Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Болезнь Фабри

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Болезнь Фабри"

На правах рукописи

ГОЛИВЕЦ ЛИДИЯ ТУХФАТОВНА

БОЛЕЗНЬ ФАБРИ: КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКИИ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ У РОССИЙСКИХ

ПАЦИЕНТОВ

03.02.07 «генетика»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 5 ДПР 2015

005567356

Москва 2015

005567356

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Медико-генетический научный центр»

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Захарова Екатерина Юрьевна

Официальные оппоненты:

Акуленко Лариса Вениаминовна, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующая кафедрой медицинской генетики.

Клюшников Сергей Анатольевич, кандидат медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научный центр неврологии», ведущий научный сотрудник 5 неврологического отделения.

Ведущая организация:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Защита состоится «13» мая 2015г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Медико-генетический научный центр» (115478, Москва, ул. Москворечье, д.1; vvww.med-gen.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Медико-генетический научный центр» по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан « ЮЛ » г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, *

доктор медицинских наук, профессор з,шченко Репа Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования

Болезнь Фабри (БФ), MIM 301500 - Х-сцепленное рецессивное заболевание, относящееся к лизосомным болезням накопления. БФ обусловлена мутациями в гене GLA, в результате которых нарушается активность фермента альфа-галактозидазы А (А-ГАЛ А). Вследствие недостаточности фермента происходит накопление токсических метаболитов гликосфинголипидов в различных органах и тканях (Germain D, Р., 2010).

Для БФ характерно полиорганное поражение с вовлечением в патологический процесс жизненно важных систем: сердечно-сосудистой, нервной, мочевыделительной, что повышает частоту ранней инвалидизации и смертности среди пациентов, страдающих БФ. Кроме того, при БФ описаны атипичные формы с поздней манифестацией и поражением одной системы органов (Nakao S., Takenaka T., Maeda M., 1995; Sunder-Plassmann G., 2006). Особенностью БФ является наличие клинических симптомов заболевания у женщин - гетерозиготных носительниц болезни, причем у 1-5% женщин тяжесть клинической картины может быть такой же, как у пораженных мужчин (MacDermot К. D., Holmes A., Miners А. Н., 2001; Wang R. Y. et al., 2007). Анализ гено-фенотипических корреляций, расширение представлений о спектре и разнообразии мутаций в гене GLA является одним из подходов для объяснения этих особенностей БФ.

Для БФ разработан эффективный метод лечения - ферментная заместительная терапия (ФЗТ), поэтому ранняя диагностика заболевания имеет большое практическое значение. Клиническое разнообразие БФ, наличие фенотипических проявлений у женщин - носительниц заболевания, а также наличие атипичных форм заболевания и внутрисемейный клинический полиморфизм затрудняют своевременную диагностику БФ, что не дает возможность эффективного применения ФЗТ (Weidemann F. et al., 2010).

Одним из методов раннего выявления многих редких заболеваний являются программы селективного скрининга (ССК). Группами высокого клинического риска по БФ являются пациенты отделений гемодиализа, неврологии и кардиологии. Разработка программ ССК на БФ является актуальной задачей, имеющей большое практическое значение, а также позволяет уточнить представления о распространенности БФ (Merta M. et al.,2007; Brouns R. et al., 2010; Hagege A. A. et al., 2011; Terryn W. et al., 2012).

Степень разработанности темы исследования

Биохимическая диагностика БФ в пятнах высушенной крови широко применяется во многих странах Европы, а также в Китае, Бразилии в качестве скрининговых методов диагностики болезни. Результаты ССК на БФ, проведенного в разных странах мира, свидетельствуют о высокой частоте БФ в таргетных группах (ЫтЬоге! О.Е. е1 а1., 2003; КхЛапко Р. й а1., 2004; РогесИ О. В. е1 а1„ 2008; Ьу У. Ь. е1 а1., 2009; Теггуп W. е1 а!., 2012). В Российской Федерации (РФ) ССК на БФ с использованием метода биохимической диагностики заболевания в пятнах высушенной крови не проводился. Настоящая работа является первой диссертационной работой в РФ по данной теме.

Цель исследования:

Основной целью исследования являлся клинико-генеалогический, биохимический и молекулярно-генетический анализ болезни Фабри в семьях пациентов из РФ и разработка комплексного клинико-лабораторного алгоритма диагностики заболевания.

Задачи исследования:

Для осуществления данной цели поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать фенотипические проявления и основные симптомы болезни Фабри в семьях, отягощенных по данному заболеванию.

2. Исследовать активности ферментов альфа-галактозидазы, альфа-галактозидазы А в пятнах высушенной крови в контроле и при болезни Фабри, определить диагностическую информативность данных показателей.

3. Провести селективный биохимический скрининг на болезнь Фабри и определить частоту заболевания среди пациентов групп высокого клинического риска.

4. Охарактеризовать частоту и спектр мутаций в гене ОЬА у пациентов с болезнью Фабри.

5. Создать алгоритм комплексной клинико-лабораторной диагностики болезни Фабри на основе полученных клинических, биохимических и молекулярных данных.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые на репрезентативной выборке больных охарактеризован спектр и частоты мутаций в гене СЫ при болезни Фабри в семьях из РФ. Выявлено 24

мутации в гене GLA, восемь из которых (с.189Т>С, c.402T>G, с.846А>С, C.8490A, c.906G>T c.541_558dell8, c.784delG, c.l085_1098dell4) описаны впервые.

Впервые в РФ определены оптимальные отрезные точки для оценки активности альфа-галактозидазы, альфа-галактозидазы А в пятнах высушенной крови.

Охарактеризованы клинические особенности заболевания, как у пораженных мужчин, так и у женщин - носительниц патологического гена GLA. Показано, что у носительниц мутаций гена GLA в 33% отмечались различные фенотипические проявления болезни, из которых наиболее частыми определена периферическая полинейропатия (у 80%). Определена динамика развития клинического фенотипа.

Впервые в РФ проведен селективный скрининг на болезнь Фабри и использован метод биохимической диагностики болезни Фабри в пятнах высушенной крови. Разработан и сформирован алгоритм верификации болезни Фабри на основе сочетания клинических, биохимических и молекулярных данных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В семьях пациентов с болезнью Фабри преобладал классический фенотип заболевания. Клинические проявления болезни Фабри выявлены у некоторых женщин - гетерозиготных носительниц мутаций гена GLA.

2. Оптимальными отрезными точками для активности альфа-галактозидазы в пятнах высушенной крови соответствуют следующие показатели: для альфа-галактозидазы - 0,145 нМ/пятно*45ч.; для альфа-галактозидазы А - 0,055 нМ/пятно*45ч.

3. В 26 неродственных семьях выявлено 24 мутации, 8 из которых ранее не описаны. В спектре мутаций преобладают однонуклеотидные замены, которые составили 71% (17/24). Большинство мутаций 79% (19/24) локализованы в области 3, 5-7 экзонов гена GLA.

4. Частота болезни Фабри в группе пациентов отделений гемодиализа составила 0,9%.

5. Сформирован алгоритм верификации болезни Фабри.

Степень достоверности и апробация результатов работы

Достоверность полученных в ходе исследования результатов подтверждена лабораторными диагностическими методами: биохимическими и молекулярно-генетическими. Результаты исследования соответствуют данным отечественной и зарубежной литературы. Проведенный статистический анализ подтверждает достоверность полученных результатов.

Изложенные в диссертационном исследовании положения, выводы и рекомендации являются достоверными.

Результаты, отражающие основные этапы диссертационной работы, представлены в виде стендового сообщения и тезисов на ежегодной европейской генетической конференции ЕЭ^Ю (2009 г.), в виде устного доклада на школе для врачей «Успехи диагностики и лечения лизосомных заболеваний» в рамках Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (2010 г.), опубликованы в виде тезисов на II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинс.кой науки третьего тысячелетия» (2012 г.).

Работа рекомендована к защите на заседании научного семинара Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Медико-генетический научный центр».

Объем и стру«сгура работы

Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста (без учета списка литературы и приложения), содержит 19 таблиц, 32 иллюстрации и состоит из следующих разделов: оглавление, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, применение результатов и научных выводов диссертации, список условных сокращений и условных обозначений, список используемой литературы, приложение. Библиографический указатель включает 166 источников по 2014 год включительно, из них 5 отечественных и 161 -зарубежных авторов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования

Размер выборки для анализа клинических проявлений БФ, составил 64 человека (чел.): 26 пациентов мужского пола с клиническими проявлениями БФ, 7 их клинически здоровых родственников мужского пола, 19 родственниц женского пола, 12 умерших родственников пробандов с клиническими симптомами) из 24 неродственных семей. Клинико-генеалогический анализ проводился у 52/64 чел. (40 чел. с верифицированным лабораторными методами диагнозом БФ и 12 умерших родственников) в возрасте от 1 до 69 лет из 24 неродственных семей. Все семьи проживали на территории РФ. Биологическим материалом пробандов и их родственников являлись образцы цельной крови и/или пятна высушенной крови.

Для ССК на БФ пациентов нефрологических, в т.ч. диализных отделений, кардиологических и неврологических центров и отделений, в отобрано 612 чел. (560 мужчин и 52 женщины) в возрасте от 5 до 86 лет из различных регионов РФ. Контрольную выборку составили 200 соматически здоровых чел. (100 мужского и 100 женского пола) в возрасте от 17 до 60 лет из различных регионов России. Биологическим материалом пациентов ССК и здоровых доноров являлись пятна высушенной крови.

Верификация диагноза БФ проводилась при помощи биохимического и/или молекулярно-генетического методов в лаборатории наследственных болезней обмена веществ ФГБНУ «Медико-генетический научный центр».

Методология и методы исследования

В исследовании применены методы биохимической диагностики БФ в пятнах высушенной крови и в лейкоцитах периферической крови - измерение активности общей альфа - D - галактозидазы (А-ГАЛ), включающей активности А-ГАЛ А и альфа - D - галактозидазы В (А-ГАЛ В) (Desnick, R. J.et al, 1973; Chamóles, N. A., Blanco, M., Gaggioli, D., 2001).

Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) выделяли из цельной венозной крови или пятен высушенной крови с помощью набора реактивов «DNA Prep200» (IsoGene) по методике, рекомендованной изготовителем. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных экзонов гена GLA проводили методом прямого автоматического секвенирования ДНК с использованием прямого и/или обратного праймеров на приборах 3130 и 3500

фирмы Applied Biosystems (LT) в лабораториях наследственных болезней обмена веществ и ДНК-диагностики ФГБНУ «Медико-генетический научный центр».

Для статистической обработки данных использован пакет программ обработки данных общего назначения Statistica for Windows версии 6.0. по рассматриваемой проблеме. Установление достоверности различий между группами определялось с помощью критерия Манна-Уитни (Реброва О.Ю., 2002). Для решения поставленной задачи - определения отрезных точек активностей А-ГАЛ и А-ГАЛ А использовался метод ROC - анализа, реализованного с помощью программы SPSS (Бююль А., Цефель П., 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ Особенности клинических проявлений БФу пациентов мужского пола

Анализ фенотипических проявлений БФ проведен для 25 больных мужчин с возрастом манифестации заболевания от 4 до 26 лет. Возраст пациентов мужского пола с установленным диагнозом БФ колебался от 8 до 44 лет, средний возраст, представленный медианой, составил 28,5 лет, с тенденцией, представленной интерквартильным размахом, 21,3-34,5 г.

У всех больных мужчин обследованной выборки наблюдался классический фенотип БФ, у большинства пациентов - 64% (16/25) заболевание манифестировало на 1-й декаде жизни с поражения периферической нервной системы, проявляющегося акропарестезиями, другими манифестными симптомами в детском возрасте являлись гипертермия (32%, 8/25), гипо-, ангидроз (20%, 5/25), ангиокератомы (20%, 5/25). Характерными клиническими проявлениями БФ, встречающимися у большинства больных, являлись патология сердечно-сосудистой системы (ССС, 92%), неврологические нарушения (патология центральной нервной системы (ЦНС) и периферическая полинейропатия - 84%), хроническая болезнь почек (ХБП) - 68%. К редким симптомам у больных мужчин относились гипоандрогения (8%, 2/25) и субклинический гипотиреоз (4%, 1/25). Симптомы БФ и их частота среди пациентов мужского пола представлена в таблице 1.

Таблица 1. Симптомы БФ и их частота у пациентов мужского пола в рассматриваемой выборке.

Симптомы Частота в % (число пациентов)

Основные симптомы

Патология ССС 92 (23)

Акропарестезии 84 (21)

Ангиокератомы 80 (20)

Гипертермия 72(18)

Почечная патология 68(17)

Патология органа зрения 40(10)

Нейросенсорная тугоухость 32 (8)

Патология опорно-двигательного аппарата 24 (6)

Гипо-, ангидроз 20(5)

Лицевой дизморфизм 20(5)

Редкие симптомы

Гипоандро гения 8(2)

Субклинический гипотиреоз 4(1)

Особенности клинических проявлений БФ у женщин -гетерозиготных носительниц заболевания

Женщины - гетерозиготные носительницы БФ довольно часто имеют легкую форму с более поздней манифестацией клинических симптомов по сравнению с больными мужчинами, крайне редко развивается классический фенотип заболевания (MacDermot К. D., Holmes A., Miners А. Н., 2001; Mehta А. et al., 2004; Deegan P. et al., 2006). В настоящем исследовании фенотипические проявления БФ отмечались у 33% (5/15) женщин с верифицированным молекулярно-генетическим методом носительством БФ, самой частой патологией являлась периферическая полинейропатия (у 80%, 4/5 женщин), встречающаяся, по данным разных исследований, у 23-90% женщин -гетерозигот (Bouwman M.G. et al., 2012). Таким образом, частота встречаемости акропарестезий у женщин рассматриваемой выборки соответствовала полученным литературным данным. Характерные для БФ симптомы -ангиокератомы, гипертермия, гипогидроз - также наблюдались у нескольких женщин - носительниц заболевания.

Разработка подходов к селективному скринингу на болезнь Фабри

Анализ метаболитов или определение активности ферментов в пятнах высушенной крови широко применяется во всем мире в программах массового и селективного скрининга на наследственные болезни обмена веществ.

Определение активности А-ГАЛ, А-ГАЛ А в пятнах высушенной

крови

Для адаптации метода биохимической диагностики БФ в пятнах высушенной крови в лаборатории наследственных болезней обмена веществ активность А-ГАЛ, А-ГАЛ А измерена у 200 здоровых доноров. Мужская группа составила 100 чел. (50%) в возрасте 17-60 лет. Средний возраст группы составил 38,5 лет, интерквартильный размах 3-50 лет. Женская группа - 100 чел. (50%), возраст варьировал от 20 до 60 лет, средний возраст 40 лет, межквартильный интервал 29-50 лет.

В качестве внутреннего контроля активность ферментов А-ГАЛ, А-ГАЛ А в пятнах крови измерена у 39 больных с верифицированной молекулярно-генетическим методом БФ (25 пациентов мужского пола и 14 - женщин с носительством БФ).

Диапазоны значений активности обоих ферментов в пятнах высушенной крови с минимумом - максимумом, медианой и межквартильным интервалом в группах контроля, пациентов и носительниц представлены в виде коробчатых графиков (рисунок 1,2). По результатам исследования, показатель активности фермента А-ГАЛ А в пятнах высушенной крови оказался более специфичным маркером для диагностики БФ в выборке больных мужчин по сравнению с А-ГАЛ.

Рисунок 1. Коробчатые графики показателей активности А-ГАЛ в пятнах высушенной крови в группе здоровых (з), у больных мужчин (мб) и женщин -гетерозиготных носительниц БФ (жн).

Рисунок 2. Коробчатые графики показателей активности А-ГАЛ А в пятнах высушенной крови в группе здоровых (з), у больных мужчин (мб) и женщин -гетерозиготных носительниц БФ (жн).

Как представлено на графиках (рисунок 1,2), интервал активностей А-ГАЛ А у больных мужчин лежит ниже и не перекрывается с областью интервала А-ГАЛ А группы контроля, в отличие от показателей А-ГАЛ (наблюдается частичное перекрытие интервалов А-ГАЛ больных мужчин и группы контроля).

У женщин-носительниц БФ наблюдалось гораздо меньшее перекрытие интервала А-ГАЛ А с соответствующим интервалом группы контроля в сравнении с показателями А-ГАЛ. Значения активностей ферментов А-ГАЛ, А-ГАЛ А у гетерозигот варьировали от низких, как у пациентов - мужчин, до нормальных. Таким образом, определение активности А-ГАЛ, А-ГАЛ А у гетерозиготных носительниц является недостаточно надежным методом диагностики БФ, что подтверждается и литературными данными (Winchester В., Young Е., 2006).

С помощью метода ROC - анализа определены оптимальные отрезные точки для активности альфа-галактозидазы: для А-ГАЛ - 0,145 нМ/пятно*45ч. (чувствительность 95,3%, специфичность 100%), для А-ГАЛ А - 0,055 нМ/пятно*45ч (чувствительность 99,1%, специфичность 100%). По европейским данным, принятыми нормами активностей для А-ГАЛ является 0,15-1,0 нМ/пятно*45ч., А-ГАЛ А 0,1-1,0 нМ/пятно*45ч. (Z. Lukacs, Университетская клиника Эппендорф г. Гамбург).

Результаты селективного скрининга на БФ С целью повышения эффективности выявления БФ у российских пациентов проведен ССК в группах высокого клинического риска.

На основании данных литературы сформированы критерии отбора пациентов на ССК (таблица 2) (Ко1апко Р. е! а1., 2004; ВгоипБ Я. Й а1., 2010; Тегтуп V/. е1 а1., 2012).

Таблица 2. Критерии отбора пациентов на селективный скрининг по БФ.

Основные клинические критерии Возраст манифестации

Патология ССС Гипертрофия левого желудочка (ГЛЖ) С подросткового периода (2-я декада жизни)

неясного генеза

Ишемическая болезнь сердца: аритмии. С 3-й - 4-й декады жизни

стенокардия, инфаркты, сердечная недостаточность

Патология почек ХБП (микроальбуминурия, гиперфильтрация) С детского/подросткового периода

ХБП (протеинурия, снижение скорости клубочковой фильтрации, нарастание креатинина) С 4-й - 5-й декады жизни

Патология ЦНС Коиптогенные инсульты (неясный генез С 3-й - 4-й декады жизни

инсультов, транзиторные ишемические атаки, преходящие нарушения мозгового кровообращения)

Дополнительные критерии

Периферическая нейропатия Акропарестезии С 1-й декады жизни

Абдомиалгии

Кожная патология Гипогдроз/ангидроз, ангиокератомы С 1-й декады жизни Со 2-й декады жизни

Дополнительные критерии

Патология органов зрения Помутнение роговицы. Со 2-й декады жизни

катаракта

Патология органа слуха Нейросенсорная тугоухость С 6-й декады жизни

На ССК направлялись пациенты мужского пола, имеющие хотя бы 1 основной или 2 и более дополнительных критерия. Учитывая особенности клинических проявлений для женщин, в скрининговое исследование отобраны пациентки, имевшие хотя бы один из клинических критериев.

В ССК на БФ приняло участие 612 чел.: 560 мужчин (91,5%) и 52 женщины (8,5%). Возрастной состав мужской группы варьировал от 5 до 86 лет, средний возраст мужчин составил 37,5 лет, интерквартильный размах 29-46 лет. Возраст пациенток женского пола, направленных на скрининговое

исследование, колебался от 10 до 77 лет, средний возраст 30 лет, межквартильный диапазон 17-44 лет.

ХБП имели 48,9% (299 чел.) всех скринингуемых, из них 217 чел. (35,5% от общего количества пациентов, 215 мужчин и 2 женщины) находились на гемодиализе/перитонеальном диализе. Доля пациентов неврологических отделений составила 32,8% (201 чел.) от общего числа скринингуемых. Из отделений кардиологии обследовано 18,3% (112 чел.). Результаты ССК на БФ приведены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты скринингового исследования на БФ.

Всего пятен 612

Пятен пригодных для анализа 585

Снижение А-ГАЛ и/А-ГАЛ А 33

Диагноз БФ установлен 3

Диагноз БФ установлен у 2 мужчин группы скрининга; оба пациента принадлежали к группе нефрологических больных и находились на гемодиализе по поводу терминальной почечной недостаточности. Результаты биохимической диагностики в пятнах высушенной крови и молекулярно-генетической диагностики БФ приведены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты биохимической и молекулярно-генетической

диагностики БФ при ССК

Пациент, возраст Пол А-ГАЛ (отрезная точка 0,145 нМ/пятно*45ч.) А-ГАЛ А (отрезная точка 0,055 нМ/пятно*45ч.) Мутации в гене GLA

Зар.,40 лет Мужской 0,03 0,00 с. 996 999delACAG

Др., 19 лет Мужской 0,04 0,01 p.Gly43Val

Жел., 25 лет Женский 0,12 0,07 p.Glu341Lys

По результатам ССК выявлено носительство БФ у одной из женщин -Жел. (1988 г.р.). У пациентки Жел. активность фермента А-ГАЛ оказалась ниже отрезной точки (таблица 5). При ДНК-диагностике гена обнаружена

мутация с.1023С>А (р.С1и341Ьу8) в гетерозиготном состоянии, описанная в международной базе мутаций. Из клинических симптомов БФ у женщины наблюдались акропарестезии. Родословная пациентки приведена на рисунке 3.

Рисунок 3. Родословная пациентки Жел.

При обследовании родственников Жел. БФ подтверждена еще 3 пациентам мужского пола - дяде по линии матери -Пол., 1969 г.р. (2.9. на рис. 3), родному брату Фр., 1986 г.р. (3.1. на рис. 3), и сыну Жел.1, 2009 г.р. (4.1. на рис.3) Таким образом, сыну женщины (Жел.1) диагноз БФ установлен на доклинической стадии. Результаты биохимической диагностики БФ в пятнах высушенной крови и молекулярно-генетической диагностики в семье Жел. приведены в таблице 5.

Таблица 5. Биохимическая и ДНК- диагностика БФ в семье Жел.

Пациент(ка) А-ГАЛ (отрезная точка 0,145 нМ/пятно*45ч.) А-ГАЛ А (отрезная точка 0,055 нМ/пятно*45ч.) Семейная мутация сЛ0230>А (рЛ31и341Ьуз) в гене ОЛ

Жел. 0,12 0,07 в гетерозиготном состоянии

Жел.1 0,02 0,0 в гемизиготном состоянии

Пол. 0,04 0,02 в гемизиготном состоянии

Фр. 0 0 в гемизиготном состоянии

Частота БФ в группе пациентов гемодиализа, по результатам селективного скрининга, проведенного в Австрии, составила 0,16%, в Чехии -0,15% (Ко1апко Р. е1 а1., 2004; МеПа М., е1 а1., 2007). В настоящем исследовании БФ выявлена у 2/217 пациентов, имеющих терминальную почечную недостаточность и находящихся на гемодиализе. Таким образом, частота БФ в группе пациентов отделений гемодиализа исследованной выборки составила 0,9%.

Интересным является тот факт, что при селективном скрининге, в основе которого лежит биохимическая диагностика БФ, удалось выявить 1 женщину -гетерозиготную носительницу заболевания. Активность А-ГАЛ у женщины оказалась ниже отрезной точки, а проведение молекулярно-генетической диагностики подтвердило наличие мутации в гене GLA в гетерозиготном состоянии у данной женщины. Однако аналогичные случаи наблюдались и в других странах, где в результате ССК также выявлены женщины -носительницы БФ. Так, например, в Чехии из 3370 диализных пациентов помимо пациентов мужского пола выявлена также 1 пациентка женского пола с носительством БФ, у которой наблюдалось снижение активности А-ГАЛ А в пятнах высушенной крови (Merta М. et al., 2007).

Всего по результатам проведенного ССК выявлено 3 новые неродственные семьи с БФ. При обследовании семьи выявленной гетерозиготной носительницы патологического гена GLA БФ верифицирована у 3-х родственников мужского пола, одному из них - сыну пациентки - БФ установлена на доклинической стадии.

Молекулярно-генетический анализ БФ В гене GLA в основном не встречается частых мутаций, поэтому единственным методом ДНК - диагностики является секвенирование экзонов гена (Gal A., Schäfer Е., Rohard I., 2006). Большинство мутаций в гене GLA (430 из 622) являются однонуклеотидными заменами, наибольшее количество мутаций сосредоточено в 2 последних экзонах гена (6-7 экзоны).

Молекулярно-генетическая диагностика - ДНК-анализ гена GLA -проводилась в выборке, состоящей из 24 семей (пациентов, прицельно направленных на диагностику БФ, и их родственников). Всего молекулярно-генетический анализ проведен у 52 чел. (26 мужчин с клиническими проявлениями БФ, 7 их клинически здоровых родственников мужского пола, 19 родственниц). Вторую группу, в которой проводилась молекулярно-генетическая диагностика, составили пациенты селективного скрининга. Всего молекулярно-генетическая диагностика БФ проведена у 71 чел. из 43 семей.

В результате проведенного молекулярно-генетического анализа гена GLA обнаружено 24 мутации у 45 чел. из 26 семей (25/26 пациентов мужского пола, 2/7 родственников мужского пола, 15/19 родственниц, 3/19 пациентов скрининговой группы) из 26 семей. В одной семье, пробандом которой являлся пациент мужского пола с клиническими проявлениями БФ, мутации в гене GLA не выявлено. 8/24 мутаций являлись новыми, не опубликованными ранее в

международной базе мутаций (ЬКр:/Ау\у\у.Ьет(1сГ.ас.икЛ. В таблице 6 приведены результаты молекулярно-генетической диагностики БФ в 26 семьях. Выделенные мутации являются новыми, курсивом обозначены одинаковые мутации в неродственных семьях.

Таблица 6. Мутации в гене ОЬА и их характеристика в 26 семьях с БФ.

№ Семья Мутация Тип мутации Локализация, экзон

1. Ск. с.ЮЗА>0 (р.Азп348ег) Миссенс 1

2. Др. с.130С>Т (р.С1у43Уа1) Миссенс 1

3. Пог. с. 336С> Т {р. А гк112 Су.ч) Миссенс 2

4. Наз. с.ЗЗбО Т Ср.Агя1 \2Cys) Миссенс 2

3. Уш. с.426Т>А (р.Суз142Агк) Миссенс 3

5. Пуш. с.444А>С (р.8ег148Агя) Миссенс 3

6. Бег. с.498С>0 (р.Ьеи166Уа1) Миссенс 3

6. Юд. с.713 714<1е1АА (р.Туг238Гз) Делеция 5

7. Вол. с.660С>Т (р.А^220Тегт) Нонсенс 5

8. Шал. с. 681 С> Т (р.Аг%227Тегт) Нонсенс 5

9. Г. с.681С>Т(р.Агя227Тегт) Нонсенс 5

10. Кр. С.8030А (р.Мс1267Пе) Миссенс 5

11. Лод. С.8230А (р.С1у274А5р) Миссенс 6

12. Зар. с.998_ЮОЫе1АСАО (р.ОпЗЗЗТегт) Делеция 6

13. Жел. С.10230А (р.01и341Ьуз) Миссенс 7

14. Сут. с.Ю270>А (р.Агй34201п) Миссенс 7

15. Пан. с. 1278 1279ае1АА(р.Агй426Гз) Делеция 7

16. Маг. с.189Т>С (р.СувбЗАгк) Миссенс 1

17. Гар. с.402Т>С (р.ТугШАвр) Миссенс 3

18. Куз. с.541 558ае118(р.8ег180Г8) Делеция 3

19. Шеп. e.784delG (р.Уа1261Г$) Делеция 5

20. Низ. с.846А>С(р.ТЬг282Рго) Миссенс 6

21. Пл. с.849С>А (р.С1п283Ьу5) Миссенс 6

22. Мар. с.906С>Т (р.Агк301Ьеи) Миссенс 6

23. Из. с. 1085 1098(]е114 (р.Н15362ГЮ Делеция 7

24. Ив. с. 548 -2 А>й (1УБЗ аэ А-в -2) Мутация сайта сплайсинга Локализация, интрон

3

В анализируемой выборке 17/24 (70,8%) мутаций, т.е. подавляющее большинство, являлись однонуклеотидными заменами (15 миссенс-мутаций и 2 нонсенс-мутации), что соответствует литературным данным. Второе место по численности занимали мелкие делеции (6/24, 25%), и одна мутация сайта сплайсинга. Полученные в результате исследования данные о частоте

встречаемости различных типов мутаций у пациентов обследованной выборки согласуются с опубликованными данными.

Большинство мутаций (19/24, 79%) у пациентов рассматриваемой выборки локализовано в 3-м (5 мутаций), 5-м (5 мутаций), 6-м (5 мутаций) и 7-м (4 мутации) экзонах гена GLA.

Среди 8 новых мутаций 3 мутации являлись делециями, 5 -однонуклеотидными заменами. Делеции одного (c.782delG) или нескольких нуклеотидов (с. 1085_1098del 14, c.541_558dell8) приводят к сдвигу рамки считывания и преждевременному образованию стоп-кодонов. Биоинформатический анализ 8 новых миссенс-мутаций проведен с помощью on-line программы Polymorphism Phenotyping 2 (PolyPhen 2). Анализ консервативности области белка проведен с помощью базы UniProt. Для всех 8 мутаций балл по PolyPhen 2 составил 1,0.

У пациента Мир. (1978 г.р.) при молекулярно-генетическом исследовании экзонов гена GLA мутации не выявлены. Отсутствие мутаций в экзонной части гена GLA не может однозначно свидетельствовать в пользу исключения БФ. По литературным данным известно, что мутации, играющие патогенную роль в развитии БФ, могут находиться в глубине интронов и не выявляться с помощью стандартных методов секвенирования экзонов (Filoni К. et al., 2008; Hwu W.-L. et al., 2009; Pisani A. et al., 2012). Диагноз БФ этому пациенту поставлен на основании результатов биохимической диагностики. Кроме того, данные клинической картины пациента (акропарестезии, ангиокератомы, ангидроз, гипертермия, нефропатия, полиостеоартроз) также свидетельствуют о БФ.

Алгоритм комплексной клинико-лабораторной диагностики БФ

На основании проведенного клинического, биохимического и молекулярно-генетического анализа в группе российских больных с БФ разработан алгоритм комплексной диагностики заболевания (рисунок 4). Лабораторная диагностика БФ отлична у мужчин и женщин. В случае снижения активности А-ГАЛ А ниже отрезной точки у мужчин проводится ретест или биохимическая диагностика - определение активности А-ГАЛ А в лейкоцитах периферической крови. Для мужчин биохимическая диагностика является подтверждающей. При подозрении на носительство БФ у женщин проводится молекулярно-генетическая диагностика, учитывая более частую встречаемость мутаций в 3, 5-7 экзонах гена GLA у российских пациентов, ДНК-диагностику следует начинать с этих экзонов.

Рисунок 4. Алгоритм комплексной диагностики БФ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

БФ - тяжелое прогрессирующее заболевание, особенно для лиц мужского пола, характеризующееся поражением жизненно важных систем: ССС, ЦНС, мочевыделительной. Таким образом, БФ ведет к ухудшению качества жизни, инвалидизации и ранней смертности. Эти факторы создают необходимость раннего выявления БФ, биохимической и молекулярно-генетической диагностики.

Данная работа является первым исследованием в РФ, в котором представлены комплексная клинико-генеалогическая, биохимическая, молекулярно-генетическая диагностика БФ и ССК на БФ.

В результате исследования получены новые данные о фенотипическом разнообразии БФ, в т.ч. и в пределах одной семьи. Клинико-генеалогический, биохимический и молекулярно-генетический анализ проведен в 27 неродственных семьях. Лаборатория наследственных болезней обмена веществ ФГБНУ «Медико-генетический научный центр» под руководством д.м.н. Е.Ю. Захаровой является первым и пока единственным российским учреждением, где разработана и проводится биохимическая (исследование активности фермента А-ГАЛ А) диагностика БФ. Биохимический метод диагностики БФ у мужчин показал высокую надежность и достоверность на всех стадиях болезни, в т.ч. и на доклинической. Биохимическая диагностика БФ у женщин-гетерозигот не является абсолютно достоверной, в этом случае необходимо молекулярно-генетическое исследование для подтверждения гетерозиготного носительства мутации в гене йЬА. Выявление женщин-гетерозиготных носительниц БФ имеет важное значение для проведения пренатальной диагностики и генетической профилактики БФ.

В лаборатории адаптирован биохимический метод диагностики БФ в пятнах высушенной крови. В результате ССК, проведенного в группах высокого клинического риска, обследовано 585 чел. Селективный скрининг может повысить эффективность диагностики БФ. С помощью ССК выявлено 2 пациента мужского пола, находящихся на гемодиализе по поводу терминальной почечной недостаточности, и 1 гетерозиготная носительница БФ. Обследование родственников мужского пола выявленной гетерозиготной носительницы позволило выявить 3 новых случая БФ, в т.ч. и на доклиническом этапе. Использованы современные методы статистического анализа, определены отрезные точки активностей А-ГАЛ, А-ГАЛ А в пятнах высушенной крови.

В результате молекулярно-генетического анализа выявлены частота и спектр мутаций гена йЬА, ответственного за развитие БФ, в выборке российских пациентов. Установлено, что большинство мутаций (17/24) являются однонуклеотидными заменами, что согласуется с литературными данными. Наиболее часто мутации встречались в 3, 5-7 экзонах, поэтому у российских пациентов ДНК-диагностику - поиск мутаций в гене СЬА - следует начинать с данных экзонов. В 26/27 семей выявлено 24 мутации, 2/24 мутаций встретились дважды в неродственных семьях. В результате исследования выявлено 8/24 новых мутаций в гене БЬА. В 1 семье у пациента мужского пола с подтвержденным биохимическим методом диагнозом БФ, при молекулярно-генетическом исследовании экзонов гена О ¿Л мутаций не выявлено. В данном

случае у пациента вероятно наличие интронной мутации, влияющей на сплайсинг, но от дальнейшего обследования больной отказался.

Для БФ разработано лечение - ФЗТ. Введение синтетических препаратов А-ГАЛ А позволяет уменьшить многие функциональные нарушения органов и систем и улучшить качество жизни. Однако у пациентов, уже имеющих необратимые патологические изменения органов, снижается и эффективность лечения, поэтому так важно своевременное выявление больных, на ранних стадиях болезни и на доклиническом этапе. К сожалению, диагностика редких болезней (в т.ч. и БФ) затруднена в связи с недостаточными знаниями о подобных болезнях у практикующих врачей, отдаленностью диагностических центров. В случае БФ клиническую диагностику затрудняет также полиморфизм фенотипических проявлений. Составленный на основе собственного исследования алгоритм комплексной диагностики, а также данные по клинической картине БФ должны помочь врачам разных специальностей: генетикам, кардиологам, неврологам, нефрологам, терапевтам, педиатрам, ревматологам, психиатрам, дерматологам.

ВЫВОДЫ

1. В семьях пациентов с болезнью Фабри преобладал классический фенотип заболевания. У большинства пациентов мужского пола (п=25), показана высокая частота кардиологических (92%, 23/25), неврологических (84%, 21/25) и нефрологических (68%, 17/25) симптомов. У 33% (5/15) женщин - носительниц заболевания отмечались фенотипические проявления болезни Фабри. Наиболее часто встречались акропарестезии (80%, 4/5).

2. Оптимальным отрезным точкам активности альфа-галактозидазы в пятнах высушенной крови соответствуют следующие показатели: для А-ГАЛ -0,145 нМ/пятно*45ч„ чувствительность 95,3%, специфичность 100%; для А-ГАЛ А - 0,055 нМ/пятно*45ч., чувствительность и специфичность 99,1% и 100% соответственно.

3. Охарактеризован спектр и частота мутаций в гене ЫА при болезни Фабри у российских пациентов. В 26 неродственных семьях выявлено 24 мутации, 8 из которых ранее не описаны: с.189Т>С, с.402Т>С, с.846А>С, с.849С>А, с.906С>Т с.541_558ёе118, с.784ёеЮ, с.1085_1098с1е114. В спектре мутаций преобладают однонуклеотидные замены, которые составили 71% (17/24). Большинство мутаций - 79% (17/24) локализованы в области 3, 5-7 экзонов гена.

4. Наибольшую эффективность селективный скрининг показал в группе пациентов отделений гемодиализа, где частота болезни Фабри составила 0,9%.

5. На основе сочетания клинических, биохимических и молекулярных данных сформирован алгоритм комплексной клинико-лабораторной диагностики болезни Фабри.

ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Всех пациентов детского и юношеского возраста с нейропатическими болями в конечностях необходимо обследовать для исключения БФ. У взрослых пациентов мужского пола, имеющих, помимо перечисленных симптомов, поражения ССС, почек, головного мозга, также должна быть заподозрена БФ.

2. В пределах одной семьи БФ должна быть заподозрена даже при различных фенотипах заболевания у родственников.

3. Метод биохимической диагностики БФ в пятнах высушенной крови внедрен в практику Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Медико-генетический научный центр», рекомендован для проведения биохимической диагностики БФ у пациентов мужского пола.

4. Алгоритм комплексной диагностики БФ опубликован в журнале «Медицинская генетика».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендуемых ВАК МОИ РФ:

1. Благова, О. В. Случай болезни Фабри у взрослого глазами кардиолога и генетика [Текст] / О. В. Благова, Е. В. Заклязьминская, А. В. Недоступ, Г. М. Папакин, В. А. Сулимов, Л. Т. Голивец // Кардиология и сердечнососудистая хирургия. - 2009. - №5. - С. 4-8.

2. Голивец, Л. Т. Болезнь Фабри: молекулярный анализ и клинико-генетические сопоставления / Л. Т. Голивец, В. П. Федотов, С. Е. Созин, Г. Н. Салогуб, Е. В. Заклязьминская, О. В. Благова, М. К. Соболева, О. В. Удалова, О. Н. Захаринская, Л. Я. Данилова, Н. П. Левандовская, А. Р. Шорина, П. Г. Цыганкова, Е. А. Осавчук Е.А, Букина Т.М., Н. А. Пичкур, Е. Ю. Захарова // Медицинская генетика. - 2012. - Т. 11, № 5. - С. 29-37.

3. Голивец Л.Т., Круглова О. В., Гусарова Е.А., Цыганкова П.Г., Захарова Е.Ю. Селективный скрининг на болезнь Фабри // Медицинская генетика. -2014.-Т. 13,№12. - С.29-34.

Публикации в других изданиях:

4. Golivets, L. Т. Five novel mutation in Fabry disease in a series of Russian patients / E. Yu. Zakharova, Т. M. Boukina, P. G. Tsygankova // European Journal of Human Genetics. - 2009. - V. 17, S. 2. - 350 p.

5. Воскобоева, E. Ю. ДНК-диагностика лизосомных болезней накопления. Результаты 15-летнего опыта / Е. Ю. Воскобоева, Т. М. Букина, А. М. Букина, В. С. Ахунов, J1. Т. Голивец, Е. Ю. Захарова // Материалы VI-го Съезда Российского общества медицинских генетиков. Медицинская генетика. - 2010. - прил. №5. - С.41-42.

6. Голнвец, Л. Т. Проблемы диагностики болезни Фабри у женщин / О. В. Круглова, П. Г. Цыганкова, Е. А. Осавчук, Е. Ю. Захарова // Материалы II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия». Медицинский академический журнал. - 2012. - прил. - С. 200-201.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

А-ГАЛ - альфа-Э-галактозидаза

А-ГАЛ А - альфа-О-галактозидаза А

А-ГАЛ В - альфа-О-галактозидаза В

БФ - болезнь Фабри

В-ГАЛ - бета-О-галактозидаза

ГЛЖ - гипертрофия левого желудочка

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПДРФ-анализ - анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразно-цепная реакция

РФ - Российская Федерация

ССК - селективный скрининг

ССС - сердечно-сосудистая система

ФЗТ - фермент-заместительная терапия

ХБП - хроническая болезнь почек

ЦНС - центральная нервная система

Чел. — человек

PolyPhen 2 - Polymorphism Phenotyping 2

Подписано в печать:

27.03.2015

Заказ № 10659 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское т., 36 (499) 788-78-56 \v\vw. autoreferat.ru