Mann, C. / The SLT2 (MPK1) MAP Kinase Homolog is Involved in Polarized Cell Growth in Saccharomyces Cerevisiae // J. Cell. Biol. 1993.-V. 123.-P. 1821-1833.

45. Valdivieso, M.H., Mol, P.C., Shaw, J.A., Cabib, E., Duran, A. / CAL1, A Gene Required for Activity of Chitin Synthase 3 in Saccharomyces Cerevisiae // J. Cell. Biol.-1991.-V. 114.-P. 101-109.

46. Shaw, J.A., Mol, P.C., Bowers, В., Silverman, S.J., Valdivieso, M.H., Duran, A., Cabib, E. / The Function of Chitin Synthases 2 and 3 in the Saccharomyces Cerevisiae Cell Cycle // J. Cell. Biol. 1991. - V. 114. - P. 111-123.

47. Millard, P.J., Roth, B.L., Thi, H.P., Yue, S.T., Haugland, R.P. / Development of the FUN-1 Family of Fluorescent Probes for Vacuole Labeling and Viability Testing of Yeasts // Appl: Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 2897-2905.

48. Wenisch, C., Moore, C.B., Krause, R., Presterl, E., Pichna, P., Denning, D. W. / Antifungal Susceptibility Testing of Fluconazole by Flow Cytometry Correlates with Clinical Outcome // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 2458-2462.

49. Prudencio, C., Sansonetty, F., Corte-Real, M. / Flow Cytometric Assessment of

50. Cell Structural and Functional Changes Induced by Acetic Acid in the Yeasts113

51. Zygosaccharomyces Bailii and Saccharomyces Cerevisiae // Cytometry. 1998. -V. 31.-P. 307-313.

52. Deere, D., Shen, J., Vesey, G., Bell, P., Bissinger, P., Veal, D. / Flow Cytometry and Cell Sorting for Yeast Viability Assessment and Cell Selection//Yeast.- 1998.-V. 14.-P. 147-160.

53. Wenisch, C., Linnau, K.F., Parschalk, В., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. / Rapid Susceptibility Testing of Fungi by Flow Cytometry Using Vital Staining // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 5-10.

54. Kretschmar, M., Nichterlein, Т., Nebe, C.T., Hof, H., Burger, K.J. / Fungicidal Effect of Tyrothricin on Candida Albicans // Mycoses. 1996. - V. 39. - P. 45-50.

55. Comas, J., Vives-Rego, J. / Assessment of the Effects of Gramicidin, Formaldehyde, and Surfactants on Escherichia coli by Flow Cytometry Using Nucleic Acid and Membrane Potential Dyes // Cytometry. 1997. - V. 29. - P. 58-64.

56. Boulos, L., Prevost, M., Barbeau, В., Coallier, J., Desjardins, R. / Live/Dead BacLight: Application of a New Rapid Staining Method for Direct Enumeration of Viable and Total Bacteria in Drinking Water // J. Microbiol. Methods. -1999.-V. 37.-P. 77-86.

57. Taghi-Kilani, R., Gyurek, L.L., Millard, P.J., Finch, G.R., Belosevic, M. / Nucleic Acid Stains as Indicators of Giardia muris Viability Following Cyst Inactivation // Int. J. Parasitol. 1996. - V. 26. - P. 637-646.

58. Gyurek, L.L. / Cryptosporidium Parvum Viability Assessment Using Nucleic Acid Staining and Flow Cytometry // Proc. Water Qual. Technol. Conf. 1998. -P. 1277-1285.

59. Belosevic, M., Guy, R.A., Taghi-Kilani, R., Neumann, N.F., Gyurek, L.L., Liyanage, L.R., Millard, P J., Finch, G.R. / Nucleic Acid Stains as Indicators of Cryptosporidium Parvum Oocyst Viability // Int. J. Parasitol. 1997. - V. 27. -P. 787-798.

60. Virta, M., Lineri, S., Kankaanpaa, P., Karp, M., Peltonen, K., Nuutila, J., Lilius E.-M. / Determination of Complement-Mediated Killing of Bacteria by Viability Staining and Bioluminescence // Appl. Envir. Micr. 1998. - V. 64. -P. 515-519.

61. Korber, D.R., Choi, A., Wolfaardt, G.M., Ingham, S.C., Caldwell, D.E. / Substratum Topography Influences Susceptibility of Salmonella enteritidis Biofilms to Trisodium Phosphate / Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. -P. 3352-3358.

62. Mason, D.J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F.C., Gant, V.A. / A Fluorescent Gram Stain for Flow Cytometry and Epifluorescence Microscopy // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 2681-2685.

63. Virta, M., Lineri, S., Kankaanpaa, P., Karp. M., Peltonen, K., Nuutila, J., Lilius, E.M. / Determination of Complement-Mediated Killing of Bacteria by Viability Staining and Bioluminescence // Appl. Environ. Microbiol. 1998. -V. 64.-P. 515-519.

64. Pettipher, G.L., Mansell, R., McKinnon, C.H., Cousins, C.M. / Rapid Membrane Filtration-Epifluorescent Microscopy Technique for Direct Enumeration of Bacteria in Raw Milk // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - V. 39.-P. 423.

65. Ann, S.J., Costa, J., Emanuel, J.R. / PicoGreen Quantitation of DNA: Effective Evaluation of Samples Pre- or Post-PCR // Nucl. Acids Res. 1996. - V. 24. -P. 2623-2625.

66. Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J., Williams, P.M. / Real Time Quantitative PCR // Genome Res. 1996. - V. 6. - P. 986-994.

67. Nasarabadi, S., Milanovich, F., Richards, J., Belgrader, P. / Simultaneous Detection of TaqMan Probes Containing Fam and Tamra Reporter Fluorophores // Biotechniques. 1999. - V. 27. - P. 1116-1118.

68. Lee, L.G., Livak, K.J., Mullah, В., Graham, R.J., Vinayak, R.S., Woudenberg, T.M. / Seven-color, Homogeneous Detection of Six PCR Products // Biotechniques. 1999. - V. 27. - P. 342-349.

69. Tapp, I., Malmberg, L., Rennel, E., Wik, M., Syvanen, A.C. / Homogeneous Scoring of Single-nucleotide Polymorphisms: Comparison of the 5'-nuclease TaqMan Assay and Molecular Beacon Probes // Biotechniques. 2000. - V. 28. -P. 732-738.

70. Monpoeho, S., Dehee, A., Mignotte, В., Schwartzbrod, L., Marechal, V., Nicolas, J. C., Billaudel, S., Ferre, V. / Quantification of Enterovirus RNA in Sludge Samples Using Single Tube Real-time RT-PCR // Biotechniques. -2000.-V. 29.-P. 88-93.

71. Zhao, Y., Yu, M., Miller, J.W., Chen, M., Bremer, E.G., Kabat, W., Yogev, R. / Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral DNA by Using TaqMan Technology // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40. - P. 675-678.

72. Maudru, Т., Peden, K.W. / Adaptation of the Fluorogenic 5'-nuclease Chemistry to a PCR-based Reverse Transcriptase Assay // Biotechniques. -1998.-V. 25.-P. 972-975.

73. Piatek, A.S., Tyagi, S., Pol, A.C., Telenti, A., Miller, L.P., Kramer, F.R. / Molecular Beacon Sequence Analysis for Detecting Drug Resistance in Mycobacterium Tuberculosis // Nature Biotech. 1998. - V. 16. - P. 359-363.

74. Tyagi, S., Bratu, D.P., Kramer, F.R. / Multicolor Molecular Beacons for Allele Discrimination // Nature Biotech. 1998. - V. 16. - P. 49-53.

75. Helps, C., Reeves, N., Tasker, S., Harbour, D. / Use of Real-Time Quantitative PCR To Detect Chlamydophila felis Infection // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 2675-2676.

76. Park, S., Wong, M., Marras, S.A.E., Cross, E.W., Kiehn, Т.Е., Chaturvedi, V., Tyagi, S., Perlin, D.S. / Rapid Identification of Candida dubliniensis Using a Species-Specific Molecular Beacon // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. P. 2829-2836.

77. Lanciotti, R.S., Kerst, A.J. / Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Assays for Rapid Detection of West Nile and St. Louis Encephalitis Viruses // J. Clin. Microbiol. -2001. -V. 39. P. 4506-4513.

78. Rhee, J.T., Piatek, A.S., Small, P.M., Harris, L.M., Chaparro, S.V., Kramer, F.R., Alland, D. / Molecular Epidemiologic Evaluation of Transmissibility and Virulence of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1999. - V. 37. -P. 1764-1770.

79. El-Haji, H.H., Marras, S.A.E., Tyagi, S., Kramer, F.R., Alland, D. / Detection of Rifampin Resistance in Mycobacterium tuberculosis in a Single Tube with Molecular Beacons // J. Clin. Microbiol. 2001. -V. 39. - P. 4131-4137.

80. Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J., Brown, T. / Mode of Action and Application of Scorpion Primers to Mutation Detection // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 3752-3761.

81. Nazarenko, I.A., Bhatnagar, S.K., Hohman, R.J. / A Closed Tube Format for Amplification and Detection of DNA Based on Energy Transfer // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 2516-2521.

82. Myakishev, M.V., Khripin, Y., Hu, S., Hamer, D.H. / High-Throughput SNP Genotyping by Allele-Specific PCR with Universal Energy-Transfer-Labeled

83. Primers//Genome Res.-2001.-V. 11.-P. 163-169.118

84. Nuovo, G.J., Hohman, R.J., Nardone, G.A., Nazarenko, I.A. / In Situ Amplification Using Universal Energy Transfer-labeled Primers // J. Histochem. Cytochem. 1999. - V. 47. - P. 273-280.

85. Rist, M.J., Marino, J.P. / Fluorescent Nucleotide Base Analogs as Probes of Nucleic Acid Structure, Dynamics and Interactions // Curr. Org. Chem. 2002. -V. 6.-P. 775-793.

86. Marras, S.A.E., Kramer, F.R., Tyagi, S. / Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - P. el22.

87. Masuko, M., Ohuchi, S., Sode, K., Ohtani, H., Shimadzu, A. / Fluorescence resonance energy transfer from pyrene to perylene labels for nucleic acid hybridization assays under homogeneous solution conditions // Nucleic Acids Res.-2000.-V. 28.-P. e34.

88. Lakowicz, J. R., Knutson, J. R. / Hindered depolarizing rotations of perylene in lipid bilayers. Detection by lifetime-resolved fluorescence anisotropy measurements // Biochemistry. 1980. - V. 19. - P. 905-911.

89. Lewis, F.D., Zhang, L., Zuo, X. / Orientation control of fluorescence resonance energy transfer using DNA as a helical scaffold // J. Am. Chem. Soc. -2005. -V. 127.-P. 10002-10003.

90. Wang, W., Li, L. S., Helms, G., Zhou, H.H., Li, A.D.Q. / To fold or to assemble?//J. Am. Chem. Soc.-2003.-V. 125.-P. 1120-1121.

91. Balakin, K.V. Conjugates of oligonucleotides with polyaromatic fluorophores as promising DNA probes / К. V. Balakin, V. A. Korshun, G.V. Maleev et al. II Biosens. Bioelectron. 1998. - V. 13. - P. 771-778.

92. Zheng, Y., Long, H., Schatz, G.C., Lewis, F. D. / Duplex and hairpin dimer structures for perylene diimide-oligonucleotide conjugates // Chem. Commun. -2005.-P. 4795-4797.

93. Aubert, Y., Asseline, U. / Synthesis and hybridization properties of oligonucleotide-perylene conjugates: Influence of the conjugation parameters on triplex and duplex stabilities // Org. Biomol. Chem. 2004. - V. 2. - P. 3496-3503.

94. Балакин, K.B. Новый реагент для мечения биомолекул — активированное производное пиренового бихромофора с эксимерной флуоресценцией / К.В. Балакин, В.А. Коршун, Г.В. Малеев и др. II Биоорган, химия. 1997. -Т. 23 (№1).-С. 33-41.

95. Balakin, K.V., Korshun, V.A., Esipov, D.S., Mikhalev, I.I., Berlin, Yu.A. / Perylene-Labeled Oligonucleotide as a Probe in Homogeneous Hybridization Assay // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 1999. - V. 18. - P. 1279-1280.

96. Maleev, G.V., Balakin, K.V. / New double dye-labeled oligodeoxyribonucleotide probes and their application in detection of PCR products // Proc. Internat. Congress "Trends in nucleic acids chemistry",

97. Moscow, November 20-26, 2000. P. 54.120

98. Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J., Williams, P.M. / Real time quantitative PCR // Genome Res. 1996. - V. 6. - P. 986-994.

99. Higuchi, R, Dollinger, G., Walsh, P.S., Griffith, R. / Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences // Biotechnology. -1992.-V.10.-P. 413-417.

100. Holland, P.M., Abramson, R.D., Watson, R, Gelfand, D.H. / Detection of specific polymerase chain reaction products by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. -P. 7276-7280.

101. Kalin, I., Shephard, S., Candrian U. / Evaluation of the ligase chain reaction (LCR) for the detection of point mutations // Mutat. Res. 1992. - V. 283. - P. 119-123.

102. Landegren, U. / Molecular mechanics of nucleic acid sequence amplification // Trends Genet. 1993. - V. 9. - P. 199-204.

103. Mackay, I.M., Arden, K.E., Nitsche, A. / Real-time PCR in virology // Nucl. Acids Res. 2002. - V. 30. - P. 1292-1305.

104. Abravaya, K., Carrino, J.J., Muldoon, S. Lee, H.H. / Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction (Gap-LCR) // Nucleic Acids Res. 1995. -V. 23. - P. 675-682.

105. Marshall, R.L., Laffler, T.G., Cerney, M.B., Sustachek, J.C., Kratochvil, J.D., Morgan, R.L. / Detection of HCV RNA by the asymmetric gap ligase chain reaction // PCR Methods Appl. 1994. - V. 4. - P. 80-84.

106. Wittwer, C.T., Ririe, K.M., Andrew, R.V., David, D.A., Gundry, R.A., Balis, U.J. / The LightCycler™: A microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control // Biotechniques. 1997. - V. 22. - P. 176-181.

107. Cardullo, R.A, Agrawal, S., Flores, C., Zamecnik, P.C., Wolf, D.E. / Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 8790-8794.

108. Barringer, K.J., Orgel, L., Wahl, G., Gingeras, T.R. / Blunt-end and single-strand ligations by Escherichia coli ligase: influence on an in vitro amplification scheme // Gene. 1990. - V. 89. - P. 117-122.

109. Wu, D.Y., Wallace, R.B. / The ligation amplification reaction (LAR)-amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation // Genomics. 1989. - V. 4. - P. 560-569.

110. Wu, D.Y., Wallace, R.B. / Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase // Gene. 1989. - V. 76. - P. 245-254.

111. Nilsson, M., Barbany, G., Antson, D.O., Gertow, K., Landegren, U. / Enhanced detection and distinction of RNA by enzymatic probe ligation // Nat. Biotechnol. 2000. - V. 18. - P. 791-793.

112. Малеев, Г.В. ПЦР, ЛЦР и ГЦР цепные реакции нуклеиновых кислот в режиме реального времени / А.В. Чемерис, Ю.М. Никоноров, Г.В. Малеев и др. II Вестник биотехн. физ.-хим. биол. 2005. - Т. 1, №2. - С. 5-14.

Информация о работе

Малеев, Григорий Владимирович
кандидата биологических наук
Черноголовка, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы