Разработка биотехнологических параметров по получению протективного, инактивированного антигена Ornithobacterium rhinotracheale

Курьянова, Назия Хусаиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биотехнологических параметров по получению протективного, инактивированного антигена Ornithobacterium rhinotracheale
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологических параметров по получению протективного, инактивированного антигена Ornithobacterium rhinotracheale"

На правах рукописи

Курьянова Назия Хусаиновна

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПО ПОЛУЧЕНИЮ ПРОТЕКТИВНОГО ИНАКТИВИРОВАННОГО АНТИГЕНА ОИМТНОВАСТЕШиМ КНШОТКАСНЕАЬЕ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 СЕН 2012

Ульяновск-2012

005052411

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина»

Научный руководитель Золотухин Сергей Николаевич

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Ежкова Галина Олеговна

доктор биологических наук, профессор кафедры технологии пищевых производств ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет»

Щербаков Анатолий Анисимович

доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»

Ведущая организация ФГБУ «Всероссийский государственный центр

качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов» (ВГНКИ).

Защита диссертации состоится «12» октября 2012 года в часов на

заседании диссертационного совета Д 220.065.01 при ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» по адресу: 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел. (8-8422) 44-30-58, факс 44-30-7£, е-таП:когт1еп@уапс!ех.ш

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», с авторефератом в сети интернет на официальном сайте Министерства образования и науки РФ vvww.vak.ed.gov.ru на сайте академии www.ugsha.ru

'д

Автореферат разослан « 1 » сентября 2012 года. Ученый секретарь

диссертационного совета Пыхтина Лидия Андреевна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последней трети XX века, несмотря на определенные успехи в борьбе с инфекционными болезнями, значение инфекционной патологии, как одного из основных критериев здоровья, признано всем мировым сообществом.

Сегодня можно констатировать, что суммарная распространенность инфекционных (и паразитарных) болезней, несмотря на предпринимаемые усилия, направленные на борьбу с ними, не только не сокращается, но даже возрастает. Так, если в начале девяностых годов в России ежегодно регистрировалось в среднем 30 млн. случаев инфекционных заболеваний, то в последние годы эта величина превышает 40 млн. (М.Г.Шандала, 2005).

Мировой опыт борьбы с болезнями животных показал, что в системе мероприятий обеспечения здоровья всех видов животных специфическая профилактика занимает важное место. Это связано с тем, что активная иммунизация является наиболее эффективным средством предотвращения многих болезней вирусной и бактериальной этиологии (М.Г. Шандала, 2003; Т.А. Костюкова, М.Н.Ляпин, Т.А.Малюкова, 2005; Л.Г. Пантелеева, 2002).

С начала девяностых годов XX века во многих странах мира были зарегистрированы вспышки заболевания респираторного тракта кур и индеек, вызванных Ornithobacterium rhinotracheale. Отмечалось увеличение смертности и снижение продуктивности у бройлеров приблизительно с 28-дневного возраста и длилось до конца периода откорма (Van Beek et al, 1994; De Rosa, 1996). Ornithobacterium rhinotracheale выделен во многих странах мира и инкриминирован, как возможный, дополнительный, причинно-обусловленный агент в комплексе респираторных болезней (Van Veen et al., 2000; Sakai et al., 2000).

Следует отметить, что, не смотря на то, что за последние годы в России расширился ассортимент разрешенных к применению средств воздействия на микроорганизмы и вирусы: в период 2001-2005 гг. в РФ зарегистрировано более 100 инактиваторов (МТ.Шандала, 2006, 2007; Т.А.Костюкова, М.Н.Ляпин, Т.А.Малюкова, 2005; Пантелеева, 2002), арсенал экологически безопасных препаратов, разлагающихся в природных условиях до продуктов, не загрязняющих окружающую среду, ограничен (М.Р.Саврилов, 2004; Л.Г. Пантелеева, 2005, 2006). Поэтому изучение антибактериальных и антивирусных свойств соединений различных классов, с целью разработки новых нетоксичных, высокоэффективных, экологически безопасных антимикробных препаратов, используемых в качестве бактерицидов для создания инактивированных вакцин, представляет собой весьма актуальную задачу для науки и практики {А.Э.Высоцкий, 2005; В.Н.Аржаков, М.М.Ермакович, П.В.Аржаков, 2003, 2004). Безопасные инактивированные вакцины - это компромисс в настоящее время в создании вакцинных препаратов.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является_разработка биотехнологических параметров создания инактивированной вакцины против орнигобактериоза.

Поставленная цель решалась следующими задачами:

1. Изучить основные биологические свойства бактерий О. гЫпои-асЬеаЫ.

2. Выбрать оптимальную питательную среду накопления для культивирования бактерий О. гИтоП-асИеЫе.

3. Разработать схему использования теотропина в качестве инактиватора бактерий О. гЫпо&асИеа1е.

4. Изучить возможность создания вакцинного препарата против орнигобактериоза.

5. Изучить безвредность, аректогенность созданного вакцинного препарата.

Научная новизна. Опираясь на биологические свойства бактерий вида О. гЫпо(гасЬеа1е, подобрана питательная среда и параметры культивирования для наработки максимально возможного количества бактериальной массы данного микроорганизма. Разработаны схемы инактивации бактерий различных морфологических форм с помощью препарата теотропина. На основании полученных данных предложена схема инактивации теотропином бактерий О. гЫпоЯасИеак с целью создания инактивированного вакцинного препарата. В результате экспериментов доказана сложность в конструировании вакцины против орнигобактериоза с использованием адьювантов и предложена схема создания инактивированной орнитобактериозной вакцины, основанной на новых биотехнологических методах, в частности, ультразвуковой дезинтеграции и инактиватора теотропина.

Практическая значимость. Предложена схема инактивации бактерий с помощью препарата теотропина. Разработано «Временное наставление по применению теотропина для профилактики и лечения инфекционных болезней птиц», утвержденное первым проректором-проректором по науке ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» (15.05.2012). Полученные данные позволяют утверждать, что указанный препарат можно использовать в качестве инактиватора для производства инактивированных вакцин.

Разработаны параметры ультразвуковой дезинтеграции бактерий ОгпНИоЬас1егшт гЫпо1гаскеа1е, позволяющие получать протективный антиген для изготовления вакцин.

Доказана возможность создания вакцинного препарата для профилактики орнигобактериоза на основе дезинтеграта бактериальной массы указанных бактерий и инактиватора теотропина.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Путем микроскопии под иммерсионной системой мазка суточной культуры, окрашенной по Грамму, установлены тинкториальные свойства бактерий Огт1коЬас1епит гМпо1гасИеа1е - это небольшие грамотрицательные палочки с круглыми концами, спор и капсул не образуют. Установлены ферментативные свойства, отсутствие способности образовывать индол, сероводород и утилизировать цитрат; не зависимо от вида донора гемолитическая активность (разрушения эритроцитов) не выявлена.

2. Опыты демонстрируют, что наиболее интенсивный рост бактерий изучаемой культуры идёт на обогащенных средах РРЬО-агаре и кровяном агаре. Данные среды для наработки бактериальной массы достаточно дороги и экономически невыгодны. По результатам экспериментов пришли к выводу, что в качестве азотно-витаминной основы конструируемой среды нужно использовать дрожжевой экстракт, пептон, в качестве источника углерода — глюкозу. По результатам опытов сконструирована оптимальная питательная среда накопления для культивирования бактерий О. гЫпо&асЪеа1е

3. Результаты исследований свидетельствуют, что из использованных доз (5,0; 7,5 и 10мг/мл) изучаемого препарата теотропина дозы 5,0 и 7,5 мг/мл обладают бактериостатическим, но не бактерицидным действием, а доза 10 мг/мл после 18 часовой экспозиции с бактериальной культурой концентрацией Ю10 микробных тел является бактерицидной для всех изучаемых микроорганизмов и может быть использованы в качестве инактиватора бактерий О. г\ипо1гаскеа1е для производства инактивированных вакцин.

4. Эксперименты позволили сделать однозначный вывод, что дезинтеграционные структуры бактериальных клеток орнитобактерий, инактивированные теотропином, обладают протективными свойствами, но величина их активности различна. Полученные данные убеждают, что дезинтеграт с дозой иммунизации по белку в 2,0 и 2,4 мг обладает более высокими протективными свойствами, чем дезинтеграт с меньшими дозами инъекций.

5. Экспериментальные биопрепараты из бактерий От'пкоЪас1егшт гЫпо1гаскеа!е не обладают дермонекротической реакцией, ареактогенены и безвредны для макроорганизма, что дает возможность сконструировать ареактогенный инактивированный вакцинный препарат.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: на Международной научно-практической конференции посвященной 65-летию УГСХА «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008), Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения» (Ульяновск, 2009). Международной научно-практической конференции «Наука в современных условиях: от идеи до внедрения: материалы международной научно-практической конференции» (Димитровград, 2009,2010,2011).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО

«Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, состоящих из материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 115 страницах, включают 11 таблиц и 27 рисунков. Список использованных литературных источников 171 (в том числе 58 иностранных).

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась в период с 2008-2011 г на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

В работе использовались референс-штаммы бактерии Orniíhobacíerhim rhinotracheah К 282 и К 33, полученные из ВНИИЗЖ в лиофилизированном виде от 15 февраля 2003 г. и 29 января 2007 г. Помимо этого, при определении специфичности селективных свойств среды использовались штаммы других бактерий - родов: Proteus, Citrobacter, Morganella, Klebsiella, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, Yersinia, Enterococcus, Escherichia, Bordetella, Aeromonas, Hafnia, Listeria, Staphylococcus, Providencia. Они обладали типичными для данных культур биологическими свойствами. Все перечисленные штаммы микроорганизмов получены из музея микроорганизмов НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина» и по своим культуральным и морфологическим свойствам были типичными, а по устойчивости к табельным дезинфицирующим средствам (фенолу 1:70 и 0,1 % хлорамину) соответствовали требованиям, регламентируемым инструкцией 739-68 (Инструкция по определению бактерицидных свойств новых дезинфицирующих средств, утверждена начальником Главного санитарно-эпидемиологического Управления Министерства здравоохранения СССР, М., 1968) и другими инструктивно-методическими указаниями по изучению, отбору новых безопасных средств инактивации бактерий и применению их в практике.

В экспериментах были задействованы 4 группы кроликов, по 3 особей в каждой, породы «Шиншилла» со средним весом 3 кг и один интактный кролик для получения контрольной сыворотки и беспородные белые мыши.

Для бактериологического исследования использовали питательные среды: мясо-пептонный бульон (МПБ) (НПО «Питательные среды», г.Махачкала), мясо-пептонный агар (МПА) (НПО «Питательные среды», г.Махачкала), среды: Симмонса (НИИ питательных сред, г.Махачкала), Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г.Оболенск), Клиглера (НИИ питательных сред, г.Махачкала), Blood agar base (bioMerieux, Франция), Trypcase soy broth

(bioMerieux, Франция), PPLO agar ( Difco, USA), Brain Heart infusion (Difco, USA), Purple Broth base (Difco, USA), Tryptose Blood agar base (Difco, USA), Bacto-Peptone (Difco, USA), DNase Test Agar, w/Toluidine Blue (HiMedia, Индия), Гисса с индикатором Андраде (глюкоза, лактоза, сахароза, манит, арабиноза, дульцит, ксилоза, адонит, инозит, салицин) (НПО «Питательные среды», г.Махачкала), наборы для ускоренного микрообъемного определения уреазы, орнитиндекарбоксилазы, аргининдегидролазы, продукции сероводорода, лизиндекарбоксилазы, ферментации углеводов и спиртов бактериями (сахароза, манноза, арабиноза, глюкоза, лактоза, манит, сорбит, адонит), нитратредуктазы бактерий нетоксичными реактивами, ферментации ацетата натрия, ферментации цитрата натрия (ФГУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, г.Санкт-Петербург), реактив Ковача на индол (ФГУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, г.Санкг-Петербург), реактив на триптофандезаминазу и фенилаланиндезаминазу (ФГУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, г.Санкт-Петербург); гель гидрата окиси алюминия (ГОА) 6 % раствора (при pH 7,2-7,4); раствор 0,1 % алюмокалиевых квасцов и 0,1 % хлористого кальция в виде 10 % раствора с pH 7,2-7,4; полный адьювант Фрейда; очищенный агар фирмы «Difco». Использовали адьювантные препараты: «Декстран Т - 500» и «Конкавалин -А», «Поли-4-винилпиридин» фирмы «Serva».

