Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и экспериментально-клиническое изучение двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и экспериментально-клиническое изучение двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры"

£

На правах рукописи

ГОРЕЛОВА Виктория Геннадьевна

Разработка и экспериментально-клиническое изучение двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры

03.00.07 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Махачкала - 2005

Работа выполнена в ФГУП «Микроген» МЗ и СР РФ НПО «Питательные среды» и Дагестанской Государственной Медицинской Академии

Научный руководитель:

академик РАМТН, чл.-корр. РАЕН, доктор медицинских наук, профессор М.М.Меджидов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Л.П.Блинкова академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор В.М.Бондаренко

Ведущая организация: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Национальный орган контроля Федеральное государственное учреждение науки ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.

Защита диссертации состоится 17 ноября 2005 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН по адресу: 105064 г. Москва, Малый Казенный пер., д.5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Автореферат разослан « К » / 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И.В.Яковлева

■герб-? //52* /

Ж№98

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В начале XXI столетия сепсис по-прежнему остается одной из самых нерешенных проблем современной медицины вследствие неуклонной тенденции к росту количества больных и стабильно высокой летальности (Б.Р.Гельфанд, В.А.Руднов и др., 2004 г.).

Известно, что в расшифровке этиологической структуры бактериемии, сепсиса и установлении диагноза ведущую роль играют лабораторные исследования. Обнаружение микробов в крови расценивается как решающий диагностический критерий, т.к. определение точного диагноза, а в дальнейшем и эффективная терапия, могут быть осуществлены только при выделении гемокультуры.

Микробиологические исследования крови требуют обеспечения лабораторной службы страны стандартными высококачественными питательными средами. Однако отечественная промышленность не выпускает питательных сред для накопления и выделения гемокультуры, поэтому каждая лаборатория самостоятельно готовит питательные среды для посевов крови. Это не дает возможности унифицировать и стандартизировать исследования, а также получать сопоставимые результаты. К недостаткам сред лабораторного приготовления относят также образование сгустка фибрина при посеве крови в питательную среду, отсутствие инактиваторов бактерицидных субстанций крови, узкий перечень выделяемых микроорганизмов, длительные сроки инкубации посевов и низкий процент высеваемости гемокультур (Бадиков В.Д.и др. 1998 г., Ребенок Ж.А., 2005 г.).

В методических рекомендациях по диагностике и терапии сепсиса (2004 г.) предлагается исключить использование сред лабораторного приготовления, заменив их средами промышленного производства... ..

Зарубежные фирмы («Ох(м<1», «Ыо-Мепеих» и др.) для выделения гемокультур выпускают во флаконах коммерческие питательные среды, готовые к употреблению. Аналогичных питательных сред отечественная промышленность не производит.

В связи с вышеизложенным разработка отечественных питательных сред ' промышленного производства для выделения гемокультуры представляется весьма актуальной.

Цель работы: разработка и экспериментально-клиническое изучение двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры.

Задачи исследования:

— разработать рецептуру жидкой питательной среды обогащения для гемокультуры с учетом физиологических потребностей основных клинически значимых возбудителей бактериемии и сепсиса (жидкая фаза);

— определить в жидкой питательной среде обогащения чувствительность, скорость роста и накопительный эффект микроорганизмов;

— разработать оптимальный состав плотной питательной среды для использования еб в качестве твёрдой фазы при конструировании двухфазной среды;

— изучить чувствительность твердой фазы и скорость роста тест-пггаммов на ней;

— разработать экспериментально-производственную технологию серийного выпуска двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры;

— определить целевые биологические свойства разработанной двухфазной среды в модельных опытах;

— изучить биологические свойства двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры с использованием клинического материала;

— предложить схему бактериологического исследования крови с использованием двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры.

Научная новизна

Научно обоснован и экспериментально апробирован состав новой среды обогащения для гемокультур. Разработанная среда обеспечивала высокую скорость роста, а также накопление при минимальных концентрациях клинически значимых возбудителей бактериемии и сепсиса. Получено положительное решение по заявке № 2003119514/13 (020615) о выдаче патента на среду обогащения для выделения гемокультур.

На основе сконструированной среды обогащения впервые создана двухфазная питательная среда, увеличивающая высеваемость микроорганизмов в 2 раза при ускорении роста гемокультур на 18-20 ч. Получено положительное решение по заявке № 2003137242/13 (039884) о выдаче патента на двухфазную среду для микробиологического исследования крови.

Практическая значимость

Впервые в России разработана и апробирована на производстве предприятия НПО «Питательные среды» ФГУП НПО «Микроген» МЗ и СР РФ двухфазная питательная среда для выделения гемокультуры.

Внедрение среды в практику позволит обеспечить лабораторную службу страны стандартными препаратами для бактериологического исследования крови и будет способствовать снижению межлабораторных вариаций результатов исследований, сокращению времени проведения анализа и установления диагноза при подозрении на бактериемию и сепсис.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.Научно обоснована, создана и апробирована отечественная промышленная технология изготовления двухфазной питательной среды для выделения гемокулыуры.

2. С использованием широкого набора музейных и свежевыделенных микроорганизмов доказана диагностическая ценность впервые разработанной коммерческой двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры. Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (СПб, 2003г.), на 4 Международной научно-практической конференции «Разработка производство стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем» (Махачкала, 2003 г.), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Томск, 2004 г.).

Диссертационная работа апробирована на Межинститутской научной конференции Дагестанского научного центра РАМН, филиала ФГУП «Микроген» МЗ и СР РФ в г. Махачкале НПО «Питательные среды» и Дагестанской Государственной медицинской академии (кафедра микробиологии, вирусологии с иммунологией), Махачкала, 2005 г. Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 в центральной печати. Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 140 источников отечественных и зарубежных авторов, и приложения. Работа

изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц и 14 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе использованы следующие материалы: белковые основы производства филиала ФГУТТ НПО «Микроген» МЗ и CP РФ «Питательные среды» в г. Махачкале: питательный бульон сухой ФС42-3505-98 и панкреатический гидролизат казеина сухой по регламенту производства № 81698; экстракт кормовых дрожжей сухой ФС 42-3441-97, изменение №1; менадион фирмы «Sigma»; гемин, пируват натрия и аргинин Шосткинского завода химреактивов по ТУ 6-09-10-694-77, 6-09-08-990-75 и 6-09-4150-78 соответственно; парааминобензойная кислота фирмы «Himedia»; глюкоза Шосткинского завода химреактивов ГОСТ 6038-79; трис-оксиметил аминометан (трис-буфер) ТУ 6-09-4292-76; цитрат натрия дигидрат ТУ 6-09-0967-77; агар микробиологический, высший сорт, ГОСТ 172 06-84; гепарин фирмы «Merck»; полианетолсульфонат натрия фирмы «Sigma». Штаммы. Для работы использовали 23 музейных тест-штамма клинически значимых возбудителей бактериемии и сепсиса, полученные из ГИСК им. JT.A. Тарасевича: Staphylococcus aureus Wood 46, Staphylococcus aureus FDA 209 P, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Streptococcus pyogenes Dick 1, Streptococcus pyogenes 1512, Streptococcus viridans 22, Streptococcus foecalis 775, Streptococcus pneumoniae ЛД, Salmonella typhi H901, Salmonella typhimurium 79, Proteus mirabilis 71 (2), Proteus vulgaris Hxl9 222, Klebsiella pneumoniae 51, Pseudomonas aeruginosa 27/99, Serratia marcescens 1, Escherichia coli Su 3912/41 (055.K59), Brucella abortus 19 BA, Listeria monocytogenes 56, Yersinia enterocolitica 885, Neisseria meningitidis 637, Haemophilus influenzae 55, Candida albicans ATCC 885/653, а также 267 свежевыделенных микроорганизмов от стационарных больных Республиканского центра инфекционных болезней, г. Махачкала и

амбулаторных больных, обследованных в комплексной научно-консультативной лаборатории клинической микробиологии Дагестанского научного центра РАМН, Дагестанской Государственной медицинской академии и НИИ «Питательные среды» МЗ РФ г. Махачкала.

Среди свежевыделенных гемокультур выявлено: 37 штаммов - S.aureus; 137— S.epidermidis; 2 - S.pyogenes; 1 - S.viridans; 26 - E.coli; 6 - P.mirabilis; 25-P.aeruginosa; 18 - K.pneumoniae; 6 - S.typhimurium; 6 - C. albicans; 3 B.melitensis.

Питательные среды. В работе применяли следующие питательные среды- в качестве среды сравнения - «двойную среду» лабораторного приготовления, рекомендованную для посевов крови « Методическими указаниями по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях» (приложение № 1 к приказу МЗ СССР №535, 1985 г.). «Двойную» среду готовили на основе 150 мл 2% питательного агара и 150 мл сахарного бульона с 0,15 г агара.

