Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка алгоритма серологической диагностики вирусных гепатитов в условиях стационара

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка алгоритма серологической диагностики вирусных гепатитов в условиях стационара"

РГБ ОД

На правах рукописи

СИМОНОВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ В УСЛОВИЯХ СТАЦИОНАРА.

1 ^

Л- ^

Специальности: -Тч —■—

03.00.07 - "Микробиология" / 4 14.00.36 - "Аллергология и иммунология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

\

МОСКВА 1999

Диссертация выполнена в Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова.

Научные руководители: доктор медицинских наук

Е.В.ВОЛЧКОВА кандидат медицинских наук

А.Я. ОЛЬШАНСКИЙ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Ю.В. НЕСВИЖСКИЙ доктор биологических наук, профессор К.И.САВИЦКАЯ

Ведущее учреждение: НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

000г. в

Защита диссертации состоится на заседании диссертационного совет^Д 074.O5.iO при ММА. им. И.М. Сеченова по адресу: 119381, г.Москва, Б. Пироговская ул., 2-6

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ММА им. И.М. Сеченова, по адресу: г. Москва, Зубовская пл., д.1

Автореферат разослан "¿¿¿_ £ 1999г.

Ученый секретарь диссертационного

совета, к.м.н., доцент Миронов А.Ю.

Введение.

Актуальность проблемы.

В последние годы в структуре вирусных гепатитов существенно возросло значение гепатитов с парентеральным механизмом передачи возбудителей и сочетанных форм ВГ. Этот рост связан с вовлечением в эпидемический процесс лиц молодого возраста, употребляющих наркотические вещества внутривенно (Шахгильдян И.В.,1999; Онищенко Г.Г.1999).

Сходство по клинической картине всех вирусных гепатитов на начальных этапах диагностики делают проблему верификации по этиологическому признаку данного поражения печени чрезвычайно актуальной (Апросина З.Г.,1996; Учайкин В.Ф.,1996; Alter H.J.,1992). На сегодняшний день в решении этой проблемы все большее значение приобретает лабораторная диагностика, т.к. она занимает центральное место в системе подтверждения диагноза вирусного гепатита (Михайлов М.И.,1999; Соринсон С.Н.,1998; Sherlock Sh.,1999).

В большинстве лечебных учреждений и в службе переливания крови г. Москвы лабораторная диагностика вирусных гепатитов осуществляется в соответствии с приказами Министерства Здравоохранения СССР №408 "О мерах по снижению заболеваемости вирусными гепатитами в стране" от 12.07.89, Департамента Здравоохранения и Центра Госсанэпиднадзора г. Москвы №493/96 "О совершенствовании системы эпиднадзора за вирусными гепатитами В и С" от 29.09.94 и ограничивается определением HBsAg и anti-HCVIgG. Этого явно недостаточно для подтверждения вирусной этиологии поражения печени, учитывая разнообразие существующих гепатотропных вирусов.

К настоящему моменту идентифицировано 8 различных гепатотропных вирусов: из них общепризнанными являются HAV, HBV, HCV, HDV, HEV (Михайлов М.И.,1998; Соринсон С.Н.,1998; Львов Д.К.,1997; Alter H.J.,1995; Sherlock Sh.,1999); роль HFV, HGV, TTV в развитии заболевания печени изучается (Балаян М.С.,1995; Михайлов М.И.,1997; Кузин С.Н.,1999; Мохонов В.В.,1999; Соринсон С.Н.,1997; Bonacini М.,1998; Charlton М.,1998; Hohne М.,1998; Naomov N.V.,1998; Okamoto Н.,1998; Simmonds P.,1998; Tanaka H.,1998).

У описанных вирусов существует значительное количество специфических маркеров, выявление которых имеет разное диагностическое значение в

зависимости от периода заболевания (Bocsan I S.,1995; Buffet С.,1995; Long G.S., 1996).

Для определения специфических маркеров вирусных гепатитов разработано множество тест-систем, выпускаемых различными отечественными и зарубежными фирмами.

Большинство исследователей считают, что для достоверной диагностики различных форм вирусных гепатитов и установления фазы инфекционного процесса крайне важно определение всего известного спектра маркеров (Михайлов М.И.,1999; Широнина Н.Л.,1999; Ющук Н.Д.,1992; Alexander M.,1998; Bocsan I.S.,1995; Buffet С.,1995; Long G.S., 1996).

Однако, реализация этой задачи в условиях стационара занимает много времени и требует значительных материально-технических затрат, что явилось решающим фактором для оптимизации схемы диагностики вирусных гепатитов, т.е. выбора наиболее информативного комплекса маркеров для подтверждения диагноза и определения характера течения заболевания на каждом этапе диагностики.

Цель работы - разработать алгоритм серологической диагностики острых вирусных гепатитов в условиях стационара, следуя которому можно оптимизировать подтверждение вирусной этиологии гепатитов при минимальных расходах диагностических средств за короткий промежуток времени с момента поступления больного в стационар.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Осуществить первичный скрининг сывороток крови больных, поступающих в стационар с подозрением на вирусный гепатит и выбрать оптимальный комплекс серологических маркеров для проведения исследований крови на первом этапе диагностики.

2. Проанализировать группу больных, поступивших в стационар с подозрением на гепатит, у которых отсутствуют маркеры первичного скрининга.

3. Определить основные показания для проведения последующих этапов диагностики.

4. Предложить оптимальный алгоритм серологической диагностики вирусных гепатитов в стационаре.

5. Изучить особенности выявления антител к антигенам HCV и HDV.

Научная новизна работы.

Впервые предложен оптимальный алгоритм серологической диагностики острых вирусных гепатитов в условиях стационара с учетом новых диагностических возможностей, ранее не описанный в литературе.

Впервые на основе комплексного использования различных методов идентификации маркеров вирусных гепатитов установлен характер соответствия серологических маркеров репликации вирусов в различные периоды заболевания и определено их диагностическое значение.

Показано, что выявление антител к антигенам вируса гепатита О не совпадает с циклом репликации вируса.

Впервые описана дискретность выявления антител классов и ¡ёСт к антигенам вируса гепатита С на ранних этапах развили инфекционного процесса и показано, что диагностика ВГС в некоторых случаях требует серологического мониторинга в течении нескольких месяцев с учетом индивидуальных особенностей течения заболевания.

Впервые оценена диагностическая роль агЦ|-НСУ1£>М в серодиагностике острой НСУ-инфекции. Показано, что выявление апи-НСУ^М характеризует фазу активной репликации вируса гепатита С и позволяет увеличить показатель подтверждения вирусной этиологии гепатитов на 18,6% среди серонегативных проб первого этапа диагностики.

Практическая значимость.

В результате проведенных исследований разработан оптимальный алгоритм серологической диагностики острых вирусных гепатитов в условиях стационара, который позволяет максимально быстро получать достоверное подтверждение вирусной этиологии поражения печени при минимальных расходах диагностических наборов.

Экономический эффект разработанного алгоритма', предложенный алгоритм позволил сократить количество проводимых исследований одной сыворотки почти в 2 раза с 7,9±1,2 (1996г.) до 4,1±0,7 (1998г.), при этом показатель подтверждения диагноза практически не изменился 86,7±2,7 (1996г.) и 89,4±1,1 (1998г.) ( при р<0,05), а также снизить стоимость исследований одной сыворотки с учетом количества проведенных исследований - при использовании отечественных тест-систем с 41,1руб.(199бг.) до 21,3руб.(1998г.), при использовании импортных тест-систем с 37,9$(199бг.) до 19,7$(1998г.).

В настоящее время диагностика вирусных гепатитов в Инфекционной Клинической больнице №2 (ИКБ№2) проводится в соответствии с предложенным алгоритмом, который включен во внутрибольничные приказы №6 от 17.01.97 "Об иммунологической диагностике вирусных гепатитов" и К» 96 от 08. 12.98 "О дальнейшем совершенствовании иммунологической диагностики вирусных гепатитов" и полностью соответствует интересам клиники и лаборатории, хота во многих лечебных учреждениях и по настоящий момент ограничиваются определением НВб^ и апй-НСУ^О для подтверждения вирусной этиологии гепатитов.

Апробация и реализация работы:

Результаты работы докладывались на 5-й Международной конференции "СПИД, РАК и Родственные проблемы" (СПб, 25-30 мая 1997г.), на 6-й Международной конференции "СПИД РАК и Родственные проблемы" (СПб, 18-22 мая,1998г.), на Ш съезде ИТАЛО-РОССИЙСКОГО общества по инфекционным болезням, научной конференции "Инфекционные болезни: новое в диагностике и терапии" (СПб, 3-7 июня, 1998г.), на 5-м Российском съезде врачей-инфекционистов (Москва, 15-17 дек., 1998г.), на Ш Российской научно-практической конференции с международным участием "Гепатит В,С и Б -проблемы диагностики, лечения и профилактики"(Москва, 22-24 июня, 1999г.), на научно-практических конференциях в ИКБ№2 (1997, 1998г.г.)

Апробация диссертации состоялась 15 октября 1999г. на совместном заседании кафедры микробиологии и иммунологии и кафедры инфекционных бо-

*

лезней ММА им. И.М.Сеченова, а также Московского Городского Центра профилактики и борьбы со СПИД на базе ИКБ №2.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ и одна принята в печать.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), материалов и методов исследования, результатов собственных исследований (4главы), обсуждений полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Общий объем работы -172 страницы машинописного текста, включающего 17 таблиц и 19 рисунков. Список литературы включает 257 источников (90-отечественных и 167-зарубежных).

Материалы и методы исследования.

В исследование включили кровь от 1163 больных (904-мужчин, 259-женщин), которые поступили в стационар в острой стадии заболевания с подозрением на гепатит - и каждый раз клиницистам приходилось решать непростую задачу - подтвердить или исключить вирусное поражение печени. Среди больных преобладали лица молодого возраста 14-30 лет - 712 из 1163 больных (61,2%), причем 605 из 712 больных (85%) использовали в/в введение наркотических средств (в основном героин).

По степени тяжести заболевания в соответствии с инструкцией к приказу Министерства Здравоохранения СССР №408 от 12.07.89, больные распределились следующим образом: 28 - легкое течение; 1007 - среднетяжелое; 128 - тяжелое течение заболевания.

Для решения поставленных задач определяли серологические маркеры в сыворотке крови методом ИФА (HBsAg, anti-HBcorlgM, anti-HBcorlgG, HBeAg, anti-HBe, anti-HBs, anti-HCVIgM, anti-HCVlgG, anti-HAVIgM, anti-HDVIgM, anti-HDVIgG); вирусологические маркеры в плазме крови методом ПЦР (HAVPHK, НВУДНК, HCVPHK, HDVPHK, HGVPHK), а также оценивали изменения биохимических показателей крови (общий белок, ACT, AJIT, ЩФ, билирубин, тимоловая проба).

При проведении ИФА осуществляли тщательный отбор современных диагностических тест-систем, учитывая основные показатели качества, предъявляемые к наборам (чувствительность, специфичность, воспроизводимость). Для этих целей был создан банк сывороток от больных с различными формами вирусных гепатитов, охарактеризованных в нескольких тест-системах. Спектр выбранных на основании комплексных исследований тест-систем для определения серологических маркеров вирусных гепатитов представлен в таблице 1.

Таблица 1. Используемые диагностические тест-системы.

Маркер 1 Название тест-системы | Производитель

Вирусный гепатит А

anti -HAV IgM Вектогеп A- lgM - cipim Вектогеп A- IgM - ускоренный ЗАО "Вехгор-Бест" ГНЦВБ "Веггоп"

Вирусный апатит В

HBlAg Вектогеп В - HBs антиген - сгрип, Аквагеп -В-Аг-2 Monolisa Ag HBs ЗАО "Вектор-Бест" ТОО НПП "Аквапаст" Sanofi Diagnostics Pasteur

подтверждение Веюогеп В - HBs антиген - подтверждающий тест - стрип Гепатаг - В - N3 Monolisa HBsAg confirmation ЗАО "Вектор-Бест" ТОО НПП "Аквапаст* Sanofi Diagnostics Pasteur

anti - HBcorlgM ИФА- ант»- НВс-М Monolisa anti-HBcIgM НПО"Диагностические системы" Sanofi Diagnostics Pasteur

anli- HBcorlaG BerroHBcAg-аятитгла-стрнп Monolisa anti-HBc ЗАО "Вектор-Бест" Sanofi Diagnostics Pasteur

HBeAg Monolisa HBe/anti-HBe Sanofi Diagnostics Pasteur

anti - HBe Monolisa HBe/anti-HBe Sanofi Diagnostics Pasteur

anti-HBs BerroHBsAg- антитела-стрнп ЗАО "Вектор-Бест"

Вирусный гепатит С

anti -UCVIbM РекоибиБесг анш-BrCIgM - сгрип ИФА-акта-HCVcIgM ЗАО "Вектор-Бест" НПО'Диапюстические системы"

anti -HCVIgG РскомбиБест анти-ВГС - сгрип ИФА-анш-HCV Гешетркп С ЗАО "Вектор-Бест" НПО" Диагностические системы" "Няармедик • плюс"

подтверждение РекомбиБест - анти-ВГС подтверждающий тест Deciscan HCV Plus ЗАО "Вектор-Бест" Sanofi Diagnostics Pasteur

Вирусный гепатит D

anti -HDV IEM Вектогеп Д - lgM - стрип ИФА-аити- HDVIgM ЗАО "Вектор-Бест" НПО"Диагностические системы"

anti- HDV IeG Вектогеп Д - антитела - стрип ИФА - анти - HDV ЗАО "Вектор-Бест" НПО"Диагностические системы"

Для оценки относительного содержания апи-НСУ1(£М и шгё-НСУ^С в сыворотке крови больных после проведения ИФА дополнительно определяли следующие коэффициенты:

ОП1 / ОПкрит.1; Я2 - ОП2 /ОП крит.2, где ОП1,ОП2 - оптическая плотность сыворотки в тест -системах для выявления ат!-НСУ1$М и алО-НСУ^в соответственно.

ОПкрит1, ОПкрит2 - критический уровень выявления ал1ьНСУ1£>М и апй-HCVIgG соответственно - рассчитывали согласно инструкциям, прилагаемым к тест - системам.

при R1,R2>1 сыворотку расценивали как положительную, т.е. в сыворотке содержался определяемый маркер.

Дополнительно для полуколнчественной оценки соотношения anti-HCVIgM и anti-HCVIgG в определенные периоды заболевания определяли коэффициент К = R2/R1, предложенный Афанасьевым А.Ю, 1996г.

Помимо метода ИФА для выявления антител класса IgG к антигенам HCV использовали метод рекомбинантного иммуноблотинга (RIBA HCV 2.0 SIA), заложенный в основу тест-системы "Desiscan HCV Р1и5"(таблица1). Данный метод позволял охарактеризовать антитела, направленные против различных участков генома вируса гепатита С (Рис. 1)

2

1 - 2 CI С2 NS3 NS4 Пластиковая

подложка

РИС. 1 Расположение контролей и антигенов на стрипе для проведения

иммуноблота.

1 - Античеловеческий IgG контроль обеспечивает:

• контроль внесения образца;

• контроль реагентов ( коньюгата и субстрата);

• считывание результатов, с учетом интенсивности

контрольного сигнала.

2- Контроль на GST.

В процессе синтеза рекомбинантных белков, гены кодирующие белки NS3 и NS4 встраивают в ген, кодирующий глугатионтрансферазу S (GST).

Контроль на GST выявляет присутствие анти - GST антител в образце, которые могут привести к ложноположительной реакции.

Процедура проведения иммуноблота соответствует стандартной методике непрямого твердофазного ИФА (Егоров А.М.,1991; Нго Г.Г.,1988; Фримель Г.,1987).

Проводили статистическую обработку полученных результатов, при этом определяли среднюю ошибку полученных показателей и доверительные интервалы (Федорова С.Ф., 1977г.), результаты считали достоверными, при р<0,05.

Результаты собственных исследований и обсуждение.

Наиболее сложной на наш взгляд задачей являлся выбор минимального комплекса серологических маркеров на начальном этапе диагностики. При решении этой задачи мы руководствовались следующими соображениями:

• вирусный гепатит А, вирусный гепатит В и вирусный гепатит С наиболее широко распространены среди населения России по сравнению с другими формами вирусных гепатитов (Шахгильдян И.В.,1999; Онищенко Г.Г.,1999; Коршунова Г.С.,1999), поэтому в первичный скрининг необходимо было включить определение маркеров ВГА, ВГВ и ВГС;

• в доступной литературе встречались противоречивые сообщения о том, какие маркеры необходимо определять при первичном исследовании сывороток крови больных в стационарах (Блюм Г.,1997, Исаева О.В.,1999; Никифоров Н.Д.,1996; Тео К.Г.,1993; Ющук Н.Д.,1992; Pawlotsky J.-M..1998), в то же время некоторые авторы, в частности Учайкин В.Ф. с соавт., 1996г. предложили определять anti-HAVIgM, HBsAg, алй-НВсот(суммарные), anti-HCVIgG на первом этапе диагностики, но подобный подход не являлся общепринятым и сами авторы отмечали необходимость исследований в этом направлении.

• Одновременно увеличивается число сообщений о том, что среди лиц, практикующих внутривенное введение наркотиков преобладают так называемые "HBsAg -отрицательные" формы вирусного гепатита В, а подтверждением диагноза в таких случаях является выявление anti-HBcorlgM (Герман K.M.,1999; Довгалюк Т.И.,1999; Жданов К.Б.,1996; Чешик С.Г.,1996; Carreda F., 1989; Gaeta G.B.,1995; Gedieh W.H.,1986, Gethe S.,1998), поэтому мы сочли целесообразным включить определение anti-HBcorlgM наряду с HBsAg в первичный скрининг сывороток крови.

Все перечисленные обстоятельства позволили на первом этапе диагностики (первичный скрининг) ограничиться определением: anti-HAVIgM, HBsAg, anti-HBcorlgM, anti-HCVIgG.

В результате проведения первичного скрининга (таблица 2) серологические маркеры ВГА выявили у 96 больных - 8,3% ; маркеры ВГВ у 376 больных - 32,3%; маркеры ВГС у 193 больных - 16,6% . Доля так называемых смешанных форм вирусных гепатитов составила - 26,6% из них: серологические маркеры ВГВ+ВГС выявили у 24S больных - 21,1% ; маркеры ВГВ+ВГА

у 18 больных - 1,5% ; маркеры ВГС+ВГА у 34 больных - 2,9% и маркеры ВГВ+ВГС+ВГА у 13 больных). -1,1%.

Таблице 2. Профили серологических маркеров вирусных гепатитов после проведения первичного скрининга.

{Ьгтерпретаиня результатов а ч м * & с Первнчиый скршпшг: маркеры

HB.Af anti-HBcorlgM «nli-HCVIgC «nti-HAVIgM Количество больных %

Вирусный гепатит А 1 - 96 8,3

Вирусный гепатит В 2 + + - 319 32J

3 + • 30

4 + - 27

Вирусный гепатит С 5 - + 193 16,6

Микст - иифехцна В+С 6 + + + 184 jia

7 + - + 30

8 + + 31

Микст - иифекиия В+А » +■ + - + S 1Л

10 + - ■ + 2

II + + II

Микст- инфекция С+А 12 - + + 34 2,9

Микст - инфекция В+С+А 13 +■ + + + 2 1.1

14 + - + + 4

15 + + + 7

Отсутствие маркеров первичного скрининга К • - - - 188 16,2

Итого: 116] 100

Достоверных отличий биохимических показателей крови у больных с выявленными маркерами различных форм вирусных гепатитов не обнаружили.

После проведения первичного скрининга подтвердили вирусную этиологию поражения печени у 975 из всех обследованных больных, при этом показатель подтверждения диагноза составил 83,8%±2,2% (при р<0,05), но мы не смогли ограничить диагностику вирусных гепатитов проведением первого этапа, т.к. определенная часть больных нуждалась в дальнейших исследованиях по клиническим показаниям, в связи с чем возникли дополнительные задачи:

1) оценить фазу развития инфекционного процесса у больных с выявленными маркерами микст-инфекций после первичного скрининга;

2) исключить или подтвердить присоединение инфекций, вызываемых другими гепатотропными вирусами, серологические маркеры которых не определяли на первом этапе диагностики, в частности провести диагностику В ГО.

В то же время осталась группа из 188 больных, серонегативных по результатам первичного скрининга, она составила значительный процент - 16,2% из всех обследованных больных, поэтому появилась дополнительная задача:

определить действительно ли у больных отсутствует вирусное поражение печени или выбранного нами комплекса маркеров для проведения первого этапа недостаточно, чтобы полностью расшифровать вирусную этнологию заболевания.

Таким образом, после проведения первичного скрининга для решения всего комплекса дополнительных задач были проведены повторные исследования крови больных, в которые включили определение всего доступного лабораторной службе спектра серологических маркеров: НВзА£, ап11-НВсог1^, апп-НВсогДО, НВеА& апП-НВе, апп-НВз, атьНСУ^М, апи-НСУДО, апп-НАУ1{>М, ant¡-HDVIgM, апй-НОУ^О. Для окончательного подтверждения диагноза и сопоставления результатов диагностики, полученных в ИФА, был использован метод ПЦР.

Проведение повторных исследований спустя 5-8 дней с момента первичного скрининга показало, что у всех 975 больных с подтвержденной вирусной этиологией поражения печени повторно выявляются маркеры первичного скрининга (Рис.2)

В группе из 96 больных с маркерами ВГА после первичного скрининга не обнаружили маркеров других форм вирусных гепатитов ни методом ИФА, ни методом ПЦР.

Дополнительное определение маркеров ВГВ и ВП) при проведении повторных исследований позволило нам разграничить фазы развития НВУ-инфекцин и выявить присоединение НОУ-инфекции у 100 больных (15,3%) -из них - у 66 больных с маркерами ВГВ после первичного скрининга, у 32 больных - с маркерами ВГВ+ВГС, у 2 больных- с маркерами ВГВ+ВГА.

При этом у 73% больных наблюдалось тяжелое течение НОУ-коинфекции (58% - с маркерами ВГВ после первичного скрининга, 15% - с маркерами ВГВ+ВГС), а у 3% - тяжелое течение ШУУ-суперинфекции на фоне ВГВ, что подтвердило господствующее в литературе мнение о том, что заражение НЮУ (ках при коинфекции, так и суперинфекции) приводит к развитию острого заболевания, при этом в сообщениях часто подчеркивалась связь между наличием дельта-инфекции и тяжестью заболевания (Балаян М.С.,1999; Логинов А.С.,1993; Шарапов Н.Б.,1996; Вегпиап 1,1991; ШггеНо М.,1991).

Среднетяжелое течение ГШУ-коинфекции наблюдали у 24% больных: из них - у 5% с маркерами ВГВ; у 17% - с маркерами ВГБ+ВГС; у 2% - с маркерами ВГВ+ВГА после проведения первичного скрининга.

Между тем, у 5 больных с тяжелым течением НВУ-инфекции не обнаружили маркеров ВГХ), но выявили маркер ВГС (апй-ЖЛП^М) при повторных исследованиях, который являлся единственным серологическим маркером, позволяющим подтвердить НСУ-инфекцию.

РИС.2 Результаты проведения повторных исследований крови.

Следовательно, проведение повторных исследований в группе больных с маркерами НВУ-инфекции позволило нам установить, что в стационаре для серодиагностики ВГВ и ВГТ) необходимо проведение двух этапов (таблица 3):

• на первом этапе подтверждаем развитие НВУ-инфекции, определяя НВ$А0 и ant¡-HBcorIgM в сыворотке крови;

• в случае положительного результата на НВбАз и на anti-HBcoгIgM -диагноз ОВГВ подтвержден уже на первом этапе диагностики, дополнительных маркеров ВГВ таким больным на втором этапе определять не следует. В случае тяжелого течения заболевания необходимо исключить присоединение инфекций, вызванных другими гепатотропными вирусами, в частности НОУ- и НСУ-, определяя апй-НЕ)У1$М и ап1'-НСУ1$М в сыворотках крови больных.

• в случаях НВ$А^+, аМьНВсогО^- и HBsAg-, anti-HBcorIgM+ необходимо проведение второго этапа диагностики для уточнения фазы ВГВ и исключения НОУ-инфекции, при этом следует определять маркеры, представленные в таблице 3.

Существуют противоречивые данные о сроках появления серологических маркеров HDV-инфекции (Liaw J.,1992; Negro F.,1995; Bocsan I.S.,1995; Carredda F.,1989), поэтому мы решили провести комплексную диагностику В ГО и оценить характер соответствия результатов, полученных различными методами (ИФА и ПЦР). Наши данные свидетельствовали, что выявление антител к антигенам HDV (anti-HDVlgM, anti-HDVIgG) не совпадает с циклом репликации вируса, поэтому при отсутствии серологических маркеров HDV-инфекции необходимо проводить исследования методом ПЦР. Таблица 3. Показания для проведения второго этапа серологической диагностики в стационаре больным с маркерами

HBV-инфекцни после первичного скрининга.

I этап II этап

Профиль J6 (из табл.2) Результаты Задачи проведения второго этапа Определение следующих серологических маркеров

2 HBsAg-t-anti-HBcorlgM-f Диагноз определен-ОВГВ. В случае тяжелого течения - исключить присоединение инфекций, вызванных другими ге-патотропнымн вирусами. anti- HDVIgM anti-HCVIgM

3 HBsAg+ anti-HBcorlgM- Установить фазу ВГВ, исключить наличие НОУ - инфекции. HBeAg anti-HBe anti-HBcorlgG anti -HBs anti-HDVlgM anti-HDVIgG

4 HBsAg-anti-HBcorigM+

В результате повторных исследований крови в группе из 193 больных (апй-НСУ^О+ после первичного скрининга) у 183 больных (94,8%) выявили anti-HCVIgM в сыворотке крови и НСУРНК в плазме.

Определение коэффициента К показало, что у 113 больных (61,7%) значение К находилось в пределах от 1 - 4, при этом 88-ми из 113 больных (77,8%) с учетом клинико-эпидемиологических данных был поставлен диагноз - ОВГС,

а 25-ти из 113 (22,2%) - обострение ХВГС. Среди 70 больных с К>4: 55 (78,5%) поставлен - ОВГС; а 15 (21,5%) - обострение ХВГС.

Таким образом, выявление anti-HCVIgM у больных ВГС отражает фазу активной репликации HCV, как при ОВГС, так и при обострении ХВГС.

В то же время, в результате повторных исследований крови среди 193 больных (anti-HCVIgG + после первичного скрининга) у 10 не выявили anti -HCVlgM в сыворотке крови и HCVPHK в плазме, но обнаружили HGVPHK в плазме крови, что свидетельствовало о развитии HGV - суперинфекцин. Возможно, обострение инфекционного Процесса у больных было связано с активизацией HGV в организме (Alter H.J.,1997; Chen H.L.,1998, Fattovich G.,1998; Hwang J.,1998; Tanaka T.,1998).

Особое диагностическое значение anti-HCVIgM нам удалось установить при повторных исследованиях в группе из 188 больных, серонегативных по результатам первичного скрининга (Рис.3).

• Обнаружено, что у 35 больных (18,6%) этот серологический маркер являлся единственным подтверждением развития HCV-инфекции. Полученные результаты подтверждены в ПЦР. Интересно отметить, что возможность определения anti-HCVIgM в стационаре появилась лишь с 1996г., когда были разработаны отечественные тест-системы. До этого момента большинство подобных больных выписывалось из стационара с диагнозом - гепатит не установленной этиологии. Выявление anti-HCVIgM позволило увеличить показатель подтверждения вирусной этиологии гепатита до 8б,9%±1,2% (при р<0,05) среди всех обследованных больных.

• HGV-PHK в плазме крови обнаружили у 38 из 188 больных (20,2%) при отсутствии остальных маркеров вирусных гепатитов.

Таким образом, проведение повторных исследований в группе больных с отсутствием маркеров первичного скрининга позволило увеличить общий показатель подтверждения диагноза до 90,1%±1,8 (при р<0,05), за счет определения anti-HCVIgM, HCVPHK, HGVPHK, что определило необходимость выявления данных маркеров на втором этапе диагностики.

• Но осталась группа из 115 больных (61,2%), у которых не удалось обнаружить ни одного специфического маркера вирусного гепатита ни методом ИФА, ни методом ПЦР. При этом дополнительные клинико- лабораторные обследования этих больных показали, что у 87 больных заболевание было связано

с развитием механической желтухи, вызванной у 31 больного (37,8%) опухолями гепатопанкреатодуаденальной зоны, у 27 больных (31,0%) - желчнокаменной болезнью, у 24 больных (31,2%)- хроническим холецистопанкреатитом.

В конечном итоге не удалось расшифровать этиологию поражения печени всего лишь у 28 из 1163 больных (2,4%). Возможно, заболевание у этих

больных было связано с наличием других гепатотропных вирусов.

РИС.3 Распределение бальных сероиегятнвных по результатам

первичного скрининга в результате проведения повторных исследований крови. Проведенные исследования по определению роли апи-НСУ1{£М в серодиагностике ВГС позволили нам предложить алгоритм диагностики НСУ-инфекции, ранее не описанный в литературе (Рис.4)

• На первом этапе необходимо определять - аШьНСУ^О. 1) Больным с положительным результатом на аяй-НСУ^в, а также больным с отрицательным результатом на алй-НСУ^О после первичного скрининга, но с подозрением на ВГС по клинико- эпидемиологическим данным необходимо проведение второго этапа серологической диагностики путем определения ат1-НСУ1(5М в сыворотке крови. 2) В случае положительного результата на апй-НСУ1{5М можно думать об активной репликации НСУ, т.е. о развитии ОВГС (при отсутствии ап^-НСУ^С) у больного, либо об обострении ХВГС (при ам1-НСУ^(3+). Окончательно определить диагноз можно только с учетом

полного клинико-лабораторного обследования больных и данных эпиданамнеза,

2) В случае отрицательного результата на ам1-НСУ1{^1 (апи-НСУЬ.О4-) можно предположить развитие перенесенной НСУ-инфекции и рекомендовать врачам обследование таких больных на наличие . НСУРНК, ШУРНК методом ПЦР.

РПС.4 Алгоритм диагностики НСУ-инфекции.

На наш взгляд, дополнительное определение апй-НСУ1{5М у больных ВГС в условиях стационара позволет решить многие вопросы, возникающие при диагностике ВГС, и не проводить исследования крови с использованием дорогостоящих методов иммуноблота и ПЦР.

Предложенный алгоритм в 93% случаев позволяет достоверно проводить диагностику НСУ-инфекшш, однако, клинико-лабораторные наблюдения больных ВГС в динамике развития заболевания показали, что выработка антител к антигенам вируса гепатита С носит строго индивидуальный характер. У одного больного при первичном скрининге на 5 день болезни обнаружили апи-НСУ^М, аШьНСУ^О методом НФА, получили положительные результаты нммуноблота, а также выявили НСУРНК (таблица 4), но в результате исследо-

ваний на 17,19 день болезни не удалось выявить апй-НСУ!^ и атШСУ^О методом ИФА, результаты иммуноблота были неопределенные; НСУРНК не обнаружили на 17 день, но выявили на 19 день болезни. Только лишь спустя 1,5 месяца с момента начала заболевания обнаружили апй-НСУ^О методом ИФА и получили положительный результат в иммуноблоте (таблица 4).

Таблица 4. Сопоставление результатов ИФА, иммуноблота и ПЦР у

больного II. в динамике развития заболевания.

День болезни anti-HCVIgM RI anti- HCVIgG R2 K-R2/R1 HCVPHK Desiscan HCV Plus

5 1,12 1,45 1,29 + положит

17 0,44 0,61 1,38 неопред

19 0,42 0,25 0,59 + неопред

1,5 мес. 0,17 1,8 10,5 + положит

2,3 мес. 0,09 2,12 23,5 - положит

S мес. 0,19 2,47 13,0 + положит

У больной К. на 19 день болезни удалось выявить ат1-НСУ1{5М при отрицательном результате в ИФА на ап^-НСУ^О (многократные исследования сыворотки крови больной в тест-системах различных фирм давали величину Я2 , приближающуюся к 1, т.е результаты тестирования находились в так называемой "серой зоне"), методом иммуноблота получили положительный результат, также выявили НСУРНК (таблица 5). Исследования проведенные спустя 1 месяц и 1,2 месяца с момента начала заболевания показали отрицательный результат на апи-НС\Л^ и апи-НСУ^О, но положительный результат в иммуноблоте. Спустя лишь 1,4 месяца получили положительный результат всеми методами диагностики - ИФА, иммуноблот, ПЦР (таблица 5).

Таблица 5. Сопоставление результатов ИФА, иммуноблота и ПЦР у

больной К. в динамике развития заболевания.

День болезни anti-HCVIgM RI anti-HCVÏgG R2 K-R2/R1 HCVPHK Desiscan HCV Plus

19 1Д4 0,96 0,77 + положит.

31 0,74 0,66 0,89 - положит.

1,2 мес. 0,87 0,49 0,56 - положит.

1,4 мес. 1,04 1,65 1.5 + положит.

2,2 мес 0,43 2,17 5.1 - положит.

Следовательно, нам удалось зарегистрировать фазу так называемого "серологического окна" у двух больных на ранних этапах развития НСУ-

инфекции. Если бы мы проводили исследования серологических маркеров методом ИФА у больных в описанные периоды заболевания, то нам бы не удалось подтвердить диагноз ВГС, хотя при проведении первичных исследований крови у этих больных диагноз подтвержден различными методами диагностики (ИФА, иммуноблот и ПЦР). Поэтому мы считаем, что диагностика ВГС должна быть комплексной, т.е. включать различные методы исследований и носить характер мониторинга с учетом индивидуальных особенностей течения заболевания, особенно на ранних этапах развития НСУ-инфекции.

Обобщая результаты проведенных исследований, мы разработали алгоритм серологической диагностики вирусных гепатитов в условиях стационара (Рис.5):

1. Для полной расшифровки этиологии острых вирусных гепатитов в условиях стационара необходимо проведение двух этапов серологической диагностики.

2. На первом этапе серологической диагностики (первичный скрининг) для подтверждения вирусной этиологии острых гепатитов достаточно определять следующие серологические маркеры: ап1!-НАУ1{5М, НВзА& апи-НВсог1{>М, ап1|-НС\^0.

3. Больным с выявленным маркером ВГА - ал(!-НАУ1$>М+ после первичного скрининга достаточно проведения первого этапа диагностики для подтверждения диагноза.

4. Больным с маркерами НВУ-инфекции после первичного скрининга необходимо проведение второго этапа серологической диагностики для определения фазы развития инфекционного процесса и исключения присоединения НОУ- и НСУ- инфекций, при этом следует определять маркеры, представленные в таблице 3.

5. При проведении второго этапа диагностики в стационаре не следует повторно определять маркеры первичного скрининга.

6. Больным с положительным результатом на ап11-НСУ1£0, а также больным с отрицательным результатом на апй-НСУ^О после первичного скрининга, но с подозрением на ВГС по клинико-эпидемиологическим данным необходимо проведение второго этапа серологической диагностики путем определения атьНСУ!^ в сыворотке крови (Рис.4).

7. Больным с выявленными маркерами микст-инфекций после первичного скрининга необходимо проведение второго этапа серологической диагностики для установления фазы развития инфекционного процесса и исключения присоединения инфекций, вызванных другими гешгтотропными вирусами, при этом необходимо придерживаться той же тактики диагностического поиска, •по и при диагностике НВУ- и НСУ- моноинфекцнй (таблица 3, Рис.4).

8. Больным, у которых отсутствуют серологические маркеры первичного скрининга, но имеются клинические признаки вирусного гепатита необходимо назначать проведение исследований методом ПЦР, определяя НСУРНК, ¡-ЮУРНК в плазме крови.

РИС. 5 Алгоритм лабораторной диагностики вирусных гепатитов в стационаре.

Выводы:

1. Разработан алгоритм серологической диагностики острых вирусных гепатитов в условиях стационара, оптимизирующий подтверждение вирусной этиологии поражения печени, а также сокращающий расходы диагностических средств и время проведения исследований.

2. На первом этапе диагностики (первичный скрининг) достаточно определять: апй-НАУ1вМ, НВзА& апЬ-НВсог1{5М, апй-НСУ^О, т.к. данный комплекс маркеров позволил подтвердить вирусную этиологию поражения печени в 83,8% случаев из всех обследованных больных.

3. Для диагностики ВГА достаточно проведения первичного скрининга, т.к в 100% случаев этот диагноз был подтвержден на первом этапе диагностики.

4. Для окончательной диагностики ВГВ и ВГС необходим учет серологических маркеров второго этапа (НВеА§, апи-НВе, апй-НВсог^О, апП-НЕЬ, апп-НСУГкМ, ап1ьШ)У1(5М) для суждения о длительности заболевания и возможности дополнительного инфицирования.

5. Выявление ал^-НСУ1{^М имеет особое диагностическое значение, т.к. отражает активную репликацию вируса гепатита С и позволяет подтвердить развитие НСУ-инфекции в 18,6% случаев среди серонегативных проб первичного скрининга.

6. Установлено, что выявление антител к антигенам НОУ не совпадает с циклом репликации вируса, поэтому диагностика ВГТ> должна быть комплексной, т.е. включать различные методы исследований - при отрицательных результатах ИФА (апй-НОУ1]$М-, апй-НОУ^О-), но при наличии клинических признаков НОУ-инфекции необходимо назначать определение ШЭУРНК методом ПЦР.

7. При вирусном гепатите С выявлена дискретность обнаружения антител классов и в ИФА и иммуноблоте на ранних этапах развития НСУ-инфекции, а также результатов ПЦР, что в некоторых случаях требует серологического мониторинга больных в течение нескольких месяцев ( от 1 до 3 месяцев).

8. Установлено, что выявление НСУРНК, НОУРНК среди серонегативных проб первичного скрининга позволяет увеличить показатель подтверждения вирусной этиологии поражения печени до 90,1%±1,8%(при р<0,05).

Практические рекомендации:

1. Для полной расшифровки этиологии острых вирусных гепатитов в условиях стационара необходимо проведение двух этапов серологической диагностики (Рис-5).

2. На первом этапе серологической диагностики (первичный скрининг) для подтверждения вирусной этиологии острых гепатитов достаточно определять следующие маркеры: ат!-НАУ1;^1, НВвАв, ал«-НВсог1{'М, апй-НСУ^О.

3. Для подтверждения диагноза ВГА достаточно проведения первого этапа диагностики.

4. Больным с маркерами НВУ-инфекции после первичного скрининга необходимо проводить второй этап серологической диагностики для определения фазы развития инфекционного процесса, а также для исключения присоединения микст - инфекций (НСУ-, НОУ-), при этом необходимо определять маркеры, представленные в таблице 3.

5. При проведении второго этапа серологической диагностики в стационаре не следует повторно определять маркеры первичного скрининга, т.к. время пребывания больных в стационаре не совпадает со сроками элиминации антител.

6. Больным с положительным результатом на апй-НСУ^О, а также больным с отрицательным результатом на аш1-НСУ1дО после первичного скрининга, но с подозрением на ВГС по клинико-эпидемиологическим данным необходимо проведение второго этапа серологической диагностики путем определения аШ1-НСУ1§М в сыворотке крови (Рис.4).

7. Больным с выявленными маркерами микст-инфекций после первичного скрининга необходимо проведение второго этапа серологической диагностики для установления фазы развития инфекционного процесса и исключения присоединения дополнительных инфекций, вызванных другими гепатотропны-ми вирусами, при этом необходимо придерживаться той же тактики диагностического поиска, что и при диагностике НВУ- и НСУ- моноинфекций (таблица 3, Рис.4).

8. При наличии эпидемиологических и клинических признаков вирусного гепатита у больных с отрицательными результатами первичного скрининга необходимо назначать определение НСУРНК, НОУРНК методом ПЦР.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Симонова И.А., Волчкова Е.В., Шипулин Г.А., Чуланов В.П., Шипу-лина О.Ю., Ольшанский А.Я. и др. Особенности лабораторной диагностики вирусного гепатита D.// Эпидемиология и инфекционные болезни, 1998, №6, стр.31-33

2. Максимов С.Л., Симонова H.A., Ольшанский А .Я. и др. Диагностическое значение обнаружения anti-HCVIgM в сыворотке крови больных вирусными гепатитами В и С// III съезд Итало-Российского общества по инфекционным болезням, научная конференция "Инфекционные болезни: новое в диагностике и терапии", СПб, 1998, стр.57

3. Симонова И.А., Волчкова Е.В., Максимов C.JI., Голиков В.А., Ольшанский А.Я. и др. Диагностическое значение выявления IgM-антител к вирусу гепатита С для верификации диагноза у больных с гепатитами неясной этиологии.// 5-й Российский съезд врачей-инфекционистов, сборник докладов, Москва, 1998, стр.285-286

4. Ольшанский А.Я., Симонова И.А. Серологическая диагностика вирусных гепатитов в условиях инфекционного стационара.// Новости "Вектор-Бест", №4 (10), 1998, стр.3-5

5. Симонова И.А., Волчкова Е.В., Голиков В.А., Ольшанский А.Я. Серологическая диагностика вирусных гепатитов в условиях стационара.// Ш Российская научно-практическая конференция с международным участием "Гепатит В,С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики", сборник докладов, Москва, 1999, стр.208-209.

6. Симонова И.А., Волчкова Е.В., Шипулин Г.А., Шипулина О.Ю., Ольшанский А.Я. Микст-инфехция (вирусный гепатит А+В) или вирусный гепатит А.// П1 Российская научно-практическая конференция с международным участием "Гепатит В,С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики", сборник докладов, Москва, 1999, стр.209-210.

7. Симонова И.А., Волчкова Е.В., Чуланов В.П., Голиков В.А., Пак С.Г., Ольшанский А.Я. Алгоритм специфической лабораторной диагностики вирусных гепатитов.// Клиническая лабораторная диагности-ка.(принята в печать).

8. Simonova I.A, Volchkova E.V., Olshansky A.Ya. Relevance of EIA for anti-HCVIgM in defining the etiology of hepatitis.// 1IRGH, Infectious pathogens in gastrointestinal and hepatic disorders, Spain, Sep. lS"1-19th, 1998, Abstr. Book, p. A26.