Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Различные изменения мембранных потенциалов лимфоцитов в ответ на действие ряда физико-химических факторов в разных физиологических состояниях жизнедеятельности млекопитащих

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Различные изменения мембранных потенциалов лимфоцитов в ответ на действие ряда физико-химических факторов в разных физиологических состояниях жизнедеятельности млекопитащих"

МОСКОВСКИЙ ордена ЛЕНИНА,ордена ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛОЦИИ и ордена ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА.

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.3.05

Тарнопольская Ольга Владимировна

Различные изменения мембранных потенциалов лимфоцитов в ответ на действие ряда физико-химических факторов в разных физиологических состояниях жизнедеятельности млекопитающих.

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультет Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова. Научный руководитель: Доктор биологических наук,

кандидат физико-математических наук Г.Н. Зацепина

Официальные оппоненты: Доктор физико-математических наук

В.А. Намиот Кандидат биологических наук Г.И. Морозова

Ведущая организация: Институт эяедершенгальяой и геореигаеско:

биофизики РАН, г .Пувдно-на-Оке ^

Защита состоится " " 1994 г. в /6 час

на заседании специализированного совета N '3 ОФТТ (К.053.05.77) МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу:

119899 ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, физический факультет, аудитория /ом -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физическ факультета МГУ.

- /У ■ оШ

Автореферат разослан 1994 года.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат физико-математических наук озлог

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Выяснение механизма взаимосвязи отдельных :вободноциркулирующих клеток - лимфоцитов и эритроцитов с целым организмом представляет собой актуальную проблему современной биофизики и медицины.

В связи с этим, исследование принципов функционирования электрической система регуляции процессов жизнедеятельности, развиваемые з работах Зацепиной Г.Н. с соавторами представляет несомненный интерес.

Так в работах Зацепиной Г.Н., Тарасовой И.М. и Лазарева А.О. ¡1980 - 1992г.) было показано, что изменение распределения разнос-гей электрических потенциалов по коже - базальной системе млекопи-гающего - корреллирует с изменениями мембранных потенциалов лимфоцитов того же млекопитающего.

В связи с этим, исследование природы мембранных потенциалов тимфоцитов при изучении их изменений in vitro под действием на них :амых разных физико-химических факторов представляет несомненный интерес.

Известно, что именно мембраны регулируют ионный гомеосгаз «легок и их резистентность к биологически активным веществам в различных физиологических состояниях организма животного. В качестве разных физиологических состояний организма нами были выбраны: 1) состояние организма, в котором развивается общая реакция на повреждение /0РГ1/ в ответ на однократное подкожное введение физраствора или <осточкового масла. 2) индуцированный канцерогенез /ИК/, вызванный однократной инъекцией специфических канцерогенов; 3) состояние "контроль" - здоровые животные.

В данной работе была исследована способность лимфоцитов адаптироваться к изменению тоничности окружающей клетки среды, изменению ионного состава электролитов среды (замещение Na+ на К'),дейст-зию фермента нейраминидазы, действию уабаина - ингибитора активного транспорта ионов, в разных состояниях жизнедеятельности организма ■шши.

Цель работы состояла в выяснении сходств и различий адаптационных характеристик лимфоцитов в ответ на изменение физико-симических факторов внешней среды в разных физиологических состояниях организма мыши.

Научная новизна работы.

1) Выполненные исследования показали, что изменения среднего мемб ранного потенциала Щ1) лимфоцитов в ответ на одинаковые возденет вия ряда физико-химических факторов различны в разных фкзиологичес ких состояниях организма;

2) Показано, что мембранный потенциал лимфоцитов многокомпонентен

3) Разные физиологические состояния организма (ИК, ОРП и контроль отличаются вкладом и электрогенкостью активного транспорта ионов МП и, следовательно, величиной МГГ: а) в контроле электрогенны активный транспорт уменьшаегТШ клеток; б) в состоянии ОРП - элекг рогенный транспорт увеличивает МП клеток; в) в состоянии ИК - ак тивный транспорт не дает вклада в МП клеток.

4) Вторая компонента Щ обусловлена разделением проникающих чере мембрану ионов, Доннановская компонента. Она различна в разных фи зиологических состояниях организма: в ИК эта доля ЙП максимальна п сравнению с ОРП и контролем.

5) Третья компонента Ш1 лимфоцитов не зависит от физиологическог состояния организмов животных, это константная составляющая, обус ловленная разделением зарядов на мембранах митохондрий - метаболиз мом.

6) Показано, что флюоресцентный зонд АНС позволяет изучать тонки изменения мембранных потенциалов лимфоцитов в ответ на действи самых разных физико-химических факторов;

7) Разработаны два новых метода исследования кинетик регуляции обч ема клеток в условиях гипотонии и с их помощью исследована кинетш-регуляции объема лимфоцитов в гипотонической среде;

8) Показано, что синхронно с изменением объема клеток изменяется МП лимфоцитов /обе характеристики восстанавливаются до значенш близких к первоначальным, за 6-10 минут/;

9) Обнаружено, что известные, широко используемые исследователя* флюоресцентные зонды АНС и ДСМ, связавшиеся с лимфоцитами в изотс нической среде, после ее разбавления водой, "замораживают" процесс регуляции объема и МП (АНС - на 10 мин);

10) Обнаружено, что в результате действия на лимфоциты фермен' нейраминидазы и 145 мМолярного KCl, Щ клеток изменяется: в перв! час инкубации наблюдается деполяризация плазматических мембран юн ток, после чего МП возвращается через 2-3 часа к первоначально] значению.

Практическое значение работы. Различия МП лимфоцитов в процессах их адаптации к действию различных физико-химических факгоро] в разных физиологических состояниях млекопитающих позволяют осуществлять диагностику состояния млекопитающего.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащий 164 источника. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и содержит 28 рисунков и 37 таблиц.

Апробация работы. Материалы диссертации неоднократно докладывались на научном семинаре кафедры биофизики физического факультета МГУ, а также на Всероссийском онкологическом съезде в г.Росгове -на-Дону, 1986 г., на Пятой Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" в г.Тбилиси, 1987г., на 10-й межвузовской научной конференции "Актуальные проблемы биологии и медицины", МГУ, октябрь, 1986 г.

Публикация результатов. Основные результаты диссертации изложены в шести печатных работах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлены литературные данные по следующим вопросам: 1. Современные представления о мембранном потенциале клетки и способы его определения флюоресцентными методами. 2. Гетерогенность популяции лимфоцитов: морфология и флюоресценция. 3. Изменение размеров лимфоцитов в условиях стресса. 4. Изменение мембранного потенцила клеток в процессах адаптации их к действию различных физико химических факторов. 5. Регуляция объема клеток и изменение мембранного потенциала в этом процессе. 6. Изменение электрических характеристик организма животного и его лимфоцитов в процессах развития общей реакции на повреждение и индуцированны канцерогенез. Важным результатом первого пункта обзора служит вы вод о потенциалочувствительности флюоресцентных зондов АНС и ДСМ Сформулированы задачи данного исследования.

Во второй главе описаны материалы и методы, использованные в экспериментах за исключением новых методов, разработанных нами в процессе исследования.

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ.

Объекты исследования: лимфоциты тимуса и селезенки мышей линии А и линии BALB/c. Мыши линии А отличаются генетической предрасположенностью к возникновению спонтанных аденом легких.. У молодых мышей линии А (2-3 мес.) при однократном введении уретана в 80% случаев через 90 дней возникают аденомы легких [Н.Н.Касаткина, 1984]. Мыши линии BALB/c чувствительны к возникновению сарком при однократном введении метилхолантрена (МХ) [Уманский Ю.А.,1982].

Модели физиологического состояния организма были разработаны в работах Зацепиной Г.Н. и Тарасовой И.М./1985 г.'/. Это общая реакция на повреждение(ОРП), индуцированный различными агентами канцерогенез на фоне той же ОРП (ИК) и контроль (К) - здоровые, интакт-ные животные.

При исследовании особенностей изменений МП в процессах развития ИК и ОРИ, животных каждой линии, одного пола, веса и возраста делили на три равные группы. Первой группе мышей линии А однократно вводили под кожу 0,2 мл физиологического раствора - группа ОРП. Второй группе мышей линии А однократно вводили под кожу 0,2 мл уретана, разведенного в.том же объеме физиологического раствора, в дозе 0,25 мг на 1 грамм веса мыши - группа ИК. Третьей группе, контрольной, ничего не вводили.

Мышам линии BALB/c, первой группы (ОРП).вводили подкожно, однократно 0,2 мл косточкого масла; второй группы (ИК), также однократно, подкожно, в том же объеме, вводили метилхолантрен, разведенный в подогретом косточковом масле, в дозе: 1 мг на 1 грамм веса мыши. Третьей группе мышей линии BALB/c препаратов не вводили.

Способ получения и хранения суспензии лимфоцитов. Клетки выделяли из организма животного стандартным способом (Фримель,1984) в среду, состоящую из физиологического раствора, стабилизированного фосфатным буфером, рН=7,2;(145-мМ NaCl с 10% фосфатным буфером) Пробирки с полученной клеточной суспензией хранили на льду при температуре +2°С. Концентрацию клеток в суспензии доводили до Зх10б кл/мл. Измерения выполняли при + 22°+ 2°С.

. Используемые вещества. В работе использовали флюоресцентные красители АНС (1-анилинонафталик-8-сульфонат) фирмы "Serva", ДСМ (4-(п-диметиламиностирил)-1-метилпиркдиний) производства Рижского Института Оргсинтеза АН ЛССР; АО (акридиновый оранжевый).синтезированный на заводе "Реактив"(трест "Союз-реактив", г.Львов). АНС

использовали в конечной концентрации 40 мкМ, ДСМ - 20 мкМ. Для исследования физико-химических характеристик лимфоцитов в различных ионных средах использовали следующие растворы:145 мМ сахарозу, 290 мМ сорбит, 145 мМ хлористый литий, 145 мМ хлористый калий, 145 мМ хлористый рубидий. LiCl и RbCl были фирмы "Serva" ФРГ, остальные препараты отечественные, марки "ХЧ". Для исследования роли сиало-вой "шубы" лимфоцитов в их жизнедеятельности использовали фермент нейраминидазу /НМ/ нехолерных вибрионов (производство г.Горький) в концентрации 1,5х10~ь мг/мкл с активностью 5,3 ед/мг. Время инкубации клеток с НМ составляло 1 час. Для отключения активного транспорта ионов через плазматическую мембрану лимфоцитов использовали уабаин производства фирмы "Serva" в концентрации 10 мкМ.

Флюориметрия клеток. Физико-химические характеристики лимфоцитов изучали посредством световой и флюоресцентной микроскопии. Интенсивность флюоресценции красителей, связанных с лимфоцитами, измеряли на люминисцентном микроскопе "Люмам-И-1". Флюоресценцию АНС возбуждали светом с максимумом интенсивности на длине волны 360 нм, а интенсивность флюоресценции ЛНС измеряли на длине волны 491 нм. Для флюоресценции ДСМ эти значения составляли 436 и 532 нм, соответственно. Флюоресценцию измеряли фотоумножителем ФЗУ-79, на который подавали напряжение 2200 В. Увеличение микроскопа - 1350 (объектив -90, окуляр - 15). Диаметр диафрагмы, вырезающий пучок сьета от образца на ФЭУ в большинстве наших измерений был равен 1,5 мм. При нашем увеличении эта диафрагма проецировалась на поле зрения окружностью с диаметром 16 мкр. Фотометрирование клеток осуществляли путем помещения в поле зрения диафрагмы одной клетки вместе с фоновым свечением вокруг клетки, поскольку размеры лимфоцитов в среднем намного меньше размера этой диафрагмы. Затем отдельно измеряли интенсивность флюоресценции фона без клетки. Интенсивность флюоресценции клетки получали как разность двух перечисленных измерений. Фотометрирование выполняли в условиях постоянства светового потока лампы ДРШ-250, которое контролировали посредством использования двух стандартных флюорохромов и специальной диафрагмы, согласно инструкции к микроскопу. Сигнал с ФЭУ от флюоресцирующей клетки измеряли по падению напряжения на внешнем сопротивлении 107 0м милливольтметром. Использовали относительные единицы (отн.ед.), которые для удобства были в 10 раз больше, чем регистрируемые вольтметром.

Концентрация АНС и ДСМ в препарате составляла 40 и 20 мкМ, соответственно. АНС инкубировали с лимфоцитами 10, а ДСМ - 20 мин.

Диаметры лимфоцитов измеряли посредством окуляр-микрометра. В каждом образце исследуемых лимфоцитов измеряли диаметр 50 клеток и находили среднее значение и дисперсию среднего.

В третьей главе представлены результаты исследований, на основании которых нами были выбраны концентрации красителей, продолжительность времени инкубации лимфоцитов с.красителями и другими используемыми веществами, методы измерения флюоресценции. Представлены разработанные нами новые методы.

' НОВЫЕ МЕТОДЫ

Метод двузондовой окраски лимфоцитов. заключается в одновременном окрашивании клеток двумя флюоресцентными потенциалозависи-мыми зондами анионом АНС и катионом ДСМ. Сначала к суспензии лимфоцитов добавляли ДСМ в концентрации 20 мкМ, через 10 мин - АНС в концентрации 40 мкМ, через 10 мин начинали измерения. Такой способ окрашивания охватывает весь спектр гетерогенной по • интенсивности флюоресценции популяции лимфоцитов (Г.И.Морозова,1985; В.И.Постников, 1986). Мы предложили'использовать этот метод для быстрого определения физиологического состояния организма, из которого выделены лимфоциты. Так, в состоянии контроля популяция тимоцитов мышей при двузондовой окраске распределяется следующим образом: зеленые (окрашены только АНС) - 4+3%; оранжевые (окрашены только ДСМ) -9±4%; смешанная окраска - 87±3% . На 5-8 день после введения препаратов мембраны лимфоцитов мыши гиперполяризованы и картина двузондовой окраски изменяется: только зеленые - 3+3%; только оранжевые - 24+6%, смешанная окраска- 73±4% . Таким образом, подсчет % оранжевых лимфоцитов характеризует их НП в отн. ед.

Метод "высушенных капель" был разработан нами для исследования кинетики регуляции объема лимфоцитов в гипотонической среде и заключается в следующем: после разбавления исходной суспензии клеток водой через определенные промежутки времени (20 сек;30 сек;1-10 мин) наносили на предметное стекло микрошприцем капли суспензии обемом 0,04 мкл. После быстрого высушивания в потоке воздуха комнатной температуры клетки фиксировали на стекле, последовательно, соответственно времени пребывания в гипотонии.

Метод фиксации объема лимфоцитов в гипотонической среде с помощью вещества АНС базируется на обнаруженном нами свойстве флюоресцентного зонда АНС мгновенно, обратимо, фиксировать объем лимфоцитов на определенной стадии процесса регуляции объема клеток в

гипотонии. При использований этого метода, к. отобранной пробе с клетками, через определенное время после разбавления исходной среды водой (20 сек;30 сек; 1-10 мин), добавляли АНС в конечной концентрации 50 мкМ и измеряли диаметры клеток в каждой пробе, содержащей клет- ки с фиксированным объемом, соответствующим времени пребывания лимфоцитов в гипотонии. Метод позволяет одновременно с измерением диаметров измерять и интенсивность флюоресценции АНС /I-АНС/, лимфоцитов в процессе регуляции объема в гипотонии.

Глава 4. РЕГУЛЯЦИЯ ЛИМФ0ЦИТ0ВВ ГИПОТОНИЧЕСКОЙ СРЕДЕ И ЕЕ МЕХАНИЗМЫ.

Разработанные нами методы исследования кинетики регуляции объема клеток в гипотонической среде были применены для изучения кинетики регуляции объема клеток в гипотонической среде. Одновременно исследовали и изменения I-АНС лимфоцитов. На рис.1 представлена кинетика изменения диаметров лимфоцитов /а/ и кинетика изменения I-АНС лимфоцитов /б/ при помещении их в гипотоническую среду. Кинетика регуляции объема исследована методом фиксации состояния клеток АНС. В основных чертах она совпадает с кинетикой, полученной мето-' дом "высушенных капель".

В нашем случае процесс регуляции объема клеток представил собой квазипериодический затухающий колебательный процесс, который описывает дифференциальное уравнение:

X' ' + 2аХ' + </х = 0 ,

где / Pt=^0gt=c° ; а=л/2пи - коэффициент

Г\ гу

затухания процесса; ц> =k/m - частота колебаний. Если и >а, то решение имеет вид: X = e~a*"-sin(u t) u = У - - а2

1 1га

Обращает на себя внимание строгая синхронность изменений I-AHC и изменения объема лимфоцитов. В силу показанной выше потенциало-чувствительности зонда АНС, мы сделали вывод о синхронном изменении МП и объема лимфоцитов в процессах рёгуляторного уменьшения объема (РУО).

Мы обнаружили нарушение процесса РУО лимфоцитов в гипотонии в присутствии ДСМ и ингибитора №+,К+-АТФазы - уабаина, а также вив среде с 145 мМ KCl. Цитоскелет, по работам Смирновой Е.А.(1988) и Зацепиной Г.Н.(1992) играет важную роль в процессе РУО лимфоцитов.

средний диаметр, мкр.

Рисунок 1.

Кинетика регуляции объема (а) и изменения интенсивности флюоресценции АНС (б) лимфоцитов при их помещении в гипотоническую среду в момент времени "О".

5 --

4 --

3 --

Т~~2

1-АНС, отн.ед.

То"

Время,мин.

Время,мин.

НИИ

ю

Нами показано, что лимфоциты, отрегулировашие объем в гипотонии имеют внутриклеточную среду изоосмотичную внешней среде.

Из работ Сг1пз1е1п (1982) и Иои-Ко1л (1973) известно, что в процессе РУО клетки имеет место изменение проницаемости плазматической мембраны клетки для К*" и С1_, которая активируется МП и ионами Са^. Из клеток выходят ионы К* и С1~ вместе с водой до состояния изоосмотичности внутриклеточной и внешней сред.

На основании наших и литературных данных можно так описать механизм РУО лимфоцитов в гипотонической среде. В первые 30 сек вода по градиенту хим.потенциала входит внутрь клеток и клетки набухают подобно осмометрам. Увеличение концентрации воды в клетках приводит к уменьшению в них концентраций К"1", С1~и Сай+ почти в 2 раза. Клетки держат гомеостаз по Са++ и он поступает из эндоплазма-тического ретикулума. Активируется работа N3", К+-АТФазы, МП клеток изменяется, активируются К+- каналы, стимулируется перестройка сети мккрофиламентов клеток, происходит их сокращение с затратой

5

АТФ. Из клеток выходит вода вместе с К4", С1~. Как видно из кинетики РУО лимфоцитов через минуту действия гипотонии объем клеток уменьшается на 70%, а НП на 100%. Осмотическое давление в клетках к этому моменту времени практически не изменяется, а гидростатическое давление, обусловленное действием сократительного аппарата клеток, выдавливает из них воду и ионы. Как только клетка сократила свой объем, Са++ уходит в депо, МП возвращается к значению, близкому к первоначальному, микрофиламенты расслабляются. Каждое сокращение объема клеток приводит к уменьшению в них концентрации К+, С1+ и воды. НП клеток уменьшается с уменьшением их объема.

Глава 5 СРЕДНИМ МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ЛИМФОЦИТОВ И СРЕДНЯЯ ИНТЕНСИВНОСТЬ ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ АНС И ДСМ ЛИМФОЦИТОВ В СРЕДАХ'РАЗЛИЧНОГО ИОННОГО СОСТАВА.

На основании наших экспериментов и выводов ряда работ можно заключить, что анион АНС не выходит в цитоплазму клетки, а распространяется по комплексам мембран эндоплазматического ретикулума и мембран митохондрий. Флюоресцирует только зонд АНС, связанный с мембранами или белками. В среде, в которой Na+ замещен на К+, более 90% лимфоцитов имеют ярко светящуюся область митохондрий и эндопла-зматическиго ретикулума, а в физиологической среде только 37% лимфоцитов имеют яркосветящуюся область митохондрий. Яркость свечения АНС любых мембран обрагнопропорционально зависит от МП. Известно /Г.И.Морозова,1985/, что разобщители фосфорилирования, например, один из них - 2,4 динитрофенол (2,4 ДНФ), добавленные к суспензии лимфоцитов, окрашенных АНС, увеличивают свечение областей митохондрий и плазматических мембран. В этом случае МП митохондрий приближается к своему минимальному значению. На основании сказанного можно записать следующее соотношение для I-AHC клетки:

а

(I-AHC)KJK =_T_Rt?r_;

где <р = МПЛЛ мем£ ~ мембранный потенциал плазматической мембраны и эпдоплазматического ретикулума; р - потенциал митохондриаль-

m х

ных мембран, а - коэффициент пропорциональности. Коэффициент к(<р) зависит от потенциала плазматической мембраны, и при ее гиперполяризации I-AHC митохондрий равна нулю. По мере уменьшения >р, например, при добавлении в водную суспензию лимфоцитов К+, уменьшается МП митохондрий'и увеличивается яркость флюоресценции АНС плазматической мембраны и митохондрий, т.е. МП митохондрий и плазматической

мембраны изменяются пропорционально друг другу. В приближении линейной зависимости: k(y)=rv>,

где г - коэффициент пропорциональности, I-AHC можно записать:

т — дн^ — _А _ _ А_

<р -г tip tp + эrip J '

I-ДСМ на основании работ Г.И.Морозовой и наших собственных данных можно представить в виде: (1-ДСМ)„_ = с(® + <р ),

Jr\ Ji to х

где с - коэфф. пропорциональности.

Эксперименты показали, что при изменении, ионного состава внеклеточной среды среднюю величину <р лимфоцитов можно считать

Ш X -

постоянной величиной, если не добавлять в суспензию клеток специальных веществ, действующих на дыхательную цепь, на фосфорилирова-ние. т.е. на Ртх-В этом приближении I-AHC обратнопропорциональна ^

- среднему мембранному потенциалу плазматической мембраны, а 1-ДСМ

- прямопропорциональна <р - среднему мембранному потенциалу плазматической мембраны.

Как измененяются I-AHC и I-ДСМ в присутствии других катионов и анионов во вне- и внутриклеточной средах представляет интерес для оценки надежности и однозначности метода использования зондов АНС и ДСМ, как зондов, измеряющих МП. В условиях приближения Нернста, МП плазматической мембраны в состояния покоя клетки имеет вид:

МП я 60 Rln([K+] /[К+]( ) * 60.,Rln([H+] /[Н+]. )

MD out In MD out in

Значения I-AHC к I-ДСМ -тимоцитов контрольных мышей-самцов линии BALB/c представлены на рис.2. По оси X указаны обозначения разных используемых сред в порядке возрастания в них значений I—АНС, а значения I-ДСМ располагаются уже в соответствии с заданной АНС последовательностью. Из анализа результатов можно сделать следующие выводы:

1. Максимальное значение Ж клетки имеют в среде В, в которой ионы могут уходить из клеток, но не могут в них входить. Изотония поддерживается сахарозой.

2. Имеет место изменение МП при замене Na+ на К+ во внешней среде (среда А и среда D) - отключение Доннановской компоненты МП.

3. Влияние осмотического давления на МП клеток можно видеть в средах С и G: наблюдаются разные I-AHC и I-ДСМ в средах с одинаковой концентрацией Na^, но разной ионной силой. В этих средах клетки отрегулированы и их диаметры одинаковы.

Из сказанного следует, что МП зависит как от ионной силы внешней среды, так и от ее состава. Этот вывод основан на результатах всех наших экспериментов, включая и опыты с LiCl и RbCi.

1-АНС ( I ) и 1-ДСЫ ( I ) в %

40 - гипо.наб. гипо г отр.

& 6 Г ч. к 0, А Й Н 6

0 73 72 12 12 0 72 140 73 218 0 0

СГ 0 73 72 145 145 145 72 145 145 218 145 145

Г 0 О 2 2 2 0 2 5 73 5 145 5

сах. 290 145 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ИЬ* 0 О 0 72 0 145 0 0 0 0 0 0

1л + 0 О 0 0 72 0 0 0 0 0 0 140

Рисунок 2 Изменение 1- -АНС и 1-ДСМ лимфоцитов в средах раз

личного ионного состава в процентах от значения 1-АНС и 1-ДСМ в физиологической среде. Среда Г - гипотоничная, клетки разбухшие; среда 0 - гипотоничная, но клеточный объем уже отрегулирован. Среда Н - гипертоничная, клетки сжаты. Остальные среды - изотоничные.

В изотоничных средах 1-АНС и 1-ДСМ лимфоцитов изменяются противоположно по знаку, а в неизотоничных средах зонд ДСМ не отслеживает МП (на рис.2 эти значения 1-АНС и 1-ДСМ заключены в квадратики). Нами обнаружено, что зонд ДСМ всегда нарушает регуляцию объема лимфоцитов в гипотонии, клетки остаются набухшими.

В среде, в которой №+ полностью замещен на К+ появляется зависимость 1-АНС и 1-ДСМ лимфоцитов от времени пребывания клеток в среде. Этот результат представлен на рисунке 3.

Результаты выполненного исследования свидетельствуют о том, что в условиях отсутствия градиента по К+между клеткой и внешней средой лимфоциты способны регулировать свой Ш.

Найдена зависимость средней, нормированной на ед.площади клетки интенсивности флюоресценции АНС и ДСМ лимфоцитов, от диаметра лимфоцитов. На рис.4 представлена эта зависимось.

На основании этих результатов можно сделать вывод о том, что более крупные клетки в среднем имеют больший МП, чем мелкие.

140--120--

Рисунок 3.

Зависимость 1-АНС и 1-ДСМ лимфоцитов от времени инкубации в среде, в которой ЭДа замещен на К ; в % по отношению к физиологической среде.

Время инкубации.час

Р-АНС, отн.ед.

Я-ОСМ (х),отн.ед.

Рисунок 4. Зависимость средней , нормированной на ед. площади, интенсивности флюоресценции АНС и ДСМ лимфоцитов от их диаметров.

Нами было исследовано и влияние уабаина на 1-АНС лимфоцитов. Результаты, представленью в таб.1.показывают, что в физиологической среде уабаин уменьшает 1-АНС лимфоцитов в среднем в 1,2 раза ± 0,3. В изотонической среде хлористого калия 1-АНС клеток также уменьшилась в 1,2+0,2 раза. При добавлении уабаина к лимфоцитам, набухшим в гипотонии, 1-АКС клеток практически не изменилась, точно также 1-АНС лимфоцитов не изменилась при добавлении уабаина в гипотоническую среду, в которой клетки уже отрегулировали объем. Поскольку результаты данной работы свидетельствуют о том.что 1-АНС лимфоцитов изменяется обратнопропорционально МП лимфоцитов, то увеличение МП в среде с уабайном, в условиях отключения работы №,К- АТФазы, свидетельствует о том,что в лимфоцитах здорового организма Ыа.К-АТФаза работает обратноэлектрогенно в физиологической среде.

Роль сиаловых кислот, ковалентно связанных с мембраной лимфоцитов; в изменении МП клеток в разных средах инкубации мы исследовали, добавляя в среду инкубации нейраминидазу(НМ), которая "сост-

ригает" часть сиалоетх кислот клеток, входящих в гликокаликс и определяющих отрицательный заряд их поверхности.

Таблица 1. 1-АНС лимфоцитов тимуса мышей линии А в присутствии и отсутствии уабаина в различных средах. "Гипотоническая 1" -в момент добавления уабаина клетки набухшие, "Гипотоническая 2" -в момент добавления уабаина клетки отрегулировали свой объем и МП.

Характеристика среды 1-АНС + о-, (отн.ед.) уабаин отсутствует 1-АНС + а,(отн.ед.) уабаин присутствует

Физиологическая 5,5+0,8 4,6+1,3

145 мМ KCl 7,3+1,3 5,9+1,4

Гипотоническая 1 2,9±0,1 2,8+0,4

Гипотоническая 2 4,2±0,7 4,1+0,2

Таблица 2. Зависимость отношения (1-АНС+НМ/1-АНС без ИМ) лимфоцитов от времени инкубации клеток с нейраминидазой (НМ).

(l-AHC+HM)/(1-АНС без НМ) + Д , п=10

Среда Время обработки нейраминидазой, часы

инкубации 0,5 от 1-го до 2-х от 2-х до 3-х от 3-х до 4-х

Физиологичес. 0,8+0,3 1,4±0,1 0,9±0,2 1,0±0,2

[КС1]=145мМ 0,6+0,6 1,0+0,2 1,2+0,2 0,9±0,3

Из таблицы видна зависимость 1-АНС лимфоцитов, от времени их инкубации с НМ, (табл.2). В среде изотонического р-ра хлористого калия НМ практически не изменяет 1-АНС лимфоцитов, а в физиологической среде 1-АНС лимфоцитов, обработанных НМ, сначала наблюдаются изменения 1-АНС, которые затем возвращаются к исходному значению.

Литературные данные, приведенные в нашей работе, свидетельствуют о роли МП в регуляции ряда физиологических функций многих клеток. Результаты наших экспериментов свидетельствуют о том, что ЙП управляет физиологическими функциями лимфоцитов, такими как РУО. Мы наблюдали сходные изменение МП лимфоцитов в ответ на действие НМ и действие среды 145 мМолярного КС1. На основании литературных данных и результатов этой работы можно сделать вывод о том, что процесс адаптации клеток к любому физико-химическому воздействию сопровождается изменением МП, его адаптацией к первоначальному значению или переходом на новый стабильный уровень. Уабаин и зонд ДСМ необратимо

нарушают процесс регуляции объема клеток, помещенных в гипотоническую среду, но уабаин не нарушают процесса регуляции МП. Эта особенность МП свидетельствует о том, что его восстановление служит основой для нормальной регуляции физиологических функций клеток. Восстановление МП клеток в ответ на гипотонический шок и действие токсических веществ (уабаин) свидетельствует о том, что жизнеспособность клеток сохраняется в экстремальных условиях. Можно предположить, что если нет восстановления МП, то клетка близка к гибели, и поэтому способность клеток восстанавливать НП можно определить как тест на-жизнеспособность.

Глава 6. ИЗМЕНЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЛИМФОЦИТОВ МЫШЕЙ В ПРОЦЕССАХ РАЗВИТИЯ ОБЩЕЙ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ПОВРЕЖДЕНИЕ И ИНДУЦИРОВАННЫЙ КАНЦЕРОГЕНЕЗ

На рис.5 представлены результаты опытов, свидетельствующие о зависимости I-AHC лимфоцитов мышей (МП) от времени, прошедшего со дня введения препаратов, индуцирующих процессы развития в организме ОРП и ИК. Поскольку I-AHC измеряет Ш лимфоцитов, можно сказать, что в первый период развития ОРП и ИК происходит кратковременная деполяризация мембран клеток (1-й день после инъекции), которая

о ч. РО

затем сменяется более^длительнои гиперполяризациеи, начиная с 3 по 8й, иногда и по 10й день. Затем наблюдается вторичная деполяризация (9-12и день) и стабилизация нового значения МП. Часть мышей после введения канцерогенов, была оставлена для проверки процента опухолевых изменений после воздействия. Эти изменения мы обнаружили у всех 100% оставленных мышей, индуцированных метилхолантреном и у 90% мышей, индуцированных уретаном. Наши результаты дают основание для утверждения, что на начальных этапах развития индуцированного канцерогенеза имеют место изменения МП лимфоцитов, характеризующие общую реакцию организма на повреждение. Максимум гиперполяризации наблюдается на. 5-7 день, что хорошо согласуется с исследованиями И.М.Тарасовой [1985]. Известно, что в организме животного, испытавшего повреждедение, происходит увеличение концентрации кортикоидных гормонов (А.Уайт,1981). В связи с этим, возможно, что полученная нами картина изменения Ш лимфоцитов.обусловлена ответом на корти-костероиды.

Рисунок 5.

Из наших экспериментов следует, что ОРП, характеризуется двухфазной зависимостью изменения МП лимфоцитов (рис.5), характерна и для самцов и для самок двух линий А и ВАЬВ/с, и' согласно результатам Тарасовой И.М./1985/, - и мышам линии С57ВЬ. Одинаковая реакция на ОРП возникает и в ответ на инъекцию косточкового масла и различные канцерогены. Таким образом, из полученных результатов следует вывод о том, что изменение МП лимфоцитов мышей разных линий и обоих полов в ответ на повреждение кожи и соединительной ткани происходит всегда и представляет собой общую реакцию организма на повреждение.

Кинетику регуляции объема в гипотонии исследовали с помощью фиксации их объема АНС. Результаты опытов представлены на рис.6: Кривые а) ОРП и б) ИК различаются начальной частью кинетических кривых: на 20 сек наблюдается максимум в случае ОРП и уменьшение набухания (включение регуляции) к 30 сек. Кривая в) контрольные мыши: первый максимум набухания наблюдается на 20 сек, следующий на

у -у у

2 и 4 минутах, а на 3 минутах имеет место минимум в отличие от первых двух случаев.

Была определена способность к регуляции объема и МП лимфоцитов мышей в состоянии ОРП, ИК и в контроле в сериях опытов. В табл. 3 представлены значения (ргипот набух/ РИЗот.)' где ^ - МП на6УХШ1Х в гипотонии клеток; и значения относительного изменения среднего

диаметра лимфоцитов ( 0 ) В табл. 4 представлены те же значения, что и в таб.3, для мышей 3х групп в состоянии "отрегулированного" объема клеток, фиксация через 6 мин после помещения клеток в гипотоническую среду: (»>гип отр / *>изот) и (0ГШ. отр Л>изот ).

Б, микрон

в.

8,5 8,0-7,5-7,06,5-

8,07,5-7,0+ 6,5-

8,5-8,0-7,57,0-6,5--

Б, микрон

"5 I Г

Б, микрон

Т"Т

5 день, 0РП

"5 I 5 5 5 У

Время,

мин

10

6 день, ИК

--^

1 7

-/

¥

Время, мин

Контроль

Рисунок 6.

Кинетика регуляции .объема тимоцитов, —> полученная методом фиксации объема клеток зондом АНС. а/ мыши в состоянии 0РП, 5-ый день после инъекции; б/ мыши в состоянии ИК, —■> /уретан/, 6-ои день после инъекции;

в/ контрольные мыши (Линия А).

"5 Г I 5 I 5 I У

Время, мин

То"

Таблица 3. Относительные значения МП и й лимфоцитов, набухших в гипотонии, по отношению к МП и 0 в в физиол.среде: (<р гип.набух./¡р изот) и (йгип.набух./Оизот.) для мышей трех разных групп, п -число случаев; л - доверит, интервал.

гип.наб./ю изот.) ± Д гип.наб./иизот.) ± д

тимоциты

п Контроль 11 ОРП п ИК

<р 15 1,28+0,33 15 1,14+0,26 18 1,32±0,35

О 20 1,11±0,06 17 1,10+0,07 21 1,11±0,07

спленоциты

<Р 4 1,28+0,30 5 1.26+0,27 18 1,18+0,22

0 8 1,11+0,05 6 1,10+0,05 21 1,12+0,04

Таблица 4. МП и 0 лимфоцитов в гипотонии в состоянии "отрегулированного" объема /6 мин. в гипотониии/, по отношению к этим характеристикам клеток в физиологической среде, для мышей трех разных групп, п - число случаев, по которым определяем среднее.

(и ГИП (□ гип отрег.Ле изот.) ± ь отрег. /иизот.) ± д

п Контроль п ОРП п ИК

тимоциты

9 7 0,81±0,26 7 0,76+0,18 10 0,83±0,19

Б 12 1,04+0,04 9 1,00+0,01 13 1,02+0,06

спленоциты

9 1 0,96+0,28 1 0,92±0,17 1 0,77±0,25

0 4 1,01+0,04 1 1,03+0,02 4 1,04+0,02

С целью выяснения различий в изменениях МП-лимфоцитов в ответ на действие нейраминидазы и уабаина у животных группы ОРП и группы ИК была выполнена серия экспериментов на мышах линии А с уретеном в качестве канцерогена, и физ. раствором - индуктором ОРП. Состояние Ж и ОРП исследовали в период гиперполяризации мембран клеток на 3-9 день после введения канцерогена и физ. раствора. Согласно нашим

данным НМ изменяет часть ЙП, обусловленную Доннановским распределением ионов, а уабаин отключает АТФ-зависимый ионный транспорт и

+ +

изменяет часть МП, обусловленную работой Иа , К -АТФазы. Помещение лимфоцитов в среду 145 гаМ хлористого калия нивелирует градиент по калию между клеткой и внешней средой. В таблице 5 представлены результаты выполненных экспериментов и среднеквадратичные отклонения ег, характеризующие, в данном случае, ширину распределения 1-АНС лимфоцитов разных животных в каждой группе, которые характеризуются разным физиологическим состоянием животных (ОРП,ИК, контроль) и физиологическим состоянием их клеток ("без воздействия", "+НМ", "+0У").

Таблица 5. МИ и 1-АНС тимоцитов мышей трех иследованных групп при воздействии на клетки нейраминидазы (НМ), уабаина (ОУ) и без воздействия (без возд.). Клетки инкубированы в физиологической среде и в изоосмотической среде, в которой Иа+ замещен на К+.

Характеристика среды инкубации клеток (1-АНС) + о-, отн. ед. МП, мВ

Контроль ОРП ИК

Физиологичес кая среда. без возд. 5,2+0,3 61,3 1 3,4+0,7 93,8 2 2,9+0,5 110 3

+. НМ 6,5±1,0 49,0 4 5,0±1,2 68,3 5 4,0±1,3 79,8 6

+ ОУ 4,3±1,5 74,2 7 4,1+1,2 77,8 8 2,7+0,6 118 9

Среда хлористого калия 145 мМ без возд. 6,9+1,0 46,2 10 6,7+1,7 47,6 11 5,4±0,9 59,1 12

+ НМ 7,1+2,1 45,0 13 5,8+1,0 55,0 14 5,3±1,9 61,2 15

+ ОУ 5,5+1,3 58,0 16 4,8±1,1 66,5 17 5,3+1,3 61,2 18

Анализ результатов таблицы 5 начнем с самой последней строки, когда тимоциты помещены в изоосмотическую среду хлористого калия и градиент по калию ликвидирован, кроме того, введенный в раствор уабаина отключил АТФ-зависимый транспорт. В этих условиях доля МП, зависящая от Доннановского распределения ионов, в основном К+, равна нулю. Из таблицы 5 следует, что оставшаяся доля МП с достаточной степенью точности одинаков в трех физиологических состояниях животных (равенство ГО в,квадратах N 16, N 17 и N 18). Этот Ш равен 60 мВ. Мы полагаем,что эта компонента определяется непосредственно метаболизмом клеток - разделением зарядов и на митохондриальных мембранах в процессах электронного транспорта за счет переноса протонов из внутренней среды митохондрий наружу в процессах окисления пластохинонов. Взаимосвязанность в клетке митохондриальных и плазматических мембран создает условия для разделения зарядов на плазматической мембране за счет метаболизма клетки. Таким образом, мы разделяем МП тимоцита на три составляющие: МП = М + А + К , где А -активная составляющая ИП, М - метаболическая, а К - Доннановская.

Рассмотрим значения МП лимфоцитов группы ИК. ЙПМ1д = ШТ и Шкз =.Ш1мд. Такие равенства значений МП в этой группе свидетельствуют в пользу того, что АТФ-зависимый, вклад в-Ш тимоцитов мышей группы ИК отсутствует:А=0. Ма,К-АТФаза не функционирует или неэлек-трогенна. МП лимфоцитов в состоянии ИК определяется только вкладом двух компонент: метаболической и Доннановской .В связи с этим ИМ не изменяет ИП клеток в отсутствии градиента по К+. Этот вывод согласуется с полученными ранее результатами (таблица 2).

Рассмотрим результаты таблицы 5, соответствующие физиологическому состоянию тимоцитов мышей групп "контроль" и "ОРП". Имеет место равенство ВП и (тимоциты в физиологической среде, когда активный транспорт ионов отключен). Различия 1-АНС клеток групп ОРП и "контроль" исчезают, если в клеточную суспензию добавлен уабаин и отключен активный транспорт. На основании этого результата можно сделать вывод о том, что различия в МП в состоянии ОРП и в контроле определяет АТФ-зависимая составляющая, которая в состоянии ОРП работает прямоэлектрогенно, а в состоянии "контроль" - обратноэлект-рогенно. Возможно, что ее электрогенность связана с конформацией фермента ИаД-АТФазы в мембране, которая может изменяться при действии на нее ряда факторов и возможно кортикоидов. НМ во всех случаях (ОРП, ИК, контроль) уменьшает НИ за счет "стрижки гликокаликса" (строка 2 табл.5, N 4, N 5 и N 6). Мы полагаем, что гликокаликс выполняет в клетке функцию своеобразного слоя Гельмгольца, калийно

го буфера, и не дает К , вышедшему из клетки по градиенту химического потенциала, далеко уйти от нее. Как только целостность глико-каликса нарушается, поток К+ из клетки увеличивается. Как видно из таблицы 5,доля МП7 обусловленная разделением ионов К+ между клеткой и средой, зависит от состояния гликокаликса клеток. Удаление части глккокаликса НЫ-зой приводит к уменьшению Mil клеток во всех трех состояниях жизнедеятельности животных (ОРП, ИК, контроль), строка 2 табл.5. Причем эффективней всего НМ действует на тимоциты контрольных животных: (практически одинаковые значения МП N 4, МП N 10 и МГ1 N 13). А в ОРП (N 5 и N 14) "стрижка" гликокаликса уменьшает вклад в 1 за счет градиента ионов К+ на ~ 70%. В состоянии ИК (N 6 и N 15) воздействие НМ на тимоциты уменьшает вклад в МП за счет градиента по К+ на 76%. Таким образом, гликокаликс лимфоцитов в разных состояниях жизнедеятельности организма различно реагирует на нейраминидазу.

Представленные данные свидетельствуют о том, что мембранный потенциал Т-лимфоцитов многокомпонентен. Он изменяется в разных физиологических состояниях животных. Метаболический потенциал представляет собой одну из компонент суммарного МП, и по нашим данным не зависит от физиологического состояния организма,а активный транспорт и градиент по К+ различны в разных физиологических состояниях организма млекопитающего. Характер электрогенности работы Na.K-АТФ-азк различает состояния ОРП, контроль и ИК.

На рис.7 представлена эквивалентная электрическая схема плазматической мембраны лимфоцита, которая описывает экспериментальные данные таблицы 5.

U

М

А

Рисунок 7. Эквивалентная схема плазматической мембраны лимфоцита: С - емкость мембраны, М - разделение заряда на мембране за счет окислительно-восстановительных реакций при работе митохондрий; А - разделение зарядов за счет АТФ-зависимого транспорта ионов; К - Доннановское распределение ионов; МП - мембр потенциал.

Таким образом, выполненное исследование показало, что мембранный потенциал Т-лимфоцита различен в разных физиологических состояниях организма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании результатов выполненного исследования и результатов ряда работ других авторов следует вывод о том, что несколько биофизических характеристик лимфоцитов могут быть использованы для оценки физиологического состояния как самих клеток, так и организма их хозяина.

Известно, что соединительная ткань организма, к которой относятся и клетки крови, образует с клетками эпителия комплекс - ба-зальную систему, которая объединяет все клетки и органы организма, в том числе и лимфоидные, в единую систему [Заварзин]. Созревание и дифференцировка лимфоцитов в лимфоидных органах происходит при непосредственном контакте их с эпителиальными клетками тимуса [Миллер,1967]. Исследование изменения МП лимфоцитов, клеток непосредственно неповрежденных, свободно циркулирующих в организме, при повреждении проводящей системы животного - базальной системы -представляет несомненный интерес, как и изучение электрической системы регуляции процессов жизнедеятельности высших растений - сим-пласта растений [Зацепина, Цаплев;1980].

Полученные результаты свидетельствуют о том, что МП Т-лимфоцитов изменяется при изменении физиологического состояния организма и изменяется в процессе адаптации клеток к изменившимся условиям окружающей их среды. На основании этих результатов можно сделать вывод о том, что процесс адаптации целого организма состоит в адаптации каждой его клетки, в адаптации мембранного потенциала плазматической мембраны каждой клетки.

выводы

1. Разработаны два новых метода исследования кинетики регуляции объема клеток в гипотонической среде.

2. Показано, что лимфоциты и тимуса и селезенки регулируют об'ем в гипотонической среде.

3. Показано, что кинетика изменения среднего мембранного потенциала лимфоцитов в процессах регуляции объема клеток в гипотонической среде синхронна с кинетикой изменения объема.

4. В результате исследования зависимости интенсивности флюоресценции АНС лимфоцитов от концентрации К+, С1~ и осмотического давления, показано, что интенсивность флюоресценции АНС зависит от концентрации как так и К+.

5. Показано, что разные физиологические состояния организма (контроль, общая реакция на повреждение и индуцированный канцерогенез) различаются вкладом и электрогенностыо активного транспорта в мембранный потенциал и, следовательно, величиной мембранного потенциала:

а) обратноэлектрогенный активный транспорт в контроле уменьшает средний мембранный потенциал клеток;

б) прямоэлектрогенный активный транспорт в состоянии ОРП увеличивает средний мембранный потенциал клеток;

в) в состоянии ИК активный транспорт не дает вклада в средний мембранный потенциал лимфоцитов.

6. Показано, что фермент иейраминидаза уменьшает средний мембранный потенциал клеток в 1,4 раза во всех состояниях жизнедеятельности в физиологической среде инкубации клеток.

7. В ответ на действие ряда физико-химических факторов, таких как гипотонический и гипертонический шок, замена физиологической среды инкубации на среду 145-мМолярного хлористого калия, введение в среду фермента нейраминидазы, средний мембранный потенциал лимфоцита сначала изменяется, а потом, посредством квазипериодических изменений, адаптируется к исходному значению или переходит на новый уровень .

8. Показано, что за процесс адаптации мембранного потенциала лимфоцитов в ответ на указанные выше воздействия отвечает вариабельная часть среднего мембранного потенциала, а именно - АТФ-зависимая компонента и Доннановская, представленная непроникающей белковой компонентой клетки.

9. Показано, что в ответ на повреждение базалъной системы животных (подкожной инъекции) изменяются средние мембранные потенциалы плазматических мембран лимфоцитов тимуса и селезенки, они гиперполяризуются на 5-7 день после повреждения. Эти изменения не зависят от линии мышей, пола мышей, и от способа повреждения.

10. Обсуждаются механизмы адаптации клеток к указанным выше физико-химическим факторам.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. О.В. Цыплякова (Тарнопольская), Г.Н. Зацепина. Изменение постоянного электрического поля человека при иглоукалывании. Электронная обработка материалов, N 4, 1984 г., с.58-59.

2. Г.Н. Зацепина, Сон Чхол Хун, О.В. Тарнопольская. Кинетика осмо-регуляции лимфоцитов. Биофизика, 1988; т.33, 163 с. Деп. в ВИНИТИ, N 4304-В-87, 11с.

3. Г.Н. Зацепина, Сон Чхол Хун, О.В. Тарнопольская. Влияние 1-ани~ линонафталин-8-сульфсната на набухание лимфоцитов в гипотонической среде. Биофизика, 1988; т.33, 164с. Деп.в ВИНИТИ, N4295-8-87. 13с.

4. Г.Н. Зацепина,С.А. Егудина, О.В. Тарнопольская. Изменение адаптационной способности и кинетики_адаптации Т-лимфоцитов в гипотонии в патологических состояниях организма млекопитающих. Биофизика, 1992; т 37; с. 142-149.

5. Г.Н.Зацепина, Сон Чхол Хун, И.М.Тарасова, О.В.Тарнопольская Набухание лимфоцитов в гипотонических средах как критерий самых ранних стадий индуцированного канцерогенеза. 3-й Всероссийский онкологический съезд. Ростов-на-Дону,1986, Материалы съезда,с.548-549.

6. Г.Н. Зацепина. О.В. Тарнопольская. Изменения флюоресценции АКС и ДСМ, связанных с лимфоцитами, в процессе адаптации клеток к новому осмотическому давлению и ионному составу среды. 5-ая Всесоюзная межуниверситетская конференция "Биология клетки". Тбилиси, 1987 г., Труды конференции, т.1, с. 489-491.

2Я