В работе использовали следующее лабораторное оборудование: весы аналитические, II класс; стандарт мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича 10 ед.; водяная баня; фотоаппарат «Ólimpus-OM4Ti» (Япония); ламинарный шкаф фирмы «Bélico Glass, Inc.»; термостаты ТС-80М-2; микроскопы МБИ-3; лабораторные центрифуги СМ-6М, ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3; фотоколориметр Anthos (Labtec Instruments, США); Nanoe Ducator SCANNING PROBE MICROSCOPE; холодильники бытовые, колбы мерные, пипетки пастеровские, пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 см3 , флаконы емкостью 50, 100 см3 , стекла покровные, стекла предметные, чашки Петри, пробирки, универсальные индикаторные бумаги pH 0-12 (ЬасЬета,Чехия), дезинтегратор фирмы MSE (Англия); холодильник бытовой, весы чашечные с разновесами, сушильный шкаф, машина для изготовления ватных пробок; электронный микроскоп (фирмы Hitachi).

В работе пользовались следующие методики: Метод Фортнера, инструкция по применению реактива Ковача на индол; инструкция по применению набора для ускоренного микрообъемного определения аргининдегидролазы бактерий; инструкция по применению набора для ускоренного микрообъемного определения орнитиндекарбоксилазы бактерий; инструкция по применению реактива на триптофандезаминазу и фенилаланиндезаминазу; инструкция по применению набора для ускоренного микрообъемного определения лизиндекарбоксилазы бактерий; инструкция по применению набора для ускоренного микрообъемного определения уреазы бактерий; инструкция по применению набора №1 для ускоренного микрообъемного определения ферментации углеводов и спиртов бактериями (лактоза, манит, сорбит, адонит); инструкция по применению набора №2 для

микрообъемного определения ферментации углеводов и спиртов бактериями (сахароза, манноза, арабиноза, глюкоза); инструкция по применению набора для ускоренного микрообъемного определения продукции сероводорода бактериями; методика предварительной оценки эффективности экспериментальной вакцины расчетом показателя ИСВ (Шляхов, 1970); методика постановки реакции иммунодиффузии (РИД) по Оухтерлони в модификации Остермана; методика негативного контрастирования 1,5 % фосфорно-вольфрамовой кислотой (ФВК); пробирочный метод постановки реакции агглютинации; метод криогенной дезинтеграции путем разрушения бактериальных клеток, предложенный Грассе; метод Кербера для расчета величины LD50 штаммов О. rhinotracheale, используемого для контрольного заражения; методика по выявлению оптимальной конструкции создаваемой вакцины (Van der Meer, 1977, 1981); определение величины бежа по методу Лоури.

Применение серологических реакций для диагностики инфекционных болезней и идентификации микроорганизмов по Л.Г. Ивановой, К.И. Матвееву, Т.Н. Булатову, (1968). Изучение морфологических, культуральных, биохимических свойств определяли по методам, рекомендованным A.C. Лабинской, Л.П. Блинковой, A.C. Ещиной (2004). Бакгериостатическую и бактерицидную концентрации теотропина определяли методом их серийных разведений согласно «Методическим указаниям по отбору, испытаниям и оценке антивирусных и антибактериальных химиопрепаратов среди соединений различных химических классов», (Москва, 2004), а также «Методическим указаниям по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04».

Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми статистическими методами (Ашмарин, Васильев, Амбросимов, 1974; Урбах, 1975). Расчет результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0. (for Windows; «Stat Soft Ins.», США), Microsoft Excel 2003 (for Windows XP).

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Основные культуральные и биологические свойства референс-штаммов бактерии Ornithobacterium rhinotracheale

Для изучения возможности создания инактивированной вакцины против орнитобактериоза птиц необходимо было изучить биологические свойства этого, малоизвестного в нашей стране, инфекционного агента.

Тинкториапьные свойства бактерий Ornithobacterium rhinotracheale устанавливали путем микроскопии под иммерсионной системой мазка суточной культуры, окрашенной по Грамму. Увеличение светового микроскопа составляло х100><15. Электронную микроскопию проводили методом негативного контрастирования 1,5 % фосфорно-вольфрамовой кислотой (ФВК).

Просматривали препараты на электронном микроскопе HV-12A (фирмы Hitachi) при ускоряющем напряжении 75 кВ и увеличении 35><103. Фиксировали культуру 2 % раствором 0s04. Результаты электронного микроскопирования морфологических свойств О. rhinotracheale представлены на рис 1. При исследовании тинкториальных свойств бактерий Ornithobacterium rhinotracheale установлено, что это небольшие грамм отрицательные палочки с округлыми концами. Споры и капсулы не образуют.

Для изучения культуральной характеристики использовали тесты, которые наиболее полно характеризуют ферментативные свойства бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale: интенсивное синие окрашивание дисков при исследовании на оксидазу (HiMedia) свидетельствует о положительной их реакции; индол и сероводород они не образуют; на среде Симмонса цитрат не утилизируют; фермент ДНК-аза не деполимеризует ДНК. При ферментации углеводов штаммы Ornithobacterium rhinotracheale производят слабое сбраживание лактозы, глюкозы, сахарозы, мальтозы, маннита, маннозы. Установлено, что при взаимодействии с аргининдекарбоксилазой, лизиндекарбоксилазой, арабинозой, лизином, аргинином, уреазой, адонитом, сорбитом - реакция отрицательная.

Рисунок 1 - Морфологические свойства О rhinotracheale К 282 (увеличение З5><103)

Определение тинкториальных и фенотипических факторов на гемолитическую активность проводили на триптозо-соевом агаре ^¡й«)) с добавлением 10 % овечьей и человеческой дефибринированной крови. Для чего культуру предварительно культивировали в течение 48ч при 37 С на бульоне Хоттингера. При изучении гемолитической активности не зависимо от вида донора, чья кровь была использована, зона разрушения эритроцитов не обнаружена.

3.2 Проведение сравнительного анализа ростовых характеристик бактерий вида Orniihobacterium rhinotracheale на различных питательных

средах

Следующей целью исследований было проведение сравнительного анализа ростовых характеристик орнитобактерий на различных средах, предлагаемых для оптимального культивирования чистой культуры, что обусловлено необходимостью получения больших объёмов бактериальной массы для цели наших исследований. Из плотных питательных сред активный рост предоставлял кровяной агар, содержащий 5-10% дефибринированной овечьей крови, его основу могут составлять Blood agar base (bioMerieux, Франция), Purple Broth base (Difco, USA), Tryptose Blood agar base (Difco, USA). Инкубировали на агаре в чашках Петри при 37 °С в течении 48-72 часов.

Так же микроорганизмы растут на триптозо-соевом агаре фирм: (bio Merieux, Франция), Tryptose agar base (Difco, USA), на PPLO агаре (Difco, USA). Из жидких питательных сред оптимум роста предоставляют бульон Хотгингера, сердечно-мозговой экстракт и пептонная вода различных фирм-производителей.

В наших экспериментах по определению оптимальной среды культивирования установлено, что бактерии вида Orniihobacterium rhinotracheale не растут на агаре Мак Конки, Дригальского, Эндо, Симмонса.

В качестве рабочего материала использовали 48 часовую культуру, культивированную на бульоне Хотгингера. В 10 пробирках со стерильным 0,85% физиологическим раствором в объеме 9 мл производили раститровывание по 1 мл культуры с получением последующих разведений:

1*ю-1,1*10-2,1*10-3,1*10'4,1*10-5,1*1оЛ i*io-7, 1*ю-Ч*ю-9, то-10.

После раститровывания производили посев по 1 мл из каждой пробирки на 10% кровяной агар и PPLO агар по 3 чашки на каждое разведении. Инкубировали 48 часов при 37° С.

Установлено, что показатели КОЕ на кровяном агаре более высокие. Это указывает на возможность его использования для наращивания бактериальной массы для дальнейших исследований. Оптимальное время культивирования микроорганизма на одной из выбранных нами питательных средах - 48 часов, что можно видеть на диаграмме (рис. 2).

сутки

Рисунок 2 - Характеристика роста референс-штамма ОгпикоЬас1егшт гЫпо1гасИеа1е К 33 на обогащенной питательной среде (РРЬО агаре)

Предыдущие опыты демонстрируют, что наиболее интенсивный рост бактерий изучаемой культуры идёт на обогащенных средах РРЬО-агаре и кровяном агаре. Данные среды для наработки бактериальной массы достаточно дороги и экономически невыгодны. Проанализировав результаты своих экспериментов и литературные данные, пришли к выводу, что в качестве азотно-витаминной основы конструируемой среды нужно использовать дрожжевой экстракт, пептон, в качестве источника углерода — глюкозу. Было исследовано четыре образца. Опыт проводился по следующей схеме. Суспензионная бактериальная культура ОгтЛоЬас(егтт гЫпо1гаскеа1е 1 млрд. бактериальных клеток титровали 1:10. Брали пробирку с суспензионным разведением ОгпкИоЬаМегтт гЫпо1гасИеа1е в 100 бактериальных клеток в 1 мл и производили посев на испытуемые прототипы накопительных сред. Посев производили стерильными пастеровскими пипетками, трехкратно в три чашки Петри на плотной среде.

Конструирование основы для накопительной среды: №1 - дрожжевой экстракт-1,0 г; пептон 5,0г; глюкоза-2,0 г, №2 - дрожжевой экстракт-2,0 г; пептон 5,0г; глюкоза-2,5 г, №3 - дрожжевой экстракт-3,0 г; пептон 5,0г; глюкоза-3,0 г, №4 - дрожжевой экстракт-4,0 г; пептон 5,0г; глюкоза -3,5 г. Хорошей минеральной базой оптимального состава для бактерий вида ОгтЛоЬааегшт гЫпоКасИеаЫ является набор солей фосфата калия двузамещенного (2,0 г) и семиводного сульфата магния (5,0 г). Соли калия, магния и фосфора стимулируют синтез микробной клетки бактерий вида ОгпИИоЬас1егшт гИто1гаскеа1е, а для образования бактериальных белков необходимы анионы, содержащие серу. Таким образом, данный набор солей целесообразно включить в накопительную среду в применяемых дозах.

Контроль осуществляли на МПА. Чашки Петри культивировали при 37°С 48 часа. Затем производили подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ). Результаты испытаний приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Показатель колониеобразующих единиц на основах

накопительных сред

Основ ы накоп игель пых сред Колониеобразующие единицы (КОЕ)

Чашки Петри

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

№1 51 33 38

С э41 КОЕ

№2 54 45 50

С р 49 КОЕ

№3 62 66 60

Ср 62 КОЕ

№4 65 65 62

Ср 64 КОЕ

Из результатов испытаний следует, что образец №4 имеет лучшие показатели по КОЕ. Таким образом, питательной основой конструируемой среды будет дрожжевой экстракт, пептон, глюкоза.

В результате вышеизложенных исследований, сконструированная нами накопительная среда для бактерий ОгпНЪоЪасгегтт гМпоШсИеак имеет следующий состав: мясопептонный агар - 1000 мл, дрожжевой экстракт - 4,0 г, пептон - 5,0 г, глюкоза - 3,5 г, К2НР04 - 2,0 г, М§504 - 5,0 г. ^

Способ приготовления: в 1000 мл стерильного и охлажденного до 45 С мясопептонного агара добавляли дрожжевой экстракт и пептон. Затем вносили калий фосфорнокислый двузамещенный, магния сульфат и глюкозу. Кипятили 2-3 минуты, при постоянном помешивании. После этого горячую среду фильтровали через ватно-марлевый фильтр. Стерилизовали при 100 С 20 минут.

3.3 Расчет оптимального времени культнвирования бактерий вида ОгпШоЪскЛет'шт гЬшо(гасИеа1е на среде накопления

Опыты проводили по следующей схеме. Суспензионная бактериальная культура ОгпШоЪааепит гЫпо^асИеак 1 млрд. бактериальных клеток подвергалась титрованию 1:10. В результате титрования получали ряд пробирок с бактериальной суспензией ОгпШюЬаМегтт гЫпо1гасИеа1е на физиологическом растворе. В накопительную среду 5 мл в пробирке, внесли 1 мл бактериальной суспензии ОтШюЬа^егшт гЫпоКасИеа1е на физиологическом растворе в объеме 10 клеток в 1 мл. Культивировали при 37 С, отбор проб для подсчета КОЕ проводили через 18, 24, 36, 48, 60, 72 часов.

Бактериальную суспензию 1 мл брали из пробирки со средой накопления, разбавляли в 9 мл физиологического раствора, затем производили посев по 1 мл бактериальной суспензии на физиологическом растворе в 10 чашек Петри с МП А. Производили подсчет КОЕ в 10 чашках, начиная с 18 часов культивирования с интервалом 12 часов в течение 3 суток. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Показатель КОЕ в различные временные периоды культивирования_

№ Штаммы ОгпиИоЬас1егшт гЫпо1гасИеа1е КОЕ

18ч 24 ч 36 ч 48 ч 60 ч 72 ч

1 К 33 19 150 276 392 396 399

2 К 282 41 101 231 389 389 382

Примечание: приведены общее количество КОЕ по 10 чашкам Петри.

Полученные результаты указывают, что резкое увеличение количества КОЕ наблюдается к 48 часам. Как вывод - оптимальное время культивирования бактерий вида ОгпИ1юЪас1ег'шт гЫпо1гасЬеа\г на накопительной среде составляет 48 часов.

3.4 Изучение бактерицидного и бактериостатического действия теотропина

Результаты исследований свидетельствуют, что дозы изучаемого препарата в 5,0 и 7,5 мг/мл обладали бактериостатическим, но не бактерицидным действием. Бактериостатическое действие препарата проверяли методом контрольного высева бактериальных культур взаимодействующих с изучаемым препаратом в различные промежутки времени от 1 до 5 часов без освобождения их от буферного раствора, содержащего препарат. Бактерицидную активность теотропина определяли методом контрольного высева бактериальной суспензии, но после освобождения её от буферного раствора, содержащего препарат. Центрифугированием осаждали бактериальные клетки, надосадок с теотропином удаляли, осадок ресуспендировали в свободном от препарата физиологическом растворе и опять центрифугировали. Данную процедуру повторяли двукратно. После последнего ресуспендирования и часовой экспозиции раствора с бактериями высевали на твёрдые питательные среды. В результате проведённых исследований установлено, что препарат теотропин в дозе 5 мг/мл при концентрации бактерий в Ю10 м.т. после пяти часовой экспозиции обладает бактериостатическим действием по отношению к бактериальной культуре указанных видов микроорганизмов. Доза препарата в 7,5 мг/мл является бактериостатической при трех часовой экспозиции. Доза в 10 мг/мл после восемнадцати часовой экспозиции с бактериальной культурой концентрацией Ю10 микробных тел является бактерицидным для данного вида бактерий и

возможна как инактиватор для производства инактивированных вакцин из бактериальной массы ОгпИИоЬас1егшт гЫпоКасИеак.

3.5 Принципиальная технологическая схема изготовления инакгивированной вакцинного препарата из бактерий ОгпМоЬас(егшт гЫпо(гасИеа1е и проверка его антигенной эффективности

Для изготовления инактивированной вакцины были выбраны в качестве адъювантов два отечественных адъюванта - гидрат окиси алюминия и алюмокалиевые квасцы, а так же полный адъюванта Фрейда (ТЖсо). Технология их изготовления была проведена по общепринятым методикам.

Исследование образца включал следующие этапы: после инактивации тешропином бактериальной суспензии концентрацией Ю10 м. т. в емкость добавляли гель гидрата окиси алюминия (ГОА) 6% раствора (при рН 7,2-7,4) до концентрации 20 - 30 % к объему. Далее проводили сорбцию в течение 10-12 часов при комнатной температуре при периодическом перемешивании, затем фасовали в стерильные флаконы по 10 мл, укупоривали стерильными резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками.

Во вторую часть инактивированной бактериальной суспензии добавляли 0,1 % алюмокалиевых квасцов и 0,1 % хлористого кальция в виде 10 % раствора с рН 7,2-7,4 и проводили сорбцию в течение 10-12 часов при комнатной температуре при периодическом перемешивании, а затем также фасовали.

В третью часть инактивированной бактериальной суспензии добавляли полный адъювант Фрейда до 20 % к объему, ресуспендировали с помощью шприца, выдерживали в течение 1-2 часов при комнатной температуре при периодическом перемешивании и фасовали во флаконы.

В опыте были задействованы 4 группы кроликов, по 3 особей в каждой, породы «Шиншилла» со средним весом 3 кг и один интактный кролик для получения контрольной сыворотки. Первой группе кроликов вводили антиген без адъювантов (1), второй - второй антигенный препарат (2), третьей - третий антигенный препарат (3), четвертой - первый антигенный препарат с адъювантом Фрейда (4).

Схема иммунизации кроликов.

Антигенные препараты вводили внутримышечно кроликам через каждые 3 дня по 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 и 1,5 мл. Искомые сыворотки контролировали на 10, 15 и 20 дни. Получали сыворотки на 26 день гипериммунизации. Для выяснения антигенного действия применяемых суспензий определяли динамику образования агглютининов в ответ на гипериммунизации кроликов с помощью пробирочного метода РА. Через 18 часов инкубации в термостате при 37 0 С учитывали реакцию агглютинации невооруженным глазом по степени прозрачности. Установили, что титр антител, регистрируемых в РА, имеет значительную разницу при гипериммунизации различными антигенными препаратами.

Установлено, что максимальная величина титра антител наблюдается в ответ на введение антигена с адьювантом Фрейда и равна к 10 дню гипериммунизации 1:80. К 20 дню титр антител вырос до 1:320 и оставался самым высоким. Дальнейшее изучение антигенных свойств у полученных препаратов было направлено на выяснение их антигенного состава с целью выбора лучшего препарата. Для этого нами была использована реакция диффузионной преципитации (РДП). В настоящее время разработано несколько методов постановки РДП. Мы для своих исследований использовали реакцию иммунодиффузии (РИД) по Оухтерлони в модификации Остермана. Данную реакцию проводили в агаровом геле на предметных стеклах. Гелевую среду готовили из очищенного агара фирмы «Э^со».

Результаты свидетельствуют, что при использовании указанных адъювантов эффективность антигенной активности выявленной данным методом незначительна. В образце, где в качестве антигена выступал вакцинный препарат с адьювантом Фрейда, количество линий преципитации ограничилось двумя. Последующие образцы показали ещё более слабую антигенную активность конструированных вакцинных препаратов.

В связи с полученными результатами, нами были проведены дополнительные эксперименты с целью улучшения антигенные свойства вакцинного препарата. Для этого было необходимо использовать в качестве протек-гивного антигена не только поверхностные антигенные детерминантные структуры, но и внутриклеточные антигенные комплексы.

3.6 Разработка методов дезинтеграции бактериальной клетки ОгпНИоЬаЫепит гЫпоНаскеак

Выше сформулированная задача заключалась в получении разрушенной суспензии бактериальной клетки ОтИкоЪааегтт гЫпо1гасИва1е. Необходимость в этом была обусловлена изучением возможности использования в качестве вакцинного препарата дезинтеграта разрушенной бактерии, учитывая, что в данном препарате в качестве протективного антигена будут использованы антигенные детерминанты не только поверхностных, но и внутренних клеточных структур - рибосом, клеточных мембран, цитоплазматической фракции. Согласно литературным данным наиболее оптимальным вариантом для решения поставленной задачи явилось бы применение криогенного метода дезинтеграции, позволяющего получить клеточные компоненты при минимальной потере их биологических свойств. Одним из методов криогенной дезинтеграции является способ разрушения бактериальных клеток, предложенный Грассе.

Проведённая нами проверка данного способа с целью применения его для целей исследований показала, что 24 кратное замораживание и оттаивание бактериальной культуры ОгпИЬоЪаШпит гЫпоШскесЛе не обеспечивает высокого процента разрушения бактериальных клеток. Увеличение числа манипуляций по замораживанию-оттаиванию не принесло значительного увеличения процента разрушенных клеток. Результаты титрования исходной

бактериальной суспензии и полученного разрушенного препарата свидетельствовали, что показатель дезинтеграции был по-прежнему низок (до 10-15 %) и не мог отвечать требованиям, необходимых для проведения исследований.

Поэтому возникла необходимость перейти к другому способу дезинтеграции, который бы позволил получить больший процент разрушенных клеток. Одним из таких способов явилась дезинтеграция бактерий с помощью ультразвука. Режимы УЗ-дезинтеграции бактерий вида ОгпНИоЬааегшт гЫпоШскеаЫ подбирали в экспериментах. В 14 проведённых опытах, варьируя показатели концентрации бактериальной суспензии, время воздействия, амплитуду зонда, способы охлаждения суспензии, был определён оптимальный режим разрушения бактериальной клетки, заключающийся в следующем: бактериальную суспензию концентрацией 10,0 млрд. м. к. в 1 мл дистиллированной воды с рН - 7,2, подвергали ультразвуковой обработке на дезинтеграторе фирмы МБЕ (Англия) с амплитудой зонда - 6 мк, временем обработки - 10 мин, объём суспензии - 18-20 мл. В качестве охлаждающей смеси стакана дезинтегратора использовали смесь спирта со льдом. Эффективность разрушения бактериальных клеток оценивали по данным световой микроскопии, а также данным подсчёта жизнеспособных клеток в исходной и разрушительной клеточной суспензии, путём титрования и высева их на питательные среды - МПА.

В проведённых экспериментах при вышеуказанных режимах дезинтеграции показатель величины разрушения бактериальной клетки доходил до 90 %.

3.7 Изучение иммуногенных свойств разрушенной бактериальной клетки вида ОгпШоЬас1егшт гЫпо(гасИеа1е

Полученный дезинтеграт бактериальной клетки был изучен в иммунологических опытах на животных, с целью выбора из экспериментальных групп препарата обладающего наиболее выраженными протективными свойствами.

Для проведения экспериментов по созданию вакцины необходимо было рассчитать величины ЬО50 штамма ОгпНкоЪас1епит гЫпоП-асЪеа1е, используемого для контрольного заражения. Опыт провели на 72 мышах, полученные данные обсчитывали по методу Кербера и установили, что при внутрибрюшинном заражении 1Л}50 составил 2,3 млн. м.к. в мл, при подкожном - 6,8 млн. м.к. в мл. После этого приступили к опытам по иммунизации.

Результаты проведённых экспериментов, позволили сделать однозначный вывод, что дезинтеграционные структуры бактериальных клеток орнитобактерий обладают протективными свойствами, но величина их активности различна. Один из опытов представлен в таблице 3.

Таблица 3 - Протективная активность изучаемых препаратов при п/к иммунизации на белых мышах при подкожном контроль заражении гомологичным штаммом дозой 4 ЬР 50._

№ п/п Иммунизирующий препарат Доза (мг белка) Количество животных Результат (выжило)

1 Не инактивированный дезинтеграт 1,25 12 10

2 Дезинтеграт инактивированный теотропином 0,7 25 12

3 Целые клетки инактивированные Т-100С 2,8 11 5

4 Целые клетки инакгивированные теотропином 2,8 11 4

5 Живая культура 20 млн.м.т. 20 1

Полученные в серии экспериментов данные указывают, что не инактивированный теотропином дезинтеграт обладает более высокими протективными свойствами, чем дезинтеграт инактивированный теотропином. Возможно, это объясняется тем, что препараты из не инактивированного дезинтеграта содержат живые бактерии, что повышает его протективные свойства. Препараты из целых, инактивированных различными способами бактериальных клеток вида Ornithobacterium rhinotracheale, обладают меньшими протективными свойствами. Суммарные показатели экспериментов по конструированию вакцины из обработанного теотропином дезинтеграта свидетельствует, что из 56 белых мышей иммунизированных дезинтегратом, после контрольного заражения выжило 31, т.е. более 50 %. У препарата с целыми инактивированными клетками данное соотношение значительно хуже -27:11.

3.8 Конструирование вакцинного препарата

Результаты выше описанных опытов дали положительный ответ на вопрос о наличии протективных свойств у изучаемых препаратов. Поэтому в дальнейших исследованиях задача была расширена. В экспериментах применяли различные комбинирования клеточных структур с новыми адьювантными иммуностимулирующими веществами (табл. 4), так как уже использованные ранее адъюванты не показали достаточного эффекта. Это было необходимым для поиска оптимальной конструкции возможного вакцинного препарата.

Интересные данные ожидали получить при использовании таких веществ как «Декстран Т-500», «ПВП» и «Конкавалин - А». Схема опыта была поставлена по методике, предложенной голландской группой C.V.Der Meer (1977, 1980). Указанные препараты использовались в расчёте 50 мг на 1 кг

живого веса. Результаты проведённого опыта указывают (табл. 4), что иммунная эффективность данной конструкции практически равна нулю.

Таблица 4 - Протективная активность препаратов из различных комбинаций изучаемых препаратов при в/б иммунизации белых мышей

№ п/п

Иммунизирующий препарат

Инактивировапный дезикгеграт + ДТ - 500

Икакгивированный

дезинтегрзт + КОН - А

Инакгивированный дезинтеграт

Инактивированный дезшггеграт + ПВП

Буферный раствор

Доза (мг белка)

ОД

0,5

Количество животных

Доза контрольного заражения Ш 5о

Результат (выжило)

Во всех иммунологических опытах хорошие результаты продемонстрировал препарат, состоящий из дезинтеграта бактериальной клетки, инактивированного теотропином. Данное сочетание в схемах иммунизации свидетельствовало, что конструкция данной вакцины обладает достаточными протективными свойствами, создавая защиту у животных против контрольного заражения дозой 10 ЬО50 практически у половины иммунизированных животных.

3.9 Проверка создаваемого биопрепарата его на безвредность

Особым вопросом при создании вакцинного препарата является его реактогенность. Как правило, вакцина считается мало реактогенна, если реакция на её введение вызывает повышение температуры тела на 1-1,5 С в течение 1-2 дня. Средняя реактогенность препарата считается при повышении температуры до 1,8- 2,0 0 С на тот же срок.

Выбранную нами в предыдущих экспериментах питательную среду для культивирования ОгпИкоЪас1гпит гЫпо1гаскеак мы использовали для наработки бактериальной массы в режимах указанных выше. После культивирования смывали физиологическим раствором и центрифугировали в режиме 3000 оборотов в минуту на центрифуге СМ6М. Надосадок удаляли, осадок ресуспендировали в физиологическом растворе и повторяли центрифугирование в аналогичном режиме. Полученную концентрацию бактерий по стандарту мутности с последующим титрованием доводили до величины Ю10 микроорганизмов в 1 мл суспензии. Далее для проверки безвредности биопрепарата провели исследования на кроликах. Для этого бактериальную суспензию, инактивированную теотропином, в указанной концентрации, раствор теотропина в исходной концентрации и, для контроля,

физиологический раствор вводили внутрикожно кроликам, выщипав предварительно участок кожного покрова от шерсти, в объёме 0,1 мл, определяя тем самым показатели дермонекротической реакции. Результаты анализировали в течение 7 дней.

По нашим данным, введение раствора теотропина и физиологического раствора не вызвало продолжительной дермонекротической реакции. Поверхность кожного покрова была неизменной, как и перед экспериментом.

Третий - же препарат инактивированная суспензия бактерий ОгпШоЪааег'шт гЫпоКасИеак вызвала покраснение участка кожи на месте введения, припухлость и локальное незначительное повышение температуры, что характерно для воспалительного процесса. Наблюдение в течение 7 дней показало, что данные изменения к началу 4 дня прекратились. Явления некроза кожи не наблюдалось, при пальпации припухлость не прощупывалась, однако гиперемия наблюдалась все 7 дней. При внутримышечном введении дезинтеграта с теотропином в исследуемой дозе отмечалось повышение температуры тела животных в среднем на 1,5 0 С. Установлено, что пирогенное действие изучаемого препарата было кратковременным: к концу двух суток температура тела у подопытных животных понизилась до нормы. Гиперемия кожного покрова продолжалась в течение четырех дней и к началу пятого дня прекратилась. Полученные результаты свидетельствуют, что экспериментальные вакцинные биопрепараты ОгпШюЬасгегшт гИто1гасИеа!е не обладают дермонекротической реакцией, ареактогенны и безвредны для макроорганизма в указанных дозах.

выводы

1. Охарактеризованы основные биологические свойства бактерий О. гЫпо1гаскеа!е (по данным электронной микроскопии - это короткие палочки с округлыми концами, спор и капсул не образуют; установлено отсутствие способности образовывать индол, сероводород и утилизировать цитрат; гемолитическая активность не выявлена; при взаимодействии с лактозой, сахарозой, глюкозой, маннозой, маннитом, оксидазой - реакция положительная, при взаимодействии с аргининдекарбоксилазой, лизиндекарбоксилазой, арабинозой, лизином, аргинином, уреазой, адонитом, сорбитом - реакция отрицательная).

2. Разработана питательная среда для наработки бактериальной массы О. гЫпо1гасИеа1е с целью получения инактивированного антигена: мясопептонный агар - 1000 мл; дрожжевой экстракт - 4,0 г; пептон - 5,0 г; глюкоза - 3,5 г; К2НР04 - 2,0 г; Ме504 - 5,0 г.

3. Определена бактерицидная доза препарата теотропина в 10 мг/мл после восемнадцати часовой экспозиции с бактериальной культурой ОгпПкоЬа^епит гЫпо1гаскеа1е с концентрацией Ю10 микробных тел

4. Исследована возможность создания вакцинного препарата против орнитобактериоза при сочетании ультразвукового дезинтеграта бактерий и теотропина. Установлено, что дезинтеграционные структуры бактериальных клеток орнитобактерий обладают протективными свойствами, но величина их активности различна.

5. Экспериментальные биопрепараты из бактерий ОгпМоЬас1егтт гЫпо1гас\\еа\е не обладают дермонекротической реакцией, ареактогенены и безвредны для макроорганизма, что дает возможность сконструировать ареактогенный вакцинный препарат.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для наработки максимально возможного количества бактериальной массы О. гЫпоШсЪеак рекомендуем использовать сконструированную нами накопительную питательную среду.

2. Разработанную схему создания протективного антигена О. гЫпотсИеак рекомендуем использовать при изготовлении инакгивированной вакцины против орнитобактериоза.

3. Материалы научных исследований, полученные в рамках диссертационных исследований, используются в учебном процессе студентов на факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Курьянова Н.Х. Орнитобактериоза - заболевание птицы / A.C. Разорвина, Н.Х.Курьянова, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев // Материалы Международной научно-практической конференции. Технологический институт (филиал) ГОУ ВПО «УГСХА» - Димитровград, 2008.

2. Курьянова Н.Х. Тинкториальные и биологические свойства Ornithobacterium rhinotracheale, используемые для идентификации / Н.Х Курьянова, A.C. Разорвина, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев // Материалы Международной научно-практической конференции на тему Актуальные вопросы аграрной науки и образования, посвященной 65-летию УГСХА, эпизоотологии, ВСЭ, биотехнологии - Ульяновск, 2008.

3. Курьянова Н.Х. Проблемы биологической диагностики орнитобактериоза / Н.Х. Курьянова, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев // Научный вестник - Димитровград, 2009.

4. Курьянова Н.Х. Дезинфектология и ее проблемы // Наука в современных условиях: от идеи до внедрения: материалы международной научно-практической конференции - Димитровград, 2009.

5. Курьянова Н.Х. Характеристика теотропина как дезинфицирующего средства / Н.Х. Курьянова Н.Х., H.A. Феоктистова, Д.А. Васильев II Материалы Международной научно-практической конференции «Аграрная и пути их решения» - Ульяновск, 2009.

6. Курьянова Н.Х. Воздействие теотропина на бактерии видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis / Н.Х. Курьянова, А.И. Калдыркаев, А.Х. Мустафин, H.A. Феоктистова, Д.А. Васильев // Материалы Международной научно-практической конференции «Аграрная и пути их решения» - Ульяновск, 2009.

7. Курьянова Н.Х. Безопасный дезинфектант нового поколения -препарат «Теотропин» // Наука в современных условиях: от идеи до внедрения: материалы международной научно-практической конференции - Димитровград, 2010.

8. Курьянова Н.Х. Воздействие теотропина на бактерии видов и родов Esherihia coli, Staphilococcus aureus, Salmonella I Н.Х. Курьянова, H.A. Феоктистова, Д.А. Васильев // Наука в современных условиях: от идеи до внедрения: материалы международной научно-практической конференции -Димитровград, 2010.

9. Курьянова Н.Х. Изучение бактерицидного и бактериостатистического действия теотропина // Наука в современных условиях: от идеи до внедрения: материалы международной научно-практической конференции - Димитровград, 2011.

Ю.Курьянова Н.Х. Изучение бактерицидного и бактериостатического действия теотропина на микрооганизмы различной морфологической структуры / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, И.Н. Хайруллин, H.A. Феоктистова, Н.Х. Курьянова // Вестник УГСХА. - № 1. - С.75-79.

КУРЬЯНОВА НАЗИЯ ХУСАИНОВИА

РАЗРАБОТКА БИОТЕХПОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПО ПОЛУЧЕНИЮ ПРОТЕКТИВНОГО IfflAKTHBIIPOBAHHOrO АНТИГЕНА ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук 03.01.06 - биотехнологи» (в том числе бионанотсхнологии)

Подписано в печать 7.09.2012. Формат 60x90/16. Бумага писчад. Усл.печ.л. 1,31. Уч.-изд.л. 1,43. Тираж 100 экз. Заказ №72.

ДИТИ НИЯУ МИФИ, РИО, 433510, Диметровграа, ул. Куйбышева, 294

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Курьянова, Назия Хусаиновна

Список условных сокращений.

Введение.

I Обзор литературы.

1.1 Биологические свойства бактерий ОтШоЪаЫегшт гЫпоЬгаскеаЫ — возбудителей орнитобактериоза птиц.

1.1.1 Морфология, тинкториальные и биохимические свойства ОтШюЬаЫегшт гЫпо1гаскеа1е.

1.1.2 Резервуар и распространение инфекции.

1.1.3 Устойчивость бактерий ОгпШюЪаМегшт гЫпоЬ'аскесйе к инактивирующим веществам.

1.2. Характеристика и практическое применение теотропина для инактивации бактерий.

1.3 Представления о строении поверхностных структур бактериальных клеток.

1.3.1 Строение клеточной стенки бактерий.

1.3.2 Строение цитоплазматической мембраны.

1.4 Дезинтеграция бактерий.

1.5 Основы взаимодействия дезинфектантов с бактериями.

II Собственные исследования.

2.1 Материалы и методы.

2.2. Результаты собственных исследований.

2.2.1 Основные культуральные и биологические свойства референс-штаммов бактерии ОгпШюЪаМепит гЫпо^аскеа1е.

2.2.1.1 Тинкториальные свойства бактерий ОтикоЪасгепит гМпои-аскеак.

2.2.1.2 Культуральные свойства бактерий ОтШюЬаМегшт гЫпо1гаскеа1е.

2.2.1.3 Проведение сравнительного анализа ростовых характеристик бактерий ОгпИкоЪасЬепит гЫпоЬ'аскесйе на различных питательных средах.

2.2.2 Определение показателей КОЕ бактерий ОтіїИоЬасіегіит гШпоії'асІїеаІе для выявления оптимальной накопительной среды для наработки бактериальной массы.

2.2.2.1 Конструирование среды накопления для наработки бактериальной массы ОтіікоЬасіегіит гкіпои'аскеаіе.

2.2.2.2 Расчет оптимального времени культивирования бактерий ОтіїкоЬасіегіит гкіпоігаскеаіе на среде накопления.

2.2.3 Изучение бактерицидного и бактериостатического действия теотропина.

2.2.3.1 Изучение бактерицидного и бактериостатического действия теотропина на микроорганизмы различной морфологической структуры.

2.2.3.2 Изучение бактерицидного и бактериостатического действия теотропина на бактерии ОгпШюЬаіїегіит гШпоігаскеаІе.

2.2.4 Принципиальная технологическая схема изготовления инактивированной вакцинного препарата из бактерии ОгпіїУіоЬасІеНит гкіпоігаскеаіе и проверка его антигенной эффективности.

2.2.4.1 Подбор адьюванта.

2.2.4.2 Разработка методов дезинтеграции бактериальной клетки ОтШгоЬасІегіит гкіпоігаскеаіе.

2.2.4.3 Изучение иммуногенных свойств разрушенной бактериальной клетки От'йНоЬаМеНит гкіпоїгасЬеаІе.

2.2.4.4 Конструирование вакцинного препарата.

2.2.4.5 Проверка создаваемого биопрепарата его на безвредность.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биотехнологических параметров по получению протективного, инактивированного антигена Ornithobacterium rhinotracheale"

В последней трети XX века, несмотря на определенные успехи в борьбе с инфекционными болезнями, значение инфекционной патологии, как одного из основных критериев здоровья, признано всем мировым сообществом.

Мировой опыт борьбы с болезнями животных показал, что в системе мероприятий обеспечения здоровья всех видов животных специфическая профилактика занимает важное место. Это связано с тем, что активная иммунизация является наиболее эффективным средством предотвращения многих болезней вирусной и бактериальной этиологии {Шандала, 2003; Костюкова, Ляпин, Малюкова, 2005; Пантелеева, 2002).

С начала девяностых годов двадцатого века во многих странах мира были зарегистрированы вспышки заболевания респираторного тракта кур и индеек, вызванных Omithobacteriwn rhinotracheale. Отмечалось увеличение смертности и снижение продуктивности у бройлеров приблизительно с двадцативосьми дневного возраста и длилось до конца периода откорма {Van Beek et al., 1994; De Rosa, 1996). Omithobacteriwn rhinotracheale выделен во многих странах мира и инкриминирован, как возможный, дополнительный, причинно-обусловленный агент в комплексе респираторных болезней {Van Veen et al., 2000; Sakai et al., 2000).

Следует отметить, что, не смотря на то, что за последние годы в России расширился ассортимент разрешенных к применению средств воздействия на микроорганизмы и вирусы: в период 2001-2005 гг. в РФ зарегистрировано более 100 инактиваторов {Шандала, 2006, 2007), арсенал экологически безопасных препаратов, разлагающихся в природных условиях до продуктов, не загрязняющих окружающую среду, ограничен {Саврилов, 2004; Пантелеева, 2005, 2006). Поэтому изучение антибактериальных и антивирусных свойств соединений различных классов, с целью разработки новых нетоксичных, высокоэффективных, экологически безопасных антимикробных препаратов, используемых в качестве бактерицидов для создания инактивированных вакцин, представляет собой весьма актуальную задачу для науки и практики {Высоцкий, 2005; Аржаков, Ермакович, Аржаков, 2004). Безопасные инактивированные вакцины - это компромисс в настоящее время в создании вакцинных препаратов.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является разработка биотехнологических параметров создания инактивированной вакцины против орнитобактериоза.

Поставленная цель решалась следующими задачами:

1. Изучить основные биологические свойства бактерий О. гЫпои-аскеа1е.

2. Выбрать оптимальную питательную среду накопления для культивирования бактерий О. гЫпоЬ'аскеа1е.

3. Разработать схему использования теотропина в качестве инактиватора бактерий О. гЫпои'аскеа1е.

4. Изучить возможность создания вакцинного препарата против орнитобактериоза.

5. Изучить безвредность, аректогенность созданного вакцинного препарата.

Научная новизна. Опираясь на биологические свойства бактерий вида О. гМпо1гасЪеа1е, подобрана питательная среда и параметры культивирования для наработки максимально возможного количества бактериальной массы данного микроорганизма. Разработаны схемы инактивации бактерий различных морфологических форм с помощью препарата теотропина. На основании полученных данных предложена схема инактивации теотропином бактерий О. гЫпо1гаскеа1е с целью создания инактивированного вакцинного препарата. В результате экспериментов доказана сложность в конструировании вакцины против орнитобактериоза с использованием адыовантов и предложена схема создания инактивированной орнитобактериозной вакцины, основанной на новых биотехнологических методах, в частности, ультразвуковой дезинтеграции и инактиватора теотропина.

Практическая значимость. Предложена схема инактивации бактерий с помощью препарата теотропина. Разработано «Временное наставление по применению теотропина для профилактики и лечения инфекционных болезней птиц», рассмотренное на научно-техническом совете и утвержденное первым проректором - проректором по научной работе ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» (15.05.2012). Полученные данные позволяют утверждать, что указанный препарат можно использовать в качестве инактиванта для производства инактивированных вакцин.

Разработаны параметры ультразвуковой дезинтеграции бактерий ОтШгоЬаМегтт гЫпои-аскеа1е, позволяющие получать протективный антиген для изготовления вакцин.

Доказана возможность создания вакцинного препарата для профилактики орнитобактериоза на основе дезинтеграта бактериальной массы указанных бактерий и инактиванта теотропина.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Путем микроскопии под иммерсионной системой мазка суточной культуры, окрашенной по Грамму, установлены тинкториальные свойства бактерий ОтШюЬаМегшт гЫпо(гаскеа1е - это небольшие грамотрицательные палочки с круглыми концами, спор и капсул не образуют. Установлены ферментативные свойства, отсутствие способности образовывать индол, сероводород и утилизировать цитрат; не зависимо от вида донора гемолитическая активность (разрушения эритроцитов) не выявлена.

2. Опыты демонстрируют, что наиболее интенсивный рост бактерий изучаемой культуры идёт на обогащенных средах: РРЬО-агаре и кровяном агаре. Данные среды для наработки бактериальной массы достаточно дороги и экономически невыгодны. По результатам экспериментов, пришли к выводу, что в качестве азотно-витаминной основы для конструируемой среды нужно использовать дрожжевой экстракт, пептон, в качестве источника углерода - глюкозу. По результатам опытов сконструирована оптимальная питательная среда накопления для культивирования бактерий О. гЫпои'аскеа1е

3. Результаты исследований свидетельствуют, что из использованных доз (5,0; 7,5 и 10 мг/мл) изучаемого препарата теотропина, дозы 5,0 и 7,5 мг/мл обладают бактериостатическим, но не бактерицидным действием, а доза 10 мг/мл, после 18 часовой экспозиции с бактериальной культурой концентрацией Ю10 микробных тел, является бактерицидной для всех изучаемых микроорганизмов и может быть использована в качестве инактиванта бактерий О. гЫпоиъскеаЫ для производства инактивированных вакцин.

4. Эксперименты позволили сделать однозначный вывод, что дезинтеграционные структуры бактериальных клеток орнитобактерий, инактивированные теотропином, обладают протективными свойствами, но величина их активности различна. Полученные данные убеждают, что дезинтеграт с дозой иммунизации по белку в 2,4 и 2,8 мг обладает более высокими протективными свойствами, чем дезинтеграт с меньшими дозами инъекций.

5. Экспериментальные биопрепараты из бактерий ОтНЬоЬаЫепит гЫпо1гаскеа1е не обладают дермонекротической реакцией, ареактогенены и безвредны для макроорганизма, что дает возможность сконструировать ареактогенный инактивированный вакцинный препарат.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А. Столыпина»

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Курьянова, Назия Хусаиновна

выводы

1. Охарактеризованы основные биологические свойства бактерий О. гЫпои-аскеа1е (по данным микроскопии - это короткие палочки с округлыми концами, спор и капсул не образуют; установлено отсутствие способности образовывать индол, сероводород и утилизировать цитрат; гемолитическая активность не выявлена; при взаимодействии с лактозой, сахарозой, глюкозой, маннозой, маннитом, оксидазой - реакция положительная, при взаимодействии с аргининдекарбоксилазой, лизиндекарбоксилазой, арабинозой, лизином, аргинином, уреазой, адонитом, сорбитом - реакция отрицательная).

2. Разработана питательная среда для наработки бактериальной массы О. гЫпои'аскеа1е с целыо получения инактивированного антигена: мясопептонный агар - 1000 мл; дрожжевой экстракт - 4,0 г; пептон - 5,0 г; глюкоза - 3,5 г; К2НР04 - 2,0 г; М§Б04 - 5,0 г.

3. Определена бактерицидная доза препарата теотропина в 10 мг/мл после восемнадцати часовой экспозиции с бактериальной культурой ОгпИкоЪаМегшт гЫпои-аскеа1е с концентрацией 1010 микробных тел.

5. Экспериментальные биопрепараты из бактерий ОтикоЬаМегшт гЫпо1гаскеа1е не обладают дермонекротической реакцией, ареактогенены и безвредны для макроорганизма, что дает возможность сконструировать ареактогенный вакцинный препарат.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для наработки максимально возможного количества бактериальной массы О. гЫпо&аскеа1е рекомендуем использовать сконструированную нами накопительную питательную среду.

2. Разработанную схему создания протективного антигена О. гЫпо&аскеа1е рекомендуем использовать при изготовлении инактивированной вакцины против орнитобактериоза.

3. Материалы научных исследований, полученные в рамках диссертационных исследований, используются в учебном процессе студентами на факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА имени П.А. Столыпина».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

До настоящего времени в Российской Федерации не поднимались вопросы по созданию вакцинного препарата против орнитобактериоза. Не существует даже методических подходов для уяснения наиболее оптимальной схемы его конструирования и как следствие схем его создания. Учитывая, что вакцинация живыми бактериальными клетками является прошедшей эпохой в создании вакцин, нами предпринята попытка в разработке наиболее вероятных инактивированных вакцинных препаратов для профилактики орнитобактериоза. С этой целью были поставлены выше приведённые задачи в диссертационных исследованиях.

Согластно поставленной задаче нами изучены основные биологические свойства Omithobacterium rhinotracheale. При исследовании морфологических свойств бактерий Omithobacterium rhinotracheale установлено, что это небольшие грамм - отрицательные палочки с округлыми концами. Споры и капсулы не образуют. Результаты электронной микроскопии дают характерную информацию о данном микроорганизме. Данная информация согласуется с результатами исследований, представленных зарубежными учеными (Van Beek et al, 1994; Charlton et al., 1993; Hafez et al., 1993; Hinz et al., 1994).

Ростовые хорактеристики бактерии следующие - колонии гладкие, мелкие, круглые, серые или серо-белые, выпуклые, непрозрачные, не пигментированы, 1-3 мм в диаметре, большинство культур имеет специфический запах масляной кислоты. Непигментированные колонии развиваются после 2 дней (48 ч) инкубации на обогащенном пептоне, что совпадает с результетами исследований Van Empel and Hafez, 1999.

В результате проведённых исследований из всех использованных накопительных сред для наработки бактериальной массы, сконструированная нами накопительная среда для бактерий Omithobacterium rhinotracheale по показателям КОЕ имеет следующий состав: стерильный мясо-пептоннный агар - 1000 мл; дрожжевой экстракт - 4,0 г; пептон - 5 г; глюкоза - 3,5 г;

К2НР04 - 2,0 г;

MgS04 - 5,0 г;

Для решения поставленной цели оптимальное время культивирования изучаемого микроорганизма на данной питательной среде составляет 48 часов.

Культуральные свойства изучаемых микроорганизмов по нашим данным соответствует следующим результатам: наличие цитохромоксидазы; отсутствие образования индола и сероводорода; не утилизируют цитрат; фермент ДНК-аза отсутствует. При ферментации углеводов бактерии производят слабое сбраживание лактозы, глюкозы, сахарозы, мальтозы, маннит, маннозы. Эти дангные аналогичны данным полученным Vandamm et al., 1994 и Gunther et al., 2002.

В результате проведённых исследований установлено, что препарат теотропин в дозе 5 мг/мл при концентрации бактерий в Ю10 микробных тел после пяти часовой экспозиции обладает бактериостатическим действием по отношению к бактериальной культуре Е. coli, L. monocytogenes, S. aureus. Доза препарата в 7,5 мг/мл является бактериостатической при трёх часовой экспозиции. Доза в 10 мг/мл после восемнадцати часовой экспозиции с бактериальной культурой концентрацией 1010 микробных тел является бактерицидным для данного вида бактерий и возможна как инактиватор для производства инактивированных вакцин из бактериальной массы Omithobacterium rhinotracheale.

Для усиления иммунного ответа было решено абсорбировать антиген с помощью адъюванта. Поэтому с целью выбора эффективного адьюванта для изготовления инактивированной вакцины были выбраны в качестве адъювантов два отечественных адыованта - гидрат окиси алюминия и алюмокалиевые, а так же полный адыованта Фрейнда (Біґсо). Технология их изготовления была проведена по общепринятым методикам.

Получив готовые антигенные препараты, трёх видов мы занялись проверкой их антигенной активности методом получения гипериммунной сыворотки при гипериммунизации кроликов и постановки реакции диффузной преципитации в агаровом геле. Первой группе кроликов вводили антиген без адьвантов, второй - второй антигенный препарат, третьей -третий антигенный препарат, четвертой - первый антигенный препарат с адыовантом Фрейнда.

В результате данных эксперементов установлено, что максимальная величина титра антител наблюдается в ответ на введение антигена с адьювантом Фрейнда и равна к 10 дню гипериммунизации 1:80. К 20 дню титр антител вырос до 1:320 и оставался самым высоким.

Дальнейшее изучение антигенных свойств у полученных препаратов было направлено на выяснение их антигенного состава с целью выбора лучшего препарата. Для этого нами была использована реакция диффузионной преципитации (РДП) по Оухтерлони в модификации Остермана. Показателем эффективности иммунного ответа макроорганизма являлось количество образованных антигенных комплексов (линий преципитации) в реакции РДП. Установлено, что сыворотка, полученная на чистый антиген инактивированный теотропином, даёт от 2 до 3 линий преципитации. Гипериммунная сыворотка, полученная на антиген, включающий полный адъювант Фрейнда даёт две чёткие линии преципитации, но по характеру рисунка, по плотности диффузионной преципитации возможны наличие ещё дополнительных линий. Гипериммунная сыворотка, полученная на антиген с адювантом гидрата окиси алюминия (ГОА) давала максимум 2 полосы преципитации. Гипериммунная сыворотка, полученная на антиген, и алюмокалиевые квасцы формировала 1 полосу преципитации. В связи с полученными результатами нами были проведены дополнительные исследования с целыо улучшения антигенных свойств вакцинного препарата. Для этого было необходимо использовать в качестве протективного антигена не только поверхностные антигенные детерминантные структуры, но и внутриклеточные антигенные комплексы.

Необходимость в этом была обусловлена изучением возможности использования в качестве вакцинного препарата дезинтеграта разрушенной бактерии, учитывая, что в данном препарате в качестве протективного антигена будут использованы антигенные детерминанты не только поверхностных, но и внутренних клеточных структур - рибосом, клеточных мембран, цитоплазматической фракции. Ключевым пунктом в решении этого вопроса является дезинтеграция микробных тел. Согласно литературным данным, наиболее оптимальным вариантом для решения поставленной задачи явилось бы применение криогенного метода дезинтеграции, позволяющего получить клеточные компоненты при минимальной потере их биологических свойств. Одним из методов криогенной дезинтеграции является способ разрушения бактериальных клеток, предложенный Грассе. Проведённая нами проверка данного способа с целыо его применения для данных исследований показала, что двадцатичетырёх кратное замораживание и оттаивание бактериальной культуры ОгпНкоЪасЬегшт гЫпои'аскеа1е не обеспечивает высокого процента разрушения бактериальных клеток, показатель дезинтеграции был низок (до 10-15 %) и не мог отвечать требованиям, необходимым для проведения исследований.

Поэтому возникла необходимость перейти к другому способу дезинтеграции, который позволил бы получить больший процент разрушенных клеток. Одним из таких способов явилась дезинтеграция бактерий с помощью ультразвука. Применяя для этих целей ультразвуковой дезинтегратор, нам удалось добиться большего процента разрушаемости бактериальных клеток. В экспериментах был определён оптимальный режим разрушения бактериальной клетки, заключающийся в следующем: бактериальную суспензию концентрацией 10,0 млрдов микробных клеток в 1 мл дистилированной воды с рН - 7,2, подвергали ультразвуковой обработке на дезинтеграторе фирмы МБЕ (Англия) с амплитудой зонда - 6 мк, временем обработки - 10 минут, объём суспензии - 18-20 мл. В качестве охлаждающей смеси стакана дезинтегратора использовали смесь спирта со льдом. Эффективность разрушения бактериальных клеток оценивали по данным световой микроскопии, а также по данным подсчёта жизнеспособных клеток в исходной и разрушенной клеточной суспензии, путём титрования и высева их на питательную среду - МПА. В проведённых экспериментах при вышеуказанных режимах дезинтеграции показатель величины разрушения бактериальной клетки доходил до 90 %. Полученный дезинтеграт бактериальной клетки был изучен в иммунологических опытах на животных с целью выбора из данной группы препарата, обладающего наиболее выраженными протективными свойствами.

Иммунологические исследования были проведены на белых мышах: в опытах мы варьировали как дозы иммунизирующего препарата, так и сами препараты, полученные из бактериальной клетки. В качестве контроля результатов опытов, для уяснения протективных свойств изучаемых препаратов, были использованы различные агенты, включая физиологический раствор, инактивированные целые клетки ОгпНкоЬаМепит гЫпои-асИеа1е и живые бактериальные клетки ОтШюЪаМег'шт гЫпо1гаскеа1е.

Результаты проведённых экспериментов позволили сделать однозначный вывод, что дезинтеграционные структуры бактериальных клеток орнитобактерий обладают протективными свойствами, но величина их активности различна. Полученные данные указывают, что неинактивированный теотропином дезинтеграт, с дозой иммунизации по белку в 2,4 и 2,8 мг, обладает более высокими протективными свойствами, чем дезинтеграт, инактивированный теотропином. Это объясняется тем, что препараты из неинактивированного дезинтеграта содержат живые бактерии, что повышает его протективные свойства. Препараты из целых, инактивированных различными способами бактериальных клеток ОтИкоЪасгепит гЫпоЬ'аскеаЫ, обладают меньшими протективными свойствами. Так, из 56 белых мышей иммунизированных дезинтегратом, после контрольного заражения выжило 31, т.е. более 50 %. У препарата с целыми инактивированными клетками, данное соотношение значительно хуже - 27:11. Таким образом, уже первые эксперименты позволили нам положительно ответить на вопрос о наличии более эффективных протективных свойств у дезинтеграта бактериальной клетки ОтИкоЬас(егшт гЫпои'асИеа1е.

Данный ответ допускает возможность конструирования вакцинного препарата на основе дезинтеграта, полученного из бактериальных клеток орнитобактерий при соблюдении требований стандартности препаратов у вновь нарабатываемых серий. Как уже указывалось выше, оптимальным показателем стандартизации в данных экспериментах является величина белка, определяемого по методу Лоури.

Несомненно, не следовало забывать, что все исследования по данному вопросу носят поисковый характер, и при решении задачи конструирования вакцинного препарата бактериальной клетки орнитобактерий и выяснения наличия созданного им иммунитета против данной инфекции, необходимо было продолжать исследования по определению иммуногенных, протективных свойств изучаемых препаратов.

Результаты проведённых эксперементов дали положительный ответ на вопрос о наличии протективных свойств у изучаемых препаратов. Поэтому в дальнейших исследованиях задача была расширена. В экспериментах применяли различные комбинирования клеточных структур с новыми адьювантными иммуностимулирующими веществами, так как уже использованные ранее адьванты не показали достаточного эффекта. Это было необходимым для поиска оптимальной конструкции возможного вакцинного препарата.

Однако, полученные результаты серии опытов по выявлению оптимальной конструкции создаваемой вакцины с новым комплектом адыовантных препаратов, таких как «Декстран Т - 500» и «Конкавалин - А», показал, что количество мышей, выживших после контрольного заражения не превышало показателей контрольной группы (инактивированный дезинтеграт), иммунная эффективность данной конструкции практически равна нулю.

В иммунологических опытах хорошие результаты опять продемонстрировал препарат, состоящий из дезинтеграта бактериальной клетки, инактивированного теотропином. Эти данные свидетельствовали, что указанная конструкция вакцины обладает достаточными протективными свойствами, создавая защиту у животных против контрольного заражения дозой 101Л)5о практически у половины иммунизированных животных.

Полученный положительный эффект в данной проблеме дал дорогу вакцине нового поколения экологически и биологически безопасной совмещающей в себе достоинства живых и инактивированных препаратов. Вакцины, конструированной на новых технологических принципах и методах, отражающие появившееся требование создание вакцин, исключающее возбудителя болезни, даже в потенциально активной биологической форме с сохранением максимума антигенных протективных детерминант. Можно согласиться с В.В. Макаровым (1983), что, несмотря на относительно высокую стоимость, будущее за вакцинами подобного типа. Об этом свидетельствуют их достоинства: чистота антигенного раздражителя, высокая точность дозировки, отсутствие или сведение к минимому побочных реакций, ограниченные возможности для ассоциации антигенов, технологические перспективы запаса впрок антигенного сырья, его длительная сохранность в минимальных объёмах и главное польнейшая безопасность в связи с отсутствием в препаратах инфекционного агента. В настоящее время имеющийся научно технологический потенциал паозволяет подойти к разработке биопрепаратов подобного типа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Курьянова, Назия Хусаиновна, Ульяновск

1. Андрус В.Н. Перспективы использования современных дезинфицирующих средств в очагах особо опасных инфекций / В.Н.Андрус,

2. Антибактериальная активность дезинфектантов нового поколения / О.Н. Воробьева и др. // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: сб. статей. Т.4. М.,2002.1. C.9-10.

3. Антимикробные и дезинфицирующие свойства двух хлорактивных дезинфектантов: усовершенствованного гипохлорита натрия и ДТСГК / В.Н.Герасимов и др. // Дезинфекционное дело. 1999 . - №4. -С.10-18.

4. Аржаков В.Н. Дезинфекция и ее место в системе противоэпизоотических мероприятий / В.Н.Аржаков, Н.В. Аржаков // БИО.-2003,-№7. -С. 9-21.

5. Аржаков В.Н. Основные требования безопасности при проведении дезинфектологических работ в ветеринарии / В.Н. Аржаков, М.М. Ермакович, П.В. Аржаков //БИО.- 2004. № 7. -С.36-37.

6. Ассоциаты на основе хлоргексидина и синергетический эффект / Г.Г. Кардаш и др. // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: сб. статей. Т.4. -М., 2002. С.21-22.

7. Ашмарин И. П., Васильев Н. И., Абросимов В. А. Быстрые методы статистической обработки и планирования эксперимента. Л.: ЛГУ,-1975.-С. 46-53.

8. Бактерицидная активность препаратов на основе полигексаметиленгуанидин гидрохлорида на возбудителей инфекционных заболеваний/ А.П. Лысенко и др. // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии: труды ВНИИВСГЭ.Т. 116. -М., 2004. С.69-73.

9. Бакулов И.А. Сибирская язва (АНТРАКС): новые страницы в изучении старой болезни / И.А.Бакулов, В.А.Гаврилов, В.В.Селиверстов. -Владимир; Вольгинский: Посад, 2001. С.86.

10. Васильев Д. А. Биологические свойства изолированных клеточных компонентов листерий: дис. канд. вет. наук: 16.00.03 / Васильев Дмитрий Аркадьевич.- Покров, 1983. С. 29-33.

11. Вашков В. И. Средства и методы стерилизации применяемые в медицине/В.И.Вашков. М.: Медицина, 1972.- С. 175-201.

12. Вашков В.И. Антимикробные средства и методы дезинфекции при инфекционных болезнях / В.И. Вашков. М. Медицина, 1977. - 295 с.

13. Ветеринарная микробиология и иммунология / H.A. Радчук и др. / под ред. Н. А .Радчука. М.: Агропромиздат, 1991. - 383 е.: ил.

14. Вирулицидная, туберкулоцидная и фунгицидная активность новых средств из группы поверхностно-активных веществ / Л.Г.Пантелеева и др. // Дезинфекционное дело. 1998. - №3. - С. 16-17.

15. Высоцкий А.Э. Бактерицидная активность и токсикологическая характеристика дезинфицирующего препарата КД/ А.Э.Высоцкий // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии: сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ.Т. 117. М., 2005. -С.183-195.

16. Высоцкий А.Э. Сравнительная биоцидная активность дезинфектанта «Сандим-Д» / А.Э.Высоцкий // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии: сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ. Т.117. -М., 2005. -С. 176-182.

17. Гинсбург A.A. Введение в химию комплекных соединений / A.A. Гинсбург. -М., 1986. С.263.

18. Говорун В.М. Зависимость переноса холестерина из липосом в плазматические мембраны клеток Acholeplasma laidlwii от содержания в мембранах каротиноидов / В.М.Говорун, А.Б. Капитонов // Биологические мембраны. 1992. - №9 (10). - С.940-945.

19. Голов Е.А. Антимикробные и физико-химические свойства новых перекисных дезинфектантов: дис. . канд. биол. наук: 03.00.06/ Голов Евгений Александрович. М., 2005. - С. 11-44.

20. Громов Б.В. Строение бактерий / Б.В.Громов. Л.: Издательство Ленинградского университета, 1984. - С. 100.

21. Гудкова Е.И. Прошлое, настоящее и будущее четвертично-аммониевых соединений / Е.И.Гудкова, А.А.Красильников, Н.Л.Рябцева // Дезинфекционное дело. 2002. - №4. - С. 18-22

22. Дезинфекция последствий биотерроризма / В.В. Буянов и др.. -Черноголовка, 2005. С. 76-78.

23. Дезинфицирующая активность йодеза и его композиций против микобактерий / И.Б.Павлова и др. // Ветеринария. 2003. - №7. - С.9-11.

24. Джассим Аднан А. Конденсация ацетилацетона с диаминами / Джассим Аднан А., Кузнецов А.И. // Ученые записки МИТХТ, выпуск. 1, Москва, 2006. С. 69-72.

25. Дмитриева Н.Д. Липотейхоевые и тейхоевые кислоты патогенных стрептококков: структура, функции, роль во взаимодействии возбудителя с макроорганизмом / Н.Д.Дмитриева, Ю.М.Тимофеев, Н.И.Брико // ЖМЭИ. -2007. -№6.-С.100-107.

26. Досанов К.Ш. Изучение ультраструктуры и дыхательной активности стафилококка при воздействии перекиси водорода / К.Ш.Досанов // Доклады ВАСХНИЛ. 1979. - №3. - С.42-45.

27. Достижения научно-исследовательской работы в области дезинфекции / Н.И.Попов // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии: сб. науч. тр. ВНИИВСГЭ. Т.117. М., 2005. - С. 39-47.

28. Елизаров В.В. Использование перекисных и хлорсодержащих средств для обеззараживания в очагах сибирской язвы / В.В.Елизаров,

29. Емцев, В.Т. Микробиология / В.Т.Емцев, E.H. Мишустин. М.: Дрофа, 2005.-С. 112-114.

30. Ефимов K.M. Полигуанидины класс малотоксичных дезсредств пролонгированного действия/ K.M. Ефимов, П.А. Гембицкий, А.Г. Снежко // Дезинфекционное дело. - 2000. - №4. - С.5-13.

31. Зарипов М.Р. Разработка пенообразующего дезинфицирующего средства для промышленного птицеводства: автореф. дис.канд. биол. наук : 03.00.07; 16.00.03 / Зарипов Марк Рафаэлович. Казань, 2004. - С. 16.

32. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот / В. Зенгер; пер с англ. -М.:Мир, 1987. С. 431-433.

33. Зеркалев Д.Ю. Разработка средств специфической профилактики и лечения вирусной геморрагической болезни кроликов в Краснодарском крае: Дис. канд. биол. наук: 03.00.23/3еркалев Дмитрий Юрьевич: Краснодар, 2004.-С.34.

34. Злыгостев А. Бактерии и актиномицеты. Общая характеристика бактерий и актиномицетов Электронный ресурс.- Режим доступа: http://plant.geoman.ru «Жизнь растений»

35. Иванова Е.Б. Новые отечественные разработки дезинфектантов для неспецифической профилактики инфекционных заболеваний / Е.Б. Иванова, A.M. Иванов, C.B. Ковалев //Ветеринарная медицина. 2006. - №1. - С.9-10.

36. Иванова Е.Б. Применение разработанных отечественных дезинфицирующих средств на основе четвертично-аммониевых соединений в профилактике внутрибольничных инфекций: дис. .канд. мед. наук : 14.00.30 / Иванова Елена Борисовна. М., 2001. - 168 с.

37. Иванова Л.Г. Иммунохимическое исследование серологически активных веществ, выделенных из а.ЬошИпит типов А и В / Иванова Л.Г. Булатова Т.И., Матвеев К.И.//Ж. микробиологии, 1968. -№1. С. 10-18.

38. Ивков В.Г. Липидный бислой биологических мембран / В.Г. Ивков, Г.Н. Берестовский. М., 1982. - С. 104-105.

39. Исследование механизма действия нового класса перекисных дезинфектантов пероксогидратов / В.Н. Герасимов и др. // Дезинфекционное дело. - 1999. - № 1.- С. 14-18.

40. Кисленко, В.Н. Ветеринарная микробиология и иммунология Часть 1. Общая микробиология./ Кисленко В.Н., Колычев Н.М.- М.: КолосС, 2006. С.37-38.

41. Колычев Н.М. Ветеринарная микробиология и иммунология / Н.М. Колычев, Р.Г. Госманов. 3-е изд., перераб и доп. - М.: КолосС, 2003. -С. 98-99.

42. Комплексная оценка вирулицидной активности дезинфектантов на основе четвертичных аммониевых соединений в отношении вируса гепатита А/ Л.И. Замятина и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. № 1. - 2007. - С. 3 7-41.

43. Костина Г.Н. К вопросу о механизмах химической инактивации микроорганизмов / Г.Н.Костина // ЖМЭИ. 1983. - №12. - С.25-32.

44. Кострюкова H.H. Современные представления о механизмах патогенного действия менингококка / H.H. Кострюкова, В.А. Бехало // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. - №3. - С.40-43.

45. Костюкова Т.А Дезинфектанты: широкий спектр и возможности выбора/ Т.А.Кострюкова, М.Н.Ляпин, Т.А.Малюкова // Медицинская микробиология XXI век: материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Саратов, 2004. - С. 123-124.

46. Кушнир A.A. Инфекционный ларинготрахеит птицы / А. Кушнир // Животноводство России. 2002. - № 3. - С. 43-44.

47. Лабинской A.C. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований / A.C. Лабинская, Л.П. Блинкова, A.C. Ещина М.; Медицина, 2004. - С. 34-37.

48. Марченко Т.В. Биологические свойства Pseudomonas aeruginosa, выделенной от животных, из кормов и объектов внешней среды в Краснодарском крае: дис. . канд. вет. наук : 16.00.03 / Марченко Татьяна Витальевна. Краснодар, 2006. - С. 9.

49. Методические рекомедации по отбору, испытаниям и оценке антивирусных и антибактериальных химиопрепаратов среди соединений различных химических классов. М. - 2004. - С.3-7.

50. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04. М. -2004.-С.З-12.

51. Методические указания по оценке эффективности дезинфицирующих средств, предназначенных для обеззараживания различных объектов и санитарной обработки людей N 859-70. М. 1970. - С. 2-6.

52. Микробиологические, биофизические и биохимические исследования механизма действия дезинфектанта Метацид на бактерии / В.Н.Герасимов и др. // Дезинфекционное дело. 1998. - №5. - С. 19-25.

53. Морозова Н.С. Дезрезистентность микроорганизмов в проблеме внутрибольничных инфекций / Н.С.Морозова, С.В.Корженевский,

54. A.В.Теленев // Вестник ассоциации. 2001. - №3. - С. 4-5

55. Несмеянов А.Н., Органическая химия. Кн.1 / А.Н. Несмеянов, H.A. Несмеянов. М.: Химия, 1974. - С502-503.

56. Особенности механизма действия перекисного дезинфектанта ПВК-2 на микробные клетки и споры / В.Н.Герасимов и др. // Дезинфекционное дело. 1998. - №1. - С. 12-19.

57. Павлова И.Б. Атлас морфологии популяций патогенных бактерий / И.Б. Павлова, Е.М. Ленченко, Д.А. Банникова. М.: Колос, 2007. -С.44-47.

58. Павлович Н.В. Возможные механизмы реализации токсического потенциала липополисахаридов патогенных бактерий / Н.В.Павлович,

59. B.И.Тынянова // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-2005.-№2. -С. 9-13.

60. Пантелеева Л.Г. Современные дезинфицирующие средства для профилактики внутрибольничных инфекций / Л.Г.Пантелеева // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: сб. статей. Т.4. М., 2002. -С.45-46.

61. Поляков A.A. Ветеринарная дезинфекция / А.А.Поляков. М.: Колос, 1979.-С. 277.

62. Попов Н.И. Дезинфекция в системе ветеринарно-санитарных мероприятий / Н.И. Попов, В.В. Селиверстов, В.В. Дудницкий // Ветеринария. 1999. - №2. - С. 18-23.

63. Прозоркина H. В., Рубашкина П. А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии Электронный ресурс. - Режим доступа: http://www.medbookaide.ru/

64. Пхакадзе Т.Я. Выбор дезинфектанта. Краткая характеристика наиболее часто используемых дезинфицирующих средств Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.iacmac.ru/

65. Рис Э. Введение в молекулярную биологию: От клеток к атомам: Пер. с англ. / Э. Рис, М. Стенберг. М.: Мир, 2002. - С. 88.

66. Романов В.Е. Применение дезинфектантов в ветеринарии /

67. B.Е.Романов, О.Г.Малых, Т.А.Тимошенко //Международный семинар «Современные средства и методы дезинфекции, применяемые при работе с патогенами»: тезисы докладов. Киров, 2006. - С.54-57.

68. Саврилов М.Р. Изыскание средств дезинфекции при сибирской язве / М.Р. Саврилов // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: материалы Международной научной конференции молодых ученых. Владимир, 2004. - С. 175-177.

69. Сварваль A.B. Липополисахарид иерсиний и его биологическая активность / A.B. Сварваль, Г.Я. Ценева, O.A. Шендерович // ЖМЭИ. 2006. -№3.-С. 100-104.

70. Сибирская язва / Н.Г. Ипатенко и др.. М.: Колос, 1996.1. C. 176.

71. Сибирская язва / П.Н.Бургасов и др. М., 1970. - С.53.

72. Сидоренко, C.B. Место бактерий в живой природе / C.B. Сидоренко // Инфекции и антимикробная терапия. 2000. - №2 (Т.2) - С. 1219.

73. Синтез и исследование реакционной способности производных 1,3,5-триазаадамантана / М.И. Шахгельдиев и др. // ХиГС. -1987. №5. - С. 654-655.

74. Современные средства дезинфекции и дезинсекции. Характеристика, назначение, перспективы / Л.С.Федорова и др. // Медицина и здравоохранение. Обзорная информация. М., 1991. - С. 3-25.

75. Современный подход к выбору дезинфицирующих средств в системе профилактики внутрибольничных инфекций / И.Ф. Веткина и др. // ФАР Миндекс Практик. - 2005. - №7. - С. 13-20.

76. Соколова Н.Ф. Методологические основы определения устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам / Н.Ф.Соколова // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: сб. статей. Т.4. М., 2002. - С.55-56.

77. Соколова Н.Ф. Современные средства и методы дезинфекции при сибирской язве / Н.Ф.Соколова // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: сб. статей. Т.4. М., 2002. -С.56-57.

78. Специализированный справочно-информационный каталог Электронный ресурс. Режим доступа: www.dezsredstva.ru

79. Сравнительный анализ средств, применяемых для дезинфекции опасных микроорганизмов / А.Д.Украинцев и др. // Химическая и биологическая безопасность. 2005. - №6 (24). - С. 12-22.

80. Срибный Н.И. Теотропин и его применение в ветеринарной практике / Срибный Н.И., Кузнецов А.И. Электронный ресурс. Режим доступа: http://rusagroug.ru/ - отраслевой агропромышленный портал «РусьАгроЮг»

81. Стрептококкус пиогенес: выделение, идентификация и определение чувствительности к антибактериальным препаратам / К.В.Шпынев и др. / КМАХ. 2007. - №2. - С. 104-120.

82. Стрилец О.И. Дезинфектанты. Новые аспекты исследований, /О.И.Стрилец, И.А.Дикий, Л.С. Стрельников // Дезинфектанты. 1999. -Вып. 11.-С. 15-19.

83. Тикунов В.И. Комплексные дезинфектанты на основе гипохлорита натрия: дис. . канд. вет. наук: 16.00.03 / Тикунов Владимир Иванович. Белгород, 2000. - С. 27-30.

84. Титова К.В. Координационные соединения пероксида водорода / К.В.Титова, В.Л.Никольская, В.В.Буянов.- Черноголовка, 2000.- С. 121-122.

85. Толстиков Г.А. Реакции гидроперекисного окисления / Г.А. Толстиков.-М.: Наука, 1976.-С. 134-136.

86. Турова Т.П. Изучение происхождения двух типов строения клеточной стенки и способности к спорообразованию у эубактерий с помощью молекулярно-биологических методов / Т.П.Турова // Микробиология. 1995. -№3(64). - С. 301-309.

87. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М.; Академия медицинский наук СССР. -1975.-С. 180-197.

88. Фридович М. Радикалы кислорода, перекиси водорода и токсичность кислорода // Свободные радикалы в биологии. Т. 1 / пер. с англ. ; под ред. М.Н.Эммануэля. -М.: Мир, 1979. С.272-378.

89. Чичибабин А.Е. Основные начала органической химии. Т.1. -М.:Госхимиздат, 1963. С. 67-70.

90. Шандала М.Г. Новые дезинфекционные технологии для профилактики инфекционных болезней / М.Г.Шандала // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. - №4. - С. 15-17.

91. Шандала М.Г. Перспективы и проблемы современной дезинфектологии / М.Г.Шандала // ЖМЭИ. 2003. - №3. - С. 119-125.

92. Шандала М.Г. Современное состояние и возможные перспективы решения проблемы тестирования вирулицидности дезинфицирующих средств/ М.Г.Шандала // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2005. -№2. - С. 42-43.

93. Шляхов Э.Н. Сибиреязвенный аллерген-антраксин (Принципы конструирования, методы получения, экспериментальное изучение, применение в эпидемической практике): Автореф. дис. . докт. мед. наук / Э.Н. Шляхов. Кишинев, 1965. 53 с.

94. Abdul-Aziz Т.A., Weber L. Omithobacterium rhinotracheale infection in a turkey flock in Ontario. Can. Vet. J. 1999. - Vol. 40. - P. 349-350.

95. Amonsin A., Wellenhan L., Li L-L., Vandamme P., Lindeman, C.Edman, M.Robinson, R.& Kapur, V. Molecular epidemiology of Omithobacterium rhinotracheale!! Journal of Clinical Microbiology. 1997. -Vol. 35. - P. 2894-2898.

96. Back A., Rajashekara G., Jeremiah R., Halvorson D and Nagaraja K. Tissue distribution of Omithobacterium rhinotracheale in experimentally infected turkeys// The Veterinary Record. 1998. - P. 143.

97. Bretscher M. Membrane structure: same general principles / M. Bretscher//Science. 1973.-Vol. 181 - P. 622-699.

98. Canal C.W., Rocha, S.L.S., Leao, J.A., Fallavena, L.C.B., Oliveira, S.D. and N. Beltrao. Polymerase chain reaction (PCR) detection of Omithobacterium rhinotracheale (ORT). Avian Path. 1999. - P. 369-377.

99. Chansiripornchai N. Molekular Interaction of Omithobacterium rhinotracheale with Eukaryotic Cells. Proefschrift, Utrecht. 2004. -P.23.

100. Charlton B.R., Channing-Santiago S.E., Bickford A.A., et al. Preliminary characterization of a pleomorphic gram-negative rod associated with avian respiratory disease// J. Vet. Diagn. Invest. 1993. - P. 47-51.

101. Charlton B.R. Omithobacterium rhinotracheale (ORT) infection. In: Avian Disease Manual, 4th ed. American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, PA. 1996.- P. 128-129.

102. Chin R.P., Droual R. Omithobacterium rhinotracheale infection// In: Diseases of Poultry. 1997. - P. 1012-1013.

103. De Rosa M., Droual, R., Chin, R., Shivaprasad, H. And Walker, R. Omithobacterium rhinotracheale infection in turkey breeders. Avian Diseases, 40.- 1996.-P. 865-874.

104. Deveiese L.A., J. Nommez, P. Vandamme, K. Kersters, F. Haesebrouck In vitro antibiotic sensitivity of Omithobacterium rhinotracheale strains from poultry and wild birds. Vet. Ree. 1995. - Vol. 137. -P. 435-436.

105. Dudouyt J. Leorat, J. Van Empel,P., Gardin, Y. and Celine, D. Isolement dvun nouvel pathogene chez la dinde: Omithobacterium rhinotracheale: Conduite a tenir, In Proceedings of the Journees de la Recherche Avicole, Angers.- 1995.-P. 240-243.

106. EI-Gohary A. A. Omithobacterium rhinotracheale (ORT) associated with hatching problems in chicken and turkey eggs. Vet. Med. J. Giza., 46. 1998. -P. 183-191.

107. El-Shamy A. Sanaa, Sohair Z. Hussein and A.H. Bayoumi Morphological and aetiological studies on pneumonia in turkey: Omithobacterium rhinotracheale infection. Assiut Vet. Med. J. 2000. - Vol. 43. - P. 338-346.

108. Frankel E.N. Analysis of autoxydised fast by gas chromotografymass spectrometry. IV. Soybean oil methyl esters / E.N.Frankel, W.E. Neff // Lipids. -1979.-Vol.14.-P.39-46.

109. Hafez H. Current status on the role of Omithobacterium rhinotracheale (ORT) in respiratory disease complexes in poultry// Arch. Geflugelk. 1996. - P. 60.

110. Hafez H. Respiratory diseases in turkey: Serological Surveillance for Antibodies Against Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) and Turkey Rhinotracheatis ( TRT) //Proceeding of the XX Worlds Poultry Congress. 1996. -P. 243.

111. Hafez H., Beyer W. Preliminary investigation on Ornithobacterium rhinotracheale «ORT» isolates using PCR-fingerprintings.// In: Proc.ll th Internation Congress of the World Veterinary Poultry Association, Budapest, Hungary. 1997. -P. 51.

112. Hafez, H, and Friedrich. S. Isolierung von Ornithobacterium rhinotracheale «ORT» aus Mastputen in Österreich. Tieraerztl. Umsch. 1998. -Vol. 53.-P. 500-504.

113. Hafez H., Hess M. Modern Techniques in diagnosis of poultry diseases: review//Arch. Geflue gelkd. 1999. - Vol. 63. - P. 237-245.

114. Hafez H. Sting, R. Serologic surveillance on Ornithobacterium rhinotracheale in poultry flocks using self-made ELISA. Proceedings of the 45th Western Poultry Disease Conference, Cancun. 1996. - P. 163-164.

115. Hafez H., Sting, R. Investigation n different Ornithobacterium rhinotracheale «ORT» isolates // Avian Dis. 1999. - Vol.43. - P. 1-7.

116. Hafez H., Sting, R. Serological surveillance on Ornithobacterium rhinotracheale «ORT» in broiler breeder flocks// In Proceedings of the XI th Internation congress of the World Veterinary Poultry Association, Budapest, 1997, p.331.

117. Hinz K.-H., Blome, C., Ryll M. Acute exudative pneumonia and airsacculitis associated with Ornithobacterium rhinotracheale in turkey// Vet. Ree. 1994.-Vol. 135.-P. 233-234.

118. Hinz, K.-H., and Hafez, H. Early history of Ornithobacterium rhinotracheale (ORT). Arch. Geflügelkd. 1997. - Vol. 61. - P. 95-96.

119. Hung A., Alvarado, A. Characterization and serotyping. of Ornithobacterium rhinotracheale isolates associated with respiratory disease indomestic poultry in Peru// Abstract: 12 th World Poultry Congress, Montreal, Canada. 2000. - P.200.

120. Hamblin M. Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease? / M.R. Hamblin, T.Hasan // Photochem Photobiol. Sci. 2004. -Vol.3, №5.-P. 436-450.

121. Joubert, P., Higgins, R., Laperle, A., Mikaclian, I., Venne, D. And Silin, A. Isolation of Ornithobacterium rhinotracheale from turkeys in Quebec, Canada. Avian Diseases. 1999. - Vol. 43. - P. 622-626.

122. King W.L. Lysis of bacterial spores with hydrogen peroxide / W.L.King, G.W.Gould // J. Appl. Bacteriol. 1969. - Vol. 32, №4. -P.481-490.

123. Leroy-Setrin, S., Flaujac, G., Thenaisy, K. and Chaslus-Dancla, E. Genetic diversity of Ornithobacterium rhinotracheale strains isolated from poultry in France. Letters in Applied Microbiology. 1998. - Vol.26. - P. 189-193.

124. Moorer, W.R. Antiviral activity of alcohol for surface disinfection. / W.R. Moorer // Int J DentHyg. 2003. - Vol. 1, №3. -P.42-138.

125. Nikaido, H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability /H.Nikado, M.Vaara M. // Microbiol. Rev. 1985.-Vol. 49. - P. 1-32.

126. Roepke D., Back, A., Shaw D., Nagaraja K., Sprenger S. and Halvorson D. Isolation and identification of Ornithobacterium rhinotracheale from commercial turkey flocks in the upper Midwest. Avian Dis. 1998. - Vol. 42. P. 219-221.

127. Rothman J. Membrane asymmetry / J. Rothman, J. Lenard // Science. 1977.-Vol.195.-P.743-753.

128. Ryll M., Hinz K, U. Neumann U., Löhren U., Südbeck M. Steinhagen D. Pilotstudie zur Prävalenz der Omithobacteriiim rhinotracheale Infektion ei Masthühnern in Nordwestdeutshcland. Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. - 1997. -Vol.110. - P. 267-271.

129. Sakai E., Tokuyama Y., Nonaka F., Ohisi S., Ishikawa Y., Tanaka M., Taneno A. Omithobacteriiim rhinotracheale infection in Japan; preliminary investigations. Vet. Ree. 2000. - Vol.146. - P. 502-503.

130. Schleifer J. ORT in turkeys, Broilers has more questions than answers. Poultry Digest, July. 1997. -Vol.14. -P. 17.

131. Siddique I., Srivastava K. Cell wall and cytoplasmic components of Listeria Inonocytogenes. Am. J.Vet. Res. 1973. - Vol.34. - P. 567-570.

132. Soriano V.E., Vera N.A., Salado C.R. In Vitro Suscebility of Omithobacteriiim rhinotraheale to Several Antimicrobial Drugs. Avian Diseases. -2003.-Vol.47.-P. 476-480.

133. Travers A.F. Concomitant Ornithobacterium rhinotracheale and Newcastle disease infection in broilers in South Africa// Avian dis. 1996. - Vol. 40. P. 488-490.

134. Ulimann W., et al, Studies on the Monoclinic and Hexagonal Modifications of Isotactic Polypropylene, Progr. Colloid & Polymer Sei. 1979 -Vol.66.-P. 25-33.

135. Vaara, M. Polycations as outer membrane-disorganizing agents/ M.Vaara, T.Vaara // Antimicrobial. Agents Chemother. 1983. - Vol.24. - P. 114122.

136. Van Beek P. Ornithobacterium rhinotracheale (ORT), clinical aspect in broilers and turkeys. Annual Meeting of the Veterinary Study Group of the EU, Amsterdam, November. 1994. - P.90.

137. Van der Meer, J.P. Genetics of Gracilaria sp. (Rhodophyceae, Gigartinales). II. The life history and genetic implications of cytokinetic failure during tetraspore formation. Phycologia 16. 1977. - P.367-371.

138. Van der Meer J.P. Genetics of Gracilaria tikvahiae (Rhodophyceae). VII. Further observations on mitotic recombination and the construction of polyploids. Can. J. Bot. 59. 1981. - P.787-792.

139. Van Empel P. Ornithobacterium rhinotracheale: Isolation, identification and experimental infection results. Paper given at Poultry Veterinarian Study group of the EU held in Amsterdam 11th November. 1994. -P.76.

140. Van Empe.l P. Ornithobacterium rhinotracheale: a review// Avian pathology. 1999. - Vol.28. - P. 217-227.

141. Van Empel, P., Van den Bosch H., Loeffen P. and Storm P. Identification and serotyping of Ornithobacterium rhinotracheale //Journal of Clinical Microbiology. 1997. - P 35.

142. Van Empel P., Van den Bosch, H. Vaccination of chickens against Ornithobacterium rhinotracheale infection// Avian Diseases. 1998. - P. 42.

143. Van Empel P. and Hafez H. Ornithobacterium rhinotracheale: a review// Avian Pathology. 1999. - P. 28.

144. Walker J. E.coli F 410 ATP-ase interact with a membrane protein component of proton channel / J.E. Walker, M.Saratse, N.J. Gay // Nature. 1982. -Vol. 289.-P. 867-869.

145. Wyffels R. and Hommez, J. Pasteurella anatipestifer isolates from respiratory lesions in parteidges kept in captivity (Perdix perdix). Vlaams Dier. Tijdschrift. 1990. - Vol. 59. - P. 105-106.

146. Yoon J.U., Lee, D.W., Kwon, H.J., Ahn, Y.K. and Kim, S.J. Pathogenicity of Korean isolates of Ornithobacterium rhinotracheale in Broiler chickens. In: Proc. Am. Assoc. Avian Path. Annual Meeting, Salt lake City, Utah. -2000. P. 29.1. O.Vl >01

Информация о работе

Курьянова, Назия Хусаиновна
кандидата биологических наук
Ульяновск, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка биотехнологических параметров по получению протективного, инактивированного антигена Ornithobacterium rhinotracheale - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы