Разработка хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий

Юнусова, Раисат Юнусовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий"

На правах рукописи

ЮНУСОВА РАИСАТ ЮНУСОВНА

РАЗРАБОТКА ХРОМОГЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И УСКОРЕННОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ УСЛОВНО ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

03.02.03-микробиология

4854453

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 7 ФЕБ 2011

Махачкала - 2011

4854453

Работа выполнена в ФГУП «Микроген» МЗ и СР РФ НПО «Питательные среды» и Дагестанской Государственной Медицинской Академии

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Меджидов Магомед Меджидович

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Степанова Элеонора Давыдовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Блинкова Лариса Петровна

доктор медицинских наук, профессор Шендеров Борис Аркадьевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится 17 февраля 2011 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01. при НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казённый пер., Д.5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Автореферат разослан «Ж> ЛН^^рЛ 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук И.В.Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Условно патогенные энтеробактерии (УПЭ), являясь этиологическим фактором как внебольничных (80-90%), так и внутрибольиичных инфекций (26%), доминируют в структуре урологической микрофлоры и других гнойно-септических заболеваний, при этом 80% всех госпитальных изолятов энтеробактерий составляют 3 наиболее часто выделяемых УПЭ: Е. coli, Klebsiella spp., Proteus spp. ( Ковалева Е.П., Сёмина Н.А.,2002; Меркушев Н.В.,2003; Воропаева Е.А. с соавт.,2005; Сбойчаков В.Б.,2007). В последние годы специалисты также отмечают, что нарушение микробной экологии желудочно-кишечного и вагинального трактов с повышением численности УПЭ (дисбиоз) часто является предрасполагающим фактором возникновения и развития многих неинфекционных соматических заболеваний (Шендеров Б.А., 2008). Количественное содержание общих колиформных бактерий (ОКБ) позволяет характеризовать как общую микробную обсемененность объектов внешней среды, в т.ч. продуктов питания, так и их свежее фекальное загрязнение по наличию Е. coli. Общее число проводимых в Российской Федерации микробиологических и санитарно-гигиенических анализов с целью обнаружения представителей данной группы грамотрицательных бактерий в биологическом материале велико и приводит к огромным трудовым и экономическим затратам.

Эти затраты, прежде всего, обусловлены тем, что регламентируемые действующими нормативными документами схемы идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ, являются громоздкими, трудоёмкими, требующими значительного времени из-за схожести биологических и биохимических характеристик этих грамотрицательных бактерий (Красноголовец В.Н., Киселёва Б.С.,1996; Сиволодский Е.П.,1996.).

В мировой бактериологической практике широкое распространение

получили хромогенные питательные среды (ХПС), выпускаемые различными

зарубежными фирмами ('Merck, bioMerieux, HiMedia и др.). Идентификация

возбудителя с помощью ХПС происходит одновременно с его выделением, что сокращает время на исследование. Хотя спрос практического здравоохранения на подобные питательные среды огромен, в России они до настоящего времени не производятся. В связи с вышеизложенным разработка отечественных ХПС для выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ представляется весьма актуальной проблемой.

Цель работы: разработка и экспериментально-клиническое изучение отечественных хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации часто выделяемых условно патогенных энтеробактерий.

Задачи исследования:

1. Разработать хромогенную питательную среду Колиформ хром агар для одноэтапного выделения, подсчёта и прямой идентификации колиформных бактерий;

2. Разработать хромогенную питательную среду Е. coli хром агар для выделения, подсчёта и прямой идентификации Е. coli;

3. Разработать хромогенную селективную питательную среду ДагХром агар для выделения и одновременной идентификации кишечной палочки и других колиформных бактерий в воде и пищевых продуктах;

4. Разработать хромогенную питательную среду Е. coli-KonH^opM-Proteus хром агар для выделения и прямой идентификации одновременно Е. coli, колиформных бактерий и протеев при клинических исследованиях;

5. Разработать хромогенную питательную среду для выявления и идентификации клебсиелл - Клебсиелла хром агар;

6. Изучить физико-химические и биологические показатели качества созданных сред;

7. Изучить диагностическую ценность разработанных ХПС;

8. Разработать алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с использованием ХПС.

Научная новизна

1. Впервые в нашей стране разработаны и научно обоснованы оригинальные качественные и количественные составы отечественных хромогенных сухих питательных сред для выделения и ускоренной идентификации УПЭ: Колиформ хром агар, Е. coli хром агар, ДагХром агар, Е. coli-KomifyopM-Proteus хром агар, Клебсиелла хром агар.

2. Показаны чёткие дифференцирующие свойства, высокая чувствительность и селективность созданных ХПС, что позволяет значительно ускорить идентификацию УПЭ в сравнении с традиционными средами.

3. Предложен алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с использованием разработанных ХПС.

4. Основные положения научной новизны отражены в патенте на изобретение «Хромогенная селективная питательная среда ДагХром агар для выделения и идентификации кишечной палочки и других колиформных бактерий» (Патент РФ №2386696, от 20.04. 20 Юг), а также в положительном решении о выдаче патента от 08.12.2010 на «Хромогенную питательную среду для выявления и идентификации клебсиелл» по заявке №2008140829/10(052823. Практическая значимость. Разработаны и апробированы ХПС для выделения и ускоренной идентификации УПЭ. Подготовлена нормативная документация на ХПС. Способ усовершенствования микробиологической диагностики инфекций, вызванных УПЭ, внедрён в практику Республиканского Медицинского Центра г. Махачкала (акт о внедрении №10-326 от 17.09.10) и в работу лаборатории клинической микробиологии ООО НПП «Питательные среды» (акт о внедрении №10-325 от 17.09.10). Внедрение в широкую практику здравоохранения разработанных сред будет способствовать более ранней диагностике заболеваний, вызванных оппортунистическими энтеробактериями, и проведению адекватных терапевтических и профилактических мероприятий.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основании экспериментально обоснованных качественных и количественных составов питательных сред впервые разработаны оригинальные отечественные хромогенные питательные среды для выделения и ускоренной идентификации часто выделяемых УПЭ. Составлена нормативная документация для промышленного выпуска препаратов.

2. Сконструированные хромогенные питательные среды не изменяют биологических свойств выросших на них микроорганизмов.

3. С использованием широкого набора музейных и свежевыделейных микроорганизмов при клинических и санитарных исследованиях, выявлена высокая диагностическая ценность разработанных ХПС для выделения и ускоренной идентификации УПЭ. Обосновано преимущество предложенного алгоритма выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с использованием ХПС по сравнению с традиционными схемами.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены на 1-ой Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии» (г. Пущино, 2007 г.); на 17-ом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010 г); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2010» (Москва, 2010 г.). Диссертация апробирована на межинститутской конференции филиала ФГУП «Микроген» МЗ и СР РФ в г. Махачкале НПО «Питательные среды» и ДГМА, г. Махачкала, 2010 г.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 12 публикациях, включая 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, а также представлено в 1 патенте на изобретение и в положительном решении о выдаче патента на изобретение по материалам 2-ой заявки.

Объём и структура диссертации. Диссертация работа изложена на 129

странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,

описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 145 источника отечественных и зарубежных авторов и приложения. Материалы исследований иллюстрированы 30 таблицами и 23 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Питательные среды и белковые основы. В работе использованы: белковые основы производства филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ и CP РФ «Питательные среды» в г. Махачкале - питательный агар сухой (СПА) ФС42-188ВС-88; питательный бульон сухой (рыбный панкреатический гидролизат - РПГ) ФС42-3505-98; казеиновый панкреатический гидролизат сухой (КПГ) по регламенту производства № 816-98; соевый пептон (СП) экспериментально-производственная серия; экстракт кормовых дрожжей сухой (ЭКД) ФС42-3441-97 (Изменение № 1). Для контроля и подтверждения правильности идентификации культур, выделенных на разработанных хромогенных питательных средах. использовали отечественные дифференциально-диагностические среды: среду Эндо, среду с инозитом для выделения клебсиелл (инозит агар), Клиглер агар, цитратный агар Симмонса, полужидкий агар, малонат агар, среду Олькеницкого, среду с аминокислотами (для определения лизин- и орнитиндекарбоксилазы), среду для выделения и идентификации протеев (ППМ агар), среду Кларка, а также хромогенную среду HiCrome"M ЕСС Selective Agar фирмы HiMedia, содержащую агар, ферментативный гидролизат казеина, пептон, триптофан, сорбитол, тергитол, натрия хлорид, натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, натрия пируват, а также хромогенную микстуру, состоящую из хромогенных субстратов - Salmon GAL и X - glucuronide. Для постановки тестов на индол и оксидазу использовали реактивы Ковача и Gaby-Hadlay, соответственно.

Реактивы Шосткинского завода химреактивов применяли в питательных

средах по следующему перечню: трис-оксиметил аминометан (трис-буфер)

ТУ6-09-4292-76, бриллиантовый зеленый ГОСТ 4198-75, бромтимоловый

синий (БТС) ТУ6-09-5430-90, феноловый красный ТУ6-09-5170-84, арабиноза ТУ6-09-1719-72, лактоза ТУ6-09-210877Е, сахароза ГОСТ 5833-75, глюкоза ГОСТ 6038-79, натрий углекислый ГОСТ 5100-73 и L-триптофан ТУ6-09-1492-77; агар микробиологический высший сорт, ГОСТ 172-06-96.

Необходимыми компонентами сред были препараты зарубежных фирм «Sigma» и «Oxoid» - 2-Nitrophenyl ß-D-galactopyranoside (ONPG), 4-Nitrophenyl ß-fl-glucuronide, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-glucurotiide cyclohexylammonium salt (XGIcA), 5-аминосалициловая кислота (5-ACK), парааминобензойная кислота (ПАБК)) и желчные соли № 3.

Штаммы. В работе использовали музейные тест-штаммы (21), полученных из ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича: Escherichia coli Su 3912/41 (055: К59), Escherichia coli ATCC 25922, E.coli 0157:H7 4, Escherichia coli Ewing (0124K72), Escherichia coli 675, Klebsiella pneumoniae 3534/51, Klebsiella oxytoca 3530/50, Enterobacter aerogenes 418, Enterobacter cloacae 10005, Citrobacter freundii 101/57, Serratia plymuthica 1, Proteus mirabilis 3177, Proteus vulgaris Hxl9 222, Providencia rettgeri «Титов», Salmonella enterica Typhimurium 79, Shigella flexneri la 8516, Yersinia enterocolitica 885, Staphylococcus aureus FDA209P, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis 775, Pseudomonas aeruginosa 68, а также 547 клинических изолятов от амбулаторных больных, обследованных в лаборатории клинической микробиологии ООО НПП «Питательные среды» и стационарных больных Республиканского медицинского центра г. Махачкала.

Определение физико-химических и биологических показателей качества разрабатываемых сред проводили согласно Методическим указаниям по контролю бактериологических питательных сред (МУК 4.2 2316-08).

Учёт результатов выращивания производили визуально через 18, 24, 36 и 48 ч инкубации посевов при температуре (37+ 1) °С. Тесты на индол и оксидазу проводили в соответствии с общепринятыми методиками (А.С.Лабинская, Л.П.Блинкова, А.С.Ещина, М., 2004.).

Всего было приготовлено 183 образца ХПС, исследовано 1102 образцов клинического материала, в том числе моча, кровь, мокрота, мазки из JIOP-органов, гениталий. Взятие и посев исследуемого материала проводили в соответствии с приказом МЗ СССР от 22.04.85 г. № 535 «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». Санитарно-микробиологический контроль объектов окружающей среды проводили согласно МУК 4.2.1018-01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды», МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов» и СанПиН 2.3.2.1280-02. «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

Статистическую обработку материала осуществляли с помощью программы Microsoft Excel, определяя достоверность различий (р) между средними величинами по критерию Стьюдента. Достоверными считали результаты при р<0,05.

Результаты исследований и их обсуждение.

В итоге исследования серий экспериментальных образцов было установлено, что для обеспечения питательных потребностей УПЭ оптимальным является вариант использования сочетанных белковых основ -РПГ и КПГ в равных количествах (1:1) (табл. 1). При этом отмечено, что при прочих равных условиях, S. plymuthica 1 отстаёт в росте от других тест-штаммов (105), что диктует необходимость внесения в среду ростстимулирующих добавок.

В качестве стимуляторов роста испытывали ЭКД и ПАБК каждый в отдельности и в сочетании, в количествах, рекомендованных литературными источниками: ЭКД - 3,0 г/л и ПАБК- 0,01 г/л (Султанов 3.3. с соавт., 2005) (табл. 2).

Таблица 1. Сравнительная характеристика чувствительности питательных бульонов, приготовленных на различных белковых основах_

Тест-штаммы Чувствительность питательных бульонов:

РПГ-18,0 г/л КПГ-18,0 г/л СП-18,0 г/л РПГ+КПГ (10,0 г/л+10,0 г/л)

Е. coli 3912/41 10'" 10"6 ю-5 106

К. pneumoniae 3534/51 10'6 10"6 ю-3 10''

Е. aerogenes418 106 10"6 105 10"6

Е. cloacael0005 10" ИГ'' 10"ь нгь

С. freundii 101/57 Ю"6 Ю-6 ю-5 10"6

S. plymuthica 1 10"4 10ч W1 Ю-3

P. vulgarisНх19 222 НУ" ю-6 ю-3 10"6

P. mirabilis3177 10ь ю-6 10- 10"6

P.aeruginosa 68 106 Ю"6 ю-5 10"6

Таблица 2. Сравнительная характеристика чувствительности питательной основы (РПГ+КПГ), с внесением в неё различных ростстимулирующих добавок

Тест-штаммы Показатели чувствительности

ЭКД-3,0 г/л ПАБК-0,01 г/л ЭКД + ПАБК (3,0 г/л+0,01 г/л)

Е. coli 3912/41 ю-' 10"' 10'8

К. pneumoniae 3534/51 ю-' ю-7 10's

Е. aerogenes418 ю-' 10"' 10 s

Е. cloacae10005 10' 10"' 10 s

С. freundii 101/57 ю-' ю-' 10"8

S. plymuthica 1 10"6 Ю"6 ю-'

P. vulgarisHxl9 222 10-' 10-' 10"8

P. mirabilis3177 10-' 10-' 10"8

P. aeruginosa 68 ю-' 10-' 10-'

Совместное внесение ЭКД (3,0 г/л) и ПАБК (0,01 г/л) в питательную

основу, состоящую из смеси РПГ+КПГ 1:1, максимально стимулировало рост всех тест-штаммов, в том числе S. plymuthica 1.

При разработке рецептуры Колиформ хром агара использовали хромогенный субстрат 2-Nitrophenyl ß-D-galactopyranoside (ONPG), выявляющий группоспецифический фермент колиформных бактерий -ß-галактозидазу. Для обнаружения Е. coli среди других колиформных бактерий в среду вводили триптофан в количестве 1,5г/л для выявления триптофаназы E.coli, которую определяли нанесением реактива Ковача (тест на индол) на жёлтые колонии тест-штаммов. При этом следует отметить, что индолположительные штаммы К. oxytoca в объектах окружающей среды встречаются довольно редко (Сбойчаков В.Б.,2007).

Для обеспечения селективных свойств среды (подавления грамположительной микрофлоры) и для исключения её стерилизации в состав Колиформ хром агара ввели жёлчные соли и бриллиантовый зелёный, что обеспечило отсутствие роста S. aureus FDA209P при посеве из разведения 10"'.

Характер роста тест-штаммов УПЭ на Колиформ хром агаре и среде Эндо (среда сравнения) приведен в таблице 3.

Таблица 3. Характер роста колоний тест-штаммов на Колиформ хром агаре и среде Эндо (через 18± 2 ч инкубаций при 37+1 °С). _

Тест-штаммы Разведение Характеристика колоний (КОЕ) на Колиформ хром агаре Тест на индол Характеристика колоний (КОЕ) на среде Эндо

КОЕ MiM Размер мм Форма Цвет КОЕ М± м Размер мм Форма Цвет

Е. coli 3912/41 106 55+5 2,2 + 0,2 S- форма жёлт с жёлт, ор. + 45 ± 3 2,2 ±05 S- форма краен с блеск

К. pneumoniae 3534/51 -II- 52+5 2,0 ±0,2 -II- -II- - 47 ± 3 2,5 ±05 -II- краен

Е. aerogenes 418 48+4 2,5 ± 0,3 -II- -II- - 45 ± 4 2,5 ±05 -II- -II-

Е. cloacae 10005 -II- 48 ±4 2,5 + 0,3 -II- - 42± 3 2,5 ±05 -II- -II-

С. freundiil01/57 -II- 46+4 2,5 ±0,5 -II- -II- - 45+3 2,5 ±05 -II- -II-

S. plymuthica 1 -II- 46 + 4 1,3 + 0,2 -II- -II- - 38 + 3 1,3 ± 02 -II- б/цв

P. mirabllis 3177 -II- 45+4 2,8 ±0,5 О- форма 6/цв - роение, сплошной газон бледно - розового цвета

P. vulgaris Hxl9 222 -II- 48+4 2,0 ±0,2 О- форма -II- + -II-

S. typhimurium79 -II- 58 + 5 2,5 ±0,3 S- форма -II- - 50± 5 2,5 ±05 S- форма б/цв

S. flexneri la 8516 -II- 45+5 1,5 ±0,2 -II- -II- - 42 + 3 1,5 ±02 -II- б/цв

P. aeruginosa 68 -II- 47 + 4 1,5 ±0,2 -II- -II- - 48 ± 2 1,5 ±02 -II- розов

S. aureus FDA209P lo-1 рост отсутствует рост отсутствует

Примечание: + положительный тест на индол с розовым окрашиванием колоний; - отрицательный тест на индол (колонии жёлтого цвета).

Колонии тест-штаммов на Колиформ хром агаре сохраняли свои физиолого-биохимические свойства, не уступая среде Эндо по количеству и размерам колоний. Кроме того, на Колиформ хром агаре, в отличие от среды Эндо, отсутствовало роение протея (рис. 1 а, б.).

а) Колиформ хром агар б) Среда Эндо

Рис. 1. а) Колиформ хром агар. Рост смеси тест-штаммов Е. coli 3912/41(жёлтые) и P. vulgaris Нх19 222 бесцветные) при посеве из разведения 10~6; б) Среда Эндо. Рост смеси тест-штаммов Е. coli 3912/41 (красные) и Р. vulgaris Нх19222(роение) при посеве из разведения 10"6

Следует отметить , что к преимуществам разработанной среды относится

также отсутствие светочувствительности в отличии от среды Эндо, которую

хранить длительное время не рекомендуется.

Для разработки следующей среды Е. coli хром агар в качестве основы использовали Колиформ хром агар, в котором хромогенный субстрат ONPG заменили на ß-D-глюкуронид. Среди хромогенных субстратов, выявляющих видоспецифический фермент Е. coli - ß-глюкуронидазу испытывали 5-Вгото-4-chloro-3-indolyl ß^-glucuronide cyclohexylammonium salt (XGIcA) и 4-Nitrophenyl ß^-glucuronide фирмы «Sigma», которые при расщеплении ß-глюкуронидазой, окрашивали колонии Е. coli соответственно в синий или жёлтый цвет. Показано, что интенсивность окраски колоний Е. coli на разработанной среде зависела не только от химической структуры использованного хромогенного субстрата, но и от его количества (табл. 4).

Таблица 4. Влияние химического состава и количества хромогенных субстратов на интенсивность окраски колоний тест-штамов_

Цвет колоний

<D U г х Е. coli Su 3912/41 Е. coliАТСС25922 К. pneumoniae 3534/51

§ 2 « н 4-Nitrophenyl ß-Д-glucuronide XGIcA 4-Nitrophenyl ß-Д-glucuronide XGIcA 4-Nitrophenyl ß-Д-glucuronide XGIcA

0,1 бледно-жёлтые голуб. бледно-жёлтые голуб. б/цвет б/цвет

0,2 бледно-жёлтые синие бледно-жёлтые синие б/цвет б/цвет

0,3 бледно-жёлтые тёмно-синие бледно-жёлтые тёмно-синие б/цвет б/цвет

0,4 желтые с тёмно- жёлтые с тёмно- б/цвет б/цвет

жёлтым ореолом синие жёлтым ореолом синие

При использовании 4-Nitrophenyl ß^-glucuronide его количество в среде для достижения интенсивной жёлтой окраски колоний Е. coli должно быть вдвое больше (0,4 г/л), чем хромогенного субстрата XGlcA с синей окраской колоний Е. coli (0,2 г/л). Глюкуронидазаотрицательные УПЭ во всех случаях оставались бесцветными (рис. 2). Среда Е. coli хром агар наиболее удобна при санитарно-микробиологических исследованиях, а, именно, для ускоренного определения коли-титра воды.

Рис.2. Среда Е. coli хром агар. Рост тест-штаммов Е. coli 3912/41и Е. coli АТСС25922 (синие - колонии), Е. aerogenes418 и С. freundii 101/57(бесцветные колонии). Посев штрихом чистых культур и из разведения 10"6 (1:1)

Для одновременного выявления и подсчёта Е. coli и колиформных

бактерий нами предложена среда ДагХром агар, содержащая два хромогенных

субстрата (ONPG и XGlcA). Контролем являлась хромогенная среда HiCrome'mi

ЕСС Selective Agar. На ДагХром агаре колонии Е. coli окрашивались в сине-

зелёный цвет с жёлтым ореолом вокруг колоний благодаря расщеплению

обоих субстратов. Остальные колиформные бактерии имели жёлтый цвет с

жёлтым ореолом, поскольку расщепляли только один хромогенный субстрат -

ONPG (рис. 3). На среде HiCromem" ЕСС Selective agar колонии Е. coli

окрашивались в фиолетовый цвет, а колиформные бактерии - в оранжево-

красный цвет. Колонии Proteus spp., S. flexneri, S. typhimurium и P. aeruginosa

на обеих средах оставались бесцветными. Среда ДагХром агар, также как и

HiCromeЕСС Selective agar, обеспечивала в течение 18±2 ч идентификацию

колиформных бактерий, в т.ч. и Е. coli с сохранением стабильными

биологических свойств. Однако контрольная среда в сравнении с ДагХром

агаром не полностью подавляла роение протея (табл. 5).

Таблица 5. Характер роста колоний тест-штаммов на ДагХром агаре и среде HiCrome'™ ЕСС Selective agar (через 18 + 2 ч инкубаций при 37+ 1 °С)_

Тест-штаммы Разведение Характеристика колоний на ДагХром агаре Характеристика колоний на среде HiCrome ЕСС Selective agar

КОЕ М + м Размер мм Форма Цвет КОЕ М± м Размер мм Форма Цвет

Е. coli 3912/41 Ю" 55 + 5 2,2+0,2 S- форма сине- зелёные с жёлтым ор. 55 + 5 2,2 ±05 S- форма Фиолет овые

К. pneumoniae 3534/51 -11- 52+5 2,0+0,2 -II- жёлт с жёлт, ор. 55 ±5 2,5 ±05 -II- Оранж ево-красн

Е. aerogenes418 -II- 48 + 4 2,5 ± 0,3 -II- -II- 48 ± 4 2,5 ±05 -II- -II-

Е. cloacae 10005 -II- 48 ± 4 2,5 ±0,3 -II- -II- 47 ± 4 2,5 ±05 -II- -II-

C.freundii 101/57 -II- 46± 4 2,5 + 0,5 -11- -II- 45 ± 4 2,5± 05 -II- -II-

S. plymiithical -II- 46 ± 4 1,3 ±0,2 -II- -II- 45 ±4 1,3 ± 02 -II- -II-

P. mirabilis 3177 -II- 45 ±4 2,8 ±0,5 О- форма б/цв О-Н-форма, б/цв

P. vulgaris Hxl9 222 -II- 48 ±4 2,0 ±0,2 О- форма -II- -II-

S. typhimurium 79 -II- 58± 5 2,5 ±0,3 S- форма -II- 55+5 2,5 ±05 S-форма б/цв

S. flexneri la 8516 -II- 45+5 1,5 ±0,2 -II- -II- 42 ± 3 1,5 + 02 -II- б/цв

P. aeruginosa 68 -II- 47 ±4 1,5 ± 0,2 -II- -II- 48+4 1,5± 02 -II- б/цв

S. aureus FDA209P ю-1 рост отсутствует рост отсутствует

Стерилизация Не требуется Щадящая стерилизация (3 дня)

Кроме того, из-за присутствия в среде HiCrome""" ЕСС Selective Agar термолабильных компонентов требуется дробная стерилизация её путём 3-кратной обработки среды в открытой струе пара, в то время как ДагХром не требует стерилизации.

Рис.3. Среда ДагХром агар. Рост тест-штаммов Е. соЧАТСС25922 (сине-зелёные с жёлтым ореолом), Е. aerogenes 418 (жёлтые с жёлтым ореолом) и P. vulgarisHxl9 222 (бесцветные). Посев смеси бактерий из разведения 10~6 (1:1) и чистых культур штрихом.

Таким образом, предлагаемая среда ДагХром агар не уступает зарубежному аналогу по дифференцирующим свойствам и срокам идентификации Е. coli и колиформных бактерий.

Среди возбудителей вне- и внутрибольничных инфекций часто выделяют Proteus spp. Используемая среда ППМ агар для выделения и идентификации Proteus spp. по принципу выявления родоспецифического фермента протеев триптофандезаминазы (ТДА), предполагает внесение в среду ex temporae 10%-го р-ра хлорного железа. Нами разработана среда Е. со/г'-колиформ-Рго/ег« хром агар, которая позволила исключить введение добавок ex temporae. С этой целью в среде увеличили количество триптофана до 7,0 г/л, что обеспечило коричневую окраску колоний протеев, такую же как в случае использования добавки раствора хлорного железа (рис.4). Культуры, выделенные со среды, сохраняли стабильные физиолого-биохимические свойств.

Рис. 4. Среда Е. соИ-копифори-Pmteus хром агар. Рост тест-штаммов Е. coli АТСС25922 (сине-зелёные с жёлтым ореолом), К. pneumoniae 3534/51 (жёлтые с жёлтым ореолом), Р. vulgaris Нх19 222 (коричневые с коричневым преципитатом) и S. typhimurium 79 (бесцветные). Посев из разведения 10~6 (1:1) и чистых культур штрихом.

Разработанная среда Е. соН-колиформ-Pwteus хром агар может быть использована взамен среды Эндо, регламентируемой действующими в РФ нормативными документами, что позволит сократить затраты времени на исследование и одновременно идентифицировать Е. coli, колиформные бактерии, а также провести родовую идентификацию Proteus в течение 18±2 ч (рис.5).

Существующая Это ага|Т(18±2 ч)

Исследуемый образец Предлагаемая

Е. coli ко. тфор м-Proteus хром at tip (18±2ч)

____Красные колонии с металлическим

' блеском и без него

Окраска по Граму

Грам «-»

Оксид аза

Оксидаза «-»

Глюкоза

Глюкоза «+» газ «+» при 37°С

(18±2 ч) - ОКБ Лактоза «+» газ «+» при 44,5°С

(18±2 ч)—Е. coli'.'

ИМАЦ-тест:

>. Сине-зелёные колонии

Е. coli *■ Жёлтые колонии ОКБ

—*■ Бесцветные колонии Salmonella. Р.aeruginosa

Коричневые колонии с корич. преципитатом

Proteus spp.

Общие затраты времени-18±2 1

1. Индол +

2. Метиловый красный +

Е. coli

3. Ацетилметилкарбинол - (48±2 ч) | Общие затраты времени-72 ч.

4. Цитрат Симмонса - (18±2 ч) Рис.5. Схемы идентификации Е. coli, ОКБ, а также родовой идентификации Proteus.

Для выявления и ускоренной идентификации клебсиелл нами разработана среда Клебсиелла хром агар на основе способности этих микроорганизмов продуцировать специфический фермент 5-аминосалицилатдекарбоксилазу, которая расщепляет 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК) (Сиволодский Е.П. с соавт., 1996.). В качестве питательной основы среды Клебсиелла хром агар использовали сухой питательный агар. В процессе исследований установили ингибирующее действие 5-АСК на рост тест-штаммов, в связи с чем в среду ввели ЭКД и ПАБК, что позволило достичь увеличения размера колоний в 1,5-2 раза. Для подавления грамположительной микрофлоры в среде использовали сочетание 5-АСК с бриллиантовым зелёным. Для выявления УПЭ, не продуцирующих 5-аминосалицилатдекарбоксилазу, в среду вводили глюкозу и бромтимоловый синий. Характер роста тест-штаммов на Клебсиелла хром агаре и инозит агаре представлен на рис.6.

б)

Рис.6. Среда Клебсиелла хром агар (а) и среда инозит агар(б). Рост смеси тест-штаммов К. pneumoniae 3534/51 и S. plymuthica 1. Посев из 10-6 разведения (1:1). На Клебсиелла хром агаре коричневые колонии клебсиелл с отчетливым

коричневым преципитатом чётко отличались от жёлтых колоний S. plymuthica,

а на инозит агаре дифференциация отсутствовала из-за идентичной окраски тех

и других колоний. Проводя исследования, мы обнаружили, что Е. aerogenes

также продуцирует 5-аминосалицилатдекарбоксилазу, образуя колонии

коричневого цвета с коричневым преципитатом (табл. 6).

Таблица 6. Сравнительная характеристика дифференцирующих свойств Клебсиелла хром агара и сред сравнения (среда Эндо и инозит агар). Посев из разведения 10'6._

Тест-штаммы Характер роста микроорганизмов на питательных средах

Клебсиелла хром агар Среда Эндо Инозит агар

КОЕ М±т и размер(с!) Форма и цвет КОЕ М+ m и размер(с1) Форма и цвет КОЕ М + m и размер(с1) Форма и цвет

К. pneumoniae 3534/51 56+5 1.8 + 0.2 Э-форма, корич. с корич.прецип 47 + 4 2,0+0,2 Э -форма, красные 56+5 2,0 + 0,2 Б-форма, жёлтые

К. oxytoca 3530/50 55 + 5 1.8 + 0.2 Б-форма, корич. с корич. прецип 50± 5 2,2+0.2 Э -форма, красные 54+5 1,8 + 0,2 Б-форма, жёлтые

Е. aerogenes 418 58 + 5 1,8+0.2 Б-форма, корич. с корич. прецип 50 + 5 2.0+0.2 Э-форма, красные 55+5 2,2 + 0,2 Б-форма, жёлтые

Е. coli Su 3912/41 57+5 2.2+0.2 Б-форма, жёлтые 55 + 5 2,5+0.3 Э -форма, красные 58+5 2,2 + 0,2 Б-форма, голубые

Е. cloacae 10005 52+4 2.5 + 0.5 Б-форма, жёлтые 55 ± 5 2.5 + 0.5 Э-форма, красные 51 + 4 2,5 + 0,3 Э-форма, голубые

С. freimdii 101/57 56+5 2.2+0.2 Б-форма, жёлтые 52 + 4 2.0+0.2 Э-форма, красные 55 + 5 2,0 ±0,2 Б-форма, голубые

S. plymuthica 1 48 + 4 1.5+0.2 Э-форма, жёлтые 42 + 3 1,0+0.2 Б-форма, б/цв 45 + 4 1,0+0,2 Б-форма, жёлтые

P. rettgeri «Титов» 54+5 1.8 + 0.2 О-форма, жёлтые 56+5 1,8+0.2 О-форма, б/цв 53 + 4 1,8 + 0,3 О-форма, жёлтые

P. mirabilis 3177 56 + 4 1,8 + 0.2 О-форма, жёлтые роение 53 + 4 1,8 + 0.2 О-форма, голубые

На предлагаемой среде только клебсиеллы и Е. aerogenes формировали колонии коричневого цвета с коричневым преципитатом, что является их специфическим дифференцирующим признаком, а на средах сравнения дифференцировать эти микроорганизмы от других УПЭ невозможно из-за сходства окраски колоний большинства УПЭ. Для дифференциации Е. aerogenes от Klebsiella spp., вырастающих на Клебсиелла хром агаре в виде коричневых колоний с коричневым преципитатом, проводят посев коричневых колоний со среды Клебсиелла хром агар в полужидкий агар для отличия их друг от друга по тесту подвижности. Все выделенные со среды культуры сохраняли свои биологические свойства.

Характеристики составов разработанных сред представлены в таблице 7.

Таблица 7. Качественные и количественные составы разработанных ХПС.

Ингредиенты Колиформ Е. coli- ДагХром Е. coli- Клебсиелла

хром агар хром агар колиформ- хром агар

(г/л) агар (г/л) Proteus хром (г/л)

(г/л) агар (г/л)

РПГ 10,0 10,0 10,0 10,0 -

ПКГ 10,0 10,0 10,0 10,0 -

СПА - - - - 35,0

экд 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

ПАБК 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

Триптофан 1,5 1,5 1,5 7,0 -

ONPG 0,4 - 0,4 0,4 -

XGlcA - 0,2 0,2 0,2 -

5-АСК - - - - 2,0

Желчные соли 1,5 1,5 1,5 1,5 -

Бриллиантовый 0,0002 0,0002 0,0002 0,0002 0,0002

зеленый

Агар микробиолог. 15,0 15,0 15,0 15,0 -

Глюкоза - - - - 5,0

БТС - - - - 0,08

Натрий углекислый - - - - 0,6

Трис-буфер 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

В отличие от зарубежных аналогов ХПС, созданные оригинальные среды

содержат отечественные ингредиенты - питательные основы, стимуляторы

роста, селективные агенты и др., которые в сочетании с подобранными

оптимальными количествами хромогенных субстратов позволили провести

чёткую идентификацию УПЭ через 18±2 ч, не уступая зарубежным аналогам.

Культуры, выделенные с предлагаемых сред, стабильно сохраняли присущие им физиолого-биохимические свойства.

Изучение разработанных сухих ХПС через 6, 15 и 24 месяцев со дня приготовления, выявило стабильность их физико-химических и биологических свойств. Среды подготовлены для промышленного выпуска в сухой и готовой к применению форме. На среды составлена нормативная документация.

Клинические испытания разработанных ХПС показали, что процент ß-глюкуронидазоположительных Е. coli, был весьма значительным (98%). Образование ß-галактозидазы у колиформных бактерий, ТДА у протеев и 5-аминосалицилатдекарбоксилазы у клебсиелл наблюдалось у всех выделенных штаммов (табл. 8).

Таблица 8. Выявление родо- и видоспецифических ферментов УПЭ, выделенных из различного клинического материала__

Микро- E. саП-колиформ-Proteus хром агар Клебсиелла хром агар

организмы В-глюкуронидаза-положительные ß-галактози-дазаположит ТДА-положит. 5-АСдекарбоксилазо-положительные

u и о в к-во % к-во % к- во % к-во %

Е. coli 382 374 98 382 100 0 0 0 0

Klebsiella spp. 125 0 0 125 100 0 0 125 100

Е. cloacae 4 0 0 4 100 0 0 0 0

С. freundii 3 0 0 3 100 0 0 0 0

P. mirabilis 27 0 0 0 0 27 100 0 0

S. marcescens 2 0 0 2 100 0 0 0 0

Полученные результаты подтвердили высокую специфичность хромогенных питательных сред - Е. ео/г-колиформ-Рго/еги хром агар и Клебсиелла хром агар в отношении часто выделяемых УПЭ - Е. coli, Klebsiella spp. и Proteus spp. Использование разработанных ХПС, позволило существенно сократить количество тестов для идентификации УПЭ (табл.9).

