Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биохимических подходов к пренатальной диагностике лизосомных болезней накопления

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка биохимических подходов к пренатальной диагностике лизосомных болезней накопления"

РТБ ОА г I ДОК 1995

российская академия медицинских наук 1вдико-генетическ11я научный центр

На правах рукописи Ш 616-056.7+577.1

гарпун сергеи сшенович разработка биохимических подходов к -пеенатальнои

диагностике лизосомных болезней накопления

03.00.15 - Генетика

автореферат дасертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

л

Москва — 1995

Работа выполнена в лаборатории неслэдстЕзнных болезней обмена Научного медико-генетического Центра РАМН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор К.Д.Кр8снопольская гандвдат медацзнских наук, ' Г.В.ЫиренОург

Официальные ошюнентк: доктор биологических наук И.В.Цветкова

доктор Сиолоютеских паук В.А.Слеше • '

Ведущее учрездеше - Российская медицинская академия госледишкшого образования ЫЗ и Щ РФ

' Защита состоится "_"___19_г. в__ часов

на заседании КМГЦ РАМН по адресу: г.Ыосква, 115478, ул.Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Цэнтра.

Автореферат разослан -;___19_г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

доктор биологических наук /Л.Ф.Курию/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ .

Кэследствэнныэ болезни, в том числа наследственные болезия обмена, играют большую и все возрастввдую роль в патологии человека. Их удельный вес возрастает в связи с успехами профилактики, диагностики и лечения приобретенных заболеваний. Лизосомнне болезни накопления представляют собой самостоятельный класс наследственных болезней обмена. Этот гсласс включает около 40 нозологических единиц, преимущественно сублетальных з некурабельных.

¡1а данном этапе развития медицинской. генетики каузальные метода терапии ЛБН в виде заместительной

энзикотералги только начинают внедряться в практику мирового здравоохранения и недоступны отечественным больным (ноььз л.я., 1990). Единственным эСЕфективннм методом их профилактики ( является прягатальная диагностика в семьях высокого риска, уже рсдаьшях больного ребенка или выявленных с гошзьв программ скрининга на гетерозиготное Еосительство (Миренбург Т.В. с соавт.,1988, 1989; Цветкова И.3.,1991; меО'ег п.л.,1990).

Программа диагностики и профилактики ЛЕН, разработанная и фуЕкциошфущаа в лаборатории наследственных болезней обмена веществ КГЩ РАШ на базе кооперации с медико-генетическими консультации®' страны, позволила' осуществить ' локуснун диффзренаиадаз 16 ЛБН у 199 больных из 742 семей и ПД 9 ЛБН в 47 сетях к началу данного исследования (Мирэвбург 1.3., 1992). Однако, целый ряд задач, связанных, главным образок, с пренатзльЕой, но теккэ и ггостнатальной диагностикой ЛЕЯ оставался нерешенным: 1)экспрессгш активности широкого ряда ЛФ в норме, у гетеро- и гомозиготных носителей мутаций в соответсвункщх структурных генах не била исследована, что препятствовало внедрении пост- и црепатальной

Сокращения, использованные в тексте: 4-МУ5 4~ме,тлуказлл2фзроЕ; АЕ - эмшгатгческвя жидкость; ГАГ -гжссозамвЕоглакана; ЛБН - лизосомнне болезни накопления; ЛФ -лизосомЕке феркевтн; - КПС - мукополисахэргдозы; ПД . -презатальная днапгоспгааг ЙР - флшрж?этричэскоэ титрование;

диагностики*- соотвегствущшс ЛШ; Анализ экспрессии вновь вводимых в практику ЛФ в нормальном 2 патологическом материале необходим для оказания медико-генетической помощи отягощенным семьям и для характеристики биохимического полиморфизма популяции. 2) ряд субстратов для энзимодиагностики ЛЕН, распространенных в популяциях страны, работали неэффективно или оказались коммерчески недоступными при новых экономических условиях или вообще отсутствовали на ринке;. 3) наряду с качественной оценкой метаболитов в ¿К необходимо' было развить количественные методы; _

РЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью данного исследования являлась разработка биохимических подходов к 1Щ ЛБН. При этом решались следущие конкретные задачи:

1. Разработка нового высокоспецифичного метода для количественной оценки гликозаминогликанов в АК.

2. Количественное исследование содержания ГАГ в биологическом материале плода и при беременностях высокого риска для НПО с помощью метода 5И.

3. Исследование экспрессии ЛФ (п=б) в биологическом материале гомо- и гетерозиготных носителей ЛЕН;

4. Исследование динамики экспрессии лизосомных ферментов на разных триместрах, беременности в биологическом материале беременных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Изучена экспрессия вновь вводимых в программу диагностики к профилактики ЛЕН ЛФ в контрольном биологическом материале у гоко- и гетерозиготных носителей ЛШ, а также в плазме и лейкоцитах женщин на разных сроках беременности. Наряду с коммерчески доступными субстратами (р -нитрофенил-^-о -маннэпиранозид, 4-МУФ-а-+<-ацетил-о-

галактозаминвд, 4-МУФ-р-м-ацеталглюкозамин-б-сульфат,

6-11ексадекансшамиЕО-4-ШФ-р-о-галактошфанозид, . ■ были использовано два вновь синтезированиях нами радиоактивных субстрата для измерения активности идуронатсульфатазы и церамидазы. Существенно, что оба субстрата в настоящее время вообще коммерчески недоступны и первый из них-необходим для пре-5 и постаетальной даагаостики самого распространенного в

а

популяциях России ЛЕН - МПС, тип II. Второй субстрат, меченый тритием церамид, был получен в связи с необходимостью верификации клинического диагноза болезни Фарбера у пробанда и с успехом■ применен для Щ в той же семье.

Разработан новый метод количественной оценки ГАГ в АН и ККАЯ, оснований на изоляции и фяюриметрнческом титровании этих метаболитов. Доказана высокая разрешавшая способность метода в даффзрзнциации разных типов ШС, обусловленных мутационной блокадой метаболизма различных типов ГАГ как на рефернсных образцах мочи, так и на диагностических образцах АХ и КХАЖ. Исследованы нормальные уровни ГАГ, суммарных и -изолированных, на образцах Ш, полученных во II триместре и ШЖ. Практическая значимость * полученных результатов определяется необходимости) постановки ПД ШС в ряде случаев только на ^сновании исследования ГАГ.

Основной практический вклад данного

исследования заключался в осуществлении ПЦ в 31 семье высокого риска для ЛБЕ при 34 беременностях. Предотвращено .рождение, 7 порагенЕых плодов. Результаты ВД верифицированы у абортарованнх плодов и новорожденных. ЖШЗЕНКЯ, ВШОСИШЕ НА ЗАЩИТУ. -

1.Изменение кинетики количественной экспрессии 5 • лизосомных ферментов 'в плазме и лейкоцитах крови беременных

от I к III триместру беременности.

2.Новый количественный высокоснецифаческий метод оценки гликозгминоглкканоз в Ш и ККАЖ в контроле и при беременностях высокого риска для МПС.

3.Получение меченного Зн-субстрата для опроделения активности идуронатсульфатазы, недостаточность которой : приводит к ШС, тип и .

4.Получение моченного Зн-субстрата для определения активности церашдазн, недостаточность которой приводит к болезни Фарбора.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты исследования были представлении на I (III) съездэ медицинских гекатаксв РФ (Москва, 1994), II съезде педиатров и акушзр-гжЕеколсгов Республики Молдова (Киеинэв, 1ЭЭЗ) и ка научном семинаре института клинической генетики

МГНЦ РАШ, состоявшемся в 23 ноября 1994 года. ПУБЛИКАЦИИ. Оэ теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. СТРУКТУРА И (ВЬЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Дисертация состоит из следукадих разделов: введений, ' обзор литературы, материалы и метода, результаты и их обсуждение, вывода, общее заключение и список литературы. Работа изложена на страницах машинописного

текста, содержит таблиц, рисунков, библиографический указатель содержит наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ Обследованный контингент. Обследованы больные дети с Гурлер-подобшм и Моркио-подобным клиническими фенотипами (п=215). Семьи для обследования направлялись в Научно-консультативное отделение МГНЦ РАШ из МГК страны. Беременные жевдины (п=31), из семей высокого риска для ЛБН.

Контрольная выборка была представлена беременными женщинами на первом <л=28), втором (п=27) и третьем (п=34) триместрах беременности, посещавшие женские консультации родильных домов (no 27 г.Москвы и no 4 г.Кипинева Республики Молдова).

Контрольные групш в данном исследовании были представлены донорами Всесоюзного научного онкологического Центра • АМН СССР, • детьми с ■• исключенной ■ наследственной патологией.

Материал для исследования. Материал для исследования был представлен бкоптатами ворсин хориона и плаценты, амниотической кидаостью, Детальной кровью и венозной кровью беременных дтящия, мочой больных ЫПС. Биоптаты хориона получали методом трансцервикальной биопсии под контролем ультразвуковой аппаратуры с помощью хориокана типа "Portex" sa 8-10 неделе Овременноеш от жешщн из группы высокого риска ЛБН и от контроля (медицинские абортусы), биоптаты плаценты и АЖ - методом трансабдоминалъного хориоцентеза под контролем ультразвуковое аппаратуры на 22-26 неделе беременности из группы высокого риска ЛБН. Образцы биоптатов транспортировали в лабораторию в сосуде с кулътуральной средой. Фетальнув кровь получали метода кордоцентеза на 20-24 недели беременности.

Биопсии хориона получали из акушерских стационаров -Московского городского Центра ЦД, родильнный дом 27 (врач

E.B.Юдина) и родильного дома no 8 (врач М.И.Кузнецов).

Процедуры, связанные с обработкой биоптата хориона, выведением культуры - клеток амниотической жидкости производились в лаборатории наследственных болезней обмена пецэств. В получеши первичных, культур клеток по ранее описаной методике принимала участие врач-лаборант ШЩ РАМН В.А.Малахова (Золотухина TJB-, Цветкова И.В. и соавт., 1982). Лейкоциты знделяли по методу snoog и Geck, 1956. Тканевые и клеточные гомогенаты готовили стандартным методом как описано

У Galjaard, i960.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЯАТйЯОГИЧЕСКИХ МЕТАБОЛИТОВ. Измерение флюоресценции свободного фяторокрасителя и комплексов ГАГ-флюсрохром с цель» количественного определения гл^козаникогликанов методом фяюриметрического титрования осуществляли на спектрофяюорикетре Hitachi-eso (Япония} при Хваз0=355 нм, A.¡ju¡bop=450 ем в кварцевой кювете сечением 1x1 стд, содержащей 2 мл рэствора ДАФЙ (водного, рн 5,6-6,0 или в 0,005 U h_so4, рн 2,0) в рабочей концентрации 5-Ю-6 М (Л.Горшее, 1984).

Перед псследозвгяен мочу даалззовали 24 часа при 4*С против 1000-кратного объема дистиллированной воды. Количественно определяли экскратируемые ГАГ методом фгоориметрического титрования раствором ДАФй в концентрации 5- 1С-6 М, как для стандартов!' Результат выражали в мг ГАГ на ыг креатина.

Выделение в очистку ГАГ из АЖ осуществляли как списано

(Lee G.L. et al., l^ao, Whitemsn Р. anc! Kenderson H. é 1*577).

Высушенные осадки ГАГ, выделенные из АН, растворяли в 50-100 1жл деионизкрозашой воды и определяли их концентрацию с помоги® фшооримзтрического титрования по методике описаной вниз. Результат выракалз в мг/мл Ш.

Иогослой ККАЖ, вкращенный в хультуральных сосудах (40 см2) стандартам методом (Золотухина Т.В., 1977) разрушали ультразвуковой обработкой. Белки клеточного гомогената переварзшалк палашом (100 кг в I и 0,2 И ма-ацетатного буфера, рн 5,5, содзряащ его 20 кЧ ЗД?А ж 20 мМ р-меркаптоэтапола}-, 18 час при вО'С. После цектрн^угарования при 2С0э 10 ига ГАГ из супернатаитз осаждали 5% раствором НИХ

В физиологическом раствора- (Lee G.J.-t. et el.., 19во) .флюориыетрическое титрование производили как описано ранее. Результат выражали в ыг ГАГ/мг белка.

При выделении ГАГ из печени и мозга абортусов кусочки ткани промывали физиологическим раствором, гомогенат готовили в 4 М Nací, центрифугировали, из супернатанта выделяли. ГАГ как описано (Whiteean P. and Henderson Н.,1977). •..

Электрофоретическое фракционирование ГАГ4 осуществляли на ацетате ллшюзнкх пленках: одномерный электрофорез - по

МвТОДУ (Wessler, 1968), ДВуМврНЫЙ ЭЛвКТрОфОрвЗ , - ПО МвТОДУ (Whiteman P. and Henderson H., 1977). В КаЧЗСТВв стандартов

использовали хондроитинсульфат, дерматансульфат, гиалуроновув кислоту (Seikagaku Kog/o Co., ЯПОНИЯ); Стандарты гепарансульфата и кератансульфата были приготовлены из мочи пациентов с ШС т а и ШС iv а соответственно, путем обработки суммарной фракции ГАГ хондроитиназой ABC (Kimata et ai., 1973). Для подуколичественной оценки ГАГ' в AS использовали принцип метода (Hronowski, Anastassiades, 1979), разработанного для стандартов ГАГ и • заключающегося в спектрофотометрическом измерении концентрации вльцианового синего, связавшегося с индивидуальными ГАГ при окраске электрофореграш, после_ разрушения комплекса враска-ГАГ диметилсулъфоксидом.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЫУТАНХШГ ФЕШЕЯТОВ. Измерение активности М в рззнородом биологическом материале осуществляли с помощью флворогенных (производных 4-ЫУФ), хромогенных (производных п-нитрофенола, п-нитрокатехола, фенола, гексадеканола) как описано в литературе (Galjard Н., 1980; O'Brien J.S., 19B0¡ Hall С.М., 1978; Gall A.E. , 19B6;). Концентрацию фЯВОрОГвННОГО

продукта фервантной реакции - 4-МУФ - определяли на сдактрофлвориыетре Hitachi -850 (Япония). Концентрацию хромогенных. продуктов ферментной реакции определяли на спектрофотометре Beckaan DU-50 (США) (Galjaard, 1980). Концентрацию каленных продуктов ферментной реакции определяла на сцинтиллядазяном счетчике магк-ш (США). Кроме • методов энзимодивгностики для лохусвой дифференциации ЛБН использовали -методы изофокусирования и термофракздяонировакия гексозаминидаз

(Na von R. et al., 1976; O'Brien J.S. et al., 1970).

Комг."-ттаски недоступные субстраты для энзимодиагнастики О- <ин--цдошршо ¿илуроновая нислота-2-сульфат )-{1-> 4 )-2,5-8Нгидро-о-с3нз-мзяЕРТол-6-сульфат и Зн-дерамид были статезирсваны на базе методов I.G.Ledsr et al., 197В и

Schwarrmann в., 1978 ПОД РУКОВОДСТВОМ K.C.H. В.С.АХУНОВа.

Концентрации уроновых кислот определяли по методу • '

Т.Sitter and И.ti.fluir, 1962. КОНЦеНГраЦКЮ ОвЛКЗ ОПрвД8ЛЯЛИ ПО методу Bredfctrd, 1976.

При статистической обработке результатов использовали общепринятые методе (Лакин Г.Ф., 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСЗЭДШЕ ' I.Количественная' сценка биохимических маркеров мукополисахаридозов - ГАГ методом фляориметрического титрования.

Ранее в лаборатории наследственных болезней обмена был -разработан оригинальный метод количественного определения содержания ГАГ в водных ргстворах методом флюоркметрического титрования катисвнкм фдюорохромом ДАК1. Принцип этого метода был использован нами для количественного определения. содержания ГАГ, суммарных путем титрования при рн 5,6 и индивидуальных (ГС, КС) путем титрования при рн 2,0. Поскольку ГАГ поступав в М главным образом из мочи плода метод - отрабатывали ее водных растворах стандартов ГАГ и рефзренсннх образцах мочи от больных с точно идентифицированным типом Ш1С.

При использовании 22 образцов мочи от пациентов с НПО i, п, in. iv" и нормальных образцов мочи было4-показано, что суммарное содержание Г1Г мочи достоверно отличалось от контроля для всех тшов МПС. Содержание ГС достоверно отличалось от контроля при МПС, тип II и III, содержание КС достоверно отличалось от контроля при МПС тип Jv при 99% и 99,5» доверительных интервалах, что хорош согласуется с литературными денеши о спектре экскретируемых ГАГ при данных типах ШС (табл.1).

Поскольку содержание ГАГ в АЖ при беременности порагенЕчм плодом достоверно изменяется, метод изоляции ГАГ. из биологических жидкостей (моча, сыворотка, AS) один и тот ке и ГАГ £Х происходят из мочи плода, то полученные результаты .косвенно свидетельствовали в пользу предпологаемой

Табл. I. Сравнительная оценка содержания ГАГ методами флгариметриче.ского титрования и электрофоретическиго

Моча

ККА2

Контроль ФГ

ЭФЗ

рн 2,0 рн 5,6

ДС/ХС ГС/ХС

3

8±0,9 23±П,5

36

0,0037±0,00031 0,0153*0,0052

<0,1 (п=15) <0,1_

6

5,5±2,63 16,5^X1,24

МПС I

ФТ эфз

п

рн 2,0 рн 5,6

ДС/ХС ГС/ХС

3

9*2,8 57±И,5

0,0085;0,018 0,035;0,0123

0,62; 0; 0; 0,41; <0,1; <0,1;

МПС и

СИ

ЭФЗ

п

рн 2,0 рн 5,6

ДС/ХС ГС/ХС

9

22±5,8 94±44

0,025;0,064;0,084;0,0013 0,778;0,476;0,543;0,0147;

' 0,3; ХС (п=9) 0,7; следы ГК (п=9)

23,3;3,8;4,3 68,0;14,3;13,9

МПС III ФГ

ЭФЗ

рн 2,0 рн 5,6

ДС/ХС ГС/ХС -

6 ' 44±Э,1 80±15,8

МПС IV ФГ

ЭФЗ

рн 2,0 рн 5,6

ДС/ХС ГС/ХС

I

230 47

ФГ: моча - мг ГАГ/г креатинина, АЖ ИСАЕ - мг ГАГ/г белка.

мг ГАГ/мл АЖ,

диагностической- значимости метода для 1Щ МПС.

При исследовании 36 контрольных образцов АЖ на II триместре беременности были определены нормальные границы вариабельности количественного содержания ГАГ в АЖ в норме. При исследования-образцов АК от 6 беременностей при риске МПС I и- МПС II оценено количественное содержание- ГАГ в диагностических образцах АЖ. Содержание ГАГ находилось за пределами вариационного ряда контрольных АЖ и статистически достоверно отличалось от него у трех плодов при риске МПС II и

п

п

у одного плода при риске ШС I. Диагноз был подтвержден 2-мя независимыми методами - определением спектра "ГАГ методом двумерного электрофореза и методами энзимодаагностики. Таким образом, результаты 1Щ, основанные на оценке спектра зкскретируемых ГАГ двумя независимыми методами, совпали. Более того, для одного из этих плодов с ШС I была проведена энзимодиагаостяка результаты которой также совпали- с результатами Щ по спектру ГАГ.

Этот вывод пока нэ представляется возможным распространить на МПС, характеризующихся изолированной гиперэскрецивй ГС и КС, поскольку беременности, при риске МПС III и IV не были представлены в исследованной выборке. Однако, результаты исследования зкскретируемых ГАГ при этих МПС 1 позволяет предаологать высокую вероятность пригодности метода ®Г для иг ОД.

Содеркание ГАГ в ИСАЯ при риске МПС п также достоверно отлеталось (р<0,001) от контроля при исследовании- ыетодом ®Г .

Такям образом была доказана падекность оригинального метода количественного определения ГАГ с помощью ОТ для ЦЦ ШС.

- Значимости разработки метода количественного определения ГАГ в биологическом материале плода при риске МПС определяется с одной стороны достаточно высокой частотой встречаемости МПС в популяциях (мс ки51с у.а., 1<?в<?), универсальностью ^ данного метода для ПД всех мукополисахаридозов и частой недостаточностью альтернативных методов (анзимодиагноетини) для ГЩ ШС.

2.Исследование экспрессии МФ (п=6) в биологическом материале гомо- и гетерозиготных носителей ЛЕН; Программа ■ диагностики и профилактики ЛЕН разработанная в лаборатории наследственных болезней обмена, охватывала не все нозологические формы, что ограничивало возможность пре- и гостЕоТальпой диагностики широкого ряда ЛБН, в том числе распространенных. Ряд субстратов для знзимодиагвостнки . ЛБН, распространенных в популяциях страны, работали неэффективно или оказались коммерчески не доступными при поеьп экономических условиях ели вообще отсутствовали на рынке; Введете субстрата 4-»д?Ф-р-,^-вцеТ2ЛГлпкоза,£КК-6~сульфат для определения

активности гексозаминидазы А было обусловлено большей дагностической специфичностью, простотой метода и более ранним получением результатов, что особенно важно при проведении ЦД в семьях высокого риска для болезни Тей-Сакса.

Е' ходе решения этой задачи исследовали количественную экспрессию ЛФ - р-маннозидазы, галвктоцереброзидазы, сфингомяеливвзы, и гексозаминидвзы А с использованием флюорогенных и хромогенных искусственных субстратов в контрольных лейкоцитах и плазме и в биологическом материале плода, используемом для Щ (табл.2 и 3). Практически для всех ферментов количественная экспрессия в лейкоцитах и плазме характеризовалась одним, из распределений для непрерывных величин далеких от 0: нормальным, логнонормальным, гамма и Вейбелл. Это позволило считать количественную экспрессии активности унимодальной и совпало с ранее полученными в лаборатории результатами для других 19 ЛЭ.

Таблица 2. Экспрессия лизосомных ферментов в контроле. Фермент п эк (st.sK) кя (Э1.кя) м ш эо

ЛЕЙКОЦИТЫ

а-м-ацэтилгалак- 26 2,36-(4,9) - 5,58 (5,8)- -16,5 1,0- 5, тозаминидаза

р-о-маннозидаза 34 0,1 (0,24) -0,97 (-1,16 ) 244,6 12,2 71,: сфингошелиназа 42 0,16 (0,42) . -0,84 (-1,1) 156,5 8,4 54,: галактоцереброзидаза 24 0,44 (0,89) -0,63 (-0,63 ) 3,2 0,33 1,6 Тексосамшидзга А 8 0,56 (0,64 ) 0,4 (0,23). 389,4 36,6 103,■

ШЗИА

р-мавнозидаза II 0,63 (0,85) -1,2 (-0,8) 1С32,4 5 16,!

Гексозаминидвза А 19 0,15. (0,26) -1,1 (-0,95 ) 45,6 2,37 10,; идуронатсульфатаза 10 1,5 (1,9) 3,0 (1,9) 13522 984,8 3114,2

На основании статистпгнсхой обработки получениях результатов мсшно сделать вывод о тканеспецифичности экспрессии ' некоторых ЛФ. >Ш ряда ферментов

Таблица 3. Активность ЛФ в ворсинах хориона (ВХ), А2, лейкоцитах и плазме новорожденного.

Фермент . п Активность Л® п Активность Ш р

ВХ ■ лейкоциты новорожденного

а-м-аце тилгалгк-тоззминидаза 4 2,8±0,Э 5 22,0*9,0 <0,001'

сфингомиелшаза 4 528,8*161,4 3 146,3*30,4 <0,001

р-маннозидаза 3 161,7*40,9 4 347,5*159,9 —

галактоцеребро-зидаза 4 8,3*3,3 5 10,1*5,1 —

церамидаза 3 116*31 ВХ 3 32,9*7,8 Плазма <0,001

гексозамшидаза А 4

идуронатсульфатаза 4

м-ацетал-а-о-- глшозаминидаза

новорожденного 1120*584,9 5 60,2*7,4 <0,001' 12595*4712,7 5 19166*6052 —

6 , 363,9*56,4

АЖ

идуронатсульфатаза II 24378*5586,2

р - уровень значимости

• - достоверность отличия между экспрессией активности ЛФ в ворсинах хориона и лейкоцитах новорожденного

«• - достоверность отличия между экспрессией активности ЛФ" в ворсинах хориона и плазме новорожденного

а-м-ацетилгалактоза'яшидазы. сфингомиелиназы, р-о-маннозидазы - выявлена тенденция сходства количественной экспрессии в лейкоцитах тгонорокденнчх и взрослого контроля при увеличении количественной экспрессии сфингомиелиназы в ВХ примерно в 3 раза и снижении ' количественной экспрессии (З-о-маннозвдазы и а-м-аце тилгалактозаминидазы в ВХ примерно в 2-10 раз. Количественная экспрессия галактоцереброзидазы характеризовалась другой тенденцией -

сходством меаду лейкоцитами новорозденного и ворсинами хориона и более низкой экспрессией в лейкоцитах контроля.'Для гексозаминидвзн А (измеренной с помощью 4-ЫУ<$-(Э-м-нцетял-глшозамш-в~сульфата) . количественная экспрессия в плазме новорожденного и взрослого контроля характергеовалась сходными величинами, "в лейкоцитах' возрастала примерно в 8 раз, а в ворсинах хориона примерно в 20 раз по сравнению с плазмой. Для идуронатсульфатвзн количественная экспрессия в ворсиЕгх хориона л плазме взрослого контроля характеризовалась сходными величинами, тогда кек в AS возрастала примерно в 2 раза.

В ходе выполнения данной задачи нашего исследования осуществляли синтез радиоактивных субстратов для пре- и постнатальной . диагнстики - МПС и и болезни Фарбере. Этот раздел работы выполнялся под руководством к.б.н. В.С.Ахунова.

Субстрат для определения активности вдуронатсульфатазы коммерчески недоступен. С другой стороны, МПС и является самой распространенной в диагностированной вами выборке больных ЛЕН, что соответствовало и максимальной обращаемости семей высокого риска для ШС х: по поводу дородовой диагностики! Ситуация • • осложняется - - Х-сцешгевным .тппом-наследозания этого заболевания: не только родители больного ребенка, но с все сестры матери цробанда, в том числе первобеременные нуадаигся в Щ ШС и, не говоря о проблеме диагностики гетерозиготного носительства. Таким образам синтез субстрата для энгимодагностики ШС и является действительно важной с здравоохраненческой точки зрения. Нами синтезирован меченный субстрат дай измерения активности ферменте по методу

I.e.Leaer С СОбСТЕвННЫМИ МОДИфИКЭЦИЯМЕ.

Радиоактивный субстрат о-(ач.-идопиранозилуроновая кислота-2-сулъфат )-(!-> 4) -2,5-ангндрс -о-г Зн з -мЕБйто.л-6-еульфат получала кислотным гидролизом гепарина в растворе азотистой кислоты с последупдим тритировапием выделенного и очищенного с помощью абсорбцонной колоночной хроматографии дисульфатированного дисахарида, используя Зн~боропщрид, Меченный дисульфатированный дисахарид выделяли в линейном градиенте Nací.

Результата специйтавости работы субстрата для

определения активности идуронатсульфатазы оценивали на ККФ больных с верифицированным диагнозом МПС I, н, ш. Фибробласты были взята из банка клеточных культур МГНЦ ИМЯ. Как показывают результаты таблица 4 активность идуронатсульфатазы в фабробластах больных с МПС п составила от 0 до 9,9% по сравнении с контролем, тогда как активность сн.-идуронидазы и р-о-галактозидазы была в пределах контрольных величин; активность идуронатсульфатазы в фибробластах больных с ШС I и 111 была на верхней границе нормы или выше контрольных величин, что соответствовало литературным данным об изменении количественной экспрессии ряда ЛФ при недостаточности одного, из них (Видершайн Г.Я., 1982; Пейдаен К., 1984; д.а. et а!., 1973).

Табл. 4.Экспрессия активности ЛФ участвующих деградации ГАГ в ККФ больных с ШС _

Активность фермента

Обследуемые идуронатсульфатаза cpm/мг белка/час идуронидзза нмоль фенола/ мг белка/18 ч ß-D-гзлактозидаза нмоль 4МУФ/1ЛГ белк /час

МПС и 2800 956 1163

ШС и - 0 -2516 -.3000

МПС п 0 669 773

МПС HIB 14623 , 1075 1033

МПС 1 9030 - 70 793

Контроль 28375*12632,6 895*334,9 626*294

В таблице 5 представлены результаты количественной экспрессии идуронатсульфатазы в разнородном биологическом материале (включая материал для ДЦ) в норме.

Получение радиоактивного субстрата для пре- и постнатальной диагностики болезни Фарбера -Зн-церамида - было вызвано необходимостью проведения дородовой диагностики в семье при риске этого заболевания, коммерческой недоступностью этого субстрата и невозможностью найти экспериментальную лабораторию в ' мире, где эта диагностика могла быть осуществление. Семья обратилась к нам по поводу заболевания у пробавда за неделю до его гибели. Повторная беременность

Таблица 5. Экспрессия идуронатсульфатазн ..в биологическом материале в ноше.

различном

Биологический иатешзл

Активность идуронатсульфатазц cnm/мг белка/чзс .

Плазма небеременных 10

AS II

НХ. 4

Плазма плода 6

Плазма новорожденного 5

13522*3114

24378*5586

12595*4713

38420*16539

19166*5052

наступила через 7 месяцев после первого обращения, когдг, субстрат не был нами еще синтезирован, поэтому пост- и пренатаяьная диагностика осуществлялись практически одновременно.

Радиоактивный субстрат Зн-церамид получали введением тритиевой метки in vitro в цераьид, выделенный и очищенный из бычьего мозга с помощью абсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле,^—Радиохимическая чистота с3нэ-церамиде была оценена как' 98% методом ТСХ на пластинах с силикагелем. Разделение субстрата и продуктов ферментной реакции такке достигалось с помощью . ТСХ при ^использовании коммерчески -доступных стандартов сфингозша и олеиновой ки слать.. Специфическая активность С°н}-цара\мда составила IG0Q Ки/И.

Полученный субстрат с успехом был применен дяя постнатальной и пренатальной диагностик!' болезни Фарбера

• (табл. 6). При отсутствии измеримой активности церамидазы в аутоптате почки и резком снгазнии активности в фябробластах , пробацда, в биологической материале плода и новорожденного активность церезшдазн бнла сопоставима с нормой. Tfkem образом была - доказана специфичность и высокая диагностическая значимость полученного нага субстрата для анзшодаагностаки болезни Фарбера. Следует подчеркнуть, что меченный тритием церачид впервые был получен и использован для диагностики болезни Фарбера. _

З.Третьей задачей исследования являлась оценка динамики экспрессии вновь вводимых в программу прсфмактики ЛБЕ" Л£> на

Таблица 6. Активность церамидазы в почках пробанда, ВХ и лейкоцитах новорожденного.

Биологический материал

Активность церамидазы (Е/мг белке)

Фибробласта пробанда

контроль (п=3) Почка пробанд

контроль (п=3) ворсизн хориона, 10 нед.. плод

контроль (п=3) ворсины плаценты, 22 нед., плод

контроль (п=3) Лейкоциты пуповинной крови , новорожденный контроль (п=3)

2.36 13.2*4.3

5.0 71.6*6.5

143 116431 62.8 52.4±10.8

28.6 -32.9*7.8

разных триместрах беременности в лейкоцитах и плазме беременных.

Ранее было показано, что динамика экспрессии активности 19 лизосомных ферментов д у беременных женщин различна, в зависимости от срока беременности, причём эти различия касаются и степени изменения и сроков манифестации (Миренбург Т.В., 1992). Все ранее исследованные ЛФ по типу кинетики на разных сроках беременности были подразделены на 3 группы: I)значительное увеличение активности (в 2 и более, раз) от первого к третьему триместру выявлено в лейкоцитах для арилсульфатазн Е, а-маннозидазы и в плазме для н-ацетил-р-о-глюкозаминидазы (тотальной) и

^ацетил-ач>-глзскозаминидазы; 2 Незначительное увеличение (менее чем в 2 раза) или слабое увеличение на I и 1.т триместрах беременности и снижение до уровня активности соответствупцего фермента у небеременных выявлены в лейкоцитах для р-о-галактозидазы, арилсульфатвзы А, а-ч.-идуронидаза; 3)в плазме обнаружено выраженное снижение процентного содержание

гексозаминадазы А. В таблицу 7 приведены полученные данные по кинетике количественной экспрессии нновь исследованных ЛФ. Из'

Таблица 7. Активность лизосомных ферментов в лейкоцитах и плазме у беременных женщин и в контроле.

Небеременные I тдаме сто II триместр III триместр

Фермент п М . БР л м БР п м ЭО л м 80

; лейкоциты

а-с-вдуронидаза' 26 120 66 26 205 116 24 207 136 29 222 157

Лрилсульфатаза В 14 92 48 26 230 89 26 281 100 34 311 154

а-р -тшозидаэа 35 191 75 27 314 146 24 494 180 34 554 320

р-о-глюкозидаза 10 12,6 Б,2 20 12,3 3,2 17 14,1 4,1 28 13,0 2,9

Арилоульфатаза А 81 246 108 22 264 108 22 395 116 32 407 166

р-р-галактозидаза 118 171 67 28 256 87 27 .399 171 34 354 172

а-N-ацэ шягалак-тоэаминидаэа 26 16,5 5,2 21 17,7 3,2 27 14,4 4г3 19 18,5 3,8

р-с-маняозидаза 34 245 71 18 109 47 18 162 57 17 148 39

сфингомиэлиназа 42 156 54 20 154 38 27 156 28 14 144 37

Активность ЛФ выражали в нмоль ¿'идролизовашого субстрата на мг белка в час; » - еа 18 час;

Продолжение таблицы 7.

Неберемешше I триместр II триместр III триместр

Фермент п м эо п м 50 п М БЦ п м го

м-ацетил-а-о- 1 глюкозамшшдаза 40 373 140 ПЛАЗМА 26 675 239 27 702 183 34 788 195

Гексозаминидаза тотальная 37 516 213 28 671 254 24 1744 3170 32 2402 977

Гексозаминидаза А,Ж 37 60 6,5 28 52 8,7 24 35 8.4 32 26 8.7

Гексозаминидаза А 19 46 10 27 75 15 23 103 17 21 153 32

р-с-маннозидаза II 102 16 23 180 38 24 166 35 20 263 64

идуронатсульфатаза' ' 10 13522 3114 10 12812 5061 10 22244 7945 10 42384 6617

Активность ЛФ выражали в нмоль пщю лазов вшюга субстрат на мг белка в час; « - на мл за.24 часа; •• - срм на мл в час.

данных представлении в таблице 7 можно заклотить, что гексозаминидаза А плазма относится к первой группе ш динамике экспрессии фермента во время беременности, р-маннозвдаза лейкоцитов относится к третьей группе. Динамика активности сфянгомиелиназы и а-и-ацетшп'алактозжиЕэдазм на протяжении беременности статистически достоверно не отличались от контроля. Нами были подтвервдетж литорвтурше данные {ИоЬодогз о., 19вь) о росте активности идуронатсулъфатазп в материзской плазме в течение беременности.

Способность лизосомных фермвнтоь, являющихся, как правило, гликопротеинами с низкой молекулярной массой, проникать в кровоток матери (аналогично' а-фгтспрстецну> доказывается изменением экспрессии вдуронатсульфатазы в плазме матери в зависимости от генотипа плода по этому ферменту -{навага г.: ег а1., 1чвь). По аналогии с ситуацией при МПС и можно предполагать, что такие лизссомшз ферменты, как м-ацетил-сх-с-глюкозамкпидаза и и-ацетил-р-с-глшозачинидаза, характеризующиеся резким возрастанием активности на и триместре беременности, следует анаше гг.овать в плазме крови беременных женщин при беременностях отягощенных ШО ш в, ем2-ганглиозидозащ и муколипидозом и и ш для косвенной диагностики., генотипа плода при беременностях .высокого риска. Проведенное нами исследование показало, что количествепая экспрессия ЛФ у беременных при риске ЛБН с с здоровыми плодами изменялась соответственно контрольным данным, в случае Р., при плоде поранзвваа ШС VI активность арилсулъфатазы В статистически достоверно не отличалась от исходного уроаня (табл.8).

В ходе данного исследования была произведение ПД 31 семье при 34 беременностях. Наиболее частыми по обращаемости были семьи с ШС II. (9), болезнями Тей-Сакса (6) и Зандхоффа (4). Предупреждено рождение 7 пораженных плодов - по два плода с болезнями Тей-Сакса и "Зандхоффа, и по одному плоду с МПС I, II, и III В.

В ходе осуществления ВД нами были встречены и преодолены следукшке проблемы: 1)обращени& семьи по поводу Щ метахроматической лейкодистрофии щлбагл, которой не был нами лично исследован. Поскольку активность арилсульфатазы А обоих.

родителей находились на никнем уровне гетерозиготного ряда, идентификация генотипа плода представила большие трудности и потребовала исследования ранообразного биологического материала плода: ВХ, ККАЖ и лейкоциты плода; 2)низкие уровни активности ач.-идуронидазы в ВХ, что также затрудняло

Таблица 8. Экспрессия активности ЛФ у беременных с риском ЛЕН.

Обследуемые

Плазма Лейкоциты

^ЦОРГЛЮ ГексТ Геке,"А АСА АСВ аМанн рГал рГлю

Ц. ет- Небер. 102 98.4 74.1

ганглио- 1 тр. 192 160.3

ЗИДОЗ 2 тр. 1300 44.2 171.6 290.6 268.3

А. а-ман-Небер. 42.7

нозидоз 1 тр. 813 1031 33.2 215.9 103.4 90.3

2 тр. 1194 167.8

Р. МПОм Небер. 344.3 57 283.4 39.5

плод 1 тр. 366 52 483 43.2 75.3

поранен 2 тр. -

Г. бол. Небер. 360 36

Тей- 1 тр- 624 12.1

Сакса 2 тр. 138.6 28.9

М. Мета- Небер.

хром.-' 1 тр.' * " 54 'бЗ' 101 122 '

лейкод. 2 тр. 56

С. бол. Небер. 178.6 78.5

Зандхоф.1 тр. ~ -529 41.3

2 тр.

идентификацию генотипа плода и потребовало дополнительных исследований Ш, ККАЖ и лейкоцитов плода; 3)позднее обращение семьи в конце второго триместра беременности по поводу ПД аи-ганглиозвдоза: исследование АЖ и КАЯ не дало определенных результатов и генотип шюда был верифицирован по его лейкоцитам, полученным с помощью кордоцентеза; 4)и наконец трудности связанных с ПД болезни Фарбера при отсутствии коммерческого субстрата для энзимодиагностики, что обсуждалось нами ранее.

6

выводи

1.Иследована количественная экспресса семи диагностически значимых лизосомных ферментов в контрольных лейкоцитах ц плазме контроля, ВХ, ¿К, лейкоцитах и плазме новоровденнкх: а-м-адетилгалактозаминидазы, рч>-маннозидазы., • сфангошелиназы, галактоцереброзидазн, гексозаминидазн А, . вдуронатсульфатазы и церамидазы. Получены значения контрольных величин, доказана тканеспецифечвость экспрессии каждого фермента и исследэвгн характер распределения активности лизосомных ферментов в лейкоцитах и плазме контроля.

2.Дрн анализе количественной экспрессии пяти лезосомеых ферментов в лейкоцитах и плазме беременных (1-Ш триместр) по сравнению с контролем (небеременные) установлено статистически достоверное увеличение активности гексозаминидазн А и идуронатсульфатазы в плазме, снижена? активности 6-маынозидазы в лейкоцитах и отсутствие статистически достоверного изменения активности ' сфингомиелиназы и а^-ацешпгалэктозамшидазы в лейкоцитах от I к III триместру беременности.

3.Разработан новый высокоснеда£ичнкй метод количественной -оценки ГАГ в AS. С помощью этого метода вперкае ншмчзствзно оценено суммарное содержание ГАГ в № - 0,0153*0,0062 ы/мл, и содераание ГС - 0,0037±0,Q0I9I мг/мл. Доказана диагностическая значимость метода

" ' для прзнатальной диагностики Ш1С I, П, III."

4.Впервые осуществлен синтез трнтированного субстрата для определения активности церамидазы - [Зн:-церамкде с высокой специфической активностью 1000 Ки/М к радиохимической частотой 98«. Впервые в отечественной медицинской генетике осуществлена пре- к постнатальной диагностика болезни" Фарбера с использованием этого субстрата.

5.Осуществлен синтез тритированяого субстрата для определения активности идуронатсульфатазы - 0-(с.ч_-идошфакозилуроновая кислота-2-сульфат)-(1->4)-2,5- ангидро-в-с3н}-макпитол-в-сульфата со специфической активностью 825 Кц/М и радиохимической чистотой 55%. Субстрат использован для мониторинга .беременностей при риске МПС II, сажй распространенной ЛЕН в популяциях России.

6.Б 31 семье с лизосомешш болезнями накопления .при 34 беременностях осуществлена -пренатальнзя диагностика с последуидей верификацией генотипа пораженных плодов л поворожденшзх: мпо 1-3

гчая, 'Л1С II - 10, МПС III А - I. ЫПЕ HI В I, cm-ганглиозидоз -метахроматическая лейкодистрофюг 2, болезнь Гоше - I, болезнь !-Сакса - 8, болезнь Зандхоффа - 4, болезнь Фарбера - I. гнт^вдировано 7 ггоражешых гомозигот, что составляет 24%.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕИЕ ДИССЕРТАЦИИ Краснопольская, К.Д., Миренбург Т.В., Чеботарев А.Н., Гаргаун. С.С. Исследование экспрессии. лизосомных ферментов у беременных за I-III триместрах беременности. // Тез. докл. II съезда педиатров и акушер-гинекологов Республики Молдова. - Кишинев. 1993. - С.37.

Ь5йренбург Т.Б., Гаргаун • С.С.» Краснопольская К.Д. Количественное определение' гликозамивогликанов в амниотяческоЯ жидкости. // Тез. дают. II съезда педиатров и акушер-гинекологов Республика Молдова. - Кишинев. 1993. - С.47. ч Ахунов B.C., Гаргаун С.С. Синтез субстрата для диагностики болезни Хантера. // Тез. докл. I съезда медицинских генетиков РФ. - Москва, 1994. - C.7-S. Ахунов B.c., Гаргаун С.С. Преватальная диагностика герзтидозз. // Тез. докл. I съезда медицинских генетиков RS. - Москва, 1994. - С.15-16.

Гаргаун С.С., Миренбург Т.Е., Малахова В.А., Юдина Е.В. Метод фпюориметрического титрования в ярена тальной и постнатальной диагностике мукополисахаридозов. // Тез. докл. I съезда медишшстах генетиков РФ. - Москва, 1994. - С.16-17.

Маренбург Т.В., Гаргаун С.С., Малахова В.А., Юдина Е.В. Пренатвльная диагностика лизосомвых болезней накопления в семьях группы риска.. // Тез. докл. I съезда медицинских генетиков FB. - Москва, 1994. - С.39-40. Миренбург Т.В., Гаргаун С.С., Чеботарев А.Н., Цдина, Е.В. Исследование активности лизосомных ферментов беременнкх женщин группы риска и в контроле. // Тез. докл. I съезда медицинских генетиков РФ. - Москва, 1994. - C.40-4I. Краснопольская к. Д., Миренбург Т.В., Гаргаун С.С., Чеботарев А.Н. Исследование экспрессии лизосомных ферментов при беременности. // Вслр.ыед.хижет. - 1995 no.I. - С.89-93.

Подписано к Отпечатано га ротапринте в Производственном комбинате Литературного фонта

печати ^ ^ 199^г. Формат бумаги 30x42/4 Объем п. л.

Зак- ЗЛО ТИР- 100