Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические методы интенсификации воспроизводства молочного и мясного скота

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические методы интенсификации воспроизводства молочного и мясного скота"

На правах рукописи

БАБЕНКОВ ВЛАДИМИР ЮРЬЕВИЧ

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ВОСПРОИЗВОДСТВА МОЛОЧНОГО И МЯСНОГО СКОТА

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Дубровицы - 2004

Работа выполнена во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Научный консультант - Заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор биологических наук, профессор Ю.Д.Клннский.

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук,

профессор Марзанов Н. С.;

- доктор биологических наук, профессор Ерохин А.С.;

- доктор биологических наук,

Рябых В.П.

Ведущее учреждение — РАМЖ

Защита диссертации состоится " ^^_2004 г. в 10 часов

на заседании диссертационного Совета Д 006.013.01 во Всероссийском государственном НИИ животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ВИЖ

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В результате углубленных исследований в области эмбриологии млекопитающих стало возможным внедрение в практику воспроизводства сельскохозяйственных животных метода трансплантации эмбрионов, как важнейшего средства ускорения качественного улучшения и более полного использования генетических ресурсов маточного поголовья молочного и мясного скота.

В биотехнологии ускоренного размножения высокоценных племенных животных трансплантация эмбрионов является наиболее апробированным на практике методом. Подтверждением этому служат успехи в создании высокопродуктивного молочного скота в странах Северной Америки и Европы, где до 70% быков-производителей, используемых для качественного улучшения стада, получены путем пересадки зародышей. Тем не менее, потенциальные возможности трансплантации эмбрионов в практике воспроизводства используются далеко не полностью.

Среди основных причин недостаточной реализации метода являются такие факторы экономического характера, как высокая стоимость работ, низкие цены на племенной скот, ограниченные ресурсы высокопродуктивных животных, а также многие биологические и технологические факторы, связанные с эффективностью использования метода в условиях производства.

В технологии трансплантации эмбрионов индукция полиовуляции является звеном, от эффективности которого в большой степени зависит конечный результат. В этой области накоплен обширный материал. До настоящего времени вызывание суперовуляции остается нестабильным и малоизученным вопросом. Большое практическое значение имеют разработки упрощенных схем гормональной обработки, поиск надежных и эффективных веществ пролонгирующего действия.

Эффективность практического применения метода трансплантации эмбрионов существенно возрастает при использовании высокопродуктивных коров в качестве доноров эмбрионов в несколько раз в год. Однако данные о влиянии на реакцию яичников и состояние матки коров многократных гормональных обработок и повторных процедур извлечения эмбрионов носят разноречивый характер.

Результаты многочисленных исследований показывают, что основным недостатком инструментов, используемых для пересадки эмбрионов, является определенный предел доступной глубины рога матки вследствие его кривизны. По мнению многих исследователей, при нехирургической пересадке верхушка рога матки, недоступная для катетера Кассу, хотя она является наиболее оптимальным местом для аппликации зародыша [Critser J.K., Rowe R.F., 1979, 1980; Newcomb R., 1985; Овчинников А.В., 1985 и др.]. Поэтому дальнейшие разработки инструментария и сопутствующих технологических фрагментов по-прежнему остаются актуальными.

Одним из резервов увеличения производства молока и мяса является повышение выхода телят за счет получения

яос национальная)

БИБЛИОТЕКА I СПетервургЛ/л I

оэ

методами. Несмотря на потенциальные экономические возможности, объем исследований по получению двоен и межпородной пересадке у крупнопо рогатого скота изучен недостаточен.

Существенный прогресс достигнут в области криоконсервирования эмбрионов. Однако жизнеспособность эмбрионов после криоконсервации существенно снижается. Поэтому большое значение имеет решение ряда вопросов, связанных с обеспечением стабильности получаемых результатов, поиск новых, менее токсичных и эффективных криофилактиков, упрощение технологии крио- и деконсервации применительно к условиям производства.

Внедрение метода трансплантации эмбрионов в практику вызвало необходимость более глубокого изучения ряда проблем, связанных с такими важными разделами молекулярной биологии и генетики, как клеточная и генетическая инженерия, которые являются основой новых направлений в биотехнологии. Сегодня направлениями, наиболее приближенными к использованию в производстве, являются определение пола эмбрионов на предимплантационной стадии развития, микрохирургическое разделение бластомеров с целью получения монозиготных близнецов и получение ранних эмбрионов на основе экстракорпорального оплодотворения ооцитов коров.

В решении проблемы определения пола достигнуты лишь незначительные успехи, что ограничивает их практическое применение. В последние годы в литературе появились сообщения об усовершенствовании метода определения пола на основе гибридизации ДНК Y-хромосом в степени, достаточной для использования в производстве, но имеющиеся данные крайне ограничены и не подтверждены исследованиями в странах СНГ.

Одним из перспективных биотехнологических приемов является проведение микрохирургических манипуляций с доимплантационными эмбрионами млекопитающих. Однако методы, используемые при микрохирургии зародышей, остаются сложными, трудоемкими, требующими специального дорогостоящего оборудования и поэтому их применение на практике ограничено. Необходимы дополнительные исследования, направленные на упрощение существующей процедуры разделения.

В последние годы во всем мире большое внимание исследователей уделяется разработке принципиально новой биотехнологии, сочетающей использование трансплантации эмбрионов, культивирование и оплодотворение ооцитов in vitro. Это позволит более интенсивно использовать в воспроизводстве высокоценных племенных коров, резко увеличить генетический прогресс в популяции на основе повышения потенциала гамет в расчете на одну племенную корову и достоверной оценке генотипа [Завертяев Б.П., 1987]. Несмотря на существенные результаты, достигнутые в работах по получению эмбрионов in vitro, многие проблемы, в частности культивирование ооцитов и зигот из-за, значительного снижения приживляемости развившихся эмбрионов, по сравнению с эмбрионами, полученными in vivo, остаются нерешенными.

Цель и задачи исследований С целью разработки и апробации в условиях сельскохозяйственного производства новых биотехнологических методов

интенсификации воспроизводства молочного и мясного скота были поставлены следующие задачи: %

- изучить эффективность различных гонадотропинов и разработать способ стимуляции суперовуляции путем пролонгирования действия гипофизарных гонадотропинов;

усовершенствовать способы и разработать устройства для нехирургического извлечения и сбора эмбрионов;

- разработать устройство и усовершенствовать технику нехирургической пересадки эмбрионов;

- определить эффективность межпородной пересадки эмбрионов для ускорения воспроизводства менее распространенных пород и различных способов получения двоен;

- изучить возможность использования пересадки эмбрионов в качестве биотехнического метода борьбы с бесплодием у коров с нарушениями воспроизводительных функций;

- усовершенствовать способы замораживания-оттаивания эмбрионов на основе использования новых криофилактиков и определить влияние породных отличий на результаты криоконсервации;

- установить достоверность определения пола на основе анализа ДНК Y-хромосом и определить влияние биопсии зародышевых клеток и процессов замораживания-оттаивания на выживаемость эмбрионов с определенным полом;

- разработать способ и устройство для микрохирургического разделения эмбрионов при получении монозиготных двоен в производственных условиях, изучить возможность разделения деконсервированных эмбрионов;

- усовершенствовать метод и определить жизнеспособность свежих и деконсервированных эмбрионов, полученных в условиях in vitro.

Объект и предмет исследования. Коровы-доноры эмбрионов, телки-реципиенты, эмбрионы, ооциты, телята и первотелки-трансплантаты. Вещества, способы, устройства для повышения эффективности индукции суперовуляции, извлечения, разделения, пересадки и криоконсервирования биоматериала.

Научная новизна. В результате многолетних исследований на большом фактическом материале теоретически обоснованы, разработаны и апробированы в условиях производства новые биотехнологические методы интенсификации воспроизводства крупного рогатого скота различного направления продуктивности.

Разработан способ гормональной стимуляции суперовуляции путем пролонгирования действия препаратов ФСГ (приоритетная справка на выдачу патента на изобретение по заявке № а20020647 от 23.07.2002г., опубл. 30.03.2003 г., бюл. № 1), устройства для нерургического извлечения (патент № 1792327) и фильтрации эмбрионов (а.с. № 1704775). В целях повышения приживляемости эмбрионов и упрощения техники пересадки сконструирован телескопический катетер для глубокой аппликации эмбрионов (а.с.№ 1796171).

Доказано отсутствие отрицательного влияния породных отличий эмбрионов при межпородных пересадках на 5 породах крупного рогатого скота

и высокая эффективность различных способов получения двоен. Показана возможность сокращения бесплодия высокопродуктивных коров с нарушениями воспроизводительных функций путем пересадки эмбрионов.

Повышена эффективность криоконсервации эмбрионов на основе применения нового криопротектора дисахарида трегалозы. Установлено влияние породных отличий эмбрионов на результаты криоконсервации.

Установлена высокая степень достоверности определения пола ранних эмбрионов методом, основанным на анализе ДНК У-хромосом. Доказано незначительное отрицательное влияние микробиопсии зародышевых клеток и процессов замораживания-оттаивания на жизнеспособность эмбрионов с определенным полом. Отмечено увеличение частоты рождения монозиготных двоен после пересадки деконсервированных эмбрионов с определенным полом (9,4%), связанное с фактором самопроизвольного разделения эмбрионов в процессе эмбриогенеза, что представляет большой практический интерес.

Разработан упрощенный способ микрохирургического разделения эмбрионов в условиях производства и специальное устройство для его реализации (а.с. № 1727819). Доказана возможность эффективного разделения деконсервированных эмбрионов.

Разработано устройство для культивирования ооцитов и эмбрионов крупного рогатого скота (патент № 1822341).

Усовершенствован метод и определена эффективность трансплантации свежих и деконсервированных эмбрионов коров, полученных на основе экстракорпорального оплодотворения ооцитов.

Практическая значимость работы. Теоретически и практически обоснованные разработки новых биотехнологических методов позволяют оптимизировать их широкое и эффективное использование в интенсификации воспроизводства молочного и мясного скота.

Разработанный способ гормональной стимуляции полиовуляции путем однократного введения ФСГ с пролонгатором позволяет отказаться от трудоемкой 8-10-кратной обработки животных при повышении выхода качественных эмбрионов на 7,5-15,2%. Способ нехирургического извлечения эмбрионов обеспечивает эффективность извлечения до 79,5%, что превышает аналогичные показатели при извлечении известными методами на 6,7 и 7,7% соответственно. Устройство для извлечения повышает выход эмбрионов на 13% по сравнению с использованием катетера "Нойштадт". Устройство для фильтрации эмбрионов исключает их потери, в 2-3 раза сокращает трудоемкость процесса поиска и время нахождения эмбрионов вне организма.

При нехирургической аппликации эмбрионов в верхушку рога матки с помощью разработанного устройства приживляемость свежих и деконсервированных эмбрионов повышается на 193 и 13,8%, соответственно.

Межпородная пересадка эмбрионов, изученная на 5 породах, обеспечивает средний уровень стельности 55,6%, в том числе при пересадке свежих эмбрионов 62,1%, деконсервированных - 50,4%, что не уступает внутрипородной пересадке и дает реальную возможность ускоренного

размножения редких и ценных пород скота, а также повышения мясной продуктивности молочного стада без увеличения поголовья коров.

Пересадка ранних эмбрионов может быть предложена как биотехнический метод борьбы с бесплодием высокопродуктивных коров — стельность после однократной пересадки деконсервированных эмбрионов составляет 33,3%.

При использовании нового криопротектора дисахарида трегалозы приживляемость деконсервированных эмбрионов повышается до 54,3%, что сравнимо с пересадкой свежеполученных эмбрионов (56,0%).

При пересадке эмбрионов на стадии морулы бычков рождается на 9,2% больше, чем при пересадке бластоцист, что установлено и теоретически обосновано в результате аналитического исследования.

Установлен высокий уровень достоверности определения пола ранних эмбрионов на основе анализа ДНК Y-хромосом (93,8%); доказано, что отрицательное влияние микробиопсии зародышевых клеток и процессов замораживания-оттаивания на жизнеспособность эмбрионов с определенным полом минимально (9,3%) и метод с высокой эффективностью может быть использован в производстве.

Предлагаемый способ и разработанное устройство для микрохирургического разделения эмбрионов позволяют проводить дисекцию в условиях производства без применения специального оборудования при 50%-й приживляемости демиэмбрионов, что позволяет получать одного теленка на каждый использованный эмбрион (100% эффективности использования эмбриоматериала).

При получении эмбрионов in vitro использование разработанного устройства для культивирования позволяет повысить уровень дробления зигот и выход эмбрионов до 54,8 и 33% соответственно, по сравнению с применением эксикатора (23,1 и 10,5%), В технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота путем оплодотворения in vitro достигнут уровень созревания ооцитов до стадии оплодотворения 43,4% и выход биологически полноценных эмбрионов на стадии развития морула-бластоциста до 33% с приживляемостью 34,0-50,0% при пересадке свежих и 33,3-39,1% после замораживания-оттаивания.

Впервые сравнительные научные исследования проведены на 6 породах крупного рогатого скота различного направления продуктивности, в ходе экспериментов получено более 1300 телят-трансплантатов 6 пород, в том числе 277 двоен, 56 телят после пересадки половин разделенных эмбрионов, из них 11 пар монозиготных близнецов, 35 телят с определенным полом и 51 теленок, в том числе 12 двоен после пересадки эмбрионов, полученных in vitro. Созданы стада и группы высокопродуктивного черно-пестрого, абердин-ангусского, симментальского, герефордского и лимузинского скота. На республиканский элевер поставлено более 200 генетически ценных бычков-трансплантатов 6 пород, полученных биотехнологическим путем, для использования в широкомасштабной селекции.

В 1987 г. по разработанному нами проекту был создан Брестский областной центр трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота (приказ Брестского областного агропромышленного Комитета № 358 от 7.12.1987 г.).

Научная новизна и практическая значимость исследований подтверждены 3' авторскими свидетельствами, 2 патентами на изобретения и 3 рационализаторскими предложениями. Получена приоритетная справка на получение патента на изобретение пролонгирования действия ФСГ (2003, бюл. №1,с. 16).

Апробаиия работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета Брестской областной государственной с.-х. опытной станции (Пружаны, 1988-1993); республиканских конференциях: "Интенсификация производства в отраслях агропромышленного комплекса на основе использования методов биотехнологии" (Минск, 1989), "Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота" (Жодино, 1989), "Биотехнология и воспроизводство в животноводстве" (Горки, 1991): расширенном заседании отдела биотехнологии БелНИИЖ (Жодино, 1993); межгосударственных научно-практических конференциях: "Генетико-селекционные и технологические проблемы разведения сельскохозяйственных животных" (Киев, 1994), "Селекционно-генетические и биотехнологические проблемы разведения крупного рогатого скота" (Брест, 1995), "Новые методы селекции и разведения высокопродуктивных пород и типов животных" (Киев, 1996); международных конференциях: "Научные основы интенсивного развития животноводства" (Горки, 1995), "Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства" (Горки, 1996), "Использование трансплантации эмбрионов в селекции и разведении сельскохозяйственных животных" (Аскания-Нова, 1997), "Конкурентоспособное производство продукции животноводства в республике Беларусь" (Жодино, 1998), "Сельскохозяйственная биотехнология" (Горки, 1998, 2001), "Интенсификация производства продуктов животноводства" (Жодино, 2002); заседании научной конференции международного общественного объединения "Восток-Запад" (Минск, 2003).

Реализация результатов исследований. Исследования проведены в 19862003 г.г. в рамках республиканских научных программ: "Межотраслевая комплексная республиканская программа по приоритетным направлениям развития агропромышленного комплекса" (ВКГОКП № госрегистрации 01.8601311552), "Трансплантация эмбрионов в животноводстве Республики Беларусь на 1993-2000 г.г." (ВКГОКП № 1997482); областных программ по развитию животноводства в период с 1990 по 2003 г.г.. Основные положения и практические предложения использованы при подготовке 4 методических рекомендаций. Результаты научных исследований внедрены и используются в лаборатории по трансплантации эмбрионов РСУП "Брестплемпредприятие", госплемзаводах и племхозяйствах "Луч", "Дружба", "Мухавец", "Видомля", "Закозельский", колхозах "Советская Белоруссия", "Молодово", "Октябрь", "Красная звезда" Брестской области, СПК "Агрокомбинат "Снов" и УП "Агрокомбинат "Ждановичи" Минской области.

За работу "Внедрение и практическое использование биотехнологии траноплантации эмбрионов в племенном скотоводстве" в 1987 г. присуждена премия МК ВЛКСМ, МОС НТО и МОС ВОИР в области науки, техники, производства и педагогической деятельности.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

- эмбриопродуктивность коров-доноров различных пород;

- стимуляция суперовуляции у коров-доноров одной инъекцией препаратов ФСГ с пролонгатором;

- эффективность длительного использования в качестве доноров эмбрионов коров различного направления продуктивности;

- разработка технологических аспектов повышения эффективности нехирургического извлечения эмбрионов;

- зависимость приживляемости от места аппликации эмбриона в роге матки и специальное устройство для трансцервикальной пересадки;

- межпородная пересадка и получение двоен;

- влияние криопротектора и породных отличий эмбрионов на их жизнеспособность после деконсервировации;

- достоверность определения пола на основе анализа ДНК Y-хромосом;

- разработка метода разделения эмбрионов при получении монозиготных близнецов в применении к условиям производства;

- жизнеспособность свежих и деконсервированных эмбрионов, полученных путем экстракорпорального оплодотворения ооцитов коров;

Опубликованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 48 научных работ, из них 3 авторских свидетельства, 2 патента на изобретения, 1 приоритетная справка на получение патента и 1 рекомендация. Материалы научных исследований были использованы при разработке 4 методических рекомендаций: "Технология трансплантации эмбрионов в молочном и мясном скотоводстве" (Жодино, 1996, 34 с); "Криоконсервирование эмбрионов крупного рогатого скота" (Жодино, 1997, 19с); "Биотехнология воспроизводства крупного рогатого скота на основе оплодотворения ооцитов коров вне организма (in vitro)" (Жодино, 1999, 15 с); "Технология получения эмбрионов крупного рогатого скота вне организма (in vitro) и долговременного их хранения" (Жодино, 2001,17 с).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 234 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, практических предложений производству, списка использованной литературы и предложений производству. Диссертация содержит 55 таблиц и 49 рисунков. Список литературы включает 494 источника, из которых 282 иностранных.

2> МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Научные исследования проведены в 1986-2003 годах во Всероссийском НИИ животноводства, Брестском областном центре трансплантации эмбрионов "Майск", областной лаборатории трансплантации эмбрионов РСУП "Брестплемпредприятие", госплемзаводах "Луч", "Дружба", "Нача", племсовхозах "Закозельский", "Мухавец", "Видомля", колхозах "Советская Белоруссия", "Октябрь", "Молодово" и "Красная звезда" Брестской области, госплемзаводе "Россь" Гродненской и агрокомбинатах "Снов" и "Ждановичи" Минской областей, а также в ряде хозяйств 6 областей Украины. Лабораторная часть исследований по новым направлениям биотехнологии проводилась совместно с лабораторией племпредприятия RPN (г.Ферден, Германия).

В качестве доноров многократно использовали 580 клинически здоровых нелактирующих коров 6 пород различного направления продуктивности в возрасте 4-10 лет: черно-пестрый молочный скот (голштины) с удоем по наивысшей лактации 6189-11407 кг молока с содержанием жира 3,63-4,82%, молочно-мясные симменталы с продуктивностью 5246-7429 кг молока жирностью 4,02-4,79 %, мясные породы - абердин-ангусская, герефордская, шаролезская и лимузинская. В качестве реципиентов - черно-пестрые телки случного возраста с живой массой 340-400 кг.

Для стимуляции суперовуляции использовали гипофизарные гонадотропины 4-х типов: фоллитропин (Литва), ФСГ-супер (Россия), ФСГ-п (США), Фолликотропин (Чехия).

Гормональную обработку коров-доноров проводили по 4-дневным схемам путем 8-кратного введение препаратов в убывающих дозах с интервалом 12 часов, начиная с 9-12 дня эстрального цикла, с последующей инъекцией аналогов простагландина и 3-кратным искусственным осеменением.

Проведены исследования по пролонгированию действия ФСГ-супер и ФСГ-п с помощью поливинилового спирта (ПВС) (в качестве лекарственного вещества используется, например, в крове- и плазмозаменителях).

Всего было проведено 136 обработок. Полученные результаты сравнивали с обработкой препаратами ФСГ в дозе 50 мг без ПВС при 8-кратном введении (179 обработок).

Извлечение эмбрионов проводили нехирургическим путем на 7-8 день индуцированного полового цикла. При извлечении использовали двухканальные катетеры производства фирмы "Нойштадт" (Германия) и разработанное нами телескопическое устройство.

При этом применяли 3 способа извлечения: 1 - порционно с помощью шприцов Фоллея объемом 60 мл; 2 — самотеком через замкнутую систему латексных трубок; 3 - разработанной нами системой, позволяющей в процессе вымывания регулировать объем вводимой среды в зависимости от индивидуальных размеров рога матки.

Рис 1. ОБЩАЯ СХЕМА ИССЛЕДОВАНИИ

В качестве промывной среды применяли сбалансированный солевой раствор Дюльбекко с добавлением сыворотки крови теленка или бычьего альбумина и антибиотиков в общем объеме от 150 до 400 мл на один рог матки.

Извлеченная среда пропускалась через фильтры: эмбриоконцентратор (Германия) с размером ячеек менее диаметра эмбриона и разработанной нами конструкции.

Среда из фильтров в поисках эмбрионов просматривалась под бинокулярным микроскопом при 60-кратном увеличении в чашках Петри с разлинованным дном. Эффективность извлечения оценивалась по числу вымытых зародышей относительно реакции яичников. В общем объеме исследований проведено 978 нехирургических извлечений, получено 7568 зародышей, из числа которых 4685 пригодных для трансплантации. Качество эмбрионов определяли по морфологическим признакам в соответствии с Инструкцией ВИЖ [1984] и Руководством для работы по пересадке эмбрионов П.Кауффольда, И.Тамма и др.[1990].

Пересадку эмбрионов проводили ректоцервикальным методом металлическим катетером производства фирмы "Нойштадт" (Германия) и сконструированным нами специальным гибким устройством.

В общем объеме исследований было проведено 3072 пересадки свежими и замороженно-оттаянными эмбрионами.

При межпородной пересадке использовали эмбрионы 6 пород: черно-пестрой, симментальской, абердин-ангусской, герефордской, шаролезской и лимузинской. Реципиентами служили телки черно-пестрой породы.

При получении двоен, помимо внутрипородных пересадок, в экспериментальных целях был проведен ряд трансплантаций разнопородными эмбрионами, в том числе пересадки двух эмбрионов различных пород одному реципиенту. Всего биотехнологическим путем было получено 274 двойни и 3 тройни.

Совместно с племпредприятием RPN (Германия) был проведен эксперимент с целью установления степени достоверности метода определения пола 6-8-суточных эмбрионов, основанного на гибридизации ДНК Y-хромосом, а также влияния микробиопсии зародышевых клеток и процессов крио- и деконсервации на жизнеспособность эмбрионов с определенным полом. В процессе эксперимента было осуществлено 87 пересадок и получено 35 телят с заведомо определенным полом.

При получении монозиготных двоен путем микрохирургического разделения ранних эмбрионов использовали 2 метода: 1 — простейший, усовершенствованный в отдельных элементах, с применением микроманипулятора и одного инструмента - микроножа, изготовленного из режущей кромки лезвия безопасной бритвы; 2 — разработанный нами принципиально новый метод, по технике исполнения максимально приближенный к условиям производства.

При использовании 1 метода эмбрионы разделяли в капле среды Дюльбекко без сыворотки крови, что создавало электростатическое поле между зоной пеллюцида эмбриона и дном пластиковой чашки Петри. При этом условии эмбрион не выскальзывает из-под ножа в процессе разделения -отпадает необходимость использования второго инструмента, - микроприсоски для фиксации эмбриона.

Для осуществления 2 метода было разработано специальное устройство -тонкий стеклянный капилляр, через который эмбрион стеклянной нитью проталкивается к режущей кромке микроножа, расположенного у выходного

отверстия капилляра и простым надавливанием рассекается на две равных половины. Использование устройства позволило существенно упростить процедуру, исключить применение микроманипулятора и проводить дисекцию эмбрионов в условиях ферм.

Всего в экспериментах было разделено 90 эмбрионов, получено после культивирования 160 пригодных демиэмбрионов, проведено 92 пересадки и получено 56 телят, в числе которых 9 пар монозиготных близнецов.

Совместно с немецкой фирмой RPN были проведены исследования по экстракорпоральному оплодотворению ооцитов коров и получению ранних эмбрионов "in vitro". Для этого использовали фолликулярные ооциты, выделенные из антральных фолликулов яичников коров, убитых на мясокомбинате. Культивирование полученных ооцитов проводили в синтетической питательной среде ТС-199 с эстральной сывороткой КРС (5%), бычьим сывороточным альбумином (5мг/мл), гентамицином (50мкг/мл) и гормональными добавками (ФСГ, ЛГ, эстрадиол). Ооциты культивировали в чашках Петри под слоем минерального масла в эксикаторе и в опытном образце разработанного устройства в условиях 5% СО2 при рН 7,3-7,5 и температуре 38,5°С в течение 24 часов.

Оплодотворяли ооциты в период достижения ими стадии мейоза метафазы 2 замороженно-оттаянной спермой (после капацитации сперматозоидов) в стандартном растворе Тироде (Sigma) с добавлением бычьего сывороточного альбумина, гентамицина и пирувата натрия в чашках Петри с лунками под минеральным маслом в течение 18-20 часов. После совместного культивирования со сперматозоидами яйцеклетки отмывали в среде для культивирования и помещали в среду для культивирования эмбрионов (среда ТС-199 с 20% фетальной сыворотки КРС и 50 мкг/мл гентамицина).

Эмбрионы, развившиеся в культуре до стадии морулы-бластоцисты, пересаживали реципиентам или подвергали глубокому замораживанию с последующей деконсервацией и пересадкой.

В ходе экспериментов было получено 1680 ооцит-кумулюсных комплексов от 57 коров, убитых на мясокомбинате. До стадии морулы-бластоцисты развилось 289 ооцитов. В общем объеме исследований осуществлено 114 пересадок эмбрионами, полученными "in vitro", родился 51 теленок, в том числе 12 двоен, из которых одна монозиготная.

В исследованиях по криоконсервированию использовали эмбрионы, полученные от коров-доноров 6 пород: молочные черно-пестрой, молочно-мясные симментальской, мясные абердин-ангусской, герефордской, шароле и лимузинской. Перед замораживанием проводили 3-ступенчатую эквилибрацию эмбрионов в растворах глицерина (ГЛ) возрастающей концентрации (3,3 - 6,6 — 10%). Замораживание проводили на программном замораживателе ЗЭМ-4 (Украина) в режиме охлаждения от 20°С до -36°С со скоростью охлаждения от 1,0 до 0,3°С/мин и спонтанным сидингом при -7°С в течение 2 минут, затем в контейнерах переносили в жидкий азот при -196°С.

Был также использован метод криоконсервации с использованием в качестве криопротектора этиленгликоля (ЭГ): эмбрионы одноэтапно

выдерживали в 1,5М растворе ЭГ в течение 5-10мин и замораживали в режиме охлаждения от -6 до -36°С со скоростью 0,3°С/мин с последующим переносом в азот.

Деконсервацию эмбрионов проводили в два этапа: Юсек на воздухе и 20сек' в водяной бане при температуре 25°С. При замораживании в ГЛ криопротектор удаляли 4 способами: 1способ - 3-ступенчато в растворах ГЛ убывающей концентрации; 2 способ - 4-ступенчато в растворах ГЛ убывающей концентрации в присутствии 0,ЗМ сахарозы (С); 3 способ, предложенный нами, включал 4-ступенчатую эквилибрацию в растворах ГЛ понижающейся концентрации аналогично 2 способу, но в присутствии нового криофилактика дисахарида трегалозы (ТГ) в 0,3М концентрации (в отличие от сахарозы, молекула которой состоит из 2 остатков - а-Б-глюкозы и В-Б-фруктозы, молекула трегалозы включает 2 остатка а-Б-глюкозы); 4 способ - в 1 ступень в 1,0М растворе С в течение 10мин с последующей отмывкой в ФБС. При использовании ЭГ криопротектор не удаляли, пайетты встряхивали и после смешивания содержимого проводили прямую пересадку.

В общем объеме исследований было подвергнуто криоконсервации 2080 эмбрионов и произведено 1240 пересадок эмбрионами после деконсервации.

Статистическую обработку результатов исследований проводили по методике П.Ф.Рокицкого (1973) с использованием компьютерной техники.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Эмбриопродуктивность коров-доноров различных пород

Величина индуцированной полиовуляции у животных разных пород различна и зависит от их генетически обусловленной плодовитости и особенностей гормонального статуса. В целом считается, что мясной скот реагирует на введение экзогенных гонадотропинов в большей степени, чем молочный.

В наших исследованиях изучалась эффективность стимуляции полиовуляции и получения эмбрионов у коров-доноров 5 пород (табл. 1): 1 группа (п=319) - маточный скот - черно-пестрые голштины, 2 группа (п=27) -молочно-мясные симменталы, 3 (п=136), 4 (п=55) и 5 (п=43) - мясные породы -абердин-ангусская, герефордская и шаролезская соответственно [26,42,44].

Как показали результаты исследований, симментальский и шаролезский скот лучше других пород реагировал суперовуляцией на введение экзогенных гонадотропинов: 92,6 и 88,4% от числа обработанных животных. В 1, 3 и 4-й группах этот показатель практически не отличался и находился в пределах 78,2 - 80,9%. Самой низкой извлекаемостью отличались коровы абердин ангусской породы. В этой группе было получено 69,6% зародышей от числа овуляций, тогда как в других группах в пределах 75,1-85,2%. Это было связано с тем, что коровы абердин-ангусской породы отличаются повышенной возбудимостью, подвержены стрессам, слабо реагируют на премидикацию, в связи с чем относительный выход зародышей часто ниже ожидаемого даже по сравнению с молочным скотом.

Таблица 1

Зависимость результатов суперовуляции от породных отличий коров-доноров

Показатели Порода коров-доноров

черно-пестрые 1 симменталы 2 абердин-ангусы 3 гере-форды 4 шароле 5

Обработано коров-доноров, гол. 319 27 136 55 43

Реагировало суперовуляцией, п-% 256-80,2 25-92,6 110-80,9 43-78,2 38-88,4

Положительн.по изв-леч. доноров, п-% 193-75,3 21-84,0 79-71,8 28-65,1 28-73,7

Овуляций в среднем на донора 11,5 17,0±1,94 11,2±0,55 *+» 12,2±1,28 »* 12Д±0,95 ♦*

Получено зародышей в среднем на донора 9,4±0,71 ** 14,5±2,31 7,8±0,6 *** 10,1±1,42* 9,2±1,1"

% от числа овуляций 81,1 85,2 69,6 82,5 75,1

в т.ч.: - пригодных 6,3 ±0,5 8 *» 9,3±1,69 5,5±0,48 *** 6,6*1,08 *» 7,0±1,06 **

в % отношении 67,4 64,1 70,2 65,0 76,7

- дегенерированных 1,0±0,22 1,0±0,43 0,9±0,19 1,9±0,43 1,1±0,32

в% 11,2 7а 11,5 18,7 12,4

- яйцеклеток 2,0±0,26* 4,2±0,89 1,4±0Д2 ** 1,6±039 *** 1,0±0,3 »+♦

в% 21,4 28,7 18,2 16,2 10,9

Оплодотворяемость яйцеклеток, % 78,6 71,3 81,8 83,7 89,1

* Р<0,05 " Р<0,01 *♦* Р<0,001

Разница в числе овуляций между 2-й группой (симменталы) и 1, 3, 4 и 5-й группами была достоверной (Р<0,001; 0,001; 0,01 и 0,01) и составляла 17,0 против 11,5; 11,2; 12,2 и 12,2 в среднем на донора соответственно. Средний выход эмбрионов, в том числе пригодных, был также наиболее высоким во 2-й группе - 14,5 и 9,3 против 9,4; 7,8; 10,1; 9,2 и 6,3; 5,5; 6,6; 7,0 в 1, 3, 4, 5-й группах при уровнях достоверности Р<0,01; 0,001; 0,05; 0,01 и Р<0,01; 0,001; 0,01; 0,01 соответственно.

В то же время, высокий уровень суперовуляции у симменталов сопровождался снижением оплодотворяемости яйцеклеток до 71,3% по сравнению с другими группами доноров, в которых этот показатель находился в пределах 78,6 - 89,1%. Увеличение числа неоллодотворенных яйцеклеток в группе симменталов по сравнению с 1, 3, 4 и 5-й группами было достоверно выше: Р<0,05; 0,01; 0,001; 0,001 соответственно.

В группе коров-доноров породы шароле был наиболее высокий относительный выход пригодных эмбрионов: при 7,0 в среднем на донора их

количество от общего числа эмбрионов и яйцеклеток составляло 76,7%, что превышало этот показатель в других группах на 6,5 - 12,6%.

В результате проведенных исследований установлено достоверное преимущество симментальского скота комбинированного направления продуктивности канадской селекции по сравнению с молочным и мясным скотом по всем показателям эффективности стимуляции суперовуляции. Высокоэффективным было также использование коров-доноров породы шароле и герефордов. Наименее эффективным, по сравнению с другими породами, было использование коров абердин-ангусской породы. По результатам суперовуляции и выхода зародышей достоверного преимущества коров мясного направления продуктивности перед молочным скотом не установлено.

3.2. Эффективность стимуляции суперовуляции при однократной инъекции препаратов ФСГ с пролонгатором

При всех преимуществах гипофизарных гонадотропинов перед плацентарными их существенными недостатками являются трудоемкость обработки и стрессовое воздействие на животное многоразовых инъекций гормонов, в связи с чем поиск эффективных пролонгаторов представляет особый интерес.

Нами на протяжении ряда лет проводились исследования по пролонгированию действия гипофизарных гонадотропинов с помощью полимера поливинилового спирта (ПВС) [4,10,16,33,43].

Опыты проводились на 4 группах коров-доноров. В 1-й (п=89) и 3-й (п=90) контрольных группах животных обрабатывали ФСГ-супер (Россия) и ФСГ-п (США) соответственно, по классической 4-дневной схеме путем 8-кратных инъекций препаратов в общей дозе 50ед. Арморовского стандарта. Во 2-й (п=113) и 4-й (п=23) опытных группах ФСГ-с и ФСГ-п растворяли в 12%-й суспензии ПВС в физрастворе в полной активной дозе и вводили однократно подкожно с помощью кровобрательной иглы в 10-15 см за хвостовым телом лопатки и в 20-30 см ниже верхней линии хребта животного. Инъекции простагландина и осеменение проводили аналогично 4-дневной схеме.

Как в 1 и 2, так в 3 и 4 группах высокая суперовуляторная реакция была близка на одном уровне и составляла 84,3 и 86,7% и 91,1 и 91,3% от числа обработанных животных при среднем числе овуляций 13,3 и 12,4 и 11,8 и 14,2 соответственно (табл. 2).

Выход эмбрионов и яйцеклеток в среднем на донора в 1 и 2 группах, где использовался ФСГ-супер практически не отличался - 10,8 и 10,5 соответственно. Однако среднее число пригодных эмбрионов в опытной группе было больше, чем в контрольной на 1,4 (8,1 против 6,7). Качество эмбрионов достоверно (Р<0,001) повышалось (на 15,2%) за счет высокодостоверного (Р<0,001) увеличения оплодотворяемости: количество неошюдотворенных яйцеклеток в опытной группе было меньше, чем в контрольной на 12,2% при Р<0,05. В процентном отношении от общего числа зародышей количество дегенерированных эмбрионов и неоплодотворенных яйцеклеток в опытной

группе снижалось: 6,7 и 16,1% против 9,7 и 28,3% соответственно при достоверной разнице (Р<0,05; 0,001).

Таблица 2

Эффективность стимуляции суперовуляции у коров-доноров при однократном введении препаратов ФСГ с пролонгатором ПВС

Показатели Препарат, схема обработки

ФСГ-супер ФСГ-п

8-кратно однокр. 8-кратно однокр.

Обработано доноров, гол. 89 113 90 23

Реагировало суперовуляцией, п - % 75-84,3 98-86,7 82-91,1 21-91,3

Среднее число овуляций 13,3±1,15 12,4±0,78 11,8±0,73 14,2±2,1

Получено зародышей, всего 626 759 600 208

• в среднем на донора 10,8±1,21 10,5±0,8 8,8±0,75 12,2±2,23

в % от числа овуляций 81,0 84,9 74,9 86,3

в том числе: пригодных 6,7±0,66 8,1±0,67 5,9±0,66 9Д±1,8*

% от общего числа 62,0 77,2*** 67,5 75,0*

дегенерированных 1,0±0,23 0,7±0,25 1,6±0,25 0,9±0,5

% 9,7 6,7» 18,1 7,7***

яйцеклеток 3,0±0,67 1,7±0,42* 1,3±0Д4 2,1±0,62

% 283 16,1*** ' 14,3 17,3

Оплодотворяемость яйцеклеток, % 71,7 83,9*** 85,7 82,7

*Р<0,05 ***Р<0,001.

В 4 группе, где животных обрабатывали ФСГ-п с пролонгатором, было получено значительно большее число зародышей по сравнению с 3 группой, где ФСГ-п вводили 8-кратно: 12,2 против 8,8 в среднем на донора, что было связано с более высоким уровнем суперовуляции (14,2 против 11,8) и извлекаемостью эмбрионов и яйцеклеток - 86,3 против 74,9%. Соответственно большим было и число пригодных эмбрионов в среднем на донора - 9,2 против 5,9 при Р<0,05. Качество эмбрионов также зависело от схемы обработки: количество нормальных эмбрионов от общего числа зародышей в опытной группе было достоверно (Р<0,05) выше и составляло 75,0% против 67,5% в контроле.

Качество эмбрионов в опыте повышалось за счет заметного снижения числа дегенерированных эмбрионов в 4-й опытной группе по сравнению с 3-й контрольной - 7,7 против 18,1% - разница высокодостоверна (Р<0,001). Оплодотворяемость яйцеклеток между группами практически не различалась — 82,7 и 85,7%.

Таким образом, при пролонгировании действия ФСГ-супер и ФСГ-п, качество эмбрионов повышается в первом случае за счет повышения оплодотворяемости, во втором, вследствие снижения процента дегенерации эмбрионов.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о несомненном преимуществе стимуляции суперовуляции пролонгированной формой ФСГ по уровню суперовуляции и качественному составу эмбрионов при значительном снижении затрат труда и стрессового воздействия на животное по сравнению с общепринятым 8-кратным введением препаратов.

На новое техническое решение "Стимулятор пролонгации ФСГ для суперовуляции у коров-доноров" получена приоритетная справка на выдачу патента по заявке № 20020647 от 23.07.2002 г (опубл. 30.03.2003 г., бюл.№1).

33. Многократное использование коров-доноров различных пород

Реальная возможность ускорения генетического прогресса в относительно короткие сроки значительно повышается при использовании коров в качестве доноров эмбрионов многократно.

Таблица 3

Изменение основных показателей эмбриопродуктивности коров-доноров различных пород в зависимости от кратности индукции полиовуляции

Изменение показателей с кратностью обработок у

Показатели коров-доноров различных пород

Черно- Симмента Абердин- Герефорд Шаро-

пестрая льская ангусская екая лезская

Число коров в группе 48 14 32 20 24

Количество обработок 19 10 15 8 5

Уровень супер- стабиле повыша стабиле стаби- повы-

овуляции н ется н лен шается

Общий выход зароды- повыш. повыша стабиле стабиле повыша

шей и яйцеклеток с 12-й ется н* н ется

Количество сниж-ся сниж-ся сниж-ся снижает повыша

пригодных эмбрионов с 15-й* с 9-й с10-й ся ется

Количество ста- повыш. повыш. повыш. снижа-

дегенерированных эмбрионов бильно* с 6-й с 10-й* с 6-й ется

Оплодотворяемость сниж-ся сниж-ся сниж-ся снижает повыша

яйцеклеток с 13-й* с 9-й с 9-й ся ется-

Примечание. В таблице приведена общая тенденция изменения основных показателей. Значком * отмечены изменения показателей с высокой вариабельностью.

В наших исследованиях многократно использовались коровы-доноры 5 пород: молочной (голштины), молочно-мясной (симменталы) и мясной -абердин-ангусы, герефорды и шароле [1, 18, 26]. Результаты анализа полученных данных приведены в таблице 3.

Согласно приведенных в таблице выводов, наиболее приемлемые результаты были получены при многократном, в течение года, использовании шароле. Однако эти данные ограничены кратностью обработки (5) и могут

измениться с увеличением их числа. Черно-пестрые доноры до 12-й обработки имели относительно стабильные результаты, с 12-й по 19-ю обработки выход эмбриопродукции повышался, что свидетельствует о возможности их положительного использования на протяжении 4-5 лет. Животные симментальской и абердин-ангусской пород показывали положительные результаты до 9 и 10 обработок соответственно, или в течение 2-2,5 лет использования.

В то же время коровы-доноры герефорды уже после первой обработки имели снижение результатов по всем основным показателям и это снижение было стабильным, что, вероятно, связано с породной чувствительностью к экзогенным гонадотропинам и может служить причиной ограниченного использования в качестве доноров в течение длительного срока.

3.4. Разработка технологических аспектов повышения эффективности нехирургического извлечения эмбрионов

Результаты получения эмбрионов нехирургическим путем зависят от целого ряда факторов, среди которых большое значение имеют способы вымывания, конструкция используемых инструментов и последующие этапы по сбору и обнаружению зародышей. Известно, что эффективность вымывания доимплантационных зародышей нехирургическим путем уступает хирургическим методам и по различным данным составляет от 40 до 76% [Lampeter Von W.W., 1977; Сергеев Н.И., 1986].

В наших исследованиях для повышения эффективности и ускорения процесса вымывания был модифицирован способ нехирургического извлечения, апробирование которого в сравнительном аспекте с известными было проведено на 3 группах коров-доноров. В 1-й (n=237) и 2-й (n=134) группах зародыши извлекали общеизвестными способами — соответственно с помощью шприцов Люэра и самотеком через замкнутую систему трубок. В 3-й группе (n=452) применяли модифицированный способ (табл. 4) [10,20,25].

В 1-й группе, где использовались шприцы Люэра, число доноров положительных по извлечению эмбрионов было ниже, чем во 2-й и 3-й группах (84,4% против 94,0 и 91,2% соответственно). Разница между 1-й и 3-й группами была достоверной при Р<0,01.

При среднем числе овуляций соответственно по группам 11,1; 11,3 и 11,8 в 3-й группе был наиболее высокий уровень извлекаемости - 79,5% зародышей и яйцеклеток от общего числа овуляций против 72,8 и 71,8% в 1-й и 2-й группах соответственно (разница достоверна при Р<0,001). При практически одинаковой суперовуляторной реакции по группам среднее число полученных эмбрионов в 3-й группе было заметно выше, чем в 1-й и 2-й: 9,4 против 8,0 и 8,6 соответственно.

Полученные результаты свидетельствуют о преимуществе модифицированного способа извлечения перед общеизвестными как по среднему числу эмбрионов на донора, так и по выходу зародышей от числа овуляций.

При нехирургическом вымывании эмбрионов в процессе попеременного введения и удаления среды просвет рога матки периодически сжимается и стенки рога закрывают отверстия катетера, препятствуя выводу среды с эмбрионами.

Таблица 4

Эффективность извлечения эмбрионов у коров-доноров тремя способами

Показатели Г руппы животных

1 2 3

Оперировано животных, гол. 237 134 452

Положит, по извлечению доноров от числа оперированных, п -% 200-84,4 126-94,0 412-91,2 ♦♦

Общее число овуляций 2212 1509 4883

Число овуляций в ср. на донора 11,1± 11,3± 11,8±

Число извлеченных зародышей 1610 1083 3883

в среднем на донора 8,0± 8,6± 9,4±

в % от числа овуляций 72,8 71,8 79,5

»♦ Р<0,01 ♦♦♦Р<0,001

Нами был разработан и изготовлен опытный образец устройства для извлечения эмбрионов у крупного рогатого скота, имеющий специальные распорные дуги, препятствующие сжатию стенок рогов матки в процессе вымывания (патент № 1792327,1993, бюл. № 4) [14,25].

Разработанное устройство апробировали при извлечении эмбрионов у 71 донора (опытная группа) в сравнении с контрольной группой (и = 137), в которой эмбрионы извлекали при помощи наиболее часто используемого специалистами на практике двухканального катетера "Нойштадт" (Германия). Результаты производственной проверки представлены в таблице 5.

Одним из показателей эффективности извлечения эмбрионов является процент положительных по вымыванию доноров, то есть тех суперовулировавших животных, от которых в процессе извлечения были получены эмбрионы. В опытной группе этот показатель был на 7,3% выше, чем в контрольной — 92 против 84,7% соответственно при недостоверной разнице.

Основной показатель — общее число полученных зародышей и яйцеклеток, в опытной группе был достоверно (Р<0,001) выше на 13% - 80,9 против 67,9%. Таким образом, при равном числе овуляций в контроле (12,5) и опыте (12,4), в опыте получили на 1,5 зародыша больше, чем в контроле - 10 против 8,5 в среднем на донора.

Таблица 5

Эффективность извлечения эмбрионов разработанным устройством

Показатели Группы животных

Контрольная Опытная

Оперировано доноров, голов 137 71

Положительных по извлечению доноров, п-% 116-84,7 66-92,0

Число овуляций 1446 818

Овуляций в ср. на полож. донора 12,5 ±0,64 12,4 ±0,67

Получено эмбрионов и яйцеклеток, п-% от числа овуляций 982-67,9 662-80,9***

в ср. на положительного донора 8,5 ±0,99 10,0 ±0,7

♦*» Р<0,001

Полученные нами практические результаты подтверждают теоретические предпосылки о более высокой эффективности вымывания эмбрионов при помощи устройства с распорными пластинами.

В последние годы для выделения эмбрионов в ограниченном объеме маточного смыва многие специалисты применяют эмбриофильтры, которые позволяют оперативно удалить избыток среды без зародышей путем ее фильтрации. Однако недостатком существующих конструкций является то, что ситечко в процессе фильтрации забивается примесями в виде сгустков слизи и спущенного эпителия, что часто приводит к потерям эмбрионов.

С целью устранения этого недостатка нами был разработан и сконструирован эмбриофильтр принципиально иной конструкции (а.с. № 1704775,1991, бюл. № 2). В отличие от известных устройств маточный смыв не пропускается через разделительное ситечко, а поступает под него и фильтруется постепенно - посторонние примеси не забивают ячейки, что ускоряет процесс отбора и исключает потери эмбрионов [11,25].

Опытный образец устройства прошел производственную проверку при извлечении эмбрионов у 73 коров-доноров (опытная группа). В контрольной группе (п=71) использовался эмбриоконцентратор германского производства. Результаты эксперимента представлены в таблице 6.

В опытной группе зародыши были получены от 67 коров-доноров из 73 обработанных (91,8%), что было на 5,9% выше, чем в контрольной группе (85,9%). Среднее число овуляций в контрольной и опытной группах составляло 12 и 11,3 соответственно. Однако в результате поиска в среднем на донора было получено практически одинаковое число эмбрионов (8,7 и 8,8) за счет более высокой извлекаемости в опытной группе - 72,2 и 77,9% от числа овуляций в контроле и опыте соответственно при достоверной (Р<0,01) разнице.

Разделительные ситечки фильтров подвергали многократному промыванию сильной струей жидкости. В контрольной группе было дополнительно обнаружено в общей сложности 33 зародыша (4,5% от числа овуляций), фактически утерянных после обычной процедуры сбора. Эмбрионы находили

тем чаще, чем больше посторонних примесей находилось в смыве. В опытной группе после аналогичной процедуры эмбрионов не обнаружили.

Таблица 6

Эффективность отбора эмбрионов при использовании _эмбриофильтра новой конструкции_

Показатели

Группы животных

Контрольная

Опытная

Оперировано доноров, гол.

71

73

Доноров, полож. по извлечению, (п-%)

61-85,9

67-91,8

Общее число овуляций

734

761

■ в среднем на положит, донора

12,0 ±0,62

11,3 ±0,79

Вымыто эмбрионов и яйцекл., (п-%)

530-72,2

593-77,9*»

■ в среднем на положит, донора

8,7 ± 0,63

8,8 ± 0,84

Обнаружено эмбрионов после промывания фильтра, (п-%)

33-4,5%

Вымыто зародышей всего, (п-%)

563-76,7

593-77,9

- в среднем на донора

9,2 ±0,63

8,8 ±0,84

** Р<0,01

Таким образом, в контрольной группе общее число зародышей после повторной процедуры промывания фильтра составило 563, или 9,2 в среднем за извлечение. Процент вымытых эмбрионов от числа овуляций повысился до 76,7%, что практически не отличалось от результативности в опытной группе -77,9%.

Сравнительный анализ результатов исследований позволяет заключить, что предлагаемый эмбриофильтр в силу конструктивных особенностей позволяет исключить потери эмбрионов в процессе их отбора, в отличие от эмбриоконцентратора германского производства, использование которого не исключает потерь эмбрионов из маточного смыва, достигающих 4,5%.

3.5. Устройство для глубокой аппликации эмбрионов трансцервикальным путем

Основным недостатком катетера Кассу, наиболее часто используемом при пересадках эмбрионов, является определенный предел доступной глубины рога матки вследствие его кривизны. По мнению многих исследователей, при нехирургической пересадке верхушка рога матки, недоступная для катетера Кассу, является наиболее оптимальным местом [Critser J.K., Rowe R.F., 1979, 1980;Newcomb R., 1985; Овчинников А.В., 1985].

Нами было сконструировано и апробировано на практике телескопическое гибкое устройство, позволяющее производить аппликацию эмбрионов непосредственно в верхушку рога матки без риска травмирования эндометрия [13,19, 23,24,25] (а.с. № 1796171,1993, бюл. № 7).

Использование разработанного устройства позволило существенно повысить приживляемость эмбрионов и подтвердить зависимость этого фактора от места аппликации в роге матки. Было установлено (табл. 7), что при пересадке по

одному свежеполученному эмбриону в верхушку рога матки телки-реципиента показатель приживляемоспЬ возрастает до 71,4% по сравнению с пересадкой в середину рога катетером фирмы "Нойштадт" (51,9%) — достоверно при Р<0,001. Аналогичная закономерность наблюдалась и при использовании деконсервированных эмбрионов: соответственно 59,2 против 45,4% (Р<0,01).

Как видно из приведенных данных, результаты пересадки в середину рога матки лишь в малой степени зависели от типа инструмента — уровень стельности при пересадке свежеполученных и замороженно-оттаянных эмбрионов базовым и разработанным устройствами составляет 51,9 и 53,3% и 45,4 и 50,0% соответственно - достоверных различий между группами не установлено. Некоторое преимущество гибкого устройства по сравнению с жестким катетером связано, вероятно, с меньшим риском травмирования эндометрия матки.

Таблица 7

Приживляемость эмбрионов в зависимости от места аппликации в роге матки

Использованы эмбрионы Тип инструмента Место аппликации в роге матки Показатели

Пересадок Стельных %

Свежие Катетер "Нойштадт Середина 661 343 51,9

Новое устройство Середина 30 16 53,3

то же Верхушка 70 50 71,4"»**

Деконсервированные Катетер "Нойштадт Середина 603 274 45,4

Новое устройство Середина 28 14 50,0

то же Верхушка 108 64 59,2**

**Р<0,01 ***Р< 0,001

Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что при нехирургической пересадке наиболее высокий уровень стельности обеспечивается аппликацией эмбрионов в верхушку рога матки реципиентов, что может быть достигнуто с помощью разработанного телескопического гибкого устройства и составляет 71,4% при пересадке свежих и 59,2% деконсервированных эмбрионов, что соответственно на 19,5 и 13,8% выше, чем при пересадке базовым устройством - катетером "Нойштадт" жесткой конструкции, ограничивающей доступную глубину рога матки.

3.6. Эффективность межпородной пересадки эмбрионов при получении мясных телят в молочном стаде

В исследованиях по межпородной пересадке использовались свежие и деконсервированные эмбрионы 5 пород: герефордская, абердин-ангусская, симментальская, шаролезская и лимузинская. Полученные результаты

24

пересадкой

реципиентам

сравнивали с внутрипородной пересадкой черно-пестрым идентичных по породе эмбрионов [8,10,25,26,35,38,41]. 1

Анализ влияния на приживляемость состояния эмбрионов в зависимости от их породной принадлежности приведен в таблице 8.

Таблица 8

Приживляемость эмбрионов при межпородной пересадке

Породная при-надл. эмбрионов Состояние эмбрионов Число реципиентов Стельных реципиентов Приживляемо сть,%

Герефордская свежие деконсерв. 23 29 14 14 60,9 48,3

Абердин-ангусская свежие деконсерв. 59 136 31 66 52,5 48,5

Симментальская свежие деконсерв. 56 34 34 15 60,7 44,1

Шаролезская свежие деконсерв. 10 6 6 3 60,0 50,0

Лимузинская свежие деконсерв. 4 26 2 12 50.0 46.1

В среднем по межпордной свежие деконсерв. 152 231 87 110 57,2 47,6

Черно-пестрая свежие деконсерв. • 761 568 409 274 53,7 48Д

Приживляемость свежеполученных эмбрионов породы герефорд, симментал и шароле при пересадке черно-пестрым реципиентам была существенно выше по сравнению с внутрипородной пересадкой: 60,9, 60,7 и 60% против 53,7% соответственно. Лимузинская порода в расчет не принималась из-за недостаточного числа пересадок. Исключение составили эмбрионы абердин-ангусской породы, приживляемость по которым не имела отличий от аналогичной пересадки внутрипородных эмбрионов: 52,5 против 53,7%. В уровне приживляемости свежих эмбрионов достоверной разницы между группами не установлено.

После пересадки замороженно-оттаянных эмбрионов приживляемость заметно снижалась по всем группам реципиентов, но между группами существенных различий не имела и составляла от 44,1 до 50% при межпородной, против 48,2% при внутрипородной пересадке. Это доказывает отсутствие отрицательного влияния на выживаемость эмбрионов их породной принадлежности.

Более значительное снижение стельности после деконсервации мясных эмбрионов, по сравнению с молочными, косвенно свидетельствует том, что эмбрионы мясных пород хуже переносят условия криоконсервации: снижение стельности при внутрипородной пересадке свежих и замороженно-оттаянных эмбрионов составляет 5,5%, тогда как при межпородной пересадке от 10 до 16,6%.

Полученные результаты показывают, что при межпородной пересадке породная принадлежность эмбрионов не оказывает отрицательного влияния на их выживаемость у промежуточных матерей. При пересадке интактных эмбрионов герефордской, симментальской и шаролезской пород этот показатель выше, чем при внутрипородной пересадке на 7,2; 7,0 и 6,3% соответственно.

Таким образом, межпородная трансплантация эмбрионов может быть одним из наиболее эффективных рычагов ускоренного воспроизводства менее распространенных пород крупного рогатого скота, что особенно актуально в мясном скотоводстве.

3.7. Получение разнояйцевых двоен путем внутрипородной и межпородной пересадки эмбрионов

Важным резервом увеличения производства молока и мяса может стать повышение выхода телят за счет получения двоен биотехнологическими методами. При этом увеличение производства говядины может быть обеспечено без увеличения поголовья коров. Развитие простой и надежной технологии получения двоен в мясном и молочном скотоводстве позволит удешевить мясную продукцию при увеличении обеспечения мясом.

В наших исследованиях при получении двоен использовались эмбрионы 4 пород: молочные (голштины), молочно-мясные (симменталы) и мясные (абердин-ангусы и герефорды) [9,19,21,38].

При получении внутрипородных двоен черно-пестрым телкам-реципиентам пересаживали по 2 идентичных породе реципиентов свежеполученных (п=358) или замороженно-оттаянных (п=140) эмбриона соответственно 179 и 70 реципиентам на 7 или 8 день полового цикла с учетом стадии развития эмбрионов. В сравнительном аспекте с пересадкой одного эмбриона, пересадка двух эмбрионов одному реципиенту повышала уровень стельности на 6,1% при пересадке свежих (59,8 против 53,7%) и на 11,8% деконсервированных эмбрионов (60,0 против 48,2% - достоверно при Р<0,05) (табл.9).

Таблица 9

Зависимость стельности реципиентов от состояния и числа

пересаже Показатели нных эмбрионов при внут Свежеполученные рипородной пересадке Деконсервированные

1 эмбрион 2 эмбриона 1 эмбрион 2 эмбриона

Число реципиентов 761 179 568 70

Пересажено эмбрионов 761 358 568 140

Стельных реципиентов 409 107 274 42

Процент стельности 53,7* 59,8 48,2 60,0*

♦ Р<0,05

При пересадке замороженно-оттаянных эмбрионов по одному на реципиента уровень стельности снижался, по сравнению с пересадкой свежеполученных эмбрионов, на 5,5% (48,2 против 53,7% - разница достоверна при Р<0,05). В то же время, при пересадке реципиентам по два эмбриона этот показатель не зависел от их состояния (свежие или деконсервированные) и составлял 59,8 и 60% соответственно.

В таблице 10 приводятся результаты получения внутрипородных двоен путем ипсилатеральной пересадки двух свежих или деконсервированных эмбрионов. Показатели частоты рождения двоен, приживляемости эмбрионов и выхода телят после пересадки соответственно свежих и деконсервированных эмбрионов практически не различались и составляли соответственно 48,9 и 48,4%, 41,3 и 39,0% и 1,49 и 1,48 в среднем на отел.

Таблица 10

Приживляемость и результаты получения двоен при внутрипородной пересадке свежеполученных и деконсервированных эмбрионов

Показатели

Свежепол ученные

Деконсер вированн ые

В

среднем

Число стельных реципиентов

107

42

149

Отелилось реципиентов

90

31

121

■ в том числе двойнями, п-%

44-48,9

15-48,4

59-48,8

Пересажено эмбр. на полученные отелы

324

118

442

Получено телят

134

46

180

Приживляемость эмбрионов, %

413

39,0

40,7

Получено телят на один отел

1,49

1,48

1,49

Получено телят на один эмбрион

0,41

0,39

0,41

Таким образом, полученные результата показывают, что при пересадке реципиенту двух эмбрионов потенции к развитию замороженно-оттаянных эмбрионов не уступают свежеполученным, что подтверждает важное значение числа эмбриональных клеток в повышении жизнеспособности эмбрионов и возникновении беременности.

В целом получение двоен путем пересадки реципиентам по два эмбриона в один маточный рог является высокоэффективным методом, позволяющим при 60%-й стельности получать около 50% двоен, что обеспечивает выход до 1,5 телят на один отел, или 0,41 теленка на один пересаженный эмбрион. Это в 1,5 раза больше, чем при пересадке реципиентам по одному эмбриону при 50%-й приживляемости.

Другим методом получения двоен является пересадка эмбрионов предварительно осемененным реципиентам в контрлатеральный или

ипсилатеральный по отношению к желтому телу яичника рог матки.

В наших исследованиях подсадку эмбрионов проводили контрлатерально в условиях фермы осемененным реципиентам-телкам (п=68) на 7 или 8 день после искусственного осеменения. Полученные результаты сравнивали с пересадкой двух эмбрионов интактным телкам (п=70). В обоих случаях для пересадки использовались деконсервированные эмбрионы со стадией развития, соответствующей стадии полового цикла реципиентов (табл.11).

Таблица 11

Эффективность получения внутрипородных двоен при пересадке деконсервированных эмбрионов интактным и предварительно осемененным _____реципиентам_

Показатели Группы реципиентов

Интактные Осемененные

Число реципиентов 70 68

Число стельных реципиентов 42 43

Уровень стельности, % 60,0 63,2

Учтено отелов 31 35

в том числе двойневых, п-% 15-48,4 11-31,4

Пересажено эмбрионов на полученные отелы 118 120

Приживляемосгь эмбрионов от числа пересаженных, % 40,0 38,3

Получено телят 46 46

Получено телят на один отел 1,48 1,31

Уровень стельности при пересадке одного эмбриона осемененным реципиентам практически не отличался от пересадки двух эмбрионов интактным реципиентам: 63,2 и 60,0% соответственно. Однако число отелов двойнями в первом случае было на 17% меньше — 31,4 против 48,4%, что мы связывали с приживляемостью эмбрионов. На этот показатель оказывает влияние целый ряд факторов, среди которых немаловажное значение имеет место аппликации зародыша. Доказанным считается факт снижения выживаемости эмбрионов при пересадке в контрлатеральный, то есть противоположный яичнику с желтым телом, рог матки. Кроме того, считается установленным, что 40% и более двойневых стельностей может быть получено при высокой оплодотворяемости (60-70%) телок после искусственного осеменения. При низкой, на уровне 45-50%, оплодотворяемости получают только 20-25% двоен [Эрнст Л.К., Сергеев Н.И., 1989]. В хозяйстве, где проводились пересадки эмбрионов искусственно осемененным телкам-реципиентам оплодотворяемость от первого осеменения не превышала 55%.

Таким образом, пересадка эмбрионов осемененным телкам при получении искусственных двоен дает возможность при стельности 63,2% получать 31,4% двойневых отелов и выходе 1,31 теленка на один отел в среднем. Эти показатели могут быть выше при более высоком индексе оплодотворяемости в целом по стаду.

При получении межпородных двоен в наших исследованиях использовались 4 группы эмбрионов двух мясных пород: свежие (п=60) и деконсервированные (п=64) герефордов и свежие (п=122) и деконсервированные (п=58) абердин-ангусов (табл. 12).

Таблица 12

Результаты получения межпородных двоен в зависимости _от породы и состояния эмбрионов_

Породная принадлежность эмбрионов

Показатели Герефордская Абердин-ангусская

Свеж. З/о Веред. Свеж. З/о В сред.

Число реципиентов 30 32 62 61 29 90

Стельных реципиентов 19 18 37 40 18 58

% стельности 63,3 56,2 59,7 65,6 62,0 64,4

Число отелов 18 17 35 32 17 49

- в том числе отелов двойнями, п-% 9-50,0 9-52,9 18-51,4 17-53,1 6-35,3 23-46,9

Пересажено эмбрионов на полученные отелы 58 62 120 106 56 162

Получено телят 27 26 • 53 49 23 72

Приживляемость эмбрионов, % 46,5 41,9 44,2 46,2 41,1 44,4

Получено телят на один отел 1,5 1,53 1,51 1,53 1,35 1,47

Получено телят на пересаж. эмбрион 0,46 0,42 0,44 0,46 0,41 0,44

Пересадку проводили черно-пестрым телкам-реципиентам по два свежих или деконсервированных эмбриона в один маточный рог путем однократного трансцервикального введения инструмента.

При пересадке эмбрионов абердин-ангусской породы отмечалось некоторое преимущество в среднем уровне стельности, по сравнению с эмбрионами герефордов - 64,4 против 59,7%. Причем, эта тенденция сохранялась как в отношении свежих, так и деконсервированных эмбрионов. В то же время, выход двоен у ангусов снижался до 46,9% против 51,4% у герефордов, что объяснялось более низкой приживляемостъю замороженно-оттаянных эмбрионов - 41,1% у ангусов против 46,5% у герефордов и, соответственно, выходом двоен - 35,3 и 52,9% у ангусов и герефордов соответственно.

Полученные данные свидетельствуют о более низкой выживаемости деконсервированных эмбрионов абердин-ангусской породы в процессе раннего эмбриогенеза: если разница между уровнем стельности и приживляемостью деконсервированных эмбрионов породы герефорд составляла 14,3% (56,2 против 41,9%), то у ангусских эмбрионов понижалась более значительно - на 20,9% (62 против 41,1%).

При изучении влияния двойневых отелов в сравнении с одинцовыми на репродуктивные функции реципиентов и сохранность молодняка было установлено, что в группе животных, стельных двойнями (п=165) число абортов

увеличивается на 3,5% по сравнению со стельными одинцами (п=848) - 10,3 против 6,8% соответственно (табл. 13) (учтены стельности и отелы с зафиксированными данными).

Таблица 13

Репродуктивные функции реципиентов, стельных двойнями и одинцами

Показатели Отелы

одинцом двойней

Число стельных реципиентов 848 165

Абортировало реципиентов (п-%) 58-6.8 17-10,3

Число отелов (п-%) 790-93,2 148-89,7

Родилось телят, всего 790 296

из них: - живых (п-%) 740-93,7*** 253-85,5

- мертворожденных (п-%) 50-6,3 43-14,5***

Пало телят (п-%) 19-2,3 9-3,6

Деловой выход телят на 1 первотелку 0,91 1,65

Сохранность телят (п-%) 721-913*** 244-82,4

Средний выход телят на 1 реципиента 0,85 1,48

*** Р<0,001

Число мертворождений часто было связано с трудными отелами и в случае рождения двоен составляло 14,5% по сравнению с рождением одинцов (6,3%). Разница статистически достоверна (Р<0,001). Процент падежа в первые 3 дня после рождения был практически одинаковым, но в целом за счет повышенного числа абортов и мертворождений сохранность телят в группе двоен была на 8,9% ниже, чем в группе одинцов 82,4 против 91,3% соответственно - разница высокодостоверна (Р<0,001).

Несмотря на ряд негативных факторов, сопутствующих двойной стельности, использование трансплантации эмбрионов с целью получения двоен может быть весьма эффективным. Такой основной показатель, как средний выход телят на стельного реципиента, в группе двоен почти в 2 раза выше, чем в группе одинцов -1,48 против 0,85 соответственно.

3.8. Эффективность использования нового криопротектора и жизнеспособность эмбрионов в зависимости от способов крио-идеконсервации

В наших исследованиях был проведен сравнительный анализ влияния на жизнеспособность эмбрионов способов крио- и деконсервации при и использовании различных криофилактиков 3,6,28,30,32,36,37,41,48].

В экспериментах учитывали 6 групп эмбрионов. В 1, 2, 3 и 4 группах эквилибрация эмбрионов перед замораживанием проводилась в 3 ступени в растворах глицерина возрастающей концентрации и замораживание в режиме быстрого охлаждения до -36°С с последующим помещением в жидкий азот. В 5 группе эмбрионы одноэтапно выдерживали в 1,5М растворе этиленгликоля и

охлаждали в быстром режиме с -6°С до -36°С. Во всех случаях конструктивные особенности программного устройства (ЗЭМ^4) обеспечивали спонтанный сидинг при -6...-7°С в течение 2 минут. В 6-й группе пересадки проводились свежими эмбрионами.

После оттаивания эмбрионов в 1, 2, 3 и 4 группах криопротектор удаляли 4 способами: 1 группа - трехступенчато в растворах глицерина понижающейся концентрации; 2 - то же в присутствии 0,3М сахарозы; 3 - то же в присутствии 0,3 М раствора нового криофилактика трегалозы; 4 - одноэтапно в 1,0М растворе сахарозы. В 5 группе после оттаивания пайетту встряхивали и проводили прямую пересадку без предварительного удаления этиленгликоля (табл. 14).

Таблица 14

Жизнеспособность эмбрионов при различных условиях крио- и деконсервации

Группы эмбрионов Сохранность эмбрионов Приживляемость эмбрионов

оттаяно сохранилось % пересадок стельных %

I 387 341 88,1 231 НО 47,6**

2 299 278 93,0 258 131 50,7

3 121 116 95,9*** 81 44 54,3

4 52 47 90,4 45 19 42,2*

5 - - - 62 • 28 45,2

в среднем 928 846 91,2 677 332 49,0***

6 - свежие - - - 1183 663 56,0

* Р<0,05 ** Р<0,01 *** Р<0,001

Наиболее высокий уровень сохранности и приживляемости эмбрионов -95,9 и 54,3% соответственно, был отмечен в 3 группе, где использовался новый непроникающий криопротектор дисахарид трегалоза. Показатель приживляемости был сравним с пересадкой свежих эмбрионов при недостоверной разнице - 54,3 и 56,0% соответственно. Статистически достоверные различия в приживляемости установлены между 1-й, 4-й, в среднем по деконсервированным и 6-й группами (Р<0,01; 0,05; 0,001).

Высокие результаты были получены при добавлении к растворам глицерина 0,ЗМ сахарозы - 93,0 сохранности и 50,7% приживляемости (2 группа).

Сохранность и приживляемость эмбрионов после оттаивания при выведении криопротектора традиционным способом (растворы глицерина понижающейся концентрации) и при одноступенчатом в 1,0М растворе сахарозы были ниже: 88,1 и 47,6% и 90,4 и 42,2% в 1-й и 4-й группах соответственно. Разница в сохранности эмбрионов между 1-й и 3-й группами была высокодостоверной (Р<0,001).

Таким образом, использование нового непроникающего криофилактика трегалозы для ускорения выведения глицерина и более равномерного поступления воды в клетку, имеет преимущество перед традиционными способами.

Высокие результаты показал метод криоконсервации эмбрионов при использовании криопротектора этиленгликоля (5 группа) - уровень приживляемости эмбрионов составил 45,2%. Особый интерес этот способ представляет применительно к условиям производства, поскольку позволяет отказаться от использования дорогостоящего оборудования, свести к минимуму существующую процедуру деконсервации и сократить затраты времени от оттаивания до пересадки с 25 до 5 минут.

3.9. Достоверность идентификации пола 7-суточных эмбрионов на основе анализа ДНК Y-хромосом и жизнеспособность эмбрионов с определенным полом при криоконсервации

Метод, основанный на гибридизации ДНК специфических участков Y-хромосом для идентификации мужских эмбрионов получил свое практическое развитие в 90-х годах и на сегодня является наиболее эффективным. Его точность в лучших лабораториях достигает 95% при уровне стельности 55,6% по свежим и 44,4% по деконсервированным эмбрионам [Roshlau К. et я1., 1997].

Нами совместно с племпредприятием RPN (Германия) были проведены исследования по изучению влияния процессов микробиопсии и замораживания-оттаивания на жизнеспособность эмбрионов с определенным полом, а также степень надежности метода определения пола на основе анализа ДНК Y-хромосом [45].

Пол определяли у 155 7-суточных эмбрионов на стадии поздней морулы. При этом пол был идентифицирован у 120 эмбрионов, что составило 77,4% эффективности.

При замораживании эмбрионов с определенным полом проводили 3-ступенчатую эквилибрацию в растворах глицерина повышающейся до 10% концентрации, после чего охлаждали до -35°С со скоростью охлаждения 0,5°С в минуту и погружали в жидкий азот. Оттаивание осуществлялось в 2 этапа: 10 сек на воздухе, затем 20 сек в водяной бане при 25°С. Глицерин удаляли в обратной последовательности в присутствии 0,3М раствора сахарозы.

В результате пересадки 87 эмбрионов с определенным полом стельность установили у 36 реципиентов, что уступало пересадке деконсервированных интактных эмбрионов, замороженных и оттаянных по аналогичной методике, на 9,3% (41,4 против 50,7%) и свидетельствует о некотором отрицательном влиянии микробиопсии на жизнеспособность деконсервированных эмбрионов, но статистически достоверной разницы между группами не установлено (табл. 15). Приживляемость мужских и женских эмбрионов в эксперименте практически не отличалась и составляла 41,4 и 41,2% соответственно.

В результате растела 32 реципиентов, которым пересадили по одному эмбриону с определенным полом, родилось 35 телят (табл. 16), из которых три монозиготных двойни (бычки), что составило 9,4% от числа отелов. Известно, что спонтанное возникновение идентичных двоен крайне редкое явление. По данным Гордона А. [1988] рождение таких двоен составляет одно на 1000 отелов. Очевидно, прокол зоны пеллюцида и отторжение клеток трофобласта при микробиопсии, а также процессы замораживания-оттаивания в присутствии

глицерина и сахарозы оказывают стимулирующее влияние на спонтанное разделение эмбрионов и возникновение однояйцевых двоен. Возможность искусственного индуцирования этого процесса у крупного рогатого скота может иметь большое практическое значение.

Таблица 15

Результаты пересадки замороженно-оттаянных интактных _эмбрионов и эмбрионов с определенным полом_

Группы эмбрионов, число пересадок

Пересажено эмбрионов

Стельных реципиентов

Приживляемость эмбрионов, %

с биопсией — 87

87

36

41,4

в т.ч.: мужские - 70

70

29

41,4

женские - 17

17

41,2

интактные — 258

258

131

50,7

Таблица 16

Достоверность определения пола на основе анализа _ДНК Y-хромосом_

Пол эмбрионов Всего отелов Родилось телят Двоен (ингемина-ция), п-%

всего бычков телочек (п-% ошибки)

Мужской 25 28 26 • 2-8,0 3 -12,0

Женский 7 7 - 7-0,0 -

Всего 32 35 26 9-6,2 3-9.4

Из 32 отелов 25 были получены от пересадки эмбрионов, пол которых определили как мужской. В результате 23 отелов родились бычки, но 2 отела закончились рождением телочек. От пересадки женских эмбрионов (7 отелов) родилось 7 телочек. Таким образом, пол был верно определен в 30 случаях из 32 - достоверность определения пола составила 93,8%.

Данные, полученные в рамках производственного эксперимента, показывают, что метод определения пола ранних эмбрионов крупного рогатого скота на основе гибридизации ДНК Y-хромосом является наиболее надежным по сравнению с известными методами: его точность составляет 93,8% при уровне приживляемости деконсервированных эмбрионов 41,4%.

3.10. Способ и устройство для микрохирургического разделения ранних эмбрионов при получении монозиготных близнецов

Возникновение в естественных условиях монозиготных близнецов, как отмечалось ранее, явление очень редкое и не превышает 0,01%. Поскольку причины спонтанного разделения эмбрионов до настоящего времени не выяснены, для повышения многоплодия определилось новое перспективное направление в биотехнологии - искусственное получение идентичных близнецов с помощью микрохирургических методов.

В настоящее время микрохирургия доимплантационных зародышей вступает в фазу использования в практических программах по воспроизводству и селекции крупного рогатого скота.

В наших исследованиях методика разделения эмбрионов была максимально приближена к условиям производства [7,9,10,12,25,27,29,31,34,38,41]. Для разделения эмбрионов пополам (дисскция) использовали два способа. По 1 способу дисскцию осуществляли с помощью единственного инструмента -микроножа, закрепленного в держателе переносного микроманипулятора, что обеспечивало контролируемое перемещение ножа в горизонтальной и вертикальной плоскостях. По разработанному нами 2 способу было сконструировано специальное устройство (а.с. № 1727819) [12].

С использованием 1 способа разделили 61 эмбрион и получили 116 равноценных половин, что составило 95,1% от числа максимально возможных (122). Полученные половинки на 60 мин переносили в среду для кратковременного культивирования. По окончании культивирования начало процесса компактизации зародышевого комплекса было отмечено у 105 половинок (90,5%), которые по 1 или по 2 были пересажены реципиентам.

Таким образом, эффективность дисекции эмбрионов при использовании 1 способа составила 86,1%: из 122 максимально возможных было получено 105 пригодных для трансплантации демиэмбрионов.

С помощью разработанного устройства разделили 22 эмбриона и получили 43 половинки (97,7%), после культивирования которых 42 (97,7%) были пригодными для трансплантации. Эффективность разделения эмбрионов по 2 способу составила 95,4% (из 44 возможных получили 42 пригодных демиэмбриона), что было выше по сравнению с 1 способом на 9,3% (Р<0,05).

Полученные демиэмбрионы по 1 или по 2 пересаживали в один маточный рог телок-реципиентов. Результаты трансплантации сравнивали с пересадкой свежеполученных интактных эмбрионов при тех же условиях (табл. 17).

Таблица 17

Результаты трансплантации демиэмбрионов

по сравнению с интактными __

Показатели Демиэмбрионы Интактные эмбрионы

1 способ 2 способ по I по 2

по 1 по 2 по 2

Число реципиентов 23 41 21 913 270

Пересажено эмбрионов или демиэмбрионов 23 82 42 913 540

Стельных реципиентов 12 27 13 497 166

Уровень стельности, % 52,2 65,8 61,9 54,4 61,5

При пересадке реципиентам по 1 демиэмбриону приживляемость снижалась на 2,2% по сравнению с пересадкой 1 интактного эмбриона - 52,2% против 54,4%. В то же время, после пересадки 2 демиэмбрионов в один маточный рог 41 реципиенту по 1 способу стельность была установлена у 27 голов (65,8%), что было несколько вы

БИБЛИОТЕКА I СЛекрвтрг I

ОЭ Я» мт \

эмбрионов (61,5%). Пересадка 2 полуэмбрионов по 2 способу по эффективности (61,9%) не отличалась от пересадки интактных эмбрионов (61,5%). Вероятно, процедура разделения эмбрионов на ранних стадиях развития и экстремальные условия in vitro в определенной степени повышают резистентность и потенции последующего развития демиэмбрионов.

В результате экспериментов по разделению свежеполученных зародышей было получено 50 телят, в том числе 8 пар монозиготных близнецов. В сравнительном аспекте трансплантация демиэмбрионов как по 1, так и по 2 на одного реципиента оказалась экономически более выгодной, чем пересадка интактных эмбрионов.

3.11. Эффективность получения и трансплантации свежих и деконсервированных эмбрионов крупного рогатого скота на основе экстракорпорального оплодотворспия ооцитов

В последние годы разработке принципиально новой биотехнологии, сочетающей использование трансплантации эмбрионов, культивирование и оплодотворение ооцитов in vitro, уделяется большое внимание исследователей во всем мире. Решение этой проблемы позволит более интенсивно использовать в воспроизводстве высокоценных племенных коров, резко увеличить генетический прогресс в популяции на основе повышения потенциала гамет в расчете на одну племенную корову и достоверной оценке генотипа [Завертяев Б.П., 1987].

Метод получения эмбрионов на основе экстракорпорального оплодотворения ооцитов коров включает ряд последовательных этапов: получение яичников и извлечение ооцитов, отбор ооцитов, способных возоновить мейоз в искусственных условиях, создание условий для созревания ооцитов, капацитация спермы, оплодотворение и культивирование зигот до стадии морулы - бластоцисты.

В наших исследованиях яичники от высокопродуктивных коров отбирались в момент убоя животных на мясокомбинате. Ооциты извлекали методом рассечения фолликулов лезвием безопасной бритвы в растворе Дюльбекко с 1% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 10 ед./мл гентамицина и 1 ед./мл гепарина. Для культивирования отбирали ооциты без видимых признаков дегенерации, с многослойным плотным кумулюсом, гомогенной ооплазмой, равномерно заполняющей прозрачную оболочку. Культивирование проводили в среде ТС-199 с добавлением 25 мМ/л буфера Хепеса и 10 ед./мл гентамицина. Для повышения выхода ооцитов со стадией развития метафаза-2 в качестве биологически активной добавки использовалась инактивированная при 56°С сыворотка крови от суперовулировавших коров в 20%-й концентрации.

Необходимое поддержание постоянного рН на уровне 7,2-7,4, 5%-ного СОг, температуры 38°С и влажности 98% осуществлялось с помощью модификации опытного образца разработанного устройства с заданными параметрами культивирования (патент № 1822341,1993, бюл. № 22).

Всего было прокультивировано 740 ооцитов. Через 24 часа культивирования стадии развития зрелой яйцеклетки достиг 321 ооцит (43,4%).

Оплодотворение проводили замороженно-оттаянной спермой после предварительной капацитации сперматозоидов. Капацитацию осуществляли в модифицированном растворе Тироде (Sigma) с концентрацией гепарина 50 мкг/мл. В среду для оплодотворения добавляли суспензию спермиев и совместное культивирование проводилось в течение 18 часов. Оплодотворенные яйцеклетки культивировали в течение 7-11 суток.

При культивировании яйцеклеток эффективность использования разработанного устройства сравнивали с эксикатором, в котором необходимые условия обеспечивались механическими методами. Результаты исследований представлены в таблице 18.

Таблица 18

Эффективность получения эмбрионов in vitro с использованием различных систем для культивирования

Система культивирования Оплодот ворено ооцитов, п-% Уровень дробления, п-% Выход морул, п-% Выход бластоцист, п-% Итого морул-блас-тоцист, п-%

Эксикато Р 372 86-23,1 27-7,2 12-3,2 39-10,5

Новое устройство 321 176-54,8*** 69-21,5*** 37-11,5** 106-33,0***

**Р<0,01 ***Р< 0,001

Через 96 часов в культуральной среде присутствовали 2-, 4-, 8- и 16-бластомерные эмбрионы, через 120 часов появлялись ранние и поздние морулы, через 192 часа - поздние и экспандированные бластоцисты, через 264 часа -бластоцисты, вышедшие из зоны пеллюцида. Необходимо отметить неравномерность процесса дробления, поскольку в каждый конкретный момент времени в среде присутствовали эмбрионы разных стадий развития.

Как показал сравнительный анализ, эффективность использования разработанного устройства для культивирования была существенно выше, чем при использования простого эксикатора. Так, уровень дробления составлял 54,8 против 23,1% при высокой степени достоверности (Р<0,001). Из 321 зиготы, прокультивированной в новом устройстве, стадии развития морулы и бластоцисты, пригодных для трансплантации, достигли 106 зигот, или 33% против 10,5% при использовании эксикатора. Разница была также высокодостоверной (Р<0,001). В устройстве для культивирования выход морул и бластоцист составил 21,5 и 11,5% соответственно. Разница по сравнению с эксикатором (7,2 и 3,2%) была достоверна соответственно при Р<0,001 и 0,01.

Эмбрионы, полученные in vitro от генетически ценных коров пересаживали телкам-реципиентам с синхронизированным циклом. Всего было пересажено 106 эмбрионов на стадии морулы и бластоцисты: 12 реципиентам пересадили по 1 эмбриону отличного и хорошего качества (1-я группа), 47 реципиентам 2-й

группы пересаживали по 2 эмбриона с некоторыми отклонениями от нормы в ипсилатеральный рог матки (табл. 19). Для сравнения были использованы результаты пересадки эмбрионов, полученных in vivo.

Таблица 19

Эффективность пересадки свежих эмбрионов, полученных

Происхожден ие и число эмбрионов на 1 реципиента Пересажено эмбрионов, всего Количество реципие нтов Стельных реципиентов, п-% Учтено отелов в т.ч. отелов двойнями п-%

in vitro 1 12 12 6-50,0 6 1-16,7

2 94 47 16-34,0 16 9-56,2

in vivo 1 761 761 409-53,7 392 3-0,8

2 358 179 107-59,8*** 90 44-48,9

*** Р<0,001

Как показали результаты пересадки, приживляемость отличных и хороших эмбрионов, полученных in vitro, не уступала аналогичному показателю у эмбрионов, полученных in vivo - при пересадке реципиентам по одному эмбриону уровень приживляемости составлял 50 и 53,7% соответственно при недостоверной разнице. В то же время, уровень стельности при пересадке двух эмбрионов с некоторыми отклонениями от нормы в первом случае был на 25,8% ниже, чем во втором - 34 против 59,8% - разница достоверна при Р<0,001. Это свидетельствует о том, что дегенеративные изменения, отмеченные у эмбрионов in vitro, имеют тенденцию к дальнейшему развитию в значительно большей степени, чем у эмбрионов in vivo. Однако число двоен при пересадке эмбрионов in vitro было даже несколько выше, чем эмбрионов in vivo - 56,2 и 48,9% соответственно (разница недостоверна). В результате 6 отелов от пересадки реципиентам по одному эмбриону in vitro была получена одна двойня в результате самопроизвольного разделения эмбриона.

С целью определения влияния процессов крио- и деконсервации на жизнеспособность эмбрионов, полученных вне организма, были проведены исследования по оттаиванию и пересадке эмбрионов, доставленных из племпредприятия RPN (г.Ферден, Германия), в сравнении с эмбрионами in vivo, замороженными в условиях нашей лаборатории.

Методы замораживания-оттаивания в обоих случаях были аналогичными. Эмбрионы замораживали в 1,4М глицерине после поэтапной эквилибрации в растворах глицерина повышающейся концентрации. Оттаивание проводили в три ступени в растворах глицерина понижающейся концентрации в присутствии 0,3М сахарозы. Сравнительный анализ жизнеспособности деконсервированных эмбрионов приведен в таблице 20.

Как показали результаты оттаивания, в группе эмбрионов, полученных in vitro, уровень сохранности был на 18,2% ниже, чем у эмбрионов, полученных in vivo - 93 против 74,8% при высокой достоверности (Р<0,001). Уровень стельности после пересадки деконсервированных эмбрионов in vitro также

существенно уступал эмбрионам in vivo: 38,2 против 50,7%, но различие было недостоверным.

Таблица 20

Жизнеспособность деконсервированых эмбрионов, _полученных in vivo и in vitro_

Метод получения эмбрионов Оттаяно эмбрионо в Сохранили жизнеспособно сть,п- % Число пересадок Число стельных реципиентов, п-%

in vivo 299 278-93,0*** 258 131-50,7

in vitro 135 101-74,8 55 21-38,2

***Р<0,001

При пересадке разного числа деконсервированных эмбрионов различного происхождения (полученных in vivo и in vitro) в показателях стельности и рождения двоен, в отличие от пересадки свежих эмбрионов, имела место существенная разница (табл. 21).

Так, при пересадке по 1 или по 2 эмбриона in vitro уровень стельности был близким по значению и составлял соответственно 33,3 и 39,1%. Аналогичные показатели по эмбрионам in vivo были значительно выше - 48,2 и 60%. Разница между группами в уровне стельности при пересадке двух эмбрионов была статистически достоверной (Р<0,001). Разница в жизнеспособности эмбрионов обеих групп особенно наглядна при учете двойневых отелов. Так, в результате 15 отелов после пересадки эмбрионов in vitro было получено только 2 двойни (19,8%), тогда как при аналогичной пересадке свежих эмбрионов этот показатель составлял 56,2% (данные табл.19). Это свидетельствует о более низкой выживаемости эмбрионов in vitro по сравнению с эмбрионами in vivo, число двоен после пересадки которых было на 28,6% выше (48,4%) -достоверно при Р<0,05.

Таблица 21

Зависимость стельности от числа деконсервированных эмбрионов

in vitro и in vivo, пересаженных одному реципиенту

Пересажено Пересаже Число Число в том числе

эмбрионов HO реци- стельных Учтено отелов

1 реципи- эмбрионо пиен- реципиентов, отелов двойнями,

енту в, всего тов п-% п-%

in vitro 1 9 9 3-333 2 -

2 92 46 18-39,1 15 2-19,8

in vivo 1 568 568 274-48,2 не учит. не учит.

2 140 70 42-60,0*** 31 15-48,4*

* Р<0,05 *** Р<0,001

Результаты исследований по получению и пересадке эмбрионов, полученных путем экстракорпорального оплодотворения ооцитов, показали, что их жизнеспособность, в том числе в условиях крио- и деконсервации, уступает эмбрионам, полученным методом трансплантации. Уровень стельности при пересадке свежих 7-9-суточных эмбрионов, полученных in vitro, составил 37,3%

(22/59), тогда как при пересадке эмбрионов in vivo - 54,9% (516/940). Аналогичные показатели при пересадке деконсервированных эмбрионов составляли 38,2% (21/55) и 49,5% (316/638) соответственно.

Таким образом, технология получения эмбрионов крупного рогатого скота на основе оплодотворения яйцеклеток в культуре in vitro позволяет получать до 33% биологически полноценных эмбрионов на стадии развития морула-бластоциста с приживляемостью 34,0-50,0% после пересадки свежих и 33,339,1% от пересадки после замораживания-оттаивания.

4. ПРАКТИЧЕСКОЕ ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ускоренное размножение мясного скота абердин-ангусской породы в

хозяйствах Брестской области. Новым стратегическим направлением в странах с развитым животноводством является сокращение численности молочных коров при одновременном развитии мясного скотоводства. Это связано с ростом валовых надоев молока за счет повышения продуктивности коров и вынужденным сокращением дойного стада, что, в свою очередь, ведет к сокращению производства говядины. Ее недостаток покрывают за счет разведения мясных пород.

В Белоруссии, особенно в полесской зоне Брестской области имеются самые благоприятные условия для развития мясного скотоводства, поскольку полесские земли могут быть привлечены к ведению данной отрасли без больших капиталовложений. В ряде хозяйств Брестской области уровень продуктивности дойного стада находится в пределах 2000 кг молока, что связано с хроническим недостатком кормов, изношенностью оборудования, недостатком рабочей силы. В этой связи повышение эффективности отрасли возможно за счет организации мясного скотоводства.

Для условий Брестской области наиболее приемлемой для разведения является абердин-ангусский мясной скот, который отличается малоплодностью и легкостью отелов, высокой приспособляемостью к климатическим условиям и неприхотливостью к кормам.

В связи со сложной экономической ситуацией приобретение быков-производителей по импорту крайне сложная проблема, решение которой представляется возможным при использовании биотехнологических методов, в частности трансплантации эмбрионов.

В 1995 году из Головного селекционного центра Украины (г. Переялав-Хмельницкий) было завезено 23 телки случного возраста чистопородных абердин-ангусов канадской селекции для использования в качестве доноров эмбрионов. Одновременно завезли сперму высококлассных ангусских быков Камил и Ран го для осеменения доноров. В последующем для прилития свежей крови из-за рубежа завозилась сперма других быков, а также замороженные эмбрионы. Путем межпородной пересадки было получено 73 высокоценных ремонтных бычка и 85 телочек, положивших начало формированию чистопородного поголовья абердин-ангусов.

В результате целенаправленной работы по программе ускоренного создания чистопородных стад мясного скота с использованием современных селекционных и биотехнологических методов уже к 2003 году в полесской зоне Бресткой области (колхозы "Молодово" и "Красная звезда" Ивановского района) было сформировано два мясных стада абердин-ангусской породы, в которых в настоящее время насчитывается более 1000 голов.

Размножение крупного рогатого скота различных пород биотехнологическими методами с целью обеспечения племпредприятий Республики Беларусь генетически ценными быками-производителями. Согласно плану племенной работы с черно-пестрой породой крупного рогатого скота в Республике Беларусь требуется ежегодно поставлять на элевер не менее 758 ремонтных бычков. Для этого необходимо иметь около 4000 потенциальных быкопроизводящих коров. Такого их количества в республике нет.

Анализ селекционной ситуации показывает, что для ведения жесткого селекционного отбора, комплектации элеверов республики ремонтными бычками и получения высококлассных быков-улучшателей недостающее их количество может быть получено при использовании метода трансплантации эмбрионов. Практический вклад Брестской области в выполнение республиканской племенной программы является наиболее весомым. Ежегодно на элеверы республики поступает до 30 и более ремонтных бычков черно-пестрой, симментальской, абердин-ангусской, герефордской и лимузинской пород. В 1999 г. было реализовано 42 бычка со средней продуктивностью матерей-доноров по наивысшей лактации 8888 кг молока с жирностью 4,37%. В 2001 г. средняя продуктивность матерей составила 9435 кг-4,13%, а в 2002 г. уже 10537 кг жирностью 4,14%. Бычков было продано соответственно 34 и 25 голов. Всего в период с 1996 по 2003 г.г. на элевер поступило 193 ремонтных бычка от высокоценных родителей. В настоящее время в целом по республике в 6 госплемпредприятиях от общего числа быков-производителей до 10-18% составляют быки-трансплантаты. Из этого числа около 80% получены в Брестской областной лаборатории по трансплантации эмбрионов.

По своему вкладу в получение ремонтных бычков Брестская областная лаборатория по трансплантации эмбрионов находится на уровне крупнейших племзаводов республики "Россь" и "Кореличи", а по наследственным качествам этих бычков значительно выше. На сегодняшний день в Брестском госплемпредприятии на проверке по качеству потомства находится 10 быков-трансплантатов, или 15,4% от общего числа быков-производителей (65 голов). Об их генетическом потенциале можно судить по происхождению. Так, у 6 быков линии Рефлекшн Соверинг общий отец - бык Менол № 389192, по происхождению немецкий голштин, продуктивность матери которого по 6-й лактации составляет 13145 кг молока с содержанием жира 5,03%. Продуктивность матерей, коров-доноров, 8500-11141 кг молока жирностью 3,83-4,13%. От других быков-трансплантатов симментальской, абердин-ангусской, герефордской лимузинской пород, получают сперму для искусственного осеменения племенных мясных стад ряда племзаводов, в частности "Приозерный" и "Дружба" Бресткой области и для промышленного

скрещивания низкопродуктивного молочного стада. Племзавод "Дружба" имеет также быков-лимузинов, полученных методом трансплантации, для естественного покрытия коров.

Создание групп молочного и мясного скота в хозяйствах Брестской области. Использование трансплантации эмбрионов в интенсификации воспроизводства крупного рогатого скота в Брестской области позволило создать в ряде хозяйств высокопродуктивные группы молочного скота, которые используются для качественного улучшения стада. В число таких хозяйств вошли племзаводы и племхозяйства "Луч", "Дружба", "Мухавец", "Октябрь", "Закозельский" и некоторые другие. Племзавод "Дружба", помимо высокопродуктивного молочного скота, специализируется на разведении симментальской, лимузинской и шаролезской пород. С использованием биотехнологии трансплантации эмбрионов здесь обновлено и значительно увеличено поголовье симменталов комбинированного направления продуктивности с высоким генетическим потенциалом путем пересадки эмбрионов от коров-доноров симментальской породы со средней продуктивностью 6858 кг молока и содержанием жира 4,15%. Увеличено стадо мясной породы лимузин с использованием канадской селекции путем завоза и пересадки замороженных эмбрионов из Головного селекционного центра Украины. Группы симментальского скота созданы также в племхозяйстве "Октябрь".

Следует отметить, что полученный в исследованиях чистый генетический материал может быть использован для дальнейшей работы с целью повыше-ния продуктивных качеств молочного и мясного стада.

ВЫВОДЫ

1. Установлена высокая эффективность стимуляции полиовуляции гипофизарными гонадотропинами различного типа - фоллитропина (Литва), ФСГ-супер (Россия), ФСГ-п (США) и фолликотропина (Чехия). Наиболее высокие результаты были получены при использовании фолликотропина: выход качественных эмбрионов составил 75,0%, или 8,1 в среднем на донора. Аналогичные показатели при использовании первых трех препаратов находились в пределах 67,4-67,6% и 5,9-6,3 соответственно [2,10,19,20,21,22, 25,29,42,44].

2. Разработанный способ стимуляции суперовуляции у коров при однократном введении препаратов ФСГ с пролонгатором поливиниловым спиртом позволяет повысить качество эмбрионов в зависимости от типа ФСГ на 7,5-15,2% и увеличить выход пригодных эмбрионов на 1,4-3,3 в среднем на донора при 8-кратном снижении затрат труда и стрессового воздействия на животное по сравнению с общепринятым 8-кратным введением препаратов [4, 10,16,33,43].

3. По эффективности стимуляции полиовуляции не установлено преимущества мясных пород абердин-ангусской, герефордской и шаролезской перед черно-пестрым молочным скотом: соответственно при среднем числе овуляций 11,2; 12,2 и 12,2 против 11,5 выход качественных эмбрионов составил

5,5; 6,6 и 7,0 против 6,3 на донора. Повышенной реакцией на введение экзогенных гонадотропинов отличаются молочно-мясные симменталы канадской селекции, аналогичные показатели у которых составляют 17,0 и 9,3 соответственно [26,42,44].

4. Повышение кратности гормональных обработок не оказывает заметного влияния на суперовуляторную реакцию и общий выход зародышей, но отмечается нестабильное снижение их качества. Эти показатели в значительной степени зависят от породных и индивидуальных отличий животных. При многократном использовании черно-пестрых коров-доноров положительные результаты получены на протяжении 4-5 лет, коровы симментальской и абердин-ангусской пород могут использоваться в течение 2-2,5 лет, после чего отмечается снижение качества эмбрионов, использование в течение года шаролезского скота было наиболее эффективным. У коров-доноров герефордской породы отмечается снижение основных показателей уже после 1-й обработки, что ограничивает возможность их многократного использования [1,2,10,18,26,42,44].

5. При применении модифицированного способа вымывания эмбрионов по сравнению с известными сокращаются затраты времени на одну операцию при повышении извлекаемости эмбрионов на 6,7-7,7%. Разработанное устройство для нехирургического извлечения повышает эффективность получения эмбрионов на 13% и в 2 раза сокращает время на одну операцию по сравнению с двухканальным катетером "Нойштадт". Разработанный эмбриофильтр исключает потери и в 2-3 раза сокращает трудоемкость процессов поиска и оценки качества эмбрионов [10,11,14,20,25].

6. Разработанное гибкое телескопическое устройство для пересадки эмбрионов позволяет повысить приживляемость свежих и деконсервированных эмбрионов на 19,5 и 13,8% по сравнению с использованием базового устройства, катетером "Нойштадт": 71,4 и 59,2% против 51,9 и 45,4% соответственно [13,19,23,24,25].

7. Установлено, что при межпородной пересадке породная принадлежность эмбрионов не оказывает отрицательного влияния на приживляемость и превышает этот показатель по сравнению с внутрипородной пересадкой: уровень стельности при пересадке свежих эмбрионов по симментальской породе составляет 60,7%, герефордской - 60,9%, шаролезской - 60,0% против 53,7% по черно-пестрой. Приживляемость деконсервированных эмбрионов при межпородной пересадке находится на одном уровне с внутрипородной [8,10,25,26,35,41].

8. При ипсилатеральной пересадке реципиенту двух эмбрионов уровень стельности составляет 59,8% при выходе двоен 48,8%, что позволяет получать до 1,5 телят на один отел. Контрлатеральная пересадка эмбрионов предварительно осемененному реципиенту обеспечивает 63,2% стельности, но число двойневых отелов снижается до 31,4%, что зависит от показателя оплодотворяемости от первого осеменения по хозяйству в целом. При межпородной пересадке эмбрионов герефордов и абердин-ангусов с целью получения двоен стельность и выход двоен не снижаются по сравнению с

внутрипородной пересадкой: 59,7 и 64,4% и 51,4 и 46,9% против 5.9,8 и 48,8% соответственно [9,19,21,38].

9. При получении разнопородных двоен имеет место доминирующее влияние чужеродных эмбрионов по отношению к эмбрионам, идентичным породе реципиента, выражающееся в повышении выживаемости после нехирургической пересадки. Приживляемость эмбрионов герефордов и симменталов при одновременной пересадке с черно-пестрыми эмбрионами заметно выше последних и составляет 41,9 и 40% против 30,2 и 30% соответственно [9,38].

10. Установлено, что трансцервикальная пересадка деконсервированных эмбрионов позволяет получать более 30% стельностей у коров с нарушениями воспроизводительных функций неясной этиологии [5,17,46].

11. Применение нового непроникающего криофилактика дисахарида трегалозы для уменьшения осмотического шока при деконсервации более эффективно по сравнению с традиционным использованием сахарозы: сохранность эмбрионов и стельность составляют 95,9 и 54,3% против 93 и 50,7% соответственно, что не уступает пересадке свежеполученных эмбрионов (56% стельности) [3,6,10,28,30,32,36,37,41,48].

12. При нехирургической пересадке эмбрионов на стадии развития поздней морулы бычков рождается достоверно на 10,4% больше, чем телочек, при пересадке поздних бластоцист, напротив, на 8% больше телочек, чем бычков [40,47].

13. Установлено, что достоверность определения пола 6-8-суточных эмбрионов методом, основанным на анализе ДНК специфических участков Y-хромосом составляет 93,8%. Микробиопсия и процессы замораживания-оттаивания снижают жизнеспособность эмбрионов на 9,3%: приживляемость эмбрионов с определенным полом и интактных после деконсервации составляет 41,4 против 50,7% соответственно [45].

14. Микрохирургическое разделение эмбрионов с помощью разработанного устройства существенно упрощает и ускоряет процедуру разделения и по эффективности не уступает методу разделения с помощью сложной микроманипуляционной техники: стельность при пересадке реципиентам по 2 демиэмбриона составляет 61,9 и 65,8% соответственно (при пересадке 2 интактных эмбрионов 61,5%). Для разделения с равным успехом могут использоваться свежеполученные и деконсервированные эмбрионы: при пересадке реципиентам двух свежих или деконсервированных полуэмбрионов стельность составляет 65,8 и 66,7% соответственно [7, 9, 10, 12, 25, 27, 29, 31, 34,38,41].

15. Технология получения эмбрионов крупного рогатого скота путем оплодотворения in vitro позволяет достичь уровня созревания ооцитов до стадии оплодотворения 43,4%, получать до 33% биологически полноценных эмбрионов на стадии развития морула-бластоциста с приживляемостью при пересадке 1 и 2 эмбрионов 50-34% при пересадке свежих и 33,3-39,1% после замораживания-оттаивания соответственно [39].

16. При лолучении эмбрионов in vitro использование разработанного устройства для культивирования позволяет повысить уровень дробления зигот и выход эмбрионов до 54,8 и 33% соответственно, по сравнению с применением эксикатора (23,1 и 10,5%) [15].

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Для повышения эффективности индуцирования полиовуляции, выхода и качества эмбрионов у коров-доноров при сокращении затрат труда и стрессового воздействия на животное рекомендуется однократное подкожное в области лопатки введение препаратов ФСГ в суспензии поливинилового спирта.

2. Для нехирургического извлечения и сбора эмбрионов предлагаются усовершенствованный способ и разработанные устройства, позволяющие повысить выход эмбрионов от числа овуляций до 80,9%, в 2-3 раза снизить трудоемкость процесса, потери эмбрионов и время нахождения их вне организма.

3. Предлагается телескопическое устройство для трансцервикальной пересадки, которое позволяет проводить аппликацию эмбрионов в верхушку рога матки без риска травмирования эндометрия и повышает приживляемость при пересадке свежих и деконсервированных эмбрионов до 71,4 и 59,2% соответственно, что на 19,5 и 13,8% выше, чем при использовании базового инструмента, катетера фирмы "Нойштадт".

4. Пересадка эмбрионов может быть использована как биотехнический метод борьбы с бесплодием у высокопродуктивных коров с нарушениями воспроизводительных функций.

5. При получении монозиготных двоен предлагается устройство для микрохирургического разделения эмбрионов, использование которого позволяет проводить разделение эмбрионов в условиях ферм с эффективностью, не уступающей использованию дорогостоящей микроманипуляционной техники.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМ Е ДИССЕРТАЦИИ

1. Кириллова В.Л., Лебедев В.И., Бабенков В.Ю. Влияние кратности суперовуляции коров-доноров на качество эмбрионов. / Животноводство, 1986. - № 10, с. 45-46.

2. Мадисон В.В., Мадисон Л.В., Бабенков В.Ю., Лыгина О.П., Сураева Т.Н. Внедрение и практическое использование биотехнологии трансплантации эмбрионов в племенном скотоводстве. - М. -1987,83 с.

3. Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В. Допустимость изменений режима замораживания эмбрионов. // Зоотехния. -1991. - №11, с. 62-63.

4. Бабенков В.Ю. Стимуляция суперовуляции у коров одной подкожной инъекцией ФСГ в суспензии поливинилового спирта. // Зоотехния. — 2003. - № 8 — С. 27-29.

5. Бабенков В.Ю. Опыт использования трансплантации эмбрионов как биотехнического метода борьбы с бесплодием высокопродуктивных коров. //Ветеринарная медицина Беларуси. - 2003. - № 3 - С. 30-31.

6. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова Л.В., Сивая Н.Н., Пронько А.Ф., Радкевич В.В., Вестфаль Я., Рошлау К. Сравнение двух способов криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота. // Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства: сб. науч. тр. БСХА. - Горки. -1996, с. 130-132.

7. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Сивая Н.Н., Бабенкова Л.В., Радкевич В.В., Вестфаль Я., Рошлау К. Дисекция деконсервированных эмбрионов. // Акт. пробл. интенс. разв. животное.: сб. науч. тр. БСХА. - Горки.-1996, с. 132-134.

8. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Сивая Н.Н., Пронько А.Ф., Радкевич В.В. Сравнение эффективности трансплантации эмбрионов различного происхождения. // Акт. пробл. разв. животное.: сб. науч. тр. БСХА. - Горки. - 1996, с. 184-185.

9. Бабенков В.Ю. Получение двоен крупного рогатого скота с использованием биотехнологических методов. // Уч. зап. Витебской гос. акад. вет. мед. - 2000. - Т.36, ч.1 -с. 126-127.

10. Бабенков В.Ю. Использование трансплантации эмбрионов в воспроизводстве крупного рогатого скота Бресткой области. // Зоотехническая наука Беларуси. — Минск, 2000. - Т.34 - с. 62-67.

И. А.с. 1704775 СССР, МКИ5 А 61 Д 19/02. Устройство для сбора эмбрионов животных. / Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В. - № 4820659/15 (030032); Заявл. 15.03.90; Опубл. 15.09.91, Бюл. № 2 // Отар. Изобр. -1992. - № 2.

12. Ах. 1727819 СССР, А 61 Д 19/02. Устройство для разделения эмбрионов животных /Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В. - № 4807032; Заявл. 15.02.90; Опубл. 22.12.91, Бюл. № 15 // Опер. Изобр. -1992. - № 15.

13. А.с. 1796171 СССР, А 61 Д 19/04 Устройство для трансплантации эмбрионов. /Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В. - J6 4769683; Заявл. 19.12.89; Опубл.8.10.92, Бюл. № 7 // Опер. Изобр. -1993. - № 7.

14. Патент СССР № 1792327. Устройство для нехирургического извлечения эмбрионов у животных. / Бабенков В.Ю., Будевич И.И., Бабенкова Л.В. // Откр. Изобр. 1993, бюл. №4.

15. Патент СССР № 1822341. Устройство для культивирования эмбрионов животных. / Кононенко В.Л., Романов Ю.Д., Бабенков В.Ю., Васин В.Т. // Откр. Изобр. 1993, бюл. №22.

16. Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Якубец Ю.А., Токолов В.П. Стимулятор пролонгации фоллинулостимулирующего гормона для суперовуляции у коров-доноров. // Заявка № а20020647 от 23.07.2002 г. на выдачу патента на изобретение с приоритетом по дате. Опубл. 30.03.2003 г., бюл. № 1, с. 16.

17. Рекомендации по воспроизводству крупного рогатого скота./ Кыса И.С., Семенов Б.Я., Голубец Л.В., Заглубоцкая В.Г., Казакевич В.М., Борищук A.M., Бабенков В.Ю., Семечко А.П. - Барановичи. - 2001,80 с.

18. Бабенков В.Ю. Влияние многократности вызывания суперовуляции ФСГ-п и нехирургического извлечения на воспроизводительную способность коров-доноров. //Науч.-техн. прогресс в животн.: тр. 5 конф. ученых и спец., 1986.

19. Бабенков В.Ю., Будевич И.И. Влияние некоторых факторов на результативность нехирургической трансплантации эмбрионов в скотоводстве. // Интенсификация производства в отраслях агропромышленного комплекса на основе использования методов биотехнологии: тез. док. науч. конф. - Минск, 1989, с. 39-40.

20. Будевич И.И., Бабенков В.Ю. Эффективность использования новых биотехнологических приемов при трансплантации эмбрионов. // Интенсиф. произв. в отраслях агропр. компл. на основе использования методов биотехнол.: тез. докл. науч. конф. - Минск, 1989, с. 40-41.

21. Бабенков В.Ю. Эффективность нехирургической трансплантации эмбрионов. // Транспл. эмбр. кр. рог. скота; тез. докл. науч.-метод. сов. - Жодино. -1989, с.63-65.

22. Бабенков В.Ю. Совершенствование способа индуцирования суперовуляции у коров-доноров. // Биотехнология и воспроизводство в животноводстве: тездокл. науч.-практ. конф.. - Горки. - 1991, с. 4-6.

23. Бабенков В.Ю., Семечко А.П. Эффективность трансцервикальной пересадки эмбрионов с помощью нового инструмента. // Биотехн. и воспр. в живота.: тез. докл. науч.-практ. конф. - Горки. -1991, с. 6-8.

24. Бабенков В.Ю. Инструмент нового типа для нехирургической пересадки эмбрионов. // Генетико-селекционные и технологические проблемы разведения с.-х. животных: тез. докл. науч.-практ. конф. - Киев. - 1994, с. 73-74.

25. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова Л.В., Сивая Н.Н. Результаты и перспективы практического использования трансплантации эмбрионов. // Селекционно-генетические и биотехнологические проблемы разведения кр. рог. ск.: тез. докл. 2 межгос. науч.-практ. конф. -Брест. —1995, с. 31-33.

26. Бабенков В.КХ, Кыса И.С., Бабенкова Л.В. Трансплантация эмбрионов у коров породы шароле. // Селекц.-генет. и биотехн. проблемы развед. кр. рог. ск.: тез. докл. 2 межгос. науч.-практ. конф. - Брест. -1995, с. 33-35.

27. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Вестфаль Я, Сивая КН., Бабенкова Л.В. К вопросу получения монозиготных двоен крупного рогатого скота. // Селекц.-генет. и биотехн. пробл. развед. кр. рог. сю: тез. докл. 2 межгос. науч.-практ. конф. - Брест. -1995, с. 64-66.

28. Бабенков В.Ю. Влияние способа оттаивания на жизнеспособность деконсервированных эмбрионов. // Научные основы интенсивного развития животноводства: тез докл. междун. конф. - Горки. -1995, с. 13.

29. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Сивая Н.Н. Практические результаты и перспективы использования трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. // Научные основы интенсивного развития животноводства: тез докл. междун. конф. - Горки. - 1995, с. 39.

30. Бабенков В.Ю., Кыса НС. Использование этиленгликоля при замораживании эмбрионов. // Новые методы селекции и разведения высокопродуктивных пород и типов животных: матер, науч.-практ. конф. - Киев. -1996, с. 304.

31. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Микрохирургическое разделение криоконсервированных эмбрионов. // Нов. мет. сел. и разв. высокопр. пород и типов животных: матер, науч.-практ. конф. - Киев. -1996, с.305.

32. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова Л.В., Сивая Н.Н., Вестфаль Я. Влияние различных способов криоконсервации и деконсервации эмбрионов на их жизнеспособность. // Использ. трансп. эмбр. в сел. и разв. с.-х. животн.: матер, межд. науч.-практ. конф. - Аскания-Нова. - 1997, с. 6-7.

33. Бабенков В.Ю., Токолов В.П., Моисеенко СИ. Пролонгирование действия ФСГ поливиниловым спиртом. // Использ. трансп. эмбр. в сел. и разв. с.-х. животн.: матер, межд. науч.-практ. конф. - Аскания-Нова. - 1997, с. 8-9.

34. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Сивая Н.Н., Вестфаль Я., Рошлау К. Практическое применение метода дисекции ранних эмбрионов. // Использ. трансп.

эмбр. в сел. и разв. с.-х. животн.: матер, межд. науч.-практ. конф. - Аскания-Нова. -1997, с. 36-37.

35. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Сивая Н.Н., Рошлау К. Приживляемость свежеполученных и деконсервированных эмбрионов в зависимости от породных особенностей коров-доноров. // Использ. трансп. эмбр. в сел. и разв. с.-х. животн.: матер, межд. науч.-практ. конф. - Аскания-Нова. -1997, с. 38-39.

36. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова Л.В., Лущинская Н.Н., Рошлау К., Вестфаль Я. Совершенствование методов замораживания-оттаивания эмбрионов. // Конкурентносп. произв. продукции животное, в Респ. Беларусь: сб. тр. межд. науч.-произв. конф. - Жодино. -1998, ч. 1, с. 89.

37. Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В. Использование дисахарида трегалозы при деконсервации эмбрионов. // Сельскох. биотехн.: мат. межд. науч.-практ. конф. — Горки.-1998, с.182-184.

38. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В. Получение двоен методом трансплантации эмбрионов. // Сельскох. биотехн.: мат. межд. науч.-практ. конф. -Горки.-1998, с. 255-257.

39. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Культивирование изолированных бластомеров 4-8-клеточных бластомеров крупного рогатого скота, полученных in vitro. // Конкурентносп. произв. прод. животн. в Респ. Беларусь: сб. тр. междун. науч.-произв. конф. - Жодино. -1998, ч. 1, с. 89.

40. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Детерминация пола и стадия развития эмбрионов при трансплантации. // Конкурентносп. произв. продукции животное, в респ. Беларусь: сб. тр. междун. науч.-произв. конф. - Жодино. -1998, ч. 2, с. 79.

41. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Лущинская Н.Н., Радкевич В.В., Рошлау К., Вестфаль Я. Эффективность трансплантации различных групп эмбрионов. // Конкурентносп. произв. продукции животн. в Респ. Беларусь: сб. тр. междун. науч.-практ. конф. - Жодино. -1998, ч. 2, с. 93-94.

42. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Стимуляция суперовуляции у коров-доноров различных пород. // Сельскох. биотехн.: матер. 2 междун. науч.-практ. конф. - Горки. -2001, с. 349-350.

43. Бабенков В.Ю., Якубец ЮА, Бабенкова Л.В., Кыса И.С. Пролонгирование действия гипофизарных гонадотропинов при стимуляции суперовуляции у коров-доноров. // Сельскох. биотехн.: матер. 2 междун. науч.-практ. конф.- Горки. -2001, с. 351-353.

44. Бабенков В.Ю., Жук Н.Ф. Стимуляция суперовуляции у коров-доноров различных пород. // Интенсифик. произв. продуктов животноводства: матер, межд. науч.-произв. конф. - Жодино. - 2002, с. 6.

45. Бабенков В.Ю. Определение пола эмбрионов крупного рогатого скота методом гибридизации ДНК Y-хромосом. // Интенсиф. произв. прод. животн.: мат. межд. науч.-произв. конф.-Жодино.-2002, с.7.

46. Бабенков В.Ю., Жук Н.Ф., Черневский Н.А. Пересадка эмбрионов крупного рогатого скота как биотехнический метод борьбы с бесплодием. // Интенсиф. произв. прод. животн.: мат. межд. науч.-произв. конф. - Жодино. - 2002, с. 8.

47. Бабенков В.Ю. Зависимость соотношения полов при трансплантации от стадии развития эмбрионов. / Ветер, газ. - 1997, № 1 (35).

48. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Сивая Н.Н. Влияние некоторых факторов на эффективность деконсервации эмбрионов. / Ветер, газ. -1997, № 6 (40).

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н, м.Дубровицы Тел. (8 - 27) 65-14-24, (8 - 27) 65-14-07

Сдано в набор 12.04.2004. Подписано в печать 13.04.2004 Заказ №8. Печ.л. 2,1. Тираж 100 экз._

»107 50

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Бабенков, Владимир Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЙ

2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Гормональная стимуляция суперовуляции у коров-доноров

2.1.1. Индукция полиовуляции у коров-доноров различными гонадотропинами, усовершенствование схемы гормональной обработки препаратом ФСГ-супер

2.1.2. Сополимеры поливинилового спирта как пролонгаторы # действия препаратов ФСГ при индукции полиовуляции у коров-доноров

2.1.3. Использование в качестве доноров эмбрионов коров различного направления продуктивности

2.1.4. Эффективность многократного использования коров-доноров различных пород и индивидуальная изменчивость суперовуляции

2.2. Нехирургическое извлечение и оценка качества эмбрионов

2.2.1. Разработка технологических аспектов повышения эффективности извлечения эмбрионов в зависимости от некоторых факторов

2.2.2. Оценка качества эмбрионов по морфологическим признакам и резистентность ранних эмбрионов в условиях "in vitro"

2.3. Нехирургическая пересадка эмбрионов

2.3.1. Влияние различных факторов на приживляемость эмбрионов

2.3.2. Устройство для глубокой аппликации эмбрионов трансцервикальным путем

2.3.3. Эффективность межпородной пересадки эмбрионов при получении мясных телят в молочном стаде

2.3.4. Получение разнояйцевых двоен путем внутрипородной и межпородной пересадки эмбрионов

2.3.5. Пересадка эмбрионов крупного рогатого скота как биотехнический метод борьбы с бесплодием

2.4. Криоконсервирование эмбрионов 132 2.4.1. Эффективность использования нового криопротектора и жизнеспособность эмбрионов в зависимости от способов крио- и деконсервации

2.5. Использование в условиях производства новых направлений биотехнологии

2.5.1. Методы регуляции соотношения полов и определения пола ранних эмбрионов крупного рогатого скота

2.5.2. Соотношение пола телят при трансплантации эмбрионов ранних стадий развития

2.5.3. Достоверность идентификации пола 7-суточных эмбрионов на основе анализа ДНК Y-хромосом и жизнеспособность эмбрионов с определенным полом при криоконсервации

2.5.4. Спонтанное и индуцированное возникновение монозиготных двоен

2.5.5. Способ и устройство для микрохирургического разделения ранних эмбрионов при получении монозиготных близнецов

2.5.6. Микрохирургическая дисекция деконсервированных эмбрионов

2.5.7. Эффективность получения и трансплантации свежих и деконсервированных эмбрионов крупного рогатого скота на основе экстракорпорального оплодотворения ооцитов

3. ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические методы интенсификации воспроизводства молочного и мясного скота"

На современном этапе научно-технический прогресс в животноводстве в огромной степени зависит от разработки, освоения и реализации эффективных биотехнологических методов интенсификации воспроизводства, создания на этой основе новых высокопродуктивных пород, линий и гибридов животных. Низкие темпы воспроизводства и селекции у крупного рогатого скота, как у одноплодного вида млекопитающих, при наличии огромного генетического потенциала (число первичных фолликулов в яичниках коров составляет несколько сот тысяч), натолкнуло исследователей на поиск нетрадиционных методов повышения многоплодия. Эти методы основаны на исследованиях регуляции репродуктивной функции, совершенствовании приемов манипуляций с зародышами ранних стадий развития, половыми и соматическими клетками.

Возникновению биотехнологических направлений в разведении и селекции крупного рогатого скота предшествовал целый ряд открытий в сфере репродукции млекопитающих. Еще в конце 17-го века голландцем R.Groaf была впервые описана яйцеклетка, но лишь в 1890 г. англичанину В.Хипу из Кембриджского университета впервые в истории биологии удалось получить беременность путем пересадки 2 эмбрионов на стадии развития 2-х и 4-х бла-стомеров от крольчихи ангорской породы покрытой крольчихе бельгийской породы. В результате крольчиха-реципиент принесла 6 крольчат, из которых 4 бельгийской, а 2 ангорской пород. Успех этого эксперимента показал принципиальную возможность трансплантации эмбрионов ранних стадий развития, в том числе межпородной пересадки.

Если первые опыты носили чисто научный характер, то в 30-х годах, после обнаружения американскими исследователями Cole Н. и Hart G. [253] в крови жеребых кобыл гонадотропинов, способных вызывать полиовуляцию у самок, и разработки в 1936 г. гормонального метода повышения многоплодия животных группой исследователей ВИЖа под руководством академика Зава-довского М.М. [65, 67], трансплантации эмбрионов приобрела реальное прикладное значение.

После многочисленных опытов на лабораторных животных в 50-х годах были проведены успешные эксперименты на козах, овцах и свиньях [80, 113]. В 1940 г. группе американских исследователей [251] впервые удалось стимулировать суперовуляцию у крупного рогатого скота.

К началу 70-х годов группой кембриджских исследователей под руководством L.Rowson [410, 412, 413] в основном была разработана технология хирургической трансплантации зародышей, а первую успешную пересадку таким путем осуществили в 1951 г. [488]. Там же в 1964 г. был получен первый теленок после бескровной трансплантации.

Начиная с 50-х годов в разных странах проводились многочисленные исследования по извлечению и пересадке зародышей нехирургическим методом. Однако существенное прикладное значение он приобрел лишь в середине 80-х годов. Этому способствовало создание практически новой технологии, позволяющей значительно упростить существовавшую процедуру. С этого времени трансплантация эмбрионов стала использоваться во многих странах мира в качестве одного из наиболее эффективных рычагов ускоренного воспроизводства элитного высокопродуктивного поголовья по материнской линии.

В настоящее время в США, Канаде и странах Западной Европы с развитым животноводством до 70% и более племенных быков поступают на станции искусственного осеменения с клеймом "Т" - трансплантат.

В СССР исследования в области трансплантации эмбрионов были начаты в конце 70-х годов. Первые телята после хирургической пересадки родились в 1977 г. во Всесоюзном НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных, а в 1980 г. во Всесоюзном НИИ животноводства были получены телята-близнецы после пересадки эмбрионов, хранившихся в течение двух месяцев в жидком азоте.

Широкое практическое внедрение метода началось с 1983 г., когда в стране, практически во всех союзных республиках создавались центры трансплантации эмбрионов. Если в 1979 г. было проведено лишь около 200 эм-бриопересадок, то в 1989 г. уже родилось более 3000 телят-трансплантатов.

Упадок в экономике в связи с распадом Союза самым негативным образом отразился на развитии нового перспективного направления. Начиная с 1992-93 годов подавляющее большинство центров и производственных лабораторий, теперь уже в странах СНГ, было расформировано, сотни высококвалифицированных специалистов остались невостребованными. Такое положение сложилось повсеместно и практически не изменилось до настоящего времени. Тем не менее, в отдельных регионах потенциал в целом удалось сохранить, хотя и в значительно сокращенном объеме.

В Белоруссии Брестская область с 1987 г. занимает лидирующее место в области практического применения трансплантации эмбрионов. В областном центре трансплантации эмбрионов до настоящего времени проводится до 500 эмбриопересадок в год. В то же время в других 5 областях вместе взятых эта цифра не превышает 100.

Заслуживает внимания опыт селекционеров Украины, которые в период перехода к рыночной экономике, когда сельскохозяйственные предприятия из-за отсутствия валютных средств не в состоянии приобретать племенной скот за рубежом, пошли по пути преобразования стада с использованием ка-надско-американской селекции путем завоза эмбрионов и спермы голштинов и абердин-ангусов. Возглавил эту работу Головной селекционный центр Украины (г. Переяслав-Хмельницкий), где коллектив лаборатории по трансплантации эмбрионов (под руководством биотехнологов Мадисон В.В. и Мадисон JI.B.) за год с небольшим (1993-94 гг.) произвел более 2000 эм-бриопересадок в различных регионах страны со средним уровнем стельности 54,3%. В настоящее время созданы чистопородные мясные стада во многих хозяйствах Украины.

В России на сегодня работа в области трансплантации эмбрионов практически остановлена. В то же время здесь сосредоточен огромный научный и практический потенциал. Для восстановления эффективного использования в производстве передовых биотехнологий необходима лишь реставрация уже существующего опыта. Это, в свою очередь, в значительной степени зависит от разработки наиболее оптимальных и экономически выгодных решений как в технологической цепи трансплантации эмбрионов, так и при освоении и внедрении новых биотехнологических методов определения пола, микрохирургического разделения и получения эмбрионов вне организма. Эти направления биотехнологии в последние годы приобретают все большее значение для практики и привлекают пристальное внимание ученых во всем мире.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В результате углубленных исследований в области эмбриологии млекопитающих стало возможным внедрение в практику воспроизводства сельскохозяйственных животных метода трансплантации эмбрионов, как важнейшего средства ускорения качественного улучшения и более полного использования генетических ресурсов маточного поголовья в молочном и мясном скотоводстве.

В биотехнологии ускоренного размножения высокоценных племенных животных трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота является наиболее апробированным и широко используемым на практике методом. Подтверждением этому служат успехи в создании высокопродуктивного молочного скота в странах Северной Америки и Европы, где до 70% быков-производителей, используемых для качественного улучшения стада, получены путем пересадки зародышей. Несмотря на большое прикладное значение, потенциальные возможности трансплантации эмбрионов в практике воспроизводства используются далеко не полностью.

Среди основных причин недостаточной реализации метода — факторы экономического характера: высокая стоимость работ, низкие цены на племенной скот, ограниченные ресурсы высокопродуктивных животных. Немаловажное значение имеют и многие биологические и технологические факторы, связанные с эффективностью использования метода в условиях производства.

В технологии трансплантации эмбрионов индукция полиовуляции является звеном, от эффективности которого в большой степени зависит конечный результат. В этой области накоплен обширный материал. Но до настоящего времени вызывание суперовуляции остается нестабильным и малоизученным вопросом. Большое практическое значение имеют разработки упрощенных схем гормональной обработки, поиск надежных и эффективных веществ пролонгирующего действия.

Эффективность практического применения метода трансплантации эмбрионов существенно возрастает при использовании высокопродуктивных коров в качестве доноров эмбрионов несколько раз в год. Однако данные о влиянии на реакцию яичников и состояние матки коров многократных гормональных обработок и повторных процедур извлечения эмбрионов носят разноречивый характер.

Основным недостатком инструментов, наиболее часто используемых для пересадки эмбрионов, является определенный предел доступной глубины рога матки вследствие его кривизны. По мнению многих исследователей, при нехирургической пересадке верхушка рога матки, недоступная для катетера Кассу, является наиболее оптимальным местом [8, 12, 146, 258, 375, 405].

Усовершенствование инструментов для пересадки и сопутствующих технологических фрагментов могут в определенной степени повысить эффективность нехирургической пересадки.

Одним из резервов увеличения производства молока и мяса является повышение выхода телят за счет получения двоен биотехнологическими методами. Несмотря на потенциальные экономические возможности, объем исследований по получению двоен и межпородной пересадке у крупного рогатого скота недостаточен.

Существенный прогресс достигнут в области криоконсервирования эмбрионов. Несмотря на это, выживаемость эмбрионов, подвергнутых криокон-сервации, существенно снижается. Ряд вопросов, связанных с обеспечением стабильности получаемых результатов, поиск новых, менее токсичных и эффективных криофилактиков, упрощение технологии крио- и деконсервации остаются актуальными.

Внедрение и прикладное значение трансплантации эмбрионов вызвало необходимость более глубокого изучения ряда проблем, связанных с такими важными разделами молекулярной биологии и генетики, как клеточная и генетическая инженерия, которые являются основой новых направлений в биотехнологии. Одними из направлений, которые в наибольшей степени приблизились к стадии практического использования в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота, являются определение пола эмбрионов на предим-плантационной стадии развития, микрохирургическое разделение бластоме-ров с целью получения монозиготных близнецов и получение ранних эмбрионов на основе экстракорпорального оплодотворения ооцитов коров.

В решении проблемы определения пола достигнуты лишь незначительные успехи, что ограничивает их практическое применение. В последние годы в литературе появились сообщения об усовершенствовании метода определения пола на основе гибридизации ДНК Y-хромосом в степени, достаточной для использования в производстве, но имеющиеся данные крайне ограничены и не подтверждены исследованиями в странах СНГ.

Одним из перспективных биотехнологических приемов является проведение микрохирургических манипуляций с доимплантационными эмбрионами млекопитающих. Однако методы, используемые при микрохирургии зародышей, остаются сложными, трудоемкими, требующими специального дорогостоящего оборудования, поэтому их применение на практике ограничено. Необходимы дополнительные исследования, направленные на упрощение существующей процедуры разделения.

В последние годы огромное внимание исследователей во всем мире уделяется разработке принципиально новой биоте?$юлогии, сочетающей использование трансплантации эмбрионов, культивирование и оплодотворение ооцитов in vitro. Решение этой проблемы позволит более интенсивно использовать в воспроизводстве высокоценных племенных коров, резко увеличить генетический прогресс в популяции на основе повышения потенциала гамет в расчете на одну племенную корову и достоверной оценке генотипа [68]. Несмотря на существенные результаты, достигнутые в работах по получению эмбрионов in vitro, многие проблемы, в частности культивирование ооцитов и зигот, значительное снижение приживляемости развившихся эмбрионов в сравнении с эмбрионами, полученными in vivo, остаются нерешенными.

Цель и задачи исследований. С целью разработки и апробации в условиях сельскохозяйственного производства новых биотехнологических методов интенсификации воспроизводства молочного и мясного скота были поставлены следующие задачи:

- изучить эффективность различных гонадотропинов и разработать способ стимуляции суперовуляции путем пролонгирования действия гипофизар-ных гонадотропинов;

- усовершенствовать способы и разработать устройства для нехирургического извлечения и сбора эмбрионов;

- разработать устройство и усовершенствовать технику нехирургической пересадки эмбрионов;

- определить эффективность межпородной пересадки эмбрионов для ускорения воспроизводства менее распространенных пород и различных способов получения двоен;

- изучить возможность использования пересадки эмбрионов в качестве биотехнического метода борьбы с бесплодием у коров с нарушениями воспроизводительных функций;

- усовершенствовать способы замораживания-оттаивания эмбрионов на основе использования новых криофилактиков и определить влияние породных отличий на результаты криоконсервации;

- установить достоверность определения пола на основе анализа ДНК Y-хромосом и определить влияние биопсии зародышевых клеток и процессов замораживания-оттаивания на выживаемость эмбрионов с определенным полом;

- разработать способ и устройство для микрохирургического разделения эмбрионов при получении монозиготных двоен в производственных условиях, изучить возможность разделения деконсервированных эмбрионов;

- усовершенствовать метод и определить жизнеспособность свежих и деконсервированных эмбрионов, полученных в условиях in vitro.

Научная новизна. В результате многолетних исследований на большом фактическом материале теоретически обоснованы, разработаны и апробированы в условиях производства новые биотехнологические методы интенсификации воспроизводства крупного рогатого скота различного направления продуктивности.

Разработан способ гормональной стимуляции суперовуляции путем пролонгирования действия препаратов ФСГ (приоритетная справка на выдачу патента на изобретение по заявке № а20020647 от 23.07.2002 г., опубл. 30.03.2003 г., бюл. № 1), устройства для нерургического извлечения (патент № 1792327) и сбора эмбрионов (а.с. № 1704775). В целях повышения прижив-ляемости эмбрионов и упрощения техники пересадки сконструирован телескопический катетер для глубокой аппликации эмбрионов (а.с.№ 1796171).

Доказано отсутствие отрицательного влияния породных отличий эмбрионов при межпородных пересадках на 5 породах крупного рогатого скота и высокая эффективность различных способов получения двоен. Показана возможность сокращения бесплодия высокопродуктивных коров с нарушениями воспроизводительных функций путем пересадки эмбрионов.

Повышена эффективность криоконсервации эмбрионов на основе применения нового криопротектора дисахарида трегалозы. Установлено влияние породных отличий эмбрионов на результаты криоконсервации.

Установлена высокая степень достоверности определения пола ранних эмбрионов методом, основанным на анализе ДНК Y-хромосом. Доказано незначительное влияние микробиопсии зародышевых клеток и процессов замораживания-оттаивания на жизнеспособность эмбрионов с определенным полом. Отмечено увеличение частоты рождения монозиготных двоен после пересадки деконсервированных эмбрионов с определенным полом (9,4%), связанное с фактором самопроизвольного разделения эмбрионов в процессе эмбриогенеза, что представляет большой практический интерес.

Разработан упрощенный способ микрохирургического разделения эмбрионов в условиях производства и специальное устройство для его реализации (а.с. № 1727819). Доказана возможность эффективного разделения деконсервированных эмбрионов.

Разработано устройство для культивирования ооцитов и эмбрионов крупного рогатого скота (патент № 1822341).

Усовершенствован метод и определена эффективность трансплантации свежих и деконсервированных эмбрионов коров, полученных на основе экстракорпорального оплодотворения ооцитов.

Практическая значимость работы. Теоретически и практически обоснованные разработки новых биотехнологических методов позволяют оптимизировать их широкое и эффективное использование в интенсификации воспроизводства молочного и мясного скота.

Разработанный способ гормональной стимуляции полиовуляции путем однократного введения ФСГ с пролонгатором позволяет отказаться от трудоемкой 8-10-кратной обработки животных при повышении выхода качественных эмбрионов на 7,5-15,2%. Способ нехирургического извлечения эмбрионов обеспечивает эффективность извлечения до 79,5%, что превышает аналогичные показатели при извлечении известными методами на 6,7 и 7,7% соответственно. Устройство для извлечения повышает выход эмбрионов на 13% по сравнению с использованием катетера "Нойштадт". Устройство для фильтрации эмбрионов исключает их потери, в 2-3 раза сокращает трудоемкость процесса поиска и время нахождения эмбрионов вне организма.

При нехирургической аппликации эмбрионов в верхушку рога матки с помощью разработанного устройства приживляемость свежих и деконсерви-рованных эмбрионов повышается на 19,3 и 13,8% соответственно.

Межпородная пересадка эмбрионов, изученная на 5 породах, обеспечивает средний уровень стельности 55,6%, в том числе при пересадке свежих эмбрионов 62,1%, деконсервированных - 50,4%, что не уступает внутрипо-родной пересадке и дает реальную возможность ускоренного размножения редких и ценных пород скота, а также повышения мясной продуктивности молочного стада без увеличения поголовья коров.

Пересадка ранних эмбрионов может быть предложена как биотехнический метод борьбы с бесплодием высокопродуктивных коров - стельность от пересадки деконсервированных эмбрионов составляет 33,3%.

При использовании нового криопротектора дисахарида трегалозы приживляемость деконсервированных эмбрионов повышается до 54,3%, что сравнимо с пересадкой свежеполученных эмбрионов (56%).

При пересадке эмбрионов на стадии морулы бычков рождается на 9,2% больше, чем при пересадке бластоцист, что установлено и теоретически обосновано в результате аналитического исследования.

Установлен высокий уровень достоверности определения пола ранних эмбрионов на основе анализа ДНК У-хромосом (93,8%); доказано, что отрицательное влияние микробиопсии зародышевых клеток и процессов замораживания-оттаивания на жизнеспособность эмбрионов с определенным полом минимально (9,3%) и метод с высокой эффективностью может быть использован в производстве в условиях специально оснащенной лаборатории.

Предлагаемый способ и разработанное устройство для микрохирургического разделения эмбрионов позволяют проводить дисекцию в условиях производства без применения специального оборудования при 50%-й прижив-ляемости демиэмбрионов, что позволяет получать одного теленка на каждый использованный эмбрион (100% эффективности использования эмбрио-материала).

При получении эмбрионов in vitro использование разработанного устройства для культивирования позволило повысить уровень дробления зигот и выход эмбрионов до 54,8 и 33% соответственно, по сравнению с применением эксикатора (23,1 и 10,5%). В технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота путем оплодотворения in vitro достигнут уровень созревания ооци-тов до стадии оплодотворения 43,4% и выход биологически полноценных эмбрионов на стадии развития морула-бластоциста до 33% с приживляемостью 34,0-50,0% при пересадке свежих и 33,3-39,1% после замораживания-оттаивания.

Впервые сравнительные научные исследования проведены на 6 породах крупного рогатого скота различного направления продуктивности, в ходе экспериментов получено более 1300 телят-трансплантатов 6 пород, в том числе 277 двоен, 56 телят после пересадки половин разделенных эмбрионов, из них 11 пар монозиготных близнецов, 35 телят с определенным полом и 46 телят после пересадки эмбрионов, полученных in vitro. Созданы стада и группы высокопродуктивного черно-пестрого, абердин-ангусского, симментальского, герефордского и лимузинского скота. На республиканский элевер поставлено более 200 генетически ценных бычков-трансплантатов 6 пород, полученных биотехнологическим путем, для использования в широкомасштабной селекции.

В 1987 г. по разработанному нами проекту был создан Брестский областной центр трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота (приказ Брестского областного агропромышленного Комитета № 358 от 7.12.1987 г.).

Научная новизна и практическая значимость исследований подтверждены 3 авторскими свидетельствами, 2 патентами на изобретения и 3 рационализаторскими предложениями. Получена приоритетная справка на получение патента на изобретение пролонгирования действия ФСГ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- заседаниях Ученого совета Брестской областной государственной с.-х. опытной станции. Пружаны (1988-1992 гг.);

- республиканской научной конференции "Интенсификация производства в отраслях агропромышленного комплекса на основе использования методов биотехнологии". Минск, 1989 г.;

- республиканском научно-методическом совещании "Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота". Жодино, 1989 г.;

- республиканской научно-практической конференции "Биотехнология и воспроизводство в животноводстве". Горки, 1991;

- расширенном заседании Ученого совета Брестской ГОСХОС. Пружаны, 1993 г.;

- расширенном заседании отдела биотехнологии БелНИИЖ. Жодино, 1993 г.;

- межгосударственной научно-практической конференции "Генетико-селекционные и технологические проблемы разведения сельскохозяйственных животных". Киев, 1994 г.;

- 2 межгосударственной научно-практической конференции "Селекционно-генетические и биотехнологические проблемы разведения крупного рогатого скота". Брест, 1995 г.;

- международной конференции "Научные основы интенсивного развития животноводства". Горки, 1995 г.;

- международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства". Горки, 1996 г.;

- межгосударственной научно-практической конференции "Новые методы селекции и разведения высокопродуктивных пород и типов животных". Киев, 1996 г.

- международной научно-практической конференции "Использование трансплантации эмбрионов в селекции и разведении сельскохозяйственных животных". Аскания-Нова, 1997 г.;

- международной научно-производственной конференции "Конкурент-носпособное производство продукции животноводства в республике Беларусь". Жодино, 1998 г.;

- международной научно-практической конференции "Сельскохозяйственная биотехнология". Горки, 1998 г.;

- 2 международная научно-практическая конференция "Сельскохозяйственная биотехнология". Горки, 2001 г.;

- международной научно-производственной конференции "Интенсификация производства продуктов животноводства". Жодино, 2002 г.;

- заседании научной конференции международного общественного объединения "Восток-Запад". Минск, 2003 г.

Реализация результатов исследований. Исследования проведены в 1986-2003 гг. в рамках республиканских научных программ: "Межотраслевая комплексная республиканская программа по приоритетным направлениям развития агропромышленного комплекса" (ВКГОКП № госрегистрации 01.8601311552), "Трансплантация эмбрионов в животноводстве Республики Беларусь на 1993-2000 гг." (ВКГОКП № 1997482); областных программ по развитию животноводства в период с 1990 по 2003 гг.

Основные положения и практические предложения использованы при подготовке 4 методических рекомендаций.

Результаты научных исследований внедрены и используются в лаборатории по трансплантации эмбрионов РСУП "Брестплемпредприятие", гос-племзаводах и племхозяйствах "Луч", "Дружба", "Мухавец", "Видомля", "За-козельский", колхозах "Советская Белоруссия", "Молодово", "Октябрь", "Красная звезда" Брестской области, СПК "Агрокомбинат "Снов" и УП "Аг-рокомбинат "Ждановичи" Минской области.

За работу "Внедрение и практическое использование биотехнологии трансплантации эмбрионов в племенном скотоводстве" в 1987 г. присуждена премия МК ВЛКСМ, МОС НТО и МОС ВОИР в области науки, техники, производства и педагогической деятельности.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. суперовуляция и эмбриопродуктивность у коров-доноров различных пород;

- стимуляция суперовуляции у коров-доноров одной инъекцией препаратов ФСГ с пролонгатором;

- эффективность длительного использования в качестве доноров эмбрионов коров различного направления продуктивности;

- разработка технологических аспектов повышения эффективности нехирургического извлечения эмбрионов;

- зависимость приживляемости от места аппликации эмбриона в роге матки и специальное устройство для трансцервикальной пересадки;

- межпородная пересадка и получение двоен;

- использование пересадки эмбрионов, как биотехнического метода борьбы с бесплодием высокопродуктивных коров;

- влияние криопротектора и породных отличий эмбрионов на их жизнеспособность после деконсервировации;

- достоверность определение пола на основе анализа ДНК Y-хромосом;

- разработка метода разделения эмбрионов при получении монозиготных близнецов в применении к условиям производства;

- жизнеспособность свежих и деконсервированных эмбрионов, полученных путем экстракорпорального оплодотворения ооцитов коров.

О публикованное ть результатов. По материалам диссертации опубликовано 48 научных работ, из них 3 авторских свидетельства, 2 патента на изобретения и 1 рекомендация. Материалы научных исследований были использованы при разработке 4 методических рекомендаций: "Технология трансплантации эмбрионов в молочном и мясном скотоводстве" (Жодино, 1996, 34 е.); "Криоконсервирование эмбрионов крупного рогатого скота" (Жодино, 1997, 19 е.); "Биотехнология воспроизводства крупного рогатого скота на основе оплодотворения ооцитов коров вне организма (in vitro)" (Жодино, 1999, 15 е.); "Технология получения эмбрионов крупного рогатого скота вне организма (in vitro) и долговременного их хранения" (Жодино, 2001, 17 е.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 234 страницах, состоит из введения, общей характеристики работы, основных методов и результатов собственных исследований с обзором литературы, заключения, предложений производству, списка использованной литературы и приложений. Содержит 55 таблиц и 49 рисунков. Список литературы включает 494 источника, из которых 282 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Бабенков, Владимир Юрьевич

выводы

1. Установлена высокая эффективность стимуляции полиовуляции ги-пофизарными гонадотропинами различного типа - фоллитропина (Литва), ФСГ-супер (Россия), ФСГ-п (США) и фолликотропина (Чехия). Наиболее высокие результаты были получены при использовании фолликотропина: выход качественных эмбрионов составил 75,0%, или 8,1 в среднем на донора. Аналогичные показатели при использовании первых трех препаратов находились в пределах 67,4-67,6% и 5,9-6,3 соответственно.

2. Разработанный способ стимуляции суперовуляции у коров при однократном введении препаратов ФСГ с пролонгатором поливиниловым спиртом позволяет повысить качество эмбрионов в зависимости от типа ФСГ на 7,5-15,2% и увеличить выход пригодных эмбрионов на 1,4-3,3 в среднем на донора при 8-кратном снижении затрат труда и стрессового воздействия на животное по сравнению с общепринятым 8-кратным введением препаратов.

3. По эффективности стимуляции полиовуляции не установлено преимущества мясных пород абердин-ангусской, герефордской и шаролезской перед черно-пестрым молочным скотом: соответственно при среднем числе овуляций 11,2; 12,2 и 12,2 против 11,5 выход качественных эмбрионов составил 5,5; 6,6 и 7,0 против 6,3 на донора. Повышенной реакцией на введение экзогенных гонадотропинов отличаются молочно-мясные симменталы канадской селекции, аналогичные показатели у которых составляют 17,0 и 9,3 соответственно.

4. С повышением кратности гормональных обработок не оказывает заметного влияния на суперовуляторную реакцию и общий выход зародышей, но отмечается нестабильное снижение их качества. Эти показатели в значительной степени зависят от породных и индивидуальных отличий животных. При многократном использовании черно-пестрых коров-доноров положительные результаты получены на протяжении 4-5 лет, коровы симментальской и абердин-ангусской пород могут использоваться в течение 2-2,5 лет, после чего отмечается снижение качества эмбрионов, использование в течение года шаролезского скота было наиболее эффективным. У коров-доноров герефордской породы отмечается снижение основных показателей уже после 1-й обработки, что ограничивает возможность их многократного использования.

5. При применении модифицированного способа вымывания эмбрионов по сравнению с известными сокращаются затраты времени на одну операцию при повышении извлекаемое™ эмбрионов на 6,7-7,7%. Разработанное устройство для нехирургического извлечения повышает эффективность получения эмбрионов на 13% и в 2 раза сокращает время на одну операцию по сравнению с двухканальным катетером "Нойштадт". Разработанный эмбрио-фильтр исключает потери и в 2-3 раза сокращает трудоемкость процессов поиска и оценки качества эмбрионов.

6. Разработанное гибкое телескопическое устройство для пересадки эмбрионов позволяет повысить приживляемость свежих и деконсервированных эмбрионов на 19,5 и 13,8% по сравнению с использованием базового устройства, катетером "Нойштадт": 71,4 и 59,2% против 51,9 и 45,4% соответственно.

7. Установлено, что при межпородной пересадке породная принадлежность эмбрионов не оказывает отрицательного влияния на приживляемость и превышает этот показатель по сравнению с внутрипородной пересадкой: уровень стельности при пересадке свежих эмбрионов по симментальской породе составляет 60,7%, герефордской - 60,9%, шаролезской - 60,0% против 53,7% по черно-пестрой. Приживляемость деконсервированных эмбрионов при межпородной пересадке находится на одном уровне с внутрипородной.

8. При ипсилатеральной пересадке реципиенту двух эмбрионов уровень стельности составляет 59,8% при выходе двоен 48,8%, что позволяет получать до 1,5 телят на один отел. Контрлатеральная пересадка эмбрионов предварительно осемененному реципиенту обеспечивает 63,2% стельности, но число двойневых отелов снижается до 31,4%, что зависит от показателя оплодотворяемости от первого осеменения по хозяйству в целом. При межпородной пересадке эмбрионов герефордов и абердин-ангусов с целью получения двоен стельность и выход двоен не снижаются по сравнению с внутрипородной пересадкой: 59,7 и 64,4% и 51,4 и 46,9% против 59,8 и 48,8% соответственно.

9. При получении разнопородных двоен имеет место доминирующее влияние чужеродных эмбрионов по отношению к эмбрионам, идентичным породе реципиента, выражающееся в повышении выживаемости после нехирургической пересадки. Приживляемость эмбрионов герефордов и симмен-талов при одновременной пересадке с черно-пестрыми эмбрионами заметно выше последних и составляет 41,9 и 40% против 30,2 и 30% соответственно.

10. Установлено, что трансцервикальная пересадка деконсервированных эмбрионов позволяет получать более 30% стельностей у коров с нарушениями воспроизводительных функций неясной этиологии.

11. Применение нового непроникающего криофилактика дисахарида трегалозы для уменьшения осмотического шока при деконсервации более эффективно по сравнению с традиционным использованием сахарозы: сохранность эмбрионов и стельность составляют 95,9 и 54,3% против 93 и 50,7% соответственно, что не уступает пересадке свежеполученных эмбрионов (56% стельности).

12. При нехирургической пересадке эмбрионов на стадии развития поздней морулы бычков рождается достоверно (Р<0,001) на 10,4% больше, чем телочек, при пересадке поздних бластоцист, напротив, на 8% больше телочек, чем бычков (Р<05001) [40, 47].

13. Установлено, что достоверность определения пола 6-8-суточных эмбрионов методом, основанным на анализе ДНК специфических участков Y-хромосом составляет 93,8%. Микробиопсия и процессы замораживания-оттаивания снижают жизнеспособность эмбрионов на 9,3%: приживляемость эмбрионов с определенным полом и интактных после деконсервации составляет 41,4 против 50,7% соответственно.

14. Микрохирургическое разделение эмбрионов с помощью разработанного устройства существенно упрощает и ускоряет процедуру разделения и по эффективности не уступает методу разделения с помощью сложной микроманипуляционной техники: стельность при пересадке реципиентам по 2 демиэмбриона составляет 61,9 и 65,8% соответственно (при пересадке 2 интактных эмбрионов 61,5%). Для разделения с равным успехом могут использоваться свежеполученные и деконсервированные эмбрионы: при пересадке реципиентам двух свежих или деконсервированных полуэмбрионов стельность составляет 65,8 и 66,7% соответственно.

15. Технология получения эмбрионов крупного рогатого скота путем оплодотворения in vitro позволяет достичь уровня созревания ооцитов до стадии оплодотворения 43,4%, получать до 33% биологически полноценных эмбрионов на стадии развития морула-бластоциста с приживляемостью при пересадке 1 и 2 эмбрионов 50-34% при пересадке свежих и 33,3-39,1% после замораживания-оттаивания соответственно.

16. При получении эмбрионов in vitro использование разработанного устройства для культивирования позволяет повысить уровень дробления зигот и выход эмбрионов до 54,8 и 33% соответственно, по сравнению с применением эксикатора (23,1 и 10,5%).

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Для повышения эффективности индуцирования полиовуляции, выхода и качества эмбрионов у коров-доноров при сокращении затрат труда и стрессового воздействия на животное рекомендуется однократное подкожное в области лопатки введение препаратов ФСГ в суспензии поливинилового спирта.

2. Для нехирургического извлечения и сбора эмбрионов предлагаются усовершенствованный способ и разработанные устройства, позволяющие повысить выход эмбрионов от числа овуляций до 80,9%, в 2-3 раза снизить трудоемкость процесса, потери эмбрионов и время нахождения их вне организма.

3. Предлагается телескопическое устройство для трансцервикальной пересадки, которое позволяет проводить аппликацию эмбрионов в верхушку рога матки без риска травмирования эндометрия и повышает приживляемость при пересадке свежих и деконсервированных эмбрионов до 71,4 и 59,2% соответственно, что на 19,5 и 13,8% выше, чем при использовании базового инструмента, катетера фирмы "Нойштадт".

4. Пересадка эмбрионов может быть использована как биотехнический метод борьбы с бесплодием у высокопродуктивных коров с нарушениями воспроизводительных функций неясной этиологии.

5. При получении монозиготных двоен предлагается устройство для микрохирургического разделения эмбрионов, использование которого позволяет проводить разделение эмбрионов в условиях ферм с эффективностью, не уступающей использованию дорогостоящей микроманипуляцион-ной техники.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Бабенков, Владимир Юрьевич, Дубровицы

1. Амарбаев A.M., Шихов И.Я., Аббасов Б.Х. Дальняя транспортировка эмбрионов коров и их межпородная пересадка. Вестник с.-х. науки Казахстана, 1982. - №8. - С. 62-63.

2. А.с. 1704775 СССР, МКИ5 А 61 D 19/02. Устройство для сбора эмбрионов животных /Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В. №4820659/15 (030032); Заявл. 15.03.90; Опубл. 15.09.91, Бюл. № 2 // Открытия. Изобретения. - 1991. - № 2.

3. А.с. 1727819 СССР, МКИ5 А 61 D 19/02. Устройство для разделения эмбрионов животных / Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В. № 4807032/15 (19975); Заявл. 15.02.90; Опубл. 23.04.92, Бюл. № 15 // Открытия. Изобретения. - 1992. - №15.

4. А.с. 1796171 СССР, МКИ4 А 61 D 19/04. Устройство для трансплантации эмбрионов /Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В. №4769683/15 (150523); Заявл. 19.12.89; Опубл. 8.10.92, Бюл. № 7 // Открытия. Изобретения. - 1992. -№7.

5. Ахмедов Н.М., Эюбов И.З., Керимов Т.А. и др. К изучению уровня полиовуляции и качества эмбрионов при применении ФСГ-п и фоллигона /Изв. АН АзССР. Сер.биол.Наук. 1986. - №6. - С. 42-46.

6. Бабенков В.Ю., Семечко А.П. Эффективность трансцервикальной пересадки эмбрионов с помощью нового инструмента. // Биотехнология и воспроизводство в животноводстве: тез. докл. науч.-практ. конф. Горки, 1991.-С.6-8.

7. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Детерминация пола и стадии развития эмбрионов при трансплантации. // Матер. Междун. науч.-произв. конф. "Конкурентоспособное производство продукции животноводства в Республике Беларусь". Жодино,1999. - С. 79.

8. Бабенков В.Ю. Инструмент нового типа для нехирургической трансплантации эмбрионов. // Генетико-селекционные и технологические проблемы разведения сельскохозяйственных животных: Тез. докл. науч.-практ. конф. Киев, 1994. - С. 73-74.

9. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова JI.B. Трансплантация эмбрионов у коров породы шароле. // Селекционно-генетические и биотехнологические проблемы разведения крупного рогатого скота: Тез. докл. 2 межгос. науч.-практ. конф. Брест, 1995. - С. 33-35.

10. Бабенков В.Ю., Бабенкова J1.B. Допустимость изменений режима замораживания эмбрионов // Зоотехния. 1991. - № 11. - С. 62-63.

11. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Микрохирургическое разделение крио-консервированных эмбрионов // Новые методы селекции и разведения высокопродуктивных пород и типов животных: Матер, науч.-практ. конф. Киев, 1996.-С. 305.

12. Бабенков В. Зависимость соотношения полов при трансплантации от стадии развития эмбрионов. // Вет. газ. 1997. - № 1 (35).

13. Бабенков В.Ю. Получение двоен крупного рогатого скота с использованием биотехнологических методов / Уч. зап. Витебской гос. акад. вет. медицины, 2000.-т. 36, ч. 1.-С. 126-127.

14. Бабенков В.Ю., Бабенкова JI.B. Использование дисахарида трегало-зы при деконсервации эмбрионов. // Сельскохозяйственная биотехнология: Матер, междунар. научно-практ. конфер. Горки, 1998. - С. 255-257.

15. Бабенков В.Ю. Использование трансплантации эмбрионов в воспроизводстве крупного рогатого скота Бресткой области / Зоотехнич. наука Беларуси, 2000. т.34. - С. 62-67.

16. Использование этиленгликоля при замораживании эмбрионов. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. // Новые методы селекции и разведения высокопродуктивных пород и типов животных: Матер, науч.-практ. конф. Киев, 1996. -С. 304.

17. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Стимуляция суперовуляции у коров-доноров различных пород. // С.-х. биотехн.: Матер. И-ой междун. науч.-практ. конф. Горки, 2001. - С. 349-350.

18. Бабенков В.Ю., Якубец Ю.А., Бабенкова Л.В., Кыса И.С. Пролонгирование действия гипофизарных гонадотропинов при стимуляции суперовуляции у коров-доноров. // С.-х. биотехн.: Матер. П-ой междун. науч.-практ. конф. — Горки, 2001. С. 351-353.

19. Бабенков В.Ю., Жук Н.Ф. Стимуляция суперовуляции у коров-доноров различных пород // Интенсификация производства продуктов животноводства: Матер, междун. науч.-произв. конф. Жодино, 2002. - С. 6.

20. Бабенков В.Ю. Определение пола эмбрионов крупного рогатого скота методом гибридизации ДНК Y-хромосом // Интенсификация производства продуктов животноводства: Матер, междун. науч.-произв. конф. — Жодино, 2002. С. 7.

21. Бабенков В.Ю., Жук Н.Ф., Черневский Н.А. Пересадка эмбрионов крупного рогатого скота как биотехнический метод борьбы с бесплодием. // Интенсификация производства продуктов животноводства: Матер, междун. науч.-произв. конф. Жодино, 2002. - С. 8.

22. Бабенков В.Ю. Опыт использования трансплантации эмбрионов как биотехнического метода борьбы с бесплодием высокопродуктивных коров.// Ветеринарная медицина Беларуси. 2003. - № 3. - С. 30-31.

23. Бабенков В.Ю. Стимуляция суперовуляции у коров одной подкожной инъекцией ФСГ в суспензии поливинилового спирта. // Зоотехния. -2003.-№8.-С. 27-29.

24. Багрий Б.А. Интенсивное использование высокопродуктивных коров в качестве доноров для получения и трансплантации эмбрионов // Проблемы развития биотехнологии в животноводстве: Тез. докл. Дубровицы, 1990.-С. 70-71.

25. Байтлесов Е.У. Криоконсервирование и морфологическая оценка эмбрионов коров мясного скота: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.13 / Всерос. науч.-иссл. ин.-т жив. Дубровицы, 1992. - 24 с.

26. Бахитов К.И., Логинов А.Г. Влияние антисыворотки к СЖК на функцию яичников коров при суперовуляции. / Бюл. ВНИИ физиологии, биохимии и питания с.-х. животных. 1986. №5. - С. 51-55.

27. Бахитов К.И., Плешкина К.И. Эндокринный контроль полиовуляций у крупного рогатого скота. // Нейроэндокринная регуляция воспроизводства и продуктивности сельскохозяйственных животных. Боровск, 1983. -Т.27.-С. 12-20.

28. Биккулов А.С., Сейдалитов С.С., Коваленко Т.П. и др. Нехирургическая трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота в условиях молочного комплекса. // Сельскохозяйственная биология. 1983. - №10. - С. 51-54.

29. Бриль Э.Е. Гормоны и воспроизводство крупного рогатого скота. -Минск: Урожай. 1979. - 88 с.

30. Брусиловский А.И. Жизнь до рождения. 2-е изд., перераб. и доп. -М.: Знание. - 1991. - 224с. ( С. 56-60).

31. Бугров А.Д., Коркин В. Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота: Тез. докл. -Тарту, 1986.-С. 7-8.

32. Бугров А.Д. Совершенствование технологии трансплантации эмбрионов. // Зоотехния. 1989. - №11. - С. 50-52.

33. Бугров А.Д., Невинный Н.А. Приживляемость эмбрионов в зависимости от качества желтого тела реципиента. // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота: Тез. докл. Жодино, 1989. - С. 101-102.

34. Бугров А.Д., Коркин В.А. Многократное использование коров-доноров при трансплантации эмбрионов. // В сб. "Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных". М., 1988. - С. 45-51.

35. Букарова В., Плаксеев А., Ефремова Н. Глубокое замораживание эмбрионов крупного рогатого скота и овец. / Сб. науч. трудов. Дубровицы, 1983.-т. 44.-С. 59-62.

36. Букаров И.В. Оценка качества зародышей крупного рогатого скота в связи с трансплантацией. // Матер. Респ. конф. Тарту, 1986. - С. 182-184.

37. Будевич И.И., Сахончик П.Е., Коломоец А.Е. Замораживание эмбрионов крупного рогатого скота. // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота: Тез. докл. Жодино, 1989. - С. 40-41.

38. Вильсон В., Зуев Н. Синхронизация охоты у коров и телок. // Животноводство. 1984. - №5. - С. 40-41.

39. Влияние простагландинов на воспроизводительную функцию крупного рогатого скота. Дьяконов Е.В., Горячев В.В., Щелова Н.Н., Булгаков Р.И. / Эндокринология и трансплантация зигот сельскохозяйственных животных. М.: Колос. - 1982. - С. 164-167.

40. Воронцова М., Тарадайник Т., Дронин А. Опыт трансплантации эмбрионов. // Молочное и мясное скотоводство. 1988. - №3. - С. 19-20.

41. Вызывание суперовуляции у крупного рогатого скота с целью получения зародышей для трансплантации. Прокофьев М.И., Рябых В.П., Бахи-тов К.И. и др. / Эндокринология и трансплантация зигот сельскохозяйственных животных. М.: Колос - 1982. - С. 42-53.

42. Гавриков А., Маслев Ц., Алексеенко А., Карадочев М. Некоторые аспекты замораживания и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. // Животн. науки. София, 1989. - 26. - № 8. - С. 66-69.

43. Гавриков A.M., Алексеенко А.Н., Маслев Ц.И. Эффективность режимов замораживания и оттаивания эмбрионов. // Зоотехния. 1989. - № 7 -С. 54-55.

44. Гавриков A.M., Маслев Ц.И., Алексеенко А.Н., Дронин А.П. Ускоренное воспроизведение высокопродуктивного мясного скота методом трансплантации эмбрионов. // Доклады ВАСХНИЛ. 1991. - № 2. - С. 40-42.

45. Гавриков A.M., Маслев Ц.И. Особенности использования мясных коров в качестве доноров эмбрионов. // Зоотехния. 1992. - № 9-10. - С. 3435.

46. Гавриков A.M. Сергеев Н.И. Методические рекомендации по отбору, подготовке к суперовуляции и осеменению коров мясных пород. — Дуб-ровицы, 1993.-С. 1-24.

47. Гавриков А. Кинзеев В., Абуов А., Мукминов М., Басанов Е. Использование мясных коров в качестве доноров эмбрионов. // Молочное и мясное скотоводство. 1993. - № 1. - С. 22-24.

48. Гавриков A.M., Сергеев Н.И., Прокофьев М.И., Павлов Е.А., Совет-кин С.В. Технология трансплантации эмбрионов в мясном скотоводстве (Рекомендации). М., 1994. - С. 1-61.

49. Гавриков A.M. Технология трансплантации эмбрионов в мясном скотоводстве. / Автореф. дис. д-ра биол. наук: 03.00.13. / Веер. НИИ жив-ва. -Дубровицы, 1995. 46 с.

50. Голубец JI.B., Будевич А.И. Содержание гормонов в крови коров-доноров при вызывании суперовуляции. // Актуальные проблемы развития АПК. Горки, 1990. - С. 6.

51. Гордон А. Контроль воспроизводства сельскохозяйственных животных. М: ВО "Агропромиздат", 1988. - 415 с.

52. Григорьева Т.Е., Рыжов Б.В., Кононов Г.А. Суперовуляторная реакция яичников у коров и телок на введение гормональных препаратов: Сб. научи. тр. Ленинград, 1979 -№ 55. - С. 21-24.

53. Гринь М.П. Состояние и направление племенной работы в молочном скотоводстве Белоруссии. // Совершенствование пород и создание высокопродуктивных стад сельскохозяйственных животных. Жодино, 1983. - С. 3-11.

54. Гузеватый О.Е. Созревание и оплодотворение in vitro ооцитов коров в фолликулярной жидкости. // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота: Тез. докл. Жодино, 1989. - С. 89-91.

55. Дисекция деконсервированных эмбрионов. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Сивая Н.Н., Бабенкова Л.В. и др. // Мат. межд. науч.-практ. конф. "Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства". Горки, 1996. -С. 132-134.

56. Довгопол В.Ф., Осташко Ф.И., Исаченко В.В. Совершенствование нехирургического метода трансплантации эмбрионов. // Зоотехния. 1992. -№ 2 - С. 17.

57. Дронин А.П., Смыслова Н.И. Сравнение двух способов гормонального вызывания суперовуляции у коров-доноров. / Труды ВИЖа: Применение метода трансплантации эмбрионов в селекции сельскохозяйственных животных. Дубровицы, 1988. - С. 21-23.

58. Дуванов А.В. Технология получения качественных эмбрионов и пересадки полуэмбрионов. // Генет.-селекц. и технологич. пробл. развед. с.-х. жив-х: Тез. докл. науч.-практ. конф., Киев, 1994. С. 79.

59. Жилайтис В., Анюлис Э. Изучение возможности получения монозиготного потомства коров при пересадке частично разделенных эмбрионов. // Матер, науч.-практ. конф. "Битехнология и воспроизводство в животноводстве". БСХА, Горки, 1991. - С. 26-27.

60. Завадовский М.М. Зоотехническая эндокринология в СССР. // Проблемы зоотехнической экспериментальной эндокринологии. 1934. — Т.1. — С. 95-98.

61. Завадовский М.М. Теория и практика гормонального метода стимулирования многоплодия сельскохозяйственных животных. М., 1963. - 258 с.

62. Завадовский М.М., Эскин И.А., Овсянников Г.Ф. Регулирование женского полового цикла у коров: Труды по динамике развития. 1936. -Т.9.-С. 95-98.

63. Завертяев Б.П. Повышение многоплодия в скотоводстве. М.: Рос-сельхозиздат, 1987. - С. 6-175.

64. Завертяев Б.П. Генетические аспекты селекции молочного скота на плодовитость. // Сел. хоз. за рубежом. 1980, № 7. - С. 43-46.

65. Завертяев Б.П. Селекция коров на плодовитость. Ленинград, 1979. -С. 120-127.

66. Завертяев Б.П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. Ленинград, 1989. - 255 с.

67. Зверева Г.В., Хомин С.П. Гинекологические болезни коров. Киев: Урожай, 1976.

68. Зверева Г.В., Хомин С.П., Осыскеев В.К. Физиологические аспекты воспроизводительной функции высокопродуктивных коров. // Республиканская науч. конф. / Институт Лесостепи и Полесья: Тез. докл. Харьков, 1988. -С. 69.

69. Ибрагимов Ю. Факторы, влияющие на эффективность гормонального вызывания суперовуляции, качество и приживляемость эмбрионов при трансплантации. // Тез. докл., Жодино, 1989. С. 47.

70. Извлечение и пересадка зародышей у крупного рогатого скота нехирургическим способом. // Белевич В.Г., Прокофьев М.И., Черных В.Я. и др./ Эндокринология и трансплантация сельскохозяйственных животных. -М., 1982.-С. 53-71.

71. Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. -М., 1984.- 136 с.

72. Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. /Росагропром СССР, ВАСХНИЛ М., 1987. - 92 с.

73. Кабира. Культивирование и оплодотворение яйцеклеток in vitro: Сб. науч. тр. / Повышение эффективности продуктивных и племенных качеств сельскохозяйственных животных. Ленинград, 1990.-С. 17-21.

74. Каганская В.В., Свиридов Б.Е. Культивирование ооцитов коров с фолликулярными клетками. // Проблемы развития биотехнологии в животноводстве: Тез. докл. Дубровицы, 1990, с

75. Квасницкий А.В. Новое в физиологии размножения животных. -М., 1950.-С. 104.

76. Кива М.С. Многоплодие коров, его параметры, биологические особенности и хозяйственное значение. // Пути увеличения производства и улучшения качества продукции земледелия и животноводства. Белая Церковь, 1980.-С. 98-100.

77. Кириллова Н.И., Лебедев В.И., Бабенков В.Ю. Влияние кратности суперовуляции коров-доноров на качество эмбрионов. // Животноводство. -1986.-№ 10.-С. 45-46.

78. Клецко Н.Г., Гольдман И.Л., Валынчук В.Ф., Никитин В.А. // 2 Всесоюзный симпозиум по иммунологии воспроизводства: Тез. докл. М., 1980. -С. 7-9.

79. Клецко Н.Г., Корецкая, 1985

80. Клецко Н.Г., Смыслова Н.И., Ефремова М.Н., Мазепкин С.А. При-живляемость замороженно-оттаянных эмбрионов крупного рогатого скота в зависимости от их качества. //Тез. докл., Львов, 1988. С. 56-57.

81. Клецко Н.Г., Мадич А.В. Основы микроманипуляции с эмбрионами животных. // Бюл. науч. работ ВИЖа, 1988. вып. 89. - С. 44-48.

82. Клецко Н.Г. Разделение эмбрионов и пересадка ядер как метод клонирования эмбрионов крупного рогатого скота. // Бюл. науч. работ ВИЖа, 1988.-вып. 89.-С. 48-52.

83. Клецко Н.Г. Волынчук В.Ф. Методические подходы к клонированию эмбрионов млекопитающих. // Бюл. научных работ ВИЖа, 1982. вып. 65.-С. 22-23.

84. Клинский Ю.Д., Башкеев Е.Д., Даровских В.Е. Методы гормональной регуляции воспроизведения сельскохозяйственнных животных при промышленной технологии. // Гормоны в животноводстве: Сб. науч. тр. М., 1977.-С. 112-125.

85. Клинский Ю.Д., Алексеенко А.А. Трансплантация зародышей у сельскохозяйственных животных. // Итоги науки и техники: Животноводство и ветеринария. М., 1979. - т. 12.

86. Клинский Ю.Д., Сергеев Н.И., Даровских В.Е. Трансплантация оплодотворенных яйцеклеток у крупного рогатого скота. // Ветеренария -1980. № 5.-С. 51-53.

87. Клинский Ю.Д., Сергеев Н.И., Шихов И.Я. Теленок из замороженного эмбриона. // Животноводство. 1980. - № 7.

88. Клинский Ю.Д. Селекция и трансплантация зигот. // Животноводство. 1981.-№ 7. - С. 20.

89. Клинский Ю.Д., Сергеев Н.И. Результаты трансплантации зародышей у крупного рогатого скота. // Эндокринология и трансплантация зигот с.-х. животных. М., Колос, 1982. - С. 16-42.

90. Клинский Ю.Д., Кудра И. Совершенствование метода вызывания суперовуляции у крупного рогатого скота. // Тез. док. науч. симп. поев. 56-летн. юбил. Молд. Гос.Агроуниверс. 1998, 7-8 октября.

91. Клинский Ю.Д. Проблемы эндокринологии сельскохозяйственных животных. // Акт. пробл. животн.: науч. тр. ВИЖ. вып. 57. - ч. 3-4.

92. Клинский Ю.Д. Оплодотворение ооцитов млекопитающих вне организма. // Сел. хоз-во за рубежом. 1984. - № 3. - С. 49-54.99. Клинский Ю.Д.

93. Клинский Ю.Д. Биотехника воспроизводства стада на крупных фермах и комплексах. // Животноводство 1984 - № 7 - С. 24.

94. Клинский Ю.Д., Истомина JT.A., Шихов И.Я. Оплодотворение ооцитов млекопитающих вне организма. // Сельское хозяйство за рубежом, 1984 -№ 3-С. 49-53.

95. Коновалов Н.Г., Сергеев Н.И., Шихов И.Я. Разработка методов подготовки доноров и реципиентов к трансплантации зародышей у крупного рогатого скота. // Гормоны в животноводстве: бюл. научн. работ. Дуброви-цы, 1981. - вып. 64. - С. 36-42.

96. Кузьмина Т.И., Завертяев Б.П., Шагометова Г.А. Перспективы использования тканевой культуры фолликулов для созревания ооцитов коров вне организма. // Проблемы развития биотехнологии в животноводстве: Тез. докл., Дубровицы, 1990. С. 22-24.

97. Курыкин Е. Эффективность различных технологий вымывания эмбрионов. // Использование метода трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота: Тез. докл., Сигулда, 1988. С. 4-6.

98. Кучухидзе М.Н. Суперовуляция у высокопродуктивных коров при обработке гормоном ФСГ. // Животноводство. 1987. - № 12. - С. 48.

99. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова JI.B. Получение двоен методом трансплантации эмбрионов. // Матер, междун. науч.-практ. конф. "Сельскохозяйственная биотехнология". Горки, 1998. - С. 255-257.

100. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Сивая Н.Н., Бабенкова J1.B., Радкевич

101. B.В., Пронько А.Ф. Сравнение эффективности трансплантации эмбрионов различного происхождения. // Матер, междун. науч.-практ. конф. "Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства". Горки, 1996. - С. 184-185.

102. Лебедев В.И., Ибрагимов Ю., Шейкин И.В. Гормональное вызывание суперовуляции у коров доноров разными препаратами. // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота: Тез. докл., Жодино, 1989. С. 69-70.

103. Лешкевич А.А. Прогнозирование эффективности трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота: Автореф. дис. . канд. с.-х. наук. / БелНИИЖ. Жодино, 1993. - 24 с.

104. Лопырин А.И., Лошнова Н.В., Карпов П.Я. Опыт межпородной пересадки зародышей. // Сельская зоотехния. 1950. - № 8. - С. 50-64.

105. Лубош Г. Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота в производственных условиях. // Междун. сельскохоз-й журн. 1987. - № 14.1. C. 82-85.

106. Мадисон В.В., Крылов С.Н. Совершенствование схем суперовуляции в условиях производства. / Сб.: "Трансплантация эмбрионов у крупного рогатого скота". Таллин, 1986.

107. Мадисон В.Л., Гавриков A.M., Сальникова И.М. Выбракованные коровы-доноры эмбрионов. // Животноводство. 1986. - № 5. - С. 48.

108. Мадисон В.В. Опыт организации работ по трансплантации эмбрионов в условиях хозяйств. // Бюл. науч. работ. Дубровицы, 1987. - вып. 87.-С. 57-59.

109. Мадисон B.JL, Сальникова И.М., Тарасюк Н.Н. Результаты крио-консервирования, дальней транспортировки и пересадки замороженно-оттаянных эмбрионов крупного рогатого скота. // Бюл. науч. работ. Дубровицы, 1987. - вып. 87. - С. 47-49.

110. Мадисон В.В., Мадисон B.J1. Трансплантация эмбрионов в практике разведения молочного скота. М: ВО "Агропромиздат". - 1988. - 128 с.

111. Мадисон В.В., Мадисон J1.B., Крылов С.Н. Совершенствование технологических приемов применительно к условиям практической трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. // Трансплантация эмбрионов с.-х. животных. -М., 1988.-С. 51-56.

112. Мадисон B.JL, Лебедев В.И., Ибрагимов Ю.Ю. Эффективность использования высокопродуктивных коров и племенных телок в качестве доноров эмбрионов. // Биология воспр. и биотехнол. методы развед. с.-х. животных. 1989. - С. 103-106.

113. Мадисон В.Л., Дронин А.П., Павлов Н.Г. Технология получения и пересадки эмбрионов в производственных условиях. // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. Жодино, 1989, С. 20-22.

114. Мадисон В.Л. Результаты исследований по трансплантации эмбрионов и внедрение метода в практику воспроизводства высокопродуктивного молочного скота. // Научн. тр. ВИЖа. Дубровицы, 1991. - вып. 104. -С. 7-11.

115. Мальцева И.В. Криоконсервирование эмбрионов в паеттах с применением сахарозы. // Животноводство. 1989. - № 7. - С. 41.

116. Мазепкин С.А., Федюшкин А.Ф., Сукачева Л.П. Замораживание эмбрионов крупного рогатого скота. // Проблемы развития биотехнологии в животноводстве: Тез. докл. Всесоюзн. науч.-техн. совещ. Дубровицы, 1990, с. 59-60.

117. Методические рекомендации по оценке качества эмбрионов крупного рогатого скота при трансплантации. Сергеев Н.И., Букарова В.И., Гольдман И.Л. Дубровицы, 1984. - 31 с.

118. Методические рекомендации по хирургическому извлечению и пересадке эмбрионов крупного рогатого скота. Н.И.Сергеев, А.В.Овчинников, А.А.Некрасов, Н.И.Смыслова. Дубровицы, 1983. - 23 с.

119. Методические рекомендации по гормональному вызыванию полиовуляции у крупного рогатого скота. Сергеев Н.И., Дронин A.M., Смыслова Н.И., Мальцева И.В. Дубровицы, 1987. - 9 с.

120. Методические рекомендации по гормональному вызыванию суперовуляции у коров-доноров при трансплантации эмбрионов. Сергеев Н.И., Дронин А.П., Смыслова Н.И., Мальцева И.В. Дубровицы, 1988. - 22 с.

121. Методические рекомендации по гормональному вызыванию суперовуляции у коров-доноров при трансплантации эмбрионов. Сергеев Н.И., Дронин А.П., Смыслова Н.И., Мальцева И.В. Дубровицы, 1991. - 28 с.

122. Методические указания по использованию французской технологии трансплантации эмбрионов. Жильцов Н.З., Кундышев П.П. и др. М., 1986.-32 с.

123. Методические рекомендации по криоконсервированию эмбрионов крупного рогатого скота, овец и кроликов. Сергеев Н.И., Нетеча В.И., Мазеп-кин С.П. Дубровицы, 1987. -23 с.

124. Методические рекомендации по использованию технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота в племенных хозяйствах. Решетникова Н.М., Малиновская В.А., Малиновский A.M., Мороз Т.А. и др. -А., 1988.-21 с.

125. Методические рекомендации по культивированию эмбрионов крупного рогатого скота in vitro. Ленинград, 1989. 36 с.

126. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. М.: Сельхозиздат. - 1962. - С. 169-595.

127. Многократное использование коров-доноров для извлечения эмбрионов. Соловский Н.С. Слипченко С.Н., Лапина М.Н., Витол В.А. // Проблемы развития биотехнологии в животноводстве: Тез. докл., Дубровицы, 1990-С. 72-73.

128. Морозов Е.И., Тарасевич Е.И., Анохина B.C. Генетика в вопросах и ответах. Мн.: Университетское. - 1989.-288с.

129. Мюйрсепп И., Хинт Р. Причины низкого количества и качества эмбрионов при суперовуляции. // Трансплантация эмбрионов у крупного рогатого скота: Тез.докл., Таллин, 1986. С. 20-21.

130. Нежданов А.Г., Соловьев Н.А. Гормональная функция яичников в течение полового цикла. // Ветеринария. 1986. - № 4. - С. 56-58.

131. Некрасов А.А., Смирнов А.О., Новгородов А.Н. Уровень полиовуляции икачество эмбрионов в зависимости от гонадотропина. // Трансплантация эмбрионов в молочном скотоводстве и овцеводстве. Дубровицы, 1985. -С. 10-12.

132. Немилов А.В. Гистология и эмбриология домашних животных. -М.: Сельхозиздат. 1934. - С. 27-30.

133. Нетеча В.И. Современная технология криоконсервирования эмбрионов. // Трансплантация эмбрионов с.-х. животных. М., 1988. - С. 81-83.

134. Нетеча В.И., Плаксеев А.А., Мазепкин С.А. Влияние некоторых факторов на приживляемость замороженно-оттаянных эмбрионов при нехирургической пересадке. // Бюл. науч. работ, ВИЖ. Дубровицы, 1987. - вып. 87. - С. 44-46.

135. Нетеча В.И., Плаксеев А.А. Криоконсервирование эмбрионов крупного рогатого скота и овец. // Трансплантация эмбрионов с.-х. животных.-М., 1988.-С. 78-81.

136. Никоян П.Е. Хориогонин, рилизинг-гормон и овуляция у коров и телок. // Ветеринария. 1981. - № 10. - С. 47-48.

137. Овчинников А.В. Результаты нехирургической трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота. // Трансплантация эмбрионов в молочном скотоводстве и овцеводстве, ВИЖ. Дубровицы, 1985. - С. 25-28.

138. Овчинников А.В., Смыслова Н.И. Уровень суперовуляции и качество эмбрионов при применении ФСГ-п, ГСЖК-маротропина и фоллигона. // Трансплантация эмбрионов в молочном скотоводстве и овцеводстве, ВИЖ. -Дубровицы, 1985.-С. 16-18.

139. Оценка качества эмбрионов крупного рогатого скота: Руководство для работы по пересадке эмбрионов. П. Кауффольд, И.Тамм, И.Я.Шихов и др. М.: Агропромиздат. - 1990. - 56 с.

140. Павлов В.А. Физиология воспроизводства крупного рогатого скота. М.: Россельхозиздат. - 1984. - 208 с.

141. Патент СССР № 1792327. Устройство для нехирургического извлечения эмбрионов у животных. / Бабенков В.Ю., Будевич И.И., Бабенкова Л.В. // Открытия. Изобретения. 1993. - бюл. № 4.

142. Патент СССР № 1822341. Устройство для культивирования эмбрионов животных. / Кононенко В.Л., Романов Ю.Д., Бабенков В.Ю., Васин В.Т. // Открытия. Изобретения. 1993. - бюл. № 22.

143. Передера К.Б. Суперовуляция и получение эмбрионов от разных пород крупного рогатого скота. // Научно-техн. бюл. НИИ животн-ва Лесостепи и Полесья УССР. 1982. - № 35. - С. 56-59.

144. Плаксеев А.А., Тарасюк Н.Н. Оценка эффективности замораживания эмбрионов при использовании разных программных устройств. // Бюл. науч. работ ВИЖ 1988. - вып. 89. - С. 55-56.

145. Плященко С.И., Сидоров В.Т. Естественная резистентность организма животных. Ленинград: Колос. - 1979. - 182 с.

146. Полянцев Н.И. // Животноводство. 1972. - № 1. - С. 73.

147. Прокофьев М.И., Алиев А.А., Рябых В.П. и др. Трансплантация зигот у крупного рогатого скота. // Вестн. с.-х. науки. 1977. - № 6. - С. 85-94.

148. Прокофьев М.И., Бахитов К.И., Рябых В.П. и др. Эндокринная реакция у коров при различных способах вызывания суперовуляции. // Сель-скохоз. биол. 1980. - № 2. - С. 302-306.

149. Прокофьев М.И., Белевич В.П., Рябых В.П. Технология нехирургической трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. // Животноводство. 1980. -№ 2. - С. 50-54.

150. Прокофьев М.И. Регуляция размножения сельскохозяйственных животных. JL: Наука. 1983. - 264 с.

151. Прокофьев М.И. Получение высокопродуктивных коров методом трансплантации эмбрионов. // Выведение коров для молочных комплексов. -М.: Колос. 1981. - С. 209-226.

152. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышейшая школа. - 1973.-320 с.

153. Рябых В.П. Эндокринные аспекты регулирования процессов фол-ликулогенеза и суперовуляции у крупногорогатого скота. // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. Жодино, 1989, С. 82-84.

154. Рэфф Р., Кофмен Т. Эмбрионы, гены и эволюция. Пер. с англ. -М.: Мир.- 1986.-404 с.

155. Самарютель Я.Ю. Зависимость качества и количества эмбрионов от сроков использования коров в качестве доноров эмбрионов после отела. // Трансплантаци эмбрионов крупного рогатого скота: Тез. докл., Жодино, 1989, С. 78.

156. Самоделкин А.Г., Гавриков A.M., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов в мясном скотоводстве. М.: АОЗТ "Зоосалон".-1996. - С.15-18. (96 с).

157. Самоделкин А.Г. Интенсификация воспроизводства крупного рогатого скота мясных пород на основе биотехнологических методов: Автореф. дис. . д-ра биол. наук: 03.00.13. / ВИЖ. Дубровицы, 1998. - 41 с.

158. Свитоюс А.Г. Усовершенствование методов вызывания суперовуляции у крупного рогатого скота: Автореф. дис. на соиск. уч. ст. канд. биол. наук. ВИЖ. Дубровицы, 1989. - 16 с.

159. Сергеев Н.И. Исследования по совершенствованию биотехнологии гормонального вызывания суперовуляции у коров-доноров при трансплантации.

160. Трансплантация эмбрионов у крупного рогатого скота: Тез. докл., Таллин, 1986, С. 5-6.

161. Сергеев Н.И., Клинский Ю.Д. Результаты трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота в СССР. // Архив экспериментальной ветеринарии и медицины. Лейпциг, 1982. - 36. - № 1. - С. 55-60.

162. Сергеев Н.И. Хирургическая техника и результаты получения и пересадки эмбрионов крупного рогатого скота. // Архив экспериментальной ветеринарии и медицины. Лейпциг, 1982. - 36. - № 1. - С. 71-75.

163. Сергеев Н.И. Получение двоен путем трансплантации эмбрионов осемененным коровам-реципиентам. / Докл. ВАСХНИЛ. 1986. - № 4. - С. 26-28.

164. Сергеев Н.И. Факторы, определяющие эффективность нехирургической пересадки эмбрионов крупного рогатого скота. / Бюл. науч. работ ВИЖ. Дубровицы, 1987. - вып. 87. - С. 34-37.

165. Сергеев Н.И., Шихов И .Я. Эффективность гормонального вызывания овуляции у коров и телок-доноров в зависимости от сезона года. // Животноводство. 1983. - № 12. - С. 53.

166. Сергеев Н.И., Гавриков A.M. Симпозиум по трансплантации. // Животноводство. 1986. - № 4. - С. 62.

167. Сергеев Н.И., Амарбаев А. Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. Алма-Ата, Кайнар - 1987. - 158 с.

168. Сергеев Н.И., Гредзен В., Лиепа А.Л., Пиланс Я.Я. Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. // Ветеринария. 1987. - № 5. - С. 56-58.

169. Сергеев Н.И., Шихов И.Я. Рождение двоен при трансплантации двух эмбрионов. / Докл. ВАСХНИЛ. 1980. - № 12. - С. 24-26.

170. Сергеев Н.И., Некрасов А.А., Смыслова Н.И. Эндокринные аспекты механизма материнского опознования беременности в связи с прижив-ляемостью эмбрионов при трансплантации. // Сельскохозяйственная биология. 1986.-№ 3. - С. 11-18.

171. Сергеев Н.И., Овчинников А.В., Смыслова Н.И. Взаимодействие между донором, эмбрионом и реципиентом при нехирургической трансплантации. // Животноводство. 1987. - № 6. - С. 52-54.

172. Сергеев Н.И., Мадисон В.Л. Использование метода трансплантации в животноводстве. // Междун. с.-х. журнал. 1985. - № 6. - С. 15.

173. Сергеев Н.И., Смыслова Н.И., Смирнов А.О. Влияние некоторых факторов на уровень суперовуляции и качество эмбрионов у коров-доноров. / Бюл. науч.работ ВИЖ. Дубровицы, 1987. - вып. 87. - С. 38-40.

174. Сергеев Н.И., Мадисон В.Л., Лебедев В.И. Методические рекомендации по многократному использованию коров в качестве доноров при трансплантации. Дубровицы, 1988. - 13 с.

175. Сергеев Н.И., Дронин А.П., Мальцева И.В. Эффективность применения трансплантации в практике разведения высокопродуктивных животных. // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота: Тез. Докл., Жодино, 1989.-С. 65-67.

176. Смирнов O.K., Клинский Ю.Д., Сергеев Н.И. Научные проблемы и пути внедрения трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. // Вестник с.-х. науки. 1980.-№ 11.-С. 73-83.

177. Смирнов O.K., Сергеев Н.И. Состояние и перспективы исследований по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. // Трансплантация эмбрионов в молочном и мясном скотоводстве и овцеводстве. Дубро-вицы, 1985.-С. 3-6.

178. Смолянинов Б.В. Вызывание множественной овуляции у коров при трансплантации эмбрионов. // Трансплантация эмбрионов кр. рог. скота: Тез. докл., Жодино, 1989. С. 56-57.

179. Смыслова Н.И. Результаты суперовуляции у коров-доноров в зависимости от исходного гормонального фона. // Трансплантация эмбрионов у кр. рог. скота: Тез. докл., Таллин, 1986. С. 18-20.

180. Смыслова Н.И., Ефремова М.Н., Петряков Ю.Н. Приживляемость эмбрионов в зависимости от гормонального профиля крови телок-реципиентов. // Биотехнология в животноводстве. Бюл. научн. работ ВИЖ. - Дубровицы, 1987. - вып. 87. - С. 38-40.

181. Смыслова Н.И. Качество и приживляемость эмбрионов при вызывании суперовуляции у коров-доноров разными гонадотропинами. / Бюл. науч. работ, ВИЖ. Дубровицы, 1988. - вып. 89. - С. 26-28.

182. Смыслова Н.И., Бушманов В. Влияние некоторых факторов на жизнеспособность замороженно-оттаянных эмбрионов. / Бюл. научн. работ. ВИЖ. -Дубровицы, 1988. вып. 104. -№ 89. - С. 26-28.

183. Советкин С.В., Назаров Е.Н., Прокофьева Е.С. Многократное применение ФСГ для вызывания суперовуляции у коров. // Зоотехния. 1989. -№ 10.-С. 60-61.

184. Соколовская И.И. Пересадка зигот. // Проблемы оплодотворения с.-х. животных. М., 1957. - С. 220-229.

185. Стрекозов Н.И., Чернушенко В.К., Цысь В.И. Интенсификация молочного скотоводства России. Смоленск. - 1997. - С. 134-137.

186. Тарасенко Н.В., Крохин В.А. Однократное использование коров для получения эмбрионов. // Трансплантация эмбрионов кр. рог. скота: Тез.докл, Жодино, 1989, С. 54-56.

187. Терешенков А.С. Профилактика и лечение акушерско-гинекологических заболеваний коров. Минск: "Ураджай". - 1990. --216 с.

188. Трошко О.Е., Артюшкова В.А. Питательные среды для жизнеобеспечения ооцитов и зародышей крупного рогатого скота. // Сельскохозяйственная биология. 1985. - № 12. - С. 100-108.

189. Ушаков С.Н. Поливиниловый спирт и его производные. M.-JI. -1960.-Т. 1-2.

190. Хилькевич С.Н., Алибаев P.M. Эффективность использования лак-тирующих и выбракованных коров в качестве доноров эмбрионов. / Бюл. науч. работ. ВИЖ. Дубровицы, 1991. - вып. 104. - С. 12-14.

191. Хилькевич С.Н. Теория и практика интенсификации воспроизводства крупного рогатого скота: Автореф. дис. . д-ра биол. наук: 03.00.13. / Всерос. НИИ жив-ва. Дубровицы, 1994. - 37 с.

192. Черемисинов Г.А. Разработка и совершенствование гормональных методов стимуляции воспроизводительной функции коров: Автореф. дис. . д-ра с.-х наук: / Воронеж, 1975.

193. Шаловило С.Г., Шульган И.З. и др. Эмбриопродукция коров-доноров в зависимости от молочной продуктивности, породы, возраста и сезона года. // Трансплантация эмбрионов кр. рог. скота. Тез. докл., Жодино, 1989-С. 52-54.

194. Шеховцов С.Ю. Использование коров-доноров в опытном хозяйстве "Украинка". // Трансплантация эмбрионов с.-х. животных. М., 1988. -С.59-62.

195. Шеховцов С.Ю., Шеховцова Е.Ю. Многократное использование коров-доноров. // Трансплантация эмбрионов кр. рог. скота: Тез. докл., Жодино, 1989.-С. 102-103.

196. Шипилов B.C. Полнее использовать биологические возможности маток. // Животноводство. 1985. - № 10. - С. 28.

197. Эрнст J1.K., Сергеев Н.И. Результаты применения простагландина для синхронизации охоты у коров-доноров и телок-реципиентов. // Молочное и мясное скотоводство. 1984. - № 3. - С. 29-32.

198. Эрнст Л.К. Научно-технический прогресс в животноводстве. // Животноводство. 1985. - № 11. - С. 2.

199. Эрнст Л.К. Итоги и перспективы дальнейших исследований по трансплантации зародышей у крупного рогатого скота. / Эндокринология и трансплантация зигот с.-х. животных. М., 1982. - С. 3-15.

200. Эрнст Л.К., Хачатуров Е.Н., Ярных Е.В. и др. Получение ранних эмбрионов крупного рогатого скота in vitro. // Сельскохоз. биология 1987. — № 12.-С. 60-65.

201. Эрнст Л.К., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат. - 1989. - 302 с.

202. Яблонский В.А. Трансплантация эмбрионов у сельскохозяйственных животных: Учебное пособие. Кишинев, 1988. - 96 с.

203. Adams C.E., Rowson L.E.A., Hunter G.L., Bishop G.P. Long distanse transport of sheep ova. // Proc. 4th Intern. Congr. Anim. Reprod. The Hague, 1961.-V. 2.-P. 381-382.

204. Adams C.E., Moor R.N., Rowson L.E.A. Survival of cow and sheep egge in the rabbit oviduct. // Proc. 6th Conf. Anim. Reprod. and A.I. Paris, 1968.- V.l.-P. 573-574.

205. Alexander A.M., Markus A.N., Hooton J.K. Non surgical bovine embryo recovery. // Vet.Rec. 1976. - V.99. - P. 221.

206. Allen W.R., Stewart F., Trounson A.O. et all. Viability of horse embryos after storage and long distance transport in the rabbit. // J.Reprod. Fert. -1976.-.47.-P. 387-390.

207. Anderson G.B., Baldwin J.M., Cupps P.T. Induced twinning in beef heifers by embryos transfer. // J.Anim.Sci. 1976. - V. 43. - P. 272.

208. Anderson G.D., Cupps P.T. Bilateral embryo transfer. // Proc. 69th Ann. Meet. Amen. Soc. Anim. Sci. 1977, 332 (Abs).

209. Aoyagi Y., Konishi M., Takedome . Effect of lipid rich bovine serum albumin on direct transfer of frozenthawed bovine embryos. // Theriogenology. -1966.-V. 45.-P. 165-166.

210. Arreseigor C.J., Sisul A.,Arreseigor A.E., Stahringer R.C. Effect of cryoprotectant, thawing method, embryo grade and breed on pregnancy rates of cryopreserved bovine embryos. // Theriogenology. 1998. - V. 49. - P. 160.

211. Aurah T. Multiple binths in Norwegian cattle. // Acta. Agric. Scand. -1974, 24.-P. 207-210.

212. Averill R.L.W., Rowson L.E.A. Attempts at storage of sheep ova at low temperatures. // J. Agric. Sci. 1959. - V. 52/ - P. 392-395.

213. Avery T.L., Fahning V.L. and Graham E.F. Investigations associated with the transplation of bovine ova. // 2. Superovulation. J. Reprod. Fert. 1962. -V. 3. P. 212-217.

214. Beatty R.A. Sex determination in farm and laboratory animals: a review. //Vet. Rec. 1972. - V. 90. - P. 243.

215. Becker W.A.P., Pinheiro L.E.L. Ovarian response to superovulation in dairy cows. // J. Theriogenology. 1986. - V. 25. - № 6. - P. 785-793.

216. Bennett J.P., Rowson L.E.A. The use of radioactive eggs in studies of egg transfer and transport in the female reproductive tract. //Proc. 4th Int. Vongr. Anim. Reprod. (The Hague), 1961. V. 2. - P. 360-366.

217. Betteridge K.J. Embryo transfer in farm animals. //Monograph 16, Can. Dept. Agric. (Ottawa). 1977. - P. 1-10.

218. Betteridge K.J. Procedures and results obtainable in cattle. //Current Therapy in Theriogen. Morrow D.A., Ed. - 1980. - P. 74-88.

219. Betteridge K.J. An historical look at embryo transfer. // J. Reprod. Fert.- 1981.-P. 1-13.

220. Bielanski A. Przeszezepianie zaredkow u budle. // Medycyns. Vet.1976, N6.-P. 329-332.

221. Bilton R.J., Moore N.W. Factors affecting the viability of frozen-stored cattle embryos.//Aust .J. Biol. Sci. 1979.-V. 32.-P. 101-107.

222. Bilton RJ. Preservation of embryos of the domestic species. // In: Proc. 9th Intern. Congr. Anim. Reprod. Artif. Insem. Madrid, 1980. - V. 3. - P. 245-253.

223. Bindon B.N. and Piper L.R. Induction of ovulation in sheep and cattie by injection of PMSG and ovine anti-PMSG Immune Serum. // Theriogenology.1977, v.8(4).-P. 17.

224. Biological nalf-life of endogeneus PMS following hysterectomy and studies on losses in corine and mile. Cole H.H., Bigekiw M., Finnel G., Rupp G.R. //Endocrinology. 1967,-V. 81.-P. 927-930.

225. Boland M.P., Crosby T.F., Gordon I. Twin pregnancy in cattle established by nonsurgical egg transfer. // Brit. Vet. J. 1975. - V. 131. - P. 738-740.

226. Boland M.P., Crosby T.F., Gordon I. Induction of twin pregnancy in heifers using a simple a non-surgical technique. // In: Proc. 8th Intern. Congr. Anim. Reprod. Artif. Insem. Krakow, 1976. - V. 3. - P. 241-243.

227. Boland M.P., Gordon I. Twinning in lactating Fresian cows by nonsurgical egg transfer. // Vet. Rec. 1978. - V. 103. - P. 241.

228. Bon Durant R.H., Anderson G.B., Boland M. et all. Pregnancy rates and embryo survival following transfer of bovine embryos stored at 4°C. // Theriogenology. 1981.-V. 15.-P. 122 (Abstr.).

229. Booman P. Sexing of boving primilation embryos. // Advansed in animal breeding. 1988. - P. 119-123.

230. Booth W.D., Newcomb R., Strange H., Rowson L.E.A., Sacher H.B. Plasma oestrogenand progesterone in relation to superovulation and egg recovery in cow. // Vet. Rec. 1975. - V. 95. - P. 366-369.

231. Bouters R., Dhordt V., Coryn M., Vanderplassche M. Embryo transfer in cattle. An evaluation of the current situation. // J. South Africa Vet. Assoc.1978,-V. 49.-Nl.-P. 1-15.

232. Boutron P., Kaufmann A. Stability of amorphous state in the sistem water 1-2-propanediol. //Criobiology. 1979. - 16. - P. 557.

233. Boyd H., Reed H.C.B. Investidation into the incedence and causes of intenlity in dary cattle.//Br. Vet.-1961, l.-V. 117.-P. 18-35.

234. Brand A., Drost M., Aarts M.H. and Gunnink J.E. A device for nonsurgical transfer in bovine embryos and its effect on uterine contamination. // Theriogenology. 1976. -V. 6 (15 ). - P. 509-514.

235. Brand A., Taverne M.A.M. et all. Non-surgical embryo transfer in cattle. Myometrial activity as a possible cause of embryo expulsion. // Proc. Seminar on Egg Transfer in Cattle(Camb.). 1976, p.41-56. - E.E.C. Publ.

236. Brand A., Drost M. Embryo collection by non-surgical methods. // In: Embryo transfer in farm animals. / Ed. K. J. Betteridge. Ottawa, 1977. - P. 16-19.

237. Brand A., Aarts M.H., Zaayer D., Oxender W.D. Recovery and Transfer of embryos by non-surgical procedures in lactating dairy cattle. / In: Control of Reprod. in the Cow. (Galway,Sreenan J.Ed.). C.E.C. Luxembourg, 1978.

238. Cady R.A., Van Vleck L.D. Factors affecting twinning and effects of twinning in Holstein dary cattle. // J. Anim. Sci. 1978. - V. 46. - P. 950-956.

239. Camp H. Jang-Diss. Untersuchung udth Einfluss faktoren auf den Em-bryotransfer deiv Rind. Hannover, 1989. - S. 60.

240. Carmichael R.A. The past, present and future of the embryo transfert industry and the potential of embryo movement for international genetic improvo-ment. // Zbornic simpozium: "Primana transfera ambriona i BLUP metode", Bel-grad, 1988, P. 29-44.

241. Casida L.E., Nalbandov A., Mc Shann W.H., Meyer P.J., Wisnicky W. Potential fertilityof artifically matured and ovulated ova in cattle. // Proc. Am. Soc. Anim. Prod. 1940. - P. 302.

242. Chafer E.S.F.,Suqie Т.,Hunt W.L. Superovulation and related phe-noment in the beef cow. Effect of gestrogen administration on production of ova. // J. Reprod. Fert. 1963. - N 5. - P. 381-388.

243. Cole H.H., Hart G.H. The potency of blood serum of mares in progressive stades of pregnancy effecting the sexual maturity of the immature rat. // Am. J. Physiol. 1930.-V. 93.-P. 57-68.

244. Conceptus development in superovulation beef heifers. Bellows R.A., Kitto G.P., Raudel R.D. Short R.E. and Varner L.W. // Anim. Sci. 1974. - V. 39. -P. 198 (Abs.).

245. Cook R. The Bucks country quintulets. 1948. - 39. - P. 346-348.

246. Christie W.B., Newcomb R. Fnd Rowson L.E.A. Ovulation rate and egg recovery in cattle, treated repeatedly with pregnant mare serum gonadotrophin and prostaglandin. //Vet. Rec. V. 104. - P. 281-283.

247. Chupin D., Procureur R. La. Stimulation de Tovaire. Pour produire des embryons chez les bovine. // Reprod. Bovins anoestrus postpartum, transplant, em-bryonnaire. C.r. Journies inf. Uncels Steb, mans, 1982. - Paris, 1983. - P. 75-83.

248. Critser J.K., Rowe R.F., Del Campo V.R., Ginther O.J. Embryo transfer in cattie: Factors affecting superovulatory response, number of transferable embryos and length of pasttreatment estroys cycle. // Theriogenology. 1980. - V. 13.-P. 397-406.

249. Cseh S., Corselli J., Nehlsen-Canarella S.L., Bailey L.L., Szalay A.A. // Direct Rehydration of morula and early blastocyst mouse embryos rapidly frozen in ethylene clycol. //Theriogenology. 1998. -V. 49. -N.l. - P. 164.

250. Crosier A.E., Farin C.E. Effect of medium and atmosphere on development of bovine embryos produced in vitro. // Theriogenology. V. 49. - N.l. -P. 197.

251. Critser E.S., Leibfried-Rutledge M.L., Eyestone W.H., Northey D.L., First N.L. Acquisition of development competence during maturation in vitro. // Theriogenology. 1986.-V. 25. - № 1. - P. 150.

252. Deep freezing of embryos in the large domestic species. // 9 th Int. Congr. Anim., Reprod. And A.I. Madrid. - V. 2. - P. 255-261.

253. Del Campo M.R., Leal P.E., Risopatron J.M., Reimer M.J. Effect of addition removal of cryprotectant on in vitro survival of bovine embryos. // Congr. Proceedings. V.l,Abstr., 1988, P. 151.

254. Dhondt D., Bouters R., Spincemaille J., Coryn M., Vandeplassche M. The control of superovulation in the bovine with a PMSG-Antiserum. // Theriogenology. 1978. - V. 9 (6). - P. 529-534.

255. Dieleman S.J., Bevers M.M., Wurth G.A. Improved embryo yield and condinion of donor ovaries in cows after PMSG superovulation with monoclonal anti-PMSG admintered shortly after the preovulatory LH peak. // Theriogenology.- 1989.-31, 2: p. 437-487.

256. Donaldson L.E., Hansel W., Van Vleek L.D. Luteotropic or luteinizing hormone and nature of oxytocin-induced luteal inhibition in cattle. // J. Dairy Sci. -1968.-V. 48.-P. 331- 338.

257. Donaldson L.E. The day of the estrous cycle that PSH is sterted and superovulation in cattle. // Theriogenology. 1984. - V. 22. - P. 97-99.

258. Donaldson L.E., Ward D.N. Effect of buteinizing hormone and embryo production in superovulation cows. // J. Veterinary Record. 1986. - V.119. - P. 625-626.

259. Douchi O., Takakura H., Jmai K. Transfer of bovine embryos cryopre-serveol by vitrification. //Japan J. Anim. Reprod. 1990. - 36, 1: p. 69-72.

260. Dowling D.F. Problems of the transplantation of fertilized ova. //J. Ag-ric. Sci. Camb., 1949. - V. 39. - P. 374.

261. Dracy A. The future of ova transfer. // Iowa State Coll. J. Sci. 1953. -V. 28.-P. 101.

262. Drost M., Anderson G.B., Cupps P.T., Horton M.B., Warner P.V., Wright R.W. A field study on embryo transfer in cattle. // J. Anim. Vet. Med. Ass.- 1975.-V. 166.-P. 1176-1179.

263. Drost M., Brand A., Aarte M. A device for non-surgical recovery of bovine embryos.// Theriogenology. 1976. - V. 6. - P. 391-396.

264. Dziuk P.J., Doncer F.D., Nichols J.P. and Petersen W.E. Problems associated with the transfer of ova between cattle. // Univ. Minn. Agr. Sta. Tech. Bull.- 1958.-P. 222.

265. Elsden R.P., Lewwis S., Cumming I.A., Lawson R.A.S. Superovulation in the cow following treatment with PMSG and prostaglandin F2alfa. // J. Reprod. Fert. 1974. - V. 36. - P. 455-456.

266. Elsden R.P., Hasler J.F., Seidel G.F. Non-surgical recovery of bovine eggs. // Theriogenology. 1976. - 6 (5). - P. 523-532.

267. Elsden R.P., Nelson L.D., Seidel G.F. Superovulating cows with follicle stimulating gormone and pregnant mare serum gonadotrophin. // Theriogenology. 1978. - V. 9.-P. 17-26.

268. Erickson B.H. Development and generescence of the post-natal bovine ovary. // J. Anim. Sci. 1966. - V. 25. - P. 800-805.

269. Farmer S.W., Papkoff H. Immunochemical studies with PMSG. // Biol. Reprod. 1979. - V. 21. - P. 425-431.

270. Falge, Rommel P. and Johanns R. Tiefgefriekonservierung von Embry-onen mit dem programmgesteuerten Einfrierferat Cryocell 2040. // Tag.-Ber. Acad. Landwirtsch. Wiss. DDR, Berlin, 1986. - 252. - P. 113-121.

271. Feminity in cattle and Superovulatiry response. Crister V.K., Gunselt R.C.,Rowe P.F. et all. // Theriogenology. 1979. - V. 11. - N 1. - p. 94.

272. Folley S.J., Malpress F.H. The response of the bovine ovaryto pregnant mares serum and horse pituitary. // Proc. R. Soc. 1944. - V. 132. - P. 164.

273. Foot A.S., Dodd F.H., Soffe D.W. Collection and use of MZ twins at the N.I.R.D. / Proc. E.A.A.P. 7th study Mt. (Stockholm) Publ. 1961. - N 9. - P. 119-128.

274. Freeman A.E. Results of holstein breef comparisons in European countries. // Sc. Holstein science rep. Holstein-Friesian assoc. Of America, Ames, Yowa. - 1984. -P. 18-31

275. Gardner R.L., Edwards R.G. Control of the sex ratio at term in the rabbit by transfering sexed blastocests. Nature, Land. - 1968. - 218. - P. 346-349.

276. Gibbons W. Veterin. Scope. 1963. - V. 8. - P. 2.

277. Gordon I., Williams G., Edwards J. The use of serum gonadotrophin (PMS) in the induction of the pregnancy in the cow. // J. Agr. Sci. (Cambr.), 1962. -V. 59.-P. 143-198.

278. Gordon I. Problems and prospects in cattle egg transfer. // Irish Vet. J. -1975.-V. 29.-P. 21-62.

279. Gordon I. Cattle twinning by an egg transfer approach. // Proc. E.E.C., Seminar Egg Transfer in Cattle (Cambridge), 1976, p. 305-505.

280. Gordon I., Boland M.P. Cattle Twinning by non-surgical egg transfer. / Control of Reprod. In the Cow (Galway), Sreenan J. 1978. - P. 336-355.

281. Gordon I., Boland M.P. Embryo transfer and twinning in cattle. // Vet. Sci. Commun., 1979. - 3 (3). - P. 177-186.

282. Gordon I., Boland M.P. Cattle twins by egg transfer. // Jr. Vet. J. -1979.-V. 33.-P. 79-94.

283. Gorlach A.A. Embryotransfer beim Rind / von Albert Gorlach. Stuttgart: Enke, 1997.

284. Greve Т., Lehn-Jensen H., Rasbech N.O. Non-surgical recovery of bovine embruos. // Theriogenology. 1977. - 7(4). - P. 239-250.

285. Hahn J., Hahn R. Experiences with non-surgical transfer techniques. // In, Egg Transfer in Cattle. Rowson L.E.A. 1976. - P. 199-204.

286. Hahn J., Hahn R., Baumgarther R. Untersuchungen sur Verbesserung der Auswahl von Spender und Empfundertieren in Auswaht der Einbertragung biem Rind. // Zuchthygiene. - 1977. - V. 2. - P. 68-76.

287. Hahn J., Roselius R., Romanowski W., Schneider U. Non-surgical collection and transfer of bovine embryos. // Arch. Androl. 1980. - 5. - P. 106.

288. Hafez E.S.E., Sugie Т., Gordon I. Superovulation and related phenomena in the beef cow. I. Superovulatory responses following PMS and HCG injections. //1. Reprod. Fert. 1963. - V. 5. - P. 359-379.

289. Hammond I. The possibility of artificial pregnancy in cattle. // I. Min. Agric. London, 1950. - P. 57-67.

290. Hansel W., Snook R.B. Pituitary ovarian relationships in the cow. // Dairy Sci.- 1970.-V. 53.-P. 945-961.

291. Hare W.C.D., Mitchell D., Betteridge K.H., Eaglesome M.D., Randall G.C.B. Sexing 2-week old bovine embryos by chromosomol analysis prior to surgical transfer; preliminary methods and results. // Theriogenology. 1976. - V. 5. P. 243-253.

292. Hare W.C.D., Betteridge K.H. Relationship of embryo sexing to other methods of prenatal sex determination in farm animals: a review. // Theriogenology. 1978. - 9 (1). -P. 27-43.

293. Нагрег M.I.K., Bennett I.P., Rowson L.E.A. A possible explanation for the failure of non-surgical ovum transfer in the cow. // Nature. Lond., 1961. -190.-P. 789.

294. Harper M.I.K., Chang M.C. Some aspects of the biology of mammalian eggs and spermatozoa. / In: Advances in reproductive physiology. Ed.V.W.H.Bishop.- New Iork; London. 1971. - V. 5.-P. 167-174.

295. Hartigan P. // Irish. Veterin. J. 1972. -V. 26. - 9. - P. 185.

296. Hasler J.F., Hurtgen P.J., Stokes J.E. and Jin Z.Q. Influence of tine of exposure to glycerol or ethylene glycol on the survival of frozenthawed bovine IVF embryos. //Theriogenology. 1996. -V. 45. - P. 172-173.

297. Hendy C.R., Bowman J.C. Twinning in cattle. // Anim. Breed. Abstr., 1970.-38.-P. 22-37.

298. Heyman V. Factours de variation du transfert d'embryons par voie cer-vicale chez les bovins. // Reprod. Bovins anoestrus post-partum. Transplant, em-bryonaire C.R. journals imf UNCEIA-ITEB, 1982. - Paris, 1983. - P. 105-111.

299. Holy L. Veterinarstvi. - 1984. - V. 34. - N 8. - P. 342-346.

300. Horton M.B., Anderson G.B., Bon Durant R.H. and Cupps P.T. Free-martins in beef cattle twins induced by embryo transfer. // Theriogenology. 1980. 14.-P. 443-451.

301. Iillella D., Baker A. A. Transcervical transfer of bovine embryos. // Vet. Rec. 1978. - V. 103. - P. 574-576.

302. Iillella D., Eaton R.I.,Bacer A.A. Successful of a bovin embryo through a cannulated fallopian tube. // Vet. Rec. 1977. - V. 100. - P. 385-386.

303. Introduction of twinning in beef heifens bilateral embryo transfer. Anderson G.B., Gurro P.T., Grost N., Horton M.B. // J. Anim. Sci. 1978. - V. 46. -P. 449-452.

304. Ishida Т., Sakai Y. Cryopreservation of bovine embryos in the medium with glycerol (1,4M) a sucrose. // Japan J. Anim. Reprod. 1989. - V. 35. - N 3. -P. 125-129.

305. Ito K., Otake S., Hirabayashi M., Hochi C., Ueda M. Cryopreservation of day 6 and 7 bovine blastocysts derived from in vitro fertilized and dna-injected zygotes. // Theriogenology. 1998. - V. 49. - N.l. - P. 169.

306. Jackowski, S.C., Leibo S.P., and Mazur P. Glycerol permeabilites of fertilized and unfertilized mouse ova. // J. of exp. Zoology. 1980. - 212. - P. 329-341.

307. Kaltenbach C.C. Pituitary control of luteal function in the ewe. // I. Anim. Sci. 1968. - Suppl. 27. - P. 204-213.

308. Kanagawa H., Inoue Т., Ishikswa T. Ovulation rate in beef cattle after repeated treatments of gonadotropins and prostaglandin. // Arch. Angrol. 1980. -V. 5.-N l.-P. 74-75.

309. Kanagawa H. One to two-day preservations of bovine embryos. // Ipn. I. Vet. Rec. 1980. - 28. - P. 1-6.

310. Killeen I.D., Moore N.W. The morphological appearance and development of sheep ova fertilized by syrgical insemenation. //1. Reprod. Fert. 1971. -V. 24.-P. 62-70.

311. Kochlar H.P.S., King W.A. Timing of sperm oocyte interaction and its effect on cleavage and development rate in a bovine IVF system. // Theriogenology. 1998. - V.49.-N.l. - P. 288.

312. Kummer V., Zraly Z., Holcak V., Veznik Z., Schlegelova I., Hruska K. Super-ovulation and cattle: Effect of goat anti-PMSG seruserum. // Theriogenology. 1980. - P. 383-390.

313. Kusters G. Tiefgefrierversuche mit Rinderembryonen unter besondere Berucksichtigung der Ausverdunnungsmethoden: Diss. Hannover, 1983.

314. Lamming G.E., Rowson L.E.A. Superovulation and ovum transfer in cattle. // Proc. 2nd Int. Congr. Anim. Reprod. A.I. Copenhagen, 1952. - l.-P. 4-153.

315. Lamming G.E., Rowson L.E.A. Ovarian hormones and uterine infection in cattle. // Proc. R. Soc. Med. 1953. - 46. - P. 387-392.

316. Lammond D.R. The effect of pregnant mare serum gonadotropin (PMS) on ovarion function of beef heifers, as influemced by progestins plane of nutrition and fasting. // Aust. I. Agric. Res. 1970. - V. 21. - P. 153-156.

317. Lampeter Von W.W. Practice ofnon-surgical collection of bovine embryos. // Zuchthygicence. 1977. - 12 (1). - P. 8-13.

318. Lampeter Von W.W. Non-surgical recovery of bovine embryos under farm conditions. // In: Control of Reprod. In the Cow. Galway, Sreenan I.,1978. -P. 305-311.

319. Lange H. Cryopreservation of bovine embryos and demi-embryos using ethyleng-glycol for direct trausfer after thawing. // Cryobiology 1993. - V. 1. -P. 183-191.

320. Laster D.B. Disappserarence and aptake of FSH in the, rabbit, ewe and cow. //1. Reprod. Fert. 1972. - V. 30. - P. 407-415.

321. Lawson R.A., Rowson L.E.A., Adams C.F. The development of cow eggs in the rabbit oviduct and their viability after re-transfer to heifers. III. Reprod. Fert.- 1972.-28.-P. 313-315.

322. Lehn-Jensen H., Greve T. Low temperature preservation of cattle blastocysts.

323. Theriogenology. 1978. - 9 (4). - P. 313-322.

324. Lehn-Jensen H., Greve T. Deep freezing of cattle embryos utilizing different freezing curves and cryoprotectauts. // Jutwrn. Congress Anim. Reprod. And Art. Jusemin. 1982. - V. 5. - P. 631-635.

325. Lehn-Jensen H., Raii W. Cryonicroscopie observations of cattle embryos during freezing and thawing. // Theryogenology. 1983. - V. 10. - N 2. - P. 263-277.

326. Leibo S.P., Masur P. Methods for the preservation of mammalian embryos by freezing.In: J.C. Daniel, Jr. (Hrsg.). Methods in mammalian reproduction. /AcademikPress. -New York, 1978.-P. 179-201.

327. Leibo S.P. Cryopreservation og embryos. // Congress proceeding. Vol. 5 (Abstracts), 1988.-P. 370-377.

328. Leibo S.P. Equilibrium and non-equilibrium cryopreservation of embryos. // Theriogenology. 1989. - 31 (1). - P. 85-93.

329. Leibo S.P. A one-step-methods for direct non-surgycal transfer of frozen-thawed bovine embryos. // Theriogenology. 1984. - 21. - P. 767-790.

330. Lieman P., Tulka Y. Pregnancy rate after synckronous and asynckro-nous transfer of frozen thwed barne embryos. // Anim. Reprod. Sci. - 1986. - V. 11.-N3.-P. 181-186.

331. Lindsell C.E. Superovulation in cows with FSH beginning in early dusters. // Dept. Of herd medecine and theriogenology Western College of Veterinary Medecine University of Saskatcheneaen, 1987.

332. Long S.E. The fertility of bulls born twin to freemartins. // A review. Vet. Rec. 1979. - 104. - P. 211-213.

333. Looney C.R., Boutte B.W., Archibald L.E., Godke R.A. Comparison of once daily and twice daily FSH injections for superovulating beef cattle. // Theriogenology. 1981. - 15. - P. 13-22.

334. Looney C.R., Hill K.G., Thompson D.L. et. All. Camparison of follicle stimulating hormone (FSH) in gelslin and saline diluents for superovulating donor Cattle. // Theriogenology. 1982. - V. 17. - N 1. - P. 97.

335. Looney C.R., Droek D.M., Gue C.S., Funk D.J. and Faber D.C. Fild experiences with bovine embryos frosen-thawend in etylene glycol. //Theriogenology. 1996. - 45. - P. 170.

336. Lopez-Gatins F. And Camon-Urgel I. Pregnancies and live offspring following transfer of onestep vitrified bovine embryos. // Zuchthygiene. 1989. -24 (6).-P. 255-258.

337. Louche O., Takahura H., Xmai K. Transfer of bovine embryos cryopre-served by vitrification. // Japan J. Anim.Reprod. 1990. - V. 36. - 1. - P. 69.

338. Maijala K. and Syvarjavi J. On the possibility of developing multipa-rous cfttle by selection. // Z. Tierarzuchtg Zuchr. 1994. - P. 126-150.

339. Macmillan K.L. The research value of identical twin heifers. // N.Z. Dairy Exporter, 1980. V. - P. 75.

340. Mapletoft R.J., Nasser L.F., Bo G.A. and Del Campo M.R. The effect of LH cintent in aporcine pituitary extract on superovulatory response to a single subcutaneons injection in beefheifers. // Anim. Reprod. 1992. - V. 1. - P. 237-239.

341. Marcum J.B. The freemartin syndrome. // Anim. Breed. Abstr., 1974. -42.-P. 227-242.

342. Marshall D.P., Struthers G.A. Commercial embryo transfers in cattle. // N. Z. Vet. I. 1978. - 26. - P. 92-95.

343. Martines A.G., Matrovic M., Pessi H.D. and Baldasseroee H. Cryopre-servation of ovine embryos: slow freezing and vitrification. // Theriogenology. -1996.-V. 45.-№ 1.

344. Massip A., Van der Zwalmen P., Ectjrs F., Coster R.D.E. et all. Hanzen Deep freezing of cattle embryos in glass ampules or french straws. // Theriogenology. 1979. - 12. - P. 79-84.

345. Massip A., Zwalmen P., Ectore F. Recent progress in cryopreservation of cattle embryos. // Theriogenology. 1987. - V. 27. - 1. - P. 69-79.

346. Mazur P. Slow freezing injury in mammalian cells. // In: The freezing of mammalian embryos. Ciba Fount. Symp. Amsterdam; Elsevier, 1977. - P. 1942,311-315.

347. Mazur P. Fundamental aspects of the freezing of ceels with emphasis on mammalian ova and embryos. // 9 th Intern. Congr. Anim. Reprod. and Artif. Insem. Madrid, 1980. - V. 1. - P. 99-1.

348. Mazur P. // Griobiology Seience. 1970. - V. 168. - № 3934. - P. 439948.

349. Merry D.A., Allen R.L., Krag K. and Wrigt R.W. Jr. Sucrose dilution of frozen mouse embryos: Interaction of glycerol and sucros concentration. // Theriogenology. 1983. - 20. - P. 325-332.

350. Mitchell D., Hare W.C.D., Betteridge K.J. et al. Sexing and transfer of bovine embryos. / Proc. 9th Int. Congr. Anim. Reprod. A. I. (Krakow). 1976. -V. 3.-P. 258-261.

351. Mosts L., Hahn I. Experimental production of identical twin mice. // Dutsch. Tierarzit. Woch. 1978. - 85. - P. 242-244.

352. Mulvehhill P., Sreenan J.M. Improvement of Fertility after different oestrous teatment with PMSG and progestagen. // J. Reprod. Fert. 1977. - V. 50. -P. 323-325.

353. Nagai Т., Geshi M., Yonai M., Yamauchi N. In vitro fertilization and subsequent development of denuded porcine oocytes matured in vitro. // Theriogenology. 1998. - V. 49.-N.1.-P. 294.

354. Nelson L.D., Seidel G.E., Elsden R.P., Bowen R.A. Superovulation of cows follicle stimulating hormone and prostaglandin F2-alfa. // Theriogenology. -1979.-V. 11 (l).-P. 104.

355. Newcomb R., Rowson L.E.A. Conception rate after uterine transfer of cow eggs in relation to synchronization of oestrus and age egg. // Reprod. Fert.1975.-V. 43.-P. 539-541.

356. Newcomb R., Rowson L.E.A., Trounson A.O. The entry of superovu-lated eggs into the uterus. // Proc. Sem. Egg Transfer in Cattle (Camb.) EEC.1976.-P. 1-15.

357. Newcomb R., Christie W.R., Rowson L.E.A. The non-surgical recovery and transfer of bovine embryos. // In: Control of Reprod. in the cow. Galway, Sreenan I., Ed. - 1978. - P. 398-417.

358. Newcomb R. Physiological factors on the early embryo. // Biochem. Soc. Transact. 1977. - V. 5. - P. 455-456.

359. Newcomb R., Christie W.R., Rowson L.E.A. Fetal survival rate after the surgical transfer of the bovine embryos. // J. Reprod. Fert. 1980. - V. 59. - P. 31-36.

360. Newcomb R. Investigation of factors affecting superovulation and nonsurgical embryo recovery from lactating British Friesian cows. // Vet. Rec. 1980. - 106.-P. 48-52.

361. Nicholas J.S., Hall B.V. Experiments on developing rates. 2. The development of isolated blastomeres and fused eggs. // J. Exp. Zool., 1942. V. 90. -P. 441.

362. Niemann H. Der embryotransfer entwickelt sich weiter. // Der Tier-suchter.- 1985.-37(11).- P. 484-485.

363. Niemann H., Dopke H., Sacher B. and Schilling E. Tiefgefrieren von Rinderembryonen im Plasticstraws mit Ausverdunning des Gefrierschutzmittels surch Sucrose. // Zuchthygiene. 1981. - 16. - P. 201-205.

364. Niemann H., Smidt. Tiefgefrieren von Rinderembryonen. Methoden und Ein355a.fluzfaktoren. // Laudbauforsch. Volkenroole. 1985. - 35 (4). - P. 205-211.

365. Niemann H. Tiefgefrieren von Embryonen landwirtschaftlicher Nutz-tiere. // Prakt. Tierarzt. 1988. - 69 (9). - P. 29-34.

366. Niemann H. Ciyopreservation of bovine embryos in the field. // Embryo Transfer Newsletter. 1990. - 8 (1). - P. 5-7.

367. Niemann H. Embryotransfer: Welche Fortschritte die Forschung macth. // Tierzuchter. 1994. - 9. - P. 8-10.

368. Nowshari M.A. Cryopreservation of expanded mouse blastocysts by rapidfreezing procedure. // Theriogenology. 1998. - V.49. - N.l. - P. 172.

369. Olsen L.M., Woods G.L., Schneider C.S., Wright Jr. R.W. Sperm penetration of in vitro bovine oocytes with sperm or oocytes preloaded with hoechst 33342 fluorochrome. //Theriogenology. 1998. - V.49. -N.l. -P.295.

370. Ozil J.P. Production of identical twins by bisection of blastocysts in the cow. // J. Reprod. Fert. 1983. - V. 69. - 3. - P. 463-468.

371. Paulyshym V., Braithneaite M., Mapletoff R. Effects on FSH dose on superovulation repose in cull beef cows. // Department of Hers Medecine and Theriology. Western college of Veterinary Medecine, University of Saskatchevan. -Canada, 1987.-P. 48-51.

372. Peters D.F., Anderson G.B., Bondaurant R. et al. // Tranfer of cultured bovine embryos. // Theriogen. 1978. - 10 ( 4 ). - P. 337-342.

373. Pincus G., Enzmann E.V. The comparative behaviours of mammalian eggs in vivo and in vitro. I. The activation of ovarian eggs. // J. Exp. Med., 1935. -V. 62.-P. 665-675.

374. Prather R.S., Spire M.F., Schalles R.R. Evaluation of cryopreservation techniques for bovine embryos. // Theriogenology. 1987. - 28 ( 2 ). - P. 195-204.

375. Prospect "Mapiehurst ova transplants the oldest transfesfer company in the United States". Nelson L., Seidal G., Bowen K. et al. // Sugested post calving care of prospective donor wes. - 1986. - 71 p.

376. Pugh A., Trounson A.O., Aarts M.H., Mc Phee S. Bovine embryo recovery by filtration on non-surgical flushings. // Theriogenology. 1980. - 13. - P. 281-285.

377. Rail W.F., Fany G.M. Vitrification: A new approach to embryo cryo-preserva.//Theriogenology. 1985. - 23. - P. 220.

378. Rail W.F., Fany G.M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. //Nature. 1985. - P. 573-575.

379. Rail W.F., Meyer Т.К. Zona fracture damage and its avoidance during the criopreservation of mammalian embryos. // Theriogenology. 1989. - 31 (3). -P. 683-692.

380. Rasbech N.D. Non-surgical recovery and transfer of bovine embryos under farm conditions. // In: 27th Ann. Meet. Europ. Assoc. Anim. Prod. Zurich. 1976.-P. 38-45.

381. Rehbock F., Rommel P., Tiemann U., Blodow G. Die Anwendung von PMSG-Antise-rum bei der Superovulations behendlung des Rinders. // Monatsh. Veter. 1986. - Bd. 41, 17. - P. 581-583.

382. Renard J.P., Heyman Y. and Du Meshil du Buisson F. Unilateral and bilateral cervical transfer of bovine embryos at the blastocyst stage. // Theriogenology. 1977.-V. 7.-P. 189-194.

383. Renard J.P., Heyman Y., Leymonie P. and Plat J.P. Sucrose dilution: A techni-que for fitld transfer of bovine embryos frozen in the straw. // Theriogenology. 1983. - 19. - P. 145.

384. Renard J.P., Heyman Y. and Ozil J.P. Condelation de l'embryon bovin: Une nouvelle merthode de decongelation pour le transfert cervical d'embryons conditionnes une seule fois. // Ann. Med. Vet. 1982. - 126. - P. 23-32.

385. Riha J., Landa V. Postupy vitrifikace in vitro. // Zivocisna Vyroba. -1989.-34 (12),.-P. 1057-1062.

386. Rocosou L.M. Embryo transfer in the sheep; The significance of synchronizing oestrus in the donor and recipient animal. //1. Reprod Fert. 1966. -11.-P. 207-212.

387. Rommel P., Rehbock F., Kauffeld P., Hanter R. Ergebnisse der Ei-tranaplantation beim Rind. // Mh.Vet.Med. 1981. - Bd.36. - P. 667-673.

388. Roshlau K., Roshlau D., Roselius R. et al. Over 5 years expirience in sexing of bovine morule and during routine embryotransfer. // Theriogenology. -1997.-P. 311-313.

389. Rowe R.F., Del Campo M.R., Eilts C.L. et al. A single cannula technique for non-surgical collection of ova from cattle. // Theriogenology. 1976. -V. 6.-P. 471-483.

390. Rowe R.F., Critser J.K., Ginther O.I. Non-surgical embryo transfer in cattle. // Theriogenology. 1979. - 11 (1). - P. 17.

391. Rowson L.E.A., Dowling D.F. An apparatus for the extraction of fertilized eggs from the living cow. //Vet.Rec. 1949. -V. 61. - P. 191-197.

392. Rowson L.E.A. Methods of inducing multiple ovulation in cattle. // J.Endocr. 1951. - 7. - P. 260-270.

393. Rowson L.E.A., Lamming G.E., Fry R.M. The relationship between ovarian hormones and uterine infection. // Vet.Rec. 1953. - V. 65. - P. 335-340.

394. Rowson L.E.A., Bennett J.P., Harper M.J.K. The problem of nonsurgical egg transfer to the cow uterus. // Vet.Rec. 1964. - V. 76. - P. 21.

395. Rowson L.E.A., Moor R.N., Lawson R.A.S. Fertility following egg transfer in the cow: effect of method, medium and synchronization of oestrus. // J. Reprod.Fert. 1969. - 18. - P. 517-523.

396. Rowson L.E.A. The role of reproductive research in animal production.// Journal of Reproduction and fertility. 1971. - 26. - P. 113-126.

397. Rowson L.E.A., Mc Neilly A.S., O'Brien C.A. The effect of vaginal and cervical simulation on oxytocin release during the luteal phase of the cow's oestrous cycle. // J.Reprod. Fert. 1972. - 30. - P. 287-288.

398. Rowson L.E.A., Lawson R.A.S., Moor R.M., Baker A.A. Egg transfer in the cow: synchronization requirements. // J.Reprod.Fert. 1972. - 28. - P. 427431.

399. Rutletge Y.Y. Twinning in cattle. // Jornal of Anim. Sci. 1975. - 40. -P. 803-815.

400. Saumande J., Chupin D. Superovulation: Alimitto Egg Transfer in cattle. // Theriogenology. 1977. - 3. - P. 1-9.

401. Saumande J. Relationship between ovarion stimulation by PMSG and steroid secretion. // In: Control of Reprod. in the Cow. Galway, Sreenan J. Ed., 1978.-P. 169-194.

402. Scanlon P.F. Ovarian response of cows following PMSG treatment during two successive estrous cells. // J. Dairy Sci. 1972. - 55. - P. 527.

403. Scanlon P.F., Sreenan J., Gordon I. Hormonal induction of superovulation in cattle. // J. Agr. Sci. (Cambr.). 1968. - V. 70. - P. 179-182.

404. Scanlon P., Gordon I., Sreenan J. Multiple ovulations multiple pregnancies and multiple births in Irish cattle. // Irish Department of Agric.Fresh. -1974.-70.-P. 2-18.

405. Scanlon P.F., Gordon I., Sreenan J.M. Multiple Ovulations, Multiple Pregnancies and Multiple births in Irish cattle. // Journal department Agric. Irish Republic. 1974. - 70. - P. 45-61.

406. Schams D., Menzer Ch., Schallenberger E. et al. Some studies on pregnant mare serum gonadotrophin (PMSG) and on endocrine responses after application for superovulation in cattle. // In: Control of Reprod. in the Cow, Sreenan J. 1978.-P. 122-123.

407. Schams D., Menzer Ch., Schallenberger E. et al. Some studies on endocrine responses after application for superovulation in the cattle. // In: EEC-seminar "Control of reprod. on the cow". Galway, 1977. - P. 27-39.

408. Schneider H.I., Castleberry R.S., Griffin J.L. Comercial aspects of bovine embryo transfer. // Theriogenology. 1980. - V. 13 (17). - P. 73-85.

409. Schneider, U. and Mazur P. Osmmotic consequenses of cryoprotectant permeability and its relation to the survival of frozen/thawed embryos. // Theriogenology. 1984. - 21. - P. 68-79.

410. Schuberth W. Tiefgefrerversuche mit Rinderembryonen zur methodi-chen Verbesserung der Kryoprotektion, der Ausverdunnung und des Auftauvor-ganges: Diss. Hannover., 1984.

411. Schwartz J., Schneider M.R., Rodrigues J.L., Reichenbach H.D. Effect of short-term storage of bovine oocytes in different media and temperatures on the subsequent in vitro embryo development. // Theriogenology. 1998. - V.49. -N.l.-P. 217.

412. Seidel G.E. The development potential of an isolated blastomere in the 2-cell stage mammalian egg. // Naturvissen, 1952. V. 15. - P. 355.

413. Seidel G.E., Ir. Browen I.M., Homan N.R., Okun M.E. Fertility of heifers with sham embryo transfer though the cervix. // Vet. Rec. 1975. - 97. - P. 307-308.

414. Seidel G.E., Ir. ElsdenR.P., Nelson L.D., Hasler I.F. Methods of ovum recovery and factors affecting fertilization of superovulation bovine ova. // In: Control of Reprod. in the Cow. / Galway, Sreenan J. 1978. - P. 268-280.

415. Seidel G.E., Ir.Elsden R.P., Nelson L.D., Bowen R.A. Superovulation of cattle with pregnant mare's serum gonadotrophin and follicle stimulating hor-mon. // In: Control of Reprod. in the Cow. / Galway, Sreenan J. 1978. - P. 159168.

416. Seidel G.E. Superovulation and embryo transfer in cattle. / Sci-ence.1981. 211. - P. 351-358.

417. Sexing 2-week old surggical transfer; preliminary methods and results / Hare W., et.al. // Theriogenology. 1976. - 5. - P. 243-253.

418. Shea B.F., Ollis G.W., Jacobson M.E. Pregnancies folloing long dis-tanse transport and transfer of frozen bovine embryos. // Can. J. Anim.Sci. 1977. -57.-P. 801-802.

419. Shea B.F., Hines D.J., Lightfoot D.E. et al. The transfer of bovine embryos. // Proc. EEC Seminar Egg Transfer in Cattle (Cambridge). 1976. - P. 5152.

420. Smith L.E., Sitton G.D., Vincent C.K. Limited inqection of follicle stimulating hormone for multiple births in beef cattle. // J.Anim.Sci. 1973. - V. 37.-P. 523-527.

421. Snook R.B., Brunner M.K., Squatman R.R., Hansel W. The effect of antisera to bovine LH in hysterectomized and intact heifers. // Biol. Reprod. -1969. — V. 1. p.49-58.

422. Spilman C.H., Seidel G.E., Larson L.L. et al. Progesterone, 20 betta-hudroxypregn-4-en-3-one and luteinizing hormone levels in superovulated prepu-beral and postpuberal cattle. // Biol. Reprod. 1973. - V. 9. - P. 116-124.

423. Sreenan J.M., Beehan D. Egg transfer in the cow; pregnancy rate and egg survival. // J. Reprod. Fert. 1974. - 41 (2). - P. 497-499.

424. Sreenan J.M., Beehan D. Methods of induction of superovulation in the cow and transfer results. / Egg Transfer in Cattle. // Ed. L.E.A. Bowson. Luxemburg, 1976.-P. 19-34.

425. Sreenan J.M., Beehan D., Mulvehill P. Egg transfer in the cow: factors affecting pregnancy. // J. Reprod. Fert. 1975. - 44. - P. 77-85.

426. Sreenan J.M. Egg transfer in the cow: effect of site of transfer. // In: Proc. 8 th Intern. Congr. Anim. Reprod. Artif. Insem. Krakow, 1976. - V. 3. - P. 269-272.

427. Sreenan J.M. Embryo transfer for the induction of twinning in cattle. // In: Embryo transfer in Farm Animals, K.I.Betteridge, Ed. Canada Dept. Agric. Monogr. 1977. -76p.

428. Sreenan J.M. Non-surgical egg recovery and transfer in the cow. // Vet. Rec. 1978.- 102.-P. 58-60.

429. Sreenan J.M. Increasing the calf crop: synchronisation and twin calving. // Irish Farmer Journal. 1979. - 31 (7). - P. 46-47.

430. Sreenan J.M. Egg transfer in the effect of site of transfer. // Jg. Grassland Anim. Prod. Assoc. I. 1976. - V. 11. - P. 115.

431. Sreenan J.M. Possibility for the improvement of reproductive effec-tiency in cattle. // Journal the future of Beef Production in the European Community, European Economic Community Seminar. Italy, 1979. - P. 191-217.

432. Sreenan J.M. Embryo transfer: Its uses and recent developments. // Vet. Rec. 1988. - 122 (26). - P. 624-629.

433. Sugie T. Successful transfer of a fertilized bovine egg by non-surgical techniques. III. Reprod. Fert. 1965. - V. 10. - P. 197-201.

434. Sugie Т., Soma Т., Fukumitsu S., Otsuki K. Studies on the ovum transfer in the cattle, with special reference to collection of ova by means of nonsurgical techniques. // Nat. Inst. Anim. Ind. Bull. 1972. - 25. - P. 27-34.

435. Suzuki Т., ShimokiraT., Fujiyama M. Transfer of bovine frozen embryos by one step straw method. // Japan J. Anm. Reprod. 1983. - V. 29. - 3. - P. 162-163.

436. Suzuki Т., Ishida Т., Sakai Y. Cryopreservation of bovine embryos in the medium with glycerol (1,4M) and sucrose. // Japan. J. Anim. Reprod. 1989. -35 (3).-P. 125-129.

437. Szell A. and Shelton J. Sucrose dilution of glycerol from mouse embryos frozen rapidly in liquid nitrogen vapour. //J. Reprod. Fertil. 1986. - 76. — P. 401-408.

438. Takedomi Т., Aoyagi Y., Koniski M. et al. Superovulation of holstein heifers by a single subcutaneous injection of FSH dissolved in polyvinylpyrrolidone. // Theriogenology. 1995. - V. 43. - P. 1259-1268.

439. Tarkowski A.K. Experiments on the development of isolated blas-tomeres of mouse eggs. // Res. Vet. Sci. 1959. - V. 17. - P. 131.

440. Tervit H.R. Culture and transfer of sheep and cattle ova. // Ph. D. Thesis. Univ. of Cambridge, 1973.

441. Tervit H.R., Rowson L.E.A. Birth of lambs after culture of sheep ova in vitro for up to 6 days. // J. Reprod. Fer. 1974. - 38. - P. 177.

442. Tervit H.R., Elsden R.P., Ferand G.D. Deep freezing 7- to 8- and 10- to 11 day old cattle embryos. // Theriogenology. -1981.-15.-P. 115.

443. Testart Y., Godart C. and du Mesnil du Buisson F. Transvaginal transplantation of an extra egg to obtain twinning in cattle. // Theriogenology. 1975. -4. - P.163.

444. Testart Y., and du Mesnil du Buisson F. Biomatric study of Placen-tomes in single or twin bovine prognancies. // Anim. Biol., Anim. Biochemistry and Biophysics. 1966. - 6. - P. 483-493.

445. Thatcher W.M. Material recognition of pregnancy in relation to the survival of transfered embryos: Endocrine aspected. // Theriogenology. 1985. -23 (l).-P. 129-143.

446. Tnimonier J. Synchronisation a oestrus in combination. // Animals of Biology, Anim. Biochemistry and Fertility. 1975. - 15. - P. 437-449.

447. Touati K., Bormans M., Ectors F., Massip A. Congelation d'emryos bo-vins par la methode an glucerol-sucrose pour transfert direct, apres decongelation. // Ann. Med. Veter. 1990. - 134 (4). - P. 249-251.

448. Trounson A.O., Moore N.W. Attempts to produce identical offspring in the sheep by mechanical division of the ovum. // Aust. J. Biol. Sci. 1974. - V. 27.-P. 505.

449. Trounson A.O., Willadsen S.M., Rowson L.E.A. The influence of in vitro culture and cooling on the survival and development of cow embryos. // J. Reprod. Fert. 1976. - 47. - P. 367-370.

450. Trounson A.O., Rowson L.E.A., Willadsen S.M. Non-surgical transfer of bovine embryos. // Vet.Rec. 1978. - 102. - P. 74-75.

451. Trounson A.O., Brand A., Aarts M.H. Non-surgical transfer of deep-frozen bovine embryos. // Theriogenology. 1978. - 10 (1). - P. 111-115.

452. Twagiramungu H., Morin N., Guilbault L.A., Sirard M.A., Bousquet D. Media and time of oocyte transport influence their developmental competence for in vitro production of bovine embryos. // Theriogenology. 1998. - V.49. — N.l. -P. 299.

453. Umbaugh R.E. Superovulation and ovum transfer in cattle. // Am. J. Vet. Res. 1949. - 10. - P. 295-305.

454. Vandeplasse N., Butaye R. and Bouters R. Twin bearing capacity of the uterus in heifers and cows. // Dtsch. Tierarzt. Wschr. 1979. - 85. - P. 470-473.

455. Voelkel S.A. and Hu Y.X. Direct transfer of frozen-thawed bovine embryos. //Theriogenology. 1992. - 37. - P. 23-35.

456. Weldt D.E., Woody H.D., Duletow W.R. Induction of multiple ovulation in the cow with single injection of FSH and HCG. // Journal of reproduction and Fertility. 1975. - 44. - P. 583-586.

457. Wettstein F. Hend book records of twinning in cattle. // Agrartud. Szle. 1947,- 1.-P. 326-338.

458. Whittingham D.G. Survival of mouse embryos after freezing and thawing. //Nature (Lond.). 1971. -V . 233. - P. 125-126.

459. Willadsen S.M., Polge C. Embryo transplantation in the large domestic species: applications and perspectives in the light of recent experiments with eggs and embryos. // I.R. Agric. Soc. Eng. 1980. - P. 115-126.

460. Willadsen S.M., Polge C., Rowson L.E.A. In vitro storage of cattle em-ryos. // Control of reproduction in the cow. Verlag Nijhoff, Den Haag., 1978. P. 81-90.

461. Willadsen S.M., Lehn-Jensen H., Fehilly C.G., and Newcomb R. The production of monozygotic twins of preselected parentage by micromanipulation ofnon-surgically collected cow embryos. // Theriogenology. -1981.-15.-P. 2329.

462. Willadsen S.M. A method for culture of micro-manipulated sheep embryos and its use to produce monozygotic twins. // Nature, Lond. 1979. — V. 277. -P. 298.

463. Willadsen S.M., Polge C. Attempts to produce monozygotic quadruplets in cattle by blastomemre separation. // Vet. Rec. 1981. - V. 100. - P. 211-213.

464. Willett E.L., Black W.G., Casida L.E. et al. Successful transplantation of a fertilized bovine ovum. // Science. -1951.-113.-P. 247.

465. Willett E.L., Buckner P.I., Larson G.L. Three transplantations of fertilized bovine eggs. // J. Dairy Sci. 1953. - 36. - P. 520.

466. Wilmut I. Embryo transfer in cattle breeding // Wld. Anim. Rev. -1980.-35.-P. 30-35.

467. Wilmut I., Rowson L.E.A. The successful low-temperature preservation of mouse and sow embryos. // J.Reprod.Fert. 1973. - V. 33. - P. 352-353.

468. Wilmut I., Rowson L.E.A. Experiments on the low-temperature preservation of cow embryos. // Vet. Rec. 1973. - 92. - P. 686-690.

469. Wintenberger-Torres S., Popescu P. Transfer of cow blastocysts after sexing. // Theriogenology. 1980. - P. 309-318.

470. Yamashina H. A practical studies for bobine embryo transfer. // Japan. J. Anim. Reprod. 1989. - 35 (5). - P. 20-23.