На основании результатов проведённых исследований нами предложен алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ (Е. coli, Klebsiella spp., Proteus spp. и др.). Посев исследуемого материала следует проводить параллельно на две разработанные среды - Е. соИ-колиформ-Proteus хром агар и Клебсиелла хром агар, а также на полужидкий агар, питательный агар (ПА) и питательный бульон (ПБ). После

18±2 ч инкубации чашек с посевами при температуре 37+ 1 °С в случае обнаружения на среде Е. coli-Kosm^o^u-Proteus хром агар сине-зелёных колоний с жёлтым ореолом (Е. coli) и коричневых колоний с коричневым преципитатом (Proteus spp.), а на Клебсиелла хром агаре - коричневых колоний с коричневым преципитатом (клебсиелл и Е. aerogenes), постановка теста на оксидазу, как и посев на среду Клиглера и цитратный агар в основном не требуется, а при необходимости постановка дополнительных тестов не исключается. Колонии Е. aerogenes дифференцируются от Klebsiella spp., как выше сказанно, по тесту подвижности (рис.7).

Исследуемый материал

Е. сол-колиформ-Proteus xdom агар

Полужидкий агар

тест на оксидазу

Клиглер Цитратный агар агар

Рис.7. Предлагаемая схема выделения и ускоренной идентификации клинически-значимых и санитарно-показательных УПЭ.

Для идентификации бактерий, выросших в виде жёлтых или бесцветных колоний на Е. со//-колиформ-Рга?е«,5' хром агаре, производят посев этих колоний с Е. соЛ-колиформ-Рго/ег« хром агара в среду Клиглера и цитратный агар, а также исследуют в тесте на индол и оксидазу. Идентификацию клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ проводят по совокупности биохимических свойств, представленных в таблице 9.

Таблица 9. Предлагаемые биохимические тесты для ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ.

УПЭ Питательные среды Тест

E.coli колиформ-Proteus хром агар Клебсиелла хром агар Клиглер агар Полужидкий агар Цитрат Симмонса Индол (тест) триптофаназа

1 галактозидаза [ глюкуронидаза 5-АСК Лактоза Глюкоза / газ сл Я подвижность пигмент

Е. coli - + + - +/+ - - - +

Е. coli гдюкуронидазо -отрицательные + + +/+ + +

К. pneumoniae - + + + +!+ - - - + -

К. oxytoca - + - + + +/+ - - - + +

Е. aerogenes - + - + + +/+ - + - + -

Е. cloacae - + - - + +/+ - + - + -

С. freundii - + - - + +/+ + + - + -

S. marcescens - + - - - +/- - + +(красн), - + -

P. vulgaris + - - - - +/+ + + - + +

P. mirabilis + - - - - +/+ + + - + -

Y. enterocolitica - + - - - +/- - (37°С) - - +

Примечание: + = положительны для 90% или более изученных штаммов - = отрицательны для 90% или более изученных штаммов

Отсутствие микробного роста микроорганизмов на ХПС при его наличии на питательном агаре свидетельствует о присутствии в исследуемом материале грамположительных микроорганизмов, что следует подтверждать окраской по Граму и проведением дальнейших регламентированных действующими документами исследований на грамположительную микрофлору.

Таким образом, предлагаемая нами оптимизированная схема выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ, позволяет через 18±2 ч идентифицировать: Е. coli, К. pneumoniae, К. oxytoca, P. vulgaris. P. mirabilis и Е. aerogenes. Идентификация до вида остальных УПЭ осуществляется в течение 36 ч вместо 3-5 суток по действующим нормативным документам.

выводы

1. Впервые экспериментально обоснован оригинальный качественный и количественный состав отечественных хромогенных питательных сред, подготовленных для производства в сухой и готовой к применению форме:

- Колиформ хром агар для выделения, подсчёта и ускоренной идентификации общих колиформных бактерий в объектах окружающей среды;

- Е. coli хром агар для выделения, подсчёта и прямой идентификации Е. coli\

- ДагХром агар для выделения и идентификации кишечной палочки и других колиформных бактерий в воде и пищевых продуктах;

- Е. со/;'-колиформ-Рга/еи5 хром агар для выделения и прямой идентификации одновременно E.coli, колиформных бактерий и протеев;

Клебсиелла хром агар для выявления и идентификации клебсиелл и Е. aerogenes.

2. Установлена зависимость интенсивности роста колиформных бактерий от содержания в среде ростстимулирующих добавок - ЭКД и ПАБК. Оптимальные концентрации указанных ингредиентов позволили увеличить чувствительность среды в отношении роста часто выделяемых УПЭ с 10"5 до 10"7-10"8.

3. Определены оптимальные количества содержания в средах хромогенных субстратов, обеспечивших визуальную регистрацию ß-галактозидазы колиформных бактерий, ß-глюкуронидазы и триптофоназы Е. coli, триптофандезаминазы протеев и 5-аминосалицилатдекарбоксилазы клебсиелл и Е. aerogenes.

4. Сконструированные дифференциально-диагностические хромогенные питательные среды характеризовались стабильными биологическими свойствами выделенных культур.

5. Предложен алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с помощью созданных хромогенных питательных сред, позволяющих существенно сократить сроки идентификации возбудителя (с 3-5 суток до 18-36 ч), что значительно упрощает процесс проведения бактериологических исследований

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Меджидов ММ. Разработка хромогенной питательной среды для ускоренной индикации колиформных бактерий. / Степанова Э.Д., Юнусова Р.Ю., Курбанова М.И., Горелова В.Г., Мирзегасанова З.В., Куделько Е.А. // Матер. Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - М.-2006.-С.65.

2. Меджидов М.М. Разработка хромогенной питательной среды для ускоренной идентификации Е. coli и других колиформных бактерий в объектах окружающей среды. / Юнусова Р.Ю., Степанова Э.Д. // Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 2007.- №4.-С.114-115.

3. Меджидов М.М. Новые подходы к решению проблемы ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий. / Степанова Э.Д., Юнусова Р.Ю. // Матер. Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты». -Пущино.-2007,- С. 13-14.

4. Юнусова Р.Ю. Экспресс-диагностика санитарно-показательных микроорганизмов с помощью хромогенных индикаторов. / Меджидов М.М., Степанова Э.Д., Мирзегасанова З.В. // Матер. Всероссийской научно-практической конференции ДГМА и филиал ФГУП НПО «Микроген» НПО «Питательные среды» МЗ РФ в г. Махачкала «Антибиотикорезистентность и антимикробная терапия». - Махачкала.-2008.- С.99-100.

5. Горелова В.Г. Этиологическая структура и антибиотикорезистентность основных возбудителей бактериемии и сепсиса, выделенных в мед. учреждениях различного профиля г. Махачкалы. / Юнусова Р.Ю., Меджидов М.М., Степанова Э.Д., Омарова С.М. // Матер. Всероссийской научно-практической конференции ДГМА и филиал ФГУП НПО «Микроген» НПО

«Питательные среды» МЗ РФ в г.Махачкала «Антибиотикорезистентность и антимикробная терапия». - Махачкала.-2008.- С.41-43.

6. Юнусова Р.Ю. Диагностика кишечной инфекции на основе выявления ß-глюкоронидазы-видоспецифического фермента Е. coli. / Меджидов М.М., Степанова Э.Д., Горелова В.Г. // Матер. 16 Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М.- 2009.-С.779.

7. Меджидов М.М. Оценка диагностической эффективности отечественных ХПС, использованных для выделения и идентификации уроинфекции. / Юнусова Р.Ю., Горелова В.Г., Степанова Э.Д., Омарова С.М. // Сб. тр. научно-практической конференции по проблеме: «Лабораторная медицина в свете концепции развития России до 2020г. Медакадем им. Сеченова. - М,- 2009.-С.234-235.

8. Меджидов М.М. Опыт использования хромогенных сухих питательных сред для ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий. / Юнусова Р.Ю., Горелова В.Г., Степанова Э.Д., Омарова С.М. // Матер. Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций». - С-П6.-2009.-С.129-130.

9. Юнусова Р.Ю. Отечественная хромогенная среда для дифференциации клебсиелл. / Горелова В.Г., Степанова Э.Д., Омарова С.М. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. - 2010.- № 3.- С. 49 - 51.

10. Юнусова Р.Ю. Отечественная хромогенная питательная среда для одноэтапного выделения и идентификации условно патогенных энтеробактерий. / Горелова В.Г., Степанова Э.Д., Омарова С.М., Меджидов М.М. // Матер. 17 Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М.- 2010.-С.311.

11. Меджидов М.М. Использование отечественных хромогенных

питательных сред для диагностики инфекций мочеполовой системы. /

Степанова Э.Д., Юнусова Р.Ю., Горелова В.Г., Омарова С.М. // Матер.

Всероссийской научно-практической конференции с международным участием

«Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - М.-2010.-С.-76.

12. Меджидов М.М. Испытания отечественных хромогенных питательных сред при санитарно-микробиологическом контроле объектов внешней среды. / Степанова Э.Д., Юнусова Р.Ю., Омарова С.М. // Матер. Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - М.-2010.-С.76.

Изобретения

1. Меджидов М.М. Хромогенная селективная питательная среда ДагХром агар для выделения и идентификации кишечной палочки и других колиформных бактерий. / Степанова Э.Д., Юнусова Р.Ю., Меджидов Ш.М. // Патент на изобретение №2386696 от 20.04.2010 г.

2. Меджидов М.М. «Хромогенная питательная среда для выявления и ускоренной идентификации клебсиелл» / Степанова Э.Д., Юнусова Р.Ю. // Положительное решение о выдаче патента от 08.12.2010 г. по заявке №2008140829/10(052823.

Отпечатано в типографии «А-4» г. Махачкала, ул. Пушкина, 46. Гарнитура «Times New Roman». Печать ризографная. Тираж ЮОэкз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юнусова, Раисат Юнусовна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ УСЛОВНО ПАТОГЕННЫМИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЯМИ

1.1. Роль условно патогенных энтеробактерий в инфекционной патологии человека

1.2. Условно патогенные энтеробактерии как санитарно-показательные микроорганизмы

1.3. Современные методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний, вызванных условно патогенными энтеробактериями

1.4. Хромогенные питательные среды — эффективное решение проблемы ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий"

На протяжении всей истории становления и развития медицинской микробиологии представители семейства Enterobacteriaceae постоянно привлекают внимание учёных и специалистов практической бактериологии. Во многом интерес к ним связан с тем, что их выделение составляет значительную часть регулярных исследований бактериологов, решающих задачи клинической и санитарной микробиологии (Голубева И.В. с соавт., 1985; Покровский В.И., Поздеев O.K., 1999; Шендеров Б.А., 2005; Поздеев O.K., Фёдоров Р.В., 2007; Батуро А.П., 2010.). В последние годы специалисты также отмечают, что нарушение микробной экологии желудочно-кишечного и вагинального трактов (дисбиоз) с повышением численности условно патогенных энтеробактерий (УПЭ) часто является предрасполагающим фактором возникновения и развития многих неиифекционных соматических заболеваний (Леонова А. Ю., Романенко Э. Е., Батуро А. П., 2007; Шендеров Б.А., 2008, 2010). Вследствие высокой частоты поражений человека и разнообразия* этиологической структуры возбудители семейства Enterobacteriaceae приобрели существенное значение. Так, достоверно расширился видовой спектр энтеробактерий, подлежащих обязательному изучению. И в первую очередь это относится к УПЭ, которых долгое время рассматривали как возбудителей оппортунистических инфекций. В настоящее время многие виды из них считают вполне сложившимися патогенами (Ющук Н.Д. с соавт., 1990; Красноголовец В.Н., Киселёва Б.С., 1996; Покровский В.И., 1996; Учайкин В.Ф., 2001; Меньшиков В.В., 2003.).

При различных состояниях, сопровождающихся ослаблением резистентности организма человека, УПЭ, адаптированные к обитанию в нестерильных полостях организма и входящие в состав нормальной микрофлоры, могут проникать в различные органы и ткани и вызывать заболевания (Иосебашвили Т., Чиквиладзе Д., 2000; Брусина Е.Б., 2001;

Бондаренко A.Jl. с соавт., 2001; Shenderov В.А., 2007). При этом следует отметить, что УПЭ регистрируются большей частью как возбудители внутрибольничных инфекций (Ковалева Е.П., Сёмина М.А., 2002; Коршунова Г.С., 2002; Меркушев Н.В., 2003 Султанов 3.3. с соавт., 2005.). В число основных возбудителей нозокомиальных инфекций вошли следующие представители семейства Enterobacteriaceae: кишечная палочка, клебсиеллы, цитробактер, энтеробактеры, серрации, протеи, которые вызывают различные гнойно-септические инфекции, в т.ч. до 50% госпитальных пневмоний, до 30% раневых инфекций и т.д., при этом нередко с тяжелой клинической^картиной заболеваниями с летальным исходом (клебсиеллезный сепсис). (Поздеев O.K., Фёдоров Р.В., 2007.; Сбойчаков В.Б., 2007; Ольховик О.П., 2009.).

В связи с тем, что в ряду возбудителей внутрибольничных инфекций значительное место занимают клебсиеллы, идентификация- их при санитарно-микробиологическом обследовании лечебных учреждений также играет важную роль (Красноголовец В.Н., Киселёва Б.С.,1996; Сиволодский Е.П.,1996.). Однако предложенные схемы для идентификации потенциально-патогенных для человека клебсиелл (К. pneumoniae, К. oxytocä) громоздки и включают в себя постановку целого ряда тестов: на сероводород («-»), орнитиндекарбоксилазу(«-»), подвижность(«-»), фенилаланиндезаминазу («-»), мочевину («+»), цитрат Симмонса («+»), малонат («+»), инозит («+»), лизиндекарбоксилазу («+») (Красноголовец В.Н., Киселёва Б.С., 1996.). Эти исследования требуют значительного времени и материальных затрат. В то же время не вызывает сомнения, что при проведении микробиологических исследований важным условием является быстрота получения результатов, которая способствует ранней диагностике, своевременному проведению терапевтических и противоэпидемических мероприятий.

Установлено, что для госпитальных штаммов характерна довольно высокая-устойчивость к антибиотикам и дезинфектантам (Favero N.S., Bond W.W., 1991.; Меджидов М.М., 2008; Омарова С.М. с соавт., 2008; Горелова В.Г. с соавт., 2008.). Это затрудняет их элиминацию, в связи, с чем внутрибольничные инфекции являются не только клинической-, но и значительной эпидемиологической проблемой (Агапов B.C., с соавт. , 2002; Онищенко Г.Г., 2002; 2003.).

Среди внебольничных инфекций условно патогенные энтеробактерии также являются наиболее частой причиной острых кишечных инфекций (ОКИ), проблема которых продолжает оставаться чрезвычайно актуальной в современной медицине (Малеев В.В. с соавт., 2006; Идармачев A.M., 2006; Султанов 3.3., Степанова Э.Д., 2006; Омариева Э.Я., 2006.). Источником заражения ОКИ являются инфицированные объекты внешней среды -питьевая вода, воды открытых водоёмов, предметы обихода. В связи с тем, что ОКИ являются заболеваниями с фекально-оральным путём, передачи инфекции, для предупреждения заболевания важное значение имеет регулярный санитарно-эпидемиологический мониторинг за объектами внешней среды, включающий в себя микробиологические исследования окружающей среды. Санитарно-эпидемиологический мониторинг играет решающую роль также в борьбе с внутрибольничными инфекциями и способствует их предупреждению.

Условно патогенные энтеробактерии, обитая в нестерильных полостях организма человека, могут подолгу жить и вне организма человека или теплокровных животных, поэтому в санитарной микробиологии их используют в качестве санитарно-показательных микроорганизмов. Так, количественное содержание общих колиформных бактерий (ОКБ) позволяет характеризовать общую микробную обсемененность объектов окружающей среды, в т.ч. продуктов питания, и свежее их фекальное загрязнение по наличию E.coli. Общее число проводимых в Российской Федерации микробиологических и санитарно-гигиенических анализов с целью обнаружения представителей данной группы грамотрицательных бактерий в биологическом материале чрезвычайно велико, что приводит к огромным трудовым и экономическим затратам.

Эти затраты, прежде всего, обусловлены тем, что регламентируемые действующими нормативными документами схемы идентификации клинически и санитарно - гигиенически значимых УПЭ, как уже отмечено ранее, являются очень трудоёмкими, требующими значительных затрат времени из-за схожести биологических и биохимических характеристик этих грамотрицательных бактерий (расщепление лактозы). Дифференцировать их друг от друга со среды Эндо (или Левина) весьма затруднительно. В случае присутствия в микробной ассоциации протея выделение чистой культуры становится невозможным из-за роения протея на этих средах. Общие затраты времени на проведение исследований для идентификации общих колиформных бактерий, в том числе и E.coli составляют от 2 до 5 сут.

В настоящее время в мировой бактериологической практике наряду с классическими питательными средами для выделения и дифференциации микроорганизмов различных таксономических групп, широкое распространение получили хромогенные питательные среды (ХПС) различных зарубежных фирм (Oxoid, Merck, bio Merieux, HiMedia, Sigma, Fluka).

Принцип действия хромогенных питательных сред определяется взаимодействием высокоспецифических ферментов бактерий с хромогенным субстратом, введённым в состав среды и играющим в ней роль индикатора. В результате этого взаимодействия хромогенный субстрат расщепляется под действием фермента искомого микроорганизма, выделяя в среду хромофор, окрашивающий колонию. Микроорганизмы, не продуцирующие высокоспецифический фермент, остаются неокрашенными, поскольку хромогенный индикатор не расщепился.

Таким образом, идентификация возбудителя с помощью хромогенных питательных сред происходит одновременно с его выделением и не требует постановки дополнительных тестов, что значительно сокращает время и материальные затраты на исследование.

Хромогенные сухие питательные среды для ускоренной идентификации микроорганизмов за рубежом выпускают и- используют со второй половины прошлого века. В России до настоящего времени подобные диагностические препараты не производили и поэтому разработка их является актуальной для практической бактериологии.

Цель исследований: разработка и экспериментально-клиническое изучение отечественных хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий.

Основные задачи исследований:

4. Разработать хромогенную питательную среду Е. со/г-колиформ-Proteus хром агар для выделения и прямой идентификации одновременно Е. coli, колиформных бактерий и протеев при клинических исследованиях;

5. Разработать хромогенную питательную среду для выявления и идентификации клебсиелл - Клебсиелла хром агар;

6. Оценить физико-химические и биологические показатели качества созданных сред;

7. Оценить диагностическую ценность разработанных ХПС;

Научная новизна

1. Впервые разработаны и научно обоснованы оригинальные качественные и количественные составы отечественных хромогенных сухих питательных сред для выделения и ускоренной идентификации УПЭ: Колиформ хром агар, Е. coli хром агар, ДагХром агар, Е. со//-колиформ-Proteus хром агар, Клебсиелла хром агар.

2. Показаны чёткие дифференцирующие свойства, высокая чувствительность и селективность созданных ХПС, что позволяет ускорить идентификацию УПЭ.

Практическая значимость

Разработаны и апробированы ХПС для выделения и ускоренной идентификации УПЭ. Подготовлена нормативная документация на ХПС. Способ усовершенствования микробиологической диагностики инфекций, вызванных УПЭ, внедрён в практику Республиканского Медицинского Центра г. Махачкала (акт внедрения №10-326 от 17.09.2010 г.) и в работу лаборатории клинической микробиологии ООО НПП «Питательные среды» (акт внедрения №10-325 от 17.09.2010 г.). Использование в широкой практике здравоохранения разработанных сред будет способствовать более ранней диагностике заболеваний, вызванных оппортунистическими энтеробактериями, и проведению адекватных терапевтических и профилактических мероприятий.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основании экспериментально выбранных качественных и количественных составов впервые разработаны оригинальные отечественные ХПС для выделения и ускоренной идентификации часто выделяемых УПЭ.

3. С использованием широкого набора музейных и свежевыделенных микроорганизмов при клинических и санитарных исследованиях выявлена высокая диагностическая ценность разработанных ХПС. Предложен алгоритм выделения и идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с использованием ХПС.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Юнусова, Раисат Юнусовна

выводы

- Колиформ хром агар для выделения, подсчёта и ускоренной идентификации общих колиформпых бактерий в объектах окружающей среды;

- E.coli хром агар для выделения, подсчёта и прямой идентификации E.coli;

- E.coli-KonnfyopM-Proteus хром агар для выделения и прямой идентификации одновременно E.coli, колиформных бактерий и протеев;

- Клебсиелла хром агар для выявления и прямой идентификации клебсиелл и E.aerogenes.

3. Определены оптимальные количества содержания в средах хромогенных субстратов, обеспечивших визуальную регистрацию ß-галактозидазы колиформных бактерий, ß-глюкуронидазы и триптофоназы E.coli, триптофандезаминазы протеев и 5-аминосалицилатдекарбоксилазы клебсиелл и E.aerogenes.

4. Сконструированные дифференциально-диагностические хромогенные среды характеризовались стабильными биологическими свойствами выделенных культур.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время продолжает оставаться актуальной проблема выявления и идентификация условно патогенных энтеробактерий при инфекционных процессах различной локализации, т.к. частота заболеваний, вызванных УПЭ, неуклонно увеличивается, определяя тем самым значительный интерес исследователей к этим возбудителям. Также с повышением численности УПЭ при дисбиозах, возникают и развиваются неинфекционные соматические заболевания (Шендеров Б.А., 2010).

Среди клинических изолятов энтеробактерий, выделенных при гнойно-септических заболеваниях, авторы отмечают в качестве наиболее частых три вида УПЭ - Е. coli, Klebsiella spp., Proteus spp., на долю которых приходится около 80% от общего количества выделенных возбудителей. Около 20% изолятов составляют представители 23 видов из этих родов: Klebsiella. Proteus, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Yersinia и др. (Сбойчаков B.B., 2007.,Поздеев O.K., Фёдоров Р.В., 2007 и др.).

Условно патогенные энтеробактерии играют немаловажную роль также и в санитарной микробиологии, где их используют в качестве санитарно-показательных микроорганизмов, характеризующих санитарно-микробиологическое состояние объектов внешней среды.

В связи со значительной ролью УПЭ в клинической и санитарной микробиологии выделение и ускоренная идентификация этих микроорганизмов имеет существенное значение.

Современные методы лабораторной диагностики УПЭ, регламентируемые действующими Методическими указаниями, представляют собой многоэтапный процесс, требующий значительного времени на исследования в связи с многообразием схожих биохимических реакций и яркой выраженностью родственных связей представителей УПЭ. Несмотря на значительную роль Е. coli в клинической и санитарной микробиологии, до сих пор нет отечественной питательной среды для прямой идентификации этого микроорганизма среди других УПЭ. Общие затраты времени для родовой и видовой идентификации УПЭ составляют несколько суток после выделения микроба.

Известно, что ранняя бактериологическая диагностика заболеваний — залог успешной терапии, а также своевременных противоэпидемических мероприятий, снижающих риск возникновения и распространения инфекций. В связи с этим разработка способов ускоренной идентификации УПЭ -несомненно актуальная задача отечественного здравоохранения.

За рубежом со второй половины прошлого века эта задача решена с помощью хромогенных питательных сред, позволяющих на основе выявления высокоспецифических ферментов бактерий осуществить идентификацию возбудителя одновременно с его выделением, т.е в один этап. Хотя спрос практического здравоохранения на подобные питательные среды огромен, в России они до настоящего времени не производятся.

Поэтому задача обеспечения отечественного здравоохранения хромогенными питательными средами для выделения и ускоренной идентификации клинически значимымых и санитарно-показательнымых условно патогенных энтеробактерий является актуальной, требует изучения и решения, что явилось основанием выбора темы диссертационных исследований.

Первый этап исследования был посвящен изучению питательных основ и других ингредиентов среды на основании известных питательных потребностей УПЭ. Поэтому при конструировании хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации УПЭ были использованы отечественные рыбные и казеиновые панкреатические гидролизаты, как наиболее часто употребляемые в питательных средах для культивирования широкого спектра микроорганизмов.

В серии экспериментальных исследований было выявлено, что среди бактерий группы кишечной палочки (колиформных бактерий) S. plymuthica 1 является наиболее прихотливым к условиям культивирования микроорганизмом. Так, при одинаковом составе питательных бульонов чувствительность среды в отношении S. plymuthica 1 (Ю"5) значительно уступала чувствительности среды в отношении других УПЭ (10"6).

Исследования стимулирующего эффекта каждого в отдельности ЭКД и ПАБК на рост микроорганизмов, показали повышение чувствительности среды в отношении S. plymuthica 1 с 10"5 до 10"6, а остальных УПЭ с 10"6 до 10"7. А совместное внесение в среду указанных ростовых факторов обеспечило повышение чувствительности среды в отношении S. plymuthica 1 до 10"7, а чувствительность среды в отношении остальных УПЭ возросла до 10"8. Таким образом, внесение в среду одновременно обоих стимуляторов роста позволило достичь более высокую чувствительность разработанной среды Колиформ хром агар в сравнении с традиционной средой Эндо. Это особенно важно при проведении санитарного контроля окружающей среды,, когда выявление присутствия в исследуемом материале даже единичных колоний колиформных бактерий является основанием для принятия необходимых санитарных мер.

Показателем свежего фекального загрязнения является присутствие Е. coli в исследуемом материале наряду с другими колиформными бактериями. Использование Колиформ хром агара, принцип действия которого основан на выявлении ß-галактозидазы, продуцируемый всеми колиформными бактериями, не обеспечивает прямую идентификацию Е. coli. Для идентификации Е. coli среди других колиформных бактерий необходима проверка каждой выделенной колонии тестом на индол, что трудоёмко. Кроме того К oxytoca также индол положительна, хотя довольно редко встречается в объектах окружающей среды.

Прямая идентификация Е. coli особенно актуальна, т.к. Е. coli является важным санитарно-показательным микроорганизмом, в частности при определении коли-титра воды, характеризующего качество питьевой воды централизованных систем питьевого водоснабжении в отношении эпидемической безопасности. Как было выше сказано, сред для прямой идентификации Е. coli в нашей стране не выпускается, в силу чего для выявления Е. coli среди других колиформных бактерий, по настоящим действующим нормативным документам, требуется не менее 3-х суток.

Разработанный в процессе настоящих исследований Е. coli хром агар позволяет одноэтапно выделить и идентифицировать Е. coli по способности продуцировать специфический фермент ß-глюкуронидазу. Среда обладает высокими дифференцирующими свойствами и не имеет отечественных аналогов.

Следуя по пути ускорения процесса идентификации колиформных бактерий и на основании результатов, полученных при конструировании предыдущих двух сред, нами разработана среда ДагХром агар. Эта среда позволяет одновременно осуществить прямую идентификацию и Е. coli, и колиформных бактерий по способности продуцировать ß-глюкуронидазу и ß-галактозидазу, что значительно сокращает время на исследования, особенно при проведении санитарно-микробиологического контроля пищевых продуктов: появление на чашке со средой сине-зелёных колоний с жёлтым ореолом свидетельствует о присутствии в исследуемом материале кишечной палочки, а, следовательно, продукт подлежит браковке. Наличие на чашке со средой только жёлтых колоний с жёлтым ореолом (колиформных бактерий) свидетельствует об отсутствии свежего фекального загрязнения. Для объективной оценки биологических свойств сконструированной среды использовали хромогенную среду сравнения ШСготе"ш ЕСС Selective Agar. Эта среда, также как и среда ДагХром агар, обеспечивала в течение (18±2) ч инкубации посевов при (37± 1) °С идентификацию колиформных бактерий, в т.ч. и Е. coli. Среда HiCromeт' ЕСС Selective Agar в сравнении с ДагХром агаром не полностью подавляет роение протея. Кроме того, из-за присутствия в среде HiCrome"ш ЕСС Selective Agar термолабильных компонентов требуется щадящая стерилизация (дробная стерилизация путём 3-кратной обработки среды в открытой струе пара). В то же время на ДагХром агаре протеи вырастали в О-форме, и среда не требовала стерилизации.

Таким образом, предлагаемая среда ДагХром агар может с достаточно высокой вероятностью заменить среду Эндо (регламентируемую действующими в РФ нормативными документами), т.к. позволяет одновременно с выделением идентифицировать Е. coli и колиформные бактерии, что значительно ускоряет время бактериологического анализа и упрощает работу практических микробиологов.

Среди УПЭ наряду с Е. coli и другими колиформными бактериями в качестве возбудителей вне- и внутрибольничных инфекций довольно часто регистрируются Proteus spp. На предыдущей среде ДагХром агар осуществить прямую идентификацию протеев невозможно, т.к. они вырастают в виде бесцветных колоний, также как Р. aeruginosa и патогенные энтеробактерии. Известные среды для прямой идентификации протеев на основе выявления их родоспецифического фермента триптофандезаминазы (ТДА) требуют внесение в среду ex temporae 10%-й раствора хлорного железа трёхвалентного. С целью обеспечения возможности одновременной прямой идентификации протеев наряду с Е. coli и другими колиформами и исключения необходимости внесения в среду ex temporae 10%-го раствора хлорного железа трёхвалентного нами сконструирована среда Е. coli-колиформ-Рго/ег« хром агар, содержащая в отличие от ДагХром агара увеличенное количество триптофана в количестве 7,0 г/л. На среде Е. coli-колиформ-Р/-о/ег/5 хром агар идентификация Е. coli, колиформных бактерий и протеев осуществляется по способности продуцировать этими микробами соответственно ß-глюкуронидазу, ß-галактозидазу и триптофандезаминазу: Е. coli вырастают в виде колоний сине-зелёного цвета с жёлтым ореолом, колиформные бактерии — жёлтые с жёлтым ореолом, а протеи — коричневые с коричневым преципитатом. Патогенные энтеробактерии и Р. aeruginosa вырастают в виде бесцветных колоний в виду отсутствия у них способности продуцировать вышеназванные ферменты.

Таким образом, среда Е. coli-Koim^o^M-Proteus хром агар имеет значительные преимущества перед традиционно употребляемой средой Эндо:

1. Прямая идентификация Е. coli через (18 ±2) ч инкубации посевов при (37 ± 1) °С , в то время как при использовании среды Эндо требуется от 3 до 5 суток (для постановки ТИМАЦ-тестов);

2. Прямая идентификация колиформных бактерий через (18 + 2) ч инкубации посевов при (37+ 1) °С, в то время как при использовании среды Эндо для этого требуется 48 ч (с посевом в среду Гисса с лактозой).

3. Прямая идентификация протеев через (18 ±2) ч инкубации посевов при (37+ 1) °С, в то время как при использовании среды Эндо протей роится, что затрудняет выделение чистой культуры УПЭ в случае присутствия в микробной ассоциации Р. vulgaris или P. mirabilis.

4. Предлагаемая среда не светочувствительная, что позволяет хранить её в чашках длительное время (8-10суток), в отличии от среды Эндо, которую готовить впрок нельзя.

Однако на предлагаемой среде Е. со//-колиформ-Рго/еш' хром агар прямую идентификацию клебсиелл осуществить невозможно, т.к. клебсиеллы, как и другие колиформные бактерии, продуцируют ß-галактозидазу, и поэтому на среде вырастают также в виде жёлтых колоний с жёлтым преципитатом. В то же время актуальность разработки среды для прямой идентификации клебсиелл не вызывает сомнений в виду вышесказанной их этиологической значимости в возникновении различных заболеваний.

Известная способность клебсиелл продуцировать родоспецифический фермент 5-аминосалицилатдекарбоксилазу, которая расщепляет 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК) с образованием продукта коричневого цвета, нацелила нас на введение в среду Е. со/г-колиформ-Рго^еш хром агар дополнительно 5-АСК для обеспечения возможности осуществления на этой среде прямой идентификации также и клебсиелл. Однако такой вариант среды оказался непригодным, т.к. дифференцировать протеи от клебсиелл оказалось невозможным из-за одинаковой коричневой окраски этих колоний и коричневого преципитата в среде в зоне их роста. Поэтому нами была сконструирована сухая питательная среда для выявления и идентификации клебсиелл, на которой через (18±2) ч инкубации посевов при (37+1) °С коричневые колонии клебсиелл с коричневым преципитатом в среде в зоне их роста чётко дифференцируется от всех остальных микроорганизмов, вырастающих в виде колоний жёлтого цвета. Полученная среда обладает, очевидным преимуществом перед известными по дифференцирующим свойствам и срокам идентификации клебсиелл. Проводя исследования, мы обнаружили, что Е. aerogenes продуцирует, также* как и К. pneumoniae, 5-аминосалицилатдекарбоксилазу, образуя колонии коричневого цвета с коричневым преципитатом. В связи с этим дифференциацию Е. aerogenes от клебсиелл осуществляли с помощью теста на подвижность.

При проведении исследований разработанных хромогенных питательных сред на клиническом материале продукцию ß-галактозидазы наблюдали в 100% случаев выявления колиформных бактерий. Аналогично в 100% случаев наблюдали продукцию ТДА при выявлении протеев, также как и продукцию клебсиеллами и Е. aerogenes 5-аминосалицилатдекарбоксилазы. Однако продукцию специфического фермента Е. coli ß-глюкуронидазу наблюдали в (98±1)% исследований. С целью обеспечения возможности идентификации E.coli, непродуцирующих ß-глюкуронидазу, а также всех остальных энтеробактерий, непродуцирующих специфических ферментов, нами предложен алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ, предусматривающий минимальный дифференцирующий ряд биохимических тестов, наряду с использованием двух разработанных нами хромогенных питательных сред -Е. coli'Komifyopu-Proteus хром агара и Клебсиелла хром агара, а также полужидкого агара, агара Клиглера и цитратного агара Симмонса, в сочетании с двумя короткими тестами - оксидазным и индольным. Идентификация выделенных микроорганизмов производится по совокупности биохимических свойств: способности продуцировать высокоспецифические ферменты и пигменты, образовывать индол, сероводород, оксидазу, ферментировать лактозу, глюкозу с газом или без него, а также по тесту подвижности, что показано в таблице 29.

Учитывая, что для идентификации УПЭ по действующим методическим указаниям затраты времени составляют от 3 до 5 суток и требуется использование не менее 10 различных дифференциально-диагностических питательных сред по 15 биохимическим тестам, предлагаемая схема, предусматривающая использование 5 питательных сред и постановки дополнительно 2-х тестов, имеет бесспорное преимущество перед действующей: менее трудоёмка и сокращает затраты времени на исследования.

Предложенный алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с помощью созданных хромогенных питательных сред, позволяет существенно сократить сроки идентификации возбудителя (с 3-5 суток до 18-36 ч), что значительно упрощает процесс проведения бактериологических исследований.

Таким образом, разработанные оригинальные качественные и количественные составы отечественных хромогенных питательных сред, в отличие от зарубежных аналогов, содержат отечественные ингредиенты -питательные основы, стимуляторы роста, селективные агенты и др., которые в сочетании с подобранными оптимальными количествами хромогенных субстратов позволяют провести чёткую идентификацию УПЭ через (18± 2) ч инкубации посевов при (37+ 1) °С, не уступая зарубежным аналогам.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юнусова, Раисат Юнусовна, Махачкала

1. Агапов B.C. Внутрибольничные инфекции в хирургической стоматологии. /Тарасенко C.B., ТрухинаГ.М. М.:Медицина, 2002.-256 с.

2. Базарный В.В. Оценка микробного пейзажа мочи в урологической клинике. / Журавлёв В.Н., Беспалова В.В., Маркина O.A. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. 1999.- №12.- С.9.

3. Байрамова A.C. Распространение клебсиелл в акушерских стационарах и некоторые биологические свойства выделенных штаммов. / Батуро А.П., Мурадова Э.К., Юсова Г.А., Агаева P.A. // ЖМЭИ. 1991 .-№8.-С.40-43.

4. Батуро А.П. Энтеробактерии. Частная микробиология. Клиническая лабораторная аналитика в пяти томах. Под общей редакцией В.В.Меньшикова.- М.: Агат-Мед, 2003. T. IV.- С.398-411.

5. Бектемиров Т.А. Препараты для диагностики инфекционных заболеваний. / Медуницын Н.В. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. 1999.-№11.-С.З-4.

6. Бендас Л.Г. Стимулятор бактериального роста из кормовых дрожжей. / Раскин Б.М., Баранова А.К. // Ж. лаб. дело-1974.- 1том.- С.43-45.

7. Блинкова Л.П. Физиологические и биохимические свойства микроорганизмов. / Горобец О.Б., Мельникова В.А. // В кн. «Общая санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований».

8. Под ред. А.С.Лабинской. Л.П. Блинковой, А.С.Ещиной. М.: Медицина, 2004.- С.135-197.

9. Божкова С.А. Госпитальные инфекции мочевыводящих путей: Мониторинг микрофлоры как средство выбора эффективной терапии. / Афиногенов Г.Е. // ЖМЭИ. -2005,- Т.7.-№2.-Приложение 1.- С. 16.

10. Бондаренко A.JI. Случай сепсиса клебсиеллёзной этиологии. / Красных А.Н., Попонин М.В., Широнина Н.Л. // ЖМЭИ. 2001.-№> 4.-С.35-36.

11. Бондаренко В.М. Секретируемые факторы патогенности энтеробактерий. / Мавзютов А.Р., Elitf Golkocheva. // ЖМЭИ. 2002.-№1.-С84-89.

12. Брусина Е.Б. Эволюция эпидемиологического процесса госпитальных гнойно-септических инфекций в хирургии // ЖМЭИ. 2001.-№2.-С.10-12.

13. Воропаева Е.А. Микроэкология и показатели гуморального иммунитета влагалища женщин с неспецифическими заболеваниями гениталий. / Афанасьев С.С., Кудрявцева М.В. // ЖМЭИ. -2005.- С.65-69.

14. Гельфанд Б.Р. Сепсис: определение, диагностическая концепция, патогенез и интенсивная терапия. / Руднов В.А., Проценко Д.Н.,Гельфанд Е.Б., Звягин A.A., Ярошецкий А.И., Романовский ЮЛ. // Ж. инфекции и антимикробная терапия. 2004.-№2.-Т.6.-С.46-60.

15. Горченина Л.В. Среды для выделения клебсиелл. / Киселёва Б.С. // ЖМЭИ. 1985.-№1 .-С. 19-22.

16. Голубева И.В. Эитеробактерии. (Руководство для врачей). / Килессо В.А., Киселёва Б.С., Прямухина Н.С., Татаринова С.Л., Хоменко

17. Н.А.,Ющенко Г.В. Под руководством Покровского В.И. М. «Медицина».-1985.-С.48-67.

18. Горелова В.Г. Клинические испытания опытного образца коммерческой двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры. / Меджидов М.М., Омарова С.М., Султанов 3.3., Степанова Э.Д. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. 2006.-№2.-С.38-40.

19. Гриценко В.А. Характеристика энтеробактерий, выделенных от больных с урогенитальной патологией. / Брудастов Ю.А., Шухман М.Г.,Сапрыкин В.Б., Данилова М.Ф. // ЖМЭИ. 2001.-№4.-С. 107-111.

20. Иосебашвили Т. Роль энтэробактерий в развитии гнойно-воспалительных процессов. / Чиквиладзе Д. II Сборник научных трудов Тбилисского государственного медицинского университета. 2000.- 36. -С. 196-200.

21. Ковалева Е.П. Внутрибольничная инфекция в педиатрии. / Сёмина H.A. // Ж. эпидемиология и инфекционные болезни. 2002.- №3.- С. 15-19.

22. Козыровская H.A. Молекулярно-биологические методы детекции и идентификации микроорганизмов в окружающей среде. 7 Ковтунович Г.Л. // Ж. биополимеры и клетка.-1994.-т.10.-№3-4.-С.5-23.

23. Колпакова С.Д. Принципиальный новый подход к идентификации бактерий. / Колпакова Г.А., Савченко Р.П. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. 2005.- №9.- С.ЗЗ.

24. Корпушина Т.П. Новые подходы к лабораторному обследованию больных с хирургической патологией. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. 1999.-№12.- С.16-17.

25. Коршунова Г.С. Эпидемиологическая ситуация по ВБИ в РФ в 1997-2001г. г. (Доклад на 8-ом съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов). // Эпидемиология и инфекционные болезни,- 2002.-№6.-С.22-24.

26. Котлярова А.Н. Оптимизация антибактериальной профилактики в терапии хирургического сепсиса у детей. // Материалы 5 Российской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии». -2003.- С. 55.

27. Кочеровец В.И. Решённые и нерешённые задачи клинической микробиологии в системе отечественного здравоохранения. / Сбойчаков В.Б. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. 2005.-№9.-С.26.

28. Красноголовец В.Н. Клебсиеллёзные инфекции. / Киселёва Б.С. -М.: Медицина, 1996,- 253с.

29. Краткий определитель бактерий Берги. Под ред. Д. Хоулта. М.: Мир, 1980.- 496с.

30. Кулагин П.В. Диагностическая эффективность микробиологического анализа крови в условиях стационара клиническойбольницы. / Савченко Р.П., Иванова B.C., Липовская А.Г., Кулагина И.Г. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. 2001 .-№11.-С.36-37.

31. Лабинская A.C. Общая санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований. / Блинкова Л.П., Ещина A.C. М.:1. Медицина, 2004.- 576с.

32. Леонова А. Ю. Характеристика микробиоты толстого кишечника у больных аллергией / Романенко Э. Е., Батуро А. П. // ЖМЭИ. 2007. - N 3 . -С. 69-72.

33. Мари П.Р. Клиническая микробиология. / Шей И.Р. // Краткое руководство. Пер. с англ. М.:Мир, 2006.- 725с.

34. Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам. М.: Медицина, 2003 .-206с.

35. Меджидов М.М. Региональные проблемы антибиотикорезистентности микроорганизмов. // Материалы 2 Всероссийской научно-практической конференции «Антибиотикорезистентность и антимикробная химиотерапия».-г. Махачкала.-2008.- С.5-7.

36. Меньшиков В.В. Лабораторная медицина мира начала 21 столетия (Заметки с 18-го Международного конгресса клинической химии и лабораторной медицины). // Ж. клиническая лабораторная диагностика. -2003 .-№4.-С.52-54.

37. Методические рекомендации по микробиологической диагностике раневых инфекций в лечебно-диагностических учреждениях армии и флота. / В.М.Добрынин и др.- С-Пб. НИИ эпидемиологии и мкробиологии им.Пастера- С-Пб. 1999.- с.75.

38. Мефодьев В.В Этиология ГСЗ и антибиотикорезистентность выделенных возбудителей. / Хохлявина P.M., Козлов Л.Б. // ЖМЭИ. 2002.-№2.-С. 119-120.

39. МУК 4.2.577-96. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов. М.: Минздрав России, 1998.-С.39-45.

40. МУК 4.2.2316-08. Методы контроля бактериологических питательных сред. М.: Минздрав России, 2008.- 67с.

41. МУК 4.2.1018-01. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды.- М.: Минздрав России, 2001.- С. 17-24.

42. Ольховик О.П. Биологическая характеристика клебсиелл, выделенных от бройлеров // Куб.ГАУ, -№49(05)-2009,- С. 1-10.

43. Омарова С.М. Микробиологическое исследование санитарного состояния перинатального центра г. Махачкала. / Алиева А.И., Абсерханова Д.У., Меджидова Д.Ш., Исаева Р.И., Горелова В.Г. // ЖМЭИ. 2010.- №5.-С.77-80.

44. Омарова Э.Б. Способ получения стимулятора роста микроорганизмов из кормовых дрожжей. / Меджидов М.М., Султанов 3.3. // Патент на изобретение № 2227158, БИМП.- 2004.- №11.- Зч:516.

45. Онищенко Г.Г. Контроль за инфекционными заболеваниями — стратегическая задача здравоохранения России в XXI веке. // Ж. эпидемиология и инфекционные болезни. — 2002. №6. — С. 4-16.

46. Онищенко Г.Г. Инфекционные болезни важнейший фактор биоопасности. // Ж.эпидемиология и инфекционные болезни.- 2003. - №3.- С. 4-16.

47. Онищенко Г.Г. Деятельность государственной санитарно-эпидемиологической службы России, направленная на профилактику инфекционных заболеваний, и задачи на предстоящий период. // ЖМЭИ. — . 2003. №6. - С.107-112.

48. Онищенко, Г.Г. Обеспечение санитарно-эпидемиологического.' £. благополучия детского населения России. // ЖМЭИ. 2005. -№ 5.- С. 33.

49. Орлова В.И. Микробиологический пейзаж влагалища беременных группы высокого риска. / Бичуль O.K., Еданова Е.А. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. 1999.-№12.- С.19.

50. Основные методы лабораторных исследований в клинической бактериологии. Всемирная организация здравоохранения. Женева. Выпущено изд-вом Медицина по поручению Минздрава РФ, которому ВОЗ доверила выпуск данного издания на русском языке,- 1994. -С.23-27.

51. Пак С.Г. Лабораторные тесты в диагностике и мониторинге инфекционных заболеваний. / Малов В.А. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. 2002.-№12.-С.7-8.

52. Поздеев O.K. Энтеробактерии: Руководство для врачей. / Фёдоров Р.В. М.:ГЕОТАР-Мед, 2007.-720с.

53. Покровский В.И. Проблемы внутрибольничных инфекций // Ж. эпидемиология и инфекционные болезни.-1996.-№2.-С.4-9.

54. Покровский В.И. Медицинская микробиология. / Поздеев O.K. -М.:ГЕОТАР-Мед, 1999.-С.583-588.

55. Приказ МЗ СССР № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».-М.:Медицина, 1985.

56. Приказ №720 МЗ СССР «Об улучшении медицинской помощи больным с гнойными хирургическими заболеваниями и усилению мероприятий по борьбе с внутрибольничной инфекцией».- М.:Медицина, 1978.

57. Прямухина Н.С. Внутрибольничные инфекции новорождённых. / Сёмина H.A., Коршунова Г.С., Морозова О.Т. // Ж. эпидемиология и инфекционные болезни.-1996.-№2.-С. 15-18.

58. Рахманова А.Г. Кишечная инфекция (стратегия и тактика лечения). / Неверов В.А., Пригожина В.К. С-Пб, "ССЗ".- 1995.- 57 с.

59. Руководство по медицинской микробиологии. Общая санитарная микробиология. Под редакцией А. С. Лабинской, Е. Г. Волиной.- М: Бином, 2008.- Книга 1 с. 1080.

60. Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Под редакцией Лабинской A.C., Костюковой H.H., Ивановой С.М. М: Бином, 2010.- Книга 2.-с. 1152.

61. Савицкая К.И. Значение лабораторных исследований в профилактике госпитальных инфекций. / Сёмина H.A., Галкин В.В., Абаш Ю.Б. // Ж. эпидемиология и инфекционные болезни.-2001.-№2.-С. 16-21.

62. СанПиН 2.3.2.1280-02. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов.- М.:Минздрав России,2003.-32с.

63. Саркулова.М.Н. Микробиологическая характеристика возбудителей ВБИ у урологических больных. // ЖМЭИ. 2005.-№5.- С. 101-103.

64. Сбойчаков В.Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований.- С-Пб.: СпецЛит, 2007.- С. 359-362.

65. Сиволодский Е.П. Систематика и идентификация энтеробактерий.-С-Пб.-2009.-36с.

66. Сиволодский Е.П. Методические рекомендации по микробиологической диагностике дисбактериозов кишечника в лечебных учреждениях Армии и Флота. / Добрынин В.М., Добрынина И.А., Кацалуха В.В., Лобзин Ю.В., Позняк А.Л., Раевский К.К. М.-1996. - 17с.

67. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под редакцией М.О.Биргера.-М.Медицина, 1973 .-456с.

68. Справочник по препаратам фирмы «Oxoid».-1983 .-352с.

69. Стецюк О.У. Результаты второго этапа программы внешнего контроля качества МАКМАХ в клинической микробиологии. / Крочикова О.И., Рябкова Б.Л., Галкин Д.В. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. №9.- 2001.- С. 25-26.

70. Султанов 3.3. Селективная питательная среда для выделения клинических штаммов E.coli 0157: Н7. / Степанова Э.Д., Какулина Е.А. // ЖМЭИ. 2001.-№1.- С. 194-196.

71. Султанов 3.3. Электролит-дефицитная питательная среда для лабораторной диагностики острых эшерихиозов, вызванных тест-штаммом

72. Султанов 3.3. Разработка и оценка диагностической ценности питательных сред для накопления и выделения гемокультуры. / Степанова Э.Д., Кулакова Л.С., Омарова С.М., Горелова В.Г., Рамазанова Н.Р., Гаджиева С.М. //ЖМЭИ, -2005.-№3.-С.19-22.

73. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты.- М.Медицина, 2000.295с.

74. Тимохина Т.Х. Этиология гнойных инфекций в Тюменьской области по данным больничного стационара. / Хохлявина P.M., Остапенко И.В., Козлов А.Б., Мефодьев В.В.,Саликова В.Н., Печникова М.Б. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. -2003.- №8.- С.46-49.

75. Тиссо-Геррас Ф. Госпитальные инфекции в роддомах. / Сетрт Ж.С., Мьелэ С.С., Николь М.С., Мелье Ж., Пюте Ж., Саль Б., Даржан Д. // ЖМЭИ. -1995.-№4.-С 35-39.

76. Туртюков А.Б. Состояние и проблемы качества микробиологической диагностики в медицинской практике // Ж. клиническая лабораторная диагностика. 2002.- №11.- С.49-50.

77. Фёдоров В.В. Бактериемия: клинико-бактериологические аспекты проблемы. / Куликова М.А. // Ж. клиническая лабораторная диагностика.-1995.-№3.-C.3-7.

78. Федоровский В.В. Анализ микрофлоры и результаты теста на госпитальный штамм в хирургическом стационаре. / Афанасьева Л.Н. // Материалы 5 Всероссийской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии». М.-2003.-С.35.

79. Хоменко H.A. Питательные среды и реактивы. В кн. Энтеробактерии. М.:Медицина, 1985.- С.287.

80. Учайкин В.Ф.Руководство по инфекционным болезням у детей. М.:ГЕОТАР-МЕ Д, 2001.- С.474-483.

81. Черкасский Б.Л. Эпидемиология эшерихиозов в Российской Федерации. / Фролочкина Т. И., Рожнова С. Ш. // Ж. эпидемиология и инфекционные болезни.- 2002. N 5 . - С. 6-10.

82. Шендеров Б.А. Микрофлора пищеварительного тракта важный фактор микроэлементарного гомеостаза хозяина. / Ж. клиническое питатние. -2005.- №.2. -С. 2-5.

83. Шендеров Б.А. Функциональное питание и его роль в профилактике метаболического синдрома. М: ДеЛи принт, 2008.- с.319.

84. Шендеров Б.А. Функциональное и персональное питание. Современное состояние и перспектива. / Ж. гастроэнтерология. С.-Пб. -2010.-№.2-3.-С. 2-5.

85. Шкарин В.В. Способ идентификации госпитальных штаммов си негнойной палочки, циркулирующих в хирургических стационарах. / Воробьёва О.Н., Никифоров В. А. // Ж. клиническая лабораторная диагностика. -1999.- №12.- С.21.

86. Энтеробактерии: Руководство для врачей. Под ред. В.И.Покровского. М.Медицина, 1985.-318с.

87. Ющук Н.Д. Острые кишечные инфекции. / Бродов JI.E. -М.:Медицина, 2001 .-304с.

88. Ющук Н.Д. Диагностика и дифференциальная диагностика острых кишечных инфекций. / Бродов Л.Е., Ахмедов Д.Р. М.:Медицина, 1998.-172с.

89. Ющук Н.Д. Клебсиллёзный сепсис. / Фролов В.М., Пересадин Н.А. // Ж. Сов. Мед.-1990.-№6.-С.79-83.

90. Alberti С. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. / Brun-Buisson C., Burchardi H. et al. // Intens Care Med.- 2002; 28: 108-121.

91. Aleshkin V.A. Vaginal microbiota in healthy women and hatients with bacterial vaginasis and non-specific vaginatis. / Voropaeva E.A., Shenderov B.A. // Microbiol Ecology in Health and Disiases. 2006.-V.18.-№.2- P.71-74.

92. Alos J.I. Epidemiology and etiology of urinary tract infections in the community. Antimicrobial susceptibility of the main pathogens and clinical significance of resistance.// Inferm. Infecc. Microbiol. Clin.-2005.-Vol.23.-P.3-8.

93. Anderson J. M. The medium should be used within 24 hours of rehydration. References 1. / Baird Parker A. C. // J. Appl. Bact. -1975.-39,111.

94. Balows A. I. Natural history of disseminated Mycobacterium avium complex infection in AIDS. // J Infect Dis.- 1991.- 164:994-8. 38. von Reyn CF, Barber TW, Arbeit RD.

95. Bascomb S. Identification of bacteria measurements of enzyme activities and its relevance to the clinical diagnostic laboratory.// Soc. Appl. Bacteriol. Symp Ser. -1980.- 8:359-373.

96. Bauer R., et al. Functional expression of bacterial (3-glucuronidase and its use as a reporter system in the yeast Yarrowia lipolytica. Yeast: 1993.- Vol. 9,-Issue 1, P.71—75.

97. Breynaert J. Evaluation of Albicans ID, a medium isolation and identification of C. albicans. / Willemsen M., Lauwers S. // 8 ECCMID, Laysanne.-1997.-Poster №345 .-P.23.

98. Chang George W. Metod for detecting colifonn and E.coli bacteria. / Lum, Rossalind A. // The Regents of the Univ. of California. 1997. (99.04,-04B428n, C-5).

99. Clasen, T. Interventions to improve water quality for preventing diarrhoea / T. Clasen et al. // Cochrane Database Syst Rev. 2006 Jul 19; 3: CD 004794.

100. Cultura media manual bio Merieux.- 1994.

101. Difco Laboratories. Product for Microbiology.-1996/97.-86-87.

102. Edberg S.C. /Rapid and Economical identification and antimicrobial susceptibility test Methodology for Urinary Tract Pathogens. / Trepeta R.W. // J. Clin. Microbiol.- 1983.-18.-P. 1287-1291. ~

103. Ellens D.J. and Gielkens A.L., J. Immunol. Meth. -1980.-37,325.

104. Frampton E.W. Evaluation of the ß-glucuronidase substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucuronide (X-GLUC) in a 24-h direct plating method for Escherichia coli. I Restaino L. and Blaszko N. // J.Food Prot.- 1988.- 51:402-404.

105. Friedman M.P. The effect of bran on dimethylhydrazine-induced colon carcinogenesis in the rat. / Isaksson P., Rafter J. et al. // Journal of Clinical Microbiology.- 1991.- 29:2385-2389.

106. Giammango Giuseppe. An enzymatic procedure for the confirmation of total coli forms and E.coli enumeration from water. / Fignoto Serino, Biandi Marisa. // Zentralbl. Hyg. und Umwelfmed. 1992.-193,№2,-P.99-105.

107. HI MEDIA Laboratories Limited.-2002.

108. Hansen W. Detection of P-glucuronidase in Lactose-Fermenting Memders of the Family Enterobacteriaceae and its Presence in Bacterial Urine Cultures. / Yjurassowsky E. // J. Clin. Microbiol. 1984.-20.-P. 1177-1179.

109. Hogenauer C. Mechanism and management of antibiotic-associated diarrhoea. / Hammer H.F. Krejs G.J, Reisinger E.C. // Clin Infect Dis 1998;27:702-710.118. Jimenez Cruz J.F., BrosetaE., Cobernado M. //Actos. Urol. Esp.-2002.-Vol.26.-P.563-573.

110. Kilian M. Rapid diagnosis of Enterobacteriaceae. 1. Detection of bacterial glucosidases. / Bulow P. // Acta Pathol. Microbiol. Scand., Sect- 1976.84:245.

111. Kilian M. Rapid identification of Enterobacteriaceae. / Bulow P. //Use of p- glucuronidase detecting agar medium (PGUA agar) for the identification of E.coli in Primory Cultures of Urine Samples.// Acta Pathol. Microbiol Scand.-1979.- B 87:.271-276.

112. Lapage S.P. The orthonitrophenol (ONPG) test and acid from lactose in gram-negative genera. / Efstratiou A., Hill L.R.// J. Clin. Pathol. -1973.- 26:821825.

113. Manafi M. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. / Kneifel W., Bascomb S. //Microbiological Reviews.- 1991.-55,335-348.132. "Merck" Diagnostika Merck. Darmstadt.-1993.

114. Murray P. Evaluation of microbiological processing of urine specimens: comparison of overnight versus two day incubation. / Traynor P., Hopson D. // Journal of Clinical Microbiology.- 1992.-30:1600-1601.

115. Parrant F. Comparative evaluation of the new Albicans ID2 chromogenic medium with clinical specimens. / Roure C., Freydiere A.M., Gille Y. // 8 ECCMTD, Laysanne.-1997.-Poster №347.- P.21.

116. Pezzlo M. Detection of urinary tract infections by rapid methods.//Clinical Microbiology Reviews.-l 988.- 1:268-280.

117. Ralovich B. Beta-D-glucuronidase (BDG) activity of gram-negative bacteria. / G.A.M. Ibrahim, Fabian A., Herpay M. //- Acta Microbiologica Hungaricas. -1991.-38.- P.283-291.

118. Richards M.J. Nosocomial infections in combined medical-surgical intensive care units in the United States Infect Control Hosp. / Edwards J.R., Culver D.H., Gaynes R.P. // Epidemiol.- 2000.- 21:510-515.

119. Rice E. Efficacy of P-glucuronidase assay for identification of E.coli by the defined substrate technology. / Allen Martin J., Edberg Stephen C. // Appl. And Environ Microbiol.-l990.-56.- №5.-P.1204-1205.

120. Scarparo C. Comparison between CPS ID2 medium and CHROMagar medium for detection and identification of urinary tract bacterial isolates. / Ricordi P., Achilli E., Scagnelli M. // 8 ECCMID, Laysanne.-1997.-Poster №351.-P.29.

121. Sigma-aldrich. Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук. Каталог.-.2002-2003. С. 13258-1360.

122. Shenderov В.А. Modern condition and prospective host microecology investigations. // Microbiol Ecology in Health and Disiases. 2007.-V.19.-№.3-P.145-149.

123. Vincent J.L. The prevalence of nosocomial infections in intensive care units in Europe. / Bihari D.J., Suter P.M. et al. // Results of the European

124. Prevalence of Infection Care (EPIC) study EPIC International Advisoiy Committee. JAMA.- 1995,- 274: 8.- P. 639-644.

125. Voigt K.D. Methods of Enzymatic Analysis. / Schmidt H. // Academic Press, New York.- 1974.- vol 4.

126. Wilkie M.E. Diagnosis and management urinary tract infection in adults BMJ. / Almond M.K., Marsh F.P. // British Medical Journal. 1992.305:1137-1141.г

Информация о работе

Юнусова, Раисат Юнусовна
кандидата биологических наук
Махачкала, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Разработка хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы