Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение физиологического состояния клеток и иx мембранных потенциалов при изменении физико-химических факторов и изотопного состава воды

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменение физиологического состояния клеток и иx мембранных потенциалов при изменении физико-химических факторов и изотопного состава воды"

МОСКОВСКИЙ ордена ЛЕНИНА, ордена ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ и ордена ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА.

>гь од-

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

^ "' "' 1 на правах рукописи

Венгрус Татьяна Владиславна

Изменение физиологического состояния клеток и их мембранных потенциалов при изменении физико-химических факторов и изотопного состава воды.

03. 00. 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель: Доктор биологических наук,

кандидат физико-математических наук Г.Н. Зацепина

Официальные оппоненты: Доктор физико-математических наук

ВЛ. Намнот Кандидат физико-математических нау! Ю.Б. Цаплев

Ведущая организация : Институт химической физики, г. Москва Защита состоится "«¿9 " ^Юй^хи? 1994 г. в час.

на заседании специализированного совета N 3 ОФТТ (К.053. 05. 77) в МГ. им. М.В. Ломоносова по адресу:

119899 ГСП, Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физическоп факультета МГУ.

Автореферат разослан

1994 года.

Ученый секретарь специачизированного совета кандидат физико-математических наук

/Т.М. Козлова/

Обшая характеристика работы.

Актуальность. Механизм взаимосвязи отдельно циркулирующих в организме клеток - клеток крови,- с целым организмом представляет собой актуальную проблему современной биофизики и медицины. В связи с этим представляет интерес анализ концепции биоэлектрической системы регуляции процессов жизнедеятельности, развиваемой Зацепиной Г. Н. с соавторами.

Ранее Зацепиной Г.Н. с соавторами было показано, что изменения распределения разностей электрических потенциалов по коже млекопитающего и изменения мембранных потенциалов лимфоцитов взаимосвязаны. Однако, можно предположить, что лимфоциты - клетки имунной системы, выполняют в организме специфическую функцию и именно ею обусловлена эта взаимосвязь.

В связи с этим представляло интерес сравнительное исследование изменения мембранных потенциалов клеток, выполняющих принципиально различные функции в организме - лимфоцитов и эритроцитов,- в разных состояниях жизнедеятельности организма и их изменений in vitro при действии на клетки различных физико-химических факторов.

Клетки функционируют в естественной воде, в которой кроме Н2О содержатся и другие изотопы воды. Представляет интерес выяснение роли различных изотопов молекул воды в процессах жизнедеятельности клетки и организма. Наше исследование роли изотопного состава молекулы воды мы начали с DiO.Известно из литературы, что малые концентрации D2O активируют все процессы жизнедеятельности клеток, в том числе и процессы их роста и деления. Большие же концентрации D2O оказывают на клетки ингибирующее действие.

В связи с этим одновременное исследование действия DiO на физиологическое состояние клеток, их электрические характеристики и внутриклеточное рН представляет несомненный интерес.

В качестве различных физиологических состояний организма были выбраны : 1) состояние организма, в котором развивается общая реакция организма на повреждение (ОРП) в ответ на однократное подкожное введение физраствора или косточкового масла, 2) индуцированный канцерогенез, вызванный однократной инъекцией канцерогена в том же растворителе, 3) состояние "контроль" - здоровые животные.

В работе были исследованы способности эритроцитов и лимфоцитов мышей адаптироваться к изменению условий внешней среды in vitro -тоничности среды, и действию уабаина ( ингибитора активного транспорта

нонов (Ка/К-АТФазы)), в средах разного изотопного состава в разных состояниях жизнедеятельности организма.

Цель работы состояла в исследовании действия различных физико-химических факторов и изотопного состава воды на электрическую систему регуляции процессов жизнедеятельности клеток крови.

Научная новизна.

1) Выполненные исследования показали, что значения среднего мембранного потенциала эритроцитов и лимфоцитов мышей различны в разных состояниях жизнедеятельности организма и изменяются аналогичным образом в ответ на изменение внешних условий.

2) Показано, что значения внутриклеточного рН и мембранного потенциала лимфоцитов связаны между собой линейной зависимостью в разных состояниях жизнедеятельности организма.

3) Показано, что внутриклеточное рН лимфоцитов регулируется в гипотонической среде. Кинетики регуляции этого параметра существенно различны в трех различных состояниях жизнедеятельности организма.

4) Показано, что значения среднего мембранного потенциала лимфоцитов в различных состояниях жизнедеятельности изменяются при изменении изотопного состава воды.

5) Обнаружено, что калибровочные кривые флюоресценции зонда ВСЕСИ при различных рН различны в средах Н2О, 1% 020 и 100% Б20.

6) Показано, что внутриклеточное рН сдвигается в кислую сторону в 1% Б20 и в шелочную сторону в 100% Б20 для клеток в трех разных состояниях жизнедеятельности.

7) Малые концентрации Б20 переводят состояния контроля и ОРП друг в друга.

8) Большие концентрации В20 нивелируют различия в состояниях контроля и ОРП.

9) Состояние ИК автономно, и его не удалось перевести ни в какое другое состояние посредством используемых нами воздействий.

10) На основании выполненного исследования кинетик регуляции мембранных потенциалов, диаметров и рН клеток в условиях гипотонии в средах разного изотопного состава с уабаином и без него сделан вывод, что адаптационные способности клеток определяются значением их среднего мембранного потенциала.

11) Выполнен сравнительный анализ влияния уабаина и Б20 на нативную клетку.

Практическое значение работы. ^Полученные в работе различия значений мембранных потенциало'в^и внутриклеточных рН лимфоцтов и

эритроцитов в процессах их адаптации к действию различных физико-химических факторов в разных физиологических состояниях млекопитающего позволяет осуществлять диагностику состояния млекопитающего.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего ЛЯО источников. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит 3S рисунков и Ч таблиц.

Апробация работы. Материалы диссертации неоднократно докладывались на научном семинаре кафедры биофизики физического факультета, а также на международном симпозиуме "Биологическая подвижность" в г. Путцино 25 сент.-1 окт. 1994г., на международном симпозиуме "Progress in Biomedical Optics" в Лос-Анджелисе (Калифорния) 24-26 января 1994г. и на европейском симпозиуме "Biomedical Optics" в Лиле (Франция) 6-10 сентября 1994г.

Публикация результатов. Основные результаты работы изложены в 4 печатных работах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлены литературные данные по следующим вопросам: I) Электрическая система регуляции процессов жизнедеятельности клеток. 2) Морфология и функции эритроцитов и лимфоцитов в организме, изменения размеров клеток в условиях стресса. 3)Представления о мембранном потенциале клетки. 4) Связь мембранного потенциала и внутриклеточного рН клеток. 5) Влияние тяжелой воды на клеточные структуры и на нативную клетку. 6) Регуляция объема эритроцитов и лимфоцитов в гипотонических условиях.

Во второй главе описаны материалы и методы, используемые в экспериментах, включая уточнения и дополнения к широко используемому методу измерения внутриклеточного рН с помощью рН-чувствительного зонда BCECF для сред различного изотопного состава. Обоснован выбор концентрации красителя АНС для использования его в суспензиях эритроцитов и лимфоцитов при измерении мембранных потенциалов клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Объекты исследования - лимфоциты тимуса и эритроциты мышей линии Balb/с.Мыши линии Balb/c чувствительны к возникновению сарком при однократном введении метилхолонтрена (Уманский Ю.А., 1982).

з

Модели физиологического состояния организма были разработаны в работах Зацепиной Г.Н. и Тарасовой И.М. /1985 г./. Это общая реакция на повреждение (ОРП), индуцированный канцерогенез (ИК) на фоне той же ОРП и контроль - здоровые, интакгаые животные.

При исследовании особенностей изменений МП и pH в процессах развития ИК и ОРП животных одного веса и возраста делили на три разные группы. Первой группе мышей однократно вводили под кожу 0.2 мл косточкового масла или физраствора - группа ОРП. Второй группе однократно вводили под кожу 0.2 мл метилхолонтрена в дозе 1 мг на 1 г веса мыши. Третьей группе мышей препаратов не вводили.

Способ получения суспензий лимфоцитов и эритроцитов. Лимфоциты выделяли из организма животного стандартным способом (Фримель,1984). Среда инкубации сотояла из физиологического раствора, стабилизированного фосфатным буфером, рН=7.2: (0.135 М NaCl, 0.01 М KCl с 10% фосфатным буфером). Иногда в качестве среды инкубации использовали белый безкарбонатный хенхс, стабилмзированый HEPES + HCl, рН=7.3.

Эритроциты выделяли из артериальной крови мышей в физиологический раствор, стабилизированный фосфатным буфером, рН=7.4. Клетки трижды отмывали по 5 мйн. при 3000xg.

Концентрацию клеток в суспензии доводили до (3+5)х106 кл/мл. Клетки хранили при температуре +2° С. Измерения МП выполняли при Т=22^-25° С, измерения pH - при Т=37° С.

Измерение диаметров и МП клеток. Диаметры и МП клеток изучали посредством световой и флюоресцентной микроскопии на флюоресцентном микроскопе ЛЮМАМ-И-3.

Диаметры лимфоцитов измеряли с помощью микрометрической сетки, вставленной в окуляр микроскопа во флюоресцентном свете, что позволяло проводить измерения диаметров одновременно с измерением интенсивности флюоресценции (1фЛ) каждой клетки и разделять живые клетки и мертвые по характеру свечения красителя в их мембранах.

Диаметры эритроцитов измеряли на телевизионном экране, увеличенные в 2000 раз при разрешающей способности 0.5 мкм с помощью передающей телевизионной камеры, изготовленной на основе фотоприемной полупроводниковой матрицы А1075 из кремниевых структур с зарядовой связью. Визуализация клеток в видимом свете позволила облегчить измерение диаметров клеток с одновременным отделением живых клеток от их теней.

МП клеток измеряли с помощью флюоресцентного красителя АНС. Флюоресценцию красителя возбуждали светом с максимумом интенсивности на длине волны 360 нм, а интенисивность флюоресценции АНС измеряли на длине волны 491 нм. Флюоресценцию измеряли с помощью фотоумножителя ФЭУ-79, на который подавали напряжение 2200 В. Диаметр диафрагмы, вырезающий пучок света от образца на ФЭУ был равен 1.5 мм. Фотометрирование клеток осуществляли путем помещения в поле зрения диафрагмы одной клетки вместе с фоновым свечением вокруг клетки, поскольку размеры как лимфоцита, так и эритроцита меньше, чем размер диафрагмы. Затем измеряли интенсивность свечения фона без клетки. Интенсивность флюоресценции клетки получхти как разность двух перечисленных измерений. Ток от ФЭУ постулат на усилитель тсха, собранный на операционном усилителе. Далее напряжение, пропорциональное току ФЭУ с выхода усилителя поступало на вход АЦП, выход которого был подключен к вводо-согласующему устройству, которое служило для ввода информации в компьютер APPLE-2.

Переход от значений интенсивности флюоресценции АНС к значениям мембранных потенциалов клеток осуществляли по формуле (Зацепина Г.Н.,1990): МП=А/1фл, где А - импирическая постоянная. Данная формула верна для случаев, когда в эксперименте не используются ингибиторы или разобщители окислительного фосфорилирования митохондрий и МП митохондрий можно считать постоянным.

Концентрации красителя состаатяли 40 и 60 мкМ для работы с лимфоцитами и эритроцитами соответственно.

Измерение внутриклеточного рН осуществляли в суспензии клеток на флюориметре в кювете объемом 1мл с помощью флюоресцентного зонда BCECF. Методика выполнения таких измерений приведена в работе (Thomas J.A., 1977). Флюоресценцию зонда возбуждали светом с длинами волн 420 нм и 495 нм, измерения флюоресценции зонда производили на длине волны 530 нм. Флюоресценцию клеток определяли как разность значений флюоресценций зонда, индуцированных на двух указанных длинах волн, что позволяло уменьшить погрешности, связанные с стслонен-.хлми в концентрации зонда, добавляемого в суспензию клеток и количеством клеток в суспензии.

Для измерения pHj сначала строили калибровочные кривые зависимости флюоресценции красителя от рН внутриклеточной среды, когда рН; строго соответствовало внешнему рН в калиевой среде, что достигали добавлением к клеткам нигерицина.

Калибровочные кривые в средах Н20, 1% Б20 и 100% Э20 оказались различными. Они представлены на рис. 1.

Полученный результат связан, по-видимому, с различиями в константах диссоциации молекул НОН, БОН (которая образуется в 1% Б20) И БОО.

Как видно из рисунка, калибровочная кривая в среде Б20 смещена относительно кривой в Н20 на 0.3 ед. рН в щелочную область. Константа диссоциации молекулы Б20 сдвинута по отношению к константе диссоциации молекулы Н2О на 0.4 ед. рН в щелочную область. В связи с этим, сдвиг калибровочной кривой в среде 020 связан с различием в константах диссоциации молекул Н20 и Б20 , так как все остальные условия в эксперименте были абсолютно одинаковы.

Сдвиг калибровочной кривой в 1% D20 в кислую область по отношению к Н20 можно, по аналогии в D20 , связать с различиями констант диссоциации молекул НОН и ООН.

Таким образом, полученные результаты показывают, что при измерении pH клеток в средах разного изотопного состава следует пользоваться независимыми калибровочными кривыми, полученными отдельно для каждой среды.

Используемые вещества. В работе использовали флюорресцентные красители АНС (1-анилинонафталин-8-сульфонат) фирмы "Serva" и BCECF -ацетоксиметиловый эфир (2'-7'-бис(карбоксиэтил)-5,б-карбоксифлюорес-ценн). Для исследования физико-химических характеристик клеток использовали следующие растворы: глюкозу, CaCl , NaCl, KCl, MgCl2 , KH2P04, Na2HP04 , HEPES, HCl, КОН. Все препараты отечественные, марки "ХЧ", кроме HEPES, который был производства фирмы "Serva". Для

22i

ноо

Рис. 1. Зависимость интенсивности флюоресценции BCECF от значений pH в средах Н20 (О), 196 D20 (*) и 100% D20 (D).

.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 pH

отключения работы Na/K-АТФозы клеток использовали уабаин в концентрации 10 мкМ фирмы "Serva", для построения калибровочных кривых при измерении внутриклеточного рН использовали нигерицин в концентрации. 10 мкг/мл фирмы "Serva". Время инкубации клеток с нигерицином составляло 15 минут.

Глава 3. СРЕДНИЙ МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ЛИМФОЦИТОВ И ЭРИТРОЦИТОВ МЫШЕЙ В РАЗНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ.

В данной главе были исследованы значения МП эритроцитов и лимфоцитов мышей в двух состояниях жизнедеятельности организма -состоянии конроля и ОРП.

Было показано (табл.1), что МП как эритроцитов, так и лимфоцитов различны в разных состояниях жизнедеятельности организма. Размеры клеток изменяются в соответствии с изменением их МП, средние диаметры как лимфоцитов, так и эритрошгтов увелшшваются с увеличением их МП при переходе из состояния контроля в состояние ОРП.

Таил. 1. Значения 1фЛ АНС и МП лимфоцитов и эритроцитов мышей в двух состояниях жизнедеятельности организма.

Контроль ОРП

1фл МП (мВ) 1фл МП (мВ)

лимфоциты 1.5 ± 0.28 60 ±9 0.66 ± 0.22 96 ± 10

эритроциты 0.722 ± 0.022 10 0.448 + 0.025 14

Эритроциты регулируют МП и диаметр в гипотонических условиях аналогично лимфоцитам. Кинетики регуляции МП и диаметров эритроцитов и лимфоцитов различны в двух состояниях жизнедеятельности организма, и аналогичны друг другу в каждом из состояний (рис.2).

Известно, что в процессе регуляторного уменьшения объема (РУО) клетки в гипотонических условиях имеет место изменение проницаемости мембран эритрошгтов и лимфоцитов для ионов К+ и С1". В случае лимфоцитов активируются Са-зависимые -каналы и независимо от них С1"-каналы. В случае эритроцитов активируется К+,С1- котранспорт, природа которого неясна. В обоих случаях мембрана гиперполяризуется из-

за выхода ионов К+ , вслед за которыми выходят ионы С1~ и мембрана деполяризуется.

Следует отметить, что в наших экспериментах гипотонический стресс

1:. (мин.)

юс

(мин.)

1фЛАНС (ж)

1ф„АНС (я)

0/0«,

1.1

1.0

1 00

80-

t. (мин.)

60-! !флАНС (ж)

0/0о

Т.08 1 .04 1 .00

бО^флАНС (я) 1-20 О/йо

т.ю -

1.00

1, (мин.)

Л г6 ч8

I, (мин.)

В)

Рис. 2. Регуляция 1фЛ АБС и диаметра эритроцитов (а,в) и лимфоцитов (б,г) контрольных мышей (а,б) и мышей группы ОРП (в,г).

(разведение суспензии клеток водой в два раза) выдерживали лишь 15-20% эритроцитов, что соответствует проценту молодых клеток в популяции. Из работ (М. Сапета, 1987) известно, что именно молодые эритроциты способны регулировать свой объем в гипотонических условиях. Результаты, полученные в данной главе, свидетелъсвуют о том, что средние мембранные потенциалы столь различных по функциям, выполняемым в организме,

з

клеток различны в разных состояниях жизнедеятельности и изменяются аналогичным образом в ответ на изменение внешних условий. Эти результаты соответствуют гипотезе однопарамегрической системы электрической регуляции в организме и свидетельствуют об общности этой концепции.

Глава 4. ИЗМЕНЕНИЕ рН КЛЕТОК В ТРЕХ СОСТОЯНИЯХ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗМА В СРЕДАХ РАЗНОЙ ТОНИЧНОСТИ.

На рис.3 представлена зависимость значение МП и рН; лимфоцитов в трех состояниях жизнедеятельности организма. Как видно из рисунка, наблюдается практически линейная зависимость между МП и pHj.

Кинетики регуляции рН, лимфоцитов в гипотонических условиях различны для трех состояний жизнедеятельности организма (рис.4). Из данных работ (Mahnensmith R.L., 1985, Dixon DA., 1989) можно предположить, что наблюдаемое защелачивание цитозоля клеток контроля связано с уходом протонов в саркоплазматический ретикулум (СПР) в обмен на ионы Са 2+.

Из данных работы (Olness S., 1986) можно предположить, что наблюдаемое в эксперименте закисление клеток в состоянии ИК связано с вькодом протонов из внутриклеточных депо с низким значением рН; =5.5 (возможно, лизосом).

Кинетика регуляции pHj клеток в состоянии ОРП является комбинацией двух вышеперечисленных кинетик.

Рис. 3. Значения МП и рН,

МП, (мВ)

120т

100 -

в трех состояниях организма в средах Н20 (О), 100% D20 (D) и 1% D20 OS).

Анализ приведенных данных показывает, что степень первоначального защелачивания и последующего закисления клеток в условиях гипотонии линейно зависит от начального значения рН;

ДрН;

Рис. 4. Кинетики изменения внутриклеточного рН лимфоцитов в состояниях - контроль (а), ОРП (б) и ИК (в).

На основании данных, представленных на рис. 1 и рис.3 и данных литературы процессы, происходящие в клетке в процессе РУО, и их взаимосвязь можно представить следующим образом:

Набухание - активация Са2+/2Н+ обмена из-за

уменьшения [ Са2+; ],

- разрушение микротрубочек,

- активация через некоторое время после начала

набухания С1 - каналов.

Увеличение [Са2+;] - активация К+ -каналов, - сокращение белков цитоскелета, - защелачивание цитозоля.

Увеличение рН, - активация К+-каналов, - разрушение микротрубочек, - структурирование микрофиламентов.

Активация К+-каналов - увеличение МП.

Увел1гчение МП - закисление.

Уменьшение рН; - сокращение цитоскелета, - инактивация К+-каналов, - уменьшение МП.

Время - инактивация С1- каналов.

Сокращение 1 цитоскелета - регуляция объема клетки, - увеличение [Са2+; ] и его уход во внутриклеточ-ные депо, возможно в обмен на протоны, что приведет к закислению цитозоля клетхи. - гидролиз АТФ в процессе сокращения микрофиламентов вызовет закисление клетки.

Регуляция объема клеток в состоянии ОРП является неполной (рис.1), а в состоянии ЙК отсутствует вообще (Зацепина Г.Н., 1990). Как следует из анализа данных, приведенных в этой главе и литературных данных, это может быть связано со значениями рН; в этих состояниях. В работе (СопйееЦБ 1.5., 1977) было показано, что увеличение [Са2+; ] в меньшей степени вызывает сокращение белков акгин-миозинового комплекса, при рН < 7.0 (состояние ОРП), если же рН=6.7, то сокращение белков вообще не происходит (значение рН близко к значению рН; в состоянии ИК). Следует отметить тот факт, что в то время как МП и объемы клеток в состояниях ОРП и ИК восстанавливаются лишь частично или вообще не восстанавливаются, восстановления рН; происходит в обоих состояниях. В работе (Оп'пяет Б., 1984) показано, что при рН;=6.9 в тимоцитах мышей начинает работать Ыа+ /Н+ обменник (Н+ выходят из клетки, входит в нее). В случае ИК р^ достигает значения 6.8, в случае ОРП - 7.0. Если обменник начинает работать, то рН; повышается и возвращается к исходному значению. В этом случае в клетке повысится концентрация На+, что может активировать На/К-АТФалу и привести к некоторой

гиперполяризации мембран. В случае ОРП мембранный потенциал действительно остается несколько выше исходного уровня. В состоянии ИК работа Ка/К-АТФалы не вносит вклад в создание МП (Зацепина Г.Н., 1990).

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что чем выше МП и ниже рН; клеток, тем хуже они адаптируются к гипотоническим условиям, что связано с ингибированием сократительной способности актин-миозинового комплекса при понижении рН;.

Глава 5. ВЛИЯНИЕ ИЗОТОПНОГО СОСТАВА ВОДЫ НА СПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК АДПТИПОВАТЬСЯ К ГИПОТОНИЧЕСКИМ

УСЛОВИЯМ.

Известно (Лобьпяев В.И., 1986), что тяжелая вода влияет на работу Иа/К-АТФазы и дыхательной цепи митохондрий. Следовательно Б20 может изменить вариабельную (зависящую от активного транспорта) и метаболическую (зависящую от работы митохондрий) составляющие МП клетки.

Наши исследования зависимости значений МП клеток от изотопного состава воды показали, что МП клеток контроля увеличивается, МП клеток в состоянии ОРП уменьшается , а МП клеток в состоянии ИК практически не изменяется при добавлении 020 в суспензию клеток.

В области малых концентраций ( до 5%) имеет место нелинейное изменение МП клеток контроля и ОРП с максимумом при [020]=0.5% (контроль) и минимумом при [020]=0.5-1% (ОРП). При концентрации Б20 порядка 1% МП клеток контроля изменяется до значения, близкого к значению МП клеток в состоянии ОРП, а МП клеток в состоянии ОРП приближается к значению МП клеток контроля (табл.2).

100% 020 нивелирует различия в значениях МП клеток ОРП и контроля и МП становятся близки к значению МП клеток контроля и ОРП при добавлении к ним уабаина, то есть при отключении активного

Табл.2. Значения мембранных потенциалов и внутриклеточных рН лимфоцитов в трех состояниях жизнедеятельности организма.

Н20 1%Ю20 100% Б2О

МП (мВ) РН; МП (мВ) РН; МП (мВ) рН!

К 61+12 7.23±0.05 98+10 7.02±0.04 8б±10 7.34+0.05

ОРП 96.5+10 7.05±0.06 63±12 7.0±0 04 74+10 7.3±0.06

ИК 112±10 6.91=0.04 115±8 6.85+0.03 106+6 7.22±0.06

транспорта.

Действительно, 100% Б20 отключает работу Иа/К-АТФазы (Лобышев В.И., 1986). Однако известно, что 100% БоО ингибирует работу дыхательной цепи митохондрий, что само может повлиять на величину МП клеток. Результаты наших исследований показывают, что Б20 изменяет лишь вариабельную составляющую МП клеток.

Изменения значений рН клеток в трех состояниях жизнедеятельности организма при замене Н20 на 1% и 100% Б^О представлены в табл. 2. Данные таблицы показывают, что рН клеток в 1% Б20 уменьшаются, а рН клеток в 100% Б20 увеличиваются во всех трех состояниях жизнедеятельности. По-видимому, это связано с активацией гидролиза АТФ Ка/К-АТФазой и дыхания в 1% П20, благодаря че,\гу увеличивается концентрация протонов в цитозоле клеток, и ингибированием этих процессов в 100% Б20. Защелачивание и закисление клеток в средах с большой и малой концентрацией различно для клеток в разных

состояниях жизнедеятельности.

Линейной зависимости не наблюдается между значениями МП и рН клеток при введении в среду Б20. Кинетики регуляции МП, рН и размеров клеток контроля и ОРП в среде, содержащей 1% Б20, свидетельствует о том, что эти состояния переходят друг в друга (рис.5 и 6). Кинетики регуляции перечисленных параметров клеток в контроле в Н20 и клеток в состоянии ОРП в 1% Б20 аналогичны друг другу, но амплитуды изменения МП и рН в процессе РУО меньше в случае ОРП, что связано, по-видимому, с более низким значением рН; в этом состоянии (рН=7.0) по сравнению с рН клеток в состоянии контроля в Н20 (рН=7.23). Кинетики регуляции МП, рН и диаметра клеток в состоянии контроля в 1) Б20 и клеток ОРП в Н2О абсолютно аналогичны друг другу и их начальные значения рН; и МП практически одинаковы. Кинетики регуляции рН; клеток ОРП и контроля в 100% Б20 имеют вид двуфазных кривых и аналогичны друг другу, как и их начальные значения рН; и МП.

Кинетики регуляции рН; клеток в состоянии ИК в средах с Б20 существенно отличаются от кинетик регуляции этого параметра в двух других состояниях. В 1% Б20 изменения рН вообще не происходит, в 100% Б20 происходит закисление щггозоля клеток (как и в Н20), но без последующего восстановления начального значения рН; . Возможно, это связано с тем, что при наблюдаемых в этом случае значениях рН; (порядка 7.2 ед.) не может активироваться Ш/Н обменншс.

МП. мВ

160 т

МП, мВ 160:

10 15 t, мин.

Рис. 5. Изменение мембранных потенциалов (МП), внутриклеточных рН (рШ) и диаметров (Б) лимфоцитов в состоянии "контроль" в средах Н20 (О) и 1% Б20 (□) в гипотонических условиях. Бо -диаметр клеток до гипотонии.

10, 15 t, мин.

Рис. 6. Изменение мембранных потенциалов (МП), внутриклеточных рН (рШ) и диаметров лимфоцитов в состоянии ОРП в средах Н20 (О) и 1% Б20 (□) в гипотонических условиях. Оо - диаметр клеток до пшотонии.

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что D20 изменяет физиологическое состояние клеток in vitro. Состояния ОРП и контроля обратимы и могут переходить друг в друга. Состояние ИК необратимо и оно не может быть переведено ни в какое другое состояние.

МП является тем параметром, который определяет физиологическое состояние клеток и их способность адаптироваться к гипотоническим условиям. Значение рН; может изменять лишь амплитуду изменения параметров в процессе РУО.

Глава 6. ВЛИЯНИЕ УАБАИНА И D20 НА НАТИВНУЮ КЛЕТКУ IN

VITRO.

В данной главе рассмотрено и проанализировано влияние D2O и уабаина на физиологическое состояние клеток in vitro в разных состояниях жизнедеятельности организма и на кинетику регуляции объема клеток в разл!гчных физиологических состояниях.

Показано, что уабаин, как и 100% D2O, вызывает защелачивание внутриклеточной среды. Кинетики защелачивания цитозоля клеток при добавлении уабаина одинаковы для клеток в трех состояниях жизнедеятельности организма. Если МП в процессе адаптации клеток к изменению изотопного состава воды или добавлению уабаина достигает значения порядка 80 мВ (через 10 минут после добавления уабаина), то pHj изменяется на 0,1 ед. в среде с уабаином; и на 0.15 ед. в контроле, на 0.3 ед. в ОРП и ИК в 100% D20.

Влияние уабаина на нативную клетку можно представить следующим образом.

1. Прекращается гидролиз АТФ ферментом (что приводит к защелачиванию цитозоля клетки) и накоплению АТФ, уменьшается концентрации внутриклеточных АДФ и Фн.

2. Имеет место ингибирование транслсказы адениновых нуклеотидов и переносчика фосфата в митохондриальной мембране.

3. В связи с накоплением АТФ, синтезированного Н+-АТФ-синтетазой митохондрий, в матриксе митохондрий ингибируется дальнейший синтез АТФ.

4. Ингибируется работа дыхательной цепи митохондрий, сопряженной с синтезом АТФ.

5. Прекращается выброс протонов за счет работы дыхательной цепи и наблюдается защелачивание внутриклеточной среды.

Различия в изменении рН клеток при добавлении уабаина и D2O позволяют предположить, что дыхательная цепь митохондрий в состояниях ОРП и ИК работает более интенсивно, но с меньшим КПД по сравнению с контролем.

Таким образом, в результате рассмотрения и анализа изменения рН клеток под действием уабаина в средах разного изотопного состава нами показано, что в 1% DjO имеет место различное защелачивание клеток при добавлении уабаина в состояниях ОРП и контроля. В состоянии ИК добавление уабаина в 1% D2O не изменяет рН клетки. В 100% D2O рН не изменяется во всех трех состояниях жизнедеятельности.

Показано, что влияние уабаина и D20 на кинетики регуляции рН клеток в гипотонических условиях различно в связи с тем, что D20 действует не только на работу Na/K-АТФззы, как уабаин, но и на дыхание митохондрий.

В процессе нашей работы мы получили 4 вида кинетических кривых регуляции pHj в гипотонических условиях в средах разного изотопного состава с уабаином и без него - две однофазные (защелачивание или закисление), двуфазная и отсутствие изменения pH¡ в гипотонических условиях. В таблице 3 и на рис. 7 приведены значения МП и pH¡ клеток для случаев, соответствующих перечисленным типам кинетик регуляции pH¡. Из таблице видно, что однофазная кинетика защелачивания цитозоля клетки соответствует состоянию клеток при pH¿ = 7.0-7.23 и МП = 60-78 мВ. Двуфазные кинетики отвечают состоянию клеток с теми же значениями pH¡, что и в предыдущем случае, но характеризующимся существенно большими значениями МП (96 мВ) или состоянию клеток со значениями pH¡ > 7.3 и МП = 74 - 86 мВ. Если же МП увеличивается в пределах 105 < МП <115 мВ, то наблюдается однофазная кинетика закисления цитозоля клетки при любых значениях pH¡. При значениях МП > 115 мВ pH¡ изменяется незначительно в гипотонических условиях.

Табл. 3. Типы кинетик изменения pH¡ клеток в разных физиологических состояниях.

рН МП (мВ) Состояние и среда инкубации Тип кинетики

7.23+0.05 61±12 К, Н-,0 Однофазная кинетика, защелачивание

7.0±0.04 63±12 ОРП. 1% D?0

7.15±0.04 78±12 ОРП, H->0+va

7.05+0.06 96±10 ОРП, Н-.0 Двуфазная кинетика

7.02±0.04 96±10 К. 1% D-,0

7.34±0.05 86110 К. D-,0

7.35±0.05 78+10 К, Н->0+ уа

7.34±0.04 78±10 ОРП. D->0+va

7.37±0.05 86±10 К. DiO-ь уа

7.34+0.06 • 74±10 ОРП, D-.0

6.91 ±0.03 11215 ИК. ЬЬО Однофазная, закисление

7.2210.04 106+8 ИК, 100% D-.0

6.85+0.03 115±3 ИК, \% D-iO Нет изменения рН

7.010.03 120±8 ИК. HiO+va |

МП. (мВ) 120-0-

100

80

4 3

га

ил

............о.......i

о

1

РН

Рис. 7. Значения мембранных потенциалов и рШ, соответствующие различным типам кинетик регуляции рНк I -защелачивание, 2 - двуфазная кинетика, 3 - зачисление, 4 -рШ не изменяется в процессе РУО.

.8 6.9 7.0 7.1 '7.7.3 7.4'

На основании результатов, представленных в таблице и на рисунке, можно сделать вывод о том, что юшетика изменения рН; в гипотонических условиях определяется практически только значением МП и эта зависимость строго отражает переход клеток из одного состояния жизнедеятельности в другое. Некоторая неоднозначность имеет место лишь при значениях МП около 80 мВ (где перекрываются зоны однофазной и двуфазной кинетик регуляции pHj). Это именно то значение МП, при котором нивелируются различия между состояниями контроля и ОРП. В этом случае тип кинетики регуляции pHj определяет начальное значение рН;.

Заключение.

На основании результатов данного исследования и работ других авторов следует вывод о том, что физиологическое состояние как клеток, так и организма определяется рядом биофизических характеристик клеток, крови (эритроцитов и лимфоцитов).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что МП и рН; клеток крови изменяются при изменении физиологического состояния организма и изменяется при адаптации клеток к измененившимся условиям окружающей среды, например при адаптации клеток к гипотонии. Адаптация клеток к изменившемуся внешнему фактору определяется начальным значением МП, а такой важный параметр как внутриклеточное рН определяет лишь амплитуду имзменений МП, pHj и объема клеток в процессе РУО.

Физиологическим состоянием клеток можно управлять in vitro, изменяя их МП.

О

На основании этих результатов можно сделать вывод о том, что различные физико-химические воздействия, изменяющие значение среднего мембранного потенциала клеток, изменяют и их физиологическое состояние. Адаптация целого организма к изменившимся условиям состоит в адапташиГмёмбранного потенциала каждой клетки к этим условиям, так как все клетки и органы данного организма объединены в единый комплекс базальной системой, которая образована соединительной тканью и клетками эпителия (Заварзин).

Выводы.

1. Показано, что средние мембранные потенциалы лимфоцитов и эритроцитов (клеток, которые выполняют существенно различные функции в многоклеточном организме) аналогично изменяются при переходе многоклеточного организма из одного состояния жизнедеятельности в другое.

2. Показано, что внутриклеточное рН различно в разных состояниях жизнедеятельности многоклеточного организма в физиологической среде, приготовленной на естественной воде.

3. Показано, что добавление в физиологический раствор 1% D20 и 100% D20 изменяют внутриклеточное рН. Наблюдается закисление в 1% D20 и защелачивание в 100% D20.

4. Показано, что калибровочные зависимости интенсивности флюоресценции зонда BCECF от рН внутриклеточной среды различны в Н20, 1% D20 и 100% D20. Высказано предположение о том, что данное различие обусловлено различиями в константах диссоциации молекул Н20, HOD и D20.

5. Обнаружено, что изменение внутриклеточного рН в процессе адаптации лимфоцитов к условиям гипотонии различно в разных состояниях жизнедеятельности млекопитающего. Предложено объяснение данного феномена.

6. В результате исследования процессов регуляции рН клеток в трех состояниях (контроль, ОРП, ИК), в средах разного изотопного состава, в присутствии и отсутствии уабаина было обнаружено четыре различных типа кинетик регуляции этого параметра: однофазное защелачивание, однофазное закисление клетки, двуфазная кинетика и отсутствие изменения рН;. Сделано предположение о том, что тип кинетики определяется только значением мембранного потенциала клетки в данном состоянии.

7. Показано, что средние мембранные потенциалы лимфоцитов могут изменяться in vitro в 1% D20. Средние мембранные потенциалы клеток

контроля трансформируются в средние мембранные потенциалы клеток в состоянии ОРП и наоборот. В 100% DjO средние мембранные потенциалы клеток контроля и ОРП одинаковы. Только в состоянии индуцированного канцерогенеза средний мембранный потенциал клеток не зависит от изотопного состава воды.

8. Показано, что добавление в суспензию клеток уабаина приводит к различному защелачиванию внутриклеточной среды лимфоцитов в каждом из трех состояний жизнедеятельности организма в зависимости от содержания D2O в инкубационной среде.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Г.Н. Зацепина, Т.В. Венгрус, Н.Н. Горюнов. Мембранные потенциалы и адаптационные способности лимфоцитов и эритроцитов в различных состояниях жизнедеятельности млекопитающего. Биофизика, 1993г., т.38, вып.6, стр. 1098-1103.

2. Т.В. Венгрус, Г.Н. Зацепина, М.Н. Крамской, Н.Н. Горюнов. Различные изменения среднего мембранного потенциала и объема Т-лимфоцитов мышей линии balb/c, находящихся в разных физиологических состояниях организма в средах с разным содержанием DoO. Биофизика, 1994г., т.39, вып. 1, стр. 116-121.

3. T.V. Vengrus, G.N. Zatsepina, S.V. Egudina, N.N. Goryunov and O.V. Tarnopolskaya. Diagnostics of phisiological states of organism by means of fluorescent measurement of membrane potential of blood cells. Procc. of Biochem. Diagnostic Inst rum., 24-26 Jan. 1994 Los Angeles, California, v. 2136, pp. 127133.

4. G.N. Zatsepina, N.N. Goryunov, S.V.Egudina, T.V.Kozina (Vengrus), O.V. Tarnopolskaya. The First World Congress for Electr. and Magnet, in Biol, and Med., 1992, Abs. P-339.