Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗРАБОТКА БИОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТОВ С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОТБОРА КОРОВ ДОНОРОВ ЭМБРИОНОВ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА БИОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТОВ С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОТБОРА КОРОВ ДОНОРОВ ЭМБРИОНОВ"

Ъ06%г!

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА < ВШИ )

На правах рукописи БОЙКО Алексей Григорьевич

УДК 636^2:57,089.38

РАЗРАБОТКА БИОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТОВ С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОТБОРА КОРОВ ДОНОРОВ ЭМБРИОНОВ

03.00.04.- 5И0ХИМКЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ДУБРОВИЦЙ,МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ 1992

* . '■. - 2 -

Диссертационная работа выполнена в Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства

НаучныА руководитель: заслуженный деятель науки РСФСР,

доктор биологических наук, профессор ВЛАДИМИРОВ В.1.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук КОНОНОВ В.П.

доктор биологических наук ИСООВ ПЛ.

Ведущее учреждение:

Всероссийский научно-исследовательский институт

физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Зашита диссертации состоится <<. 2$ в

час. на заседании специализированного Совета Д.020.16.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства

а

Адрес института: 142012»Московская сбласть,Подольский район,пос.Дубровины,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. . ^ —,

Автореферат разослан 199^, г.

Учешй секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук ЦШП® И.И.

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. АКТУАЛЬНОСТЬ Т£МЬ1:Внедрение метода трансплантации морионов в практическое животноводство сдерживаемся рядом серьезных причин.

Для качественного подбора потенциальных коров доноров эмбрионов необходимо определять возможную реакцию яичников на гонадотропин т.е. предсказывать результаты суперовуляции.Супе-ровуляция, вызванная ['онадотропннзми.не 1шеет точных пределов. Различия в реакции яичников на гонадотропин свидетельствует об индивидуальной чувствительности организма на гонадотропную обработку. Метод пгг"верительного и целенаправленного отбора по этому признаку в настоящее время пока не разработан.Непредска-зуеность результатов индуцированной суперовуляции является основным сдерживгтеим фактором внедрения метода трансплантации эмбрионов н требует первоочередного научного решения.

1.2. ЦЕЛЬ И ЗЛДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.Основная цель исследований заключалась в разработке биохимического метода прогнозирования результатов суперовуляции у коров доноров эмбрионов.

Для достижения данной целк ставились следующие задачи:

- изучить корреляционное связи ме^ду активностью ферментов катричьый синтез которых регулируется.эстрадиолом и уровнем суперсвуляцин коров доноров,а именно:т-глутамилтрансфера-рази.к^езтинкиназы,щелочной фосфатазы,кислой фосфатазы,лактат-

дагидрогеназы.аланинамлногрансферазы.аспартатаминотрансферазы.

- изучгть корреляционное связи мекду концентрацией т[<иг-лицер':дов крови доноров в зависимости от уровня суперовуляцнд, как веществ уровень которых регулируется количеством с^кретп-руемого эстраднола.и некоторых других метаболитов.

- по возможности,на основании установленных связей разработать простую методику для прогнозирования результатов супе-ровугяции для коров, доноров эмбрионов.

Работа носчла поисковый характер.Учитывая особую вашность решения эуой проблемы для хозяйств, использующих в качестве доноров эмбрионов выГфаковакных из продуктивного стада ко-

ров.обьектом исследования была выбрана именно эта группа животных.

1.3. HAY4HMI КОВКЗНЛ. заключается в том,что в процессе исследования установлен биохимический тест (активность АЛТ плазмы крови) ичеюэдй тесную статистическую связь с результатами суперовуляции у коров доноров эмбрионов. Изучены особенности азотистого к липидного обмена.динамики эстраднолзависи-кых факторов,а также метаболизма глюкозы,кальция и некоторых других показателей обмена низко- и высокоэмбриопродуктивных животных.Выдвинута новая концепция разработки методов прогнозирования результатов суперовуляция."

1.4. ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ,Результаты работы позволяют предложить для широкой апробации з производственных условиях методику прогнозирования результатов суперовуляции выбракованных из продуктивного Ci ада коров доноров эмбрионов.суть которой заключается в определении активности AJ1T в закороженно -оттаянной плазме крови.Для практического использования предлагается отбирать дэнорог с уровнем активности АЛТ плазмы кровав диапазоне 17-24 ИЕ/А. Отобранные по АЛТазному тесту группы доноров из числа коров выбракованкых по разным причинам из продуктивного стадг имели эмбрчосбор качественных эмбрионов приближающийся к эмориосбору здоровых коров и телок.

1.5. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:Основные положения диссертации доложены и получили положительную оценкута Э-й Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, Алма-Атинский ЗВК,Алма-Ата,1991 г.

1.6. ОБЬЕИ РАБОТЫ.Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста,содержит 22 таблицы,4 графикаД рисунка. Список литературы включает 58 отечественных и 74 иностранных источников,

2, ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ.

Во многих публикациях предлагается прогнозировать результаты суперовуляции во уровню эстрадиола и прогестерона в крови или молоке коров доноров эмбрионов.

Секреция эстсаднола в яичниках коров доноров зависит от количества фолликулов,степени их зрелости и дня эстрального ц.:кла.В отдельных работах показано,что чем больше' зрелых фолликулов тем выше концентрация эстрлдиола в перефг.ркческой крови коров доноров.Например,на основе этой закономерности разработана методика прогнозирования результатов суперовуляции ( Рябых 8.П. Ii др.- A.c. 1304182 ).Эта методика позволяет судить о функциональном состоянии яичников но динамике содержания эс-традиолэ 17(5 в перефиричрской крови на 6-7 день полового цикла .Однако она позволяет прогнозировать результаты судеровуля-ции толькс в опрелеленные дни эстрального цикла,что в условиях практики не совсем удобно.Кроме того,определение уровня стероидных гормонои в крови животных сспряжеко с некоторыми существенными трудностями методического характера.Стероидные гормоны изменяют количественно и качественно биосинтез некоторых белков,в том числе и ферментов (липотро.чинлипази, ^-глутамилт-рансферазы.креатинкин^зы,щелочной и кислой фосфатазы,лактатде-гидрогеказьцаланинаминотрансферазы.аспартатакккотрансферазы) в клетках организма млекопитающих,а гакяе уровень триглецерндов и трансферрнна в крсвк коров.Таким образом,стероидные гормоны являются клеточным сигналом,и если возникают затруднения в измерение величины сигнала,то не проще ЛИ измерять величину ответа на сигнал? Т.е.активность и концентрацию ферментов и других веществ синтез которых находите? под контролем стероидных гормонов.Если гормональный сигнал статистически связан с уровнем суперовуляции, то логично предположить, что и ответ на сигнал будет иметь связь с результатами суперовуляции коров доноров.

Исходя из выие излояехного и была поставлена цель: разработать методику прогнозирования результатов суперовуляции на основании измерения концентрации метаболитов и активвости ферментов в крови коров доноров.

3. МАТЕРИАЛЫ Н М£ТРДО ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ.Исследования проводили в лаборатории

биохимии с /х животных ВНЖа и базовом пункт«1 Центра трансплантации эмбрионов ВИИа ГПЗ "ЗАРЯ КОММУНИЗМА" в два этапа.

На первом этапе изучала динамику активности ферке&тов в зависимости от уровня суперовуляции кора г. доноров,а киенно:7 -глутанилтраисФеразы.креатинкиназы.челочной фосфатазы,ки слой фосфатазы, лактатдегидрогеназц.алакинаминотрансферазн, аспартат-аминотрансферазы,а также изменение концентрации триглице?идоь крови доноров в зависимости от уровня суперонуляции. Из втором этапе на основании материалов собственных исследований один из изученных ферментов (активность АЖТ плазмы крови ) был половеи б основу создаваемой методики прогнозирования результатов сутгеровудяцкк.Проведека апробация разработанной методики в практических условиях в разных режимах использования.

3.2- ОТБОР ЖИВОТНЫХ.В исследоваигч использовали 3 группы животных аналогов из стада постоянных коров «онеров эмбрионов которое было сформировано методом дробных суперовуляцнй из числа коров закончивших продуктивный период на фермах и выбракованных из молочного продуктивного стада по возрасту или дру-ги« причинам не связанный с утратой воспроизводительной функции после 4-6 лактаций,в возрасте ?-10 лет черно-пестрой и голатияофризской пород. Продуктивность коров по предшествующим лактациям составляла 7-12 тыс кг молока в год,Животных кормили по нормам ВИКа.

3.3. ГОРМОНАЛЬНОЕ ВЫЗЫВАНИЕ СУПЕРОВУЛЯЦИИ.Индуцировалось введением донорам 50 иг. ФСГ производства ВЙИИФБ и П сельскохозяйственных животных ( 50 мг. супер ФСГ растворяли в 14 мл,физ.раствора) начиная с 8 - 10 дня полового цикла по 4-х дневной схеме.На третий день обработки коровам ккьецкровалн лютеолитяческий преперат "РЕМОФАН" 2 раза по 2 мл.Доноров осеменяли замороиенио-аттаянноЭ спермой 3 раза,с интервалом в 12 часов.Осеменение проводили ка 5-й и б-й день с начала обработки.

3.4. ИЗВЛЕЧЕНИЕ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ. Нехирургическое извлечение эмбрионов и оценка их качества проводилась на 7 день после осеменевня традиционным методом согласно '"Инс-"

- 7 -СХЕМА ОБРАБОТКИ ТАБЛИЦА 1.

Дни ! обработки ; 1 1 1 1 1 к Г 2 13 14! 1 1 1 t t ь : 1 6 i i . <... ...

Утро Вечер 2,5 2.5 2.0 1.5* 1.0 2.0 1.5* 1.0 0,0 0.0 0,0 Милилитри раствора ФСГ

* + 2 ил. РВИОФМЩО,С - охота, осеменение

трукции по трансплантации эмбрионов крупногс рогатого скота" И. 1987 Т. •

3.5. ОТБОР И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ.Б исследовании использовали цельную кровь и плазму крови.Цельвуо кровь к кговь используемую в процессе получения плазмы стабилизировали растгором цитрата натрия.Часть крови помещали в холодильник и хранили до использования при температуре +4°С ,а из другой части предназначенной для получения плазмы в течении 1 часа с момента взятия крови получали плазму центрифугированием в течении 15 ми-

-1

нут при 4,5 тыс.мии. Сбежеполученную плазму помешали в сосуд Дьюара с йидкик азотом и хранили до использования.

3.6.БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.Активность щелочкой фос-фатазы.аланинаминотрансфераэы,амилазы, аспартатамянотрансами-назы, лактатдегидрогеназы, y-глутамилтрансферазы, концентрацию альбумина, мочавиш, холестерана, креатинина, глюкозы, Ca, определяли на автоматическом анализаторе Synchron СХ - 5 фирмы BECKMAÜ при температуре 39°С. Микрооиологическ.!, по методу

' Одинцовой ErH.-(1S56) исследовали уровень рита^ина в све-неэамороиекной плазме крови доноров эмбрионов .Цельную кровь исследовали на обоше липидм,фос^олипндн и холестерин методами упомянутыми в спрэгочниках Покровского A.A.- (1985) и Бала-ховского С.Д.-(1953),В целъаоЗ крови определяли концентрацию общего,небелкового и аминного аз^та.Общий азот определяли на

аппарате КШЛЖ AUTO 1030 Analyzer фирна TECATÖR.Определение небелкового ( остаточного ) я амицного азота проводили согласно методик принятых в ВИЖе.

3.7.СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛКЗ.Статистнчес'шй в той числе и короеляционйо-ре г рес с ионный анализ проводился по Плохинекому H.A. - (19б9),Рокицкому П.Ф. - (1964) и Корозову. И.Д. - (1963).

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 4.1. ПОИСКОВЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.Исследования проводили в сле-^. дующем порядке:Образцы крови'отбирали у животных на 8-10 день полового цакла за 6 .часов до гормональной обработки,Плазму крови получали способом принятым в настоящих исследованиях. В полученных образцах определяли активность ферментов и концентрацию белковых и небелковых компонентов плазмы и цельной крови упомянутых в разделе 3.6. По результирующим факторам^ оСщий эмбриосбор,эмбриосбор годных для пересадки эмбрионов .активность - уелочной фосфатаэы.аланинаминотраясферазы,амилазы, аспартататаминотрансферазы и т.д.) коров предварительно оценивали,варианты,имеющие крайние значения, из дальнейших

расчетов исключали по правилу трех сигм.Взаимосвязь между общим энбриосбором,выходом годных для пересадки эмбрионов ,с одной стороны н исследуемыми биохимическими факторами с другой, оценивали при помоги коэффициента линейной корреляции ( г ) и его достоверности t Р< j.Для каждого фактора вычисляли среднюю

по группе (М) и ее ошибку ( m ),Группу коров делили на две

i* 1*

подгруппы - с низкой ( эмбриосбор по ЭОКЭ и 30 - менее 3-х эмбрионов) и высокой эмбриопродуктявностью ( эмбриосбор по ЭОКЭ к ЭО - 3 я более эмбрионов),Для подгрупп вычисляли среднюю,

1. ЭО - эмбриосбор общий,суммарное количество полученных от

донора качественных и негодных дня трансплантации эмбриопов.а также цеошюдотворенных яйцеклеток.

2. ЭОКЭ- эмбриосбор качественных эмбрионов.

ее ошибку к достоверность разницы иеяду подгруппами ( р < ) , Как и ожидалось.динамика изменения активности у некоторых из исследуемых ферментов плазмы крови зависит от величины э«б-риоебора коров доров эмбрионов. Ими оказались аланинаминот-рансфераза и лактатдегидрогеназа. Активность хрейтиикиназк,судя по динамике изменения концентрации креатинмна также статистически связана с эмбриосбором.

Статистическая связь кевду эмбряосбором и активностью т-глутамнлтрансферазы, щелочной фосфатазы, аспартатаминот-рансферазы не установлена.(табл. 3)

Установлена ыаимная корреляционная связь между актив-костью АЛ плазмы крови ,30,ЭОКЭ,общим небелковым и аниннык азотом цельной крови.

ТАБЛИЦА 2.

КОРРЕЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ АЗОТИСТОГО ОШЕНА У ШИВОТЙМХ ПЕРВОЙ ГРУППЫ

АЛТ ; ОА : НА : АА

30

ЭОКЗ

Ш

#

ОА

0.71** -0.38* 0.39* -0.25* -0.68е

-0.6' -0.35 * -0.57* -0.27* -0.56* -0.26*

Р<0.02;@® - Р<0.01 АНИННЫЙ АЗОТ

- недостоверно^ - Р<0.05;® -ОБЩИЙ АЗОТгНА - НЕЕЕЛКОБЗЙ А30Т:АА -

Проводила нелинейный корреляционно-регрессионный анализ между факторами приведенными в таблице 2 и 30 И ЗОКЕ,Индекс ( корреляции и (эта) для всех факторов недостоверно отличался от коэффициента линейной корреляции г ,за исключением АЛТ/ЗОКЕ ( г = 0.39 Р - н/д ; п = 0.75 Р<0,01),Для этого фактора провели

дополнительный статистический анализ который заключался в следующем :

). РегрессионыЙ анализ данных по 1-й группе выявил нижнею

ТАБЛИЦА

АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ И СОДЕРЖАНИЕ МЕТАБОЛИТОВ В ГЦАЗЙЕ И ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ КОРОВ ДОНОРОВ ПРИ НИЗКОМ (<3 эмбрионов) К ВЫСОКОМ (>3 эмбрионов) УРОВНЕ СУПЕРОВУЛЯЦИИ.

ФЕРМЕНТЫ И :ЕДЙ- : М^м : м:и :Рз < : г : Рг <

МЕТАБОЛИТЫ :НИЦА ; <3 : >3 : .

:ИЗМЕ-:Низкоэмбрио-:Выеокоэмбрио-;РЕНИЙ;продуктнекая:продукт«виая; : :подгруппа :подгрупна :

1 , 2 3. А

- активность даяштоб mm крови

ЩЕЛОЧНАЯ 38,8-2.9

ФОСФАТАЗА (П)ИЕ/Л (39,4-3,14

AJSMffiHAIflfflO- ИЕ/Л 17,15-1,36 ТРАНСФЕРАЗА (П) (15-0,82

АМИЛАЗА (П) Е/Л 13,8-0,6 (14,1-0,7 ACT (П) ИЕ/Д 55-5,1 (52,2-5 .ЙАКТАТДЕ- ИЕ/1 2737,5-92 ГИДРОГЕКАЗА (П) (2680-133,3

ГАЙИАГЛУТА«ИЛ-ИБ/Л22,8-1,9 ТРАНСФЕРАЗА (П) (20,9-1,59

ОБЩИЙ

БЕЛОК (П) Г% АЛЬБУМИН (П) 7%

ОБЩКЙ АЗОТ (К)

MPS

НББЕЛХОВИИ мгХ АЗЭТ (К)

АМИНHUH АЗОТ (К)

мгХ

КРЕАТИЙИН {В) мг%

8,44i,23 (8,2-0,23

0,85-0.03 (0.83-0.03

2730,4-76,1 (2831,1-72,8

32.32-1,7 (33.96-1,8

10,83-1 (Ю, 77-1,2

0,58-0,09 (0,55-0,1

50-12,6 45,13-8,4 # « 0,05 -0,14 * * )

19,8-0.92 21,5-1,2 ' .# . 0,39 0,001 0,7.1 # 0,01}

13-0,6 12,9-0,48 55,8-1,2 59.6-4,9 2841,4-128 2866-76,77 * * # # # # -0,28 -0,3 0,1 -0,3 -0,17 0.4 # -* ) # # ) # * )

19-2,1 22.88-2,9 # # -0,21 0,18 » * )

ПЛАЗМЕ И ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ 9.12-0,42 # 0,38 9,1- 0.3 0.05 0,52 # 0,05;

0.98-0.02 0,95-0,027 0.02 0,54 0.001 0,36 0,05 * )

2708-10,4 -0,25 #

2590,5-63 * -0,38 # )

25,7-1Д 26,26-1,4 0,05 0.01 -0,57 -0,6 0.05 0,02)

9,28-1,3 9,94-1,2 # * 41,37 -0,35 # * )

0,96-0,17 •0,86-0,13 0.05 0,1 0.64 0,45 0,01 0,1 >

1 2 л 4 5 6 7

ГЧЕВИНА <П> 10,443,9 10,6-1,4 # О,05 #

мгК С 1С,7-1,09 10,13—1 л. -тг 0,02 * )

ОБЩИЙ 4,67-0,21 4,76-0,36 ** 0.17 #

БИЛИРУБИН (П) (4,34-0,164 5,09-0,19 0,01 0,56 0,05)

ГЛЮКОЗА (П) 60,6-1,4 59,4-2,4 # -0,25 »

мг& (61,8-1,18 58,4-2,2 # -0,54 0,05)

ТРИГЛИЦЕРИдЫ (11; 44-1.7 76,4-7 0,001 0,7) 0,01

мгй С 42,9-2 65,5-6,7 0,01 0,6 0,02)

ХОЛЕСТЕРОЛ 97.8-5.4 99,5-4,4 # -0,03 *

КГЙ ' .Л, 3-4,7 91,4-6,3 -0,22 # )

ОБЩИЕ 274,74-16,4 280,8-13,6 к 0,08 я

липиды (К) ига (291,6-13.8 255-19,4 * -0,22 * )

Ф0СФ0- 116-8.2 124-6,5 * 0,08 #

ЛИГЩЫ (К) игй (124,4-7.2 110,6-10 # -0,12 # )

КАЛЬЦИЙ(П) МГЙ 7,9-0,5 3,7-0,3 0,52 0,05

(8,4-0,22 6,7-0,21 -тг 0,25 в )

ХЛОР СП) ммоль/Л 94,6-7,8 92-9,5 # -0,05 #

(82,42-10,32 96,63-11.4 # 0,21 * )

ВИТАМИН 0,016-0,0013 0,0176-0,0018 * 0,17 $

В5 (П) кг/мЛ (0,0163-0,00167 0,017-0,001 # 0,06 * ;

(1!) - в плазме крови;(К) - б цельной крови- недостоверно В скобках представлены данные статистического анализа ме^ду 30 и изучаемыми факторами,без скобок -между ЭОКЭ и изучаемыми факторами.

и верхнюю границу экбриопродуктивкости между низко- и вксоксзмб-риопродуктквнши животными ( по ЭО и ЭОКЭ > в диапазонах активности ДЛТ.

2,Согласно установленных границ эмбриопродуктивнэсти коров делили на две подгруппы - о низкой и высокой эмбриопродуктив-ноотьй по градациям исследуемого фактора .Для подгруп вычисляли средни»,ее ошбку и достоверность разницы между подгруппами.Для проверки полученных результатов применялся однофакторный дисперсионный анализ,где подгруппы использовались в качестве градаций АЛТ.

- 12 -

В процессе регрессионного анализа { при линейном и нелинейном приближении ) для откоректмрованной выборки были подобраны, как наиболее соответствующие { в качестве степени соответствия эмпирическим данным использовался - для линейного приближения коэфициент корреляции, а для нелинейного - индекс корреляции) эмпирические данным следующие модели( рис.1): Линейная для 30

30 = -7.66 + 0.621*АЬТ

И = 0.71 Р < 0.01

Нелинейная для ЭОКЭ з

ЭОКЭ = -18.89 + 2.073*АЬТ - 4.835*ю' *АЪТ т] = 0.75 Р < 0.01

По результатам регрессионного анализа группу животных разделили на две подгруппы - низкопродуктивных ( активность АЛТ- 17 ИЕ/Л и нике) и'высокопродуктивных (активность АЛТ -18 НЕ/Л и выше).Исходные параметры подгрупп приводятся в табл.4:

ТАБЛИЦА 4.

РАЗНИЦА Я ЕЕ ДОСТОВЕРНОСТЬ МЕЖДУ ВЫСОКО- И НИЗКОЭМБРИОИРО-ДУКТИВНШИ ПОДГРУППАМИ 1 ГРУППЫ

п дивогных- 18

: п ! М ! т | ¡достоверность ¡р«зница|разницы

низкопродуктивные 9 0.76 0.26

5,35 Р < 0.001

30 (6,74) (Р<0,01)

высокопродуктивные 9 6,11 1.3

(10) (Т,5) (1.8)

низкопродуктивные ? 0.22 0.22 ЭОКЭ

высокопродуктивные 9 3.44 0.9

{10) (5,0) (1,75)

Одно животное было исключено из статистического анализа согласно правила 3<г.В скобках приводятся данные с учетом этого животного.

3,22 Р < 0,01 (4,78) (Р<0,05)

Как видно из расчетов,выход эмбрионов у коров доноров ву-сокоэмбриопродуктивных подгрупп, отобранных по ЛЛТазному тесту приближается к средним показателям экбрнопродуктявности здорозых животных. Для проверки полученных результатов применялся ;1ДНофа к торный дисперсионный анализ, где подгрулпи использовались в качеств-з градаций АЛТ.Результаты дисперсионного анализа в целом совпадают с результатами линейного и ае.-шнейлого корреляционно-регресионкых анализов,что подтверждает точность расчетов.Согласно результатов дисперсионного анализа 1-й группы установлено,что сила влияния АЛТ на обшнй эмбриосбор - 50 6,а на выход качественных эмбрионов - ¿3 5, этого вполне достаточно для прогнозирования результатов сугеровуляции.

Регрессионен анализ данных по 1-й группе выявил нижнюю границу эн&риопродуктивности между низко и высоэмбриопродук-тизными животными ( по 30 к ЭОКЭ ) — для большинства животных она находится б диапазоне 17 НЕ/Л активности АЛТ,а также верхнюю границу эмбриопродуктивности по ЗОКЭ между низко и высско-эмбрипродуктивными животными - ока находится в диапазоне £4 ИБ /Л активности АЛТ.

Литературные данные представленные г таблице 5 свидетельствуют о тон,что в большинстве случаев факторы прямо или косвенно влияющие на размер эмбриосбора влияют также и на активность АЛТ крсвк изучаемых животных.

Вышеизложенное позволяет предложить,измерение активности АЛТ плазмы крови коров доноров,как метод прогнозирования результатов суперовуляции.

4.2. ВЛИЯНИЕ ВРЕМЕНИ ВЗЯТИЯ КРОВИ НА ТОЧНОСТЬ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ .На втором этапе исследований, после того как стало ясно ,что наиболее подходящим методом для прогнозирования результатов еупероБулкции может служить измерение активности АЛТ плазмы крови коров доноров эмбрионов,необходимо было выяснять:вли-яет ли физиологическое состояние животного (день полового цикла) в момент взятия крови на точность прогнозирования .С

ристж i

РЕГЯШЮШЬЙ АНШЕЗ ЖЕДГ АКГИВЗХГГЫЗ МГ ПДАЗШ КРОВИ И Э^етюПРОДЛСТЙЗШСШ) КОРОВ ДОЗОРОВ ЗЖРИОШВ

Активность АКР плазму крови Iffi/Л,

первая группа

а) прямая - линия регресс es мазду активность» АЛТ плазмы крови и 30

б) парабола - линия регрессия кзззду активностью АЛТ алазш крови, z ЭОКЭ

кторая группа - линия регрессии ы&члу активность» AIT плазш крови и ЭОКЭ

уровень 3-х эмбрионов,граница ыезду шсо-

KO И Н23КОэмбриодродуКТИЕ.ЧШЗ животными.

СОПОСТАВЛЕНИЕ JW ГЕРАТ УРН Ш йШШ О ЗАВИСИМОСТИ АКТИВНОСТИ ЛЛТ ПЛАЗШ КРОВИ И РАЗМЕРОВ СУПЕРОВУЛЯЦИИ У КОРОЗ ДОНОРОВ ЭМБРИОНОВ СТ ОДНИХ H Т£Х ЖЕ ФАКТОРОВ

-ямттт-

факторе!

Уровень суперовуляции

Уровень При недостаточном пита-

кормления нии уровень суперовуляции у коров снижает ея.ФИШ Р.Э,( 1983);

Й.Е (1972); бТАКЙЯШЕ 8.В.,(1979); МАТОАЕЗЕ С.^ а1.( 1985) Порода Мясные пород» порода

р дн более реактивны на гонадотрогтную обоаботку чем молочные.ГОЯАИВОН Ь.Е.,(1984)¡ПРОКОФЬЕВ М.Й.Л1984)¡ГОНЧАРОВ В.П. КАРЛОВ В. .(1933) Нарушения обме- При нарушении обмена

: АКТИВНОСТЬ-

: АЛТ

"Даже кратко-

временное голодание вызывает резкее повышение уровня акта вкости АЛТ.ВАМСЗШ О. еХ а1. ( 1989)¡КОЕГО Р.

а1.{ 1959) У мясных пород активность сыворотки крови в 1.5-2 раза выше чеу у молочных.ПОКРОВСКИЙ А.А.(1986);КУЛИШ Л.В,, (1981)

В.,

на веществ

Сезон года

Секреция эстрадиола

веществ у коров доноров уменьшается уровень эмбриосбора. ШЬКБВИЧ с.н.АЯЙБАЕЗ Р.И. (1991): ГОРДОН А.,(1981) Уровень суперовуляции зависит от сезона года. СМЫСЛОВА Н.Я.,(1985) ГОРДОН А.{ 1981); ВДИРСЕТТ Й.ДИЙТ Р. {Î986);НЯК0ЯН П.Е. i Î985)¡ПАВЛОВ В.А. (1984)¡ПРОКОФЬЕВ М.ИЛ 1983).

При несбалансированном протеиновом питании активность АЛТ сыворотки крови увеличивается BOU О.А. ( 1991 ) ¡ROS33J F.H. et al,(1959)

Активность АЛТ сыворотки крови независит от •сезона года.НТТНКБОН D.S.P. Л 1967);RAIK£R U.R (1964)

Витамин Б6

В определенные дни астрального цикла уровень концентрации эстрадиола сильно коррелирует с величиной эибри-осбора.МЕНЮЮ А., ег а1Л1991);РЯБЫХ и дрЛА.с, 1304182) Инфекции витамина В перед гормональной обработкой у коров доноров увеличиваю? уровень эмбриосбора ЧОРКЕНЬШ Т.К,и ; ДР.(1939)

С увеличением сек -реции эстраднола в сыворогке крови возрастает активность АЛТ,1ИСАЕ У.,еЪ а1. (1991);ВА1ЮБ0Н О. 13., ег а1. ( 1989);ВАНЕ-СЯН А.СЛ1989),

При авитаминозе В5 в животном Организме активность АЛТ уменьшается,

( ко не концентрация катившего фермента)

- 16 -

этой целью были проведены исследования на второй ( п - 7 ) и третьей ( п - 21 ) группах животных и результаты этих исследований сопоставлена с данными полученными на 1-й группе.Условия исследований в этих группах отличались ох первой только тем,что во второй груме образцы крови отбирались не на 8-10

день полового цикла,как в первой группе,а произвольно,на протяжении первых десяти дней полового цикла.В третьей группе день полового цикла у тестируемых животных не определялся.

Используя выявленные в результате регрессионного анализа данных 1-й группы границы знбриопродуктнвкости между низко и вы-соэмбриопродуктивны»и животными ( по ЭО и ЗОБЭ ) коров-доноров 3-й группы разделили, на'две 'подгруппы - с низкой (активность АЛТ плазмы крсан 16 ИЕ/Л и ниве) и высокой_ эмбриадродуктив-ноотью (активность АЗТ плазмы крови 17 ЙЕ / Л и выше ).

Сравнивая результаты статистического анализа' 1-й и 2-й групп ,необходимо отметить, что прогнозирование и в этом случае возможно { табл. б ) ,во граница энбриопродуктиеностн несколько смекается в сторону уменьиения (рис, 1).

ТАБЛИЦА 6.

СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ КОРРЕЛЯЦИОННОГО АНАЛИЗА 1-й И 2-й ° ГРУПП КОРОВ ДОНОРОВ ЭМБРИОНОВ

1 - я 2-я

группа группа

Бремя взятия крови 8-Ю день 0 - 1Й день

астрального астрального

цикла цикла

¡Количес- ! ' \ ! Количёс! ;

тво жн- ¡г 1 Р< ! тво жи-| г | Р<

1вотных ¡{или и) \ 5 вотных ¡(или п)!

Ж!--57П-ЕШ-?-ОЗ-*

ЭОКЭ 18 0.75 0.01 7 0.71 0.1

»- недостоверно

Сравнивая результаты статистического анализа 1-Й и 3-й групп ,можно сделать вывод, что прогнозирование возможно даке в этой случае (взятие крови в любой из дней полового цик-

ла),так как отобранная по АЛТазному тесту высокоэмбриопродук-тивнан подгруппа имела значительно больший эмбриосбор чем низ-

коэмбриопродуктивная,

ТАБЛИЦА 7.

СОПОСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СТАТИСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА 1-й И 3-й ГРУПП КОРОВ ДОНОРОВ ЭМБРИОНОВ

:Низкээмбриопродуктивная ;Высокоэмбриопродукти вная

: подгруппа : подгруппа

: ИР.щ : ЬР m

1-я группа ЭО 0,76-0,28 6,11tl,3

ЭОКЭ 0,22-0,22 1* tt ItWITM fMft*H(l Hltnl' »♦ »t » »1 И *MI t» tt f » tf H rttt Hftn MHtttlf 3,44Î0,9

3-я группа ЭО 3,36-0,83* 9,C£l,95

ЭОКЭ 1,27^0,49* 4,55^1,37

* - данные за первую предиествующую взятию крови суперовуляцию

4.3. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.Установлено,что использование сыворотки крови вместо свекезамороженной при температуре жидкого азота плазмы крови недопустимо,а также т„,что активность АЛТ плазмы крови лабильный показатель.С изменением активности AIT изменяется соответственно у одних и тех же животных н эмбриосбор.

5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Сопоставление собственных данных с литературными косвенно говорит о том,что различие в метаболическом профиле низко- и высокоэмбриопродуктивных животных вызвано различием в суммарной секреции эстрадяола фолликулами исследуемых животных (табл. 8 ).

5.1. ФЕРМЕНТЫ И ОБМЕН АЗОТА.Наша гипотеза предполагала наличие статистической связи между активностью некоторых из зстрадиолзависимых ферментов крови н уровнем суперовуляции коров доров эмбрионов. Ими оказались аланинаминотрансфераза и дактатдегидрогеназа. Активность крегтинкиназы.судя по динамике

ТАБЛИЦА 6.

СОПОСТАВЛЕНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ КОРОВ-ДОНОРОВ ЭМБРИОНОВ t-Й ГР/ППЫ С ЛИТЕРАТУРНЫМИ ДАННЫМИ (БОЗДЕИСТВИС ЭСТРАДИОЛА)

ФЩ-ОР : воздействие : Собственные

: эстрадиола на : исследования

: фактор( лит. 4

данные)

ÎTT

Повышение уровня эстрадиола приводит к усилении синтеза АЛТ .геномом клеток.ВАНЕСЯН А.С.-( 1989) ;KAGAE Y'.et . al.(1991)îSNELL E.'B; (1952)

Повышение уровня эстпаднола приводит к усилению синтеза ЛДГ геномам к легок .'¿ANCSON 0. ,et al,( 1989).

Повеление уровня эстрддиога приводит к увеличению концентрации ТГД в гглазче крови крупного рогатого скота.FOREES J.M.0984)

Повышение уровня эстрадиола приводит к увеличению потребления печенью гликоген» и уменьшения уровня печеночного глюкснеогене-за.ЕШЕНЗ J.M.0984).

Повышение уровня эстрогенов приводит к увеличению синтеза белка в печенл FOKBES J.M.(19S4>

йизкозмбриопродуктквные животные имели пониженный уровень активности по сравнению с

высокоэнбриопродуктив -ними.

Ни зкоэ мбри о с родукти в ные животные имели понижен-чый уровень активности по сравнения с'

зысскоэмбриопродуктив -ним«.

Низ к о эмб ри оп родукти в ные кивотные имели пониженный уровень чонцентрации ТГД плазмы крови

по сравнению с

гиспкоэибриопродухгив -ними.

Низ коэмб р иоп родукт й В НЫ f кивотные имели позшпк -нын уровень концентрации глюкозы плазма крови ос сравнение с

высокоэмбриопродуктив -ными.

Ни з коэмбр иоп родук т и в ны е животные имели пониженный уровень концентрации альбумина плазкы крови по сравнению с высоко-экбр иопродуктн вными

ЛДГ

ТГД о

Гллкоза

Белковый синтез

изменения концентрации креатин «ша также статистически связана с эмбриосбором,Наиболее устойчивая и достоверная связь по результатам наших исследований установлена между активностью АЛТ 30,Э0КЭ.Но некоторые результаты трудиообьясн;:мы,

1.Связь между общим количеством вымываемых качественных, дегоадировань:х эчбриснов и ^оплодотворенных яйцеклеток.и акттностью АЛТ плазмы крови прямойролорцнональная (линейная}, тогда как между количеством вымываемых качественных эмбрионов и активностью А-1Т - параболическая (нелинейная).Зго согласуется с работой ЕШг£1оп З.Е.ег а1 -(1989), а которой показано ,что инье.;цня норовам и телкам донорам эмбрионов экзогенного эстрадиола присудит к увеличению 30 но ЭОКЗ при этом резко уменьшается особенно у телок,что еще раз косьенно подтверждает эстрогениую природу изучаемого феномена.Другими словами -инъецирование больших доз экзогенного эстрадиола приводит к увеличению выхода суммы качественных.дсгенерированных эмбрионов и неоплодотворенных яйцеклеток,но доля качественных зморионов при г том резко уменьшается.Логично предположить,что такая же картина должна наблюдаться и у животных с высокой суммарной секрецией эстрадиола. Если исходить из той точки зрения ,что чем выше активность АЛТ тем больше концентрация эстрадиола в «рови коров доноров,то ?се становится понятным.

2.Статистическая связь между активностью АЛТ плазмы крови и уровнем суперовуляции коров доров эмбрионов сохранялась во всех группах животных,несмотря ва то,что образцы крови з разных группах отбирались в разные дни эстрального цикла.Как известно,у короЕ во время эстрального цикла наблюдается несколько пиков эстрадиола.Первый пик выброса эстрадиола наблюдается по данным одних авторов непосредственно перед охотой,1 по данным других авторов - между 48-м и 24-м часами до начала охоты .Второй подьем уровня эстрадиола в крови коров установлен в период начала полового цикла с 1-го по 5-й день. В исследовании Уагшап Р.Л.ег а1-(19б4), продемонстрировано такаю

повышение уровня эстрогенов в крови у короз между б-м н 8-м днями цикла. Третий пик подьека концентрации эстрогенов С эст-рона) Hansel Vi.« EctiternKamp S.F.-(1972) наблюдали между 13-16 днями полового цикла.

В первой группе мы брали образцы крови между 8-Ю днем полового цикла.По данным многих авторов именно Б эти дни ( 1 -8 ) наблюдается максимальная корреляция эм0р;юсбора с уровнем эстрадиола Учитывая то .что период полужизни фермента АЛТ составляет 3,5 дня то по всей видимости в этом случае урорекь активности АЛТ отражает ^суммарную секрецию эстрадиола(и уровень суперовуляции .соответственного время второго пика. Во второй группе ооразцы тфови отбирались между 0-10 днем полового цикла,Корреляция между эмбриосборок качественных эмбрионов и активностью АЛТ плазмы крови*, в этом случае сохранилась достаточно высокой,но резко понизилась граница между высоко- и низкоэмбрнопродуктивными яивотными.К такому результату по нашему мнению привело то,что в этом случае уровень активности АЛТ отражает суммарную секрецию эстраднола фолликулами во время первого , второго пика и между ними. Но в"принципе эти результата согласуются с положениями рабочей гипотезы.

Трудно объяснимыми кажутся результаты исследований ло 3-й группе.В этой группе сохранилась довольно значительная разница в уровне змбриопродуктивности К1чественных эмбрионов по высоко- и низкоэнбриопродуктивным подгруппам сформированным по АЛТазному тесту. Несмотря на то,что в данном случае мы брали образцы крови независимо от физиологического состояния животных с имеется ввиду - дань полового цикла ).При взятии образцов крсви у животных 3-й группы день полового ци.сла не устанавливался. &* этом случае увязать активЕюсть АЛТ с суммарной секрецией эстрадиола довольно трудно,так как секреция эстраднола яичниками,,в разные периоды полового цикла сильно различается.Сопоставление литературных я собственных исследований в таблице 5" позволяет предположить, что активность АЛТ плазмы.

крови может служить интегральным показателем энбриопродуктив-ности коровы доноэа, так как ее активность и концентрация ча-тивного фермента в плазме крови регулируется помимо гормональных и другим» факторам;;,которые изменяют эмОриопродуктивиось кс.ров доноров.

Процессы гереаминирования ,6ел!;ового обмена и величина эмбриосбора у коров доноров ■эмбрионов теснг связаны Друг с другом,Низкан концентрация обгега .небелкового к аминного азота цельное кров*; и повышенная активность ЛАТ плазмы крови указывает на повышенную активность процессов переаминирования к белкового обмена.Такие животные имеют повышенный эмбриосбор.

Устойчивая I"'вязь также наблюдалась между уровнен креати-нина и общего билирубина плазмы крови с одной стороны и эмбри-опродуктивность» «цветных с другой.Пониженный уровень билирубина у низкспмбр!-,опродуктиЕ1Шх иивотиых ноее? также свидетельствовать о не полной обеспеченности этих животных железом.

возрастание уровня концентрация креатинкна у высо-чоэмбрилпродуктиьной подгруппы отражает усиление

протеолитических процессов.Кроме того,повышенный уровень кок-цеьтрации иреатинина у выескоэ'мбриопродуктившй подгруппы свидетельствует о повышенной активности эстрадиолзависимого фермента - креагинкиназы.Повышение уровня концентрации небелкового азот*; у низкоэмбриопродухтявной подгруппы, свидетельствует об усилении процессов белковой деградации.

Повышенный уровень концентрации альбумина ,обаего протеина высокоэмбриопрсдуктивные коров доноров по видимому отражает включение генов находящихся под контролем стероидна гормонов ответственных за матричный синтез некоторых белков, Кроме того,повышенный уровень концентрации альоумина свидельствует о 'повышенном содержании стероидных гормонов в плазме крови,так как среди альбумине? есть специфические стероидсвязывасщие бзлки.

Полученныеданныа свидетельству»! о высокой гэаимосвяэи уровня азотистого обмена и процессов воспроизводства у коров доноров эмбрионов.

б.ГЧЛНПЙДННЙ ОБМЕН.В наших исследованиях статистическая связь между уровнем концентрации фосфо- и общих липидов цель-вой крови коров доноров н их змбриссборок пе наблюдалась,загс уровень концентрации триглицеридов плазмы крови достоверно коррелировал с эмбриосРором херов доноров. Согласно литературным данным фолликулы коров-доноров э*5риоков с высоким эмбри-осбором суммарно секретируют больше эстрогенов чем кизкоэмбри-опродуктивные.В обзоре Forbes J.M.- (1984), показано,что увеличение уровня эстрадкол? приводит к увеличению уровня тригле-цирпдов плазмы крови крупного рогатого скота,увеличивается ли-' потропирлипазная активность в адипоцитах крыс,кроме того обработка эстрогенами приводит к увеличению синтеза СНК к белка в печени,что приводит я увеличению потребления печенью гликогена н уменьшению уровня глюконеогеиеза .В наших исследованиях уровень концентрации глюкозы плазмы крови достоверно и отркдцательно коррелировал ; уровнем ебцеге эмбриосбора,Участие жировой ткани в процессах размножения довольно неизученная область.Фэиш Р,- '1988) предполагает,что жировая 1Кань организма непосредствэнно участвует в регуляции детородней функции,поскольку часть эстрогено.» синтезируются из андрогеиов в лиловой ткани.Возможно уровень триглицеридов в какой -г» мере отражает интенсивность вышеупомянутых процессов,

5,3.МИНЕРАЛЬНЫЙ ОБМЕН.В нашем исследовании установлена положительная статистическая гвязь между уровнем Са в плазме крови и эмбряоебором качественных эмбрионов ( г=0.52 Р< 0,05). А между уровнем ионов С1 в плазме крови и эмбриосборок. (30, ЗОНЕ) по нашим данным статистическая связь не наблюдается.

Таким образом, на основании изученных зависимостей установлено,что высокоэмбриопродуктивные коровы донора имеют повышенную активности АЛТ я ДДГ плазмы крови,а также повышенные уровень концентрации альбумина .общего протеина.

креатинина.Са,общего билирубина,триглицеридов плазмы крови по сравнению с ниэкозмбриолродуктивными,и пониженный уровень кон-ценрации глюкозы плазмы кроен,общего, аминногои небелкового азота ьцельной крови соответственно.НаиСолевсильная и достоверная связь по результатам навих исследований установлена ^ между активностью АЛТ плазни крови и общим эмбриосбором и эмб-риосбором качественны* энбркоков.

ВВВОДН

Усть .влено наличие связи между уровнем активности

1, некоторых эстрадиолзависимых ферментов плазмы крови ( АЛТ , ЛДГ й креатинкиназы ) с результатами супе" ровуляции.

Высокоэмбрнепродуктивные коровы доноры имеют повышенную активность АЛТ я ЛДГ в плазме крови,а также повышенный уровень концентрации альбумина .обоего

2. протеина,креатинина,Са,общего билирубина,триглицеридов по сравнению с низкоэмбриопродуктивныни,н пониженный уровень концентрации глюкозы в плазме крови,а также обцего, аминного и небелкового азота » цельной крови ,

Наиболее устойчивая н достоверная связь установлена

3, между активностью АЛТ плазмы крови к общим эмбрмос-бором,а также эхбрносборон качественных эмбрионов.

Активность АКТ вдазки крови хаСияъний показатель.С

4. изменением активности АЛТ изменяется соответственно и эмбриосбор" ксрОв доноров.

- гч -

Активность АЛТ плазмы крови полученной в промежутке

5. между двумя суперовуляциями свидетельствует только о результатах этих суперовуляций.

На основании результатов дисперсионного анализа ус-

6. тановлено.что сила влияния АЛТ на общий зуШриосбор - 50 на выход качественных эмбрионов - 43 %.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Выявленная закономерность может использоваться для прогнозирования суперовуляционного ответа яичников коров-доноров на гормональную обработку.отбора коров в стадо доноров,и для выбраковки коров из стада доноров, Для прогнозирования результатов суперогуляцкя .нужно использовать метод' определения активности АЛТ в плазме крови.Для целей трансплантации эмбрионов отбирать доноров с уровнем активности АЛТ плазмы крови в диапазоне 17-24 ИЕ/Л. на 7-10 день астрального цикла.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕШЕ ДИССЕРТАЦИИ:

о

\.Зависимость результатов суперовуляции у коров-доноров эмбрионов от уровня активности АЛТ плазмы крови /БОЙКО А.Г.,МАДИС0Н В.В..МАДИСОН Л.В.,САДИКОВ В.Л.//Доклады ВАСХНИЛ.-1991,- Я.8.- С,39 - 42,

2.БОЙКО А,Г,Зависимость результатов суперовуляции у коров -доноров эмбрионов ог уровня активности аланннамннотранеферазы плазмы крови.//Задачи молодых ученых в повышении эффективности сельскохозяйственного производства:Материалы 3-й Республиканской научно-практической конференции молодых ученых к специалистов (животноводство,ветеринария).- Алма-Ата,- 1991,-С.8 -9.

П«дпас&н* (гпечат* г. Тира* Ю »xi. Заказ 762.

- Объ«к л.

ПШ1 ВЖа