Для высева из среды обогащения использовали питательный агар сухой, по ФС 42-188ВС-88; питательный агар с 0,5% глюкозы и 10% инактивированной сыворотки; 5% кровяной и 20% сывороточный агары - для обеспечения роста максимально возможного количества тест-штаммов микроорганизмов при высевах в чашки Петри.

Двухфазную среду разливали в стеклянные флаконы, вместимостью 100 мл и 250 мл, с резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками по ТУ 642-87-87.

Всего было приготовлено 118 образцов жидкой среды обогащения, 53 образца плотной среды и 178 - двухфазной среды. Для клинических испытаний двухфазную среду готовили в двух вариантах: для посева крови от детей - во флаконах, вместимостью 100 мл, содержащих по 20 мл жидкой и плотной среды. Для взрослых двухфазную среду готовили во флаконах, вместимостью 250 мл, содержащих по 50 мл каждого из компонентов. На тест-пггаммах было проведено 736, а на клиническом материале — 557 исследований

Физико-химические методы изучения белковых основ и образцов питательных сред проводили в соответствии с Методическими указаниями, МУК 4.1/4 - 2588 -96 и требованиями Государственной Фармакопеи XI издания. В жидкой среде обогащения определяли содержание аминного азота и показатель рН среды В плотной среде (твердая фаза) определяли прочность студня с помощью прибора Валента и величины рН среды.

Биологические методы оценки качества разработанных сред проводили согласно «Методическим рекомендациям к контролю питательных сред по параметрам роста микроорганизмов в процессе их культивирования» (М.1980 г.). С целью максимального приближения эксперимента к естественным условиям испытание лабораторных образцов проводили в модельных опытах. Для этого кровь человека, получаемую из Республиканской станции переливания крови, инфицировали каждым тест-штаммом из максимального разведения, после чего инфицированную кровь вносили в питательную среду в соотношении 1:10.

Чувствительность среды оценивали по максимальному разведению культуры, при высеве из которого во всех засеянных флаконах (чашках) обнаруживали рост микроорганизмов. Суспензию для высева готовили, используя ОСО мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича (10 ед.). Скорость роста микроорганизмов определяли по минимальному времени инкубации посевов культур, достаточному для визуального выявления микроорганизмов.

Контроль жизнеспособных клеток в посевной дозе осуществляли путем высева ОД мл суспензии каждого тесг-штамма го разведений 10"6 на перечисленные плотные среды. Подсчет количества колоний производили через (18 ± 2) ч инкубации посевов при температуре (37 ±1)°С.

Показатель эффективности среды Рэ определяли как отношение среднего количества колоний микробов (с учетом разведения), выросших при высеве из среды обогащения на плотные среды в чашках Петри, к среднему количеству колоний, выросших на тех же средах без предварительной инкубации в среде обогащения:

Р -"о)-*

ГЭ —

»0

где Рэ - показатель эффективности среды;

Dt - количество колоний, выросших на чашках с плотными средами через (1820) ч инкубации после высева суспензии из жидкой среды обогащения; по - количество жизнеспособных клеток микробов в посевной дозе (без инкубации в среде обогащения); к - степень разведения суспензии.

Показатель высеваемости определяли в процентах к общему количеству посевов крови, этиологическую структуру возбудителей - в процентах к количеству положительных результатов. Идентификацию гемокультур осуществляли по предлагаемой схеме с использованием микротест-систем МТС-12 Е, МТС-С и МТС - СТРЕП производства НПО «Питательные среды» г. Махачкала.

Статистическую обработку материала проводили по методу определения достоверности различий (р) с помощью критерия Стыодента. Достоверными считали результаты при р <. 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Оптимальный состав разрабатываемой жидкой среды обогащения устанавливали на основе известных принципов конструирования питательных сред - качественного и количественного отбора питательных основ и ингредиентов при стабильности изучаемых культур. В качестве белковых основ использовали рыбные (РПГ) и казеиновые (КПГ) панкреатические гидролизаты, к которым добавляли вещества, оказывающие стимулирующий эффект на рост гемокультуры. Исследования показали, что только сочетание рыбного и казеинового панкреатических гидролизатов в соотношении 1:1 обеспечивало рост всех тест-штаммов клинически значимых возбудителей бактериемии и сепсиса при высеве из разведения 10"6. Это позволило снизить общее содержание аминного азота в среде со 170 мг%, рекомендованное для прихотливых (фастидиозных) микроорганизмов (Костюкова H.H., 2001г.) до 140 мг%.

Проведенные нами исследования по выявлению оптимального количества глюкозы в жидкой среде показали, что из всех изученных тест-штаммов заметное влияние она оказывала только на интенсивность роста S.pyogenes Dick 1 и N.meningitidis 637. Это подтвердили расчеты показателя эффективности накопления этих микроорганизмов в зависимости от различной концентрации глюкозы в среде.

При этом установлено, что накопление S.pyogenes Dick 1 и N.meningitidis 637 в разработанной среде обогащения происходило при всех испытанных количествах глюкозы (от 0,25 до 2 %). Однако огггимум показателей эффективности накопления этих тест-штаммов, а также наибольший размер и количество колоний на чашках с плотной средой, наблюдали при 1% концентрации глюкозы в среде (рис.1).

Показатель Рэ

Рис 1. Влияние содержания глюкозы в жидкой среде обогащения на показатель эффективности накопления (Рэ) биомассы S.pyogenes Dick 1 и N.meningitidis 637.

С целью сокращения сроков выделения гемокультуры проведено изучение влияния различных стимуляторов на скорость роста тест-штаммов и на чувствительность среды при минимальной посевной дозе.

Полученные результаты показали, что среди всех испытанных факторов роста наиболее высоким стимулирующим эффектом в отношении высокотребовательных микроорганизмов обладал экстракт кормовых дрожжей

(ЭКД) в количестве 3 г/л и парааминобензойная кислота (ПАБК) в количестве 0,01 г/л.

Чувствительность среды в отношении этих микроорганизмов через (18+2) ч инкубации без внесения ЭКД и ПАБК составляла 10"5, а при внесении указанных стимуляторов роста достигала 10"6 степени разведения.

В связи с этим, в состав конструируемой среды обогащения были введены экстракт кормовых дрожжей как источник витаминов группы В и парааминобензойная кислота, выполняющая роль инактиватора сульфаниламидов, которые могут присутствовать в крови больного в результате проводимой антибактериальной терапии.

Кроме того, нами испытан другой инактиватор бактериальных субстанций крови - полианетол сульфонат натрия, однако как показали наши исследования он ингибирует рост N.meningitidis 637.

Из исследованных в качестве антикоагулянтов цитрата натрия и гепарина предпочтение отдано цитрату натрия, который также способствует снижению бактерицидного действия крови (С.А.Блинкин, 1963). В концентрации 0,4 г/л среды он обеспечивал полное отсутствие сгустка фибрина при посеве крови в жидкую питательную среду.

Особое внимание при конструировании жидкой среды обогащения было уделено подбору буферной системы. Исследования показали, что среди буферных систем наибольшей буферной емкостью, обеспечивающей минимальный сдвиг величины рН в среде, обладал трис-оксиметил аминометан (трис-буфер) Он поддерживал этот показатель в среде в период интенсивного размножения в ней микроорганизмов в пределах 7,3 -7,5, что является оптимальным для роста большинства микробов. При использовании неорганических буферных систем показатель рН в среде уменьшался до 5,0, что тормозило рост микроорганизмов.

Для снижения отрицательного действия метаболитов на рост и размножение микроорганизмов в среды обогащения вводят сорбенты. Основным недостатком испытанного нами активированного угля являлось

помутнение жидкой среды. В то же время известно, что сорбционными свойствами обладает и агар (И.В. Кизеветгер, 1967 г.), в связи с чем он включен в состав разрабатываемой среды. При этом его количество (0,05%) было оттитровано так, чтобы обеспечить прозрачность жидкой среды и возможность наблюдать характер роста тест-штаммов в ней. Введение агара в среду обеспечило удержание пузырьков газа в толще и на поверхности среды при росте газообразующих микроорганизмов. Это позволило провести четкую дифференциацию микроорганизмов по тесту газообразования.

Особое внимание в проводимых исследованиях уделено определению величины посевной дозы тест-пггаммов для внесения в разрабатываемую среду при биологическом контроле ее качества.

Согласно литературным данным у больных с положительной гемокультурой концентрация микроорганизмов в крови колеблется от 1 до 100 микробных клеток в мл (м.к./мл). Учитывая это, в результате проведенных исследований определена оптимальная посевная доза для жидкой среды, равная 500 м.к., что составило 5 м.к. в мл. Это соответствует нижнему пределу напряженности бактериемии, и достаточно информативно (табл.1).

Изучение показателя эффективности среды обогащения свидетельствует о том, что в разработанной среде накопление микроорганизмов превышает контрольную в 1,5-3 раза в зависимости от вида микроорганизма. При этом наибольший показатель эффективности зафиксирован при посеве условно-патогенных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, которые являются основными клинически значимыми возбудителями бактериемии и сепсиса (рис.2).

