Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разделение ранних эмбрионов кроликов методом микроманипуляций с целью получения монозиготных близнецов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Клецко, Надежда Георгиевна

ВВЕДЕНИЕ.г.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. "Однояйцевые близнецы животных и методы их искусственного получения"

1.1. Однояйцевые близнецы сельскохозяйственных животных

1.2; Природа однояйцевых близнецов.II

1.3. Искусственное получение однояйцевых близнецов сельскохозяйственных животных методом микроманипуляций на эмбрионах.

2/ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Экспериментальные животные.

2.2. Извлечение эмбрионов.

2.3. Культивирование эмбрионов. 2.4. Изготовление микроинструментов

2.4.1. Микрокузница

2.4.2. Микропипетка универсальная

2.4.3. Микропипетка-держатель

2.4.4. Микропипетка-игла

2.4.5. Микропетля с постоянным диаметром

2.4.6. Микропетля: с изменяющимся диаметром.

2.4.7.' Универсальный держатель микроинструментов ■.

2.4.8. Механический шприц для микроприсосов

2.5. Перевязка двубластомерных эмбрионов кролика

2.6. Трансплантация перевязанных пополам эмбрионов кролика

2.7. Вазектомия самцов кролика.

2.8. Микрошотографирование эмбрионов.

3. ЭКСПЕРШ'ЖНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Развитие вне организма перевязанных пополам эмбрионов кролика.

3.2. Результаты трансплантации перевязанных пополам эмбрионов крольчихам-реципие нтам.

3.2.1.Трансплантация перевязанных пополам двубластомерных эмбрионов

3.2.2.Трансплантация перевязанных пополам ранних морул

3.3. Зоотехническая характеристика кроликов, полученных из половин эмбрионов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разделение ранних эмбрионов кроликов методом микроманипуляций с целью получения монозиготных близнецов"

В решении Продовольственной программы, предусматриваадей значительное повышение производства продуктов животноводства, большая роль отводится сельскохозяйственной науке. Наряду с традиционно разрабатываемыми вопросами зоотехнии , интенсифицируются исследования по биотехнологии, активно использующей достижения современной биологии«

В последнее десятилетие большие успехи достигнуты в совершенствовании метода трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных, открывающего реальную возможность повышения уровня генетического влияния на популяции животных-рекордистов. Появились способы определения пола эмбрионов. Создана технология их криоконсервации, позволяющая создать банк генетически ценных эмбрионов, В развитие этого поставлена задача разработки методов клонирования эмбрионов с целью копирования генотипов высокопродуктивных животных.^ Прогресс исследований в данном направлении обусловлен открытием принципиальной возможности получения генетически идентичных животных при разделении их эмбрионов методами микроманипуляций на две или несколько частей, способных при создании определенных условий развиваться в самостоятельную особь. Таким путем уже получены однояйцевые близнецы крупного рогатого скота и овец. Эти методы, однако, еще не стали достоянием практики животноводства. В связи с этим, актуальна дальнейшая разработка микроманицуляционной техники и приемов микроопераций на эмбрионах различных видов сельскохозяйственных животных.

Настоящая работа посвящена совершенствованию техники микроманипуляций на эмбрионах млекопитающих для целей клонирования. Ставилась задача разработать способ перевязки ранних эмбрионов кроликов для получения животных из половин эмбрионов.

Исследование выполнено в соответствии с Государственным планом по решению научно-технической проблемы: "Усовершенствовать системы селекционной работы и повышения продуктивности сельскохозяйственных животных с использованием молекулярно-генетических иммунологических и физиолого-биохимических методов исследований и ЭВМ, № 81103329".

По результатам исследований опубликовано 4 печатные работы и выполнено 5 рационализаторских предложений по ВИЖу.

Материалы диссертации доложены и одобрены: на Втором Всесоюзном симпозиуме по иммунологии воспроизведения (1980 г), на 36-й научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВИЖа (1983 г), на объединенной конференции отдела генетики сельскохозяйственных животных ВИЖа (1984 г), на объединенной конференции отдела биофизики клетки института биофизики Ш СССР (1984 г).

Работа премирована на смотре НТО молодежи (1982 г).

Разработка метода перевязки эмбрионов; впервые обеспечившего получение высших животных, однояйцевых близнецов кроликов из разобщенных лигатурой бластомеров, выносится на защиту;

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Однояйцевые близнецы животных и методы их искусственного получения ь

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Клецко, Надежда Георгиевна

ВЫВОДЫ

1. Ранние эмбрионы кроликов перевязаны пополам синтетической нитью с использованием микроманипуляционной техники или вручную без нарушения целостности их оболочек и внутренних структур.

2. Методом культивирования установлено, что перевязанные пополам синтетической нитью ранние эмбрионы кроликов сохраняют способность к дроблению, которое синхронно или асинхронно происходит в разобщенных его частях.

3. Трансплантацией перевязанных синтетической нитью эмбрионов (от 2-х бластомеров до ранних морул) кроликов крольчихам-реципиентам получены крольчата, происходящие из половин эмбрионов, в том числе однояйцевые близнецы.

Крольчата из перевязанных пополам эмбрионов получены в составе собственного потомства крольчихи-реципиента, если она покрывалась нормальным самцом и индивидуально, если она спаривалась с вазектомированным самцом.

4. Кролики, полученные методом трансплантации из половин разделенных перевязыванием ранних эмбрионов, йенотипически нормальны, развиваются и имеют плодовитость как животные, рожденные естественным путем,

5. Для проведения микромашшуляций с ранними эмбрионами кроликов пригодны микроинструменты: микропипетка-игла, микропипетка-держатель, микропипетка универсальная, выполненные из стекла, молибденового, "пирекс" и ДГ-2.

ПРАКТИЧЕСЖИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработан комплекс микроинструментов и технология их изготовления, которые могут быть использованы для выполнения микроманипуляций с эмбрионами животных.

2. Метод перевязки ранних эмбрионов можно использовать в научных целях для получения однояйцевых близнецов кроликов.

Автор выражает благодарность сотруднику института биофизики АН СССР В.А.Никитину за помощь в освоении микроманипуляционной техники, микроминиатюристу Н.С.Сядристому за предоставление нити, при помощи которой выполнялась перевязка эмбрионов.

Автор признателен сотрудникам отдела генетики сельскохозяйственных животных ВЙЖа и сотрудникам отдела биофизики клетки института биофизики АН СССР за обсуждение, замечания и советы при выполнении настоящей работы.

I. Аракелян М.А.

2. Арзуманян Е.А.

3. Вагонжс 3., Тарвидас А.

4. Венге 0.

5, Гольдман ИД,

6. Гольдман И,Л,, Клинский Ю.Д., Сергеев Н,И,

7, Гольдман И.Л., Эрнст Л.К., Живалев И,К,

8. Завадовский М.М.

9. Завертяев Б,П. 10, Зоранян В.А.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Клецко, Надежда Георгиевна, Дубровицы

1. Руткис З.А., Бех^гина В.Г.

2. Сергеев Н.Й., Некрасов А., Овчинников А., Букарова В.И., Смыслова H.A.29. Фонбрюн П.30. Хеммонд Д.

3. Эрнст Л.К*, Макарова З.Н., Голубев А.К., Томская Л.Н.

4. Химеры млекопитающих, М., Мир, 1979, с. 1-176 .

5. Отелы двойнями у коров молочного направления. Вестник с/х науки, 1965 г., № 2, с. 87-89.

6. Фотореценсурный справочник, М., 1958, с. 163.

7. Эмбриональные парабиозы и многоплодие сельскохозяйственных животных. Труды института морфологии животных им. Северце-ва, АН СССР, 1955, с. 14.

8. Роль предзародышевого периода развития в изменчивости близнецов млекопитающих. В кн."Внутривидовая изменчивость в онтогенезе животных", Наука, М., 1980, с. 177-180.

9. Культивирование яйцеклеток млекопитающих как модель для изучения физикобиохи-мических условий, обеспечивающих их жизнеспособность и дальнейшее развитие эмбрионов. Сб.научн.трудов ВИРГ&а, 1976, вып. 23, с. 82-89.

10. Суперовуляция, получение, криоконсерви-рование и пересадка эмбрионов крупного рогатого скота. Животноводство, 1983, 10

11. Методы микроманипуляций. М., 1951, с. 1-167.

12. Биологические проблемы животноводства. М., Колос, 1964, с. 56.

13. Разделение эмбрионов на бластомеры и культивирование их Г п V11 г 0 . Докл.-ВАСХНИЛ, 1979, !Ь II, с. 26-29.32. Эрнст Л.К., Чемм В,А.

14. Binkerd P.S. Anderson G.B.34. Brem G. Kräusslich H.

15. Szilvassy B. Kruff B. Lampeter W. Graf F.

16. Brem G. Kruff B. Szilvassy B.36. Brinster R.L.37. Brinster R.L.38. Gohrs P.39. Daniel J.40. Donasoury Ы.С.1. Driesch H.- Современные методы совершенствования молочного скота. М., Колос, 1972, с. 130.

17. Studies on the development of mouse embry-0s in vitro. II The sffect of energy sourse J.Exp.Zool.,1965, v.158, HI,p.34-40

18. Culture of two-cell rebbit embryos to moru-lae. J.Reprod.and Pert.,1970, v.21,KI,p.17-23.

19. Eineiige Zwillinge bei Schaf und Schweinundzweiige, aber monofollikulare Zwillingebeim Schaf.Berl.Tierarzttl.Wocheschr.,1934, v.39, s.611-645.-Culture of rebbit embryo in circulating medium. Nature, 1970, v.225, H5228,p.193-194

20. Gestation period, twinning and sex ratio.in grossbred cattle in the Sudan, J.Anim. Product. U.A.R., v.2, H2, I67-I68, 1962-Entwicklungsmechanische Studien.I. Der

21. Werth der beiden ersten Furdmugszellen inder Echinodetermentwicklung.Z.wiss.Zool., I89I.,1T53, s.160-178.42. Dunn H.1. Mc Entee K.1. Johnsen R.1. Stone W. Hall C.1. Enders A.C.44. Fischer J.45. Gedada L.46. Herweijr C.H.

22. Holtz W. Haring F. Smidt D.48. Kane M.T.49. Kane ffi.T. Foot R.H.- Cytogenetic and reproductive studies of bulls born cotwin with freematins. 2T. Reprod.

23. Kille J.W. The influence of oviducal fluid on thecell rebbit embryos in vitro.

24. J.Reprod.Fertil.,1973, v.35,113,415-423.

25. Versuche mit gleichgeschlechtlichen (ein eiigen) Rinder Drillingen. Züchtungskunde, 1965, B 37, K4,s.154-174 .51. Krüger L. Keger F.

26. Massip A. Atipical hatching of a cov,- blastocyst non der Zv/almen P. leading to separation of complete twin Mulnard J. hall blastocysts. Vet.Rec.,1983, v.112, Zwysen w. N13, p. 3oI.

27. Mauer R. Viability of culturred and transfered Unuma U. rebbit embryos. Reprod. Fertil.,1970,

28. Foot R. v.2I, N3, p.417-422.

29. Meinecke-Tillmann S. Möglichkeiten and Grenzen der microma-Meinecke B. nipulation embryonaler Furchungsstadienlandwirtschaftlicher Nutztiere dargestellt am Modell artifizill monozygotz Zwillinge beim Schaf. Zbl.Vut.Med., 1983, A30, s.146-153.

30. Thephysiology of twinning. Chicago, 1923, p.23.59. Nicholas J.S. Hall B.V.

31. Experiments on developing rats II. The development of isolated blastomeres and fused eggs. J.Exp. Zool.,1942, v.90,p.441.

32. Ogawa S, Saton H. Hashimoto H.1. vitro culture of rebbit ova from the single cell to the blastocyst stage. Eature, v.233, p.422-424. 19716I. Osterhoff D.R.

33. Sind Zwillinge beim Rind, Tierzuchter, I960, v.I2, H2, s.537-539.62. Ozil J.P.

34. Production of identical twins by bisection of blastocysts in the cow. J.Repr. Pert., 1983, v.69, 13,463-468.

35. Ozil J.P. Heyman J. Renard S.U.- Production of monozigotic tv/ins by micromanipulation and cervical transfer in1982the cow. Vet.Recov. ,vV. HQ, H6, p. 126-12'64. Patterson J. T.

36. Poliembryonie development in Tatusia novemcincta, J.Korph.,1913, v.24,p.559-662.65. Piesbergen H.

37. Blutuntersuchungen an eineiigen Rinderdrillingen. üiss.,1956, s.97.66. Roberts S.J.

38. Veterinary obstetrics and genital.didi-seases. Theriogenology, v.7,p.776. 197767. Schermer S.- Eineiige Zwillinge beim Pferd. Züchtungskunde, 1936, v.II, s.395 -401.68. Seidel P.69. Seidel F.70. Speman H.71. Swett W.W.72. Tarkowski A.K

39. Tarkowski A.K. Wroblewska J.74. Trounson A.O. Moore H.W.• Die Entwicklungspotenzen iener isolierten Blastomere des Zweistellenstadiumsim Säugetirei. Naturwissenschaften, 1952 v.39, s.355.

40. Die Entwicksfähigkeiten isolierten Fur-hungszellen aus dem Ei des Kaninches. W.Roux. Arch. Entw.Mech.Org. I960,v.152, s. 43-130.• Entwicklungsphysiologische Studien am Tritone. W.Roux.Arch.Entw.riech.Org., I90I.U2, 224-264.

41. Early recognition of the freemartin conditionin heifers twin born with bull. J.Agric.,1940,587-624.• Experiments on developing rats II. The development of isolated blastomeres and fused eggs. J. Exp. Zool. 1942,v.90,s.44

42. A metod for culture of micromanipu-lated sheep embryos and its use to produce monozygotic twins.Nature, 1979, v.277, 298-300.

43. Willadsen S.M. Lehn Jensan H, Fehelly C.B. Hewcomb R.

44. The production of monozygotic twins of preselected parentage by micromanipulation of.non-surgically collected cow embryos. Theriogenology, I98I,v.I5. UI, s.23-29.77. Willadsen.S.M. Godke R.A.

45. A simple procedure for the production of identical sheep twins.Vet. Rec.,198/v.114,H10,p.240-243.

46. Зав. центра трансплантации д.б.н.1. Н.И.Сергеев9. Ю- М*

47. Зав.отделом трансплантациии<Х /1. Кононов Г.А.о'рЩичную ПОДПИСЬ ~ удостовер я ю1. Нач. ОК ВИИИРГЖ