Разработка биотехнологического процесса получения комплексного ферментного препарата пуллуланазы и использование его для крахмалопаточной промышленности

Кривова, Ирина Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биотехнологического процесса получения комплексного ферментного препарата пуллуланазы и использование его для крахмалопаточной промышленности
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологического процесса получения комплексного ферментного препарата пуллуланазы и использование его для крахмалопаточной промышленности"

На правах рукописи

/Р

✓ / 1/ Л

'Фт^г/

Кривова Ирина Анатольевна

Разработка биотехнологического процесса получения комплексного ферментного препарата пуллуланазы и использование его для крахмалопаточной промышленности

Специальность: 03.00.04.- Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» Государственного образовательного учреэвдения высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет пищевых производств» (МГУПП)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Бутова Светлана Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Еремец Владимир Иванович кандидат биологических наук, доцент Шаненко Елена Феликсовна

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт пищевой биотехнологии» РАСХН (ГНУ ВНИИПБТ)

Защита состоится «15» декабря 2006 года в 10 часов на заседании Диссертационного совета К 212.148.01 Московского Государственного Университета пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11 ,ауд. 53 ВК

Просим Вас принять участие в заседании диссертационного совета или прислать отзыв в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д.11, МГУПП, ученому секретарю Диссертационного совета К 212.148.01.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПП Автореферат разослан « Ц » ноября 2006г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, к.б.н. * Ильина Н.А.

Актуальность темы.

Нарушение структуры питания приводит к дефициту отдельных видов пищевых продуктов, например, таких как углеводы. В свою очередь это, вызывает необходимость организации и развития производства сахаристых веществ из крахмалосодержащего сырья и их отходов для обеспечения населения пищевыми заменителями сахара, такими как патока с высоким содержанием мальтозы и глюкозы. Такие патоки являются ценными пищевыми продуктами, более сладкими и менее — вязкими по сравнению с обычной карамельной патокой. Они не гигроскопичны, не кристаллизуются при хранении, в связи с чем, пригодны для замены сахара в кондитерской, хлебопекарной, консервной, молочной и других отраслях промышленности.

Приоритетным направлением в области решения проблем обеспеченности пищевыми ресурсами народонаселения нашей планеты является внедрение в народное хозяйство экологически безопасных и экономически выгодных новых технологий. В связи с этим, перспективным представляется способ получения заменителей сахара путем ферментативного гидролиза с помощью амилолитического комплекса ферментов. Особая роль отводится ферменту пуллуланазе, которая гидролизует в пуллулане а-1,6 связи, в результате возникают молекулы триоз, состоящих из трех остатков глюкоз. Важно отметить, что пуллуланазы расщепляют не только пуллулан, а также а-1,6 связи в крахмале, предельных декстринах и гликогене. Это свойство пуллуланазы ценное и имеет большое практическое значение при получении сахаристых веществ на основе крахмала особенно при совместном действии а-амилазы, Р- амилазы и глюкоамилазы, при этом не образуется продуктов кислой деструкции Сахаров, а также продуктов их термического разложения, рН конечного продукта колеблется от 5,5 до 6,0.

мультиэнзимных композиций ферментных препаратов пуллуланазы при биоконверсии крахмалистого сырья с целью получения высокомальтозно-глюкозной патоки является весьма актуальным. Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлся поиск активного продуцента внеклеточной пуллуланазы, разработка условий культивирования последнего, получение ферментного препарата, обладающего пуллуланазной активностью и последующее использования мультиэнзимных амилолитических композиций ферментных препаратов при деградации крахмалистого сырья для получения высокомальтозно-глюкозной патоки.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

- скрининг микроорганизмов на их способность образовывать пуллуланазу;

- подбор оптимальной среды и режимов культивирования штамма — продуцента пуллуланазы;

- разработка оптимального способа хранения посевного материала микроорганизма-продуцента пуллуланазы;

- выделение и очистка внеклеточной пуллуланазы;

- исследование физико-химических свойств очищенного ферментного препарата пуллуланазы;

- использование амилолитического комплекса ферментов при деградации крахмалистого сырья для получения высокомальтозно — глюкозной патоки;

- разработка технологии получения высокомальтозно-глюкозной патоки из крахмалосодержащего сырья.

Научная новизна.

В представленной диссертационной работе научно обосновано и экспериментально доказано:

- по результам скрининга бактериальных культур, выделенных из различных почвенных образцов, найден продуцент пуллуланазы, изучены его культурально-физиологические особенности и определена видовая принадлежность - Micrococcus amylofaciens;

- оптимизированы условия питания и культивирования продуцента пуллуланзы;

- изучены условия выделения препарата внеклеточной пуллуланазы, хранения и очистки;

- на основании выявленных зависимостей выхода высокомальтозно- глкжозной патоки от степени биоконверсии крахмалистого сырья впервые обоснован оптимальный состав ферментативных систем амилолитического действия;

- разработана технология получения высокомальтозно-глюкозной патоки при использовании мультиэнзимных композиций амилолитических ферментов; Практическая значимость работы.

Проведенные исследования являлись основой для решения эколого-биологических задач по совершенствованию комплексной переработки различного крахмапосодержащего сырья и его отходов при использовании амилолитического комплекса ферментов микробного происхождения. Наряду с получением ценного продукта, а, именно, высокомальтозно-глюкозной патоки, нами одновременно решались вопросы снижения загрязнения окружающей среды отходами крахмалистого сырья и токсичными продуктами их деструкции:

- получен новый высокоактивный штамм - Micrococcus amylofaciens - продуцент пуллуланазы и разработана технология получения препарата пуллуланазы. -разработана технологическая схема переработки растительного сырья, содержащего крахмал с целью получения высокомальтозной- глюкозной патоки;

- разработана стадия осахаривания сырья с использованием энзиматических комплексов;

- увеличен выход мальтозы по сравнению с традиционной технологией на 18,0+1,5%;

- улучшены разнообразные свойства и качественные характеристики паток. Результаты проделанной работы подтверждены в полупроизводственных условиях на установке опытного участка апробаций научных разработок при Центре "Биоинженерия" РАН.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы представлены в докладах и сообщениях:

-Научные конференции МГУПП 2004-2005 гг., г. Москва;

-Выставка-конкурс «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации», г. Москва, 2004г.

-Третья юбилейная международная конференция посвященная 75-летию МГУПП, Москва, МГУПП, 2005г.

-Третий съезд общества биотехнологов России, г. Москва, 2005 г.

-Научная конференция «Значение биотехнологии для здорового питания и решения

медико-социальных проблем», г. Калиниград, 2005 г.

Публикации.

Основные положения и результаты диссертационной работы изложены в восьми печатных работах и тезисах. Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 133 источника, приложений. Работа изложена на 200 страницах компьютерного текста и содержит таблиц 35 и 54 рисунка. Содержание работы.

Во введении дано обоснование актуальности проблемы, сформулированы цель и задачи исследования, охарактеризована научная новизна и практическая значимость работы. 1,Обзор литературы

В обзоре литературы представлены данные о важной роли крахмала и продуктах его гидролиза в обмене веществ у растений, животных и человека, в основе питания и жизнедеятельности любого организма. Рассмотрен процесс гидролиза крахмала и производства его продуктов при использовании традиционного кислотного способа гидролиза и ферментативного. Указана важная роль ферментативного гидролиза с указанием значения фермента пуллуланазы при производстве высокомальтозно-глюкозной патоки. Обсуждаются вопросы расщепления крахмала и крахмалосодержащего сырья в свете представления действия ферментов, направленных на гидролиз разветвлений крахмала, где первостепенное значение имеет пуллуланаза. Рассмотрены современные представления о воздействии этого фермента на а-1,6 связь амилопектина, что

дает возможность получения глюкозы амилолитическим комплексом ферментов. Проанализированы сведения о микроорганизмах- продуцентах пуллуланазы, условия выделения последней, механизме действия, хранении. Обсуждены перспективы использования пуллуланазы при получении сахаристых крахмалопродуктов с высоким содержанием мальтозы и глюкозы. 2.Эксперименталькая часть

Исследования и промышленные испытания проводились на кафедре "Биотехнология" ГОУ ВПО МГУ 1111, Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова, Центре «Биоинженерия» РАН, ВНИИ крахмалопродуктов. .2.1. Материалы и методы исследования.

Объектами исследования было 187 культур микроорганизмов, выделенных из различных почвенных образцов. Идентификация видовой принадлежности микроорганизмов проводилась по тест системе API® фирмы «Биомерье» (eioMERIEUX / France). Культивирование бактериальных культур осуществляли в аэробных условиях глубинной ферментацией. В качестве субстратов для изучения процессов ферментативного гидролиза использовали крахмалосодержащее сырье и его отходы. Биохимические и химические анализы крахмалосодержащего сырья проводили общепринятыми стандартными методами. Ферментативный гидролиз субстратов проводили с использованием фильтратов бактериальных культур, а также отечественных ферментных препаратов и зарубежных фирм "Ново"(Дания) и "Эндэ Индустриал Корпорэешн" (США). Активности культур определяли в фильтратах культур и в ферментативных препаратах по методикам, представленным в книге Полыгалиной Г.В., Чередниченко B.C., Римаревой Л.В. (2003). Очищенные препараты внеклеточной пуллуланазы получали путем диализа и фракционирования на колонках со смолой DEAE Toyopearl 650.

Патоку оценивали по общепринятым биохимическим показателям. Концентрацию редуцирующих веществ, образовавшихся в ходе ферментативной реакции, определяли методом Шомоди-Нельсона.

Достоверность экспериментальных данных подтверждена статистическими методами, в таблицах и на рисунках приведены результаты в виде средних

значений, при этом величина доверительных интервалов средних арифметических значений параметров составила 1,0 -1,5% при уровне значимости 0,5. 2.2. Результаты и их обсуждение.

2.2.1.Скрининг микроорганизмов на их способность образовывать пуллуланазу.

С целью отбора продуцентов пуллуланазы было обследовано 187 культур рода Bacillus, а именно представители следующих видов: B.mesentericus, B.circulans, B.subtilis, B.megaterium, B.macerans, B.stearothermophilus, B.brivis, B.Hcheniformis, B.thuriengiensis, B.polymyxa, B.coagulans и серия бактериальных культур, выделенная из различных почвенных образцов. Была осуществлена проверка всех культур на способность синтеза пуллуланазы. Критерием оценки при отборе продуцента служила декстринирующая способность (ДС), перспективными приняты те штаммы, которые давали более 30 % выхода от максимального значения ДС. По результатам было отобрано 6 культур рода Bacillus (табл.1), которые были предоставлены для исследования Институтом Биологии Уральского Научного Центра РАН и две бактериальные культуры, выделенная из различных почвенных образцов без идентификации видовой принадлежности. Наиболее активным являлся штамм 1-25, выделенный из почвенного образца, активность культуральной жидкости которого

Таблица!.

Скрининг бактериальных культур на способность синтезировать пуллуланазу.

№ п/п Наименование культуры Индекс штамма ДС, % от шах № п/п Наименование культуры Индекс штамма ДС, % от max

1 Бактериальная культура 1-25 100 5. Bacillus megaterium 402 32

2 Bacillus species ИБ1131 45 6. Bacillus species ИБ112 70

3 Bacillus species ИБ1128 50 7. Бактериальная культура 1-63 31

4 Bacillus macerans 697 45 8. Bacillus species ИБ1062 40

2,0-2,5 раза превышала пуллуланазную активность других штаммов. Для видовой идентификации штамма в своей работе мы использовали идентификационные системы фирмы «Биомерье» (btoMERIEUX / France), а именно: стрип API® Staph,

стрип API® 20 NE, стрип API® 20 С AUX, стрип API® 20 E. Каждый из вышеперечисленных стрипов содержит 20-25 тест, позволяющий идентифицировать культуры микроорганизмов, используя программное обеспечение поиска в базе данных по числовому профилю. Результаты проверки чистой культуры показали, что она представлена кокками и является грамположительной, дает положительную реакцию на каталазу, не образует стадию покоя - это дало основание предположить, что возможно данный микроорганизм может принадлежать родам Staphylococcus, Kocuria, Micrococcus. Использование стрипа API® Staph позволило

идентифицировать штамм и определить основной таксон, как Micrococcus amylofaciens, при этом процент идентификации (%ИД) был равен 99,9.

Для поддержания чистой культуры Micrococcus amylofaciens в неизменном состояние исследовали условия хранения ее в лабораторных условиях, используя различные методы хранения: лиофилизацию, хранение под слоем вазелинового масла, хранение при низких температурах. Показано, что в лабораторных условиях продуцент пуллуланазы целесообразно хранить под слоем вазелинового масла с периодичностью пересева один раз в месяц.

2.2.2. Оптимизация состава ферментационной среды для культивирования Micrococcus amylofaciens.

Для обеспечения максимального синтеза ферментов, как правило, требуется оптимизация условий культивирования.

На первом этапе работы по изучению физиологии питания Micrococcus amylofaciens с целью оптимизации состава ферментационных сред изучено влияние природы крахмала и его количества на биосинтез фермента. Наилучшие результаты получены при использовании картофельного крахмала при содержании его в питательной среде — 1,3%. С этим уровнем крахмала в среде изучалось влияние источников неорганического азота на биосинтез: KNOj, NH4NO3, (NH^SO^ (NH4)2HP04 , NH4CI. Показано, что соли оказывают влияние на рост биомассы продуцента и накопление фермента. Наилучшие результаты в этой серии экспериментов достигнуты при добавлении в среду соли CNHOiHPOi . Увеличение пуллуланазной активности наблюдалось 'при добавлении в питательную среду

совместно с неорганическими источниками азота органических, таких как казеин, пептон, кукурузный экстракт, плотен, экстракт солодовых ростков, БВК. При введении в среду 0,2% (NH^HPO^ 0,3% пептона и 0,3 % кукурузного экстракта отмечался наибольший биосинтез пуллуланазы. Введение в питательную среду некоторых ионов металлов оказывало положительное влияние на биосинтез фермента, особенно таких как К* (К2НР04 -0,2%) , Са2+ (СаСОз -0,1%). Следует отметить, что соль К2НРО4 помимо ионов калия является источником и ионов фосфора (как и соль (ЫН^НРОд).

В связи с тем, что биодобавки, в частности кукурузный экстракт, способствуют биосинтезу пуллуланазы, исследовали влияние на биосинтез биологически активных веществ (биоса) более детально. В качестве биоса были апробированы: экстракт солодовых ростков (ЭСР), автолизат пивных осадочных дрожжей (АПОД), дрожжевой экстракт (ДЭ-пекарские дрожжи) и БВК. Результаты эксперимента представлены на рис.1. Анализ полученных данных показал, что дрожжевой экстракт в количестве 0,3% способствовал синтезу пуллуланазы, увеличивая выход на 24-25%.

Рис. 1 Влияние биоса на биосинтез пуллуланазы Micrococcus amylofaciens.

1 2 з 4 s 6

Концентрация биологически активных веществ,0,1%

Таким образом, эксперименты по оптимизации состава питательной среды для глубинного выращивания Micrococcus amylofaciens позволили предложить среду

следующего состава (%): картофельный крахмал - 1,3; К2 НРО 4 - 0,2; (NH4)2HP04 - 0,2; кукурузный экстракт -0,3; дрожжевой экстракт - 0,3; пептон - 0,3; СаСОз - 0,1. Культивирование Micrococcus amylofaciens на разработанной питательной среде позволил увеличить продуктивность штамма в 3,2 раза, а уровень активности пуллуланазы сотавил 38,0 ед / см3.

2.2З.Подбор условий культивирования Micrococcus amylofaciens.

Априори наилучшие качества посевного материалы непосредственно связаны с экспоненциальной фазой развитая микроорганизма, поэтому испытания по определению возраста посевного материала было проведено с культурой от 14 до 32 часов роста. На рис.2 представлены полученные результаты, из которых видно, что максимальная продуктивность микроорганизма наблюдается при возрасте 24-26 ч. В наших дальнейших исследованиях в качестве посевного материала использовалась 24-часовая глубинная культура Micrococcus amylofaciens. Оптимальная доза посевного материала согласно результатам эксперимента (рис.2) была определена как 0,9-1,1%.

Рис.2. Влияние возраста и количества посевного материала на биосинтез пуллуланазы.

М « М I м

Количество 24 ч. посевного материала,%

Возраст посевного материала, ч

Дальнейшим исследованием было показано, что длительность культивирования влияет на биосинтез пуллуланазы Micrococcus amylofacie. Выращивание культуры осуществляли в качалочных колбах и в ферментере вместимостью 5 дм3. Накопление в культуральной жидкости фермента начиналось с 30-го часа культивирования продуцента и достигало максимума в качалочных колбах на 7072 ч роста микроорганизма , а в условиях ферментера на 48-54 рост культуры. Изучения влияния аэрации, температуры и рН на биосинтез пуллуланазы Micrococcus amylofacie осуществляли в условиях ферментера, компенсируя

выпаренную влагу из культуральной жидкости добавлением стерильной воды на 36, 48 часы роста культуры (рис.3). Изменение уровня аэрации достигалось варьированием расхода подаваемого воздуха в ферментер от 5 до 60 дм3/дм3среды в час, что в свою очередь соответствовало 40 - 480 мгОг /дм3 соответственно. Результаты опытов представлены на диаграмме, из которой видно, что наиболее благоприятный для биосинтеза режим аэрации был 30 дм3/дм3 среды в час, увеличение доли растворенного кислорода воздуха существенно не изменяло уровня накопления пуллуланазы . Было показано, что оптимальной температурой для роста и биосинтеза Micrococcus amylofaciens является 50°С, а рН питательной среды наиболее благоприятный 7,0. Таким образом , максимальное накопление пуллуланазы Micrococcus amylofaciens происходит при культивировании на оптимизированной питательной среде (см.выше), при аэрации 30 дм3/дм3 среды в

Рис.3 Влияние аэрации на биосинтез пуллуланазы M.amylofaclens.

1 3 1 » »

Пуллуламазиая активность, Ч от максимума , при различной аэрации.

час, температуре 50°С , рН 7,0 на 48-54 часы роста и составляет 43,8+3,0 ед/см3, что вЗ,7 раза выше продуктивности исходного уровня синтеза фермента. 2.2.4. Выделение, очистка и физико-химические свойства препарата пуллуланазы.

2.2.4.1. Выделение и физико-химические свойства препарата пуллуланазы.

Рассматривая способность изучаемой культуры к биосинтезу ферментов в условиях, определенных предшествующими исследованиями, особое внимание

было уделено амилолнтнческому комплексу. Было показано, что на биосинтез этой группы ферментов большое значение имеет рН ( рис.4).

Таким образом, максимальное накопление пуллуланазы происходит при рН 7,0, а-амилазы при рН 4,5, глюкоамилазы при рН -6,8. Для получения препарата пуллуланазы нами была взята культуральная жидкость, обладающая максимальной активностью пуллуланазы. Осаждение фермента проводилось из фильтрата культуральной жидкости этиловым спиртом в соотношении 1:1,5 соответственно при температуре смешиваемых компонентов 4°С.

40 35

4,0 4,0

3,5 1 3,5

3.0 ш 3,0

2,5 ш Б « я я S 2,5

2,0 2,0

1,5 сч § s « 1,5

1,0 и г 1,0

0,5 >2 0,5

Рис.4. Влияние рН среды на накопление ферментов Micrococcus amylofaciens.

Полученный согласно данной технологии, препарат ферментов обладал пуллулазной, амилазной, глюкоамилазной активностями. Проведены исследования по субстратной специфичности препарата, результаты представлены в таблице 2. Наибольшая пуллуланазная активность была при гидролизе пуллулана, на декстрине и амилопектине уровень активности на 30% меньше. Результаты по гидролизу крахмалов свидетельствуют о приблизительно равном действии на них пуллуланазы. Рассматривая действия а-амилазы на исследуемые субстраты, необходимо отметить отсутствие ее активности на пуллулане. Согласно данным литературы, пуллуланаза «работает» при температурах от 30 до 90°С. Нами проведены исследования активностей ферментативного комплекса Micrococcus amylofaciens в этом диапазоне

Таблица 2.

Гидролиз полисахаридаых субстратов ферментным препаратом.

№п/п Полисахаридные субстраты Ферментативная активность,ед/мг белка

Цуллуланазная, Амилазная, Глюкоамилазная,

1 Растворимый крахмал 33,0 0,13 5,5

2 Картофельный крахмал 31,3 0,32 5,0

3 Кукурузный крахмал 31,0 0,39 5,8 .

4 Рисовый крахмал 33,0 0,14 6,6

5 Амилопектин 42,0 0,09 5,5

6. Декстрин 44,0 0.08 5,0

7. Пуллулан 62,0 6,0

использовали растворимый крахмал. Исследования показали, что пуллуланаза сохраняет достаточно высокую активность в интервале температур от 50 до 80 °С, равную 38 ±3,5 ед/мг белка, для дальнейших испытаний ферментативного комплекса определена температура 60°С.

Известно (Cha H.J et al, 1998, Bertoldo С.,2004 и др.) , что различные ионы металла поразному влияют на активность ферментов амилолитического комплекса. Для изучения этого вопроса в инкубационную среду вносили одинаковое количество

ионов различных металлов, все используемые соли представляли собой хлориды, в ходе эксперимента определяли пуллуланазную, амилолитическую и глюкоамилазную активности. Полученные данные представлены в табл.3.

Таблица 3.

Влияние ионов металлов на активность ферментативного комплекса.

№ п/п Ионы металлов Ферментативные активности, % от контроля

Пуллуланазная Амилазная Глюкоамилазная

1 КГ 93,1 171,8 99,1

2 Na- 77,3 101,9 101,5

3 105,5 263,1 102,4

4 Mg- 42,1 147,5 100,0

5 Мп" 48,3 120,4 103,4

6 Со^+ 45,5 181,5 101,5

7 CdiT 40,1 95,1 101,5

8 Zn2+ 114,0 130,0 103,4

9 0,0 167,1 98,0

10 Контроль 100,0 100,0 100,0

Как видно из таблицы наибольшая пуллуланазная активность наблюдается при добавлении к субстрату ионов Zn*2 ,Са+2, ионы А13+ полностью инактивировали фермент. Оставшиеся двухвалентные ионы металлов уменьшают пуллуланазную активность в 2- 2,5 раза. Ионы калия практически не влияли на действие фермента, а ионы натрия уменьшали активность на 25%.

На основании проведенных исследований было показано, что ферментативный комплекс, выделенный из фильтрата культуральной жидкости Micrococcus amylofaciens, обладал пуялуланазной, амилолитической и глюкоамилазной активностями, наилучшие результаты получены при гидролизе пуллулана, амилопектина, p-декстрина и крахмала.

2.2.4.2. Очистка и физико-химические свойства препарата пуллулаиазы.

Для более детального изучения свойств пуллуланазы нами был очищен и разделен комплекс ферментов, выделенный из фильтрата культуральной жидкости Micrococcus amylofaciens. Дальнейшая очистка фермента осуществлялась после

диализа методом хроматографии с использованием смолы ДЭАЭ Toyopearl 650 М, кооперативного механизма действия, включающего ионооменную хроматографию и гель фильтрацию, эксперименты проводили в МГУ им. М.В. Ломоносова, результаты представлены в табл.4.

Таблица 4.

Очистка внеклеточной пуллуланазы Micrococcus amylofaciens.

Стадии очистки Общий объем, см3 Общая активность, ед/см3 Общий белок, мг Удельная активностье д/мг.белка Степень очистки

Фильтрация культуральной жидкости 100,00 4100,00 3300,00 1,24

Осаждение фермента (1:1,5 С2Н5ОН) 10,00 44,00 24,40 1,80 1,50

Диализ 7,00 88,90 14,00 6,35 5,29

Хроматография * Смола ДЭАЭ -Тоуореаг! 650 М 2,00 140,10 2,32 60,34 48,66

фильтрацию.

Рис.6. Хроматография пуллуланазы из Micrococcus amylofaciens на DEAE Toyopearl 650 М. 1,2,3 - номера белковых пиков; К - градиент NaCI (стрелка указывает момент подключения градиента NaCl)

IА к

2 --—"""Т

а ю т5 го 23 зо за 40

Номера фракций ОП/280 нм Ферментативные активности К —Линейный (К)

о -0.S

На колонку со смолой наносили 100мг высушенного препарата пуллуланазы, растворенного в 1 мл 0,1 М ацетат-аммонийного буфера pH 8,0. Элюцию помещенных на колонку белков проводили в градиенте NaCl от 0,15 до 1,0 М в том же буфере . На рис. 6 представлены результаты хроматографического разделения исследуемого препарата, которые свидетельствуют о получении трех белковых пиков с различной ферментативной активностью. Изучение свойств которых показало, что амилолитическая активность а- амилазы обнаружена только во фракциях, не сорбировавшихся на смоле белков (пик 1), а интересующая нас активность пуллуланазы выявлена в пике 3 и предшествующему ему маленьком пике, находящемуся между 2 и 3 пиками.

Рис 7.Влияние pH среды на активность пуллуланазы.

so 45 40 35 30 25 20 15 10 I

Л !

Е m Б !

19 ы I

ях к &

X м U

X я

fc. с;

На объединенной фракции было показано, наличие двух ферментов пуллуланазы кислой и щелочной , причем максимальная активность кислой пуллуланазы наблюдалась при рН 5,5 и составила 43,2 ед/ мг белка, тогда как щелочная пуллуланаза имела активность 28 ед/ мг белка при рН 7,5.( рис.7)

При изучении устойчивости активности фермента при оптимальных условиях ведения гидролиза растворимого крахмала было показано, что стабильные результаты получены при длительности гидролиза 30 минут. Отмечено, что пуллуланаза больше

всего проявляет свою активность при действии на пуллулан при температуре 60°С, рН среды 5,5 в присутствии ионов 2л*2 .

2.2.5.Гидролиз крахмалосодержащего сырья ферментными препаратами.

Перспективным направлением в решении проблемы усовершенствования технологии и увеличения ассортимента мальтозных продуктов является поиск новых сочетаний катализаторов гидролиза крахмала, в качестве которых могут применяться ферментные препараты, получаемые путем микробного синтеза. Исходя из выше сказанного, были проведены исследования по подбору ферментных препаратов микробного происхождения, эффективных при гидролизе крахмалов. 2.2.5.1. Результаты исследования процесса разжижения крахмалов.

Традиционно разжижение крахмала осуществляют кислотным способом, используя в качестве катализатора соляную кислоту, или проводят с использованием ячменного солода, ферментативный комплекс которого содержит Р- амилазу. На рис. 8 представлены углеводные составы гидролизатов, при ГЭ субстрата 17,0 ± 0,5%, полученный различными способами: кислотным и с использованием а-амилазы и ячменного солода. Показано, что реакционная смесь содержит мало глюкозы, однако много мальтотреоз и мальтотетроз — объектов для действия пуллуланазы.

2.2.5.2. Исследования процесса осахаривания крахмала.

Принятая в настоящее время схема ферментативного осахаривания крахмала для получения гидролизатов заданного состава состоит из следующих стадий: приготовление крахмальной суспензии —> клейстеризация -> разжижение (ферментативное) —> инактивация фермента -> осахаривание (ферментативное) инактивация фермента —> фильтрование —> обесцвечивание —» фильтрация —» упаривание —> упаковка. Целью нашего исследование было получение патоки для использования в кондитерской промышленности, содержащей значительные количество мальтозы, а глюкозы на уровне 10%. В связи с тем, что ячменная Р-амилаза у нас в стране не производится, в качестве перспективного фермента при разработке технологии мальтозных продуктов нами был выбран препарат Р- амилазы

Рис. & Углеводньй состав гедрапизаговраээюмомвных кислалтьм и фермвктативньмспособом

ГЦдропю имспотиый **" Фермвнтагиеньй гидролиз. |

глюкоза

из В.ро1утуха, любезно предоставленный ВНИИ крахмалопродуктов (Коренево). Сравнение результатов использования для осахаривания крахмала препарата р-амилазы из В.ро1ушуха и ячменной Р-амилазы показало, что за 24 ч гидролиза накапливалось в гидролизатах: ГЭ -48%, мальтоза - 45-47%, глюкоза 5-7%. Наибольшее накопление мальтозы происходит при дозировке фермента 1,0-1,5ед / г крахмала, причем при дальнейшем увеличение вносимого препарата до 2,5ед /г крахмала содержание мальтозы увеличивается на 1%. При исследовании состава гидролизатов, было показано, что наряду с мальтозой в них присутствуют высокомолекулярные декстрины, устойчивые по отношению к р-амилазе. Следовательно препятствием для действия фермента с одной стороны является редуцирующий конец декстрина, а с другой а-1,6-гликозидная связь. Дальнейшее превращение такого аномального декстрина возможно, когда в глубине его разорвана какая-либо а-1,4-гликозидная связь. Исходя из представлений О механизме гидролиза крахмала а-амилазой, можно предположить, что дальнейший гидролиз возможен при совместном действии р- и

Таблица 5.

Состав гидролизатов при осахаривании разжиженного кукурузного крахмала (1,5 ед/г крахмала) и а- амилазой.

| а- амилаза, ед/г крахмала Состав гидролизата после осахаривания,%* Скорость фильтрования, дм3/м ч Вязкость, мПас Цветность, ед.оптической плотности

Глюкозный эквивалент Глюкоза Мальтоза | Три и тетрасахара Декстрины

- 47,97 6,10 45,46 24,56 22,56 110,00 3,00 0,21

0,30 49,76 7,25 46^8 26,13 20,00 135,00 2,55 0,23

0,35 49,71 7,67 47,38 26,86 18,14 143,00 2,36 0,23

0,40 50,63 8,07 47,52 27,10 17,06 150,00 2,27 0,25

0,45 51,36 9,30 48,06 27,61 14,05 158,00 2,22 0,26

0,50 52,64 10,23 48,71 28,11 12,76 163,00 2,16 0,27

* другие углеводы до 100%.

а- амилазы на стадии осахаривания, причем последний фермент будет выступать в роли синергетического фактора. При проведении эксперимента в контрольном образце после стадии разжижения а-амилаза полностью инактивировалась и более не вносилась. В опытах а -амилаза была представлена препаратом «Ликсамил 1200», в качестве субстрата использовался ферментативно разжиженный крахмал с ГЭ 15,3% и исходной концентрацией СВ 30%. . Вязкость крахмальных гидролизатов снижалась пропорционально степени расщепления крахмала, характеризуемой значением глюкозного эквивалента . В гидролизатах, в которые, помимо р-амилазы, внесена была а- амилаза вязкость снижалась быстрее, что свидетельствует об уменьшении содержания декстринов и более глубоком гидролизе крахмала Р-амилазой (табл.5). Наряду с этим было показано, что время введения а- амилазы в реакционную смесь должно совпадать с временем введения Р-амилазы, т.к. после длительного воздействия р-амилазы в гидролизатах накапливаются низкомолекулярные декстрины, а а- амилаза проявляет сродство к высокомолекулярным олигосахаридам. При внесении в реакционную смесь а- амилазы из расчета 0,3-0,45 ед/г крахмала, содержание мальтозы в гидролизатах увеличивается на 3,0-5,7%, в 1,2-1,5 раза увеличивается

скорость фильтрации, цветность возрастает незначительно. Увеличение концентрации а- амилазы свыше 0,45 ед/г крахмала нежелательно, т.к. в этом случае содержание глюкозы в гидролизатах превышает 10%, а дополнительный расход фермента приводит к удорожанию продукта.

Т.о. была показана необходимость присутствия а- амилазы на стадии осахаривания крахмалосодержащего сырья, что позволило исключить стадию инактивации фермента после стадии разжижение крахмала. А также рекомендовать для производства дробное внесение а- амилазы, для стадии разжижения субстрата 60-70% регламентных количеств данного фермента, а на стадии осахаривания субстрата 30-40%, что в свою очередь, приводило к увеличению на 4,5% в среднем содержания мальтозы в гидролизатах.

2.2.6. Использование мультиэнзимиых композиций ферментов для гидролиза крахмалов.

Согласно данным литературы (Cha Н.,1998, Myers А.,2000 и др.) показано, что применение пуллуланазы при получении сахаристых крахмалопродуктов является перспективным. Так как нами был найден продуцент пуллуланазы и получен комплексный препарат данного фермента, последний был нами апробирован при ферментативном гидролизе крахмала . Осахаривание субстрата проводили Р-амилазой ( 1,5 ед/г крахмала), (3-амилазой и а- амилазой ( 1,5 ед/ г. крахмала : 0,2% препарата «Ликвамил 400»), р-амилазой и препаратом пуллуланазы (1,5 ед/г.крахмала :1,0 ед/г. крахмала) . На рис. 9 приведены данные компонентного состава ферментативных гидролизатов по результатам осахаривания в течение 48 часов , при температуре 55°С. Как видно, из полученных данных происходит увеличение выхода мальтозы в гидролизатах, а уровень глюкозы по результатам применения полученного нами ферментного препарата из Micrococcus amylofaciens остается практически неизменным. Для изучения влияния пуллуланазы на процесс гидролиза крахмала исследовали влияние дозы пуллулланазы на эффективность процесса. Концентрация пуллуланазы варьировала от 0,1 до 1,5 ед/ г крахмала, диапазон определялся согласно данным литературы и экономическими соображениями. В таблице б показана кинетика изменения углеводного состава

гидролизатов при различных дозировках пуллуланазы и длительности гидролиза.

Рис. 9 • Динамика изменения компонентного состава ферментативного гидролизатов при осахаривании крахмала

(ВЭЖХ).

бета-амилаза бэта-амилаза ♦ альфа-амипаза ***"6вт» амилаза* пугшуланаза

1 А 2

1 / \

1 г \\

! ( - И ( А

! И . NN 3

1 | 1 \\ 5

к 5

; ; ■ 1 1 11 1 1 I

ПИКИ: 1-глюкоза; 2- мальтоза; 3- мальтотриоза; 4- мальтотетроза; 5- мальтопентоза; 6-

мальтогексоза.

Длительность гидролиза составляла 48, 72 часа. Наилучшие результаты получены при введение в реакционную смесь наряду с Э-амилазой (1,5 ед/ г. крахмала) 1,5 ед/ г крахмала пуллуланазы при длительности 48 часов, т.к. увеличение продолжитель-

Таблица 6.

Состав гидролизатов при осахаривании крахмала р-амилазой (1,5 ед/ г. крахмала) и

пуллуланазой.

Концентрация пуллуланазы, ед/г. крахмала Состав гидролизатов,%*

ГЭ Глюкоза Мальтоза Три и тетрасахара

Длительность гидролиза,ч

48 72 48 72 48 72 48 72

Контроль,0 46,34 46,46 6,80 6,90 46,25 46,31 27,16 27,30

0,1 48,91 48,96 7,21 7,25 48,46 48,50 28,10 28,23

0,5 л: 51,14 52,10 7,07 7,32 54,.90 54,97 29,24 29,32

1.0 . 53,18 53,45 7,30 7,52 56,50 56,80 30,05 30,24

1,5 ' 54,43 55,20 7,33 7,62 58,51 58,80 31,37 31,53

•другие углеводы до 100%.

ности гидролиза до 72 часов давало незначительные изменения в углеводном составе гидролизатов.

Таким образом, применение пуллуланазы, полученной из фильтрата культуральной жидкости Micrococcus amylofaciens для осахаривания крахмала в сочетании с р-амилазой из B.polymyxa позволяет повысить содержание мальтозы в гидролизатах на 17-18 % по сравнению с осахариванием только одной (З-амипазой и на 10- 13% по сравнению с осахариванием р-амилазой и а-амилазой.Полученные результаты указывают на целесообразность использования пуллуланазы в крахмалопаточной промышленности.

2.2.7.Варианты технологии ферментативного гидролиза крахмала.

В настоящее время, с целью получения высокомальтозно-глюкозных сиропов используют ферментные препараты фирмы Ende Industries INS, такие как "Конверзим AMF-ЗОО» и «Глюкозим JI-100C+». Для сравнения эффективности полученного нами мультиэнзимного комплекса из Micrococcus amylofaciens использовали препарат «Глюкозим Л-100С+», который содержит пуллуланазу, а так же глюкоамилазу. т.е. набор ферментативного комплекса у двух исследуемых препаратов был аналогичен.

Гидролиз проводили в присутствии Р-амилазы из B.polymixa. Оптимальные концентрации совместного действия Р-амилазы и «Глюкозим Л-100С+» подобраны на 30% суспензии разжиженного крахмала при рН5,5: дозировка р-амилазы составила 1,5 ед/г крахмала, «Глюкозим Л-100С+» -0,2-0,3 ед/г крахмала. Осахаривание проводили при температуре 55°С в течение 48 ч., увеличение длительности гидролиза практически не изменяла конечного результата. При сравнении полученных данных по гидролизу крахмала мультиэнзимным комплексом из Micrococcus amylofaciens и импортным ферментным препаратом установлено, что при рекомендованных дозировках накопление мальтозы в гидролизатах происходит практически на одинаковых уровнях (58,5% и 60,0 %) при одинаковой экспозиции гидролиза.

На основании полученных экспериментальных данных нами предложено две альтернативных технологии по осахариванию крахмала , фрагмент блок-схемы

ВР 1.1. Прием крахмалосодержгщего сырья

ВР 1.2. Прием и хранение ортофосфорной кислоты

ВР 1.3. Прием и хранение аммиачной воды

ВР2.1. Приготовление раствора каустической соды

ВР 1. Прием и хранение сырья, хим. реагентов -

ТП 1.1, Подготовка реактора к загрузке

вода пар

ВР1. Приготовление ферментных препаратов

"Ликвамил1200" -1500ед/кгс.крахмала, для стабилизации САС03 _

ВР 2,Подготовка и мойка оборудования

ВРЗ.Подготовка . _

крахмапосодержащего

сырья

ВР 4. Приготовление раствора ортофосфорной кислоты ВР 5. Приготовление раствора . Ферментных препаратов

ТП1. Приготовление крахмалосодержащей суспензии (30-35%)

ТП2.Клейстеризация крахмалистого сырья (Т-105°С, т-5 мин) ТПЗ.Охлаждение крахмалистого сьфья (80-85°С) . ТП4.Разжижение крахмалистого сырья (80-85°С, т-2 ч.) ТП 5. Охлаждение (55°С)

Рис. \ 0 Фрагмент блок-схемы технологического процесса получения глюкозо-мальтозных сиропов (высокомальтозной патоки).

ТП 8. Фильтрование сиропа ТП 9. Обесцвечивание сиропа ТП10. Фильтрование угольно-сиропной суспензии

ТП 11. Упаривание на ВВУ (до 7880% СВ)

ТП12. Охлаждение (40-45°С)

представлен на рис. 10. Где, базируясь на полученных нами ранее результатах, исключена стадия инактивации а-амилазы после разжижения крахмала и на стадии осахаривания рекомендованы к употреблению две альтернативные ферментативные композиции, позволившие увеличить выход мальтозы до 60 ±1,5%, что на 18 ±1,5% больше по сравнению с исходным уровнем, причем разработанная нами в данной работе ферментативная композиция противопоставлена импортной, которая является дорогостоящей.

Расчет экономической эффективности показал, что уменьшение энергозатрат и трудоемкости, за счет сокращения продолжительности процесса, а также экономия средств при использовании комплекса ферментных препаратов отечественного производства, при производстве высокомальтозно-глюкозных сиропов (высокомальтозных паток) позволяет снизить себестоимость на 4,7%, тем самым увеличить прибыль при использовании разработанной технологии на 2720 рублей на 1000т сырья (расчеты приведены в диссертационной работе в приложении №2).

3.Выводы.

1.Путем скрининга 187 прокариотных микроорганизмов из различных систематических групп найден продуцент, обладающий высокой биосинтетической способностью к образованию пуллуланазы. Определена видовая принадлежность микроорганизма с использованием международной системы API - Micrococcus amylofaciens.

2. Подобранные экспериментальным путем условия культивирования продуцента позволили увеличить продуктивность штамма в 3,2 раза , при этом уровень активности пуллуланазы составил 38,0 ед/см3,для этого:

-разработаны эффективные методы поддержания штамма-продуцента; -сконструированы новые питательные среды для культивирования и биосинтеза пуллуланазы;

-экспериментально обоснованы оптимальные параметры биосинтеза пуллуланазы

( рН среды, возраст, и доза посевного материала, длительность культивирования и аэрация), обеспечивающие максимум накопления фермента;

3.Разработаны методы выделения ферментного препарата пуллуланазы из фильтрата культуральной жидкости Micrococcus amylofaciens :

- определен спектр ферментативных активностей препарата, показано наличие амилолитической, пуллуланазной, глкжоамилазной активностей последнего;

- дана характеристика физико-химических свойств ферментного препарата.

4. Обоснована целесообразность применения мультиэнзимного биокатализа крахмала для повышения эффективности процесса гидролиза последнего, увеличен выход мальтозы до 60,0±1,5%, при уровне содержания глюкозы в сиропах до 10%;

Подобраны оптимальные условия гидролиза крахмала Р-амилазой из B.polymyxa, препарата сс-амилазы, комплекса ферментов из Micrococcus amylofaciens

5. Усовершенствована традиционная технология производства высокомальтозных паток на основе ферментативного гидролиза крахмала:

- на основании экспериментальных данных исключена из традиционной технологии ферментативного гидролиза крахмалосодержащего сырья стадия инактивации ферментов после этапа разжижения крахмала;

- показана целесообразность сохранения а-амилазы, вносимой на стадии разжижения крахмала, в процессе осахаривания;

предложены альтернативные технологии осахаривания крахмала с использованием мультиэнзимного комплекса на основе Micrococcus amylofaciens и импортного препарата «Глюкозим JI-100C+»;

- определена экономическая эффективность предложений, позволившая снизить себестоимость получения высокомальтозных паток на 4,7%, тем самым увеличить прибыль при использовании разработанной технологии на 2720 рублей на 1000т сырья.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1 .С.Н.Бутова, ИАЛСривова, ТАЛадур, И.В.Воробьева. Получение

высокомальтозных сиропов из отходов крахмалистого сырья с использованием мультиэнзимных композиций препаратов амилолитического действия. // Сб.научных трудов «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК», М, Пшцепроиздат, 2004, с.274-278.

2. А.Ю.Кривова, С.А.Ливинская, С.Н.Бутова, ИА.Кривова, Д.В.Горячев. Некоторые аспекты микробиологической безопасности эмульсионных продуктов. // Масла и жиры, 2006, №1 (59), с.13-16.

3.С.Н.Бутова, ИА.Кривова, ТА.Ладур, И.В.Воробьева. Использование мультиэнзимных композиций для получения высокомальтозно-глюкозных сиропов. // Сб. докладов молодых ученых МГУПП, 2-ая Всероссийская науч.-технич. конференция - выставка «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для реализации», часть 2, М, 2004, с. 135-136.

4. И.А.Кривова, С.Н.Бутова. Использование пуллуланазы в конверсии растительного сырья. // Труды 5 ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-Вузы «Биохимическая физика», М, 2005, с.315-316.

5. С.Н.Бутова, ИА.Кривова. Применение биотехнологии в производстве сахаристых продуктов. // Материалы третьего съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова, М, 2005, с. 143-144.

6. С.Н.Бутова, И.А.Кривова. Пуллуланаза - фермент расщепляющий растительное сырье, используемое в пищевой промышленности. // Сб. докладов молодых ученых МГУПП, Всероссийская науч.-технич. конференция -выставка, М, 2005, с.24-25.

7.И.А.Кривова, С.Н.Бутова. Пуллуланаза - необходимая составляющая мультиэнзимной композиции препаратов амилолитического действия, в производстве сахаристых продуктов. // Сб. научных трудов «Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК», М, 2006 , с.197-201.

8. ИА.Кривова, С.Н.Бутова, ТАЛадур Выделение и изучение внеклеточной пуллуланазы Micrococcus amylofaciens. // Хранение и переработка сельхозсырья, 2006, №1, с.24-26.

Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ

Фирма «Простатор» Москва,ул.Палиха,2а, тел. 250-92-06.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кривова, Ирина Анатольевна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Крахмал-запасное вещество растительной клетки

2.2. Особенности строения и свойства пуллуланана 2.2.1. Пуллулан и амилопектин: сходство и различие

2.3. Микробная деградация крахмалистого сырья

2.3.1. Расщепление крахмала амилолитическими ферментами.

2.3.2. Механизм действия амилолитического комплекса ферментов на крахмал

2.3.3. Пуллуланаза и механизм действия внеклеточной пуллуланазы

2.4. Получение высокомальтозных сиропов из крахмалосодержащего сырья

3. Экспериментальная часть

3.1. Материалы и методы исследования.

3.1.1. Материалы

3.1.2. Методы исследования

3.1.2.1 .Метод определения содержания сухих веществ в растворах с использованием рефрактометра

3.1.2.2.0предедление восстанавливающих Сахаров по методу Бертрана

3.1.2.3.0предедление количества сырой клетчатки методом Кюршнера и Ганака

3.1.2.4.0пределение общего азота по Неслеру

3.1.2.5.Определение свободных минеральных кислот

3.1.2.6.0пределение цветности раствора

3.1.2.7.0пределение вязкости на капиллярном вискозиметре

3.1.2.8.0пределение пуллуланазной активности методом Шомодьи-Нельсона

3.1.2.9.0пределение а-амилазной активности колориметрическим методом

3.1.2.10.Определение глюкоамилазной активности с применением метода Зихера-Блейера в модификации Смирновой В.А. для опреления глюкозы.

3.1.2.11 Определение (3-амилазной активности

3.1.2.12.Методы статистической обратки результатов

3.2. Результаты и их обсуждение

3.2.1. Скрининг микроорганизмов на их спсобность образовывать пуллуланазу

3.2.2. Идентификация видовой принадлежности перспективного штамма микроорганизмов.

3.2.3. Хранение культуры Micrococcus amylofaciens в лабораторных условиях

3.2.4. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза пуллуланазы бактериальной культурой Micrococcus amylofaciens

3.2.5. Подбор условий культивирования бактериальной культуры Micrococcus amylofaciens

3.2.6. Выделение, очистка и физико-химичекие свойства препарата пуллуланазы.

3.2.6.1. Выделение и физико-химические свойства препарата пуллуланазы

3.2.6.2. Очистка и физико-химические свойства препарата пуллуланазы

3.2.7. Гидролиз крахмалосодержащего сырья ферментными препаратами

3.2.7.1. Результаты исследования процесса разжижения крахмалов

3.2.7.2. Исследование процесса осахаривания крахмала

3.2.7.3. Влиянии различных факторов на процесс осахаривания крахмалистых субстратов (3-амилазы и оптимизация условий

3.2.7.4. Определение оптимальной дозы вносимого ферментного препарата (3-амилазы на стадии осахаривания

3.2.7.5. Применение композиции а и {3-амилазы для получения высокомальтозных сиропов

3.2.7.6. Использование мультиэнзимной композиции ферментов для гидролиза крахмалов

3.2.8. Варианты технологии ферментативного гидролиза крахмалов.

3.2.9. Некоторые свойства высокомальтозных сиропов, полученных из крахмалосодержащего сырья.

4. Обсуждение результатов 174

5. Выводы 181

6. Литература 183

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биотехнологического процесса получения комплексного ферментного препарата пуллуланазы и использование его для крахмалопаточной промышленности"

В настоящее время тяжелая экологическая обстановка, вызванная загрязнением окружающей среды отходами химических и микробиологических производств, не совершенностью технологических процессов, воздействием производства на окружающую среду привели к неправильному использованию огромного количества сырья, изымаемого из природы. В конечный продукт превращается в среднем лишь 1,5-2,5%, остальная же его масса переходит в производственные и бытовые отходы, из которых только лишь 3,0% используется в качестве вторичного сырья. Ограниченность сырьевых ресурсов и экологически вредные для человека изменения в природе ставят вопрос о разработке комплексной и правильной технологии переработки отходов растительного сырья (Витол И.С. и др.,2000). Нарушение структуры питания приводит к дефициту отдельных видов пищевых продуктов, например, таких как углеводы. В свою очередь это, вызывает необходимость организации и развития производства сахаристых веществ из крахмалосодержащего сырья и их отходов для обеспечения населения пищевыми заменителями сахара, такими как патока с высоким содержанием мальтозы и глюкозы. Такие патоки являются ценными пищевыми продуктами, более сладкими и менее вязкими по сравнению с обычной карамельной патокой. Они не гигроскопичны, не кристаллизуются при хранении, в связи с чем, пригодны для замены сахара в кондитерской, хлебопекарной, консервной, молочной и других отраслях промышленности.

Приоритетным направлением в области решения проблем, обеспеченности' пищевыми ресурсами народонаселения нашей планеты является внедрение в народное хозяйство экологически безопасных и экономически выгодных новых технологий. В связи с этим, перспективным представляется способ получения заменителей сахара путем ферментативного гидролиза крахмала с помощью амилолитического комплекса ферментов (Кислухина О.В., 2002). Особая роль отводится ферменту пуллуланазе, которая гидролизует в пуллулане а-1,6 связи, в результате возникают молекулы триоз, состоящих из трех остатков глюкоз (Грачева И.М. и.др.,2000).

Важно отметить, что пуллуланазы расщепляют не только пуллулан, а также а-1,6 связи в крахмале, предельных декстринах и гликогене. Это свойство пуллуланазы ценное и имеет большое практическое значение при получении сахаристых веществ на основе крахмала особенно при совместном действии а-амилазы, [3- амилазы и глюкоамилазы, при этом не образуется продуктов кислой деструкции Сахаров, а также продуктов их термического разложения, рН конечного продукта колеблется от 5,5 до 6,0.

Учитывая тот факт, что в нашей стране промышленного производства пуллуланазных препаратов нет, вопрос о поиске продуцентов внеклеточной пуллуланазы, разработке условий культивирования последнего, выделении фермента из культуральной жидкости, а также о возможности использования мультиэнзимных композиций ферментных препаратов пуллуланазы при биоконверсии крахмалистого сырья с целью получения высокомальтозно-глюкозной патоки является весьма актуальным. Цели и задачи исследования.

Для достижения данной цели были поставлены следующие 'задачи: . - скрининг микроорганизмов на их способность образовывать пуллуланазу; '

- подбор оптимальной среды и режимов культивирования штамма - продуцента пуллуланазы;

- разработка оптимального способа хранения посевного материала микроорганизма-продуцента пуллуланазы;

- выделение и очистка внеклеточной пуллуланазы;

- исследование'физико-химических свойств очищенного ферментного препарата пуллуланазы;

- использование амилолитического комплекса ферментов при деградации крахмалистого сырья для получения высокомальтозно - глюкозной патоки;

- разработка технологии получения высокомальтозно-глюкозной патоки из крахмалосодержащего сырья.

Научная новизна.

В представленной диссертационной работе научно обосновано и экспериментально доказано:

- по результам скрининга бактериальных культур, выделенных из различных' почвенных образцов, найден продуцент пуллуланазы, изучены его культурально-физиологические особенности и определена видовая принадлежность - Micrococcus amylofaciens;

- оптимизированы условия питания и культивирования продуцента пуллуланзы;

- изучены условия выделения препарата внеклеточной пуллуланазы, хранения и очистки;

- на основании выявленных зависимостей выхода высокомальтозно- глюкозной патоки от - степени биоконверсии крахмалистого сырья впервые обоснован оптимальный состав ферментативных систем амилолитического действия;

- разработана технология получения высокомальтозно-глюкозной патоки при использовании мультиэнзимных композиций амилолитических ферментов;

Практическая значимость работы.

Проведенные исследования являлись основой доя решения эколого-биологических задач по совершенствованию комплексной переработки различного крахмалосодержащего сырья и его отходов при использовании амилолитического комплекса ферментов микробного происхождения. 'Наряду с получением ценного продукта, а, именно, высокомальтозно-глюкозной патоки, нами одновременно решались вопросы снижения загрязнения окружающей среды отходами крахмалистого сырья и токсичными продуктами их деструкции:

- разработана стадия осахаривания сырья с использованием энзиматических комплексов;

- увеличен выход глюкозы по сравнению с традиционной технологией на 18,0+1,5%;

- улучшены разнообразные свойства и качественные характеристики паток . Результаты проделанной работы подтверждены в полупроизводственных условиях на промышленной установке опытного участка апробаций научных разработок при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова.

2 . Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кривова, Ирина Анатольевна

5. Выводы.

2. Подобранные экспериментальным путем условия культивирования продуцента позволили увеличить продуктивность штамма в 3,2 раза , при этом л уровень активности пуллуланазы составил 38,0 ед/ см ,для этого: -разработаны эффективные методы поддержания штамма-продуцента; -сконструированы новые питательные среды для культивирования и биосинтеза пуллуланазы;

-экспериментально обоснованы оптимальные параметры биосинтеза пуллуланазы ( рН среды, возраст, и доза посевного материала, длительность культивирования и аэрация), обеспечивающие максимум накопления фермента;

3.Разработаны методы выделения ферментного препарата ' пуллуланазы из фильтрата культуральной жидкости Micrococcus amylofaciens :

- определен спектр ферментативных активностей препарата, показано наличие амилолитической, пуллуланазной, глюкоамиЛазной активностей последнего;

- дана характеристика физико-химических свойств ферментного препарата.

Подобраны оптимальные условия гидролиза крахмала |3-амилазой из B.polymyxa ,препарата а-амилазы, комплекса ферментов из Micrococcus -amylofaciens;

- предложены альтернативные технологии осахаривания крахмала с использованием мультиэнзимного комплекса на основе Micrococcus amylofaciens и импортного препарата «Глюкозим Л-100С+»;

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кривова, Ирина Анатольевна, Москва

1.Балаян A.M., Маркосян J1.C. Характеристика внутриклеточной пуллуланазы термофильного штамма Bac.spp.//Биохимия, 1989,т.54, вып.1, 273-281.

2. Баразненок В.А. Выделение и свойства эндоглюконаз и ксилоназ .// Диссертация кандидата химических наук, М, МГУ, 1999,175 с.

3. Беликов П.С.Дмитриева Г.А. Физиология растений.//РУДН,М, 1992,248 с.

4. Бендецкий К.М., Яровенко B.J1. Действие альфа-амилазы из Bac.subtilis на крахмал.//Биохимия. 1987 , т.38, №3, 568-572.

5. Бородин З.М., Ладур Т.А. Исследование процесса разжижения крахмала при производстве глюкозы ферментативным способом.// Сахарная промышленность, 1974,№2, 53-58.6.Бутова С.Н.

6. Бутова С.Н., Кривова И.А., Ладур Т.А., Воробьева И.В.

7. Витол И.С.,Кобелева И.Б.Драубенберг С.Е. Ферменты и их применение в пищевой промышленности. // М: Издательский комплекс МГУПП, 2000,213с.

8. Гаспарян А., Абелян Р., Африкян Р. Характеристика бета-амилазы Bac.polymyxa. // Биохимия, 1992,т.57, вып.6, 356.

9. Ю.Герна Р.Л. Хранение микроорганизмов. Методы общей бактериологии . // Мир,М, 1983,т. 1,512с.11 .Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. // М: Элевар,2002, 512с.

10. Грачев Ю.П. Математические методы планирования эксперимента. // Пищевая промышенность, М, 1979,199с.

11. З.Громов М.А. Термофизические характеристики мальтозы и ее водных растворов. // Сахарная промышленность, 1987,№11, 59-61.

12. М.Гулюк Н.Г., Жушман А.И. и др. Крахмал и крахмалопродукты.// Агропромиздат., М, 1985,238с.

13. Канбурова М. Оптимизация условий синтеза термофильной пуллуланазы Вас. stearothermophilus.// Acta Microbiol. Bulg., 1986, №9,48-51.

14. Каприлянц Т., Тарахтий С., Стынгач Р. Ферментативный гидролиз пшеничного крахмала различными амилазами.// Микробиология, 1991, №6, с.50.

15. Квеситадзе Г.М. Грибные и бактериальные амилазы.//Тбтлиси : Мецниереба, 1990,154 с.

16. Квеситадзе Г.М. Эндоглюканазы термофильных и мезофильных грибов. // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук,Тбилиси,1994, 40 с.

17. Киселева 3.JI. Окислительно-щелочная и водно-бутанольная делигнификация растительного сырья для получения глюкозы ферментативным гидролизом.// автореферат диссертации на соискание степени кандидата химических наук, м, 1993,24 с.

18. Кислухина О.В. 2002 Ферменты в производстве пищи и кормов.//М.ДеЛи принт, 2002, 336 с.

19. Кондратьева Н.А., Исакова Е.П., Бирюков В.В. Выделение и изучение термофильных анаэробных бактерий, утилизирующих целлюлозосодержащие материалы.// прикладная биохимия и микробиология, 1998, т.34,№4, 388-398.

20. Кудряшова О.А., Юрлова Н.А. Изучение естественной изменчивости Aureobasidium pullulans шт. 11 продуцента эндосахарида.// Микробиология, 1997,т.66,№3,354-357.

21. Ладур Т.А. Временная технологическая инструкция по применению ферментного препарата «Глюкозим Л-400С+Нео» в крахмало-паточном производстве.// Коренево:ВНИИК, 2001,-сЗ.

22. Ладур Т.А. Выдача рекомендаций по внедрению ферментных препаратов при производстве глюкозы. // Отчет ВНИИК,№3551, 1971,47с.

23. Ладур Т.А. Производство и применение низкосахаристых продуктов ферментативного гидролиза крахмала.// АгроНИИТЭИПП, 1988, сер.19, вып.2., 9-16.

24. Ладур Т.А. , Лукин Н.Д. Совершенствование техники и технологии сахаристых крахмалопродуктов в СССР и за рубежом.// АгроНИИТЭИПП, 1987, сер. 19, вып.9,с.7-16.

25. Ладур Т.А. , Лукин Н.Д. Применение биотехнологии для получения сахаристых продуктов для зернового крахмалосодержащего сырья.//Пищепромиздат,М, 2004, с.263-266.

26. Ладур Т.А., Пучкова Т.С. Глюкозо-фруктозный сироп новый сахарозаменитель. // Сахарная промышленность, 1983,9, 53-54.

27. Ладур Т.А. ,Сидорова Е.К., Лукин Н.Д. и др. Новое в технике и технологии производства сахаристых крахмалопродуктов и их применение в СССР и за рубежом. // ЦНИИТЭИ1111ищепром., 1983,сер.5,вып.6,11-16.

28. Лукин Н.Д., Сидорова Е.К., Дубинская И.П. Пути совершенствования паточного производства.// АгроНИИТЭИПП, 1986, сер.19, вып.5, 1-36.

29. Ленинджер А. Основы биохимии, тт.1-3- М.:Мир,1990,-957с.

30. Маркосян Л.С.Балаян A.M. Внеклеточная пуллуланаза термофильного штамма Bacillus sp.// Прикладная биохимия и микробиология, 1990,т. 26,№3, 313-320.

31. Мазуренко А.Н., Каменский А.А., Сериченко Л.Г., Сазонова A.M., Румянцев В.М., Купцов Н.В. Штамм бактериий Bacillus subtilis продуцент осахаривающей амилазы, расщепляющей пуллулан. Патент 2034923, C1,RU, 1996, бюлл.13.

32. Максимов В.И. Реакции трансгликозилирования в ферментативном гидролизе полисахаридов и методы их исследования // в книге «Микробиология и биохимия разложения растительных материалов», М, Наука, 2000,181-230.

33. Номенклатура ферментов.//М: Изд-во ВИНИТИ, 1979-3 20с.

34. Павлова И.Н., Ночарова Н.А.,Захарова И.Я., Титиянова Н.З. Штамм бактерий B.lichenifor продуцент термофильных амилолитических ферментов.// Патент 5021951/13, опуб. 15.10.2001, бюл.37.

35. Павлова И.П.,Кочанова Н.А. и др. Штамм бактерий Вас. lichienifor -продуцент термостабильных амилолитических ферментов, патент 2001103, бюл.16,15.10.1993.

36. Полыгина Г.В.,Чередниченко B.C., Римарева Л.В. Определение активности ферментов.// ДеЛи принт,М,2003,372с.

37. Пучкова Е.О. Методы определения содержания жизнеспособных микроорганизмов.//Биотехнология, 1996, т.4.,№1,142.

38. Пучкова Т.С. Разработка технологии глюкозо-фруктозного сиропа из крахмала с применением глюкозоизомеризующих ферментных препаратов.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук, 1984,М,ВНИИК, 26с.

39. Соловьева С.Ю.,Ладур Т.А. Биоконверсия крахмала при производстве патоки заданного углеводного состава. // Пищепромиздат,М,2004,266-269.

40. Сторневая В.В. Влияние рН на термочувствительность глюкозных сиропов.// ЦНИИТЭИПищепром., 1978,вып.4, 5-6.

41. Сторневая В.В. Термическая устойчивость глюкозных сиропов при выпаривании и упаривании.// Сахарная промышленность, 1981 ,№ 1 .,52-53.

42. Рид. Д. Ферменты в пищевой промышленности. // Пищевая промышленность, М, 1971,342с.

43. Рухлядева П.П. , Полыггалина Г.В. методы определения гидролитических ферментов.//Легпищепром, 1981,290 с.

44. Трегубов Н.Н. , Костенко В.Г. Технохимический контроль крахмало -паточного производства.// Агропромиздат, 2-е изд., 1991,271 с.

45. Трегубов Н.Н.,Жаров Е.Я. и др. Технология крахмала и крахмалопродуктов. //Легкая и пищевая промышленность, М, 1981,472с.

46. Шапашников Г.П., Иванова Е.А. Совершенные способы производства патоки и глюкозы из крахмала и крахмалосодержащего сырья.// ЦИНТЭИПищепром., 1969,40 с.

47. Уистлер Р.Л., Пашаль Э.Ф. Химия и технология крахмала.// Пищевая промышленность, М, 1975,360с.

48. Яровенко В.Л.,Понамарева А.Н. «11»-комплекс растений и пуллуланаза Aerobacter aerugenes. //Пищевая промышленность, М, 1970, 243с.

49. Altschul S F, Gish W, Miller W, Myers E W, Lipman D L. Basic local alignment search tool.// J Mol Biol. 1990;215:403-410.

50. Anderson, S. & Weber, G. The reversible acid dissociation and hybridization of lactic dehydrogenase. //Arch. Biochem. Biophys. ,2002 ,116,207-223.

51. Antranikian, G. Microbial degradation of starch. In Microbial Degradation of Natural Products (Winkelmann, G., ed.), pp. 28-56. VCH, Weinheim, Germany.2002.

52. Ara K, Igarashi K, Saeki K, Ito S. An alkaline amylopullulanase from alkalophilic Bacillus sp. KSM-1378: kinetic evidence for two independent active sites for the a-1,4 and a-1,6 hydrolytic reactions. //Biosci Biotechnol Biochem. 1995;59:662-666.

53. Arnosti C.,Repeta D. Extracellular enzyme activity in anaerobial culture ".Evidence of pullulanase activity among mesophilic marine bacteria.//Appl.And Environ.Microbiol.,1994,v.60,3, 840-846.

54. Badal C.,Saha C., Saroj P., et al. Purification and characterization of ahydric thermostable pullulanase from Clostridium sp.// Microb. ,1998,453-478.

55. Badal C.,Saha C., et al. Novel highly thermostable pullulanase from thermophiles.//Trends Biotech., 1989,v7,1,56-64.

56. Bauer M.W.,Driskill L.E.,Kelly R.M. Glycosylgydrolases from hyperthermophilic microorganisms.//Curr. Opin. Biotechnol.,1998, 9,141-145.

57. Bentley I.S., Williams E.C. Starch conversion. In: Industrial enzymology.//L.Macmilliam Press, 1996,337-357

58. Bers, D.M., Patton, C.W. & Nuccitelli, R. A practical guide'to the preparation of Ca2+ buffers.// Methods Cell Biol. ,2004 ,40,3-29.

59. Bergmeyer, H.U. & Grassl, M. Methods for Enzymatic Analysis, Vol. 2, 3rd edn. (Bergmeyer, H.U., ed.), pp. 151-152. Verlag Chemie, Weinheim.,2001.

60. Bibel M.,Bretti C.,Gosslar U. Et al. Isolation and analysis of genes from amylolitic enzymes of the hyperthermophilic bacterium.//FEMS Microbiol.Lett., 1998,158 ,9-15.

61. Bisgard-Frantzen H., Svendsen A. Amylase variants. Patent application WO 96/23873, 2004.

62. Bradford M M. A rapid sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.// Anal Biochem. 1999;72:248-254.

63. Brown S H, Kelly R M.Characterization of amylolytic enzymes having both a-1,4 and a-1,6 hydrolytic activity from the thermophilic archaea Pyrococcus furiosus and Thermococcus litoralis.//Appl Environ Microbiol. 1999;59:2614-2621.

64. Brown, S.H., Kelly. R.M. Characterization of amylolytic enzymes from the thermophilic archaea Pyrococcus furiosus and Thermococcus litoralis.// Appl. Environ. Microbiol,.2003 63, 2616-2628.

65. Bryant, D.T. Quin 2: the dissociation constants of its Ca2+ and Mg2+ complexes and its use in a fluorimetric method for determining the dissociation of Ca2+-protein complexes. //Biochem. J. ,2005,226, 613-616.

66. Canganella F., Andrade C, Antranikian G. Characterisation of amylolytic and pullulytic enzymes from thermophilic archaea and from a new Fervidobacterium species. //Appl Microbiol Biotechnol. 1994;42:239-245.

67. Cha H J. ,Yoon H G, Kim Y W, Lee H S, Kim J W, Kweon К S, Oh В H, Park К H. Molecular and enzymatic characterization of a maltogenic amylase that hydrolyzes and transglycosylates acarbose. Eur J Biochem. 1998;253:251-262.

68. Cheoral K., Chung Y.C. et al. Enzymes involved in the processing of starch to sugars.//Appl.Environ. Microboil. ,1994,57,123-128. ,

69. Chung H.,Yoon S, Lee M, Kim M, Kweon K, Lee I, Kim J, Oh B, Lee H-S. Characterization of a thermostable cyclodextrin glucanotransferase isolated from Bacillus stearothermophilus ET1// J. Agric Food Chem. 1998;3:952-959.

70. Coleman, R.D., Yang, S.-S. & McAlister, M.P. Cloning of the debranching-enzyme gene from Thermoanaerobium brockii into Escherichia coli and Bacillus subtilis.// J. Bacterid., 1998,169,4302-4307.

71. Crabb W D, Mitchinson C.Enzymes involved in the processing of starch to sugars. //Trends Biotechnol. 2004;15:349-352.

72. Costanzo B.,Garabed A. Starch-hydrolyzing enzymes from thermophilic archaea and bacterua,// Chemical Biplogy, 2002, 6,151-160.

73. Diderichsen B, Christiansen L. Cloning of a maltogenic a-amylase from Bacillus stearothermophilus.// FEMS Microbiol Lett. 2000;56:53-60.

74. Diderichsen B, Wedsted U, Hedegaard L, Jensen В R, Sjiuholm C. Cloning of aldB, which encodes a-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J Bacterid. 1990; 172:4315-4321

75. Dong G., Vieille C, Zeikus J G. Cloning, sequencing, and expression of the gene encoding amylopullulanase from Pyrococcus furiosus and biochemical characterization of the recombinant enzyme. //Appl Environ Microbiol,2000,34-78.

76. Duffner F., Bertoldo C. A new thermoactive pullulanase from Desulfiirococcus mucosus: cloning, sequencing and characterization of the recombinant enzyme after expression in B.subtilis.//J.Bacteriol.,2000,182,6331-6338.

77. Freer S. Purification and characterization of an extracellular a-amylase from Streptococcus bovis YB.II Appl Environ Microbiol. 2000;59:1398-1402.

78. Furegon L, Curioni A, Peruffo DBA. Direct detection of pullulanase activity in electrophoretic polyacrylamide gels.// Anal Biochem. 2001 ;221 ;200-201,

79. Gantelet H, Duchiron F. Purification and properties of a thermoactive and thermostable pullulanase from Thermococcus hydrothermalis, a hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent.// Appl Microbiol Biotechnol. 2003;49:770-777.

80. Gastro G.Purification and properties of a thermoactive and thermostable pullulanase from Thermococcus hydrothermalis.// Appl. Microbiol.Biotechnol.,1992, 49,770-777

81. Jakovljevic D.,Vrvic M. et al. Fine structural analysis oh the fungal polysaccharide pullulan elaborated by Aureobasidium pullulans CH-1 st.// J.Serb.Chem Soc.,2001,66,6,377-383/

82. Henry, E.R. & Hofrichter, J. Singular value decomposition: application to analysis of experimental data.// Methods Enzymol. 2000 ,210,129-192.

83. Hyun, H.H. & Zeikus, J.G. General biochemical characterization of thermostable pullulanase and glucoamylase from Clostridium thermohydrosulfuricum.// Appl. Environ. Microbiol.2000,49,1168-1173.

84. Kamburova A. Amylolytic enzymes and production derived from starch: a review. // Crit. Rev. Food Sci. Nutr.1986,35,373-403.

85. Kashiwabara S, Ogawa S, Myyoshi N, Oda M, Suzuki Y. Three domains comprised in thermostable molecular weight 54,000 pullulanase of type I from Bacillus flavocaldarius KP 1228.//Biosci Biotechnol Biochem. 2000;63:1736-1748. „

86. Kelkar H.S.,Despande M. Purification and kinetic studies of wheat bran J3-amylase and pullulan-hydrolysing glucoamylase from Selerotium rolfsii.// Starch., 1993,45, 361-368.

87. Koch, R., Zablowski, P., Spreinat, A. & Antranikian, G. Extremely thermostable amylolytic enzyme from the archaebacterium Pyrococcus furiosus. //FEMS Microbiol. Lett.,1990, 71,21-26.

88. Koch, R., Spreinat, A., Lemke, K. & Antranikian, G. Purification and properties of a hyperthermoactive a-amylase from the archaebacterium Pyrococcus woesei.// Arch. Microbiol., 2000,155, 572-578.

89. Johnson, W.C. Jr Analysis of circular dichroism spectra.// Methods Enzymol. 2003 , 210,426-447.

90. Lehrer, S.S. Solute perturbation of protein fluorescence. The quenching of the tryptophyl fluorescence of model compounds and of lysozyme by iodide ion.// Biochemistry , 2001 ,10,3254-3263.

91. Leuschner, C. & Antranikian, G. Heat-stable enzymes from extremely thermophilic and hyperthermophilic microorganisms.// World J. Microbiol. Biotechnol. 1999,11, 95-114.

92. Linse, S., Johansson, C., Brodin, P., Grundstroem, Т., Drakenberg, T. & Forsen, S. Electrostatic contributions to the binding of Ca2+ in calbindin D9k.// Biochemistry, 2001, 30, 154-162.

93. Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L. & Randall, J.R. Protein measurement with the Folin phenol reagent. //J. Biol. Chem. ,1951,193, 265-275 .

94. Madi, E. & Antranikian, G. Identification of a starch degrading anaerobic thermophile producing thermostable a-amylase and pullulanase.// Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999,30,422-425.

95. Marc J. Van der Maarel et al. Properties and applications of starch-converting enzymes of the a-amylase family.//J. Biotechnol.,2002,94,137-155.

96. Mathupala, S.P. & Zeikus, J.G. Improved purification and biochemical characterization of extracellular amylopullulanase from Thermoanaerobacter ethanolicus 39E. //Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003,39,487-493.

97. Melasniemi H. Effect of carbon source on production of thermostable a-amylase,pyllulanase and a-glucosidase by clost thermohydrosuturicum.// J.Ben Microb.,1997,133,4,883-890.

98. Melasniemi, H. Purification and some properties of the extracellular alpha-amylase-pullulanase produced by Clostridium thermohydrosulfuricum. //Biochem. J. ,2001,250,813-818.

99. Myers, J.K., Pace, N.C. & Scholtz, M.J. Denaturant m values and heat capacity changes: relation to changes in accessible surface areas of protein unfolding. // Protein Sci. ,2005, 4, 2138-2148.

100. Myers, J.K., James M.G. et al Recent progress towards under-standing biosynthesis of the amylopectin crystal.// Plant Physiol.,2000,122,1989-1997.

101. Nakamura, N., Sashihara, N., Nagayama, H. & Horikoshi, K. Characterization of pullulanase and a-amylase activities of a Thermus sp. AMD33.// Starch/Starke,2000,41,112-117.

102. H.Pace, C.N. & McGrath, T. Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation.// J. Biol. Chem, 2000,. 255,3862-3865.

103. PattT. Microbiology degradation of chemical pullulans.// Appl.Biochem. Biotechnol., 1993,43, 6, 567-575.

104. Permyakov, E.A., Yarmolenko, V.V., Emelyanenko, V.I., Burstein, E.A., Closset, J. & Gerday, C. Fluorescence studies of the calcium binding to whiting (Gadus merlangus) parvalbumin. //Eur. J. Biochem.2001,109,307-315.

105. Royer, C.A., Mann, C.J. & Matthews, C.R. Resolution of the fluorescence equilibrium unfolding profile of trp aporepressor using single tryptophan mutants.// Protein Sci., 2002 ,2,1844-1852.

106. Saha B.,Leikus J. Biotechnology of maltose syrup production.// Process Biochem., 1989,22,3,78-81.

107. Salva G.,Iracema.O. Effect of the carbon source of a-amylase production by B.subtilis.// Rev.Microbiol.,2001,26,1,46-51.

108. Santoro, M.M. & Bolen, D.W. Unfolding free energy changes determined by the linear extrapolation method. 1. Unfolding of phenylmethanesulfonyl alpha-chymotrypsin using different denaturants. //Biochemistry, 2000, 27, 8063-8068.

109. Schultes, V. & Jaenicke, R. Folding intermediates of hyperthermophilic D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Thermotoga maritima are trapped at low temperature.// FEBS Lett.2002,290,235-238.

110. Spreinat, A. & Antranikian, G. Analysis of the amylolytic enzyme system of Clostridium thermosulfurogenes EMI.// Starch, 2002, 8,305-312.

111. Sunna, A., Moracci, M., Rossi, M. & Antranikian, G. Glycosyl hydrolases from hyperthermophiles.// Extremophiles ,2002,1,2-13.

112. Takasaki J. Production and utilization of P-amylasa and pullulanase. // Agricult.and Biolog.Chem., 1976,v40, 8,1551-1522.

113. Takasaki J. Production of pullulanase. // Biolog.Chem., 1993 , 5,8, 551-522.

114. Tanford, C. Physical Chemistry of Macromolecules. -John Wiley, New York.,2000,672 p.

115. Tomimura E. Action of neopullulanase.Neopullulanase catalyzes both hydrolysis and transglycosilation at a-1-4 and a-1-6 glucosidic linkages. // J. Biol.Chem., 1991, 267,18447-18452.

116. TeggeG. Action of pullulanase.//J. Biol.Chem,1980, 128, 786-897.

117. Tegge G. Pullulanase.//J. Biol.Chem,1986, 228,186-197.

118. Tsou, C.L. Conformational flexibility of enzyme active sites. //Science,2003, 262,380-381.

119. Директор МентраН'Бйа^нженёрия" РАН академик.ГРА'СХН Скряби!! К.Г. Ч:' ''' "2$Йшваря 2006 г.1. АКТ

120. Опытно-промышленных испытаний ферментного препарата пуллуланазы, полученного из фильтрата культуральной жидкости Micrococcus amylofaciens.

121. Процесс осахаривания крахмала осуществляли с использованием амилазы из B.polymyxa и препарата пуллуланазы из Micrococcus amylofaciens, без инактивации а-амилазы.

122. Разжиженный продукт без изменения рН охлаждали до температуры 57°С и в него задавали ферментные препараты в количестве 1,5 ед/г крахмала каждого. Процесс осахаривания осуществлялся в течение'60 часов.

123. Затем осахаренный сироп подвергали механической фильтрации на лабораторном вакуум-фильтре и обесцвечиванию с использованием в качестве адсорбента порошкообразного активного угля в количестве 0,5% к СВ сиропа.

124. Далее сироп уваривали на вакуум-аппарате до содержания СВ 47%.

125. В результате получили высокомальтозный сироп в количестве 9,5 кг с содержанием сухих веществ 47%, редуцирующих веществ 98,5%, мальтозы 79,4%, глюкозы 10,2%, золы 0,45%.1. Заключение.

126. Сокращается также продолжительность осахаривания до 60 часов вместо 72 часов для получения высокомальтозного сиропа при использовании пуллуланазы вместо традиционных ферментных препаратов.

127. Подписи членов комиссии: зав. лабораторией инженерии ферментов Центра "Биоинженерия" РАН, jIri —Jд.х.н., профессор ^ Варламов В.П.старший научный сотрудник1. Лопатин С.А.

128. Центра "Биоинженерия" РАН, к.х.н. ^у/ профессор кафедры "Биотехнология" МГУПП,д.б.н., профессор Бутова С.Н.соискатель кафедры "Биотехнология" МГУПП- Кривова И.А.

Информация о работе

Кривова, Ирина Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Разработка биотехнологического процесса получения комплексного ферментного препарата пуллуланазы и использование его для крахмалопаточной промышленности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы