Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологические свойства бактерий Ornithobacterium Rhinotracheale, выделенных на территории Российской Федерации

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства бактерий Ornithobacterium Rhinotracheale, выделенных на территории Российской Федерации"

ЧЕРНЫШОВ Анатолий Викторович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ ОПМТНОВАСТЕМиМ ЯНтОТЯАСНЕАЬЕ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

/

2 1 АПР 2011

Владимир - 2011 г.

4844286

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»)

Научный руководитель -

доктор биологических наук, профессор ПРУНТОВА Ольга Владиславовна

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор ДИЕВ Вячеслав Иванович ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир

доктор ветеринарных наук, профессор ПИРОЖКОВ Михаил Константинович

ФГУ «Всероссийский государственный научно-исследовательский институт

контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов», г. Москва.

Ведущая организация -

ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина», г. Москва

Защита состоится « » 2011 г. в часов на заседании совета по

защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГУ «ВНИИЗЖ».

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»: Ьйр/Ми^.arriah.ru.

Автореферат разослан ¿-¿Уа¿1— 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент

А.П. Пономарёв

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Респираторные заболевания птиц являются одной из важнейших ветеринарных проблем. К ним относится и орнитобактериоз, вызываемый бактериями вида Ornithobacterium rhinotracheale. Экономический ущерб, наносимый промышленному птицеводству этой инфекцией, складывается из высокой выбраковки больной птицы, смертности (1-15% у индеек и до 10% у цыплят-бройлеров), снижения приростов живой массы, яйценоскости (от 2 до 5%), выводимости цыплят и затрат на проведение оздоровительных и лечебных мероприятий [S.N. El-Sukhon et al., 2002; R. Bock et al., 1995; P. van Empel, H.M. Hafez, 1999; D. Lafay, 2000].

Заболевание может возникать как самостоятельно, так и в ассоциации с другими патогенными агентами бактериальной, вирусной или микоплазмозной этиологии, что значительно затрудняет проведение диагностики заболевания и его лечение.

Ввиду сложности диагностики орнитобактериоза птиц (низкая осведомленность специалистов о свойствах бактерии, снижение вероятности выделения на поздних стадиях заболевания, сходство с другими респираторными болезнями) и высокой вероятности заноса возбудителя с инкубационным яйцом, а также резистентности ко многим широко используемым антибиотикам [L. Van Veen at al., 2004], постановка вопроса об изучении биологических и антигенных свойств бактерий вида Ornithobacterium rhinotracheale, выделенных на территории РФ, является актуальной задачей, имеющей научное и практическое значение.

Цели и задачи исследований. Основной целью данных исследований было выделение и идентификация бактерий вида О. rhinotracheale из патологического материала от птиц, изучение их морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и патогенных свойств.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выделить изоляты бактерий О. rhinotracheale от птиц из птицеводческих хозяйств РФ.

2. Изучить биологические свойства изолятов О. rhinotracheale, выделенных на территории РФ в сравнении с референтными штаммами.

3. Подобрать оптимальную питательную среду и условия для культивирования О. rhinotracheale

4. Подобрать оптимальные условия для длительного хранения штаммов О. rhinotracheale

5. Получить специфические компоненты бактерий О. rhinotracheale для постановки серологических реакций.

6. Определить антигенное родство между референтными штаммами и изолятами бактерий О. rhinotracheale

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований патологического материала получены 19 патогенных изолятов О. rhinotracheale, один из которых детально изучен, паспортизирован и депонирован как производственный штамм в коллекции бактериальных культур ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»).

Изучены биологические свойства 3 референтных штаммов и 4 полевых изолятов О. rhinotracheale.

Изучена чувствительность полевых изолятов О. rhinotracheale к широкому спектру антибактериальных препаратов.

Подобрана питательная среда и оптимальные условия для культивирования О. rhinotracheale с целью получения большого объема биомассы.

Определены оптимальные условия и сроки хранения возбудителя орнитобактериоза птиц.

Установлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК выделенных изолятов О. rhinotracheale и заложены в базу данных GenBank.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований впервые в РФ разработаны «Методические рекомендации по лабораторной диагностике орнитобактериоза птиц» (2010 г.), одобренные ученым советом ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и утвержденные Заместителем руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору в установленном порядке.

Штамм «Задонский-1» №130 ДЕП, депонирован в коллекции бактериальных культур ФГУ «ВГНКИ» и используется при производстве набора ИФА для выявления антител в сыворотке крови кур к О. rhinotracheale.

В коллекцию бактериальных культур ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» после детального изучения заложены следующие изоляты О. гЫпо1гаскеа!е: «Т-1», «Кр-1», «Б-1».

Основные положения выносимые на защиту.

- штамм О. гИто1гасИеа1е «Задонский-1» №130 ДЕП, депонированный в коллекции ФГУ «ВГНКИ»;

- результаты изучения биологических свойств референтных штаммов и выделенных изолятов О. гИ1по1гасИеа1г;

- питательная среда для получения биомассы бактерий О. гЫпо1гасИеа1е\

- антигенное родство выделенных изолятов;

- способы хранения возбудителя орнитобактериоза птиц в лабораторных условиях.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и опубликованы в материалах научных конференций: «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» посвященная памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. (г. Покров, 2009 г.), VII Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (г. Москва, 2010 г.), «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященная 30-летию создания СМУ ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2010 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2007-2010 гг.

Публикации научных работ. По теме диссертационной работы опубликовано 7 научных работ в журналах и материалах научных конференций, 3 из них в изданиях рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Нуклеотидное секвенирование осуществлялось сотрудниками лаборатории диагностики вирусных болезней птиц ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Место выполнения работы. Исследования по диссертационной работе выполнены в 2007-2010 гг. в соответствии с планами НИР в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения. Список литературы включает 143 источника, в том числе 115 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована II рисунками и 17 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории микробиологии, лаборатории микробиологии кормов и пищевых продуктов, лаборатории диагностики вирусных болезней птиц и лаборатории эпизоотологии и гриппа птиц ФГУ «ВНИИЗЖ» за оказание консультационно-методической помощи.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. Штаммы бактерий. В работе использовали следующие референтные штаммы бактерий, полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС): О. rhinotracheale №51463 (типовой), О. rhinotracheale №51464, О. rhinotracheale №51465, Pasteurella multocida №15742, Mannheimia haemolytica №29699, Actinobacillus pleuropneumoniae №27088, Haemophilus parasuis №19417 и референтные штаммы, полученные из коллекции ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»: О. rhinotracheale «Задонский-1» №130 ДЕП (выделенный и депонированный в ФГУ «ВНИИЗЖ»), Salmonella enteritidis №7. Три изолята бактерий О. rhinotracheale «Т-1», «Кр-1», «Б-1», полученные из патологического материала от птиц сотрудниками лаборатории микробиологии кормов и продуктов питания ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Подопытные животные. В экспериментальной работе использовали следующие виды и возрастные группы лабораторных животных:

- бройлеры, возраст 21-30 суток, для определения патогенных свойств и вирулентности возбудителя орнитобактериоза птиц;

- СПФ-цыплята, возраст 14 суток, для определения патогенных свойств бактерий вида О. rhinotracheale;

- кролики, массой 2,5-3,0 кг, для полунения специфических и нормальных сывороток крови.

Питательные среды. Для изучения культуральных свойств бактерий О. rhinotracheale использовали следующие питательные среды: мясо-пептонный бульон (МПБ); МПБ с добавлением экстракта пекарских дрожжей (10% от объема среды) (МПБД); мясо-пептонный агар (МПА); мясо-пептонный полужидкий агар (ПЖА); бульон на основе мясного перевара по Хоттингеру (с содержанием 250-300 мг% аминного азота) (ХБ); ХБ с добавлением 10% экстракта пекарских дрожжей (ХБД); бульон Когана; 1,5% агар на основе мясного перевара по Хоттингеру (ХА); ХА с добавлением дефибринированной крови барана (5-10% от объема среды) (КА); ХА с добавлением экстракта эритроцитов крови лошади (10% от объема среды) (ХКЭ); ХА с добавлением экстракта пекарских дрожжей (10% от объема среды) и 40% раствора глюкозы (0,3% от объема среды) (ХДЭ); ХА с добавлением экстракта пекарских дрожжей (10% от объема среды), экстракта эритроцитов крови лошади (10% от объема среды), сыворотки крови крупного рогатого скота 1-й категории (5% от объема среды), 40% раствора глюкозы (0,3% от объема среды) (ХФ); ХА с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота 1-й категории (10% от объема среды) (XSB); ХА с добавлением сыворотки крови цыплят (10% от объема среды) (XSA); соевоказеиновый агар (СК); бульон Тодца-Хевита (БТХ); агар МакКонки; агар Эндо; PPLO агар, приготовленный из основы PPLO бульона «Difco PPLO Broth» (PPLOA); PPLO агар с добавлением 10% экстракта пекарских дрожжей, экстракта эритроцитов крови лошади (10% от объема среды), сыворотки крови крупного рогатого скота 1 -й категории (5% от объема среды), 40% раствора глюкозы (0,3% от объема среды) (PPLOF); PPLO бульон с аргинином (РРВА).

Приготовленные питательные среды хранили в защищенном от света месте при 4°С не более 14 дней.

Сыворотку крови крупного рогатого скота 1-й категории, 40% раствор глюкозы и экстракт пекарских дрожжей (производства ФГУ «ВНИИЗЖ») добавляли непосредственно перед использованием среды. В плотные питательные среды их вносили в расплавленный агар, охлажденный до температуры 40-45°С.

Отбор проб патологического материала для бактериологического исследования. Материал для бактериологического исследования отбирали от вынужденно убитой или павшей птицы (различных возрастов).

Для исследования отбирали экссудат из перикардиальной полости, содержимое воздухоносных мешков и синусов, выделения из носовой полости, смывы с трахеи; паренхиматозные органы - легкие, селезенку, печень и головной мозг.

Изучение биологических свойств микроорганизмов. Культурально-морфологические свойства штаммов и изолятов бактерий изучали при выращивании на различных жидких, полужидких и плотных питательных средах с добавлением и без добавления различных питательных веществ.

При изучении морфологических свойств штаммов и при выделении чистой культуры посевы на плотные питательные среды производили по методу Дригальского.

Для определения биохимических свойств использовали культуры орнитобактерий, выросшие на плотной питательной среде, через 48 часов инкубации при 37"С, среды Гисса, системы индикаторные бумажные (СИБ) для идентификации микроорганизмов, карты GN (для идентификации грамотрицательных микроорганизмов, не требовательных к составу питательной среды) и NH (для микроорганизмов, требовательных к составу питательной среды) для бактериологического анализатора Vitek2 Compact (bioMerieux, Франция), наборы API 20Е (bioMerieux, Франция).

Культуру, выросшую на плотной питательной среде, смывали стерильным 0,85%-м раствором поваренной соли и доводили концентрацию бактериальной суспензии до 50 ед. мутности по оптическому стандарту. Эту суспензию использовали в соответствии с наставлением по применению систем индикаторных бумажных (СИБ) и высевали на среды Гисса.

На приборе Vitek2 Compact и в наборах API 20Е использовали концентрации бактерий в соответствии с инструкцией по применению.

Каталазную активность определяли с помощью 1% раствора перекиси водорода. Образование сероводорода определяли посредством высева культуры бактериологической петлей на ПЖА и последующим нанесением на поверхность среды соответствующего индикаторного диска. Подвижность орнитобактерий определяли высевом бактериальной культуры в ПЖА уколом бактериологической петлей. Посевы инкубировали от 30 минут до 24 часов при температуре 37°С [Gerhardt P. etal., 1981].

Чувствительность орнитобактерий к антибактериальным препаратам определяли диско-диффузионным методом в соответствии с "Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам" (МУК 4.2.1890-04).

Патогенные свойства орнитобактерий изучали посредством экспериментального заражения восприимчивых животных (цыплят-бройлеров) в инфраорбитальные синусы и брюшные воздухоносные мешки для подбора оптимальных путей заражения.

Для определения концентрации суспензии орнитобактерий экспериментально заражали цыплят-бройлеров в возрасте 24-25 суток в подглазничные синусы О. rhinotracheale в объёме 0,5 см3 десятикратными разведениями суспензии 48-часовой агаровой культуры возбудителя. Из расчета по 10 голов цыплят-бройлеров на одно 10-кратное разведение.

Наличие антител в сыворотках крови цыплят-бройлеров к орнитобактериям проверяли в коммерческом наборе ИФА (IDEXX) перед заражением и на 14 сутки.

За клиническим состоянием подопытной птицы вели наблюдение в течение 14 суток. Павшую и вынужденно убитую птицу вскрывали, проводили отбор проб патологического материала для бактериологического анализа с целью подтверждения специфичности заболевания и определения диссеминации возбудителя в организме. В качестве материала для бактериологического исследования отбирали: легкие, селезенку, печень, головной мозг, смывы с трахеи, инфраорбитапьных синусов и воздухоносных мешков.

Патогенные свойства референтных штаммов и полевых изолятов О. rhinotracheale изучали на СПФ-цыплятах в возрасте 14 суток и цыплятах-бройлерах в возрасте 25 суток. Наблюдение за птицей вели в течение 14 дней.

Патогенные свойства штаммов орнитобактерий оценивали при помощи бальной системы [Р. van Empel et al., 1996], основанной на проявлении тяжести видимых патологоанатомических изменений, наблюдаемых при вскрытии через 14 дней после экспериментального заражения.

Культуру считали патогенной в случае гибели или наличия у зараженной птицы соответствующих патологических изменений в период наблюдения 14 суток.

Филогенетические свойства изучали с помощью секвенирования гена 16S рРНК. ДНК из исследуемой культуры О. rhinotracheale выделяли с помощью магнитных частиц MagneSil на автоматической станции Freedom EVO 100. Постановку ПЦР проводили по стандартной методике с использованием фермента Taq DNA Polymerase. Очищенные фрагменты гена 16S рРНК секвенировали на генетическом анализаторе ABI Prism 3130 с использованием праймеров OR16S-R1 и OR16-F1 (концентрация 5 пМ/мкл каждого праймера в смеси). Полученные последовательности сравнивали с аналогичными последовательностями из GenBank.

Получение специфических компонентов для постановки серологических реакций. Антигены бактерий для гипериммунизации кроликов и для серологических реакций получали по методам описанным О. Erganis и A. Back [О. Erganis et al., 2002; A. Back et al., 1998]. Антиген, предназначенный для иммунизации животных, хранили без консерванта при 4°С, в то время как антигены, предназначенные для использования в серологических реакциях, консервировали раствором мертиолята (1:10 000) и хранили при 4°С.

Гипериммунизацию кроликов формалинизированным антигеном (Ф-АГ) О. rhinotracheale проводили в соответствии с методикой описанной О. Erganis [О. Erganis et al., 2002].

Определение антигенного родства изолятов бактерий О. rhinotracheale.

Степень двустороннего антигенного родства (R) по соматическому антигену определяли в реакции агглютинации, рассчитывали по формуле Архетги и Хорсфала [J. Archetti, F.L. Horsfall, 1950] и выражали в процентах.

При 3-кратном титровании значение R > 70% свидетельствует о родстве испытуемых изолятов.

Определение концентрации микробных клеток. Концентрацию микробных клеток в бактериальных суспензиях определяли визуально по стандарту (эталону) мутности или по МакФарленду. Концентрацию живых микробных клеток определяли методом титрования на плотной питательной среде и выражали в колониеобразующих единицах.

Культивирование орнитобактерий проводили методами поверхностного и периодического глубинного культивирования. Поверхностное культивирование

и

проводили на поверхности плотной питательной среды для изучения культуралыю-морфологических свойств бактерий, получения антигенов для иммунизации животных и постановки серологических реакций.

В ходе изучения динамики роста графически описывали кривые изменения концентрации микробных клеток в процессе культивирования, а также определяли фазы роста бактерий и их продолжительность.

При определении основных параметров роста бактерий учитывали удельную скорость роста, время удвоения концентрации живых микробных клеток, максимальное накопление бактерий в питательной среде и время культивирования орнитобактерий.

Расчет показателя удельной скорости роста микроорганизмов производили по общепринятой методике [С.Дж. Перт, 1978].

Подбор условий и способов хранения орнитобактерий. Хранение штаммов орнитобактерий в лабораторных условиях осуществляли путем замораживания штаммов орнитобактерий при температуре минус 40°С и минус 20°С, лиофильного высушивания культур, а также методом субкультивирования на плотных и жидких питательных средах. При хранении проводили количественную оценку выживаемости бактерий.

При хранении на плотных и жидких питательных средах выживаемость микроорганизмов оценивали качественно. С этой целью бактериальные культуры высевали на плотные питательные среды. Посевы инкубировали при 37°С в течение 48 часов.

Статистическая обработка результатов. При анализе и обработке результатов исследований были использованы статистические методы, описанные И.П. Ашмариным и A.A. Воробьевым (1962).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Бактериологический анализ патологического материала. Первым этапом данной работы было исследование патологического материала от вынужденно убитой и павшей птицы. Материал поступал из различных регионов РФ: Белгородской, Вологодской, Владимирской, Нижегородской, Новгородской, Самарской, Московской, Костромской, Ярославской, Ульяновской, Липецкой, Тульской, Пермской, Челябинской, Курской, Ростовской, Ленинградской, Кировской областей и республик: Мордовия, Чувашия, Татарстан, Башкортостан.

За период с 2007 по 2010 гг. исследовано 410 проб патологического материала от заболевших кур и индеек различных возрастов на наличие возбудителя орнитобактериоза птиц. Получено 19 изолятов орнитобактерий. На основании исследования биохимических свойств изолятов, в дальнейшем для работы использовали изоляты «Т-1», «Кр-1», «Б-1» и штамм №130 ДЕП.

В лабораторию доставляли как живую птицу на разных стадиях заболевания, так и патологический материал от павшей и вынужденно убитой птицы.

Схема бактериологического исследования патологического материала на орнитобактериоз птиц представлена на рис. 1.

В качестве патологического материала для исследования на наличие возбудителя орнитобактериоза птиц отбирали кровь из сердца, смывы с трахеи, подглазничных синусов и воздухоносных мешков, пораженные легкие, экссудат из перикардиальной полости, суставную жидкость, селезенку, печень и головной мозг.

Посевы из органов (отпечатки), экссудата и смывов проводили на плотные питательные среды (ХА, Эндо или МакКонки, КА или ХФ, ХКЭ). Также первичный посев делали на жидкие питательные среды (ХБ, МПБ). Рост учитывали через 24-72 ч инкубирования в аэробных условиях при 37°С.

Возбудитель орнитобактериоза птиц был выделен только из легких и инфраорбитальных синусов птицы с респираторным синдромом.

После инкубирования посевов патологического материала выросшие культуры просматри^али^изуальноТГмикроскопировали мазки из подозрительных "колоний—под—иммерсией при х2000, наблюдали мелкие грамотрицательные полиморфные палочки. Изолированные колонии с КА, ХКЭ, ХФ, характерные по тинкториапьным и морфологическим свойствам для О. гкто1гаскеа1е (через 48 часов инкубации округлые, выпуклые, прозрачные или полупрозрачные с ровными краями колонии, диаметром около 0,2-1 мм), пересевали на КА, ХКЭ или ХФ для получения чистой культуры.

Рис. 1. Схема бактериологического исследования на орнитобактериоз

птиц

Для установления принадлежности к виду О. rhinotracheale исследовали биохимическую активность подозрительных культур, их серологические свойства в РА на стекле, а также проводили постановку ПЦР. Для дальнейшей работы были отобраны изоляты бактерий О. rhinotracheale, обладающие различиями между собой по биохимическим свойствам. Изолят О. rhinotracheale «Т-1» был выделен из легкого цыпленка-бройлера 30-суточного возраста, «Кр-1» был выделен из

инфраорбитальных синусов индейки 105-суточного возраста, «Б-1» выделен из инфраорбитальных синусов цыпленка-бройлера 32-суточного возраста. Штамм «Задонский-1» №130 ДЕП был выделен из легких цыпленка-бройлера 24-суточного возраста.

Основные биологические свойства референтных штаммов и изолятов бактерий О. гМпо1гасНеа1е. На данном этапе работы были изучены культурально-морфологические и биохимические свойства бактерий О. гЫпо1гасИеа1е изолятов «Т-1», «Кр-1», «Б-1» и штамма «Задонский-1» №130 ДЕП в сравнении с референтными штаммами №№ 51463, 51464, 51465.

При окраске по Граму в фиксированных мазках культур О. гЫпоШскеак всех выделенных изолятов наблюдали мелкие, тонкие, полиморфные, грамотрицательные палочки, расположенные одиночно или парами. Окраск изолятов орнитобактерий по Бурри-Гинсу и Ольту показала отсутствие капсулы. Рост на ПЖА всех изолятов О. гЫпо1гаскеа1е строго по уколу свидетельствовал об отсутствии жгутиков.

Референтные штаммы и изоляты орнитобактерий росли на КА, ХКЭ, ХДЭ, ХФ, Х8В, ХБА, ХБ, ХБД через 24-48 часов инкубации. На СК, ХА только через V часа инкубации. На МПБ, МПА, МПБД, БТХ, агаре МакКонки, среде Эндо рос орнитобактерий отсутствовал. На РРВА рост орнитобактерий наблюдали через 4 часов инкубирования в виде небольшого помутнения. Выделенные изоляты н обладали гемолитической активностью на КА.

Морфологию колоний изолятов О. гЫпоРасИеак определяли пр выращивании на ХФ и КА, через 24-48 ч инкубирования в термостате при 37°С Колонии изолятов О. гИто!гасИеа1е через 24 часа инкубирования был прозрачными, правильной круглой формы, блестящие, диаметром не более 0,2 мм через 48 часов инкубации круглые, блестящие, края ровные, полупрозрачные диаметром около 0,5-0,7 мм.

При изучении биохимических свойств изолятов орнитобактери посредством наборов СИБ и сред Гисса было отмечено, что все изоляты имею положительную реакцию по оксидазе, р-галактозидазе, лактозе и О-маннозе Отрицательные результаты наблюдали в реакциях на орнитиндекарбоксилазу лизиндекарбоксилазу, цитрат и малонат натрия, окисление арабинозы, инозита сорбита, на образование индола и сероводорода, а также на уреазную активность

Штамм «Задонский-1» №130 ДЕП отличался от других изолятов положительной реакцией по окислению сахарозы и маннита. Изоляты «Т-1» и «Б-1» отличались положительной реакцией по аргининдегидролазе. Изоляты «Т-1», «Б-1», штамм «Задонский-1» №130 ДЕП, в отличие от изолята «Кр-1», показали положительный результат по окислению мальтозы. Изолят «Б-1» не окислял D-глюкозу.

При изучении биохимических свойств изолятов орнитобактерий на бактериологическом анализаторе Vitek2 Compact, с использованием карт GN было отмечено, что все они обладают одинаковой биохимической активностью. Изоляты О. rhinotracheale «Т-1» и «Б-1» окисляли D-мапьтозу в отличие от других. Изоляты «Т-1» и «Кр-1» ферментировали D-глюкозу в отличие от остальных изолятов. Изолят «Б-1» также отличался от других изолятов отрицательной реакцией по липазе. Изолят «Задонский-1» №130 ДЕП в отличие от других изолятов показал отрицательную реакцию по D-маннозе и положительную реакцию по окислению сахарозы.

При исследовании биохимических свойств изолятов орнитобактерий на бактериологическом анализаторе с использованием карт NH установили различия между изолятами и штаммами. Штамм «Задонский-1» №130 ДЕП отличался от других выделенных изолятов положительной реакцией по у-глютамилтрансферазе и отрицательной по окислению D-глюкозы, D-мальтозы и N-auemn-D-глюкозамину. Изолят «Кр-1» отличался от других изолятов положительной реакцией по L-лизинариламидазе.

При исследовании биохимических свойств изолятов орнитобактерий с использованием систем API 20Е наблюдали идентичные биохимические свойства у всех штаммов и изолятов О. rhinotracheale.

При определении чувствительности изолятов О. rhinotracheale к антибактериальным препаратам было установлено, что выраженным антибактериальным действием обладают цефалоспорины III поколения (цефоперазону), полусинтетические аминопенициллины (ампициллин), ингибиторозащищенные пенициллины (амоксициллин клавуланат), фторхинолоны III поколения (байтрил) и группа левомицетина (левомицетин).

Патогенные свойства О. rhinotracheale. Результаты опытов показали, что орнитобактериоз птиц удалось воспроизвести при способах заражения птицы в инфраорбитальные синусы и брюшные воздухоносные мешки. Тем не менее, в

дальнейших экспериментах по изучению патогенных свойств О. гЫпо1гасИеа1е мы пользовались только методом заражения в инфраорбитальные синусы, как наиболее удобным и максимально приближенным к естественному пути заражения птицы. Установлено, что для полноценного воспроизведения орнитобактериоза птиц в лабораторных условиях, концентрация живых микробных клеток в используемой суспензии должна составлять не менее 3,0х109 КОЕ/см3.

Патогенность изолятов О. г!ипо1гасИеа1е «Т-1», «Кр-1», «Б-1» и штаммов №№51463, 51464, 51465, «Задонский-1» №130 ДЕП оценивали при экспериментальном заражении в подглазничные синусы цыплят мясных кроссов 21-30-суточного возраста в концентрации бактерий 5,0х109 КОЕ/см3 и СПФ-цыплят 14-суточного возраста в концентрации бактерий 1,0x10'° КОЕ/см3. Наблюдение за экспериментально зараженной птицей показало, что все изоляты и штаммы вызывали клинические и патологоанатомические изменения, которые в полевых условиях можно было спутать с другими заболеваниями респираторного тракта.

У экспериментально зараженных цыплят мясных кроссов 21-30 суточного возраста наблюдали стертые респираторные клинические признаки. Начало падеж птицы наблюдали при экспериментальном заражении штаммом О. гИто1гасИеа1е «Задонский-1» №130 ДЕП на 3 день после заражения, при введении возбудителя концентрации живых микробных клеток 6,6x10" КОЕ/см3. В остальных случая падеж не наблюдали.

При вскрытии павшей и вынужденно убитой на 14 сутки птицы, заражение штаммом О. гИто^аскеак «Задонский-1» №130 ДЕП, наблюдали следующи патологоанатомические изменения: катаральные и серозные синуситы, трахеиты одно- или двустороннюю крупозную пневмонию в стадии красной гепатизации серозные аэросаккулиты и редкие случаи гидроперикардита. При вскрытии птицы зараженной изолятом «Т-1», наблюдали катаральные синуситы, трахеиты и оте легких. Вскрытие птицы, зараженной изолятом «Кр-1», показало катаральны синуситы, трахеиты и крупозное воспаление легких. При экспериментально; заражении бактериями штаммов №№51463, 51464, 51465 наблюдали катаральные серозные синуситы, трахеиты, одно- или двустороннюю крупозную пневмонию стадии красной гепатизации, единичные случаи аэросаккулитов гидроперикардита.

При экспериментальном заражении СПФ-цыплят !4-сугочного возраста штаммом О. гЫпо1гасИеа1е «Задонский-1» №130 ДЕП наблюдали наиболее тяжелые патологоанатомические поражения в отличие от остальных изолятов, общая сумма баллов была равна 24. При экспериментальном заражении СПФ-цыплят суспензиями полевых изолятов «Т-1», «Кр-1», «Б-1», а также референтного штамма №51463, среди опытной птицы наблюдали схожую тяжесть патологоанатомических изменений около 18 баллов. Было установлено наличие положительных титров антител к О. гШпо1гасИеа1е в сыворотках крови птиц опытных групп в ИФА.

Возбудитель болезни был изолировал из пораженных легких, реже из инфраорбитальных синусов и трахеи.

Таким образом, на основании патологоанатомических изменений и результатов бактериологического исследования можно заключить, что на территории РФ циркулируют патогенные изоляты О. гЫпо1гасИеа1е, вызывающие заболевание восприимчивой птицы в экспериментальных условиях.

Определение филогенетических свойств, выделенных изолятов О. гЫпо(тас1геа1е. При изучении нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК установлено, что все выделенные изоляты были близкородственны с уровнем идентичности 99-100%. В результате сравнения с аналогичными последовательностями изолятов и штаммов О. гИ1П01гасИеа1е из ОепВапк российские изоляты были генетически наиболее близки к РТ-8В930803-Е2 и СУ200505Ь2, выделенным в Тайване, а также референтному штамму АТСС-51464. Изоляты «Б-1», «Кр-1», «Т-1» были полностью идентичны изолятам Ш7100, АТСС-5М64, ОЯ-К, тогда как штамм «Задонский-1» №130 ДЕП не имел полной идентичности ни с одним из зарубежных изолятов.

Подбор условий культивирования орнитобактерий. В исследованиях использовали ХБ, ХБД и РРВА. Оценку питательных сред проводили комплексно -изучали динамику и определяли основные параметры роста орнитобактерий на примере штамма №51463. Также проводили сравнение динамики роста орнитобактерий в стационарных условиях и при культивировании на УВМТ-12-250 (при шуттелировании), кроме того изучали ростстимулирующее влияние экстракта пекарских дрожжей.

Кривые динамики роста орнитобактерий на различных питательных средах представлены на рисунке 2.

п=3

Время культивирования (1), ч [ - - -БХ БХД--РРВА БХ(термостат) ^

Рис. 2 Динамика роста О. гМпо(гас1геа1е на различных питательных

средах.

Было установлено, что наилучшими ростовыми свойствами обладаю питательные среды на основе ХБ. При выращивании бактерий на данны: питательных средах отмечали высокие показатели удельной скорости рост (0,39±0,04, 0,32±0,02 ч"'), продолжительную экспоненциальную фазу роста (6-! часов) и большое накопление орнитобактерий (8,23±0,03; 8,22±0,09 ^ КОЕ/см3).

Изучено ростстимулирующее влияние экстракта пекарских дрожжей н динамику роста бактерий О. гЫпо1гасИеа1е при его добавлении к ХБ. При это» отмечали увеличение удельной скорости роста на 43,8% (0,73 ч"1), сокращены экспоненциальной фазы до 6 часов, увеличение максимального выхода биомасс; до 8,40 1ё КОЕ/см3.

Культивирование орнитобактерий на ХБ в УВМТ-12-250 позволяет получит] максимальное накопление биомассы (8,36 ^ КОЕ/см3) через 8 часо! культивирования, что в 1,5 раза превышает максимальный выход пр)

культивировании в стационарных условиях (8,23 ^ КОЕ/см3), полученный через 10 часов культивирования.

Получение специфических компонентов для серологических реакций.

Формапинизированный антиген (Ф-АГ) и специфические сыворотки крови кролика получали по методикам, изложенным в предыдущих разделах.

При постановке качественной РА на стекле, реакцию наблюдали лишь между специфическими компонентами одного вида. В количественной РА все компоненты были высоко активны и специфичны.

Показано, что сыворотки гомологичные О. гИто^асИеЫе имели титр от 21±5 до 1024.

Полученные специфические компоненты позволяют проводить качественную РА на стекле и количественную РА для идентификации культур орнитобактерий.

Определение антигенного родства орнитобактерий. На данном этапе работы для определения антигенного родства использовали Ф-АГ из референтных штаммов О. гИшо1гасИеа1е из АТСС. Серотипирование проводили в РА посредством перекрестного титрования сывороток сравниваемых штаммов с гомологичными и испытуемыми антигенами.

Установлено, что изолят «Кр-1» родственен штаммам №№ 51463, 51464, изолят «Б-1» родственен штамму №51464. Изолят «Т-1» и штамм «Задонский-1» №130 ДЕП не родственны ни одному из референтных штаммов.

Определение условий и сроков хранения штаммов О. г1йпоиасИеа1е. С этой целью изучали выживаемость бактерий в процессе хранения методом субкультивирования, замораживания на минус 40°С и минус 20°С и в лиофилизированном виде. В ходе проведенных опытов было установлено, что хранение бактерий О. гИто1гасИеа!е в лиофилизированном виде обеспечивало сохранность исходных биологических свойств штаммов в течение 12 месяцев (срок наблюдения).

4. ВЫВОДЫ

1. Впервые выделены изоляты О. гЫпо1гасИеа1е от птиц, поступавших из различных регионов РФ, и изучены их основные биологические свойства

2. Изучены генетические свойства изолятов орнитобактерий. Установлена идентичность последовательностей гена 16S рРНК изолятов «Кр-1», «Т-1» и «Б-1» с изолятами из Тайваня: PT-SB930803-E2, CY200505L2 и зарубежным штаммами U87100, АТСС-51464, OR-IR. Последовательность гена 16S рРНК штамма «Задонский-1» №130 ДЕП отличалась от последовательностей генов зарубежных штаммов, содержащихся в базе данных GenBank.

3. Обоснована рецептура питательной среды на основе мясного гидролизата по Хоттингеру (с содержанием аминного азота 250-300 мг%) и определен оптимальный способ культивирования О. rhinotracheale (в динамических условиях), что позволяет через 6 часов культивирования получить максимальный выход бактериальной массы (8,40 lg КОЕ/см3).

4. Установлено, что лиофильное высушивание орнитобактерий в сахарозо-желатозной среде и последующее хранение при минус 40°С в течение 12 месяцев (период наблюдения) не изменяет их биологических свойств.

5. Определена заражающая доза (ЗхЮ9 КОЕ/см3) у цыплят, необходимая дл воспроизведения орнитобактериоза птиц. Было показано, что гибель цыплят наиболее тяжелые поражения вызывал штамм «Задонский-1» №130 ДЕП.

6. Роль О. rhinotracheale в этиологии респираторной патологии кур был подтверждена при экспериментальном заражении, при котором у птиц опытны групп наблюдали развитие пневмонии, трахеита и синусита.

7. Впервые в РФ получены специфические компоненты О. rhinotracheale определена степень антигенного родства изолятов между собой и по отношению референтным штаммам. Изолят «Кр-1» родственен референтным штамма №№51463, 51464, изолят «Б-1» - штамму №51463, в то время как, изолят «Т-1» штамм «Задонский-1» №130 ДЕП не родственны ни одному из референтны штаммов.

8. Установлено, что выделенные изоляты О. rhinotracheale чувствительны аминопенициллинам, ингибиторозащищенным пенициллинам, фторхинолонам II поколения, группе левомицетина, группе нитрофурановых препаратов цефалоспоринам III поколения.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Для практического использования предложены «Методически рекомендации по лабораторной диагностике орнитобактериоза птиц>

утвержденные Заместителем руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору. Данная методика позволяет проводить выделение орнитобактерий из патологического материала и их идентификацию.

Штамм «Задонский-1» №130 ДЕП депонирован в коллекции бактериальных культур ФГУ «ВГНКИ» и используется при производстве набора для выявления антител к О. rhinotracheaíe в ИФА.

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чернышов A.B., Прунтова О.В., Ручнова О.И. Патогенные свойства Ornitobacterium rhinotracheaíe при экспериментальном заражении цыплят-бройлеров // Вестник ветеринарии. - 2010. -№55. - С. 45-49.

2. Чернышов A.B., Ручнова О.И., Прунтова О.В. Подбор питательной среды и условий культивирования Ornithobacterium rhinotracheaíe II Ветеринария и кормление.-2010.-№6.-С. 52-53.

3. Генетическая характеристика бактерий Ornithobacterium rhinotracheaíe, выделенных на птицеводческих хозяйствах Российской Федерации / Чернышов A.B., Спрыгин A.B., Ручнова О.И., Мудрак Н.С., Прунтова О.В., Дрыгин В.В. // Сб. тр. VII Всерос. конф. с междунар. участием «Молекулярная диагностика -2010». - Москва, 2010. - Т.2. - С. 191-192.

4. Чернышов A.B., Ручнова О.И., Прунтова О.В., Шадрова Н.Б. Биологические свойства штаммов Ornithobacterium rhinotracheaíe II Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2010. - Т.8. - С. 204-213.

5. Чернышов A.B., Ручнова О.И. Изучение биологических свойств штамма «3-1» Ornithobacterium rhinotracheaíe, выделенного на территории РФ // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2009. - Т.7. - С. 202-209.

6. Чернышов A.B., Прунтова О.В., Шадрова Н.Б. Биохимические свойства Ornithobacterium rhinotracheaíe II Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины / Всерос. науч.-исслед. ин-т ветеринар, вирусологии и микробиологии.-Покров, 2009.—С. 166-168.

7. Genetic characterization of Ornithobacterium rhinotracheale from commercial chicken flocks in Russia / Chernyshev A.V., Sprygin A.V, Mudrak N.S. [et al.] // MEEGID X Congress. - Amsterdam, the Netherlands, 2010.

Подписано в печать 17.03.2011 г. Заказ № 4 Формат 60x90/16. Усл. печ. л.1. Тираж 90 экз. Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Чернышов, Анатолий Викторович

аминного азота 250-300мг%) с добавлением экстракта пекарских дрожжей;

ХДЭ — агар на основе мясного гидролизата по Хоттингеру с добавлением 10% экстракта пекарских дрожжей;

ХКЭ - агар на основе мясного гидролизата по Хоттингеру с добавлением 10% эритроцитов крови лошади;

ХФ — агар на основе мясного перевара по Хоттингеру с добавлением экстракта пекарских дрожжей, эритроцитов крови лошади, сыворотки крови крупного рогатого скота I категории и 40%-ного раствора глюкозы;

АТСС - Американская коллекция типовых культур;

API — analytical profile index — аналитический индекс профилей;

GN — gram-negative identification card — карты для идентификации ферментирующих и неферментирующих грамотрицательных палочек;

NH — Neisseria-Haemophilus identification card — карты для идентификации клинически значимых прихотливых микроорганизмов;

PPLO - среда для культивирования плевропневмониеподобных микроорганизмов;

РРВА - PPLO-бульон с добавлением аргинина; PPLOA - PPLO-arap; РРЬОБ - PPLO-бульон;

PPLOF - PPLO-arap с добавлением 10% экстракта пекарских дрожжей, эритроцитов крови лошади, сыворотки крови крупного рогатого скота 1-й категории, 40%-ного раствора глюкозы; SDS - sodium dodecyl sulfate - додецил сульфат натрия;

XSA - агар на основе мясного перевара по Хоттингеру с добавлением сыворотки крови цыплят;

XSB - агар на основе мясного перевара по Хоттингеру с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота 1-й категории.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.^.

1.1. Роль О. гМпо(гаскеа1е в патологии птиц.

1.2. Характеристика бактерий вида О. гМпо1гаскеа1е.

1.2.1. Классификация и таксономия.

1.2.2. Тинкториальные свойства.

1.2.3. Культурально-морфологические и биохимические свойства.

1.2.4. Патогенные свойства.

1.2.5. Серологические свойства.

1.3. Эпизоотологические особенности, клиническое проявление и патологоанатомические изменения при орнитобактериальной инфекции.

1.4. Дифференциальная диагностика орнитобактериальной инфекции от других болезней бактериальной этиологии.

1.4.1. Риемереллез уток.

1.4.2. Пастереллезы.

1.4.3. Инфекционный ринит.:.

1.4.4. Бордетеллиоз (ринит индеек).

1.4.5. Колибактериоз.

1.5. Методы лабораторной диагностики орнитобактериоза птиц.

1.5.1. Бактериологическое исследование.

1.5.2. Серологическое исследование.

1.5.3. Иммуногистохимическое исследование.

1.5.4. Молекулярно-биологические исследования.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Биологические свойства бактерий Ornithobacterium Rhinotracheale, выделенных на территории Российской Федерации"

Актуальность темы. Заболевания респираторного тракта животных являются одной из важнейших проблем в ветеринарии. В частности, к ним относится и орнитобактериоз птиц. Особый интерес ветеринарных врачей к данному заболеванию обусловлен скудностью информации и сложностью его диагностики.

Возбудителем орнитобактериоза птиц являются бактерии семейства Flavobacteriaceae, рода Ornithobacterium, вида Ornithobacterium rhinotracheale [39, 87]. Заболевание относится к высоко контагиозным и характеризуются респираторным синдромом.

Орнитобактерии относятся к паразитическим микроорганизмам и могут вызывать заболевание как самостоятельно, так и в ассоциации с другими инфекциями вирусной, бактериальной или микоплазмозной этиологии [6, 42, 87, 139].

Впервые орнитобактерии были выделены в 1981 году в Германии, от индеек, имели сходные характеристики с представителями рода Pasteurella, поэтому были отнесены к пастереллоподобным микроорганизмам. Более подробно эти бактерии были описаны в 1991 году Jan DuPreez, а в 1994 году вынесены Vandamme et al. в новый вид бактерий, названный Ornithobacterium rhinotracheale [42, 91, 101].

По данным зарубежной литературы в настоящее время бактерии О. rhinotracheale широко распространены в промышленных птицеводческих хозяйствах и среди дикой птицы (утки, гуси, чайки, страусы, фазаны, голуби и т.д.) многих стран, таких как Нидерланды, Франция, США, Южная Африка, Великобритания, Испания и др. [3, 4, 14, 15, 27, 47, 55, 60, 64, 91]. В то же время данные по орнитобактериозу в РФ ограничиваются только результатами серологических исследований, которые свидетельствуют о возможной циркуляции О. rhinotracheale на территории страны. Мониторинговые исследования и учет орнитобактериальной инфекции в РФ не проводятся, а также отсутствуют нормативные документы по диагностике данного возбудителя [4, 15].

К орнитобактериозу среди домашней птицы восприимчивыми являются только индейки и куры.

Заболевание по основным клиническим и патологоанатомическим признакам имеет много общего с различными респираторными инфекциями: вирусной (например, метапневмовирусная инфекция, инфекционный бронхит кур, болезнь Ньюкасла и т.д.), микоплазмозной и бактериальной этиологии [3,4, 6, 8, 33,61,64,91, 109].

Специфическими признаками инфекции, вызванной О. rhinotra.chea.le, являются отставание в росте, серозно-фибринозные аэросаккулиты и одно-или двусторонние пневмонии.

Лечение орнитобактериоза антимикробными препаратами связано с определенными трудностями, так как большинство штаммов О. гЫпо&асЬеа1е невосприимчивы к широко распространенным антибиотикам [3, 15, 24, 44, 49, 62, 64, 83, 91].

Исходя из вышеизложенного можно заключить, что постановка вопроса о выделении изолятов О. гМпо&аскеа1е, циркулирующих на -территории РФ, изучении их биологических свойств с целью использования для изготовления диагностикумов и вакцин, является актуальной задачей, имеющей научное и практическое значение.

Цель и задачи исследований. Основной целью данных исследований было выделение и идентификация бактерий вида О. гМпо1таскеа1е из патологического материала от птиц, изучение их морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и патогенных свойств.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выделить изоляты бактерий О. гМпо&аскеа1е от птиц из птицеводческих хозяйств РФ.

2. Изучить биологические свойства изолятов О. гЫпо^аскеа1е, выделенных на территории РФ в сравнении с референтными штаммами.

3. Подобрать оптимальную питательную среду и условия для культивирования О. гЫпо1таскеа1е.

4. Подобрать оптимальные условия для длительного хранения штаммов О. гЫпо1таскеа1е.

5. Получить специфические компоненты бактерий О. гЫпо1гаскеа1е для постановки серологических реакций.

6. Определить антигенное родство между референтными штаммами и изолятами бактерий О. гЫпо1таскеа1е.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований патологического материала получены 19 патогенных изолятов О. гЫпо&аскеа1е, один из которых детально изучен, паспортизирован и депонирован как производственный штамм в коллекции бактериальных культур ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»).

Изучены биологические свойства 3 референтных штаммов и 4 полевых изолятов О. гЫпо№аскеа1е.

Изучена чувствительность полевых изолятов О. гЫпо&аскеа1е к широкому спектру антибактериальных препаратов.

Подобрана питательная среда и оптимальные условия для культивирования О. гМпо1гаскеа1е с целью получения большого объема биомассы.

Определены оптимальные условия и сроки хранения возбудителя орнитобактериоза птиц.

Установлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена 168 рРНК выделенных изолятов О. гЫпо^аскеа1е и заложены в базу данных вепБапк.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований впервые в РФ разработаны «Методические рекомендации по лабораторной диагностике орнитобактериоза птиц» (2010 г.), одобренные ученым советом ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и утвержденные Заместителем руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору в установленном порядке.

Штамм «Задонский-1» №130 ДЕП, депонирован в коллекции бактериальных культур ФГУ «ВГНКИ» и используется при производстве набора ИФА для выявления антител в сыворотке крови кур к О. гЫпо1гасЬеа1е.

В коллекцию бактериальных культур ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» после детального изучения' заложены следующие изоляты О. гМпо1гаскеа1е: «Т-1», «Кр-1», «Б-1». Основные положения выносимые на защиту.

- штамм О. гЫпо&аскеа1е «Задонский-1» №130 ДЕП, депонированный в коллекции ФГУ «ВГНКИ»;

- результаты изучения биологических свойств референтных штаммов и выделенных изолятов О. гЫпо^аскеа1е\

- питательная среда для получения- биомассы бактерий О. гЫпо1таскеа1е\

- антигенное родство выделенных изолятов;

- способы хранения возбудителя орнитобактериоза птиц в лабораторных условиях.

Апробация результатов работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и опубликованы в материалах научных конференций: «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» посвященная памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. (г. Покров, 2009 г.), VII Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная диагностика — 2010» (г. Москва, 2010 г.), «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященная 30-летию создания СМУ ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2010 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2007-2010 гг.

Публикации научных исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 7 научных работ в журналах и материалах научных конференций, 3 из них в изданиях рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Нуклеотидное секвенирование осуществлялось сотрудниками лаборатории диагностики вирусных болезней птиц ФГУ «ВНИИЗЖ».

Исследования по диссертационной работе выполнены в 2007-2010 гг в соответствии с планами НИР в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах компьютерного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 143 источника, в том числе 115 зарубежных. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 17 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Чернышов, Анатолий Викторович

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые выделены изоляты О. гЫп(Ягаскеа1е от птиц, поступавших из различных регионов РФ, и изучены их основные биологические свойства

2. Изучены генетические свойства изолятов орнитобактерий. Установлена идентичность последовательностей гена 168 рРНК изолятов «Кр-1», «Т-1» и «Б-1» с изолятами из Тайваня: РТ-8В930803-Е2, СУ200505Ь2 и зарубежным штаммами и87100, АТСС-51464, ОЯ-Ж. Последовательность гена 168 рРНК штамма «Задонский-1» №130 ДЕП отличалась от последовательностей генов зарубежных штаммов, содержащихся в базе данных ОепВапк.

3. Обоснована рецептура питательной среды на основе мясного гидролизата по Хоттингеру (с содержанием аминного азота 250-300 мг%) и определен оптимальный способ культивирования О. гЫпо1гаскеа1е (в динамических условиях), что позволяет через 6 часов культивирования получить максимальный выход бактериальной массы (8,40 1ё КОЕ/см3).

4. Установлено, что лиофильное высушивание орнитобактерий в сахарозо-желатозной среде и последующее хранение при минус 40°С в течение 12 месяцев (период наблюдения) не изменяет их биологических свойств.

О о

5. Определена заражающая доза (3x10 КОЕ/см ) у цыплят необходимая для воспроизведения орнитобактериоза птиц. Было показано, что гибель цыплят и наиболее тяжелые поражения вызывал штамм «Задонский-1» №130 ДЕП.

6. В этиологии респираторной патологии кур была подтверждена роль О. гЫпо1таскеа1е при экспериментальном заражении, при котором у птиц опытных групп наблюдали развитие пневмонии, трахеита и синусита.

7. Впервые в РФ получены специфические компоненты О. гШпо^аскеа1е и определена степень антигенного родства изолятов между собой и по отношению к референтным штаммам. Изолят «Кр-1» родственен референтным штаммам №№51463, 51464, изолят «Б-1» - штамму №51463, в то время как, изолят «Т-1» и штамм «Задонский-1» №130 ДЕП не родственны ни одному из референтных штаммов.

8. Установлено, что выделенные изоляты О. гЫпо1гаскеа1е чувствительны к аминопенициллинам, ингибиторозащищенным пенициллинам, фторхинолонам III поколения, группе левомицетина, группе нитрофурановых препаратов и цефалоспоринам III поколения.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются «Методические рекомендации по лабораторной диагностике орнитобактериоза птиц», утвержденные Заместителем руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору. Данная методика позволяет проводить выделение орнитобактерий из патологического материала и их идентификацию.

Штамм «Задонский-1» №130 ДЕП депонирован в коллекции бактериальных культур ФГУ «ВГНКИ» и используется при производстве набора для выявления антител к О. rhinotracheale в ИФА.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Чернышов, Анатолий Викторович, Владимир

1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. — Л.: Медгиз, 1962. —180 с.

2. Бакулов И.А., Васильев Д.А., Козлова Д.И. Пастереллёз, как зооантропонозная инфекция // Вопр. вет. микробиологии, эпизоотологии и вет.-сан. экспертизы: тез. докл. Ульяновск, 1994.- С. 26-32.

3. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц: пер. с англ. / под ред. Б.У. Кэлнека и др.. -М.: Аквариум Бук, 2003. -1232 с.

4. Борисенкова А.Н., Рождественская Т.Н. Респираторный синдром бактериальной этиологии у птиц // Ш Междунар. вет. конгр. по птицеводству. -М., 2007.-С. 176-181.

5. Биологические свойства пастерелл, выделенных при респираторном синдроме птиц / А.Н. Борисенкова, Т.Н. Рождественская, А.И. Лебедева, О.Б. Новикова // Рос. вет. журн. сельскохозяйственных животных. — 2007. — №3. -С. 39-40.

6. Борисова O.A., Борисова И.А. Метапневмовирусная инфекция птиц: обзор литературы. Владимир: ФГУ «ВНИИЗЖ», 2007. - 80 с.

7. Власкина О.В. Патоморфологическая характеристика патогенности Р. multocida различных серовариантов и их неочищенных экзотоксинов: автореф. диссертации канд. вет. наук. — М., 1999. — 23 с.

8. Доморадский И.В. Возбудители пастереллёзов и близких к ним заболеваний. М.: Медицина, 1971.-288с.

9. Запорожцев JI.H. Перспективы изучения и усовершенствования процессов культивирования патогенных микроорганизмов // ЖМЭИ. — 1981. -№8.-С. 19-25.

10. Инфекционные болезни животных / Б.Ф. Бессарабов, А.А. Ватутин, Е.С. Воронин и др.. -М.: КолосС, 2007. 671 с.

11. Инфекционная патология животных: 3 т. Т. 3 / под ред. А.Я. Самуйленко. -М.: РАСХН, 2009. 881 с.

12. Коровин Р.Н., Зеленский В.П., Грошева Г.А. Лабораторная диагностика болезней птиц. -М.: Агропромиздат, 1989. 256 с.

13. Ленгелер Й, Древе Г., Шлегель Г. Современная микробиология. Прокариоты: в 2 т. Т. 1 -М.: Мир, 2005. 656 с.

14. Лысый В.Г. Новое заболевание в комплексе респираторных проблем птиц. Орнитобактериальный ринотрахеит // Белорус, сельское хоз-во. — 2007. -№11.-С. 51-53.

15. Махмутова Л.Р., Макаров В.В. Ornithobacterium rhinotracheale: бактериология, патология, эпизоотология // Ветеринарная патология. 2006. — № 4. -С. 181-185.

16. Методические указания по лабораторной диагностике пастереллёза животных и птиц / Г.Е. Толяронок, А.С. Андрусевич, Р.П. Лизун и др.. Минск: РУП «Ин-т эксперим. ветеринарии им. С.Н. Вышелесского», 2009. — 24 с.

17. Методы общей микробиологии: в 3 т. Т.1 / Ф. Герхардт, Р.Г. Мюррей, Р.Н. Костилов и др.. М.: Мир, 1983. - 536 с.

18. Методы общей микробиологии: в 3 т. Т.З / Ф. Герхардт, Р.Г. Мюррей, Р.Н. Костилов и др.. М.: Мир, 1983. - 264 с.

19. Микробиологические и вирусологические методы в ветеринарной медицине: справ, пособие / А.Н. Головко, В.А. Ушкалов, В.Г. Скрыпник и др.. — Харьков: ХГМТ, 2007. 512 с.

20. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. Т. 1: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др.. -М.: Мир, 1997. 432 с.

21. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий: пер. с англ. / Р. Вейант, У. Мосс, Р. Уивер и др.. М.: Мир, 1999. -791 с.

22. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток: пер. с англ. -М.: Мир, 1978. 332 с.

23. Сонин П.Ф., Сухинин A.A. Ринотрахеит птиц, вызванный орнитобакгериями // Архив вет. наук. 2003. - Т.4, №51. — С. 1-9.

24. Хоменко H.A., Родионова Г.Л. О причинах спонтанной агглютинации паратифозных А диагностикумов // Вакцины и сыворотки. Материалы по производству. -1966.—Вып. 6. — С. 210-217.

25. Черняев Ю.А., Собко А.И. Определение соответствия эпизоотических штаммов вируса ящура производственным // Ветеринария. — 1973.-№1.-С. 43-46.

26. Шурахова Ю.Н., Кононенко А.Б., Виткова О.Н. Ornithobacterium rhinotracheale: распространение и диагностика // Ш Междунар. вет. конгр. по птицеводству. М., 2007. - С. 181 -183.

27. Энтеробактерии: руководство для врачей / И.В. Голубева, В.А. Килессо, Б.С. Киселева и др.. М.: Медицина, 1985. - 321 с.

28. A potential new serotype of Riemerella anatipestifer isolated from ducks in Thailand / P. Pathanasophon, P. Phuektes, T. Tanticharoenyos, W. Narongsak // Avian Pathology. -2002. Vol. 31, №3. -P. 267-270.

29. Allan B J., van den Hurk J.V., Potter A. A. Characterization of Escherichia coli isolated from cases of avian colibacillosis // Cañad. J. Vet. Res. —1993. — Vol. 57. — P. 146151.

30. Archetti J., Horsfall F.L. Persistent antigenic variation of influenza // J. Exp. Med. — 1950. Vol. 92.-P. 441.

31. Banani M., Pourbakhsh S.A., Khaki P. Characterization of Ornithobacterium rhinotracheale isolates from commercial chickens // Arch. Inst. Razi.-2001.-Vol. 52.-P. 27-34.

32. Bernardet J.F., Nakagawa Y., Holmes B. Proposed minimal standards for describing new taxa of the family Flavobacteriaceae and emended description of the family // Intern. J. of Systematic and Evolutionary Microbiology. — 2002. — Vol. 52.-P. 1049-1070.

33. Blackall P.J. Infectious Coryza: Overview of the disease and new diagnostic options // Clinical Microbiology Reviews. — 1999. — Vol. 12, №4. — P. 627-632.

34. Blackall P.J., Doheny C.M. Isolation and characterization of Bordetella avium and relates species and an evaluation of their role in respiratory disease in poultry // Austral. Vet. J. 1987. - Vol. 64. - P. 235-239.

35. Bordetella avium virulence measured in vivo and in vitro / Temple L.M., Weiss A.A., Walker K.E. et al. // Infection and Immunity. 1998. - Vol. 66, №11. -P. 5244-5251.

36. Bordetella avium sp. nov., isolated from the respiratory tracts of turkeys and other birds / K. Kersters, K.H. Hinz, A. Hertle et al. // Intern. J. Syst. Bacteriology. 1984. - Vol. 34, №1. - P. 56-70.

37. Bergey's manual of systematic bacteriology. — 2nd ed. Vol. 2. The Proteobacteria. Part A / ed. G.M. Garrity et a!.; Bergey's Manual Trust Department of Microbiology and Molecular Genetics Michigan State University, 2005. 1136 p.

38. Bragg R.R., Greyling J.M., Verschoor J.A. Isolation and identification of NAD-independent bacteria from chickens with symptoms of infectious coryza // Avian Pathology. 1997. - Vol.26, №3. - P. 595-606.

39. Carriage of potentially pathogenic Escherichia coli in chickens / S. Kariuki, C. Gilks, J. Kimari et al. // Avian Diseases. 2002. - Vol. 46, №3 - P. 721-724.

40. Chansiripornchai N., Wanasawaeng W., Sasipreeyajan J. Seroprevalence and identification of Ornithobacterium rhinotracheale from broiler and broiler breeder flocks in Thailand // Avian Diseases. -2007. Vol. 51, №3. - P. 777-780.

41. Christensen J.P., Bisgaard M. Avian pasteurellosis: Taxonomy of the organisms involved and aspects of pathogenesis // Avian Pathology. — 1997. Vol. 26, №3.-P. 461-483.

42. Control of Ornithobacterium rhinotracheale in poultry / K. Warner, M.I. Clark, S. Perez, R. Jennison // Vet. Record. 2009. - Vol. 165, №22. - P. 668.

43. Development of a serum plate agglutination test to detect antibodies to Ornithobacterium rhinotracheale / A. Back, D. Halvorson, G. Rajashekara, K.V. Nagaraja // J. Vet. Diagn. Invest. 1998. - Vol. 10. - P. 84-86.

44. Diagnosis and incidence of Ornithobacterium rhinotracheale infections in commercial broiler chickens at slaughter / L. van Veen, J. Nieuwenhuizen, D. Mekkes et al. //Vet. Record. -2005. Vol. 156. -P. 315-317.

45. Diagnosis of Ornithobacterium rhinotracheale infection in chickens by ELISA / M. Refai, A. El-Gohary, S.A. Attia, R.A. Khalifa // Egyptian J. of Immunology. 2005. -Vol. 12, №1.-P. 87-93.

46. Devriese L.A., Herdt P., Haesebrouck F. Antibiotic sensitivity and resistance in Ornithobacterium rhinotracheale strains from Belgian broiler chickens // Avian Pathology. 2001. - Vol. 30. - P. 197- 200.

47. Dho-Moulin M. Les Escherichia coli pathogènes des volailles I ! Annales de Médecine Vétérinair. 1993. - Vol. 137. - P. 353-357.

48. Dho-Moulin M., Fairbrother J.M. Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) II Vet. Research. 1999. - Vol. 30. - P. 299-316.

49. Domingo D.T., Jackwood M.W., Brown T.P. Filamentous forms of Bordetella avium: culture conditions and pathogenicity // Avian Diseases. — 1992. Vol. 36, №3. - P. 707-713.

50. Emele J., Loht J. Respiratory diseases in chickens of non-viral origin // World Poultry. 2001. - Vol.17, №12. - P. 39-43.

51. Evaluation of a commercial system for the identification of Ornithobacterium rhinotracheale / K.W. Post, S.C. Murphy, J.B. Boyette, P.M. Resseguie // J. Vet." Diagn. Invest-1999.-Vol. 11.-P. 97-99.

52. Evaluation of two experimental infection models for Avibacterium paragallinarum / Q. Zhao, Y. Sun, X. Zhang et al. II Vet. Microbiology. 2010. -Vol. 141.-P. 68-72.

53. Etude de l'infection par Ornithobacterium rhinotracheale en elevages de dindes de chair / T. Bazin, B. Dominique, M. Antoine et al. Il Sixièmes Journees de la Recherche Avicole, St. Malo, 30 et 31 mars 2005. P. 360-364.

54. Experimental infection in turkeys and chickens with Ornithobacterium rhinotracheale / P. van Empel, H. van den Bosch, D. Goovaerts, P. Storm // Avian Diseases. -1996. Vol. 40, №4. - P. 858-864.

55. Genetic diversity of Ornithobacterium rhinotracheale strains isolated from poultry in France / S. Leroy-Setrin, G. Flaujac, K. Thenaisy, E. Chaslus-Dancla // Letters in Applied Microbiology. -1998. Vol. 26. -P. 189-193.

56. Hafez H.M. Emerging and re-emerging diseases in poultry // World Poultry. -2003.-Vol. 19, №7.-P. 23-27.

57. Hafez H.M. Diagnosis of Ornithobacterium rhinotracheale II Intern. J. Poultry Sci.-2002.-Vol. 1,№5.-P. 114-118.

58. Hafez H.M. Diagnostic approach and control of Ornithobacterium rhinotracheale "ORT" and other similar bacterial diseases in poultry // Selezione Veterinaria. 1999. - Vol. 8/9. - P. 551-565.

59. Hafez H.M. Current status on the laboratory diagnosis of Ornithobacterium rhinotracheale «ORT» in poultry //Berl. Munch, tierarztl. Wschr. 1998. -Bd. Ill, №4. -S. 143-145. '

60. Hafez H.M. Current status on the role of Ornithobacterium rhinotracheale «ORT» in respiratory disease complexes in poultry // Arch. Geflugelkunde. 1996. - Bd. 60, №5.-S. 208-211.

61. Hafez H.M. Sting R. Investigations on Ornithobacterium rhinotracheale «ORT» isolates // Avian Diseases. 1999. - Vol. 43, №1. - P. 1-7.

62. Hafez H.M., Friedrich S. Isolation of Ornithobacterium rhinotracheale from meat turkey in Austria II Tierarztl. Umschau. 1998. - Bd. 53. - S. 500-502.

63. Hafez H. M., Sting R. Serologic surveillance on Ornithobacterium rhinotracheale in poultry flocks using self-made ELISA // Proceedings of the 45th Western Poultry Disease Conference. Cancun, 1996. - P. 163-164.

64. Harper M., Boyce J.D., Adler B. Pasteurella multocida pathogenesis: 125 years after Pasteur // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - Vol. 265, №1. - P. 110.

65. Hemagglutinating activity of serovar reference strains of Ornithobacterium rhinotracheale / V. Vega, A. Zepeda, S. Ramirez et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 2008. - Vol. 20. - P. 353-355.I

66. Hinz K.H., Hafez H.M. The early history of Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) //Arch. Geflugelkunde. -1997. -Bd. 61. S. 95-96.

67. Hinz K.H. Acute exudative pneumonia and airsacculitis associated with Ornithobacterium rhinotracheale in turkeys // Vet. Record. — 1994. — Vol. 135, №10. — P. 233-234.

68. Hugo C.J., Jooste P.J. Culture media for genera in the family Flavobacteriaceae II Handbook of Culture Media for Food Microbiology / ed. J.F.I. Corry et al.. Elsevier Sei. B.V., 2003. - P. 355-367.

69. Immunohistochemical and serological investigation of experimental Ornithobacterium rhinotracheale infection in chickens / P. van Empel, M. Vrijenhoek, D. Goovaerts, H. Van Den Bosch I I Avian Pathology. 1999. - Vol. 28, №2. - P. 187-193.

70. Increased condemnation of broilers associated with Ornithobacterium rhinotracheale / L. Van Veen, E. Gruys, K. Frik, P. van Empel // Vet. Record. -2000. Vol. 147, №15. - P. 422-423.

71. Infection of turkeys with Ornithobacterium rhinotracheale and Mycoplasma synoviae / O. Zorman-Rojs, I. Zdovc, D. Bencina, I. Mrzel // Avian Diseases. 2000. - Vol. 44, №4. - P. 1017-1022.

72. Interaction of Ornithobacterium rhinotracheale and Bordetella avium in turkey poults / M. De Rosa, R. Droual, R.P. Chin, H.L. Shivaprasad // Proceedings 46th Western Poultry Disease Conference. 1997. - P. 52-53.

73. Investigations on the clonality of isolates of Pasteurella gallinarum obtained from turkeys in Germany / M. Bisgaard, H. Christensen, K-P. Behr et al. II Avian Pathology. -2005. Vol. 34, №2. - P. 106-110.

74. Investigations on Ornithobacterium rhinotracheale in broiler flocks in Elazig province located in the East of Turkey / G. Ozbey, H. Ongor, D.T. Balik et al. // Vet. Med. Czech. - 2004. - Vol. 49, №8. - P. 305-311.

75. Iron acquisition by Ornithobacterium rhinotracheale / L.B. Tabatabai, E.S. Zehr, M.K. Zimmerli, K.V. Nagaraja // Avian Diseases. 2008. - Vol. 52, №3. - P. 419425.

76. Isolation and differentiation of a cytochrome oxidase-negative strain of Ornithobacterium rhinotracheale from turkeys / M. Ryll, R. Günther, H.M. Hafez, K.H. Hinz // Berl. Munch, tieraizü. Wschr.-2002. Bd. 115, №7-8. - S. 274-277.

77. Isolement d'un novel pathogene chez la dinde: Ornithobacterium rhinotracheale : conduit a tenir / Dudouyt J., Leorat J., Van Empel P. et al. // Proceedings of the J. de la Recherche Avicole, Angers. 1995. - P. 240-243.

78. Isolation of Ornithobacterium rhinotracheale from chickens and turkeys / O. Erganis, M. Ates, H.H. Hadimli, M. Corlu // Tur. J. Vet. Anim. Sei. 2002. -Vol. 26.-P. 543-547.

79. Isolation of Ornithobacterium rhinotracheale from turkeys in Quebec, Canada / P. Joubert, R. Higgins, A. Laperle et al. // Avian Diseases. 1999. - Vol. 43, №3.-P. 622-626.

80. Jackwood M.W., McCarter S.M., Brown T.P. Bordetella avium: an opportunistic pathogen in leghorn chickens // Avian Diseases. 2008. - Vol. 39, №2. - P. 360-367.

81. Jooste P.J., Hugo C.J. The taxonomy, ecologie and cultivation of bacterial genera belonging to the family Flavobacteriaceae / Intern. J. of Food Microbiology. — 1999.-№53.-P. 81-94.

82. Jordan F.T.W., Pattison M. Poultry Disease. 4th ed. - Great Britain: W.B. Saunders Company Ltd., 1996. - 546 p.

83. Kabir S.M.L. Avian colibacillosis and salmonellosis: a closer look at epidemiology, pathogenesis, diagnosis, control and public health concerns // Intern. J. Environ. Research Public Health. 2010. - Vol. 7. - P. 89-114.

84. Koga Y., Zavaleta A.I. Intraspecies genetic variability of Ornithobacterium rhinotracheale in commercial birds in Perú // Avian Diseases. — 2005. Vol. 49, №1.-P. 108-111.

85. Lafay D. Ornithobacterium rhinotracheale: patogenicite et importance en medicine veterinaire: these doct. vet. — Toulouse, 2000. 83 p.

86. La Ragione R.M., Woodward M.J. Virulence factors of Escherichia coli serotypes associated with avian colisepticemia // Reseach in Vet. Sei. — 2002. -Vol. 73.-P. 27-35.

87. Marien M. Mixed respiratory infections in turkeys, with emphasis on avian metapneumovirus, Ornithobacterium rhinotracheale, Escherichia coli and Mycoplasma gallisepticum: these doct. vet. — Ghent, 2007. — 219 p.

88. Minimization of pathologic changes in Ornithobacterium rhinotracheale infection in turkeys by temperature-sensitive mutant strain / V. Lopes, A Back, D.A. Halvorson, K.V. Nagaraja // Avian Diseases. 2002. - Vol. 46, №1. - P. 177185.

89. Mohd-Zain Z., Jee T.L., Jusoff K. Phenotypic characteristics, antibiotic susceptibility and pathogenicity of Ornithobacterium rhinotracheale II WSEAS Transactions on Biology and Biomedicine. 2008. - Vol. 5, №7. - P. 133-142.

90. Molecular epidemiology of Ornithobacterium rhinotracheale / A. Amonsin, J.F.X. Wellehan, L.L. Li et al. II J. Clin. Microbiology. 1997. - Vol. 35, №11. - P. 2894-2898.

91. Molecular characterization of Ornithobacterium rhinotracheale / P. van Empel, P. Savelkoul, R. Segers et al. II P. van Empel Ornithobacterium rhinotracheale: thesis. Utrecht: University of Utrecht, The Netherlands, 1998. -P. 37-48.

92. Mouahid M., Mutters R., Mannheim W. Rapid identification of Bordetella avium and related organisms on the basis of their cellular carbohydrate patterns I I Avian Pathology. -1991. Vol. 20, №4. -P. 627-636.

93. NAD (V-factor)-independent and typical Haemophilus paragallinarum infection in commercial chickens: A five year field study / R.F. Horner, G.C. Bishop, CJ. Jarvis etal. //Avian Pathology. -1995. Vol. 24, №3. -P. 453-463.

94. Nervous signs associated with otitis and cranial osteomyelitis and with Ornithobacterium rhinotracheale infection in red-legged partridges (Alectoris rufa) / B. Moreno, G. Chacon, A. Villa et al. // Avian Diseases. 2009. - Vol. 38, №5.-P. 341-347.

95. Ornithobacterium rhinotracheale gen. nov., sp. nov., isolated from the avian respiratory tract / P. Vandamme, P. Segers, M. Vancaneyt et al. // Intern. J. Syst. Bacteriology. 1994. - Vol. 44, №1 - P. 24-37.

96. Ornithobacterium rhinotracheale associated with respiratory infection and high mortality in turkey breeders / M. de Rosa, R. Droual, R. Chin et al. // American Association of Avian Pathologist Annual Meeting, Scientific Proceedings. 1995. - P. 126.

97. Ornithobacterium rhinotracheale infection in Japan: preliminary investigations / E. Sakai, Y. Tokuyma, F. Nonaka et al. // Vet. Record. 2000. -Vol. 146, №17.-P. 502-504.

98. Ornithobacterium rhinotracheale infection in commercial laying-type chickens / SJ. Sprenger, D.A. Halvorson, K.V. Nagaraja et al. // Avian Diseases. -2000. Vol. 44, №3. - P. 725-729.

99. Ornithobacterium rhinotracheale infection in turkeys: experimental reproduction of the disease / S.J. Sprenger, A. Back, D.P. Shaw et al. // Avian Diseases. 1998. - Vol. 42, № 1. - P. 154-161.

100. Pathological examination and bacterial reisolation by culture and PCR of experimental Ornithobacterium rhinotracheale infection in broiler chickens / A.

101. Kilic, N. Timurkaan, H.B. Erta§, F. Yilmaz // Revue Med. Vet. 2009. - Vol. 160, №3. — P. 140-144.

102. Pathogenic bacteria related to respiratory diseases in poultry with reference to Ornithobacterium rhinotracheale isolated in India / T.R.G.K. Murthy, N. Dorairajan, G.A. Balasubramaniam et al. // Vet. Arhiv. 2008. - Vol. 78. - P. 131-140.

103. Pathogenesis of avian pneumovirus infection in turkeys / F. F. Jirjis, S. L. Noll, D. A. Halvorson etal. //Vet. Pathology. -2002.- Vol. 39.- P. 300-310.

104. Pastereila avium (Hinz and Kunjara 1977) comb. nov. and Pasterella volantium sp. nov. / R. Mutters, K. Piechulla, K.H. Hinz, W. Mannheim // Intern. J. Syst. Bacteriology. -1985. Vol. 35, №1. - P. 5-9.

105. Pasteurella multocida from outbreaks of avian cholera in wild and captive birds in Denmark / K. Pedersen, H.H. Dietz, J.C. Jorgensen et al. // J. of Wildlife Diseases. -2003. Vol. 39, №4. -P. 808-816.

106. Pharo H. Import risk analysis: belovo egg powders. New Zeland: Ministry of Agriculture and Forestry Wellington, 2003. - 14 p.

107. Phenotypic characteristics of Riemerella anatipestifer and similar microorganisms from various hosts / K.H. Hinz, M. Ryll, B. Kohler, G. Glunder // Avian Diseases. -1998. Vol. 27, №1. - P. 33-42.

108. Pilot study on the prevalence of Ornithobacterium rhinotracheale infections in food chickens in northwest Germany / M. Ryll, K.H. Hinz, U. Neumann et al. // Berl. Munch, tierarztl. Wehr. 1997. - Bd. 110, №7-8. - S. 267271.

109. Preliminary characterization of a pleomorphic gram-negative rod associated with avian respiratory disease / B.R. Charlton, S.E. Channing-Santiago, A.A. Bickford et al. // J. Vet. Diagn. Invest. -1993. Vol. 5. - P. 47-51.

110. Prevalence of fowl cholera (Pasteurella multocida) in commercial broiler breeder flocks maintained in Abbottabad and Mansehra / B. Tahir, F.R. Durrani, M. Farooq et al. // J. Anim. Vet. Advances. 2003. - Vol. 2. - P. 444447.

111. Pyzik E., Rzedzicki J., Kolasa A. Etiopathogenesis and diagnostics of avian ornithobacteriosis // Ann. Univ. Maria Curie-Sklodowska. Sect. DD. 2007. -Vol.62, №2.-P. 32-39.

112. Rahimi M., Banani M. Isolation of Ornithobacterium rhinotracheale from the chickens of a broiler farm in Kermanshah province, west of Iran // Iranian J. of Vet. Research, University of Shiraz. 2007. - Vol. 8, № 4. - P. 355-359.

113. Rimler R.B., Simmons D.G. Differentiation among bacteria isolated from turkeys with coryza (rhinotracheitis) // Avian Diseases. — 1983. — Vol. 27, №2.-P. 491-500.

114. Rhoades K.R., Rimler R.B., Bagley R.A. Fowl cholera epornitic: antigenic characterization and virulence of selected Pasteurella multocida isolates // Avian Diseases. 1992. - Vol. 36, №1. - P. 84-87.

115. Serological classification of Haemophilus paragallinarum with a hemagglutinin system / K. Kume, A. Sawata, T. Nakai, M. Matsumoto // J. Clin. Microbiology. 1983. - Vol. 17, №6. - P. 958-964.

116. Seroprevalence of Ornithobacterium rhinotracheale infection in commercial laying hens in the north central region of the United States / C.J. Heeder, V.C. Lopes, K.V. Nagaraja etal. //Avian Diseases. 2001. - Vol. 45, №4. -P. 1064-1067.

117. Synergy between avian pneumovirus and Ornithobacterium rhinotracheale in turkeys / M. Marien, A. Decostere, A. Martel et al. // Avian Pathology. 2005. - Vol. 34, №3.-P. 204-211.

118. The relevance and efficacy of Ornithobacterium rhinotracheale control in chickens / P.D. Herdt, K. Cauwerts, J. Vervloesem, R. Ducatelle // World Poultry. 2001. -Vol.17, №10.-P. 32-33.

119. The role outer membrane proteins of Ornithobacterium rhinotracheale in attachment to chicken tracheal epithelium / K. Nofouzi, S. Shapouri, M. Jamshidian et al. //Pakistani of Biological Sci. -2007. Vol.10, №3. P. 470-473.

120. Travers A.F. Concomitant Ornithobacterium rhinotracheale and Newcastle disease infection in broilers in South Africa // Avian Diseases. — 1996. -Vol. 40, №2.-P. 488-490.

121. Travers A.F., Coetzee L., Gummow B. Pathogenicity differences between South African isolates of Ornithobacterium rhinotracheale II Onderstepoort J. Vet. Research. 1996. - Vol. 63. - P. 197-207.

122. Tsai H., Huang C. Phenotypic and molecular characterization of isolates of Ornithobacterium rhinotracheale from chickens and pigeons in Taiwan // Avian Diseases. 2006. - Vol. 50, №4. - P. 502-507.

123. Unexpected similarities between Bordetella avium and other pathogenic Bordetellae / P.A. Spears, L.M. Temple, D.M. Miyamoto et al. // Infection and Immunity. -2003.- Vol. 71, №5.-P. 2591-2597.

124. Van Empel P., van den Bosch H., Loeffen P. Identification and serotyping of Ornithobacterium rhinotracheale II J. Clin. Microbiology. — 1996. — Vol. 35, №2. P. 418-421

125. Van Empel P., Hafez H.M. Ornithobacterium rhinotracheale\ a review // Avian Pathology. -1999. Vol. 28, №3. - P. 217-227.

126. Van Empel P., van den Bosh H. Vaccination of chickens against Ornithobacterium rhinotracheale infection // Avian Diseases. — 1998. — Vol. 42, №3. — P. 572-578.

127. Varga J., Fodor L., Makrai L. Characterization of some Ornithobacterium rhinotracheale strains and examination of their transmission via eggs // Acta Vet. Hungarica. -2001. Vol. 49, №2. - P. 125-130.

128. Vargas E.S., Garduno M.L., Rosas P.F. Isolation and characterization of Ornithobacterium rhinotracheale from respiratory diaseased turkeys // Vet. Mexico. 2003. - Vol. 34, №3. - P. 283-288.

129. Van Veen L., van Empel P., Fabri T. Ornithobacterium rhinotracheale, a primary pathogen in broilers // Avian Diseases. 2000. — Vol. 44, №4. — P. 896900.

130. Van Veen L., Vrijenhoek M., van Empel P. Studies of the transmission routes of Ornithobacterium rhinotracheale and immunoprophylaxis to ~ prevent infection in young meat turkeys // Avian Diseases. 2004. — Vol. 48, №2, P. 233237. J

131. Virulence of the nine serovar reference strains of Haemophilus paragallinarum / V.E. Soriano, G.M. Longinos, R.P. Fernandez et al. // Avian Diseases. -2004. Vol. 48, №4. - P. 886-889.

132. Yersin A.G., Edens F.W., Simmons D.G. The effects of Bordetella avium infection on elastin and collagen content of turkey trachea and aorta // Poultry Sci. 1998. - Vol. 77, №11. - P. 1654-1660.

133. Youssef N.M.A., Ahmed M.H.H. Serological studies on flocks showing depressed egg production // Vet. Med. J. Giza. 1996. - Vol. 44. - P. 719-726.