Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка бактериальной композиции для производства ферментированного мясного продукта Вьетнама

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка бактериальной композиции для производства ферментированного мясного продукта Вьетнама"

005060334

На правах рукописи

НГУЕН ТХИ МИНЬ КХАНЬ

РАЗРАБОТКА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ФЕРМЕНТИРОВАННОГО МЯСНОГО ПРОДУКТА ВЬЕТНАМА

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 о МАЙ 2013

Щелково - 2013

005060334

Работа выполнена на кафедре «Химия пшци и пищевая биотехнология» федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств» (ФГБОУ ВПО МГУПП)

Научный руководитель: доктор технических наук, ведущий научный

сотрудник ФГБОУ ВПО МГУПП, лауреат премии Правительства РФ в области науки и техники для молодых ученых Машенцева Наталья Геннадьевна

Официальные оппоненты- доктор биологических наук, старший научный

сотрудник ГНУ ВНИТИБП РАСХН Скотникова Татьяна Анатольевна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГУП «ГосНИИгенетика» ГНЦ РФ Вустин Михаил Михайлович

Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится: « 21 » июня 2013 г в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП; тел./факс 8 (496) 567-32-61, e-mail: vni(ibp(g> mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии

Автореферат разослан « 20 » мая 2013 г, размещен на сайте ВНИТИБП Россельхозакадемии www.vnitibp.ru и на официальном сайте ВАК http://www.vak.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Фролов Юрий Дмитриевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Мясная промышленность - крупнейшая отрасль пищевой индустрии, выпускающая широкий ассортимент продукции пищевого, технического и медицинского назначения. Основными задачами производства мяса и мясных продуктов являются улучшение качественных показателей продукции (пищевая ценность, органолептика); создание новых видов продуктов питания с заданными свойствами; увеличение объемов производства.

Один из путей решения такой проблемы - создание и использование для производства мясных изделий биологически активных веществ на основе продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. Установлено, что стартовые культуры, посредством ферментов, изменяют состав и структуру мясных продуктов, образуя новые вещества, способствующие улучшению их качественных показателей.

Исследования применения стартовых культур при переработке пищевого сырья животного происхождения широко рассматриваются во всем мире (Ганина В.И., Костенко Ю.Г., Липатов H.H. (мл), Рогов И.А., Семенихина В.Ф., Соловьев В.И., Хорольский В.В., Bover-Cid S., De Vuyst L., Eerola S., Klaenhammer T.R., Leroy F., Madsen S.M., Niinivaara F., Tanous C., Vandamme E.J. и др.). Ферментированные мясные продукты относительно недавно стали относить к пробиотическим продуктам, усиливающим иммунную систему организма человека. Применение стартовых культур в мясной промышленности является современной тенденцией получения новых видов мясных, в том числе национальных, продуктов с высокой пищевой ценностью, гарантированной безопасностью и специфическими органолептическими показателями.

Вьетнам - аграрная страна с развивающейся промышленностью. Основными сельскохозяйственными продуктами страны являются рис, кукуруза, батат, кофе, чай, маниока, бананы, ананасы, арахис, цитрусовые, сахарный тростник и др. Также разводят крупный и мелкий рогатый скот, свиней и домашнюю птицу, ведется промысел рыбы.

Степень разработанности проблемы В настоящее время, благодаря развитию биотехнологии и применению новых технологических методов, начато производство высококачественных мясных продуктов с повышенной пищевой ценностью. Наравне с новыми видами мясных продуктов большую роль в жизнь людей играют национальные продукты. Сегодня национальные ферментированные продукты востребованы потребителем и занимают отдельный сегмент в пищевой промышленности страны. В действительности процесс ферментации национальных мясных продуктов нестабилен, и вьетнамские производители часто сталкиваются с проблемами контроля качества в связи с ростом нежелательных гетероферментативных микроорганизмов, образующих, помимо молочной кислоты, другие кислоты, что ведет к резкому снижению pH среды, кислому вкусу, неприятному аромату, жесткой консистенции. На наш взгляд, одним из путей решения данной проблемы является использование в рецептуре такого продукта стартовых культур.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы является разработка бактериальной композиции для контроля процесса ферментации и стабилизации качества мясного продукта.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи;

1. Изучить состав микрофлоры и выделить новые микроорганизмы из колбасы, выработанной во Вьетнаме;

2. Провести исследование фенотипических, молекулярно-генетических и технологических свойств выделенных микроорганизмов и идентифицировать их до вида;

3. Провести ПЦР-генотипирование генов патогенности в геноме энтерококков;

4. Изучить пробиотические свойства, в т.ч. адгезивную способность, выделенных микроорганизмов на эпителиальных клетках человека;

5. Провести паспортизацию промышленно-ценных штаммов с помощью ДНК-фингерпринта (геномной дактилоскопии) методом ПЦР с использованием штаммоспецифических праймеров;

6. Разработать бактериальную композицию стартовых культур для ферментированных мясных продуктов и проект технической документации на бактериальный препарат;

7. Провести оценку влияния бактериальной композиции на качественные показатели национального ферментированного мясного продукта;

8. Сформулировать научно-практические рекомендации для реализации технологического процесса производства ферментированных мясных продуктов в условиях Вьетнама.

Научная новизна работы

• С помощью метода T-RFLP, основанного на анализе вариабельности генов 16S ДНК бактерий, произведена оценка состояния микрофлоры мясного продукта «Нем-Чуа». Установлено, что микрофлора продукта включает 18 видов лактобакгерий, бифидобактерии Bifidobacterium indicum, Bacillus sp„ буркхольдерии Burkholderia tropica.

• Из национального вьетнамского мясного продукта «Нем-Чуа» были выделены новые штаммы; проведена их идентификация с применением классических фенотипических методов в сочетании с генетическими методами в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ: Pediococcus pentosaceus КПБ-1, Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Enterococcus thailandicus КПБ-2.

• Установлено отсутствие трансмиссивной антибиотикоустойчивости у штаммов Pediococcus pentosaceus КПБ-1, Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Enterococcus tlmilandicus КПБ-2 - при устойчивости всех трех штаммов к антибиотику ко-тримоксазолу и умеренной устойчивости штаммов КПБ-1 и КПБ-2 к эритромицину плазмидной ДНК в геноме микроорганизмов не обнаружено.

• Исследования на тестовых питательных средах (тесты на протеолитическое разжижение желатина, ДНКазу) показали отсутствие факторов вирулентности у штамма Enterococcus thailandicus КПБ-2. Поиск генов, отвечающих за признаки патогенности энтерококков: прикрепление бактерий к поверхности эукариотической клетки (agg, 1553 п.н.); синтез токсина, обеспечивающего гемолиз эритроцитов (gelE, 419 п.н.); синтез сериновой протеиназы (sprE, 233 п.н.); активация цитолизина (су/А, 517 п.н.); внеклеточный поверхностный протеин (esp, 933 п.н.), необходимый для колонизации мочевыводящих путей и образования биопленок (fsrB 316 п.н.), показал отсутствие этих генов в геноме штамма Enterococcus thailandicus КПБ-2.

• Разработан оригинальный способ определения адгезивных свойств микроорганизмов с помощью клеточной линии СаСо-2 (эпителеподобные клетки аденокарценомы ободочной кишки человека), на который оформлена заявка № 2012119278 от 12.05.2012 на выдачу патента РФ, положительное решение, май 2013.

• Установлено, что Е. thailandicus КПБ-2 имеет высокоадгезивную способность, которая является одним из важнейших свойств пробиотических штаммов.

Практическая значимость работы

• Установлено, что по своим технологическим свойствам (активная и предельная кислотность в процессе сквашивания молока, время образования сгустка в молоке, устойчивость к различным концентрациям NaCl, не способность образовывать биогенные амины выше допустимого уровня 350 мг/л, антагонистическая активность по отношению к санитарно-показательной микрофлоре) штаммы Pediococcus pentosaceus КПБ-1, Pediococcus pentosaceus КПБ-3 и Enterococcus thailandicus КПБ-2 могут быть использованы в мясной промышленности в качестве стартовых культур. Штаммы депонированы в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика под номерами В-10983, В-10985, В-10984 соответственно.

• По совокупности технологических свойств, с учетом отсутствия антагонизма между штаммами, разработана бактериальная композиция, содержащая штаммы Enterococcus thailandicus КПБ-2, Pediococcus pentosaceus КПБ-3 и микроорганизмы из коллекции ФГБОУ ВПО МГУПП Staphylococcus camosus 108 (В-8953), Lactobacillus citn>atus LCR-2 (B-8906), и проект технической документации ТУ 9229-048-0206840-13 на бактериальный препарат «Немчуа-Н» на ее основе.

• Проведена паспортизация промышленно-ценных штаммов Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Enterococcus thailandicus КПБ-2, Staphylococcus camosus 108 и Lactobacillus cunatus LCR-2 с

4

помощью ДНК-фингерпринга методом ПЦР с использованием штаммоспецифических праймеров.

• Установлено, что введение бактериальной композиции в рецептуру ферментированного мясного продукта Вьетнама позволяет контролировать технологический процесс, длящийся 5 сут, а также способствует формированию насыщенного цвета, плотной структуры, придает специфический вкус, аромат готовому продукту и обеспечивает его микробиологическую стабильность.

• Сформированы научно-практические рекомендации для производства вьетнамского ферментированного мясного продукта со стартовыми культурами.

Основные положения, выносимые на защиту

• Анализ структуры микробного сообщества мясного продукта «Нем-Чуа» и идентификация трех новых промышленно-ценных штаммов Pediococcus pentosaceus КПБ-1 (В-10983), Pediococcus pentosaceus КПБ-3 (В-10986) и Enterococcus thailandicus КПБ-2 (В-10984) из национальной вьетнамской колбасы «Нем-Чуа».

• Создание бактериальной композиции на основе стартовых культур Enterococcus thailandicus КПБ-2, Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Lactobacillus curvatus LCR-2, Staphylococcus carnosus 108 для производства ферментированных мясных продуктов Вьетнама.

• Оценка влияния разработанной бактериальной композиции на качественные и микробиологические показатели ферментированного продукта и рекомендации по ее использованию для контроля процесса ферментации мясного продукта Вьетнама.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы проводились совместно с научными сотрудниками лаборатории Современных методов биотехнологической экспертизы пищевых продуктов, лаборатории Пищевой биотехнологии, кафедры «Технология мяса и мясных продуктов» ФГБОУ ВПО МГУПП.

Апробация работы. Основные положения работы и результаты исследований были представлены на следующих конференциях: V Международной научно-технической конференции «Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2011 г.); IX, X Международных научных конференциях студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2011 г, 2012 г); Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», (Москва, 2012 г, 2013 г); Н-ой Международной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов (Киев, 2012 г); VIII Международной научно-практической конференции «Наука и технологии: шаг в будущее - 2012» (Прага, 2012 г); IX, X научно-практической конференции с международным участием «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» (Москва, 2011 г, 2012 г); Международной конференции «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред» (Москва, МГУ, 2013).

Публикации научных исследований. По результатам исследований, изложенных в диссертационной работе, опубликовано 14 печатных работ, в т.ч. статей в журналах, рекомендованных ВАК — 3, в других изданиях —11.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, изложена на 115 страницах основного текста, содержит 17 таблиц и 18 рисунков. Список литературы состоит из 104 источников.

Благодарности. Автор выражает благодарность директору Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика» ГНЦ РФ, д.б.н., профессору Синеокому С.П., заведующей отделом микробиологии ОАО «ГосНИИсинтезбелок» ГК Ростехнологии, д.б.н. Ботиной С.Г., директору ООО «Биотроф», д.б.н. Лаптеву Г.Ю. и главному специалисту Никонову И.Н., научному сотруднику ФГБОУ ВПО, к.т.н. Колотвиной С.В.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Работа выполнена в рамках Ведомственной программы Министерства образования и науки РФ 4.2053.2011 «Разработка принципов контроля морфогенетической активности физико-химических факторов на биосистемы с привлечением современных методов экологической экспертизы пищевых продуктов» и гранта Президента РФ для молодых ученых -

докторов наук МД-3302.2012.4 «Поиск и идентификация биорегуляторов систем гомеостаза организма человека, входящих в состав функциональных продуктов питания».

Введение. Обоснована актуальность темы диссертационной работы и изложена ее общая характеристика.

Глава 1. «Литературный обзор». Представлен анализ научно-технической литературы о ферментированных мясных продуктах, в том числе национальных продуктах Вьетнама. Представлена информация о стартовых культурах, используемых в пищевой промышленности, в т.ч. о роли пробиотических микроорганизмов в составе пищевых продуктов. Приведены данные о микроорганизмах рода Enterococcus, которые несут в себе большой потенциал для использования в качестве стартовых культур и пробиотиков. Обозначена проблема контроля процесса ферментации национального мясного продукта Вьетнам «Нем-Чуа». Поставлена цель, определены задачи исследований и сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну, показана практическая значимость и степень апробации работы.

Глава 2. «Методы исследования». Изложены краткие характеристики объектов исследований, представлена схема эксперимента (рис. 1), обоснован комплекс исследуемых показателей и изложены методики их определения.

Объектами исследования в данной работе являлись: вьетнамский национальный мясной продукт «Нем-Чуа»; штаммы Enterococcus thailandicus КПБ-2, Pediococcus pentosaceus КПБ-1, КПБ-3, выделенные из вьетнамского национального мясного продукта «Нем-Чуа»; штаммы Lactobacillus cun'atus LCR-2 (В-8906) и Staphylococcus carnosus 108 (В-8953) из коллекции ФГБОУ ВПО МГУПП; национальный мясной продукт Вьетнама с бактериальной композицией.

В работе при изучении свойств микроорганизмов были использованы оригинальные (1 -определение совокупной микрофлоры мясного продукта экспресс-методом на основе T-RFLP-анализа в условиях капиллярного электрофореза с флуоресцентной детекцией с использованием автоматического секвенатора CEQ8000 (Beckman Coulter)) и классические микробиологические методы (2 — метод получения накопительной культуры из мясного продукта по ГОСТ 9952; 3 — выделение чистой культуры методом истощающего штриха; 4 - определение чистоты выделенной культуры), 5, 6 - физиолого-биохимические методы); 8 - определение устойчивости к антибиотикам проводилось диско-диффузионным методом; 12 -антагонистической активности - методом перпендикулярных штрихов; 5 - определение декарбоксилаз аминокислот с использованием основы бульона Мюллера; 10 - определение адгезивной способности бактерий на эпителиальных животных клетках СаСо-2; 11 -микроскопирование с помощью конфокального микроскопа Nikon Eclipse ТЕ2000-Е, Япония.

Генетические методы, используемые в работе (9 - выделение плазмиды из грамположительных микроорганизмов, 7 - ПЦР, секвенирование 16S рРНК, и др.) являются модификацией известных методов (Маниатис Т., 1984); 13 - применение ДНК-фингерпринта методом ПЦР для паспортизации промышленно-ценных микроорганизмов.

Для исследования ферментированных мясных продуктов были привлечены следующие методы: 14 — определение массовой доли влаги по ГОСТ Р 51479, 15 — массовой доли белка на полуавтоматическом приборе Kjeltec System 1002 «Tecator», Швеция, ГОСТ 25011, 16 -массовой доли жира методом Сокслета по ГОСТ 23042, 17 - массовой доли углеводов расчетным методом, массовой доли золы по ГОСТ Р 53642, 18 - массовой доли хлорида натрия по ГОСТ 9957; 19 - массовой доли нитрита натрия по ГОСТ 29299; 20 - определение водосвязывающей способности методом прессования по П. Грау и Р. Хама в модификации, 21 — активности воды на автоматическом анализаторе «Roremeter RM-10», Германия; 22 -определение величины рН потенциометрическим методом (Журавская, 1985); 23 - определение предельного напряжения сдвига методом пенетрации по ГОСТ Р 50814, 24 - работы резания по общепринятым методикам работы на универсальной испытательной машине «Инстрон-1140»; 25 - бактериологический анализ по ГОСТ 9958; 26 - органолептическая оценка по ГОСТ 9959. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили по стандартным программам и общепринятым алгоритмам с использованием регрессионного анализа и оптимизации.

Рис. 1. Схема проведения исследований

Глава 3. «Идентификация и изучение промышленно-цепных свойств штаммов, выделенных из национальной колбасы Вьетнама «Нем- Чуа»»

Одним из популярных ферментированных мясных продуктов во Вьетнаме является мясной продукт «Нем-Чуа». Он изготовлен из нежирной свинины, специй, сахара, соли, нитрита натрия и т. д., которые смешиваются с вареной свиной шкурой, нарезанной на тонкие полоски. Фарш формируется в форме кубов (2x3x3 см) или батонов (10x4 см) с тонкими ломтиками чеснока и черного перца горошком, используемых в качестве украшения и для аромата. Мясные кубики заворачивают в банановые листья, которые создают особый аромат, и затем обматывают шпагатом. Банановые листья, как правило, используются в качестве внешнего покрытия. Ферментация длится около 3-5 дней при температуре плюс 28-30 "С, происходит либо самопроизвольно, либо путем обратной инокуляции. На рис. 2 представлен национальный вьетнамский мясной продукт «Нем-Чуа», микрофлора которого была изучена.

Рис. 2. Национальный вьетнамский мясной продукт «Нем-Чуа»

Для изучения состава микрофлоры мясного продукта «Нем-Чуа» был использован молекулярно-генетический метод - T-RFLP-анализ (terminal restriction fragment length polymorphism). Данный метод основан на анализе вариабельности консервативных участков генома микроорганизмов. Суть метода заключается в выделении из мясного продукта ДНК всех находящихся там бактерий, амплификации с помощью ПЦР, ферментативном расщеплении ДНК на фрагменты и разделении их на автоматическом секвенаторе. Таксономическая принадлежность бактерий определяется в соответствии с длинами терминальных фрагментов гена с помощью программы Fragment Sorter.

ДНК из мясного продукта выделяли экстракцией фенолом/хлороформом и очисткой раствором СТАВ. ПЦР-амплификацию генов 16S рРНК бактерий проводили с использованием праймеров: 63F (caggcctaacacatgcaagtc) - с меткой на 5'-конце (флуорофор D4-WellRed); 1492R (lacgghtaccttgttacgactt). Амплифицированный фрагмент выделяли из агарозного геля с помощью ЗМ раствора гуанидина тиоционата. Рестрикцию ампликонов проводили с помощью рестриктаз НаеШ, Hhal и Mspl («Fermentas») в течение 2 ч при 37 "С. После окончания рестрикции ДНК из реакционной смеси осаждали этанолом, растворяли в SLS (Beckman Couller) с добавлением маркера молекулярного веса 600 п.н. (Beckman Coulter) и разделяли в условиях капиллярного электрофореза с флуоресцентной детекцией с использованием автоматического секвенатора CEQ8000 (Beckman Coulter).

Вычисление размеров пиков и их площади проводили с использованием программного блока Fragment Analysis (Beckman Coulter). Для идентификации пиков T-RFLP-граммы для трех эндонуклеаз (НаеIII, Hhal и Mspl) обрабатывали с помощью программы Fragment Sorter (http://www.oardc.oliio-state.edu/trflpfragsort/index.php).

Для мясного продукта «Нем-Чуа» были получены T-RFLP-граммы, отражающие структуру бактериальных сообществ ферментированного мясного продукта в оболочке из банановых листьев (рис. 3). Состав микрофлоры исследуемого продукта представлен в табл. 1.

Проба № 1

Проба № 2

I jrx 111 11 iTTffl 11 M < | M 1111111 1111111111~i... 11 f, f\ |T.T. I, I 1111

iL

1111 ijj'i 111 iLij..... I i |

Проба № 3

Проба № 4

Рис. 3. Т-ЫРЪР-граммы исследуемого мясного продукта Состав бактериального сообщества мясного продукта «Нем-Чуа», '

Таблица 1

Микроорганизм Внутренняя часть Внешняя часть

№ 1 №2 Среднее значение №3 №4 Среднее значение

Лактобактерии Lactococcus lactis, Lb pentosus, Lb. zeae, Lb. plantarum, Lb pantheris, Lb. graminis, Lb. genomosp., Lb. parafarraginis, Lb. sanfranciscensis, Lb sakei, Lb. curvatus. Lb casei. Lb. paracasei, Lb. hilgardii, Lb. rhamnosus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus stilesii 67,7 62,4 65,1 40,5 57,2 48,9

Бациллы Bacillus sp. 16,8 19,9 18,4 0 0,56 0,28

Бифидобактерии Bifidobacterium indicum 0 0 0 0 0,74 0,32

Буркхольдерии непатогенный вид Burkholderia tropica 0,77 0 0,3 0 0 0

Некультивируемые формы 14,7 17,7 16,2 59,5 41,5 50,5

- проба № 1 - внутренняя часть колбасы, первая повторность;

- проба № 2 - внутренняя часть колбасы, вторая повторность;

- проба № 3 — внешняя часть колбасы, первая повторность;

- проба № 4 - внешняя часть колбасы, вторая повторность.

Результаты исследований показали, что во внутренней части колбасы микрофлора представлена лактобактериями на 65,1%, бациллами на 18,4%, буркхольдериями на 0,3%, остальные 16,2% занимают некультивируемые формы микроорганизмов. Преобладают лактобакгерии и бациллы. Бифидобактерии отсутствуют. Небольшой процент буркхольдерий представлен видом Burkholderia tropica, обитающим на листьях и корнях растений, произрастающих в климатических зонах тропического пояса (пальма, кукуруза, сахарный тростник) (GenBank:АВ568320.1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/AB568320).

Во внешнем слое колбасы микрофлора представлена лактобактериями на 48,9%, бациллами на 0,28%, бифидобакгериями на 0,32%, а большую часть - 50,5% занимают некультивируемые формы микроорганизмов. Лактобактерии так же составляют большой процент. Бациллы и бифидобактерии составляют незначительную долю от всех микроорганизмов. Буркхольдерии отсутствуют.

Патогенных для человека микроорганизмов найдено не было

Кроме того, анализ полученных данных показал, что во всех исследуемых образцах значительная часть представлена некультивируемыми бактериями. Данные микроорганизмы невозможно выявить и изучить с помощью традиционных методов микробиологии (культивирование на питательных средах), а также выяснить их роль в процессе созревания колбасных изделий, которая может быть далеко не всегда положительной.

Для отбора промышленно-ценных микроорганизмов были изучены следующие свойства выделенных штаммов:

- культуральные (описание колоний, характер роста на жидких, полужидких, плотных средах, морфология клеток, окраска по Граму);

- физиолого-биохимические (рост при различных значениях рН, температуры, наличие каталазы, пероксидазы, восстановление лакмусового молока, утилизация углеводов, образование индола при ферментации триптофана, образование аммиака из аргинина;

- технологические (тип молочнокислого брожения, активная и предельная кислотность в процессе сквашивания молока, время образования сгустка в молоке, устойчивость к разным концентрациям поваренной соли, отношение к антибиотикам различных групп с анализом природы устойчивости);

- пробиотические (устойчивость к различным концентрациям фенола, желчи, к кислой и щелочной реакциям среды, способность к адгезии на эпителиальных клетках ЖКТ).

При изучении свойств штаммов было установлено, что:

- штамм КПБ-1 представляет собой клетки шаровидной формы диаметром 0,2-0,5 мкм, располагающиеся отдельно или тетрадами. Грамположителен, неподвижен, спор и капсул не образует. В среде MRS через 24 ч образует сильное помутнение и плотный белый трудноразбивающийся осадок. На твердых питательных средах образует точечные колонии круглой формы с ровными краями, выпуклые, непрозрачные, кремового цвета, диаметром 0,5-1 мм. Поверхность колоний гладкая. Растет на MRS-arape + 2-8 % NaCl. Лакмусовое молоко свертывает с образованием неоднородного сгустка, разделенного на отдельные части, и обесцвечивает в течение 24 ч. Ферментирует глюкозу, фруктозу, лактозу, сахарозу, мальтозу. Каталазоотрицательный (возможна псевдокаталаза). Растет при 45 °С. Аммиак, сероводород и индол не образует. Титруемая кислотность на 1 сут - 68 °Т, время образования сгустка - 24 ч, предельная кислотность на 7 сут - 125 °Т. Обладает антагонистической активностью по отношению к сальмонелле и протею. Декарбоксилазы аминокислот L-орнитина L-лизина L-тирозина L-гистидина не обнаружены. Проявляет аминоксидазную активность в соотношении кадаверина, путресцина.

- штамм КПБ-2 имеет сферическую форму клеток в парах или цепочках. Грамположителен, неподвижен, спор и капсул не образует. В среде MRS через 24 ч образует

сильное помутнение, исчезающее на 2 сут, и плотный белый трудноразбивающийся осадок. На твердых питательных средах образует мелкие колонии круглой формы с ровными краями, прозрачные, чуть мутноватые, диаметром 1-2 мм. Поверхность колоний гладкая. Растет на MRS-arape + 2-8 % NaCl. Образует аммиак из аргинина. Индол не образует. Через 24 ч обесцвечивает лакмусовое молоко, образует отдельный трубчатый сгусток. Титруемая кислотность на 1 сут - 75 °Т, время образования сгустка - 24 ч, предельная кислотность на 7 сут - 101 °Т. Каталазоотрицателен. Растет при 45 °С. Обладает антагонистической активностью по отношению к сальмонелле и протею.

- штамм КПБ-3 представляет собой клетки шаровидной формы диаметром 0,2-0,5 мкм, располагающиеся отдельно или тетрадами. Грамположителен, неподвижен, спор и капсул не образует. В среде MRS через 24 ч образует помутнение и плотный белый осадок. На твердых питательных средах образует точечные колонии круглой формы с ровными краями белого цвета однородной структуры. Поверхность колоний гладкая. Растет на MRS-arape + 2-8 % NaCl. Лакмусовое молоко свертывает с образованием трубчатого сгустка и обесцвечивает в течение 48 ч. Титруемая кислотность на 2 сут - 71 °Т, время образования сгустка - 48 ч, предельная кислотность на 7 сут - 120 °Т. Ферментирует фруктозу, лактозу, сахарозу. Каталазоотрицательный. Растет при 45 "С. Обладает антагонистической активностью по отношению к бактериям группы кишечных палочек, сальмонелле и протею. Проявляет аминоксидазную активность в отношении путресцина.

Изучение морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств позволило отнести выделенные микроорганизмы к следующим двум семействам: Enterobacteriacecie и Pediococcaceae, а изучение технологических свойств - рекомендовать данные штаммы в качестве стартовых культур.

Таксономический статус микроорганизма устанавливали на основании фенотипических свойств в сочетании с генетической идентификацией на основе сиквенса 16S рРНК. При проведении анализа нуклеотидных последовательностей вариабельный участков 16S рРНК продукты амплификации участка 16S рРНК после проведения электрофореза в агарозном геле визуализировали в УФ-свете на приборе УФ-трансиллюминатора УВТ-1 при помощи программы BioTest. Нуклеотидная последовательность амплифицированных участков 16S рРНК была получена в результате секвенирования на автоматическом секвенаторе CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, США). Для подтверждения идентичности штамма тем микроорганизмам, таксономический статус которых уже установлен, были использованы молекулярно-биологические базы данных http://rdp.cme.msu.edu/. При построении филогенетических деревьев (дендограмм) использовалась матрица эволюционных расстояний. Построение осуществлялось с помощью программы Ribosomal Database Project-II (http://rdp.cme.msu.edu) (рис. 4).

ШТАММ КПБ-1

Pediococcus cclllcoia (Т); Z-8

I — Pediococcus etbanolidnrans ill: Z-9

- Pediococcus arpentinicus ГГ1

_ Pediococcus stiiesii <T): type strain: LGJ1 23082

__I_ Pediococcus ciaussenil (T); type strain: DSM

_Pediococcus iolii (T): NGRI 0510Q; AB362985

Pediococcus acldllactlcl (T); DSM 20284 (T)

unknown

_ Pediococcus penlosaceus CT): DSM 20336

Pediococcus daninosus (T); DSM 20331

Pediococcus inopinatus (T): type strain: DSM 20285

Scale I-1

0.01

ШТАММ КПБ-2

Enlerococcuspseudoavium (Г); АТСС49372

Enterococcusrafflnosus(I);NCXMB ШШТ

Enterococcus dn-riesd (Г); typestrain I.MG 14595 Emerococciis gilrus (T); ATCCBAA-350 -Emerococcus аттот (T); CIP 103 019

.Enlfrocwtm phoenicuScola (I); JI, Ii 1

Enrerococcus thattandicus 0 i- FP48-3 -Emerococcus га ttt (T); ЛТСС 700914

Enterococcas hir&e (!>; DSM 20160

Enterococcus durans (Г); DSM20633

Scale

0,01

ШТАММ КГТБ-3

Pedlococcus pentosaceus (T): DSM 20336 (T)

I unknown

- I-Pediococcns daussenii (T); type strain: DSM 148000

1- Pcdiococcus lolU (T); NGRI

I Pediococcns addUacllcf (T): DSM 20284 (T>

---Pedlococcus stllesil (T); type strain LMG 23082-FAIR-E 18

_ Pcdiococcus argenlinicus (T)

-Pcdiococcus ethanolidurahs fit 7.-9

- Pedlococcus parvulus (T): JCM5889

-Pcdiococcus cdlicola (T): Z-8

- Pcdiococcus inopinatus (T); type strain DSM

Scalc I-1

Результаты секвенирования вариабельных участков 16Б рРНК позволили отнести штамм КПБ-1 к виду РесИососсиз решозасею (97%), штамм КПБ-2 - к виду Ешегососсиз ИшИапсИсия (97%), штамм КПБ-3 - к виду РесИососсих решозасеиз (99%). Штаммы депонированы во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика под номерами В-10683, В-10684, В-10685 соответственно.

Глава 4. «Разработка бактериальной композиции для производства ферментированного мясного продукта»

Определение способности выделенных штаммов образовывать биогенные амины

Молочнокислые микроорганизмы, используемые для пищевой ферментации, не проявляют токсигенных или патогенных свойств, однако некоторые штаммы могут продуцировать биогенные амины. Изучение декарбоксилазной активности у микроорганизмов, особенно тех, которые используются в пищевой промышленности, является важным и обязательным, так как от этого зависит безопасность и качество ферментированных мясопродуктов.

При определении декарбоксилазной активности микроорганизмов использовали основу бульона для обнаружения декарбоксилаз по Мюллеру, а также аминокислоты: тирозин, лизин, гистидин и орнитин. При наличии декарбоксилазной активности у микроорганизмов среда

0.01

Unknown - исследуемые штаммы

Рис. 4. Филогенетическое дерево штаммов

подщелачивается за счет образования аминов, вызывая изменение окраски индикатора до фиолетовой или красно-фиолетовой.

У исследуемых штаммов декарбоксилаз аминокислот L-орнитина, L-лизина, L-тирозина, L-гистидина обнаружено не было.

Определение факторов вирулентности у штамма Enterococcus thailandicus

Штаммы молочнокислых энтерококков в последнее время все чаще предлагается использовать в качестве пробиотиков для улучшения микробного баланса тонкого кишечника. Неоднозначное отношение к энтерококкам связано с тем, что, будучи частью нормальной микрофлоры, они являются и одним из важнейших возбудителей госпитальных инфекций, и отсутствие факторов патогенности - главный и обязательный критерий при оценке возможности использования бактерий рода Enterococcus в пищевой промышленности, а также в качестве пробиотиков. Во многих случаях патогенность не является видовым признаком микроорганизма. Разработанные на сегодняшний день тесты, в том числе генетические, позволяют выявить степень безопасности энтерококковых штаммов.

Первым этапом было проведение исследований на тестовых питательных средах. Тесты на протеолитическое разжижение желатина и ДНКазу показали отсутствие факторов вирулентности у штамма Enterococcus thailandicus КПБ-2.

Вторым этапом было проведение ПЦР-генотипирования штаммов. Был проведен поиск генов, отвечающих за различные признаки патогенности энтерококков: прикрепление бактерий к поверхности эукариотической клетки (agg, 1553 п.н.); синтез токсина, обеспечивающего гемолиз эритроцитов (gelE, 419 п.н.); sprE (233 п.н.) - синтез сериновой протеиназы, cylA (517 п.н.) - активация цитолизина, esp (933 п.н.) - внеклеточный поверхностный протеин; fsrB (316 п.н.) - феромон, способствующий конъюгативной передаче плазмидной ДНК от штамма к штамму (рис. 5). Для сравнения был взят штамм Enterococcus faecalis 55 (В-8652), у которого ранее в геноме были обнаружены гены вирулентности gelE и agg. Результаты показали отсутствие генов вирулентности в геноме исследуемого микроорганизма Enterococcus thailandicus КПБ-2.

1 2 3 4 5 6 7 8

щр IP я* >■ щ

9 10 11 12 13 14 15 16

щ i " Ш

I ' _ ^

Рис. 5. Электрофорез фрагментов генов:

1 - маркер 100 bp DNA Ladder SMI 143 (Ferinentas), 2-маркер 1 kb DNA Ladder SM 1163 (Fermernlas), 3 - agg (B-8652), 4 - agg (B-10684), 5 - gelE (B-8652), 6 - gelE (B-10684), 7 - cylA (B-8652), 8 - cylA (B-10684), 9 - маркерЮО bp DNA Ladder SMI 143 (Fermentas), 10 - маркер 1 kb DNA Ladder SM 1163 (Fermerntas), 11 - esp (B-8652), 12 - esp (B-10684). 13 - sprE (B-8652), 14 - sprE (B-10684), 15-fsrB (B-8652), 16-fsrB (B-10684)

Как известно из литературных источников, у энтерококков, выделенных от больных, количество выявляемых детерминантов вирулентности существенно выше, чем у штаммов, выделенных из различных объектов внешней среды. Средой обитания исследуемого нами штамма является местная флора Вьетнама, в частности листья банановых деревьев, которые используются при производстве ферментированной колбасы «Нем-Чуа». Для выживания в растительной среде обитания гены патогенности, позволяющие конкурировать с другими штаммами, не нужны.

Определение устойчивости выделенных штаммов к антибиотикам

В последнее время, в связи с глобальным распространением явления антибиотикоустойчивости у микробов, влекущего за собой рост неблагоприятных последствий для человека (снижение эффективности лечения различных широко распространенных заболеваний, повышение тяжести инфекций, вызванных антибиотикорезистентными возбудителями, усиление агрессивных свойств возбудителей и т.д.), в мире стало уделяться повышенное внимание такому важному критерию отбора микроорганизмов для промышленных целей как отсутствие антибиотикоустойчивости, связанной с эффективно распространяющимися путем горизонтального переноса генетическими факторами. Такие генетические факторы могут, в частности, передаваться с высокой частотой от лактобактерий к патогенным микроорганизмам и наоборот.

Возможность горизонтального переноса генов устойчивости к антибиотикам повышается при локализации этих генов в составе плазмид и транспозонов. Следует учитывать, что плазмиды широко распространенны среди всех видов молочнокислых бактерий, и ряд плазмид кодирует важные технологические свойства. Наличие плазмид у стартовых культур и пробиотиков может не представлять опасности, если штаммы не содержат трансмиссивных генов устойчивости к антибиотикам.

У выделенных и идентифицированных микроорганизмов было определено отношение к антибиотикам различных групп диско-диффузионным методом. На основании полученных диаметров зон подавления роста микроорганизмов вокруг дисков с антибиотиками тестируемые штаммы подразделяются на Б — чувствительные, Я — устойчивые, I — умеренно устойчивые. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Чувствительность штаммов к антибиотикам различных групп_

Антибиотики Диаметр зоны подавления роста, мм

Штамм КПБ-1 Штамм КПБ-2 Штамм КПБ-3

Амоксициллин 40 Б 38 5 29 5

Клоксациллин 11 I 13 5 13 5

Эритромицин 18 I 22 I 29 5

Тетрациклин 17 I 36 Э 19 5

Пенициллин 23 I 34 Б 17 Я

Ко-тримоксазол <5 К <10 Я <5 Я

Цефалексин 17 I 23 Э 13 Я

Результаты показали, что все три штамма проявляют устойчивость к антибиотику ко-тримоксазолу, к эритромицину умеренно устойчивы штаммы КПБ-1 и КПБ-2. Устойчивость к антибиотикам штаммов промышленных микроорганизмов сама по себе не является вредным фактором. В некоторых случаях природная устойчивость может быть полезной для стабилизации микрофлоры кишечника при проведении антибиотикотерапии. В то же время, при рекомендации к использованию в пищевой промышленности штаммов молочнокислых микроорганизмов необходимо учитывать опасность переноса генов антибиотикоустойчивости от молочнокислых бактерий к патогенным микроорганизмам.

Определение плазмидного профиля выделенных штаммов

М 1 2 3 М

Рис. 6. Плазмидный профиль исследуемых микроорганизмов

М - маркерlOObp Ladder DNA marker - 100 bp - 3000 bp, 1 - Pediococcus pentosaceus КПБ-1, 2 - Enterococcus thailandicus КПБ-2, 3 - Pediococcus pentosaceus КПБ-3

Для определения плазмидной ДНК был использован набор AxyPrep™ Plasmid Miniprep Kit, Axygen, США. Принцип метода основан на щелочном лизисе бактериальных клеток в присутствии SDS. Фильтрация лизата и селективное связывание плазмидной ДНК происходит в специальных колонках AxyPrep™. На стадии лизиса происходит разрушение белков и липидов клеток бактерий в условиях, позволяющих сохранить плазмидную ДНК интактной. Результаты показали отсутствие плазмид у исследуемых штаммов (рис. 6).

Установлено, что выделенные микроорганизмы не имеют плазмидной ДНК и не способны к распространению генов антибиотикоустойчивости, локализованных на плазмидной ДНК. Это позволит предотвратить опасность переноса генов антибиотикоустойчивости от молочнокислых бактерий к патогенным микроорганизмам.

Изучение адгезивных свойств пробиотического штамма Enterococcus thailandicus с использованием линии клеток СаСо-2

Было исследовано одно из важных свойств пробиотичсских микроорганизмов -адгезивность. В качестве контроля был выбран штамм Enterococcus faecalis 55 (ВКПМ В-8652), в геноме которого обнаружен ген вирулентности agg (прикрепление бактерий к поверхности эукариотической клетки).

Монослой клеток СаСо-2 при увеличении в 330 раз

Модель адгезии Е. thailandicus КПБ-2 на клетках СаСо-2 при увеличении в 3000

Рис. 7. Эпителеподобные клетки СаСо-2 и адгезия на них штамма энтерококка

Для изучения адгезивных свойств штамма Е. thailandicus КПБ-2 использовали линию клеток СаСо-2 (эпителеподобные клетки аденокарценомы ободочной кишки человека) в монослое. Клеточную культуру выращивали на 6-луночном планшете в условиях 5% СО2 до образования монослоя в течение 5-7 суток. Образовавшийся монослой клеток СаСо-2 инокулировали 1 мл бактериальной культуры определенной концентрации. После инокуляции культуры выдерживали в течение 1 ч при 37 "С, затем отмывали физраствором для удаления несвязанных бактериальных клеток. Снятие монослоя со связанными бактериальными клетками осуществлялось растворами Версена 0,02% и трипсина 0,25% в соотношении 3:1. Для подсчета связанных бактериальных клеток использовали метод разведений при выращивании клеток на плотной среде MRS. Адгезивные свойства микроорганизмов определяются по числу бактерий, связывающихся с 1000 клетками СаСо-2: от 1010 до 3000 бактериальных клеток -высокоадгезивный штамм; от 210 до 1000 - среднеадгезивный; от 0 до 200 - низкоадгезивный (заявка № 2012119278 от 12.05.2012 на выдачу патента РФ «Метод определения адгезивных свойств бактерий с помощью клеточной линии СаСо-2», положительное решение, май 2013). Результаты исследования показали, что с 1000 клетками СаСо-2 связывается 27х103 клеток Е. thailandicus КПБ-2 и 109х103 клеток Е. faecalis 55. Из этого исследует, что Е. thailandicus характеризуется высокоадгезивными свойствами, хотя ниже, чем у штамма Е. faecalis. Адгезивность является одним из важных свойств пробиотических штаммов, поэтому определение адгезивных свойств является важным этапом для исследования пробиотических микроорганизмов.

Исследование антагонизма среди выбранных микроорганизмов

В основном в промышленности применяют многоштаммовые бактериальные препараты, поэтому задача отбора микроорганизмов состоит как в выборе оптимальных по функциональным свойствам для конкретного продукта штаммов, так и штаммов, обладающих взаимной совместимостью.

Использование стартовых культур для преобразования структуры сырья и формирования специфического аромата является основным аспектом производства ферментированных мясных продуктов. Производство таких продуктов представляет собой сложный и длительный процесс. Знание протекающих во время созревания микробиологических, биохимических, физических и ферментативных процессов позволяет разработать научно обоснованные критерии для управления технологическим процессом и получения высококачественных колбас. Одним из важных факторов является верный выбор стартовых культур, который позволит достичь желаемых и запланированных результатов, таких как быстрое и контролируемое снижение уровня рН и управление кислотным профилем продукта; безопасное образование и стабилизация характерного красного цвета с помощью нитритредуктазы; улучшение структуры готового продукта; защита липидов от окисления за счет каталазы, пероксидазы, супероксиддисмутазы; формирование вкуса и аромата за счет определенных метаболитов стартовых культур; микробиологическая безопасность продукта при хранении.

По своим функционально-технологическим свойствам были выбраны пробиотический штамм Enterococcus thailandicus КПБ-2 и штамм Pediococcus pentosaceus КПБ-3.

В дополнении к этим штаммам для составления бактериальной композиции, удовлетворяющей требованиям технологического процесса, были добавлены штаммы из коллекции ФГБОУ ВПО МГУПП:

В качестве денитрифицирующего микроорганизма был предложен штамм Staphylococcus camosus 108 (В-8953), который характеризуется следующими свойствами: растет при концентрации 2-12 % NaCl; образует каталазу; способен синтезировать бакгериоцины, подавляющие рост Salmonella typhymurium LT2 (киллерная активность 38%), Proteus vulgaris АТСС 13315 (26%); проявляет аминоксидазную активность в отношении гистамина, кадаверина, путресцина;

Также был взят ароматобразующий штамм с активным ферментом глутаматдегидрогеназой Lactobacillus curvatus LCR-2 (В-8906), который обладает следующим набором промышленно-ценных свойств: растет при 2-8 % NaCl; синтезирует бактериоцины,

подавляющие рост Salmonella typhymurium LT2 (киллерная активность 21%), Proteus vulgaris АТСС 13315 (7%), Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P (9%); проявляет аминоксидазную активность в отношении гистамина, кадаверина; обладает высокой способность связывать ионы металлов переходной валентности Fe2+ (292,08 мкг/мг белка), Си2"1" (96,6 нмоль/мг белка) и активным ферментом супероксиддисмутазой (8,42 ед/мг) для защиты от разрушающего воздействия радикалов кислорода, что способствует замедлению окислительной порчи мясных продуктов.

Таким образом, была предложена бактериальная композиция, состоящая из следующих микроорганизмов: Enterococcus thailandicus КПБ-2, Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Staphylococcus camosus 108 и Lactobacillus cun'atus LCR-2.

Характер взаимоотношений микроорганизмов в такой комбинации зависит, в первую очередь, от таксономической принадлежности бактерий, условий их культивирования и адаптации к ним, от роста и размножения микроорганизмов, а также способности продуцировать различные метаболиты, в том числе бактериоцины. В связи с этим была изучена способность к совместному росту и размножению предложенных штаммов.

Для микроорганизмов, входящих в бактериальную композицию, необходимо учитывать способность культур сосуществовать между собой, не подавляя рост друг друга. Для изучения отсутствия антагонизма между этими штаммами использовался метод перпендикулярных штрихов (рис. 8).

Рис. 8. Совместный рост штаммов стартовых культур

Enterococcus thailandicus КПБ-2, Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Staphylococcus camosus 108 и Lactobacillus cun'atus LCR-2

По активному и равномерному росту, отсутствию зон задержки роста микроорганизмов в области их соприкосновения, установлена возможность совместного использования этих штаммов в бактериальной композиции.

На основе данной композиции был разработан бактериальный препарат «Немчуа-Н» для производства ферментированных мясных продуктов и проект технической документации на него, ТУ 9229-048-0206840-13.

Применение ДНК-фипгерпринта для паспортизации промышленно-ценных микроорганизмов

ДНК-фингерпринт или геномная дактилоскопия - метод генных отпечатков, который используется для идентификации штаммов на разных таксономических уровнях (до рода, вида

или штамма). Уровень идентификации зависит от выбора праймеров: родо-, видо- или штаммоспецифичных. Идентификация на уровне штамма (паспортизация) позволяет точно говорить, что данный штамм, используемый в промышленности, идентичен той культуре, которая была депонирована или же запатентована, разрешена к использованию в пищевой промышленности и будет проявлять нужные в технологическом процессе свойства. ДНК-фингерпринт позволяет обезопасить производство и оградить автора данной культуры от незаконного ее использования. Идентификацию на уровне штамма (генетическое типирование) проводили методом ПЦР с анализом полиморфизма случайно амплифицированных последовательностей ДНК (рис. 9).

В работе были использованы ЯАРО-праймеры случайно амплифицируемых последовательностей: праймер М13 (gag-ggt-ggc-ggt-tct); праймер 1254 (ccg-cag-cca-a). Реакция ПЦР проводилась на многоканальном ДНК амплификаторе «ТЕРЦИК» АО «ДНК-Технология» при следующих условиях: начальная денатурация (1 цикл) при 95 °С, 3 мин, 39 циклов (95 "С, 30 с; 45 "С, 30 с; 72 °С, 2 мин), конечная стадия при 72 "С, 5 мин.

250 пн

М 1 2 3 4 5 6 7 8 М М123 4 5678 М

\ .

Праймер М13 Праймер 1254

Рис. 9. RAPD-ПЦР-фингерпринт исследуемых штаммов

М - маркер lkb DNA GeneRuler (10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н., снизу вверх); 1 - типовой штамм Staphylococcus camosus 361 DSM 20501, АТСС 51365, ВКПМ В-8726; 2 - исследуемый штамм Staphylococcus camosus 108 ВКПМ В-8953; 3 - типовой штамм Enterococcus durans DSM 20633, АТСС 19432, ВКПМ В-9397; 4 -исследуемый штамм Enterococcus thailandicus КПБ-2 ВКПМ В-10684; 5 - исследуемый штамм Pediococcus pentosaceus КПБ-3 ВКПМ В-10685; 6 - типовой штамм Pediococcus pentosaceus N-32 АТСС 8081, ВКПМ В-7538; 7 - типовой штамм Lactobacillus curvatus АТСС 25601, ВКПМ В-9639; 8 — исследуемый штамм Lactobacillus curvatus 2 ВКПМ В-8906

ПЦР-фингерпринт с использованием праймера М13 позволил выявить следующие особенности, характерные для исследуемых штаммов:

- Staphylococcus camosus 108, образование мажорного фрагмента ДНК размером 1000 п.н. и фрагментов ДНК средней интенсивности размером 350, 450, 550, 700 и 1300 п.н.

- Enterococcus thailandicus КПБ-2, образование мажорных фрагментов ДНК размером 500 и 2000 п.н., минорных фрагментов ДНК размером 400, 1700 и 2200 п.н.

- Pediococcus pentosaceus КПБ-3, образование мажорных фрагментов ДНК размером 400, 450, 700 и 900 п.н., фрагменты ДНК средней интенсивности размером 550 и 1100 п.н.

- Lactobacillus curvatus 2, образование мажорных фрагментов ДНК размером 300 и 750 п.н., минорный фрагмент размером 900 п.н.

ПЦР-фингерпринт с использованием праймера 1254 позволил выявить следующие особенности, характерные для исследуемых штаммов:

- Staphylococcus camosus 108, образование фрагментов ДНК средней интенсивности размером 200, 300, 500, 750 и 1100 п.н.

- Enterococcus thailandicus КПБ-2, образование мажорных фрагментов ДНК размером 700, 900 и 1300 п.н.; фрагментов ДНК средней интенсивности размером 150 п.н.; минорного фрагмента ДНК размером 550 п.н.

- Pediococcus pentosaceus КПБ-3, образование мажорных фрагментов ДНК размером 600 и 1100 п.н.; фрагментов ДНК средней интенсивности размером 770 и 1200 п.н.; минорного фрагмента ДНК размером 1300 п.н.

- Lactobacillus curvatus 2, образование фрагментов ДНК средней интенсивности размером 200 и 350 п.н.; образование слабо выраженных фрагментов ДНК размером 300, 500, 600 и 750 п.н.

Результаты ПЦР-фингерпринта могут быть использованы как молекулярно-биологическая характеристика для исследуемых штаммов.

Глава 5. Апробация разработанной бактериальной композиции при производстве национального ферментированного мясного продукта Вьетнама

В условиях Технологической станции кафедры «Технология мяса и мясных продуктов» ФГБОУ ВПО МГУПП были выработаны опытные образцы № 1 (без бактериальной композиции) и № 2 (с использованием бактериальной композиции) (рис. 10); образец № 3 -аналоговый продукт, представляет собой национальный ферментированный продукт «Нем-Чуа», выработанный во Вьетнаме (продукт ферментировался в течение 72 ч).

Проанализирована способность выбранных стартовых культур влиять на органолептические, физико-химические, структурно-механические характеристики и микробиологические показатели готового продукта.

При исследовании утилизации микроорганизмами углеводов установлено, что в результате своей жизнедеятельности они образуют большое количество кислоты в среде с содержанием глюкозы, фруктозы, сахарозы и мальтозы, значение рН при этом снижается до 3,7-4,5 единиц. В среде с лактозой, медом и тростниковым сахаром молочной кислоты образуется меньше (рН 4,0-5,9). В диапазоне 4,0-5,9 продукты не имеют выраженного кислого вкуса, а характеризуются специфическим кисловатым привкусом с ароматом молочной кислоты. Кроме этого, мед и тростниковый сахар придают продуктам дополнительный колоритный вкус и аромат. В связи с этим в качестве рецептурных ингредиентов рекомендуется использовать мед и тростниковый сахар.

Рецептура мясного продукта представлена в табл. 3. Бактериальную композицию вносили в количестве 10* КОЕ/г на конечной стадии фаршесоставления при перемешивании фарша в мешалке после внесения всех остальных ингредиентов, соли и специй.

Таблица 3

Рецептура национального ферментированного мясного продукта_

Ингредиенты Содержание, %

Свинина нежирная 70

Свиная шкурка (вареная, обезжиренная) 15

Тростниковый сахар 5

Мед 5

Чеснок свежий 1,5

Черный перец (горошек и молотый) 1

№С1 2,15

Соль нитритная (нитрит натрия) 0,15

Натрия глутамат 0,195

Бактериальная композиция 0,005

Оболочка Банановые листья, 0,25 кг/кг сырья

Рис. 10. Технологическая схема производства национального ферментированного мясного продукта с бактериальной композицией

При исследовании органолептических характеристик по 5-тибальной системе оценивали внешний вид, вкус, цвет, аромат и консистенцию готовых мясных продуктов (рис. 11).

консистенция 5„

общая оценка

-Образец №1 -Образец №2 -Образец №3

цвет

запахи вкус

Рис. 11. Органолептическая оценка образцов мясного продукта

Установлено, что все три образца имеют вид брусочков размером 10x5 см; банановые листья имеют желто-зеленый цвет, у образца № 1 - влажные, плесневелые; внутри имеют слизистую поверхность; у образца № 2 и аналогового продукта банановые листья не имеют плесневого налета, внутри чистая поверхность, нет вязкой слизи.

У всех трех образцов на разрезе шкурка распределена равномерно, у первого образца консистенция мягкая, у второго образца и аналогового продукта консистенция плотная.

У первого образца неприятный вкус и запах, цвет бледно-розовый. У второго образца специфический аромат с нотой чеснока и черного перца, вкус кисловатый, молочнокислый, насыщенный розовый цвет. У аналогового продукта резко выраженный кислый вкус и запах, специфический аромат с нотой чеснока и черного перца, розовый цвет.

В табл. 4 представлены физико-химические показатели мясного продукта.

Таблица 4

Физико-химические показатели готового продукта

Исследуемые показатели Образец № 1 Образец № 2 Образец JV» 3

влаги 60,6+0,35 58,3+0,35 64,6+0,35

белка 25,4±0,1 28,1±0,1 21,7±0,1

* о жира 7,7+0,09 7,9+0,09 5,70+09

в? я углеводов 4,2+0,05 2,5+0,05 5,3+0,02

со о о золы, 2,09+0,02 3,2+0,02 2,7±0,01

га s в т.ч. хлористого натрия 1,9+0,01 1,8+0,01 1,7+0,01

нитрита натрия 0,0046+0,0001 0,001+0,0001 0,0017±0,0001

Активность воды, а„ 0,957±0,02 0,943+0,07 0,951+0,03

рн 5,01+0,05 4,51±0,05 3,45±0,04

Полученные результаты показывают, что химический состав образцов готового продукта по показателям белка и жира близок между собой. Количество влаги в процессе ферментации в образце № 2 меньше (58,3%) по сравнению с образцом № 1 (60,6%) благодаря снижению рН в результате жизнедеятельности стартовых культур.

Установлено, что за счет введения в рецептуру штамма Staphylococcus camosus 108, обладающего денитрифицирующей активностью, в образце № 2 существенно снижается массовая доля остаточного нитрита натрия по сравнению с образцом № 1 с 0,0046% до 0,001%. Таким образом, применение бактериальной композиции, содержащей денитрифицирующий штамм Staphylococcus camosus 108, позволяет снизить уровень нитрита натрия, при этом качество продукта не ухудшается в сравнении с образцами № 1 и 3, полученными без

стартовых культур. Кроме того, за счет полного восстановления нитрита натрия исключается его поступление в организм человека, что придает продукту дополнительную безопасность.

По результатам исследования активности воды готового продукта установлено, что образец № 1 имеет более высокое значение активность воды а„ - 0,957 по сравнению с образцом № 2 и образцом № 3 - 0,943, 0,951, соответственно. При значениях активности воды > 0,95 возможен рост и размножение как патогенных микроорганизмов родов Pseudomonas, Escherichia, Proteus, Shigella, Klebsiella, Bacillus, Salmonella, Clostridium perfingens и некоторых видов дрожжей, так и молочнокислых микроорганизмов. Однако патогенные микроорганизмы и микроорганизмы санитарно-показательной группы не обнаружены в готовом продукте. Это можно объяснить низкими значениями рН опытных образцов готового продукта. Самое низкое значение рН у образца № 3 (аналоговый продукт), обусловленное активностью спонтанной микрофлоры, поэтому данный образец по органолептическим показателям характеризуется ярко выраженным кислым вкусом. Значение рН образца № 2 ниже, чем рН образца № 1, за счет присутствия в продукте молочной кислоты, продуцируемой стартовыми культурами.

Определение микробиологических показателей в готовом продукте включает определение общего количества микроорганизмов, бактерий группы кишечных палочек, бактерий рода Salmonella, рода Proteus, сульфитредуцирующих клостридий, числа молочнокислых бактерий, дрожжей и плесеней в соответствии с СанПиНом 2.3.2.1078-01, индекс 1.1.11.1. Колбасные изделия сыровяленые, сырокопченые.

КМАФАнМ для фарша составило 10' КОЕ/г, образца № 1 - 8х104 КОЕ/г, образца №2-5х108 КОЕ/г, образца № 3 - 2х106 КОЕ/г. Количество молочнокислых бактерий в образце № 1 было 103 КОЕ/г, образце № 2 - 4х107 КОЕ/г, образце № 3 - 105 КОЕ/г, в фарше молочнокислых бактерий обнаружено не было. Были обнаружены кишечные палочки, дрожжи и плесневые грибы в образце № 1. В образцах № 2 и 3 эти микроорганизмы обнаружены не были, что для образца № 2 связано с активностью стартовых культур, для образца № 3 - с низким значением рН. В результате жизнедеятельности молочнокислых бактерий образуется молочная кислота, которая позволяет предотвратить развитие вредной микрофлоры, в том числе кишечных палочек и некоторых видов дрожжей и плесеней.

Полученные результаты позволяют рекомендовать разработанную бактериальную композицию для применения в производстве мясного продукта с контролируемой ферментацией при непосредственном внесении стартовых культур на стадии фаршесоставления для эффективного ингибирования санитарно-показательной микрофлоры, цветообразования и образования специфического вкуса продукта; новые штаммы также можно рекомендовать для получения алиментарных пробиотиков - обогащенных культурами микроорганизмов пищевых продуктов.

Экономическая эффективность предложенной технологии может быть получена за счет снижения объемов возврата из торговой сети мясного продукта в результате улучшения его качественных, в т.ч. органолептических показателей, гарантированной безопасности и стабильности при хранении.

Апробация бактериальной композиции была осуществлена в условиях кафедры Микробиологии факультета Биологии и сельскохозяйственной техники Ханойского педагогического университета 2.

Научно-практические рекомендации для технологии производства вьетнамского ферментированного мясного продукта со стартовыми культурами

- использование бактериальной композиции, содержащей штаммы Enterococcus thailandicus КПБ-2, Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Staphylococcus carnosus 108 и Lactobacillus curvatus LCR-2, позволяет контролировать технологический процесс, длящийся в течение 5 сут, а также способствует формированию насыщенного цвета, плотной структуры, придает специфический вкус, аромат готовому продукту, обеспечивает микробиологическую стабильность продукта;

- в качестве Сахаров рекомендуется использовать мед и тростниковый сахар, которые придают продуктам дополнительный колоритный вкус и аромат;

- технологические параметры: формование батонов в банановых листьях размером 10x5 см; внесение бактериальной композиции в количестве 109 КОЕ/г фарша ферментация 96-120 ч при 30+5 "С.

ВЫВОДЫ

1. В результате T-RFLP-анализа установлено, что микрофлора национального вьетнамского мясного продукта «Нем-Чуа» включает лактобакгерии, бифидобактерии, бациллы, непатогенные буркхольдерии Burkholderia tropica. Выделены и идентифицированы новые штаммы Pediococcus pentosaceus КПБ-1, Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Enterococcus thailandicus КПБ-2, которые депонированы в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика под номерами В-10983, В-10985, В-10984 соответственно.

2. Исследования на тестовых питательных средах и проведение ПЦР-генотипирования штаммов показали отсутствие факторов вирулентности у штамма Enterococcus thailandicus КПБ-2. Установлено, что все три штамма проявляют устойчивость к антибиотику ко-тримоксазолу, к эритромицину умеренно устойчивы штаммы КПБ-1 и КПБ-2; показано отсутствие плазмид у исследуемых штаммов.

3. Разработан метод определения адгезивных свойств бактерий на клеточной линии СаСо-2; установлено, что Е. thailandicus КПБ-2 имеет высокоадгезивную способность, которая является одним из важных свойств пробиотических штаммов.

4. Установлено, что по своим технологическим свойствам (активность кислотообразования, устойчивость к высоким концентрациям NaCl, не способность образовывать биогенные амины, антагонистическая активность) штаммы Pediococcus pentosaceus КПБ-1, Pediococcus pentosaceus КПБ-3 и Enterococcus thailandicus КПБ-2 могут быть использованы в мясной промышленности в качестве стартовых культур.

5. По совокупности технологических свойств разработана бактериальная композиция, содержащая штаммы Enterococcus thailandicus КПБ-2, Pediococcus pentosaceus КПБ-3 и микроорганизмы из коллекции ФГБОУ ВПО МГУПП Staphylococcus carnosus 108 и Lactobacillus curvatus LCR-2, с учетом отсутствия антагонизма между штаммами внутри композиции, разработан проект технической документации на бактериальный препарат «Немчуа-Н».

6. Проведена паспортизация промьппленно-ценных штаммов Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Enterococcus thailandicus КПБ-2, Staphylococcus camosus 108 и Lactobacillus curvatus LCR-2 с помощью ДНК-фингерпринта методом ПЦР с обнаружением штаммоспецифических мажорных и минорных фрагментов ДНК.

7. Установлено, что введение бактериальной композиции в рецептуру ферментированного мясного продукта позволяет стабилизировать технологический процесс в течение 5 суток, а также способствует формированию насыщенного цвета, плотной структуры, придает специфический вкус, аромат готовому продукту, обеспечивает микробиологическую стабильность.

8. Сформулированы научно-практические рекомендации для технологии производства вьетнамского ферментированного мясного продукта со стартовыми культурами:

- в качестве Сахаров использовать мед и тростниковый сахар, которые придают продуктам дополнительный колоритный вкус и аромат;

- стартовые культуры: композиция молочнокислых палочек и денитрифицирующих стафилококков в количестве 109 КОЕ/г фарша;

- технологические параметры: формование батонов в банановых листьях; ферментация 96-120 ч при 30+5 °С.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Титов, Е.И. Стартовые культуры, снижающие холестерин, в мясных продуктах / Е.И. Титов, С.В. Колотвина, Н.Г. Машенцева, А.И. Семёнышева, Нгуен Тхи Минь Кхань // Мясная индустрия. - 2012. - № 2. - С. 22-25.

2. Машенцева, Н.Г. Рецептура ливерных колбас с пряными травами с использованием клеточных тест-систем / Н.Г. Машенцева, Нгуен Тхи Минь Кхань, C.B. Колотвина, B.C. Котова // Мясная индустрия. - 2012. - № 9. - С. 40-42.

3. Нгуен, Тхи Минь Кхань / Новая стартовая культура Enterococcus tliailandicus, выделенная из национальной колбасы Вьетнама «Нем-Чуа» // Техника и технология пищевых производств. - 2013 - Ks 1. - С. 21-26.

Материалы конференций:

4. Нгуен, Тхи Минь Кхань Изучение фенотипических свойств молочнокислых микроорганизмов из национальной ферментированной колбасы «Нем-Чуа» (Вьетнам) / Нгуен Тхи Минь Кхань, Н.Г. Машенцева // Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке: мат. V Междунар. научно-технической конф. - Санкт-Петербург. - 2011. - С. 314— 316.

5. Нгуен, Тхи Минь Кхань Выделение нового микроорганизма Enterococcus thailandicus из национальной колбасы Вьетнама / Нгуен Тхи Минь Кхань, И.Н. Трушанова, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: мат. IX Междунар. научной конференции студентов и молодых ученых. - Москва. - 2011. - С.16-17.

6. Нгуен, Тхи Минь Кхань Определение факторов вирулентности нового штамма Enterococcus thailandicus, выделенного из национальной колбасы Вьетнама «Нем-Чуа» / Нгуен Тхи Минь Кхань, Н.Г. Машенцева // Технологии и продукты здорового питания. Функциональные продукты питания: мат. IX Международной научно-практической конференции. - Москва. - 2011. - С. 248-251.

7. Нгуен, Тхи Минь Кхань Изучение адгезивных свойств пробиотического штамма Enterococcus thailandicus с использованием линии клеток СаСо-2 / Нгуен Тхи Минь Кхань, Н.Г. Машенцева // Биотехнология: состояние и перспективы развития: мат. Московского международного конгресса. - Москва. - 2012. - С. 141.

8. Трушанова, И.Н. Определение пробиотических свойств нового микроорганизма Enterococcus thailandicus, выделенного из национальной колбасы Вьетнама / И.Н. Трушанова, Нгуен Тхи Минь Кхань, Н.Г. Машенцева // Биотехнология: состояние и перспективы развития: мат. Московского междунар. конгресса. - Москва.- 2012. - С. 151.

9. Нгуен, Тхи Минь Кхань Рекомендация к производству вьетнамской ферментированной колбасы / Нгуен Тхи Минь Кхань, Н.Г. Машенцева // мат. П-ой междунар. научно-практической конф. молодых ученых, аспирантов и студентов. - Киев.- 2012. - С. 132.

10. Нгуен, Тхи Минь Кхань Выбор бактериальных препаратов для вьетнамской ферментированной национальной колбасы Вьетнама «Нем-Чуа» / Нгуен Тхи Минь Кхань, Н.Г. Машенцева // Наука и технологии: шаг в будущее: мат VIII междунар. научно-практич. конф. - Прага. - 2012. http://www.rusnauka.eom/7 NITS В 2012/Agricole/4 103445. doc.htm

11. Нгуен, Тхи Минь Кхань Исследование безопасности штамма энтерококка - новой стартовой культуры для мясной промышленности / Нгуен Тхи Минь Кхань, Н.Г. Машенцева // Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты: мат. X Международной научно-практической конференции. - Москва. - 2012. - С. 196-198.

12. Ахромова, Е.С. Выбор рецептурных ингредиентов для колбас мажущейся консистенции / Е.С. Ахромова, Нгуен Тхи Минь Кхань, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: мат. Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - Москва. - 2012. - С. 49-51.

13. Нгуен, Тхи Минь Кхань Биотестирование биологических объектов на клеточных линиях животных и человек / Нгуен Тхи Минь Кхань, Н.Г. Машенцева, C.B. Колотвина // Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред: мат. Международной конференции. - Москва. - 2013. - С. 154

14. Нгуен, Тхи Минь Кхань Клеточные технологии при доклинических испытаниях функциональных пищевых ингредиентов / Нгуен Тхи Минь Кхань, Н.Г. Машенцева, C.B. Колотвина, Е.С. Ахромова // Биотехнология: состояние и перспективы развития: мат. Московского международного конгресса. — Москва. — 2013. — С. 145.

Подписано в печать 19.05.2013г.

Усл.п.л. - 1.5 Заказ №14107 Тираж: 100 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нгуен Тхи Минь Кхань, Щёлково

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ

ПРОИЗВОДСТВ»

На правах рукописи

04201358088

НГУЕН ТХИ МИНЬ КХАНЬ

РАЗРАБОТКА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ФЕРМЕНТИРОВАННОГО МЯСНОГО ПРОДУКТА

ВЬЕТНАМА

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.т.н. Машенцева Наталья Геннадьевна

Щелково-2013

Содержание

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................4

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР...................................................6

1.1 Ферментированные мясные продукты.............................................6

1.1.1 Мясные продукты естественной ферментации..................................6

1.1.2 Ферментированные колбасы с мажущейся консистенцией................12

1.1.3 Национальные ферментированы колбасы Вьетнама.........................17

1.2 Стартовые культуры..................................................................19

1.2.1 Все о стартовых культурах........................................................19

1.2.2 Микроорганизмы, используемые в мясной промышленности............21

1.3 Пробиотики....................,.........................................................25

1.3.1 Понятие о пробиотиках............................................................25

1.3.2 Механизм действия пробиотиков................................................26

1.3.3 Требования, предъявляемые к микроорганизмам-пробиотикам.........28

1.4 Род Enteroccocus.......................................................................30

1.4.1 Общая характеристика бактерий рода Enterococcus........................31

1.4.2 Энтерококки в составе препаратов и продуктов - пробиотиков..........33

1.4.3 Изучение патогенных факторов рода Enteroccocus..........................36

Заключение по литературному обзору. Цель и задачи исследований..........40

ГЛАВА 2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.............................................45

2.1.Методика постановки эксперимента. Характеристика объектов

исследования................................................................................45

2.2 Методы исследований................................................................47

ГЛАВА 3 «ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВЫХ ШТАММОВ ИЗ НАЦИОНАЛЬНОЙ ВЬЕТНАМСКОЙ КОЛБАСЫ «НЕМ-ЧУА»...............71

3.1 Изучение состава микрофлоры мясного продукта «Нем-Чуа»...............71

3.2 Идентификация и изучение промышленно-ценных свойств.................74

3.3 Идентификация на основе анализа нуклеотидных последовательностей 16SpPHK....................................................................................79

ГЛАВА 4 РАЗРАБОТКА БАКТЕРИАЛЬНОЙКОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ФЕРМЕНТИРОВАННОГО МЯСНОГО ПРОДУКТА.....82

4.1 Определение способности выделенных штаммов образовывать биогенные амины.........................................................................................82

4.2 Определение факторов вирулентности у штамма Enterococcus thailandicus КПБ2...........................................................................................83

4.3 Определение устойчивости выделенных штаммов к антибиотикам.......85

4.4 Определение плазмидной ДНК у выделенных штаммов.....................88

4.5 Изучение адгезивных свойств пробиотического штамма Enterococcus thailandicus КПБ-2 с использованием линии клеток СаСо-2.....................89

4.6 Выбор микроорганизмов для бактериальной композиции....................91

4.7 Исследование антагонизма среди выбранных микроорганизмов............93

4.8 Применение ДНК-фингерпринта для паспортизации промышленно-

ценных микроорганизмов................................................................94

ГЛАВА 5. АПРОБАЦИЯ РАЗРАБОТАННОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КОМПОЗИЦИИ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ НАЦИОНАЛЬНОГО ФЕРМЕНТИРОВАННОГО МЯСНОГО ПРОДУКТА ВЬЕТНАМА............97

5.1 Изготовление национальной вьетнамской колбасы............................97

5.2 Органолептические показатели готового продукта...........................100

5.3 Химический состав фарша и готового продукта..............................101

5.4 Определение активности воды, ВСС, рН и активность воды готового продукта.....................................................................................102

5.5 Структурно-механические свойства готового продукта.....................103

5.6 Определение микробиологических показателей..............................104

ВЫВОДЫ..................................................................................105

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................108

ПРИЛОЖЕНИЯ...........................................................................116

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время мясная промышленность - крупнейшая отрасль пищевой индустрии, выпускающая широкий ассортимент продукции пищевого, технического и медицинского значения, в том числе благодаря успехам биотехнологии в области мясного производства и применению новых физических и биологических методов, способствующих интенсификации технологических процессов и получению многих видов мясных продуктов [42, 1].

Основными задачами производства мяса и мясных продуктов являются улучшение качественных показателей продукции (пищевая ценность, органолептические показатели); создание новых видов продуктов питания с заданными свойствами; увеличение объемов производства [52].

Один из путей решения такой проблемы связан с биотехнологическим принципом модификации мясного сырья - направленным регулированием хода биотехнологических, физико-химических и микробиологических процессов, в результате которых формируется структура, цвет и вкусо-ароматические характеристики готового продукта. Целенаправленное использование микроорганизмов способствует получению стабильного качества готового продукта. Технологическое действие микроорганизмов связано с образованием специфических биологически активных компонентов: органических кислот, бактериоцинов, ферментов, витаминов и др., что способствует улучшению санитарно-микробиологических, органолептических показателей готового продукта, а также позволяет интенсифицировать производственный процесс [42, 52, 56].

Одним из перспективных направлений следует признать создание и использование для производства мясных изделий биологически активных веществ на основе продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. Установлено, что стартовые культуры, посредством ферментов, изменяют структуру колбас, образуя новые вещества, способствующие улучшению качественных показателей продукта [52, 59].

4

Активность большинства микроорганизмов обусловлена их основными свойствами: высокой приспособляемостью к меняющимся условиям внешней среды, способностью быстро размножаться и широким спектром возможных биохимических реакций [52]. В качестве стартовых культур в основном используются денитрифицирующие кокки, гомоферментативные молочнокислые бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы и нетипичные молочнокислые бактерии в виде чистых или смешанных культур [54].

Сегодня исследования о применении стартовых культур в мясном производстве широко рассматриваются во всем мире. Ферментированные мясные продукты относительно недавно стали относить к пробиотическим продуктам, усиливающим иммунную систему организма человека [32]. Выделение и отбор бактерий, и использование их в качестве стартовых культур начинались во второй половине двадцатого века. В 1940 году Енсен и Падок (1940, США патент 2,225,783) предложили идею добавления живых материалов (молочнокислых бактерий рода Lactobacillus) для ферментации колбас с целью регулирования и ускорения процесса ферментации мяса [87, 91]. В России разработанная во ВНИИМПе им. В.М. Горбатова технология производства сыровяленых колбас из мяса предусматривает использование стартовой закваски ПБ-МП [23, 31]. В готовой колбасе сохраняется достаточно высокий уровень молочнокислой микрофлоры, которая может оказывать положительное влияние на кишечную микрофлору человека, поэтому эти колбасы относят к функциональным продуктам.

Применение стартовых культур в мясном производстве является современной тенденцией для получения новых видов мясных, в том числе национальных, продуктов с высокой пищевой ценностью и специфическими органолептическими показателями.

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Ферментированные мясные продукты

1.1.1 Мясные продукты естественной ферментации

Ферментированные колбасы производятся обычно в виде сухих или

полусухих продуктов, хотя некоторые являются промежуточными. Сухие

колбасы или колбасы итальянского типа содержат 30-40 % влаги, не

коптятся или не проходят тепловую обработку и употребляются без

предварительной готовки [70]. При их производстве соль и специи

добавляются к рубленому мясу с последующим наполнением оболочек и

выдержкой в течение различных промежутков времени при температуре 62-71

°С. Время выдержки короче, когда используются стартовые культуры.

Посолочные смеси включают глюкозу в качестве субстрата для процесса

ферментации и нитраты и/или нитриты как стабилизаторы цвета. Когда

используются только нитраты, необходимо, чтобы колбаса содержала

бактерии, способные восстанавливать нитраты до нитритов, обычно

денитрифицирующие кокки присутствуют в микрофлоре колбасы или

добавляются в смесь (при перемешивании). Далее следует выдержка, во

время которой происходит ферментация, продукты при этом помещаются в

сушилки с относительной влажностью 55-65 % на срок в пределах от 10 до

100 дней, или, в случае с венгерской салями, до 6 месяцев [99]. Генуйская и

миланская салями - другие примеры сухих колбас.

В одном исследовании сухих колбас значение рН, как было

обнаружено, уменьшилось от 5,8 до 4,8 в течение первых 15 дней созревания

и оставалось постоянным после этого [82]. Девять различных марок

промышленно произведенных сухих колбас имели уровни рН в пределах от

4,5 до 5,2 со средним значение 4,87. Относительно изменений, которые

происходят в микрофлоре ферментированной сухой колбасы, когда стартовые

культуры не используются, игЬагиак и Регаскл [69] обнаружили, что в целом

преобладали гомоферментативые микроорганизмы, при этом наиболее часто

6

выделяемым являлся вид Lactobacillus plantarum. Количество гетероферменативных бактерий, таких как L. brevis и L. buchneri, возрастало во время шестидневного инкубационного периода в результате изменений рН и Eh, вызванных гомоферментативными бактериями.

Полусухие колбасы производятся по существу тем же самым способом, как и сухие колбасы, но подвергаются меньшей сушке. Они содержат приблизительно 50% влаги, и конечной стадией их производства является термообработка до температуры внутри батона 60-68 °С во время копчения. Сервелат, летняя колбаса и Лебанонская болонья являются примерами полусухих колбас. «Летняя колбаса» относится к традиционным североевропейским колбасам, производящимся в течение более холодных месяцев, хранящимся, вызревающим и затем потребляемым в течение летних месяцев. Они могут быть сухими или полусухими [28].

Лебанонская болонья является типичной полусухой колбасой. Этот

продукт, первоначально произведенный в Лебаноне, штат Пенсильвания,

является полностью говяжьей, сильно копченой, пряной колбасой, которая

может быть приготовлена с использованием стартовой культуры Pediococcus

cerevisiae [71]. Продукт изготавливается с добавлением приблизительно 3%

NaCl наряду с сахаром, приправами и нитратом/нитритом или и с тем, и

другим к сырой нарубленной кубиками говядине. Соленую говядину

выдерживают при температуре холодильника приблизительно 10 дней, в

течение которых происходит рост молочнокислых бактерий естественного

происхождения или стартовых культур, а грамотрицательные бактерии

погибают. В период копчения при более высоких температурах наблюдается

более высокий уровень микробной активности наряду с некоторым

высыханием. Контролируемый и управляемый процесс производства этого

продукта был изучен [65], и он состоит из созревания посоленной говядины

при 5 °С в течение 10 дней и копчения при 35 °С с относительно высокой

влажностью в течение 4 дней. Ферментация может осуществляться

естественной микрофлорой мяса или при помощи коммерческих стартовых

7

культур P. cerevisiae или P. acidilactici. Уровень кислотности в Лебанонской болоньи может достигать 0.8-1,2 % [74, 80].

В производстве сухих колбас лактобациллы вырабатывают аминопептидазы, которые способствуют распаду белков колбасы до аминокислот. Аминокислоты участвуют в ароматообразовании сухих колбас [73].

Ферментированные колбасы, произведенные без использования стартовых культур, как было обнаружено, содержали большие количества лактобацилл, таких как!, plantarum [94]. Использование стартовой культуры P. cerevisiae приводит к образованию более желательного продукта [76, 81]. При исследовании коммерчески произведенных ферментированных колбас, Smith и Palumbo [61] обнаружили, что суммарное количество аэробных

7 8

колоний было в пределах 10-10 КОЕ/г с преобладанием молочнокислых

бактерий. При использовании стартовых культур конечный уровень рН

продуктов колебался от 4,0 до 4,5, тогда как продукты, произведенные без

добавления стартовых культур, имели рН между 4,6 и 5,0. Для колбас

летнего типа 72-часовой ферментации уровень рН был 4,5-4,7 [88].

Ферментация при 30 °С и 37 °С приводит к более низкому конечному рН,

чем при 22 °С, и что конечный рН непосредственно связан с количеством

выработанной молочной кислоты. Уровень рН ферментированной колбасы

может фактически возрастать на 0,1 или 0,2 единицы в течение длительных

периодов сушки из-за колеблющегося забуферивания, обусловленного

увеличением количества щелочных соединений [60]. Конечный уровень рН,

достигнутый после окончания процесса ферментации, зависит от типа

добавленного сахара. Хотя наиболее широко используется глюкоза, сахароза,

как оказывается, была одинаково эффективным ферментируемым сахаром

для получения низкого рН [64]. Влияние коммерческого замороженного

концентрата стартовой культуры (P. acidilactici) при ферментировании

различных Сахаров, добавленных при производстве колбас, иллюстрировано

на рисунке 1.1. Lactobacillus gasseri, при ее использовании для ферментации

8

мяса, как было показано, предотвратила формирование энтеротоксина, вырабатываемого Staphylococcus aureus в модельных образцах колбас [90]. Этот вид был самым эффективным среди пяти других видов Lactobacillus.

До конца 1950-х годов в производстве ферментированных колбас практиковалась обратная инокуляция (введение в сырье 5-10 % предыдущего батона), или производитель, используя сырье для производства колбас, надеялся на присутствие в нем желательных микроорганизмов. До недавнего времени производство этих, так же, как многих других ферментированных продуктов, было больше искусством, чем наукой. С появлением чистых стартовых культур не только время производства было сокращено, но появилась возможность производить более безопасный продукт с постоянным качеством [85]. Хотя использование стартовых культур практиковалось в действительности много лет в молочной промышленности, их использование во многих немолочных продуктах во всем мире - недавнее нововведение с большими перспективами. «Micrococcus aurantiacus» использовался наряду со стартовыми культурами в производстве некоторых европейских колбас [63]. Дополнение Micrococcus или Staphylococcus, особенно S. carnosus, к молочнокислой культуре является обычной практикой в Европе. Немолочнокислые бактерии восстанавливают нитраты до нитритов и вырабатывают каталазу, которая приносит пользу молочнокислой культуре.

Рисунок 1.1- Скорость снижения рН в ферментированной колбасе,

содержащей 0% или 1% различных углеводов Благородные плесени, как известно, способствуют качеству сухих колбас Европейского типа, таких как итальянская салями. В обширном исследовании мицелиальных грибов созревших мясных продуктов Ayres и др. [62] обнаружили девять видов Pénicillium и семь аспергиллов на ферментированных колбасах и заключили, что организмы играют роль в сохранении продуктов этого типа. Видов других родов плесеней было выделено меньше. Исследование грибной микрофлоры естественно ферментированных колбас в северной Италии показало, что Pénicillium составлял 96% и аспергиллы 4% [66]. Начальная микрофлора колбас была составлена из > 95% дрожжей. После 2 недель количество дрожжей и плесеней было примерно 50 : 50, но после 4—8 недель плесени составляли > 95% биоты [66]. Пятьдесят процентов микрофлоры плесеней было P. nalgiovensis.

Добавление Pénicillium camemberti и P. nalgiovensis во время посола сырья для сухих колбас использовалось, чтобы предотвратить рост плесеней, вырабатывающих микотоксины, и это было более успешно, чем применение сорбата калия [96].

Деревенские соленые окорока - сухо-соленые окорока, произведенные на юге Соединенных Штатов. Во время посола и созревания в период от 6 месяцев до 2 лет на поверхности происходит сильный рост плесеней. Хотя Ayres и др. отметили, что присутствие плесеней случайно (второстепенно), и что удовлетворительный посол не зависит от их наличия, вероятно, некоторые аспекты ароматообразования этих продуктов связаны с сильным ростом подобных микроорганизмов, и в меньшей степени от роста дрожжей. Обильный рост плесеней устраняет действие токсигенных и гнилостных бактерий, и в этом смысле мицелиальная биота способствует сохранению продукта. Ayres и др. обнаружили, что преобладающими типами плесеней, выделенными из деревенских соленых окороков, были аспергиллы �