Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование экспрессии лизосомных ферментов у гомо- гетерозиготных носителей наследственных лизосомных болезней

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование экспрессии лизосомных ферментов у гомо- гетерозиготных носителей наследственных лизосомных болезней"

^ J

российская академия медицинских наук МЕДИ КО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 616.056.7:151.645

МИРЕНБУРГ ТАТЬЯНА ВАСИЛЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ЛИЗОСОМНЫХ ФЕРМЕНТОВ У ГОМО- И ГЕТЕРОЗИГОТНЫХ НОСИТЕЛЕЙ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЛИЗОСОМНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1922

Работа выполнена в лаборатории наследственных болезней обмена веществ Медико-генетического Центра РАМН.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор К.Д.Краснопольская

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

И.В.Цветкова - доктор медицинских наук, профе ссор Н.П.Кулешов

Ведущее учреждение - Институт педиатрии и детской

хирургии МЗ РФ

Защита состоится " $ " ^ д М Г. в ' 7 часов

на заседании МГЦ РАМН по адресу: г.Москва, 115478, ул.Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра. Автореферат разослан " ^ " .¿¿¿¿'-С 19 УД г.

Ученый секретарь Специализирозаккого Совета, доктор биологических наук

/Л.Ф.Курило/

'''¿ПЕЛИ

: I

Ml

■ г.

- I -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лизосомных болезни накопления (ЛБН), включают более 30 нозологических единиц, преимущественно сублетальных и некурабельных [Видершайн Г.Я.,1980, Neufeid е. et ai.1989]. Характерными свойствами ЛБН, как и других наследственных болезней обмена (НБО) является генетическая гетерогенность, клинический полиморфизм, наличие гено- и фенокопий. Эти свойства обуславливают невозможность локусной дифференциации данной группы заболеваний на клиническом уровне. Единственным эффективным методом их профилактики является дородовая диагностика [Цветкова И.В.,1991, Краснопольская К.Д.,1982, Kleyer w.j.,1990], требующая точной локусной, а во многих случаях и аллельной диффзренциации дефекта. Основным методом локусной дифференциации ЛБН на данном этапе является определение активности мутантного фермента в биологическом материале пациентов, хотя для ряда нозологических форм с успехом используются методы генетики соматических клеток и молекулярно-генетические подходы. Энзкмоднагностика ЛБН представляет серьезные трудности, связанные с широкой вариабельностью активности лизосомных ферментов в нормальном биологическом материале, тканеспецифичностью уровня экспрессии, выраженной генетической гетерогенностью нозологических единиц, реципрокным изменением активности группы лизосомных ферментов при-мутационной блокаде одного из них. Определенный вклад в вариабельность активности вносит биохимический полиморфизм по лизосомным ферментам, проявляющийся наличием частичных и псевдоэнзимодифицитов [J.J.P. van cie Кашр et al., 1981, H.Kihara, 1982], а также сложный внутриклеточный процерсинг лизосомных ферментов [sabbatini,l989], находящиеся под контролем многочисленных .генетических и физиологических факторов [Nakagawa s. et al., 1983]. Эти факторы обуславливают возникновение промежуточных биохимических фенотипов, с трудом поддающихся однозначной генетической интерпретации. Анализ экспрессии лизосомных ферментов необходим как для оказания помощи отягощенным семьям, так и для популяционных исследований, связанных с планированием мер профилактики. Литературные данные по экспрессии активности лизосомных ферментов в норме ограничены небольшими выборками и номинальной статистической обработкой

[огапа р. т. et а1.,1990]. Все вышесказанное определяет актуальность исследования экспрессии лизосомных ферментов у гомо-и гетерозиготных носителей ЛЕН и в норме.

Цель и задачи исследования Целью данного исследования являлось изучение экспрессии лизосомных ферментов в норме и при ЛБН. При этом решались следующие конкретные задачи:

1. Исследовать экспрессию активности лизосомных ферментов в плазме, лейкоцитах, культуре кожных фибробластов (ККФ), биоптате (БХ) и культуре клеток ворсичатого хориона (ККХ), культуре клеток амниотической жидкости (ККАЖ).

2. Исследовать экспрессию активности лизосомных ферментов у женщин на разных сроках беременности.

3. Исследовать экспрессию лизосомных ферментов у гомо- и гетерозиготных носителей ЛБН.

4. Исследовать экспрессию лизосомных ферментов в биологическом материале плодного происхождения при беременностях с риском ЛБН.

Научная новизна и практическая значимость. Изучена

экспрессия лизосомных ферментов в плазме, лейкоцитах, ККФ, БХ, ККХ, ККАЖ в норме, у гомо- и гетерозиготных носителей ЛБН, а также в плазме и лейкоцитах у женщин на разных сроках беременности.

Спректр исследованных ферментов исчерпывает почти все энзимопатии, входящие в группу ЛБН. Наряду с коммерчески доступными субстратами был использован синтезированный нами субстрат для определения активности н-ацетилгалактозамин-6-сульфат сульфатазы, что позволило осуществить энзимодиагностику всех известных типов мукополисихаридозов (МПС).

Исследован характер распределения активности 12 лизосомных ферментов в плазме и лейкоцитах для трех групп генотипов.

Установлено статистически достоверное увеличение активности большинства исследованных лизосомных ферментов у женщин на 1-1II триместрах беременности по сравнению с возрастным контролем.

Анализ экспрессии лизосомных ферментов в диагностически значимом биологическом материале позволил создать методическую базу для пре- и постнатальной энзимодиагностики ЛЕН. Главным практическим результатом исследования является локусная дифференциация ЛБН у 199 пациентов. Диагносцированная выборка больных представлена 17 нозологическими формами и является одной

ИЗ самых Обширных среди описанных В литературе [Galajaard Н. and Reuser A.J.J., 1984, Ozand P.т., 1990].

Наряду с постнатальной локусной дифференциацией ЛБН решена задача профилактики повторного рождения больных детей в отягощенных семьях с помощью пренатальной диагностики. Пренатальная диагностика осуществлена в 47 семьях при 56 беременностях с риском ЛБН (9 нозологических единиц). Результаты пренатальной диагностики верифицированы у абортированных плодов и новорожденных. Результаты данной работы использованы для разработки и решения задач, предусмотренных научно-технической проблемой "Разработка методических подходов к локусной и аллельной дифференциации и фенотипической коррекции дефекта in vitro при лизосомных болезнях", включенной в Госпрограмму 'Томеостаз" (задание 01.03.05.).

Положения, выносимые на защиту.

1. Тканевая специфичность, поло- и возрастзависимость экспрессии лизосомных ферментов в диагностически значимом биологическом материале.

2. Изменение экспрессии лизосомных ферментов в плазме и лейкоцитах крови беременных от I к III триместру беременности в норме.

3. Получение меченного н3 субстрата для определения активности N-ацетилгалактозамин-б-сульфат сульфатазы.

4. Количественная оценка экспрессии лизосомных ферментов у гомо- и гетерозиготных носителей ЛБН в выборке больных повышенного риска (п=742) с анализом распределения активности.

5. Неравномерность этнического распространения ЛБН; оценка суммарной встречаемости мукополисахаридозов в среднеазиатском регионе страны.

6. Идентификация генотипа плода (п=57) в семьях с верифицированным диагнозом ЛБН пр.: повторных беременностях.

Апробация работы. Материалы докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Профилактика наследственных болезней" (Вильнюс, 1986), Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологии (Махачкала, 1986), III Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция лизосом" (Тбилисси, 1986), v съезде ВОГиС ям.Н.И.Вавилова (Москва, 1987), Конференции по клинической "енетике ВНОМГ (Москва, I9S7), II Всесоюзном совещании по проблеме "Физиологически активные соединения, меченные

.радиоактивны!'® и стабильными изотопами" (Звенигород, I98S), II съезде (Алма-Ата, 19Э0), 5 Международном конгрессе по

пренатальной диагностике (Прага,1930), Всесоюзной научно-практической конференции "Пренаталькый и кеонаталъный скрининг врожденной и наследственной патологии" (Харьков, 1990).

Публикации.По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит кз следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их оссуждение, ььводы и список литературы. Работа нзлольна на страницах машинописного текста, содержит

таблиц, рисунков, библиографический указатель содержит наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалом для исследования являлись плазма, лейкоциты и ККФ больных детей и их родителей. Первичный прием больных осуществляли врачи научно-консультативного отделения ВНМГЦ РАМН по направлениям из медико-тенэтичсских кабинетов страны. Контрольные группы с данном исследовании были представлены добровольцами из числа сотрудников ЕНМГЦ РАМН, донорами Везсоюзного онкологического центра АМН СССР. Культивирование фибробластов осущоствлнли сотрудники ВНМГЦ РАМН М.И.&рейдик, В. А. Малахова, Ю.М.Кулагина, O.A. Смирнова, В.С.Ахуноз стандартным методом [Кухарскко В.И. и соавт., 1974]. Для. целей пренатальной диагностики исследоБали амниотическую жидкость (АЛ), EX, ККХ и ККАХ. Образцы БХ и АХ баш получены ст беременных женщин при искусственном прерывании беременности (контрольная группа) и женщин, имеющих.ребенка с ЛЕН. Акушерские манипуляции выполняли в Центра охраны здоровья матери и ребенка (д.м.к. Бахарев В.А.), роддоме и 9 (д.м.н. Фукс М.А., врач Бирюков В.Б.), роддоме и 8 (врач Кузнецов М.И.). Культивирование ворсинчатого хориона и клеток амниотической жидкости осуществляли к.б.н. Барцева О.Б. и врач-лаборант Малахова В.А. стандартными методам [Золотухина Т.В., Цветкова Н.В. и соавт., IS82]. Для подтверждения диагноза у пораженных абортированных плодов иисследовали печень и мозг абортусов. Для верификации диагноза у новорожденных исследовали мочу и пуповинную кровь. Лейкоциты выделяли по методу Skoog И Beck (1956). Тканевые и клеточные гомогекаты готовили стандартным методом [Gaijaard, 1980].

Таблица I.

- 5 -

Определение активности лизосомных ферментов.

Фермент

Субстрат

Ссылка

j-D-глюкуронидаза í-N-непраминидаза

f-D-маннозидаза

t-L-фукозидаза

1-ацетил-/?-в-глю-газаминидаза

i-D-глюкозидаза

'-D-галактозидаза

-D-галак гозидаза

-D-глюкозидаза

'лслая липаза

-L-идуронидаза

-аце тил-а-D-rлю-озаминидаза

рилсульфатаза А

рилсульфатаза В

-D-галактоцереб-озидаза

$ингомиелиназа

Galjaard,1980

O'Brien et al.,1970 Galjaard,1930

эпаран-и-сульФа-аза

-ацетилгалактоз-

•шн-6-сулъфат

/льфатаза

4-МУФ-р-0-ГЛЮКур0НИД Glaser and Sly,I973

4-МУФ-а-0-И-неЙрамн- O'Brien and Warner,1980 новая кислота

4-МУФ^«-с-маннопиранозид

4-МУФ-а-ь-фуко1шранозид

4-Ь!УФ-2-ацетам1!До-2-деокск-р-о-глюкопиранозид

4-МУФ-э-о-глюкопиранозид

4-МУФ-р-с-галакто1П!ранозвд - " -

4-ГлУФ-а-в-галакто1шранозид - " -

4-МУФ-с<-П-ГЛЮК0ГОфаН03ИД shin et al . ,1985

4-МУФ-ОЛеЭТ Cortner et al.,IS75

Фенил-а-ь-идуронид Hall et al.,I978

р-нитрофеннл-2-ацетамидо-2-деокси-а-о-глюкогпфакознд

} р-нитрокатехол сульфат - " -

2-и-гексадеконоиламино-4-нит-'Gall et ai.,IS77 рофенил-д-о-галактопиранозид

2-Г1-геКСадеКОНОИЛЗМИНО-4-НИТ- Patrick et al., рофенилфосфорил холнн 1977

355-гепарин

Hall et al.,1978

0-(р-П-6-суЛЬф0-2-ацетаМИД0-2- Kresse at г. 1. деоксигалактопиранозил)-(i-4)-о- 1982 (ß-D-галактопиракозил уроновая кислота)-(1-з)-б-сульфо-2-деокси

-Б-[к3]-галактиол

Определение • активности лизосомных ферментов проводили ;тодами описанными в литературе (табл. I). Концентрацию тоорогенного продукта ферментной реакции •метилумбеллиферона (4-МУФ) - определяли на спектрофлюориметре tachi-850. Концентрацию хромогенных продуктов ферментной акции (п-нитрофенола, п-нитрокатехола, фенола) определяли на :ектрофотометре Beckman du—so, Концентрацию меченных продуктов рментной реакции определяли на сцинтилляционном счетчике rk-iii. Коммерчески недоступный субстрат для

зимодиагностики N-ацетилгалактозамлн-б-сульфат судьфатазы был

синтезирован на Ш ПО методу [H.Kresse et al., 1982]. Кроме методоз знзкмодиагнэстики для локуской дифференциации ЛБН использовали метод метаболического кооперирования (к.б.н. Т.В.Лебедева), методы хроматофокусирования и термофракционирования гексозамикидаз (к.б.н. Е.Л.Аронович) и нагрузочные тесты с gm^- и см2-ганглиозидами (к.б.н. В.С.Ахунов). У всех больных с Гурлер- и Моркио-подобным фенотипом определяли концентрации и спектр гликозаминогликанов (ГАГ) (врач-лаборант О.Б.Садова) в моче, у всех больных с клиническим фенотипом "лейкодистрофия" исследовали спектр олигосахаридов в моче методом тонкослойной хроматографии (врач-лаборант О.Б.Садова).

При дородовой диагностике ЛЕН использовали методы ЭНЗИМ0ДИЭГН0СТИХИ [Galjaard, 1930].

Выделение очистку гликоз&мпногликаков (ГАГ) из А7 ОСущеСТБЛлЛИ как описано [Lee G.L. et al.,1Э80, Whiteman P. an< Henderson н.,1977]. При выделении ГАГ из печени и мозга абортусо! кусочки ткани промывали физиологически;.! раствором, гомогенен готовили в 4 М Had, центрифугировали, ис супериатанта выделял; ГАГ K5K ОПНГ-ЕНО [Whiteman P. and Henderson Н.,1977].

Злектрсфоретическое фракционирование ГАГ осуществляли н; зцетатцеллюлозных пленках: одномерный электрофорез - по метод; [Wessler, 1963], двумерный Электрофорез - по методу [Whiteman Р and Henderaor. п., 1977]. В качестве стандартов использовал! хондроит'инсульфат, дерматансульфат, кератаасульфат, гиалуронову] кислоту (seikagaku Kogyo Co., Япония); стандарт гепарансульфат; был приготовлен из мочи пациента с МПС III А путем обработю суммарной фракции ГАГ хондроитиназой ABC [Kimata et al. 1973]. Для полуколичестзенной оценки ГАГ в АЖ использовали принц] метода [Hronowski, RnastassiadeE, 1979], разработанного ДЛ: стандартов ГАГ и заключающегося в спектрофотеметрическо! измерении концентрации альцианового синего, связавшегося i индивидуальны!« ГАГ при окраске электрофореграмм, поел' разрушения комплекса краска-ГАГ диметилсугьфоксидом. Концентраци: УРОНОЕЫХ КИСЛОТ определяли ПО методу [Т.Bitter and H.M.Muir 1962]. Концентрацию белка определяли по методу Бредфор, [Eredford, 1976}.

При статистической обработке результатов использовали общепринятые методы [Лакин Г.Ф., 1973].

Таблица 2„ Активность лнзосоьзшх ферментов в биологическом материале человека з норме (¡.¡+5'Ь).

1,1,2 ПП Фермент Плаз!.;а Лелксц::тц Ш ККАЯ БХ ккх

I 2 3 4 5 6 7 8

I. ¿-¿-пдуронндаза - 118,8+56,9 486,1+219,0 732,9£325,6 149,6+48,1 175,0+80,4

п. =19 л=26 л. =18 /г =17 П--6

2. Гепаран-лЧзуль:Тзтаза 1,6+0,8 5,3+ 2,9 6,0+4,1 - 3,6+2,5

«-=13 «.=22 л =8 л =9

3. У-ацотал-^-й- 434,5+176,6 21,6+10,2 16,7+5,6 13,4+2,1 30,0+17,1 9,7+0,6

глп::озаг.глн::даза л =23 й=17 л=13 л =8 л=30 л= 3

Л'- а ц е т и л г о лак т о з а и ин- 5,4+1,8 16,3+7,0 - - -

б-сульфатсульфатаза /1=5 л =8

5. ^-ь-галактозидаза - 165,1+66,8 562,0+144,5 912,4+323,3 376,0+205,3 619,7+210,3

л. =51 л =22 л =27 л =21 /2- =б

б. Арилсульфатаза В - 81,3+38,5 286,7+90,9 211,8+49,2 150,1+67,1 254,3+140,1

л= 22 л =15 «=18 л =30 «.=7

7о у»-Ь-глюкуронидаза 22,4+13,9 226,5+79,0 244,2+85,8 767,3+309,4 148,2+78,1 481,8+287,7

й-=16 «•=29 л =17 п. =18 л =19 Л. =6

8. <<-М~п е йр а нид аза — 23,9+14,3 А =17 —

9. ¿-¿-фукозидаза 113,4+39,7 62,1+28,6 161,8+34,2 423,3+246,5 289,6+151,4 143,0+82,7

л=И л =32 л =22 «.=13 л =18 п. =5

10. ¿-й-ыашюзидаза 34,1+13,3 146,9+58,6 226,9+77,3 318,7+151,8 152,4+54,6 243,7+130,2

А. =14 л=37 л-=22 л.=16 л-=21 /г_=6

Продолжение табл. 2.

I 2 3 4 5 6 7 8

II. Сфингомлелиназа - 146,9+53,6 -2? 320,2+110,7 /г =6 - - -

12. /-ь-глюкозпдаза - • 12,9+4,6 166,0+64,0 -№8,8+260,7 218,3+91,9 228,8+68,8

л- =30 /г. =16 /г.=Ю п. =16 я_=6

13. у?~й-галакто- - 127,5+44,4 199,9+71,2 321,0+156,4 44,4+10,5 73,7+24,5

цереброБпдаса Л.~20 л =18 п. =6 л-=17

14« Арплсульфатаза А - 210,2+83,? 998,0+546,3 953,2+429,8 334,8+188,6 407,7+192; 9

л-=42 «■=24 л- =12 *-=34 л. =7

15. //-ацетнл-/-Ь-гексоз- 694,8+171,3 1136+334 4018+1174 2796+497 10098+1315 3607+557

аыннидзва (тотальн.) л =33 л =5 А =14 п. =7 л-=П л.=8

16. /ь гзксозамнпидазы А 54,1+3,2 60,6+6,2 59,7+5,1 56,1+7,2 42,2+14,7 60,8+3,7

17. ¿-2-галактоэидаза - 35,5+9,6 83,8+38,0 86,9+45,5 54,3+15,7 61,3+15,5

л. =12 л =13 /г. =8 /г =16

18 „ Кислая липаза — 23,4+9,9 П-ГТ17 64,3+25,5 П=4 — —

19. ¿-Ъ-глюкозпдаза - 36,0+7,6 79,0+35,5 91,3+44,7 58,7+14,1 73,2+15,8

12 /т-=13 «-=8 л.=1б /2-=6

Активности ферментов виракены в н1,1 преобразованного субстрата на I мг белка (для клеточного материала) или на I ил (для плазш) в единицу времени» Активность гепаран-ЛЧзульфатазы выранена в % осво-бозденногс 3550^/1С0 мкг болка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Анализ экспрессии лизосомных ферментов в норме. В таблице 2 приведены результаты определения активности 19 лизосомных ферментов в плазме, лейкоцитах, ККФ, БХ, ККХ, ККАЖ. Большие различия в числе обследуемых по каждому ферменту и по каждому типу клеток связаны с тем, что некоторые виды биологического материала были мало доступны для контрольных исследований, а некоторые субстраты требовали экономного расхода. Экспрессия активности лизосомных ферментов в нормальном биологическом материале характеризуется выраженным разбросом данных, что соответствует литературным данным [Galjaard н.,1980]. Величина стандартной ошибки была ниже при оценке активности лизосомных ферментов в биологическом материале, характеризующемся матричным синтезом лизосомных ферментов in vivo, т.е. в некультивированных клетках (лейкоциты, БХ) по сравнению с культивируемыми клетками (ККФ, ККХ, ККАЖ) и плазмой. Тканеспецифичность экспрессии лизосомных ферментов, изученных на достаточно представительных выборках, оценивали по уровню значимости на материале попарных сравнений. При сравнении активности лизосомных ферментов в разных группах с применением критерия Стыодента были использованы три уровня значимости: 95%,99% и 99 , 955.

Таблица 3. Тканеспецифичность экспрессии лизосомных ферментов.

Фермент ККФ -лейкоциты ККФ - ККАЖ ККФ - БХ БХ - ККАЖ

a-L-идуронидаза +++ + + +++ +++

Гепаран-н-сульфа-таза +++ - н/о н/о

N-anenm-a-D-глюкозаминидаза - - ++ +

Арилсульфатаза В +++ ++ +++ ++

д-Б-глюкуронидаза - +++ ++ +++

a-D-маннозидаза ++ + +++ +++

a-L-фукозидаза +++ +++ +++ -

Э-о-глюкозидаза +++ +++ - +++

/з-ю-галактозидаза +++ +++ ++ + + +

Арилсульфатаза А +++ - +++ +++

p-D-галактоцерибро-зидаза +++ + +++ +++

a-D-глюкозидаза +++ - ++ +

- р>0,05;+ 0,01<р<0,05;++ o,ookp<o,oi;+++ р<о,оо1;н/о-не опреляли

Различия в активности лизосомных ферментов в ККФ и лейкоцитах, играющие большую роль для постнатальной диагностики очевидны и включают практически все ферменты, что хорошо согласуется с литературными данными и объясняются, по-видимому, тканеспецифическими различиями генетического контроля экспрессии соответствующих генов.

Попытка проанализировать причины выявленных различий в тканеспецифической экспрессии лизосомных ферментов побудила нас изучить характер распределения активности лизосомных ферментов в лейкоцитах и плазме в норме (табл. 4).

Практически все ферменты, кроме «-ь-идуронидазы имели одно из распределений, характерных для непрерывных величин, далеких от 0: нормальное, логнормальное, гамма и распределение Вейбулла. Это позволило считать количественную экспрессию их активности унимодальной. Распределение активности в-ь-идуронидазы в лейкоцитах (рис. I), позволило заподозрить неоднородность анализируемой выборки, состоящей из суммы двух распределений. Подразделив совокупность значений активности этого фермента на две группы (груша А < 120, группа В > 120), мы показали, что различия между сравниваемыми группами статистически достоверны по ^критерию (р=0; 1=-17.5). Это позволило предположить существование более одного нормального аллеля а-ь-идуронидазы в ■ исследованной выборке доноров.

я и

сз я о

И 1

о «

о

V? 4

о к

о

г

I I;

Л

1

Ж

V

ТР"

8 к 133 158 :а Й8 3-Й активность

8 56 1 100 133 208 250 300

активность

Рис.1. Распределение активности о-ь-идуронидазы в лейкоцитах донороЕ

й

в

Таблица 4. Анализ наблюдаемых распредальний экспрессии лизосомных

ферментов лейкогигсв и плазмы крови в контроле.

Фермент 3 к(Б1 эк) Кг СЭЪ Дсвери тельн.

г. кг) м т ЕС инте рвал

нижн.| ведан.

I 2 з 4 5 6 7 8

лейкоциты

а-ь-идуронидаьа 8С 0,68(2,51) -0,4С(- -0,73) 128 6,1 55 78 170

группа А 46 0,08(0,22) -I.39 - -1,92) 87 2,5 17 71 104

группа В 34 1,29(3,08) 1,84 ( 2,18) 185 5,7 33 158 196

Гепаран-к-суль-фатазгг 13 1,61(2,37) 2,1'Н 1,54) 1,6 0.3 I I 2

и-ацетил-а-в-глюкозаминидаза IV 2,54(4,28) 8,37 ( 7,04) 22 2,5 10 16 24

Арилсульфатаза В 34 0,46(1,71) -0,91( -1,70) 83 4,5 42 49 112

/л-ь-глккурони-даза 121 0,30(1,35) -0,44 (- -0,98) 219 8,3 92 147 285

«-п-мгшнозидаза 164 0,97(5,09) 1,53 ( 4,01) 170 6,1 78 109 216

«-ь-фукозидаза 143 1,13(5,50) 2,ОН 4,91) 70 3,0 36 41 92

р-и-глюксзицаза 69 1,39(4,70) 1,Э8( 3,35) 13 0,5 5 10 14

Арилсульф&таза А 274 0,67(4,53) 0,20 ( 0,66) 219 5,7 94 145 280

р-с-галактоиег риброзидаза 189 0,45(2,53) -0,39( -1,10) 124 8,3 48 82 159

Сфингомкелинеза 27 0,69(1,47) -0,65( -0,69) 154 13 Л 68 91 193

р-с-галактози-даза 330 0,84(6,26) 0,47 ( 1,74) 167 3,5 64 ПЭ 205

а-в-глыкозидаза 72 Т,17(4,04) 2,03( 3,52) 36 1.8 15 26 45

о-о-г&лактозидаза 15 0,70(1,10) -0,72( -0,57) 35 0 Т 9 27 42

Кислая липаза 17 2,34(3,93) 7,21( о 6.07) 23 2,4 10 17 26

Продолжение таблицы 4.

I 2 3 4 5 6 7 8

плазма •

л-ацетил-а-п-глюкозаминидаза 119 I,'88(8,35) 4,79(10,86) 410 16,6 180 291 467

р-с-глюкурони-даза 59 1,48(4,63) 2,75( 4,31] 19 1,4 10 II 23

а-в-маннозидаза 54 0,78(2,35) 0,17( 0,25) 33 1,5 II 25 39

а-ь-фукозидаза 96 0,17(0;67) -1,03(-2,05) ИЗ 3,3 33 85 138

к-ацетил-р-г- глюкозаминидаза (общая) 149 0,48(2,41) 0,03( 0,07) 576 16,5 201 457 684

Гексозаминида-за А (%) 149 0,03(0,17) -0,91(-2,27) 60 0,5 6 55 64

Л

Математическая обработка наблюдаемых кривых распределения (асимметрия и эксцесс) подтвердила справедливость ранее высказанных предположений. Практически для всех проанализированных ферментов наблюдаемые асимметрия и эксцесс в норме не превышали ожидаемых. Небольшие отклонения могут быть связаны с тем, что наблюдаемое распределение активности ряда ферментов соответствовало не нормальному, а другим типам распределения для непрерывных величин. Что касается a-L-идуронидазы, то наблюдаемые асимметрия и эксцесс для обеих групп не превышали ожидаемые (А и В в табл.4).

Для наиболее используемого при постната;;ьной энзимодиагностике ЛБН биологического материала (лейкоциты и плазма) нами проанализирована экспрессия большой группы лизосомных ферментов в различных возрастных и половых группах. Выбор возрастных групп определялся возрастом пациентов с ЛБН и их родителей. При сопоставлении уровней активности лизосомных ферментов лейкоцитов и плазмы у женщин с таковыми у мужчин уровень значимости был велик (0,0i<p<0,05), что говорит об отсутствии достоверных различий в экспрессии лизосомных ферментов между мужчинами и женщинами. Статистически достоверные возрастные различия в экспрессии активности лизосомных ферментов выявлены для и-ацетил-а-п-глюкозаминидазы, /з-о-глюкуронидазы (p<o,ooi), «-п-маннозидазы (o,ooi<p<o,oi) в плазме. Однозначная интерпретация этого феномена требует дальнейшего исследования на более представительных выборках, однако, можно высказать несколько предположений. Лизосомные ферменты, характеризующиеся ярко выраженной возрастной динамикой, вовлечены в метаболизм экстраклеточного матрикса, а именно, двух его макромолекулярных компонент - протеогликанов и структурных гликопротеидов. Эти компоненты характеризуются высокой скоростью синтеза и деградации с ярко выраженной возрастной динамикой [Rosenfeld,I97I, Rao et al.,1975]. Специфика функционирования лизосомных ферментов, связанная с их сложнейшим многоступенчатым процессингом, объясняет преимущественное возраст-зависимое увеличение активности лизосомных ферментов в плазме, а не в клеточном материале обследуемых. Плазма (и, возможно, другие биологические жидкости) является тем пулом, в котором находят отражение возраст-зависимые колебания активности лизосомных ферментов. Обнаруженный нами факт должен учитываться в

иктепретации генотипов обследуемых.

Влияние физиологического фактора беременности на экспрессию 10-ти ллзосомных ферментовв лейкоцитах и 4-х лизосомных ферментов е плазме оценивали у беременных на I, II и III триместрах (г.=20) по сравнению с контролем (рис. 2). Динамика изменения активности разных лизосомных ферментов у беременных женщин различна и описывается тремя формами кривых, причем эти различия касаются и степени изменения, и сроков манифестации. К числу неизменяющихся Ферментов относится только ß-D-гллкозидаза, которая является мембрано-встроенным ферментом. Экспрессия активности и-:.-лдуронкдазы незначительно увеличивается в I триместра (c,oi<F<o,0D) и снижается до контрольных значений ко II и III триместрам (р>о,о5). Экспрессия активности a-d-глюкозидазы, арилсульфатазы В, «-п-мсннозидазы, p-d-глюхуронидазы, ß-D-галактоцеребрсзидазы, ß-d-галактсзкдазы увеличивается в два и более раз. Изменениение экспрессии активности сг-ь-фукозидазы

/ЕЙ.КОИИГЫ

п/!а"чк.<л

о

о

в

ш

Рис.2. Изменение экспрессии лизосомных ферментоз лейкоцитов и плазмы у беременных (I, II, III триместры). 100% - контроль, (идентификация н ферментов дана в таблице 2).

(р>0,05) и арилсульфатазы А (р>0,05) в I триместре не было статистически достоверным, однако, ко II и III триместрам экспрессия активности этих ферментов возрастала почти в два раза. В плазме крови беременных выявлено увеличение активности и-ацетил-р-о-глюкозаминидазы (общей), и-ацетил-а-п-глюкозамини-дазы, а-ь-фукозидазы и снижение активности а-о-маннозидазы и гексозаминидазы А (%). Наряду с генерализованной интенсификацией метаболизма матери, в том числе гормонально-опосредованной, может иметь место индуцибельная интенсификация активности лизосомных ферментов, связанная с попаданием лизосомных ферментов плода и продуктов его метаболизма через фетоплацентарный барьер в кровоток матери, что допускает гемохориальный тип строения плаценты у человека. Влияние генотипа плода на уровень активности идуронатсульфатазы было показано для беременностей при риске МПС II [г1о1:одога е1 а1.Д984]. Можно предполагать, что такие лизосомные ферменты, как н-ацетил-а-п-глюкозаминидаза и к-ацетил-р-Б-глюкозаминидаза, характеризующиеся резким возрастанием активности на II триместре беременности, следует анализировать в плазме крови беременных женщин при беременностях отягощенных МПС III В и см0-ганглиозидозами соответственно.

2. Постнатальная диагностика ЯБН

Медико-генетическое консультирование семей, отягощенных ЛБН, начали проводить в 1982 г., сначала для семей с МПС, имеющими яркий клинический фенотип, а потом и для семей с другими ЛБН. Объем выборки, подразделенной на 3 группы клинических фенотипов, и результаты локусной дифференциации ЛБН в . выборке больных приведены в таблице 5. Из данных этой таблицы явствует, что большая часть известных к настоящему времени ЛБН была выявлена в данном исследовании. Практически все ЛБН, выявленные более чем в одной семье, характеризовались выраженным клиническим полиморфизмом (МПС I, II, У1, муколпнидозыП и III, «-маннозидоз, см^ и см^-ганглиозидозы, болезнь Гоше и болезнь Нимана-Пика).

В таблице 6 представлены данные по количественной экспрессии лизосомных ферментов у гомо- и гетерозиготных носителей ЛБН. Дисперсия значений активности у пациентов была выражена сильнее, чем в норме, что позволяло предположить генетическую неоднородность выборок пациентов по большинству нозологических форм. Активность лизосомных ферментов в

Таблица 5. Результаты локусной дифференциации ЛБН в выборке больных. Всего 742 семьи

- с подозрением на МПС 340 -"-

- с подозрением на прогрессирующее нейродегенеративное заболевание

- с подозрением на прочие ЛБН 34 -"-

ЛБН Число пациентов Число семей

Болезнь Гурлер (МПС I) 48 45

Болезнь Санфилиппо А (МПС III А) 28 27

Болезнь Санфилиппо В (МПС III В) 10 10

Болезнь Моркио А (МПС iv А) 23 16

Болезнь Моркио В (МПС iv В) 3 2

Болезнь Марото-Лами (МПС vi) 13 . II

Муколипидозы II и III 10 10

Мукосульфатидоз 2 I

a-D-маннозидоз 12 10

Сиалидоз 2 2

см^ганглиозидоз II II

Метахроматическая лейкодистрофия 14 12

Болезнь Гоше 17 16

Болезнь Ниманз-Пика 4 2

Болезнь Фабри I I

Болезнь Вольмана I I

неоднородных выборках гомозиготных носителей ЛБН не перекрывалась с контролем. В группе гетерозигот активность лизосомных ферментов перекрывалась с нормальными величинами, хотя средние значения у гетерозигот были меньшими.

Математическая обработка наблюдаемых кривых распределения (асимметрия и эксцесс) подтверждает предположение о полиаллельном контроле уровней активности лизосомных ферментов в груше гомо- и гетерозиготных носителей ЛБН. Наблюдаемый эксцесс практически для всех проанализированных ферментов в обеих группах превышал ожидаемый. Наблюдаемая величина асимметрии в группе гомозиготных и,в меньшей степени, гетерозиготных носителей ЛБН существенно выше, чем в норме. Следует подчеркнуть, что

активности лизссонных ферментов у больных с различными клиническими формами одной ЛЕН перекрывались, что не позволяло проводить аллельную дифференциацию только на основании экспрессии активности лизосомных ферментов, но требовало использования дополнительных методов.

Таблица 6.Активность лизосомных ферментов в клетках пациентов с ЛЕ

Лейкоциты ККФ

гомозиготы гетерозиготы гомозиготы

Фермент

ЛБН

Мукополисахаридозы

а-ь-идуронидаза

Гепаран-н-суль-

фатаза

к-ацетил-ге-Б-

глюкозаминидаза

и-ацетилгалак-

тозамин-6-сульфат

сульфатаза

д-с-галактозидаза

Арилсульфатаза В

«-о-маннозидаза «-н-нейроминидаза

Сфингомиелиназа р-о-глюкозидаза р-Б-галактозидаза «-о-галактозидаза Арилсульфатаза А

Кислая липаза

О - 35,0 90,6 + 57,6 0,03-0,35

О - 11,3 136.0 + 89,8 0-2,4

0-3,7 ' 119,1 + 46,5

О - 18,5 61,0 + 50,7

Гликопротеинозы

2.0-28,0 99.0 _+ II,3

Сфинголипидозы 1.9-2,4

0,6-2,5 4,9 + 2,6

О - 22,5 119,1 + 46,5 2,2 —

5.1-32,3 97,6 + 47,0

Другие ЛБН 0,93

О - 22,0 МПС I О - 0,9 МПС III А О - 8,9 МПС III В

0,14-0,29 МПС IV А

7,2-12.8 МПС IV В 29,0-46,0 МПС VI

4,1-41,0 Маннозидоз О Сиалидоз

ьолезнь Ннмана-Пика 2,3-45,0 Болезнь Гоше

8,2-27,8 см.-ганг-лиозодоз 4,2 Болезнь Фабри 18,7-20,1 Метахрома-тич.лейко-дистрофия

Болезнь Вольмака

Большая величина нашей выборки больных, длительный срок ее формирования, и растущий год от года опит сотрудничающих с нами врачей-консультантов позволяют нам считать, что соотношение встречаемости различных ЛБН, наблюдаемое нами соответствует реальному для "усредненной" популяции страны. То есть, выявленное соотношение встречаемости разных форм см^ганглиозидозов, метахроматической лейкодистрофии и других нейродегенеративных форм сфинголипидозов, а также МПС с Гурлер-подобным фенотипом и поражением интеллекта, безусловно, отражает реальное. Наибольшие искажения встречаемости и эпидемиологии эта выборка дает для ЛБН, не поражением интелекта (МПС IV, VI, болезнь Гоше, взрослых форм ЛБН.

В двух регионах страны встречаемость и спектр МПС были оценены в ходе медикс-генетических экспедиций, руководимых профессором Е.К.Гинтером [Гинтер Е.К. ,1932]. Все семейные случаи выявлялись и диагностировались в 9 регионах Узбекистана и II регионах Туркмении (средний размер семьи в этих мусульманских популяциях около 5). Встречаемость МПС в этих регионах составила 1:15000, что сравнимо со среднеевропейской частотой фенилкетонурии [Краснопольская К.Д.,1984].

Таблица 7. Этническая принадлежность больных с МПС.

сопровождающихся тип I) и особенно

Болезнь

Количетьо больных(семей)

НКО

МГЭ

Этническая принадлежность

МПС I МПС II

МПС III А

МПС III В

МПС III (неидентифиц)

МПС 1У А МПС 1У В

48 45) . 76 (70)

28 (27)

10 (10)

6 (6) 12 (II)

3 (2)

4 (3) 2 (2)

МПС неидентифи-цированного типа 7 (7) (I; II или 1У)

II (5)

4 (2)

русские*., украинцы, армя не, туркмены, буряты русские, украинцы, белорусы, молдаване, грузины, армяне, туркмены, немцы, корейцы, казахи

русские, украинцы, армяне, азербайджанцы, литовцы, грузины

русские, украинцы, армяне, белорусы, евреи

русские, украинцы, азербайджанцы

русские, белорусы, армяне, туркмены, узбек*

русские

русские, украинцы азербайджанцы, узбеки

Данные по этническому составу больных ЛБН, обратившихся в НКО Медико-Генетического Центра РАМН, и выявленных во время экспедиционных обследований (МГЭ), представлены в табл. 7.

В Узбекистане и Туркмении относительно часто встречался МПС

IV, ЧТО Характерно И ДЛЯ ДРУГИХ мусульманских ПОПУЛЯЦИЙ [ОгапсЗ

р.т.,1990], но, вообще, не был выявлен МПС III, хотя все семейные случаи с умственной отсталостью и скелетными аномалиями были исследованы. Напротив, большинство больных из Закавказья имело МПС III. МПС I обнаружил тенденцию к накоплению в Ростовской области, 5 имели МПС I и один - МПС II (их принадлежность к коренным жителям области определена при составлении родословной). В нашей выборке пациентов наиболее частым типом МПС, обнаруженным у русских, украинцев, белорусов, молдаван, туркмен, грузин, армян, азербайджанцев, бурят, немцев, казахов был МПС II. Множественный сульфгтидоз был диагностирован только у лиц мусульманского происхождения. Спектр ЛБН, найденный в мусульманских популяциях страны, выявил большое сходство с таковым в Саудовской Аравии [огаг.а р.т., 1590].

ЛБН, с высокой частотой встречающиеся у евреев-ашкенази, на примере нашей выборки не выявили тенденции к накоплению в данной этнической группе. Из 14 пациентов с болезнью Геле, пга I, только 4 были езреи-ашкенази, среди 4 пациентов болезнью Нимана-Пика -2, среди пациентов с МПС II - один. С высокой частотой в выборке диагностированных пациентов была гредставлена болезнь Тея-Сакса (21 из 23), которая с высокой частотой встречается у евреев ашкенази [Аронович 2. Л. и ссавт., 1986].

3. Пренатальная диагностика ЛБН.

Анализ экспрессии лизссомных ферментов в контрольном материале плодного происхождения (БХ, 1СХХ, ККАЗ) создал методическую базу для пренаталь\ой диагностики в семьях с верифицированным диагнозом ЛБН. По поводу пренатальной диагностики при повторной беременности обратилось 47 семей, отягощенных ЛБН. Результаты пре,гстазлены в табл.8 .Для более эффективной пренатальной диагностики ГИПС наряду с традиционными методами знзимодиагностики нами с успехом были применены методы качественной и полуколичественной сценки ГАГ в А?:. Использование этих методов позволяет получить быстрый и достаточно надежный ответ, и дает возможность исследовгтелю и семье ориентироваться в отношении наиболее вероятного результата пренатальной диагностики.

Таблица 0. Суммарные данные пренатальной диагностики в семьях с риском ЛБН.

тгт-ц Число JlbH семей Число беременностей Число здоровых плодов Число пораженных плодо]

МПС I 7 9 7 2

МПС II 18 23*. 15 9*

МПС III А 6 7 6 I

МПС III В 7 7 7 0

МПС У1 2 2 I I

Мукосульфатидоз I 2 I I

Маннозидоз I I I 0

gi^-ганглиозидоз 3 3 3 0

Метахроматичес- - 2 кая лейкодистрсфия 2 2 0

Итого 47 56 43 14

одна беременность была близнецовая, оба плода поражены.

ВЫВОДЫ.

1. В плазме 'и лейкоцитах крови, культуре кожных фибробластов, биоптате и культуре ворсинчатого хориона, культуре клеток амниотической жидкости изучена экспрессия 19 лизосомных ферментов: к-ь-идуронидазы, гепаран-и-сульфатазы, м-ацетил-а-Б-глюкозамкнидазы, н-ацетилгалактозамин-6-сульфат сульфатазы, /з-о-галактозидазы, арилсульфатазы • В, р-п-глкжуронидазы, а-с-маннозидазы, а-ь-фукозидазы, а-и-нейраминидазы, арилсульфатазы А, р-о-глюкозидазы, р-с-галактоцереброзидазы, сфингошелиназы, н-ацетил-э-Б-глюкозаминидазы (общей), гексозаминидазы А (%), «-о-галактозидазы,• кислой липазы, а-Б-глюкозидазы. Обнаружена тканеспецифичность, отсутствие половых и наличие возрастных различий в их экспрессии.

2. Распределение активностей 14 ферментов в лейкоцитах и 5 1 ' ферментов в плазме у нормальных доноров было унимодальным. По уровню активности «-ь-идуронидазы доноры разделялись на два класса, что позволило выдвинуть предположение о существовании в популяции более чем одного нормального аллеля соответствующего гена.

3.Установлено увеличение активности 10 лизосомных ферментов в лейкоцитах беременных (1-1II триместры) ' по сравнению с

контролен: активность «-о-глюкозпдазы, арилг.удьфэтазы В, u-D-маккозидазы, р-с-глюкуронлдззь:. ¿-о-галактоцеребгозидэзы, ¿¡-ь-галактозидззы увеличивается б два и Солс-з раз, активность а-ь-фукозидазы и арилсульфатазы А увеличивается менее чем в два разг. активность ¿-ь-идуронидази незначительно увеличивается в I триместре с последую;;;:;:.', снижением до контрольных значений. В плазме крови беременных выявлено увеличение активности н-ацетпл-р-п-глюкозгьшнпдазы (тотальной). я-яцетил-а-о-гляксз-амикидазы, к-ь-фукозндазы и снижение активности п-о-маннозлдазы и гексозамикидазы А (3) по сравнений с контролем.

4. Распределения активностей зсех исследованных отзосомкых ферментов у гомозиготных носителей лизосомных болезней накопления не перекрывались с распределениям:! в контроле для всех видов исследованного биологического материала. 3 группе облигаткых гетерсзнгот распределение активности всех лизосомных ферментов обнаруживало существенное пепекравание с распределением активности Э1нх ферментов в контроле, хотя средние значения у гетерезигот были яект-апми. Это позволило создать методическую базу для локусксЛ дифференциации ЛБп.

Б. При обследовании 742 семей, присланных из различных медико-генетических консультаций страны с подозрение!! на болезни накопления, диагноз был установлен у 199 больных, в том числе у 125 больных из III семей диагностировано 6 типоз муксполисахаридозоз, у 14 больных из 12 семей - 2 типа глихопротеинэза, у 47 больных из 42 семей - 5 типоз сфинголипидозов. у 10 больных из 10 семей - 2 типа муколипидоза, у двух больных из одной семьи - мукосульфатидоз. Методами энзиыодиагиостики 5 лизосомных болезней накопления было диагностировано впервые в стране.

6. В 47 семьях с лизосомкымл болезнями накопления при 56 беременностях осуществлена пренатальная диагностика с последующей верификацией генотипа пораженных плодов и КС порожденных: МПС 1-9 случаев, МПС II - 24, МПС III А - 7, МПС III В - 7, МЛС У1 - 2, мукосульфатидоз - 2. ианкозидоз - 2, см,-ганглиозидоз -- 3. метахроматическая лейкодистрофпя - 2. Идентифицировано 14 пораженных гомозигот, что составляет ожидаемые 25% пораженных.

- 22 -

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. МиренбургiT.В., Аронович Е.Л., Барцева О.Б. Изучение экспрессии лизоссмных ферментов в различных тканях плода для целей дородовой диагностики болезней накопления.//Тез. докл.Всесоюзного симпозиума "Актуальные вопросы профилактики наследственных болезней".- Вильнюс, 1986.- С.81-82.

2. Краснопольская К.Д., Миренург Т.В., Лебедева Т.В. Проблемы энзимодиагностики наследственных дефектов обмена.//Тез. докладов Всесоюзного симпозиума по медицинской энзимологии.-Махачкала, 1986.- С.138-139.

3. Краснопольская К.Д., Миренбург Т.В., Аронович Е.Л., Лебедева Т.В. Проблемы пре- и постнатальной диагностики лизосомных болезней. //Тез.докладов Третьего Всесоюзного симпозиума "Структура и функция лизосом".- Тбилиси, 1986.- С.I09-III.

4. Краснопольская К.Д., Миренбург Т.В. Биохимическая диагностика наследственных болезней.//Сборник научных трудов. Москва, 1936.-С.53-75.

5. Миренбург Т.В., Аронович Е.Л., Лебедева Т.В. Дородовая диагностика наследственных лизосомных болезней.//Тез.докладов У създа ВОГиС им.Н.Vi.Бавалова.- Москва, 1987.- С.77.

6. Миребург Т.В., Аронович Е.Л., Лебедева Т.В., Ахунов B.C., Краснопольская К.Д., Барцева О.Б., Смирнова O.A., Бахарев В.А'., Фукс М.А. Пренатальная диагностика наследственных лизосомных болезней.//Вопр.мед.химии.- 1988.- и 4.- С.41-46.

7. Krasnopolskaya K.D., Mirenburg T.V., Lebedeva T.V., Aronovich E.L.The experience in prevention of inherited lysosomal diseases in the USSR.//Abstrakta. VI Celastatny rjazd Lekarskey Genetiky.-Eanska Eystryca, 1938.

8. Миренбург T.B., Лебедева T.B., Краснопольская К.Д., Барцева О.Б., Козлова В.М., Бахарев В.А.Биохимическая диагностика мукосульфатидоза.//Вопр.мед.химии.- 1989.- n 6.- С.27-31.

9. Миренбург Т.В., Краснопольская К.Д., Аронович Е.Л., Лебедева: Т.В.Пренатальная диагностика наследственных лизосомных болезней.//Советско-чешский сб.научных трудов "Медицинская генетика.Теория и практика."- Москва, 1989.- С. 122-132.

10.Ахунов B.C., Краснопольская К.Д., Миренбург Т.В. Использование нагзузочных тестов с помошыо меченого GMj^-ганглиозида для дифференциальной диагностики GM.-ганглиозидоза.//Вопр.мед.химии.- 1989.- N 5.- C.II9-I22.

11.Исследование генетической гетерогенности ганглиозидозов у человека.//'Тенетика"-1989.-т.ХХУ.-n 10.- C.I86I-IS7I.

12.Ахунов B.C., Миренбург Т.В., Лебедева Т.В. Получение и исследование меченых органических соединений в диагностике наследственных болезней накопления.//II Всес.совещ. по пробл. "Физиологически активные соединения".-Звенигород, 1988.-С.25.

13.Миренбург Т.В., Аронович Е.Л., Лебедева Т.В., Малахова В.А., Бирюков В.Б., Золотухина Т.В. Пренатальная диагностика наследственных болезней накопления.//Тезисы II съезда ВНОМГ.-Алма-ата, 1990,- С.299-300.

14.Krasnopolskaja K.D., Aronovich E.L., Mirenburg T.V. Investigation program for lysosomal storage diseases in the USSR //8 Symposium of Socialist Countries on Hereditery Metabolyk Disorders.-1989.

15.Mirenburg T.V., Lebeaeva T.V., Aronovich E.L., Krasnopolskaja K.D. Prenatal diagnosis of lysosomal diseases in the USSR.-1990.- Prague,-Р.186

16.Краснопольская К.Д., Миренбург Т.В., Лебедева Т.В., Аронович Е.Л. Пренатальная диагностика наследственных лнзосомных болезней.//Тезисы. "Пренатальный и неонатальный скрининг врожденной и наследственной патологии"- Харьков,- 1990.-

С.24-25.

17.Ахунов B.C., Аронович Е.Л., Миренбург Т.В., Краснопольская К.Д. Локусная и аллельная дифференциация ганглиозидозов.//Тезисы Второй Всес.конф."Геном человека - 91".- Переславль-Залесский,-1991.- С.I0I-I02.

Заказ № ^76Ти[>ам/ЛГэкз. МОЭЗ "Механизация"