Полученные показатели чувствительности, скорости роста и эффективности среды были подтверждены в модельных опытах, показавших преимущество разработанной среды обогащения перед контрольной. Опережение в росте микроорганизмов в разработанной среде отмечено не менее, чем на 18 - 20 ч по сравнению с контролем.

Таблица 1.

Рост тест-штаммов в жидкой среде обогащения при различной посевной дозе

Тесг-шгашы Посевная доза

я 1 Я ¡Г V о. « 0,1мл микробной взвеси 0,5мл микробной взвеси

ю-5 1000 м к 10"" 100 м.к. ю-' 10 м к 10" 5000 м.к 10"6 500 м к 10 50 м к

испыт. среда контр, спела испыт. среда контр, среда испыт. среда контр, среда испыт. среда контр, среда испыт среда контр, сиеда испыт. среда контр, среда

&додеюШс1 18±2 +++ + + - - - +++ -н- ++ - + -

Брусуете 1512 18±2 +++ + + - - - +++ ++ ++ - + -

18±2 -Н-+ + + - - - +++ ++ ++ - + -

&рпа1тюиаеДЦ 18±2 +++ + + - - - +++ ++ ++ - + -

8&есаЬ775 18±2 +-н- 4+ + - + - +++ ++ +++ + ++ -

Зажав АТСС 25923 18±2 +++ ++ ++ - + - +++ ++ +++ + ++ -

8ажоб \Vood46 18±2 +++ ++ ++ - + - +++ ++ +++ + ++ -

5дигеи8ГОА209Р 18±2 +++ ++ ++ - + - +++ ++ +++ + ++ -

ЗерйепшЬ АТ0С1499 18±2 4-н- ++ ++ - + - +++ ++ +++ + ++ -

&1яНН901 18±2 -Н-+ ++ -н- - + - +++ ++ +++ + ++ -

&<ур)пштт79 18±2 +++ ++ ++ - + - +++ ++ +++ + ++ -

Рлпа№71/2 18±2 +++ ++ ++ - + - +++ ++ +++ -н- ++ -

Рм%гвНх19222 18±2 +++ -Н- ++ - + - +++ ++ +++ ++ ++ -

К_рпешпогаае51 18±2 +++ ++ -Н- - + - +++ ++ +++ + ++ -

Р аешэпова 27/99 18±2 +++ ++ ++ - + - +++ ++ +++ + ++ -

Блигоеэсав 1 18±2 +++ ++ ++ - + - +++ ++ +++ + ++ -

ЕооКБи39Ш1 (055X59) 18±2 +++ ++ ++ - + - +++ ++ +++ •н- ++ -

1л1тхэ*£01е85б 18±2 +++ ++ ++ - + - +++ ++ ++ + + -

У«агосо(ва885 18±2 ++ - + - + - +++ + ++ + + -

Кяеш^ЬхЬЗ? 18±2 ++ - + - - - +++ - ++ - + -

Нтйиепгае55 18±2 ++ - + - - - +++ - ++ - + -

САкагеАТСС $85/653 18±2 ++ + + - + - +++ + +++ + ++ -

ВАойи&19ВА 36-48 + - + - - - +++ - ++ - +

123456789 10 11

Тест-штаммы

Ш разрабатываемая среда Ш контрольная

Рис.2. Сравнительная характеристика показателей эффективности разрабатываемой и контрольной сред в отношении основных возбудителей бактериемии и сепсиса.

1-Streptococcus, 2- Staphylococcus, 3-Escherichia, 4-SalmoneI!a, 5- Pseudomonas, 6-Klebsiella, 7-Candida, 8-Listeria, 9-Proteus, 10-Enterococcus, 11-Serratia

Разработку состава плотной среды, предназначенной в качестве твердой фазы в двухфазной среде, проводили с учетом основного требования к качеству твердой фазы - обеспечение благоприятных условий для роста, выделения и визуального определения культуральных свойств изучаемых микроорганизмов. Учитывая полученные результаты исследований при конструировании жидкой среды обогащения, ее состав использовали как основу при создания рецептуры плотной среды.

Разработанная плотная среда по сравнению с контрольной обеспечивала ускорение роста прихотливых микроорганизмов (табл.2).

Обобщая данные, полученные при проведении исследований по первым двум этапам работы, а также имеющиеся в литературе рекомендации по методам стерилизации и герметизации питательных сред, нами разработана промышленная технология получения готовой к употреблению двухфазной питательной среды (рис.3).

Таблица 2

Рост тест-штаммов на плотной среде (твердая фаза) в зависимости от посевной __дозы (размер колоний, мм)_

Тесг-шпммы Рюработятая фена (М±т) Среасрюкмия (М± ш)

Ю"(100ик) Ю'(Юшс) ИГ(ЮОмк) КГЧЮмх)

18-20ч 3648ч 18-20ч 3648ч 18-20ч 3648ч 18-20ч 3648ч

ЯдадовОШ 21*5 (4=0,5 ма 21*5 (1=1,0 ш ■ягвтяяй рост

в дрвата 1512 2545 <НЦ5 ш 2545(4=1,0 мм - ияяный рост ■

8\шЬв22 28*5<4=0.8 мм 2845(4=1,2 мм 1845(1=05 мм *

ЯркиготаеДД 23*5(4=05 23*5(442 мм 2Й5 д=0,8мм *

&&евЛ775 З9»ба=ц) мм 612 ¿=1,011« •

ватавАТОС 25923 45*5(1=1,0 4545 с1=У т 8*2 (И,0мм 384=7 (4=03 мя 38*7 <4=Ц)мм 642 <4=0,8 ми

8 аиав\Vocd46 45й4д=Ц мм мм 842(4=0« мм т <4=1,0 мм 2645 д=1,0мм 2645 (4=1Дмм ■ 542 (4=1,0мм

вакш ГОА209Р 51*5 <4=Ц №1 51*5(4=^5 мм ш <4=1,0 мм Ш <4=1,0 мм 31*5 <4=1,0 мм 31*5 (4=1^ мм * 842 (Н2м*

&Чжкт*Ь 14990 54*5 54Й сН8»м т (Н,0м* т д=1Дкм 4845 (4=1,0»« 48*5 (4=и«« 542 <4=0,5 »м

ым 51*5 (Н» ш &2 (1=1,0 612 (ИЦш 4845 (1=1,2 км 4845 <1=1,5 мм ■ 642 (4=15 мм

53±5сИ,6 5345(448 им Ш ¿1=1,5 мм 7±а (4=1,8 мм 5045 (4=1,5 мм 5045 (М,8мм 842 (4=1,8 мм

Р.пиаЫв71Д 404« <1=2,0 мя 8±2 (1=2,0 ш (4Н£2м* «1:7 (4=1,8 мм 424:7 (НОш ■ т (4=2,0 мм

Кргеитсте 51 45±5<Ы0 мм 4545 *=2,8 ■Й2Ф2.0 7Й <4=2,8 ь« 45±5 (4=2,0 мм 45*5 (4=2^ мм 742 (4=2^ мм

Р.аацрхва 2399 3&7(|=Ц) мм 3&=7(4=У мм 7*2 Ъ2 <4=1,5 мм 35=15 <1=1,0 мм 3545 (4=12™ 7542 (4=1,2 мм

8.ншшшб 1 мм 4ЬЬ5(Н5 5±2<4=Ц 542 с4=У м* 43*5 (4=0,8 ми «45 д=Ц) мм 5а2 <4=0,8мм

Еа4 $13912/41 54±5(4=2^ кМ 54*5 (4=2Д ш 8*2сНУ мм Ш 5045 (4=25 мм 5Ш5 (4=2^ мм ■ 8±2 (4=2£мм

В.аЬ<Лщ19ВА - 3245(4=05 мм - 5±2 <4=0,5 ми " - -

КтшвЫБ^ 21*5 21*5 (4=1,2 ми - 542 (4=1,0мм -

С айкапБ АТСС 885/653 Ш5 «но»« 18±5 (4=15 МИ 5±2 (1=1,0 «ли 542 (4=У м* тсда-ФЫЙ рост

Рис.3. Технологическая схема производства двухфазной питательной среды для накопления и выделения гемокультуры.

Состав разработанной двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры в сравнении с контрольной средой представлен в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительный состав двухфазных питательных сред для накопления и

выделения гемокультур (г/л)

Ингредиенты среды Жидкая фаза Твердая фаза

разработанная среда среда сравнения разработанная среда среда сравнения

Питательный бульон сухой 15,0 15,0 15,0 -

Питательный агар, сухой - - - 35,0

Глюкоза 10,0 15,0 5,0 -

Агар 0,5 1,0 25,0 -

экд 3,0 - 3,0 -

Казеиновый панкреатический гидролизат 15,0 - 15,0 -

Трис-буфер 0,6 - 0,6 -

Натрия цитрат дигидрат 0,4 - - -

Парааминобензойная кислота Итого: 0,01 44,51 31,0 63,6 35,0

Испытание готовой к употреблению коммерческой двухфазной среды с клиническим материалом показало ее преимущество по высеваемости гемокультур по сравнению с контрольной средой (рис. 4).

] ■ испытуемая среза □ контрольная среда

Рис 4. Сравнительная характеристика высеваемости гемокультур на разработанной я контрольной средах (п=440),%

Высокая скорость роста гемокультур, выделенных на разработанной среде, в сопоставлении с контролем обеспечивала опережение получения результатов на 18-20 часов (табл.4)

Таблица 4

Скорость роста гемокультуры на разработанной и контрольной

двухфазных питательных средах

Гемокультуры Рост на поверхности твердой фазы

Испытуемая среда Среда сравнения

(20±2)ч (42±6)ч 72ч (20±2)ч (42±6)ч 72ч

S. aureus ++ +++ +++ - + ++

S. epideimidis ++ +++ +++ - ++ +++

S. pyogenes ++ +++ +++ - - -

S. viridans ++ +++ +++ - - -

E. coli +++ +++ +-Н- + ++ +++

P. aeruginosa ++ +++ +++ - + ++

К pneumoniae -н- +++ +++ - + ++

S. typhimurium ++ +++ +++ + ++ +++

P. mirabilis ++ +++ +++ + ++ +++

C. albicans ++ +++ +++ + ++ +++

B.melitensis - ++ +++ - - -

Как видно из таблицы 4, перечень выделяемых микроорганизмов на

разработанной среде шире, чем на контрольной, на которой не были идентифицированы стрептококки и бруцеллы.

Высеваемость гемокультур по видам возбудителя показана на рис.5, из

12Э49«789 Гемокультуры

| Ш разработанная среда И коитролшм среда |

Рис.5 Сравнительная характеристика высеваемости гемокультуры на разработанной и контрольной средах (в % к общему числу посевов): ЬЗ.ешёепшсКв; 2- Б аигеив; 3-Б.утешив; 4-Е.соН; 5-

которого видно преимущество разработанной двухфазной среды перед контрольной по проценту высеваемости основных возбудителей бактериемии и сепсиса.

На разработанную двухфазную питательную среду для выделения гемокультуры получено положительное решение ФИПС, утвержден экспериментально-производственный регламент, а также составлены проекты ФС предприятия и инструкция по применению среды с предложенной схемой выделения гемокультуры (рис.7).

Даухфамея питательна« среда

гп

• •

О ЕЕ

Кроатой Шоколадный слбуро Квталвза

•пр агар агар (гемолиз)

Плазмой»гуля^я По Грому Реакция

аглптинацрм

Антибиотжшрамма

Рве. 7. Предлагаемая схема бактериологической диагностики бактериемия и сепсиса с использованием двухфазной среды

Выводы

На основе изучения физиологических потребностей возбудителей бактериемии и сепсиса разработана жидкая среда обогащения гемокулътуры, состоящая из смеси панкреатических гидролизатов каспийской кильки и казеина в соотношении 1:1, экстракта кормовых дрожжей, глюкозы, парааминобензойной кислоты, агара микробиологического, цитрата натрия и трис-буфера. Показана зависимость эффективности накопления высокотребовательных микроорганизмов (Б.руо^пез ГЙск1 и Ктетн'гщШ&з 637) от содержания глюкозы в среде обогащения. Оптимальный накопительный эффект достигается при внесении в среду глюкозы в количестве 10 г/л. Жидкая среда обогащения обладает высокой чувствительностью и ускоряет рост гемокультур на 18-20 часов. Показатель эффективности накопления клинически значимых возбудителей бактериемии и сепсиса превосходит среду лабораторного приготовления в 1,5-3 раза в зависимости от вида микроорганизма.

На основе жидкой среды обогащения экспериментально обоснована и впервые разработана промышленная технология получения готовой к употреблению двухфазной питательной среды для выделения гемокулътуры.

Созданная двухфазная питательная среда для выделения гемокулътуры стандартна, превосходит контрольную по чувствительности при минимальных посевных дозах микроорганизмов, что позволяет выделить гемокультуру с исходной низкой напряженностью бактериемии. Испытания с клиническими образцами экспериментально-производственной двухфазной среды для выделения гемокулътуры показали ее преимущества перед средой лабораторного приготовления как по срокам выделения, так и по проценту высеваемости широкого спектра клинически значимых микроорганизмов.

7. Предложенная схема бактериологического исследования крови с использованием двухфазной среды позволяет ускорить лабораторную диагностику бактериемии и сепсиса с сокращением сроков установления диагноза на 18-20 часов, а также своевременно провести эффективную антибактериальную терапию.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Повышение эффективности диагностики брюшного тифа и паратифов с помощью новой сухой питательной среды для выделения и предварительной дифференциации гемокультур сальмонелл И Матер. Всероссийской научной конференции, посвященной 105-летию Пермского научно-производственного объединения «Биомед».-Пермь., 2003.-С. 187-189. (Соавт.: Султанов З.З., Меджидов М.М., Степанова Э.Д., Какулина Е.А.)

2. Совершенствование лабораторной диагностики бактериемии и сепсиса // Международный конгресс «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы».- СПб, 2003.-С.180. (Соавт.: Султанов З.З., Меджидов М.М., Степанова, Э.Д., Кулакова Л.С.)

3. Двухфазная питательная среда для накопления и выделения гемокультуры // Матер. 4-й Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию НПО «Питательные среды» МЗ РФ.

- Махачкала.,2003.-С.30-32. (Соавт.: Султанов З.З., Степанова Э.Д., *

Кулакова Л.С. и др.)

4. Сравнительная характеристика питательных сред для накопления и выделения гемокультур // Матер. Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов».-Томск., 2004.-С.233-236. (Соавт.: Султанов З.З., Степанова Э.Д.. Меджидов М.М.,)

5. Разработка и оценка диагностической ценности питательной среды для накопления и выделения гемокультуры // Ж.Микробиол.ЭИ, 2005.-№3,-С.19-22 (Соавт.: Султанов 3.3, Степанова Э.Д., Кулакова Л.С. и др.)

6. Питательная среда для выделении гемокультур // Бюлл. «Изобретения. Полезные модели», ФИПС.-2004.-36 (Зч). - С.497 (Соавт.: Султанов 3.3, Меджидов М.М., Степанова Э.Д. и др.)

7. Питательная среда для микробиологического исследования крови // Бюлл. «Изобретения. Полезные модели», ФИПС.-2005.-16(2ч). - С.658-659 (Соавт.: Султанов 3.3, Меджидов Ш.М., Степанова Э.Д. и др.)

Для заметок

Для заметок

Сдано в печать 14 октября 2005г. Объем печати 1,0 п.л. Заказ № 1156 Тираж 100 Отпечатано: ООО «Спринт-Принт» г. Москва, ул. Краснобогатырская, 92 тел.: 963-41-11,964-31-39

» 1911*

РНБ Русский фонд

2006-4 18528

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Горелова, Виктория Геннадьевна

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА БАКТЕРИЕМИИ И СЕПСИСА И МЕТОДЫ ИХ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

1.1. Особенности современной этиологической структуры бактериемии и сепсиса

1.2. Современные методы выделения гемокультуры

1.3. Питательные среды в лабораторной диагностике бактериемии и сепсиса СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. МАТЕРИАЛЫ

2.2. МЕТОДЫ.

3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ДВУХФАЗНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕМОКУЛЬТУРЫ

3.1. Экспериментальное обоснование состава жидкой питательной среды обогащения гемокультуры (жидкая фаза)

3.1.1. Подбор источников азотистого питания

3.1.2. Изучение влияния различных стимуляторов роста на накопление микроорганизмов

3.1.3. Обеспечение энергетических потребностей микробов и подбор сорбентов для продуктов их метаболизма.

3.1.4. Изучение влияния различных антикоагулянтов и инактиваторов бактерицидных субстанций крови на рост тест-штаммов

3.1.5. Определение оптимальной буферной системы среды обогащения

3.1.6. Изучение чувствительности жидкой среды обогащения и скорости роста тест штаммов

3.1.7. Изучение показателей эффективности накопления тест -штаммов в жидкой среде обогащения

3.1.8. Изучение качества разработанной жидкой среды обогащения в модельных опытах

3.2. Разработка плотной питательной среды для выделения гемокультуры (твердая фаза)

3.3. Определение оптимального соотношения жидкой и твердой фаз в двухфазной среде

3.4. Определение величины посевной дозы тест-пггаммов для двухфазной среды

4. РАЗРАБОТКА ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДВУХФАЗНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕМОКУЛЬТУРЫ

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДВУХФАЗНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕМОКУЛЬТУРЫ

5.1. Изучение биологических свойств двухфазной питательной среды в модельных опытах

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и экспериментально-клиническое изучение двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры"

Бактериемия и сепсис продолжают оставаться одной из актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту количества больных и стабильно высокой летальности даже в самых авторитетных отечественных и зарубежных клиниках. Летальность от сепсиса занимает 13-ое место среди всех причин смертности (Бондаренко A.JI. с соавт., 2001 г., Бодман К.Ф. с соавт., 2004 г., Покровский В.И., Поздеев O.K., 1999 г., Smego R.A. с соавт., 1999 г., Смирнов И.В., 2004 г., Ющук Н.Д., 1990 г.).

Высокая летальность при бактериемии и сепсисе в значительной мере связана с изменением этиологической структуры сепсиса и преобладанием в настоящее время полирезистентных к антибиотикам возбудителей, что в определенной степени объясняет недостаточную эффективность антибактериальной терапии и более высокую, по данным ряда исследователей смертность от сепсиса в сравнении с доантибиотическим периодом (Генчиков JI.A. с соавт., 1986 г., Прямухина Н.С. с соавт, 1996 г., Рафиев Х.К., Саттаров С.С., 2001 г., Руднов В.А., 2000 г., Finkelstein R. с соавт., 2000 г., Dubost J.J. с соавт.2002 г.).

Исходя из этого, к актуальным задачам здравоохранения также относятся поиски путей снижения заболеваемости и летальности населения от сепсиса и создание средств для проведения эффективной диагностики.

Раннее обнаружение микроба-возбудителя в сочетании с оптимальной антибактериальной терапией позволяет кардинально улучшить результаты лечения и значительно снизить летальность (Котлярова А.Н., 2003 г.).

В связи с этим не ослабевает интерес ученых к проблеме бактериологической диагностики и лечения бактериемии и сепсиса, а также организации эффективной противосептической службы (Гельфанд Б.Д., Руднов В.А. и др., 2004 г.).

В 80-х годах прошлого столетия возникла новая клиническая дисциплина - сепсисология, так как было констатировано, что «сепсис перешагнул туберкулез; есть фтизиатрия, должна быть и сепсисология». Для решения проблем сепсисологии была создана научная и лечебная база повышения квалификации врачей и профессорско-преподавательского состава по всем вопросам, касающимся диагностики и лечения бактериемии и сепсиса (Гуревич П.С., 1984 г., Бочоришвили В.Г., Долидзе Н.Г., 1986 г.).

Известно, что в постановке диагноза и расшифровке этиологической структуры бактериемии и сепсиса ведущую роль играют лабораторные исследования.

Кровь является одним из наиболее распространенных образцов клинического материала, исследуемого в бактериологических лабораториях. Обнаружение микробов в крови, будучи одним из наиболее ответственных и трудных микробиологических исследований, расценивается как решающий диагностический критерий, так как точный диагноз, а в дальнейшем и эффективные терапевтические мероприятия, могут быть определены только при положительной гемокультуре (Покровский В.И., Поздеев O.K., 1999 г., Ребенок Ж.А., 2001 г., Самсыгина Г.А., 2003 г., Семина H.A. с соавт., 2001 г.).

Микробиологические исследования крови требуют обеспечения лабораторной службы страны стандартными высокоэффективными питательными средами. Однако исследователи сообщают о плохой оснащенности лабораторий питательными средами для посевов крови, что увеличивает срок постановки диагноза (Волкова И.В., 2001 г., Семина H.A.,2001 г.).

Отечественная промышленность производит значительное количество сухих питательных сред широкого ассортимента, стандартных по своим качественным показателям. Однако для выделения гемокультуры выпускалась всего одна среда - в ФГУП «Аллерген» г. Ставрополь. Это среда узкогоцелевого назначения, только для выделения гемокультуры стрептококка при подозрении на стрептококковую инфекцию.

В то же время известно, что современная этиологическая структура бактериемии и сепсиса чрезвычайно разнообразна и представлена широким спектром грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (Бондаренко А.Л. с соавт., 2001 г., Брусина Е.Б., 2001 г., Зайцев A.A., 2003 г., Ковалева И.С., 2000 г.,Котлярова А.Н., 2003 г., Меркушев Н.В., 2003 г., Федоровский В.В., Афанасова Л.Н., 2003 г., Бодман К-Ф., 2004 г.). Поэтому одной среды для работы с гемокультурой недостаточно. В настоящее время в связи с отсутствием коммерческих питательных сред для выделения гемокультуры практические лаборатории пользуются средами лабораторного приготовления, которые, как известно, трудоемки и нестандартны, так как изготовляются в различных лабораториях с использованием разных ингредиентов, по разным рецептурам, не проходят тестирование с контрольными штаммами, и поэтому не могут обеспечить сопоставимых данных по результатам исследований.tБолее того, по литературным данным, отечественные среды лабораторного изготовления имеют ряд недостатков, к которым относят образование сгустка фибрина при посеве крови в питательную среду, отсутствие в средах инактиваторов бактерицидных субстанций крови, узкий перечень выделяемых микроорганизмов, длительные сроки инкубации посевов (от 3 до 5 суток, а нередко и более того), низкий процент высеваемости гемокультур (от 5 до 20 %, реже около 30 %) (Бадиков В.Д.с соавт., 1998 г., Кулагин П.В. с соавт., 2001 г., Багирова Н.С., Дмитриева Н.В., 2002 г., Бодман К-Ф. с соавт., 2004 г.). Очевидно, по этим причинам в методических рекомендациях по диагностике и терапии сепсиса рекомендовано исключить использование сред лабораторного приготовления, заменив их средами во флаконах промышленного производства (Гельфанд Б.Р. с соавт., 2004 г.)Зарубежные фирмы для выделения гемокультуры выпускают жидкие питательные среды и двухфазные системы во флаконах в готовом к употреблению виде (фирмы «01£со», «Ыо-Мепеих», «Охо1ё» и др.). Эти препараты сложны по составу, содержат сочетание специальных пептонов, набор витаминов, антикоагулянты, инактиваторы бактерицидных свойств крови, сложные буферные системы. Питательных сред, аналогичных по назначению и составу, отечественная промышленность не выпускает.

В связи с вышеизложенным, целью настоящих исследований явилась разработка и экспериментально-клиническое изучение двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены и решены следующие задачи:— разработать рецептуру жидкой питательной среды обогащения для гемокультуры с учетом физиологических потребностей основных клинически значимых возбудителей бактериемии и сепсиса (жидкая фаза);— определить в жидкой питательной среде обогащения чувствительность, скорость роста и накопительный эффект микроорганизмов;— разработать оптимальный состав плотной питательной среды для использования её в качестве твёрдой фазы при конструировании двухфазной среды;— изучить чувствительность твердой фазы и скорость роста тест-штаммов на ней;— разработать экспериментально-производственную технологию серийного выпуска двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры;— определить целевые биологические свойства разработанной двухфазной среды в модельных опытах;— изучить биологические свойства двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры с использованием клинического материала;— предложить схему бактериологического исследования крови с использованием двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры.

Научная новизна.

Научно обоснован и экспериментально апробирован состав новой среды обогащения для гемокультур. Разработанная среда обеспечивала высокую скорость роста, а также накопление при минимальных концентрациях клинически значимых возбудителей бактериемии и сепсиса. Получено положительное решение по заявке № 2003119514/13 (020615) о выдаче патента на среду обогащения для выделения гемокультур.

На основе сконструированной среды обогащения впервые создана двухфазная питательная среда, увеличивающая высеваемость микроорганизмов в 2 раза при ускорении роста гемокультур на 18-20 ч. Получено положительное решение по заявке № 2003137242/13 (039884) о выдаче патента на двухфазную среду для микробиологического исследования крови.

Практическая значимость.

Впервые в России разработана и апробирована на производстве предприятия НПО «Питательные среды» ФГУП НПО «Микроген» МЗ и СР РФ двухфазная питательная среда для выделения гемокультуры.

Внедрение среды в практику позволит обеспечить лабораторную службу страны стандартными препаратами для бактериологического исследования крови и будет способствовать снижению межлабораторных вариаций результатов исследований, сокращению времени проведения анализа и установления диагноза при подозрении на бактериемию и сепсис.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Горелова, Виктория Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. На основе изучения физиологических потребностей возбудителей бактериемии и сепсиса разработана жидкая среда обогащения гемокультуры, состоящая из смеси панкреатических гидролизатов каспийской кильки и казеина в соотношении 1:1, экстракта кормовых дрожжей, глюкозы, парааминобензойной кислоты, агара микробиологического, цитрата натрия и трис-буфера.

2. Показана зависимость эффективности накопления высокотребовательных микроорганизмов (S.pyogenes Dickl и N.meningitidis 637) от содержания глюкозы в среде обогащения. Оптимальный накопительный эффект достигается при внесении в среду глюкозы в количестве 10 г/л.

3. Жидкая среда обогащения обладает высокой чувствительностью и ускоряет рост гемокультур на 18-20 часов. Показатель эффективности накопления клинически значимых возбудителей бактериемии и сепсиса превосходит среду лабораторного приготовления в 1,5-3 раза в зависимости от вида микроорганизма.

4. На основе жидкой среды обогащения экспериментально обоснована и впервые разработана промышленная технология получения готовой к употреблению двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры.

5. Созданная двухфазная питательная среда для выделения гемокультуры стандартна, превосходит контрольную по чувствительности при минимальных посевных дозах микроорганизмов, что позволяет выделить гемокультуру с исходной низкой напряженностью бактериемии.

6. Испытания с клиническими образцами экспериментально-производственной двухфазной среды для выделения гемокультуры показали ее преимущества перед средой лабораторного приготовления как по срокам выделения, так и по проценту высеваемости широкого спектра клинически значимых микроорганизмов.

7. Предложенная схема бактериологического исследования крови с использованием двухфазной среды позволяет ускорить лабораторную диагностику бактериемии и сепсиса с сокращением сроков установления диагноза на 18-20 часов, а также своевременно провести эффективную антибактериальную терапию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Горелова, Виктория Геннадьевна, Москва

1. Акимкин В.Г., Покровский В.И. Нозокомиальный сальмонеллез взрослых. -М., 2002.-130 с.

2. Багирова Н.С., Дмитриева Н.В. Бактериемии у больных гемобластозами // Пробл. Гематологии и переливания крови.-2002.-№4.- С. 21-33.

3. Бадиков В .Д., Журавлева Л.Е., Болехан В.Н., Тихонов Ю.Г., Мазайшвили К.В. Совершенствование методов микробиологического исследования крови у больных с гнойно-септическими инфекциями // Клиническая лабораторная диагностика. -1998.-№7-С. 17-19.

4. Баронец Н.Г. Витамин "К" как стимулятор роста микроорганизмов //Микробиология.- 2003.-С.104-105.

5. Бендас Л.Г., Раскин Б.М., Баранова А.К. Стимулятор бактериального роста из кормовых дрожжей // Лаб.дело.- 1974.-№1.-С. 43-45.

6. Блинкин С.А. Методы ускоренной бактериологической диагностики кишечных инфекций. М., 1963.-С.64-72.

7. Блинкова Л.П., Горобец О.Б., Мельникова В.А. Физиологические и биохимические свойства микроорганизмов // Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований / Под ред. A.C. Лабинской, Л.П. Блинковой, A.C. Ещиной.- М., 2004.

8. Бодман К.-Ф., Лоренц Дж., Бауэр Т.Т., Эвиг С., Траутман М., Фогель Ф. Нозокомиальная пневмония: профилактика, диагностика, лечение // Клин, микробиология и антимикробная химиотерапия.-2004.- Т.6.- №1.- С. 92102.

9. Бондарев Л.С., Заполотная A.A. // Врач.дело.-1990-№6.-С. 221-223.

10. Бондаренко В.М.,Лопушанская O.B. /Комплексный экспресс-метод идентификации гемокультур энтеробактерий //Матер. Всесоюзной научно-практической конференции: "Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике". М., 1983.-С. 133-134.

11. Бондаренко В.М., Марченко В.Г., ,Лопушанская О.В., Руднев И.А., Яблочков А.Л. Этиологическая структура токсико-септических состояний // Эпидемиология и микробиология раневых инфекций: Сб. науч. тр.- М., 1986,- С.31-33.

12. Бондаренко А.Л., Красных А.Н., Попонин М.В., Широнина Н.Л. Случай сепсиса клепсиеллезной этиологии // Ж-л эпидемиологии и инфекционные болезни.- 2001.-№ 4.-С. 35-36.

13. Бочирошвили В.Г., Долидзе Н.Г. Организация противосепсисной службы в Грузии. //В сб. Эпидемиология и микробиология раневых инфекций. -М.Д986.-С.15-17.

14. Брико Н.И., Ещина A.C., Ряпис Л.А. Лабораторная диагностика стрептококковых инфекций. М.,2000.-63 с.

15. Брусина Е.Б. Эволюция эпидемиологического процесса госпитальных гнойно-септических инфекций в хирургии // Ж-л эпидемиология и инфекционные болезни.-2001.-№ 2.- С.10-12.

16. Вайнтруб С.Н., Каюмова М.К. Выделение изменённых форм стафилококка при септических состояниях у детей // Матер. Всесоюзной научно-практической конференции "Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике".- M., 1983.-С.114.

17. Васильева Е.И., Фесечко Л.В., Марченкова A.B., Файнштейн Е.Ш. Клиническая значимость микробиологических исследований крови //Актуальные вопросы клиники железно-дорожной медицины: Опыт диагностики и лечения больных ЦКБ МПС России.- М.Д997.-С. 130-131.

18. Виноградова И.Н., Котова О.Г., Третьякова Л.И. Использование физико-химических показателей в качестве теста однородности казеина приизготовлении питательных сред // Ж-л микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-1966.-№8.-С. 144-145.

19. Вишневская С.М. Изучение питательных сред для выявления бактериемии у хирургических больных // Ж-л лаб. дело.-1983 .-№ 11.-С.58-60.

20. Волкова И.В. Диагностика инфекционного эндокардита // Клинич. антибиотикотерапия.-2001.-№5-Т.6.-С.51 -53.

21. Гельфанд Б.Р., Руднов В.А., Проценко Д.Н., Гельфанд Е.Б., Звягин А.А., Ярошецкий А.И., Романовский Ю.Я. Сепсис: определение, диагностическая концепция, патогенез и интенсивная терапия // Инфекции и антимикробная терапия.- №2- Т.6.- С.46 60.

22. Генчиков JI.A. Здоровье населения и среда обитания //Ежемесячный информ. бюллетень Рос. Респ. информ. аналит. центра Госсанэпиднадзора России.- 1994.-№1.-С. 14-17.

23. Генчиков JI.A., Володина Н.И., Обухова Т.М. Эпидемиологические аспекты сепсиса // Эпидемиология и микробиология раневых инфекций: Сб. науч. тр.- М., 1986.-С.6-8.

24. Горобец О.Б., Блинкова Л.П., Батуро А.П. Влияние примесей в агарах на качество питательных сред // Клин. лаб. диагностика.-2001.-№11.-С. 34.

25. Грубер И.М., Мельникова В.А., Андреева О.А. Усовершенствование питательной среды для выделения бактерий.рода Haemophilus //Матер. 5-й Рос. конф. " Современные проблемы антимикробной химиотерапии".- М., 2003.-С. 16.

26. Грубер И.М., Мельникова В.А. Селективная питательная среда для бактерий родаНаеторЫ lus. // Клинич. лаб. диагн.- 2004.-№1.-С.50-52.

27. Гостев B.C. Биохимические основы медицинской бактериологии.-М.,1951.-С. 88-91.

28. Демешева М.И., Нечисляев В.А. Подбор и конструирование питательных сред для выращивания бифидобактерий // "Актуальные вопросы вакцинно сывороточного дела в XXI веке": Сб. науч. тр.-Пермь, 2003.-С. 290-293.

29. Дехнич А.В. и др. Эпидемиология антибиотикорезистентности нозокомиальных штаммов Staphylococcus aureus в России: результаты многоцентрового исследования //Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.-2002.-Т.4.-№4.-С.325-337.

30. Егорова Н.С. Метаболизм микроорганизмов. М., 1986.-С. 86-106.

31. Емельянова О.С. Микробиология туляремии. М.Д960.-С. 51-95.

32. Жемчугов В.Е. Механизмы сохранения и распространения патогенных микроорганизмов // Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2004.-№ 6.-С. 54-58.

33. Зайцев А.А., Карпов О.И., Сидоренко С.В. Стафилококки и ванкомицин: тенденции противостояния // Антибиотики и химиотерапия.- 2003.-№6.- С. 20-26.

34. Зубков М.Н., Гугуцидзе Е.Н., Чегин В.М., Овсянкин В.М., Кулешов И.Ю. Использование микробиологических и иммунологических методов для экспресс -диагностики сепсиса // Ж-л микробиологии.- 1987.-№3.- С. 120.

35. Зуева Л.П. Основание стратегии борьбы с госпитальными инфекциями и пути ее реализации // Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2000.- № 6.-С.10-13.

36. Иосебашвили Т., Чиквиладзе Д. Роль энтеробактерий в развитии гнойно-воспалительных процессов: Сб. науч. тр. Тбилисского госмедуниверситета.-2000.-№36.-196-200.

37. Кизеветтер И.В. Переработка морских водорослей и других промысловых водных растений. М., 1967.- 416 с.

38. Киселева Б.С., Красноголовец В.Н. Роль Klebsiella pneumoniae в этиологии бактериального сепсиса //Микробиология, эпидемиология и иммунология.-1983.-№2.-С. 20-25.

39. Кобахидзе-Ониани М.А., Жвания М.А. Основные принципы лечения неонатального сепсиса у недоношенных // Сб. тр. Тбилисского госмедуниверситета .-2003.-№4.-С. 49-52.

40. Ковалёва Е.П., Сёмина Н.А. Внутрибольничные инфекции в педиатрии // Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2002.-№ 5.-С.4-6.

41. Королева И.С., Лыткина И.Н., Чистякова Г.Г., Свистунова Т.С., Быкова Р.Н. Эпидемиологические особенности носительства Haemophilus influenzae типа В // Эпидемиология инфекционных болезней.- 2000,- №3.-С.15-19.

42. Коршунова Г.С. Эпидемиологическая ситуация по внутрибольничным инфекциям в Российской федерации в 1997-2001 гг.// Эпидемиология и инфекционные болезни .- 2002.-№5.-С. 22-24.

43. Костюкова Н.Н. Этиологическая структура острых гнойных менингитов и методы их микробиологической диагностики // Клинич. лаб. диагн.-2001 .-№8.-С.25-32.

44. Котлярова А.Н. Оптимизация антибактериальной профилактики и терапии хирургического сепсиса у детей // Матер. 5-й Рос. конф. "Современные проблемы антимикробной химиотерапии М., 2003.- С. 55.

45. Котлярова А.Н. Оптимизация антибактериальной профилактики и терапии хирургического сепсиса у детей. // Матер. 5 Рос. конф. «Современные проблемы антимикробной химиотерапии». М.,-2003.-С. 55.

46. Коэн Д. Современные подходы к лечению сепсиса: есть ли новые надежды? //Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.-2002.-Т.4-№4.-С.300-313.

47. Красильников А.П. Микробиологический словарь-справочник.-Мн.,1986.-С.42-43; 87-88.

48. Кулагин П.В., Савченко Р.П., Иванова B.C., Липовская А.Г., Кулагина И.Г. Диагностическая эффективность микробиологического анализа крови в условиях стационара клинической больницы // Клинич. лаб. диагн.-2001.-№11.-С.36 -37.

49. Лабинская A.C. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., 1978.-С. 351-352.

50. Лабораторная диагностика стрептококковых инфекций / Под ред. В.И. Покровского.- М., 2000.- С. 28-30.

51. Лазарева Е.Б., Мартынова В.А. Этиологическая структура лихорадочных состояний у гематологических больных по данным бактериологических исследований. М., 1983.-С.74-75.

52. Лихварь H.A., Горшанова E.H., Ряполова Р.Г., Швецова Е.А. Получение сухих казеиновых гидролизатов //Технология производства сухих диагностических питательных сред: Сб. науч. тр. Махачкала, 1974.- № 6.-С. 36-38.

53. Машковский М.Д., Бабаян Э.А., Обоймакова А.Н., Булаев В.М., Северцев В.А., Любимов Б.И., Соколов С.Д., Тенцова А.И. Государственная фармакопея СССР.- М., 1990.- С. 194-195.

54. Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам.-М.: Медицина, 2003.- 208 с.

55. Медицинская микробиология /Под ред. A.M. Королюк, В.Б. Сбойчаков.- 2 изд.- СПб: ЭЛБИ-СПб, 2002.-267 с.

56. Мельникова В.А., Скаженик В.Ю. Основы приготовления питательных сред / Под ред. A.C. Лабинской, Л.П.Блинковой, A.C. Ещиной // Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований.- M., 2004.-С. 104-118.

57. Меньшиков В.В. Лабораторная медицина мира начала XXI столетия (заметки с 18-го международного конгресса клинической химии и лабораторной медицины) //Клин. лаб.диагн.-2003.-№4.-С. 52-54.

58. Меньшиков В.В. Научно-практический симпозиум «Организация, менеджмент и экономика клинической лабораторной службы учреждений здравоохранения» // Клин. лаб. диагн.- 2004.- №3.-С. 50-52.

59. Меньшиков Д.Д., Каншин H.H., Пахомова Г.В., Смирнова C.B., Воленко A.B., Лазарева Е.Б. Профилактика и лечение внутрибольничных гнойно-септических инфекций //Эпидемиология и инфекционные болезни.-2000.-№5.-С.44-46.

60. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования вклинико-диагностических лабораториях: Приложение 1 к приказу МЗ СССР № 535 от 22 апреля 1985 г.

61. Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Герхардта и др.- М., 1983.-Т.1.- С. 364-366.

62. Миронов А.Ю., Савицкая К.И., Воробьёв A.A. Условно-патогенные микроорганизмы при гнойно-воспалительных заболеваниях лор-органов и менингитах // Микробиология.- 2001.-№ 2.-С.21-25.

63. Митрохин С.Д. Мупироцин: профилактика внутрибольничных инфекций, вызываемых золотистым стафилококком, и оздоровление госпитальной среды // Антибиотики и химиотерапия.- 2003.- Т. 48.-№ 9.-С. 13-19.

64. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований /Под ред. A.C. Лабинской, Л.П. Блинковой, A.C. Ещиной.-М., 2004.- 533 с.

65. Омарова Э.Б., Меджидов М.М., Султанов 3.3 Способ получения стимулятора роста микроорганизмов из кормовых дрожжей. Пат. на изобретение № 2227158, БИМП, 2004, №11, Зч:516.

66. Османов С.К. Получение и экспериментальное изучение питательных сред с гидролизатами крови животных для микробиологической диагностики стрептококковых инфекций: Автореф. канд. дис., к.м.н.- М., 1982.

67. Основные методы лабораторных исследований в клинической бактериологии.- Женева, 1994.- С. 23-27.

68. Основные питательные среды производства Санофи Диагностике Пастер, применяемые в клинической бактериологии: Каталог.-1999.

69. Осокина Т.И., Астарханова Л.А. Сухие питательные среды для выделения и идентификации стрептококка // Международный конгресс «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней прогресс и проблемы».- СПб, 2003.-175 с.

70. Покровский В.И. Проблемы внутрибольничных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни.- 1996.-№ 2.- С. 4-9.

71. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология.- М.,1999,-С. 583-588.

72. Прямухина Н.С., Коршунова Г.С., Семина H.A., Тясто A.C. Здоровье населения и среда обитания // Ежемесячный информбюллетень Рос. Респ. информ. аналитического центра Госкомсанэпиднадзора России.- 1994.-№12.-С. 1-5.

73. Прямухина Н.С., Семина H.A., Коршунова Г.С., Морозова О.Т. Внутрибольничные инфекции новорожденных // Эпидемиология и инфекционные болезни.-1996.-№2.-С. 15-18.

74. Рафиев Х.К., Сатторов С.С. Этиологическая структура гнойно-воспалительных заболеваний в различных отделениях больниц Душанбе // Эпидемиология и инфекционный болезни.- 2001.-№5.-С. 13-15.

75. Ребенок Ж.А. Возможность диагностики септических заболеваний // Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2001.-№2-С.47-50.

76. Руднов В.А. Современные принципы антибактериальной терапии сепсиса // Антибиотики и химиотерапия.- 2000.- Т. 45.-№ 7.- С. 3-5.

77. Руднов В.А. Сепсис. Эволюция представлений, необходимость унификации терминологии и критериев диагноза //Хирургия .-2000.-№4.-С. 36-40.

78. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней / Под ред. Н.Н.Жукова-Вережникова.- М.Д962.-Т.1.-С. 340-350.

79. Савицкая К.И., Сёмина H.A., Галкин В.В., Абаш Ю.Б. Значение лабораторных исследований в профилактике госпитальной инфекции // Эпидемиология и инфекционные болезни.-2001.-№2.- С. 16-21.

80. Савицкая К.И., Семина H.A., Галкин В.В. Клиническая микробиология: роль сотрудников лаборатории в контроле за госпитальной инфекцией // Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2000.-№5.-С. 20-25.

81. Самсыгина Г.А. Антибактериальная терапия сепсиса у детей // Антибиотики и химиотерапия.- 2003.- Т. 48.-№ 8.- С. 17-27.

82. Семина H.A. Научные и организационные принципы профилактики внутрибольничных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни.-2001.-№5.-С. 5-6.

83. Сёмина H.A., Вымола Ф., Красильников А.П., Влодавец В.В., Белокрысенко С.С. Роль лабораторных исследований в эпидемиологическом надзоре за гнойно-септическими инфекциями // Эпидемиология и микробиология раневых инфекций.- M., 1986.-С. 6-8.

84. Скала JI.3., Сидоренко C.B., Нехорошева А.Г., Резван С.П., Карп В.П. Практические аспекты современной клинической микробиологии. М., 1997.-С. 102-103.

85. Смирнов И.В. Возбудитель иерсиниоза и близкие к нему микроорганизмы //Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.- 2004.-Т.6.-№1.-С. 10-21.

86. Смолянская А.З., Сакаян H.H., Дронова О.Н., Гриненко Г.И., Соколова В.И. Эпидемиологическое значение синегнойной палочки в онкологической клинике // Эпидемиология и микробиология раневых инфекций: Сб.науч.тр.-M., 1986.-С. 14-15.

87. Снелл Э. Основные бактериальные ростовые вещества // Физиология бактерий.-M., 1954.-С. 153-182.

88. Справочник по препаратам фирмы «Oxoid».- Изд.З-е.-С. 4-5.

89. Страчунский JI.C., Решедько Г.К., Рябкова E.J1. и др. Рекомендации по оптимизации антимикробной терапии нозокомиальных инфекций., вызванных грамотрицательными бактериями и интенсивной терапией

90. Пособие для врачей) //Клиническая и антимикробная химиотерапия.2002.-Т.4.-№4.-С.З 79-390.

91. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты.- М., 2000 .- 295 с.

92. Федоров В.В., Куликова М.А. Бактериемия: клинико-бактериологические аспекты проблемы // Клин, лабораторная диагностика.- 1995.- №3.-С. 3-7

93. Федоровский В.В., Афанасова Л.Н. Анализ микрофлоры и результаты теста на госпитальный штамм в хирургическом стационаре // Матер. 5-й Рос. конф. "Современные проблемы антимикробной химиотерапии".- М.,2003.- С. 35.

94. ЮО.Ходоесевич Л.С., Крылова Л.Е., Шипанов И.Н., Воротынцев А.Н., Мочалова Л.Г., Кочетков Н.М. Случай сепсиса, вызванного Haemophilus Influenzae, осложненного абсцессом и разрывом миокарда // Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2005.-№5.-С. 53-54

95. Черкасская P.C., Сёмина H.A., Дарбеева О.С., Мамонтова Т.Н. Характеристика условно-патогенных микроорганизмов возбудителей гнойных инфекций новорожденных // Эпидемиология и микробиология раневых инфекций: Сб. науч. тр.- М.,1986.- С. 27-29.

96. ЮЗ.Ющук Н.Д., Фролов В.М., Пересадин H.A. Клепсиеллезный сепсис //Советская медицина.- 1990.-№6.-С.79-83.

97. Abbot К.С., Agodoa L.Y. Etiology of bacterial septicemia in chronic dialysis patients in the United States //Clin.Nephrol.-2001.-56.-2-124-131.

98. Bibes В., Lion C., Rabaud C., May T. Infections a streptocoque du groupe В chez l'adulte:Etude clinique de 41 bacteriemies //Med. Et malad. Infec. — 2002.-32.-6.-294-298.

99. Castaneda M.R. A practikal method for rautine blood cultures in brucellosis //Proc. Sos.Exp. Biol .Med.,64,114-115. (1947).

100. Cohen Jonathan The immunopathogenesis of sepsis. // Nature (Gr. Brit.).-2002.-420.-6917.-885-891.

101. Cultura media manual, bio Merieux ,1994, 29. Гемолайн 2-х фазного действия.

102. Difco Laboratories. Product for Microbiology.- 1996/97.-86-87.

103. Fernandez G.M.,Ramos J.M.,Marrero J. et. all. Bacteremic pneumococcal promised patients without AIDSrThe impact of beta-lactam resistance on mortality // Int.J.Innfec. Diseasis.- 2003.-7,№1- 46-52.

104. Finkelstein R., Fusman R., Oren I., Kassis I., Yashman N. Clinical and epidemiologic significance of coagulase-negative staphylococci bacterimia in a tertiary cfre university Israeli hospital //Amer.J.Infec. Contr. 2002.-30.-1.-21-25.

105. Hall M.M.,Mueske C.A., Washington I.A. /Evaluation of a biphasis medium for blood cultures // Amer. Sos.Mikrobiol.,Los Angeles.Calif.- 1979.,311.

106. Hall M.M.,Mueske C.A. Waschington J.A. Evaluation of a biphasis medium for blood cultures //J.Clin.Mikrobiol.,10, 6773 -676 (1979).

107. Halmann M., Benedict M., Mager I. Natritional reguirements of Pasteurella tularensis for growth from small inocula // Jörn. General. Microbiol.- 1967.-vol.49.-3 .-451-460.

108. Hill J.M.,Dorn G.L.,Lemeshev Juri. Rapid detektion and quantitation of septicemia // Amer. J.Clin., Pathol., 1980, 73, №2, 305.

109. HiMedia Laboratories Limited, 2002.-28.

110. L hospital quirend malade Rossion Pierre // Sei. et. Vie. 1998.- 965.- 90-97.

111. Lisby Gorm, Brasholt Marie S., Teglbjerg Lars. Bacteremia and meningitides causet by a macrolidesensitive strain of streptococcus pneumoniae during treatment with azitromycin // Clin.Infec. Diseases.- 2001.-33.-3.-415-416.

112. Mackenzie A.R., Laing R., MacDonald A.G., Smith C.C. //Ann. Rheum Diseases.-1997.-56.,№7.-403-404.

113. Mackowiak P.,Prowne R., Southevn P., Smith I. Polimicrobial septsis: analisis of 184 cases using log linear models. "Abstrs^111 Annu.Meet. Amer.Sos.Microbiol. Los Angeles.Calif., 1979 , Washington,D.C.,1979, 13.

114. Macphail G.L.P., Taulor G.D., Buchanan-Chell M.,Ross C., Wilson S., Kureishi A. Epidemiology, treatment and outcome of candidemia : A five-year review at three Canadian hospitals // Mycoses.-2002.-45.-5-6.-141-145.

115. Matejcka F.,Spanik S.,Trupl I. Nosocomial bacteremia due to Klebsiella pneumoniae in cancer patients : Analisis of 49 episodes // Antiinfec.Drugs and Chemother.- 1998. 16 , №3-4. - 233-236.

116. Meynell J., Meynell E. Theory and Practice in Experimental Bacteriology, 2d ed, Cambridge, 1969.

117. Neuman Mark I., Harper Marvin B. Time to positivity of blood cultures ror children with Streptococcus pneumoniae bacteremia // Clin. Infec. Diseases.-2001.- 33.-8.-1224-1328.

118. Passaro D.I., Smith D.S., Hett E.C., Reingold A.L., Daily P., Van Beneden C.A., Vugia D.Y. Invasive group A streptococcfl infections in the San Francisco Bay area, 1989-1999. //Epidemiol. And Infec.- 2002.-129.-3.-471-478.

119. Pirt S. John. Principles of Microbe and cell cultivation // Blackwell Scientific publications Oxford London Edinburg Melbourn, 1975.

120. Prats G., Sanchez F. El hemocultivo en lostiempos de la reaccion en cadena de la polimerasa //Med. clin. 1997 - 108, №14 - p. 534 - 536.

121. Quality control of culture media. Difco laboratories. Detroit Michigan, USA, 1975.-40. 49.

122. Reid Karlene C., Cockerill Franklin R., Patel Robin. Clinikal and epidemiological features of Enterococcus casseliflavus flavescens and Enterococcus gallinarum bacteremia. A. report of 20 cases // Clin. Infec. Diseases.-2001.-32.-11.-1540-1546.

123. Rossion Pierre . L hopital qui rend malade // Sci.et. vie.-1998. №965 .- 90- 97.

124. Scribner Ronald K., Welch David F. / Isolator. Neutrolization of the inhibitory effect of sodium polyanetholesulfonate on Neisseria meningitidis in blood cultures Processed with the Du Pont Isolator System // J. Clin. Microbiol, 1984.-20.-1.-40-42.

125. Smego R.A., Frean J., Koornhof H.J. Yersiniosis: microbiological and clinicoepidemiological aspects of plaque and non-plaque Yersinia infections. //Eur.J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1999.-18.-1-15.

126. Steig Torkil, Iohannesen Niels, Schnheyder Henrik C. Propensity of streptococcus pneumoniae for the aorta. Report of 3 cases // Scfiid. J. Infec. Diseases.-2001.-33.-10.-772-774.

127. Takala A.K., Eskola I., Peltola H., Makela P.H. // Pediat. Infect. Dis. -1989.-8.-297-302.

128. Tee Wee, Montgomery Janet, Dyall-Smith Michael. Bacteremia cfused by a Helicobacter pullarum like organism. // Clin. Infec. Diseases.-2001.-33.-10.-1789-1791.

129. Unal S., Masterton R., Goossens H. Bacteriemia in Europe Antimicrobial Susceptibility Data from the Mystic Surveillance programme. // International Joornal of antimicrobial agents. 2004; 23: 155- 163.

130. Vaqueiro Subirats Montserrat, Sampere Valero M., Font Creus Bernat at all. Bacteriemia pneumococica en pacientes mayors de 65 anos // Med. Clin.- 2001.-117.-7.-241-245.