Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ускоренное воспроизводство высокопродуктивных племенных животных в молочном и мясном скотоводстве на основе новых биотехнологических методов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Ускоренное воспроизводство высокопродуктивных племенных животных в молочном и мясном скотоводстве на основе новых биотехнологических методов"

На правах рукописи

КЫСА ИВАН СТЕПАНОВИЧ

УСКОРЕННОЕ ВОСПРОИЗВОДСТВО ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ ПЛЕМЕННЫХ ЖИВОТНЫХ В МОЛОЧНОМ И МЯСНОМ СКОТОВОДСТВЕ НА ОСНОВЕ НОВЫХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Дубровицы - 2000

Работа выполнена во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Научный консультант - Заслуженный деятель науки Российской

Федерации, доктор биол. наук, профессор, Сергеев Н.И.

Официальные оппоненты - доктор биол наук, профессор,

Башкеев Е.Д. доктор биол. наук, профессор Ерохин A.C. доктор биол. наук, Тяпугин Е.А.

Ведущая организация - Российский университет дружбы народов.

Защита состоится' 2000 г. в 10 часов на заседании

диссертационного Совета Д 020.16.02 во Всероссийском государственном НИИ животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ВИЖ

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института.

Автореферат разослан 'V^Vd^V^ 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета;

канд. биолог, наук / -^/р В.П. Губанова

П Со -34/ ^ 0 г/ u-6/iO

1. ОКЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Интенсификация воспроизводства стада невозможна без использования новейших достижений биологической пауки, к которым относится и биотехнология трансплантации эмбрионов. Ее использование в практике животноводства открывает огромные возможности в разведении и воспроизведении крупного рогатого скота.

Она обеспечивает более интенсивное размножение животных с высокой генетической ценностью, сокращает генерационный интервал, является важным фактором ускорения процесса качественного улучшения популяции сельскохозяйственных животных.

В последние полтора-два десятилетия трансплантация эмбрионов стала важным инструментом племенного прогресса, о чем говорит тот факт, что во многих странах мира с развитым скотоводством она включена в селекционные программы. Среди 50-ти лучших быков черно-пестрой породы в США 32(64%) получены путем трансплантации. Из 47 быков-производителей на станции ЯРЫ Германии 28(59,5%) получены также с использованием данного метода. Уже в начале 90-х годов в мире проводилось 72 ООО вымываний ежегодно и получали 364 ООО эмбрионов, пригодных для пересадки. В Брестской области Беларуси за последние 12 лет получено 5 938 нормальных эмбрионов произведено 4 336 пересадок и получено 1 847 телят.

Разработка технологии криоконсервации эмбрионов позволила снять проблему импорта-экспорта скота и внести элемент планирования в работу с телками-реципиентами.

Маточное поголовье через своих сыновей оказывает значительное влияние на крупные популяции скота.

Естественным путем от коровы получают по одному теленку в год, при вероятности рождения 50% бычков. В связи с этим большое значение и приобретает получение быков-производителей от меньшего числа, но более ценных в генетическом отношении коров. Это побудило ученых разработать методы определения пола ранних зародышей.

Последние достижения в области биологии клетки позволили разработать технологию получения эмбрионов путем оплодотворения ооцитов коров вне организма, что еще на порядок повышает эффективность трансплантации эмбрионов и интенсивность использования высокоценных животных. Существенную роль в повышении эффективности трансплантации играет и технология разделения эмбрионов на две половинки, что позволяет за счет двойне-вых отелов на 35-40% повышать выход молодняка от одной коровы.

Однако, не смотря на достаточно высокий уровень развития, технология трансплантации в животноводстве не получила широкого использования. Многие ее элементы требуют дальнейшего совершенствования и внимания ученых.

Цель н задачи исследований. В связи с вышеизложенным, целью наших исследований явилась разработка технологии ускоренного воспроизводства высокопродуктивных племенных животных на основе совершенствования старых и разработки новых биотехнологических методов.

Для достижения поставленной цели были поставлены и решены следующие задачи:

-разработка методики отбора и подбора коров-доноров для ускорешюго воспроизводства;

- определение эффективности различных тинов гонадотропинов при вызывании суперовуляции у доноров;

- изучение факторов, влияющих на уровень суперовуляции, оплодотво-рясмость яйцеклеток и качество эмбрионов;

- определение эффективности получения двоен после нехирургической пересадки;

- изучение влияния различных факторов на приживляемость целых и разделенных эмбрионов;

- усовершенствование методов разделения эмбрионов и определение эффективности нехирургической пересадки разделенных эмбрионов;

- изучение влияния биопсии клеток при определении пола на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов;

- изучение эффективности трансплантации эмбрионов, получешшх путем экстрокорпоралыюго оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота;

- определение перспективы и экономической эффективности трансплантации эмбрионов в разведении и селекции крупного рогатого скота

Научная новизна. На основе использования последних достижений в биологической науке, совершенствовании старых и разработки новых методов получила развитие технология ускоренного воспроизводства племенных животных.

Разработана методика отбора и подбора коров-доноров. Определена эффективность различных типов гонадотропинов. Изучена результативность получения телят-двоен после пересадки свежих, замороженно-оттаянных и половин разделешшх эмбрионов. Определена степень влияния породы, сезона года, числа лактаций, продолжительности сервис-периода, интенсивности охоты, синхронности эстрального цикла донора и реципиента, качества и стадии развития эмбриона на приживляемость целых и разделенных эмбрионов.

Внесены новые технологические решения в способы пересадки эмбрионов, их микрохирургическое деление. Впервые в Республике Беларусь получены телята с заведомо определенным полом и телята из эмбрионов, культивированных in vitro. Совместно с коллегами из Германии изучено влияние биопсии эмбрионов при определении пола на их жизнеспособность и при-

живляемость. Изучена эффективность трансплантации эмбрионов, полученных in vitro.

Практическая ценность работы. Впервые обобщен богатейший материал полученный в производственных условиях и определена экономическая эффективность биотехнологии трансплантации эмбрионов в ускоренном воспроизводстве племенных животных.

Изучена эффективность большого количества гормональных препаратов используемых для стимуляции суперовуляции и синхронизации половой охоты. В первые в Республике Беларусь получены телята с прогнозируемым полом и оплодотворенные вне организма. С использованием этиленглюколя разработан экспрес-метод замораживания и пересадки эмбрионов.

В производственных условиях разработана и внедрена технология получения телят-двоен различными способами. Созданы две лаборатории по трансплантации эмбрионов на производстве.

По результатам исследований изданы три монографии и шесть информационных бюллетеней и листков.

Новизна и практическая ценность исследований подтверждена тремя изобретениями. Полученные результаты использованы при разработке пяти методических рекомендаций и комплексных программ по племенной работе и воспроизводству.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту;

- влияние условий синхронизации охоты на эффективность трансплантации эмбрионов;

- зависимость суперовуляции от ряда биотехнологических факторов;

- влияние некоторых факторов на эффективность получения эмбрионов;

- оценка качества целых и разделенных эмбрионов в зависимости от различных факторов;

- эффективность крио- и деконсервирования эмбрионов в зависимости от различных факторов;

- обоснование эффективности трансплантации эмбрионов, полученных in vitro;

- влияние биопсии клеток при определении пола на приживляемость эмбрионов;

- биотехнологические методы получения двоен;

- рост и развитие телят-трансплантатов;

- экономическая эффективность биотехнологии трансплантации эмбрионов в ускоренном воспроизводстве племенных животных.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены:

- на Республиканской научной конференции «Состояние и перспективы развития биологии в животноводстве» (20-21 сентября), г. Харьков,!988г.;

- на 42 научно-методической конференции «Проблемы интенсификации животноводства» Дубровицы, ВИЖ, 1989г.;

-на Республиканском совещании-конференции «Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота» г. Жабинка, 1990 г.;

- на научно-практической конференции «Генетико-селекционные и технологические проблемы воспроизводства сельскохозяйственных животных» (19-20 мая), г. Киев, 1994 г.;

- на международной научно-практической конференции «Селекционно-генетические и биотехнологические проблемы разведения крупного рогатого скота» г. Брест, 23-25 мая 1995г.;

-на международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы интенсификации развития животноводства», 6-8 июня 1996г.,Горки;

- на международной научно-практической конференции «Использование трансплантации эмбрионов в селекции и разведении сельскохозяйственных животных», октябрь 1997г.,Аскания-Нова;

- на коллегии Минсельхозпрода (30,03.1996г.);

- на международной научно-производственной конференции «Конкурентоспособное производство продукции животноводства в Республике Беларусь», г.Жодино, 1998г.

- на 49-ой ежегодной конференции ассоциации европейских животноводов, 24-27 августа 1998 г. Варшава, Польша.

- на конференции в рамках Форума « Восток-Запад» 24-25 января 1999 г. и 14-17 января 2000 г., г. Берлин, ФРГ.

По материалам диссертации опубликовано 30 научных работ, в том числе три монографии.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 257 страницах, содержит 95 таблиц, 6 схем, 52 рисунка, состоит из введения, результатов собственных исследований, обсуждений, выводов и практических предложений.

Список литературы включает в себя 375 источников, из них 189 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы п методы

Исследования проводили в Центре по трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных (ВИЖ), в лаборатории по трансплантации эмбрионов Брестского госплемпредприятия, на племзаводах «Луч» и «Нача», в племсовхозах «Муховец», «Видомля», «Закозельский», в колхозе «Красная

звезда» Брестской области, племенной станции ИРЫ г.Ферден (Германия), по следующей схеме:

Схема 1

СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЙ

- желательный тип скота

- направление селекции

- отбор потенциальных коров-доноров

-методы получения высокопродуктивных коров-доноров

Ускоренное воспроизводство высокопродуктивных племенных животных биотехнологическим путем

Экономическая эффективность разведения племенных животных биотехнологическими методами

Совершенствование и разработка теоретических и практических основ биотехнологии трансплантации эмбрионов

Изучение эффективности различных методов увеличения числа потомков

Рост и развитие телят-трансплантатов

Гормональное кндутшрование охоты и суперовуляции у телок и коров

Совершенствование

методов 1

криоконсервашш | эмбрионов

Пересадка различного

числа эмбрионов

Методы получения монозиготных двоен

Рост и развитие телят-трансплантатов

Особенности роста и развития телят-трансплантатов мясных пород

Методы получения и оценки качества эмбриона

Получение и переездка эмбрионов мотодом ш уйго

Развитие телят одинцов и двоен

Эффективность

пересадки различных групп эмбрионов

Пересадка эмбрионов с определенным полом

Рост и развитие быков полученных различными способами

В качестве доноров использовали клинически здоровых молочных коров черно-пестрой породы в возрасте от 4 до 8 лет, живой массой 600-650 кг, с удоем но наивысшей лактации более 7000 кг молока, жирностью 3,8% и более, а также коровы мясных пород: абердин-ангусской, герефордской, саперской, симментальской.

Реципиентами служили молодые коровы (по 1-3 лактации) и телки в возрасте 16-18 месяцев с живой массой 350-420 кг.

Синхронизацию охоты у реципиентов проводили СЖК в сочетании с эс-трофаном. Животным с известным половым циклом на 9-13 день полового цикла вводили СЖК в дозе 400-500 ИЕ. Через двое суток - эстрофан в дозе 500 мкг.

Вторую группу телок обрабатывали двухкратным введением эстрофана. Интервал между первым и вторым введениями составлял 11 дней. Число животных, пришедших в охоту, учитывали через 24,48 и 72 часа.

Через 6-7 дней после охоты у животных ректально определяли наличие и качество желтого тела.

С целью изучения влияния стрессов ка эффективность стимуляции охоты было сформировано две группы животных. Синхронизацию проводили двухкратным введением эстрофана с интервалом в 11 дней. Животных первой группы перевозили на пункт трансплантации на пятый день после охоты. Животных второй группы за 12-24 часа до ожидаемой охоты.

Для гормонального вызывания суперовуляции использовали литовский препарат фоллитропин, ФСГ (США), фолликогропин (Чехия), ФСГ-супер (Россия). Гормональные препараты вводили на 9-й - 12-й день эстралыюго цикла.

Осеменение доноров проводили трехкратно с интервалом в 12 часов.

Эмбрионы извлекали на 7-й день полового цикла. Кратковременное хранение эмбрионов осуществляли в фосфатно-солевом буфере Дюльбекко с добавлением 20% фегальной сыворотки крови теленка и антибиотиков.

Морфологическую оценку качества эмбрионов осуществляли согласно инструкции по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота ВИЖ (1987).

С целью определения влияния возраста и числа лактаций на приживляе-мость эмбрионов, реципиентов разделили на три группы. В первую группу вошли животные в возрасте 3 лет по 1 лактации, во вторую - от 3 до 4 лет гго 2 лактации, в третью - от 4 до 5 лет по 3 лактации. Так же учитывали вшгя-ние на этот показатель сервис-периода, стадии развития и качества эмбрионов, синхронности половых циклов и интенсивности охоты. Для получения телят-двоен использовались как свежеполучешше, так и замороженно-оттаянные эмбрионы, а также их половинки. Пересадку проводили катетером «Найштадт» и катетером нашей конструкции, позволяющим пересаживать два эмбриона в разные рога матки без повторного прохождения канала мат-

ки. Для деления использовали эмбрионы отличного и хорошего качества, на стадии поздней морулы или ранней бластсцисты.

Деление эмбрионов проводили двумя методами: первый метод - металлическим микроскальпелем под лупой со 100-кратным увеличением без подсадки полуэмбриопов в пустые зоны пеллюцида (в условиях производства). Второй метод - с использованием микроманипулятора в лабораторных условиях. Половинки эмбрионов помещали в пустые зоны пеллюцида.

Кратковременное хранение полуэмбрионов проводили в среде Дюльбек-ко с содержанием 20% сыворотки крови теленка.

Выделение ооцитов проводили двумя методами: 1- трансцервикалышм отсасыванием ооцитов из фолликулов доноров с использованием ультросо-нографа; 2 - из яичников убитых на мясокомбинате коров. Полученные эмбрионы пересаживали или подвергали криоконсервации.

Определение пола эмбрионов производили в лаборатории племстанции ЯРЫ г. Ферден (ФРГ). Для определения пола у эмбрионов брали один или несколько бластомеров и ставили две или три независимые реакции, в результате чего производили анализ ДНК. Для повышения точности определения пола использоали полимеразную цепную реакцию. Предметом наших исследовании было изучение влияния биопсии бластомеров на жизнеспособность эмбрионов.

Криокопсервирование эмбрионов проводилось двумя методами.

Метод 1: в качестве криопротектора использовался 10% раствор глицерина в культуралыюй среде «ОСМ» (фирма Вос1тко). Эмбрионы помещались на 10-15 мин. в 10% раствор глицерина, затем заправлялись в 0,25 мл паетгы. Режим замораживания начинался при -»-40С. Охлаждение проходило со скоростью 1,0°С в мин до -6°С. При -6°С проводился сидинг с 5 мин. выдержкой и дальнейшим охлаждением со скоростью 0,5°С в мин до -32,5°С с последующим переносом замороженных эмбрионов в жидкий азот (-196°С).

Метод 2: в качестве криопротектора использовался 1,5М раствор эти-ленгликоля в «ОСМ». Эмбрионы, максимум на 10 мин. помещались в 1,5М раствор этиленгликоля и заправлялись в паетты. Криокопсервирование эмбрионов проводилось аппаратом «Сгуосе11»1200.

Оттаивание эмбрионов, замороженных в 10% глицерине и в 1,5М эти-ленгликоле, проводилось двумя методами. Первый метод - стандартный: паетгы с эмбрионами, замороженными в 10% глицерине оттаивались 10-12 сек. на воздухе, затем в водяной бане, при 25-30°С, 15-20 сек. Удаление криофи-лактика проводилось четырехступенчатым методом. Пересадка заморожен-но-оттаянных эмбрионов проводилась в течение 10 мин. после размораживания.

Разморажившше эмбрионов, криоконсервированных с применением в качестве криопротектора 1,5М раствора этиленгликоля, проводилось 10 сек. на воздухе, затем в водяной бане при 30°С 15 сек., при этом время и темпера-

тура выдерживались точно. Непосредственно перед трансплантацией паетта встряхивалась, таким образом перемешивалась культурвльная среда и крио-филактик. Пересадка замороженно-оттаянных эмбрионов проводилась в той же паетге без контроля под микроскопом в течение 5 мин.

При втором методе размораживание и выведение криопротекторов (глицерина и этиленгликоля) проводилось с использованием 1,0М сахарозы в качестве среды для удаления криофилактиков. Оттаивание па воздухе и в водяной бане проводилось аналогично первому методу, затем эмбрионы извлекались из паетт и помещались на 2 мин. в 1,0М сахарозу, после чего эмбрионы переносились в культуральную среду для насыщения. Процесс насыщения проходил в течение 1-2 мин. Замороженно-оттаянные эмбрионы заправлялись в паетты и пересаживались.

2.2. Влияние условий синхронизации охоты на эффективность трансплантации эмбрионов

В наших исследованиях при точно синхронизированной охоте у реципиента с донором приживляемость составила 81,2%. 70,4% - когда день эст-рального цикла реципиента опережал день полового цикла донора на 1 день, и 55,9% - когда на один день запаздывал.

Стимуляция охоты реципиентов с использованием простагландина + СЖК (опыт) или простагландина (контроль) показало некоторое преимущество опытной группы над контрольной но общему числу пришедших в охоту на 5,7% и на 21,6% по числу животных, пришедших в охоту через 48 часов (табл. 1).

Таблица 1

Эффективность стимуляции охоты у доноров и реципиентов путем комплексного применения СЖК и простагландина

Показатель

Обработано животных Число животных, проявивших признаки охоты в том числе: через 24 часа через 48 часа через 72 часа Число животных, не проявивших признаки охоты

Группы

СЖК+простагландин

79

73-92.4

2-2,7 53-72,6 18-24,7

6-7,6

Простагландин

113

98-86,7

5-5,1 50-51,0 43-43,9

15-13,3

Аналогичные результаты получены по наличию и качеству желтого тела (табл. 2).

Таблица 2

Качество желтых тел и приживляемость эмбрионов в зависимости от способа синхронизации охоты у телок-реципиентов

Показатель Группы (п-%)

СЖК+простагландин Простагландин

Число животных 73 98

Количество животных с активным

желтым телом в яичнике 67-91,7 74-75,5

в том числе:

отличного качества 48-71,6 41-55,4

хорошего качества 9-13,4 14-18,9

удовлетворительного качества 10-14,9 19-25,7

Отсутствовали желтые тела в яичнике 6-8,2 24-24,5

Пересажено эмбрионов 64 44

Стельных реципиентов 39-60,9 20-45,5

Данные таблицы 2 показывают, что животных с наличием желтого тела в яичнике в опытной группе было больше на 16,2%. Число коров с отлично развитым желтым телом в этой группе также превышало контрольную на 16,2%.

Процент приживляемости эмбрионов в опытной группе составил 60,9% против 45,5% в контрольной.

Результаты исследования эффективности стимуляции охоты у коров в зависимости от функционального состояния яичников показали, что большее количество коров пришедших в охоту оказались животными с активным желтым телом - 93,1%, незначительно ниже у коров с желтым телом и фолликулом в яичнике - 90,9%.

Животные с наличием в яичнике фолликула с желтым телом предыдущего цикла, проявили признаки охоты хуже - 65,7%, что на 27,4% ниже но сравнению с коровами первой группы и ка 25,2% второй. При этом подавляющее большинство коров 1-ой группы (87,3%) пришло в охоту через 48 ч., в то время как во второй - 69,3%, в третьей -49,3%.

Количество телок, пришедших в охоту было следующим: в первой группе их количество составило 95,3%, во второй - 83,2%, в третьей - 62,4%. Через 48 часов проявили признаки охоты 91,1; 71,9; и 55,7% соответственно

Опыты по определению влияния стрессов механического и физического характера на эффективность синхронизации охоты и приживляемость эмбрионов показали, что из 30 телок, которые подвергались стрессовым воз-

действиям, с хорошо выраженными признаками охоты, оказалась 21 или 70%. В контроле этот показатель составил 90,7%. Число животных с отлично развитым желтым телом в опытной группе было ниже на 13%, а приживляе-мость - на 28,3%.

По результатам синхронизации охоты различными простагландинами было установлено, что более результативно проявили себя эстрофан и ани-прост. После однократной обработки в первом случае в охоту пришло 67% реципиентов, стельными из которых стало 51,3%, во втором эти показатели составили 69,0% и 56,2% соответственно. Что касается синхронизации охоты с использованием эстуфалана, эффективность данного препарата оказалась значительно ниже и составила 51,1% и 30,1% соответственно.

2.2. Влияние некоторых биотехнологнчесих факторов на эффективность стимуляции множественной овуляции

В наших исследованиях гормональная стимуляция полиовуляции проводилась препаратами ФСГ различного типа. По результатам экспериментов установлено, что обработка коров-доноров различными препаратами ФСГ в уменьшенных дозах обеспечивала высокий процент реагирующих полиовуляцией животных (табл. 3).

Таблица 3

Уровень суперовуляции и изменчивость реакции яичников у коров-доноров при обработке различными препаратами ФСГ

Показатели Фоллико-тропин (Чехия) ФСГ-П (США) Фоллитропип (Каунас) ФСГ-супер (Россия)

Обработано животных 21 53 104 11

Реагировато суперовуляцией 19 50 90 9

% от обработанных 90,5 94,3 86,5 81,8

Число овуляций в среднем па донора 9,3 12,2 11,2 8,9

Изменчивость в числе овуляций 3-6 (п-%) 6-31,6 13-26,0 22-24,4 2-22,2

7-9 (п-%) 6-31,6 13-26,0 19-21,1 4-44,4

10 и более (п-%) 7-36,8 24-48,0 49-54,4 3-33,3

Получено в среднем на донора эмбрионов и яйцеклеток 7,4 7,1 9,0 5,0

в т.ч. нормальных эмбрионов 6,6 4,7 5,8 4,3

% от общего числа 89,2 66,2 64,4 86,0

Овулирующая реакция яичников была наиболее высокой в группах, где использовался ФСГ-П и фоллитропин - соответственно 12,2 и 11,2 желтых тел в среднем на донора.

Несколько ниже, но на достаточно высоком уровне в группах с фолли-котропином и ФСГ-супер - 9,3 и 8,9 соответственно.

Общее число эмбрионов и неоплодотворенных яйцеклеток составляло в среднем на донора 7,4; 7,1; 9,0 и 5,0 у фолликотропина, ФСГ-П, фоллитропи-па и у ФСГ-супер соответственно, в т.ч. жизнеспособных - 6,6; 4,7; 5,8; 4,3.

В наших исследованиях в качестве доноров эмбрионов использовались 3 породы животных: черно-пестрая (голштины), герефордская, абердин-ангусская (табл. 4).

Таблица 4

Уровень суперовуляции и выход эмбрионов в зависимости от породы коров-доноров

Показатели Порода коров-доноров

черно-пестрая герефорд абердин-ангусская

Обработано животных 81 24 29

Реагировало полиовуляцией 62 16 21

% от числа обработанных 76,5 66,7 72,4

Овуляций в среднем на донора 9,6 11,8 Ю,1

Получено эмбрионов и норм, яйцеклеток на донора 7,2 10,2 7,3

В т. ч. пригодных (п-%) 4,6-63,9 6,9-67,6 4,3-56,9

дегенерированных (п-%) 1,1-15,3 1,7-16,7 1,5-20,5

нормальных яйцеклеток (п-%) 1,6-22,2 1,6-15,7 1,4-19,2

В ходе экспериментов установлено, что от 66,7 до 76,5% доноров от числа обработанных реагировали суперовуляцией. В группе герефордов отмечен наиболее высокий уровень полиовуляции - 11,8 овуляций в среднем на донора, выход эмбрионов и яйцеклеток - в среднем 10,2, в том числе нормальных эмбрионов - 6,9 на донора.

Коровы черно-пестрой и абердин-ангусской пород по овулирующей реакции яичников уступали герефордам и имели в среднем по 9,6 и 10,1 овуляций на донора.

Аналогичная тенденция наблюдается по общему выходу зародышей -7.2 и 7,3 соответственно, нормальных эмбрионов - 4,6 и 4,3 с среднем на донора.

При гормональной обработке коров-доноров весной и летом процент реагирующих суперовуляцией животных был выше, чем летом и осенью:

81,8 и 82,1% по сравнению с 67,4 и 72,1% соответственно. В то же время среднее число овуляций было высоким во все периоды года и составляло 11,3 и 11,2 в весенне-летний и 10,9 и 10,7 осенью и зимой.

Наибольшее число нормальных эмбрионов получено весной и летом -5,5 и 5,7 в среднем на донора по сравнению с осенью и зимой - 4,5 и 4,5 соответственно.

В таблице 5 приведены результаты исследований по изучению взаимосвязи качества желтого тела с уровнем прогестерона, количеством и качеством полученных эмбрионов.

Таблица 5

Взаимосвязь качества желтого тела с уровнем прогестерона в крови донора и его влияние на выход жизнеспособных эмбрионов

Показатели Качество желтого тела

отличное хорошее удолетв.

Обработано животных, голов 15 17 17

Уровень прогестерона до обработки, нг/мл 3,0*0,13 3,1443 2,8*0,23

Среагировало полиовуляцией, п-% 12-80,0 13-76,5 13-76,5

Число овуляций на донора 10,7-1,4 11,9*1,35 7,6*0,83

Получено эмбрионов и яйцеклеток

Получено жизнеспособн. эмбрионов 5,2*1,35 4,6*1,1 3,8*1,2

Анализ приведенных данных показьшает, что наименьшая концентрация прогестерона была у доноров с удовлетворительным желтым телом в яичнике - 2,79 нг/мл против 3,01 и 3,11 нг/мл у доноров с отличным и хорошим желтым телом соотвегственно. Достоверной разницы по количеству среагировавших коров, как и по числу овуляций не установлено. У доноров с уровнем прогестерона 2,8 и удовлетворительным желтым телом количество овуляций и выход жизнеспособных эмбрионов составили 7,6 и 3,8 против 10,7 и 5,2 у доноров с уровнем прогестерона 3,0 нг/мл, и 11,9 и 4,6 у доноров с уровнем прогестерона 3,1 нг/мл.

Анализ результатов исследовашш по изучению влияния концентрации прогестерона и эстрадиола показывает, что в случае, когда в крови доноров перед гормональной обработкой содержалось прогестерона менее 1,0 нг/мл ни один донор не ответил положительной реакцией на обработку. Наибольший выход эмбрионов был получен у тех доноров, средний уровень прогестерона в крови которых находился в пределах 2,88-2,9 нг/мл (7 и более эмбрионов), а уровень эстрадиола - 19,0-21,0 нг/мл.

Результаты исследований по изучению взаимосвязи количества овуляций с концентрацией прогестерона и эстрадиола из которых видно, что сред-шй уровень прогестерона у доноров с уровнем овуляции 7-12; 13 и более составил 3,9-3,7 нг/мл, а концентрация эстрадиола - 21,8-19,2 соответственно. Соотношение этих гормонов у доноров с высокой овуляцией было 1:6-1:5, а с низкой и средней -1:23-1:9 соответственно.

Наши исследования показали, что в целом количество гормональных обработок (до 7) не повлияло на число среагировавших доноров. В среднем эта цифра колебалась от 80 до 91,1. Не отмечено существенных различий по числу овуляций (7,4-11,1). Число извлеченных зародышей уменьшалось после третьей гормональной обработки, то же самое можно сказать и о полноценных зародышах, выход которых снизился с 6,8 (3-я обработка) до 1,8 (7-я обработка). Значительно снизилась и оплодотворяемость яйцеклеток: с 94,498,8 при 1-й, 2-й и 3-й обработках до 64,3 при 7-й обработке.

2.3. Влияние некоторых факторов на эффективность получения эмбрионов

При изучешп! эффективности нехирургических методов извлечения эмбрионов с использованием различных катетеров не установлено достоверной разницы в эффективности использования катетеров Нойштадт (Германия), Кассу (Франция) и конструкции ВИЖ. Хотя при использовагаш последнего наблюдается некоторое снижепие количества извлеченных клеток - 77,7% против 85,5 и 87,7% при использовании катетеров Кассу и Нойштадт соответственно. Данное заключение подтверждается и повторным промыванием рогов матки. Процент дополнительно извлеченных эмбрионов колеблется от 2,3% при использовании катетеров конструкции ВИЖ до 3,6% при использовании катетера Кассу. При этом необходимо отметить, что эта разница недостоверна. То же самое можно сказать и потерях промывной жидкости.

В наших исследованиях расход среды Дюльбекко составлял 500 и 250 мл на один рог. Как видно из полученных данных, снижение в 2 раза поступающей в рог жидкости не отразилось на количестве извлеченных эмбрионов и неоплодотворешшх яйцеклеток. Повторное промывание рогов средой в количестве 500 мл на каждый рог полученных показателей практически не изменило.

2.4. Оценки качества целых н разделенных эмбрионов методом культивирования

Как показали наши исследования, наименьшее количество эмбрионов, продолживших свое развитие в процессе 24 ч. культивирования, было в случае, когда на культивирование ставились ранние морулы. Средний процент

таких зародышей составил всего 66,0. (табл. 6). По мере увеличения возраста эмбрионов увеличивалось и количество продолжавших свое развитие -77,0% в случае поздних морул, 92,7% ранних и 100% поздних бластоцист. Кроме этого отмечено более эффективное действие на этот процесс сложных питательных сред. В данном случае - ТС-199 (86,7%). При использовании фосфатного буфера Дюльбекко и раствора Хенкса эти показатели составили 76,4 и 84,5% соответственно. Следует также отметить более высокую эффективность эстралыюй сыворотки по сравнению с феталыюй сывороткой плодов крупного рогатого скота.

Таблица 6

Оценка качества эмбрионов методом культивирования

Стадия развития

Морула 1 Морула 2 Бластоцисга 1 Бластоциста 2

Питательная среда с « 8 ^ 5 О £ о О ч о. Р, ■ Е С ^ о § £ с а - в 5 О га Б о ч о. ! : р с ! % сГ . г, к с Й а о ёЗ д га ¡и о о. з 1 ¿ § ё с « а = 2 О га X со 4> О ч о. элжили ие, п-%

м Ё § 1 2 ® : « 5 Й в 1 ~ § 5

£ 52 С ч и: СХ рт Г"* « 1-1 о. б 5 С Р о. 2 ! С « £ С ч О, еч г-, га а. ° ^ с Р, 1 >-< о.

х ы ^

Дюльбекко т20%ФС 10 5-50,0 7 1 5-71,4 5 4-80,0 7 7-100

Дюльбекко+20%ЭС 7 4-57,1 5 ; 4-80,0 5 4-80,0 9 9-100

Хенкса + 20%ФС 8 5-62,5 8 ; 7-87,5 1 7-100 5 5-100

Хенкса + 20% ЭС 9 6-66,7 8 | 6-75,0 1 7-100 6 6-100

ТС-199 +20%ФС 8 6-75,0 11 ! 8-72,7 9 8-88,9 7 7-100

ТС-199 + 20%ЭС 8 7-87,5 9 : 7-77,8 8 8-100 7 7-100

ИТОГО 50 33-66,0 48 ; 37-77,1 41 38-92,7 41 41-100

Анализ данных регенеративной способности демиэмбрионов в зависимости от стадии, на которой находился интакгный эмбрион, выявил, что наибольшей способностью к дальнейшей компактизации и развитию обладают половинки поздних морул и ранних бластоцист, процент жизнеспособности которых составил 85,4% и 90,6%, в то время как среди поздних бластоцист развилось 40,5% полуэмбрионов, а среди ранних морул всего лишь 15%.

Таким образом, наиболее пригодными для деления являются эмбрионы на стадии поздней морулы и ранней бластоцисты.

2.5. Влияние некоторых факторов на эффективность крио- и деконсервпрования эмбрионов

Согласно данных таблицы 7 наиболее эффективным было использование в качестве криопротектора этиленгликоля и раствора сахарозы при от-

таивании. Так, эмбрионы отличного качества сохранили жизнеспособность в 100% случаев, а хорошего в 96,2%. Резкое снижение сохранности отмечается при использовании стандартного метода оттаивания на эмбрионах удовлетворительного качества - 44,4 и 37,9% при замораживании в этиленгликоле и глицерина соотвественно.

Таблица 7

Сохранность эмбрионов в зависимости от криопротектора, способа оттаивания и качества эмбрионов

Криопротектор

Качество эмбрионов Этиленгликоль Глицерин

Способ оттаивания

Стандартный С сахарозой Стандартный С сахарозой

оттаяно, пригод- оттаяно, ПрИГОД- оттаяно, пригод- оттаяно, ггригод-

п ных,п-% п ных,п-% п ных,п-% п ных,п-%

Отличные 357 327-91,6 97 97-100 341 312-91,5 102 92-90,2

Хорошие 108 97-89,8 53 51-96,2 150 135-90,0 41 37-90,2

Удолетв. 36 16-44,4 33 23-69,7 29 11-37,9 20 15-75,0

В целом же, как при криоконсервации зародышей в этиленгликоле, так и при их криоконсервации в глицерине отмечена тенденция снижения сохранности при оттаивании клеток с использованием стандартного метода по сравнению с использованием сахарозы по всем уровням качества эмбрионов.

В таблице 8 приведены результаты исследования по изучению влияния криопротектора на сохранность эмбрионов при замораживании, способа оттаивания и стадии развития эмбрионов.

Таблица 8

Сохранность эмбрионов в зависимости от способа замораживания, оттаивания и стадии развития

Криопротектор

Этиленгликоль Глицерин

Стадия Способ о паивания

развития Стандартный С сахарозой Стандартный С сахарозой

оттаяно, п пригодных, п-% оттаяно, п пригодных,п-% оттаяно, п пригодных,п-% оттаяно, п пригодных,п-%

Морула 362 320-88,4 90 83-92,2 279 236-84,6 77 68-88,3

БластоцистаI 104 93-89,4 60 57-95,0 185 173-93,5 59 53-89,8

Бластоциста И 35 ~1 97-77,1 31-93,9 56 49-87,5 27 23-85,2

Анализ полученных данных показывает, что независимо от используемого при замораживании криопротекгора и способа оттаивания наибольшая выживаемость отмечена у ранних бластоцист по ставнению с морулами и поздними бластоцистами.

Следует отметить и тот факт, что сохранность эмбрионов при использовании стандартного метода оттаивания несколько снижалась по сравнению со способом оттаивания с применением сахарозы - 88,4-89,0% против 92,192,5% при применении этиленгликоля и глицерина соответственно, что еще раз подтверждает положительное влияние данного криопротекгора на жизнеспособность эмбрионов при их замораживании и опаивании.

Как видно из данных таблицы 9 наивысшую сохранность (96,8%) показали ранние бласгоцисты отличного качества, замороженные в этиленглико-ле. Несколько ниже (95,3%) при заморозке в глицерине, а самую низкую -поздние бластоцисты удовлетворительного качества, замороженные в глицерине (50,0%). Достаточно высокая сохранность отмечена также у морул и ранних бластоцист хорошего качества, замороженных в этиленгликоле - 92,8 и 94,0% соответсвенно.

Одним из основных критериев жизнеспособности как свежих так и за-мороженно-оттаянных эмбрионов является их приживляемость.

Таблица 9

Сохранность эмбрионов в зависимости от криопротекгора, стадии развития и качества

Криопротектор

Эпиенгликоль Глицерин

Качество эмбрионов Стадия развития

Мор) ла Блаетоциста I.Бластоцист II! Морула Бластоциста 1 Бластоциста II

Оттаяно, п Пригодных, п-% Оттаяно, п Пригодных п, -% Оттаяно, п Пригод- | От-ных п, - ! тая- % , НО, 11 Пригодных п, - % Оттаяно, п Пригодных п, -% Оттаяно, п Пригодных, п-%

Отличные 326 30292,6 95 92-96,8 33 30-90,9 :' 204 181-88,7 170 16295,3 69 61-88,4

Хорошие 83 77-92,8 50 47-94,0 28 24-85,7 | 117 105-89,7 62 57-91,9 12 10-83,3

Удовлетв. 43 24-55,8 19 11-57,8 7 4-57,1 ! 35 18-51,4 12 7-58,3 2 1-50,0

В таблице 10 представлены результаты пересадки зародышей с учетом одного из факторов, влияющих на его приживляемость после оттаивания и пересадки. Приживляемость свежих эмбрионов хотя и недостоверна, но зна-

читсльно выше замороженно-оттаяпных: 69,8% против 55,9 и 57,8%, при использовании глицерина и этиленгликоля соответственно.

Таблица 10

Приживляемость эмбрионов при учете одного из факторов

Факторы влияния

Крнопротектор Стадия развития Качество эмбрионов Качество желтого тела Реципиент Сторона пересадки Способ оттаивания

Показатели л с; § и X О д о Глицерин 1 Контроль(интак) Морула БластоцистаI Бластоциста 11 Отличное Хорошее £ Е. с и ь н о Отличное Хорошее Уловл створит. Телка | Корова Левая Правая Стандартный 'о о а. 3 и

Кол-во

амбрио-переса- 611 602 686 1154 521 224 1246 482 171 835 942 122 1441 458 840 1059 898 315

док,п

Уровень

приживляемо- 57,8 55,9 69,8 57,4 65,4 13,Ъ 67,1 54,1 42 1 68,9 57,9 39,3 64,2 53,3 63,3 60,4 56,7 57,4

сти, %

Сравнительный анализ результативности пересадок зародышей разных стадий развития выявил достоверную разницу в пользу поздних бластоцисг по сравнению с ранними бластоцистами и морулами: 73,7%, 65,4% и 57,4% при Р<0,05 и Р<0,001 соответственно.

Не менее важным фактором чем соответствие возраста зародыша сроку развития в момент извлечения, является его качество. Как видно из таблицы 10 наиболее высокую приживляемость при достоверной разнице показали эмбрионы отличного качества по сравнешпо с хорошими и удовлетворительными.

Сравнительный анализ эффективности использования в качестве реципиентов телок и коров показывает, что приживляемость у телок достоверно (Р<0,001) выше по сравнению с коровами - 64,2 и 53,3% соответственно.

Что касается стороны пересадки, то здесь какой-либо существенной разницы не отмечено: 63,3% при пересадке в левый рог и 60,4% - в правый.

Изучение влияния способа оттаивания эмбрионов на их последующую приживляемость показало, что уровень стельности практически не зависит от способа оттаивания зародышей 56,7% при стандартном и 57,4% при оттаивании в присутствии сахарозы.

В таблице 11 представлены результаты приживляемости эмбрионов в зависимости от криопротектора, стадии развития и качества эмбрионов. Как и во всех предыдущих случаях в данном лучшая приживляемость была у эмбрионов хорошего и отличного качества на стадии поздней бластоцисты: 76,7 и 75,0% при применении в качестве криопротектора этиленгликоля, что на 15,4. и 9,4% выше но сравнению с ранними бластоцистами и на 17,9% и 22,1% по сравнению с морулами.

Таблица 11

Приживляемость эмбрионов в зависимости от криопротектора, стадии развития и качества эмбрионов

Качество эмбрионов Криопротектор

Этиленгликоль | Глицерин | Ингактные

Стадия развития

Морула Бласто-циста I Бласто-циста II Морула Бласто-цистаI Бласто-циста II Морула Бласто-циста! Бласто-циста11

Количество пересадок Уровень стельности 1 Количество пересадок | Уровень стельности Количество пересадок Уровень стельности о э о о о. о = о Й <и ь к о ^ Уровень стельности Количество пересадок Уровень стельности | Количество пересадок Уровень стельности Количество пересадок Уровень стельности Количество пересадок Уровень стельности 1 Количество пересадок Уровень стельности

Оглич ное 302 54,6 92 67,4 30 76,7 181 61,3 162 62,9 61 63,9 236 77,1 106 77,3 76 92,1

Хорошее 77 57,1 47 59,6 24 75,0 105 37,1 57 61,4 10 20,0 115 56,5 31 61,3 16 68,7

Удов-лств. 24 29,1 11 54,5 4 0 18 22,2 7 ¡57,1 1 100 96 47,9 8 37,5 2 50

Анализ приживляемости эмбрионов отличного качества при использовании для замораживания этиленгликоля и глицерина, показал увеличение приживляемости поздних бластоцист в случае применения этиленгликоля но сравнению с использованем глицерина (76,7% против 63,9%), то же можно сказать о приживляемости поздних бластоцист хорошего качества (75,0 против 20,0 при Р<0.001).

В таблице 12 приведены результаты исследований по изучению взаимовлияния на результативность эмбриопересадок криопротектора, качества эмбриона и качества желтого тела реципиента.

Анализ представленных данных выявил достоверное увеличение приживляемости эмбрионов только в случае пересадки эмбрионов хорошего ка-

чества реципиентам с отличным желтым телом при использовании в качестве крионротектора этиленгликоля, по сравнению с теми же даипыми, но при использовании глицерина. Далее следует отметать достаточно высокий уровень приживляемости эмбрионов удовлетворительного качества при их пересадке реципиентам с хорошим желтым телом как при использовании этиленгликоля, так и глицерина (40 и 42,1% соответственно). Отмечается стабильная тенденция снижения приживляемости эмбрионов всех категорий качества по мере снижения качества желтого тела реципиента. Это характерно как для этиленгликоля, так и для глицерина. Однако во втором случае эта тенденция выражена слабо.

Таблица 12

Приживляемостъ эмбрионов в зависимости от криопротектора, их качества и качества желтого тела реципиента

Качество эмбрионов Криопротектор

Этиленг.тиколь | Глицерин | Интактные

Качество желтого тела

Отличное Хорошее Удовлетворительное Отличное Хорошее Удовлетворительное Отличное Хорошее Удовлетворительное

Количество пересадок Уровень стельности Количество пересадок Уровень стельности Количество пересадок 5 Н О о Л р; о 6 л а о л о а. > Количество пересадок Уровень стельности Количество пересадок Уровень стельности Количество пересадок Уровень стельности Количество псресадок 1 | Уровень стельности * о 5 о и о, о о Я Й о Е о ЬЙ Уровень стельности Количество псресадок Уровень стельности

Отли ное 175 62,8 224 58,4 25 36 218 68,8 1 179 ¡55,3 1 7 42,8 222 87,4 176 73,9 20 50

Хорошее 68 66,9 73 57,5 7 42,8 72 оо 93 45,2 7 14,3 46 60,8 101 59,4 15 46,7

Удов летв. 16 31,2 15 40 8 25 5 20 19 42,1 2 0 13 69,2 62 45,1 31 41,9

Кроме этого следует отметить, что независимо от качества желтого тела и используемого криопротектора, удовлетворительные по качеству эмбрионы имели самый низкий уровень приживляемости.

Анализ эффективности пересадки эмбрионов на разных стадиях развития реципиентам с разным качеством желтого тела не выявил достоверных различий (табл. 13). При этом следует отметить снижение приживляемости эмбрионов всех стадий развития по мере снижения качества желтого тела.

Таблица 13

Приживляемость эмбрионов в зависимости от криопротектора, стадии развития и качества желтого тела реципиента

Стадия развития Криопротектор

Этиленгликоль | Глицерин | Интактные

Качество желтого тела

Отличное Хорошее Удовлетворительное Отличное Хорошее Удовлетворительное Отличное Хорошее Удовлетворительное

Колггчество пересадок Уровень стельности Количество пересадок Уровень стельности к о § о о о. 1) с о со н и о Е п о К Уровень стельности Количество пересадок Уровень стельности Количество пересадок | Уровень стельности Количество пересадок Уровень стельности Количество пересадок Уровень стельности и о 3 О О. <ц С О а н о 2 Ь о и: Уровень стельности Количество пересадок Уровень стельности

Мору- ла 172 58,1 205 53,6 26 23,1 144 55,5 152 48,7 8 0 158 79,7 239 61,1 50 42

Бласто циста I 62 66,1 80 65 8 37,1 117 68,4 102 37 55,9 7 57,1 70 82,7 65 63,1 10 50

Бласто циста II 25 76 27 62,9 6 83,3 34 70,6 48,6 1 0 53 88,7 35 88,6 6 66,7

Применение этиленгликоля позволило получить стабильно высокую приживляемость поздних бластоцист по сравнению с морулами и ранними бластоцистами.

Исследования комплексного влияния на приживляемость эмбрионов в зависимости от криопротектора при замораживании, качества эмбрионов и последующего способа оттаивания, результаты которых приведены в таблице 14, показывают достоверное увеличение приживляемости зародышей хорошего качества, замороженных в этиленгликоле и оттаянных по стандартному методу, по сравнению с эмбрионами, замороженными в глицерине и оттаянными по тому же методу: 58,1% против 44,4 при Р<0,05. Аналогичные результаты получены и при пересадке эмбрионов, оттаянных в присутствии сахарозы: 67,4% против 42,8% при Р< 0,05.

К этому следует добавить, что эмбрионы хорошего и удовлетворительного качества, замороженные в этиленгликоле, показали более высокую приживляемости при условии их оттаивания в присутствии сахарозы. У эмбрионов отличного качества результаты были практически одинаковыми 59,5 и 56,5% соответственно.

Таблица 14

Приживляемость эмбрионов в зависимости от криопротектора, способа оттаивания и качества эмбрионов

Криопротектор

Этиленгликоль Глицерин

Способ оттаивания

Качество Стандартный С сахарозой Стандартный С сахарозой

эмбрионов количество пересадок, и уровень стельности,% количество пересадок, п уровень ! | стельности,% количество пересадок,п уровень стельности,% количество пересадок, п уровень стел ьн ости,%

Отличное 341 59,5 83 56,6 315 62,2 89 62,9

Хорошее 105 58,1 43 67,4 144 44,4 28 42,8

Удовлетвор. 25 28,0 14 42,8 20 40,0 6 16,7

При заморозке в глицерине прослеживается несколько иная тенденция: более высокий результат был получен при пересадке эмбрионов хорошего и удовлетворительного качества, оттаянных по стандартной методике - 44 и 40%, и 42,8 и 16,7% при использовании сахарозы.

В таблице 15 представлены результаты исследований по изучению взаимовлияния на эффективность эмбриопересадок криопротектора, способа оттаивания и стадии развития эмбрионов.

Таблица 15

Эффективность криоконсервации эмбрионов в зависимости от качества желтого тела, криопротектора и способа оттаивания

Качество желтого тела рещшиента Криопротектор

Этиленгликоль | Глицерин

Способ оттаивания

Стандартный С сахарозой Стандартный С сахарозой

количество пересадок, п уровень стельности,% количество пересадок, п уровень стелыюсти,% количество | пересадок,п уровень стел ьн ости, % количество пересадок, п 1 о4 х ¡~ " У 23 о о = с. ¡а о В

Отличное 201 60,2 58 67,2 235 62,9 60 60,0

Хорошее 247 57,1 65 58,5 232 50,4 59 54,2

Удовлетвор. 23 39,1 17 29,4 12 25,0 4 ! 25.0 1

Результативность была наиболее высокой при использовании для крио-консервации реципиентов с отличным желтым телом яичника - от 60,0 до 67,2% при всех способах замораживания-оттаивания.

Несколько более высокие результаты (57,1 и 39,1 % против 50,4 и 25,0%) были получены при пересадке эмбрионов, замороженных в этиленг-ликоле, реципиентам с хорошим и удовлетворительным желтым телом при стандартном методе оттаивания. Та же тенденция прослеживается и при использовании для оттаивания сахарозы - 58,5 и 29,4% против 54,2 и 25,0%.

2.6. Результативность трансплантации эмбрионов, полученных in vitro

Выделение ооцитов проводилось одним из двух методов: 1 - трансцер-викальное отсасывание ооцитов из фолликулов доноров с использованием ультразвукового зонда; 2 - из яичников убитых на мясокомбинате коров.

Полученные эмбрионы пересаживались или подвергались криоконсерва-ции. За 418 операций трансцервикатьному по отсасыванию было получено всего 3429 ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) или по 8,2 ОКК на одну операцию. Пригодными для постановки на дальнейшее созревание оказалось 2092 ОКК или 61%. После оплодотворения и культивирования ранних зародышей в течение 7-9 дней было получено 717 жизнеспособных эмбрионов, что составило 1,72 зародыша на операцию.

Анализ эффективности использования ооцитов, полученных из яичников коров, убитых на мясокомбинате, показывает, что всего за 77 циклов получено 6890 ооцитов или 89,5 ооцита на один цикл. Из них пригодных для дальнейшего созревания оказалось 4898 или 71,1%, что на 10,1% выше по сравнению с трансцервикальным получением женских гамет.

Из оставленных на созревание ооцитов было получено 1768 жизнеспособных эмбрионов или 22,9 на один цикл. Выход полноценных зародышей от числа пригодных ооцитов в первом случае составил 34,3% , во втором -36,1%.

Для получения одного эмбриона при использовании трансцервикального метода затрачивается 4,8 ооцита, а использование ооцитов из м/к - 3,9, но достоверных различий в этом вопросе не установлено.

Из 209 пересадок свежих зародышей стельность установлена у 99 реципиентов (47,4%) (табл. 16). Из 89 пересадок замороженно-оттаянных эмбрионов стельными стали 37 реципиентов (41,6%).

При пересадке эмбрионов, полученных из яичников коров, убитых на мясокомбинате, из 78 свежих эмбрионов прижилось 35 (44,9%), из 47 пересадок замороженно-оттаянных эмбрионов стельными оказалось 20 реципиентов или 42,5%.

Таблица 16

Влияние стадии развития эмбрионов, полученных in vitro, при различных методах получешш ооцитов на уровень стельности

Стадия развития OPU Мясокомбинат

кол-во пересадок ,п стельных реципиентов,гол. уровень стельности^ кол-во пересадок ,п стельных реципиентов,гол. уровень стельности,%

Мо ,31 12 38,7 14 5 35,7

В1 1 60 27 j 45,0 19 9 47,3

В12 67 35 ! 52,2 25 12 48,0

В13 51 25 i 49,0 20 9 45,0

ИТОГО 209 99 | 47,4 78 35 44,9

Таким образом, анализ результатов работы по получению эмбрионов вне оргаш!зма показывает достаточно высокую эффективность как одного, так и второго способа получения ооцитов, их созревания и оплодотворения.

Как при пересадке эмбрионов, полученных традиционным методом, так и при пересадке эмбрионов, полученных in vitro, важное значение имеет стадия их развития.

Анализ результатов говорит о том, что при пересадке свежих эмбрионов, полученных путем оплодотворения вне организма, наиболее высокий уровень стельности отмечен при пересадке экспандированных бластоцист - 51% против 48,5%, в случае пересадки поздних бластоцнст, и против 42,6% ранних бластоцист. Самая низкая приживляемость наблюдалась при пересадке морул (34,4%). Что касается замороженно-оттаянных эмбрионов, то здесь прослеживается несколько иная картина. Так, наиболее высокий уровень стельности показали ранние и поздние бластоцисты - 45,2 и 45,1% соответственно. Экспандированные бластоцисты и морулы прижились в 38,5 и 33,3% соответственно, что свидельствует о более низкой выживаемости этих возрастных групп в процессе криоконсервации.

Сравнивая эффективность трансплантации эмбрионов, в зависимости от стадии их развития, но полученных по разным методикам выделения ооцитов, мы отметили несущественное преимущество приживляемости эмбрионов, полученных путем оплодотворения ооцитов, выделенных методом трансцервикалыюй аспирации фолликулов, за исключением ранних бластоцист. Разница составляла от 3% при пересадке морул до 4,2% при пересадке поздних бластоцист.

Качество эмбрионов, полученных in vitro, так же, как и полученных посредством гормональной обработки, варьирует от непригодных к пересадке до 0ТЛИЧ1ШХ.

В таблице 17 представлены результаты пересадки свежих и заморожен-но-оттаянных эмбрионов. Показатели приживляемости в первом случае составили 53,7, 47,5 и 12,9% у отличных, хороших и удовлетворительных эмбрионов, соответственно во втором - 47,1; 40,3 и 11,1%. Аналогичная тенденция прослеживается и в случае пересадок эмбрионов, полученных из ооцитов, выделенных по разным методикам (табл. 18).

Таблица 17

Влияние качества эмбрионов на их приживляемость

Качество эмбрионов Свежие Заморожешю-отгаянные

кол-во пересадок ,п стельных реципиентов,гол. уровень стельности^ кол-во пересадок ,п стельных реципиентов,гол. уровень стельности^

Отличное 134 72 53,7 70 33 47,1

Хорошее 122 58 47,5 57 23 40,3

Удовлетв. 31 4 12,9 9 1 11,1

ИТОГО 287 134 46,7 136 57 41,9

Таблица 18

Влияние качества эмбрионов при различных методиках получения ооцитов на их приживляемость

OPU Мясокомбинат

Качество кол-во пе- стельных уровень кол-во пе- стельных уровень

эмбрионов ресадок ,п реципиен- стельно- ресадок ,п реципиен- стельно-

тов, гол. сти,% тов,гол. сти^

Отличное 90 50 55,5 37 18 48,6

Хорошее 83 44 53,0 33,0 16 48,5

Удовлетв. 36 115 13,9 8 1 19,5

ИТОГО 209 99 47,4 78 35 44,9

Эмбрионы отличного и хорошего качества, полученные путем трансцер-викалыгой аспирации фолликулов показали более высокие результаты но сравнению с послеубойным извлечением ооцитов из яичников, полученных с мясокомбината. Следует отметить тот факт, что эмбрионы отличного и хорошего качества показали в данном случае практически одинаковую приживляемость. В первом случае - 55,5 и 53,0; а во втором - 48,6 и 48,5%. При пересадке свежих эмбрионов телкам и коровам стельность составила 49,3 и 39,7%; при пересадке замороженно-оттаяпных - 44,3 и 35,9% у телок и коров соответственно. То же самое можно сказать и о эмбрионах in vitro, полученных по разным методикам. При использовании технологии OPU этот показа-

тель составил 40,0 и 48,4%, при использовании ооцитов с мясокомбината -38,1 и 47,3% соответственно у коров и телок.

Одним из субъективных критериев оценки готовности реципиентов к восприятию пересаженного эмбриона является наличие и качество желтого тела, отражающего в какой-то мере соответствие гормонального фона и вероятности наступления беременности.

В таблицах 19 и 20 представлены результаты исследований по изучению влияния качества желтого тела на уровень приживляемости зародышей. Следует отметить, что при пересадке свежих эмбрионов реципиентам с различным по качеству желтым телом отмечается довольно высокая их приживляе-мость - от 43,1%, при наличии удовлетворительного желтого тела, до 50,8% при пересадке эмбрионов реципиентам с отличным желтым телом. При пересадке заморожепно-оттаянных эмбрионов приживляемость снижается по всем уровням качества желтого тела, особенно при наличии желтого тела отличного и удовлетворительного качества с 50,8% до 44,0%, при пересадке свежих эмбрионов, и с 43,1% до 37,9%, при пересадке деконсервированных эмбрионов.

Таблица 19

Влияние качества желтого тела на приживляемость эмбрионов

Качество желтого тела Свежие Заморожешго-оггаянные

кол-во пересадок ,п стельных реципиентов,гол. уровень стельности^ кол-во пересадок ,п стельных реципиентов,гол. уровень стельности,%

Отличное 112 57 50,8 ■ 50 22 44 ,

Хорошее 117 52 44,4 57 24 42,1

Удовлетв. 58 25 43,1 29 11 37,9

ИТОГО 287 134 46,7 '[ 136 57 41,9

Таблица 20

Влияние мегода получения ооцитов и качества желтого тела на приживляемость эмбрионов

Качество желтого тела ори Мясокомбинат

кол-во пересадок ,п стельных реципиентов,гол. уровень стельности,% кол-во пересадок ,11 стельных реципиентов,гол. уровень стельности,%

Отличное 87 43 49,4 27 13 48,1

Хорошее 78 37 47,4 35 16 45,7

Удовлетв. 44 19 43,2 16 6 37,5

ИТОГО 209 99 47,4 | 78 | 35 44,9

Таким образом, приведенный выше анализ результатов исследований показывает, что технология получения эмбрионов вне организма животного отличается достаточно высокой эффективностью и может иметь существенное значение наряду с искусственным осеменением и трансплантацией эмбрионов в практической селекщш крупного рогатого скота, позволит значительно повысить интенсивность использования высокоценных животпых и, тем самым, сделать экономику воспроизводства стада более эффективной.

2.7. Влияние биопсии клеток при определении пола на приживляемость эмбрионов

Результаты определения пола у ранних зародышей в зависимости от стадии их развития и качества эмбрионов показали, что соотношение полов оставалось примерно одинаковым: из 1524 эмбрионов, у которых был определен пол, процент бычков составил 51,8, телочек - 48,2%. Стадия развития и качество зародышей на это соотношение влияния не оказывало.

В таблице 21 представлены дшшые о влиянии биопсии зародышей па их дальнейшую приживляемость. При пересадке свежих эмбрионов стельность составила 55,6% при биопсии и 53,0% интактных эмбрионов. Что касаегся замороженно-оттаянных, эти показатели составили 44,4% и 49,5% соответственно.

Таблица 21

Влияние биопсии эмбрионов при определении пола на уровень стельности

Характеристика эмбрионов Количество пересадок, п Уровень стельности, %

Свежие: - -

С биопсией 410 55,6

Без биопсии 953 53,0

Замороженно-оттаянные: - -

С биопсией 90 44,4

Без биопсии 200 49,5

Как видим, биопсия не имеет достоверного влияния на дальнейшую жизнеспособность эмбрионов.

2.8. Биотехиологические методы получения телят-двоен

Одним из направлений нашей работы было определение эффективности получения двоен путем пересадки эмбрионов предварительно осемененному

реципиенту. Пересадку свежеполученных эмбрионов проводили на 7-ой день эстрального цикла в контрлатеральный рот матки. Всего было пересажено 40 эмбрионов, стельными оказались 29 реципиентов (72,5%). Двойнями отелилось 15 коров (51,7%).

По результатам исследований установлено, что пересадка эмбрионов осемененным первотелкам не эффективна. Они хуже осеменялись (54,5%). У них значительно снижалась приживляемость эмбрионов (18,2%). Меньше было получено отелов двойнями (33,3% от числа стельных реципиентов). Наиболее подходящими для этой цели являются коровы в возрасте 4-х лет по второй лактации. У них отмечена высокая оилодотворяемость после первого осеменения (81,3%), стельность двойнями (61,5%) и приживляемость эмбрионов (50%).

В наших исследованиях сделана попытка выяснить влияния продолжительности сервис-периода на оплодотворяемость коров, приживляемость эмбрионов после нехирургической пересадки и уровень двойневых отелов.

Общий уровень стельности составил 72,5% и уровень двойневых отелов ог числа стельных коров - 51,7%. Продолжительность сервис-периода оказывала определенное влияние на оплодотворяемость коров и приживляемость эмбрионов при нехирургической пересадке.

Так, при осеменении коров до 60 дня после отела, оплодотворяемость составила 58,3%, приживляемость эмбрионов - 25%.С увеличением продолжительности сервис-периода от 60 до 100 дней оплодотворяемость коров и стельность двойнями заметно повышалась и составила 82,4% и 71,4% соответственно. До 58,8% повышался и уровень приживляемости эмбрионов. Дальнейшее увеличение сервис-периода от 100 до 130 дней снижало оплодотворяемость коров на 9,7%, стельность двойнями - на 25% и приживляемость эмбрионов - на 18,2%.

При нехирургической пересадке также прослеживается зависимость уровня стельности от стадии развития эмбрионов. Оказалось, что наиболее подходящими для пересадки были ранние бластоцисты (табл. 22).

Таблица 22

Приживляемость эмбрионов у коров в зависимости от стадии их развития

Показатель С тадия развития Всего

Поздние морулы Ранние бластоцисты

Число реципиентов 16 24 40

Пересажено эмбрионов 16 .24 40

Стельных реципиентов 11 18 29

Процент стельности 68,8 75,0 1 72,5

Стельность от пересадки ранних бластоцист достигла 75,0%, что на 6,2% выше по сравнению с группой коров, которым пересаживали поздние морулы. Общая стельность от пересадки 40 свежеполученных эмбрионов составила 72,5%. При этом необходимо подчеркнуть, что 40% и более двойне-вых стельностей, при контрлатеральной нехирургической пересадке, можно получить только при высокой оплодотворяемости коров (65-70%) после искусственного осеменения. При низкой оплодотворяемости коров (45-50%) получают только 20-25% двойневой стельности при пересадке эмбрионов предварительно осемененному реципиенту.

Перед нами ставилась задача изучить эффективность получешш телят-двоен путем пересадки двух эмбрионов. Было пересажено всего 212 эмбрионов: из них 56 эмбрионов 56 реципиентам, 106 эмбрионов - 53 реципиентам но два эмбриона в один рог, 50 эмбрионов - 25 реципиентам по одному в каждый рог матки (табл. 23).

Таблица 23

Результаты получения двоен при пересадке разного числа эмбрионов

Показатель Группы

Один эмбрион в 1 рог Два эмбриона в 1 рог Два эмбриона в оба рога

Число реципиентов 56 53 25

Пересажено эмбрионов 56 106 50

Число стельных реципиентов 29 33 18

Процент сгельности 51,8 62,3 72,0

Процент стельных от числа пересаженных эмбрионов 51,8 31,1 36,0

Число стельных двойнями 14 9 36,0

Процент двойневых стельностей от общего числа стельностей 42,4 50

Получено телят 27 41 26

Процент полученных телят от числа стельных реципиентов 93,1 124,2 144,4

Самый высокий процент стельности был в группе, где реципиентам пе-ресажив&чи по одному эмбриону в каждый рог матки (72%). Когда два эмбриона пересаживали в один рог матки, процент стельности составил 62,3%, а в группе телок, которым пересаживали один эмбрион - 51,8%. Однако процент стельности от числа пересаженных эмбрионов был выше в первой группе (51,8) и значительно ниже во второй и третьей группах (31,1 и 36 со-

ответственно). Во второй и третьей группах процент приживлясмости был в два раза ниже, так как каждому реципиенту пересажено по два эмбриона. Число двойневых стельностей в третьей группе было выше на 7,6%, чем во второй (50% против 42,4%). Необходимо отметить, что во всех трех группах наблюдались аборты. В первой группе один аборт - 3,4%, во второй три аборта - 9%, в третьей один аборт - 5,5%. По выходу телят показатель был выше в третьей группе - 144,4% против 124,2% во второй и 93,1% в первой.

В результате исследований установлено, что наиболее эффективным является способ получения телят-двоен путем пересадки двух эмбрионов одному реципиенту в разные рога.

Нами изучено влияние стадии развития эмбриона на эффективность получения телят-двоен. Эмбрионы перед пересадкой строго дифференцировали по качеству и стадии развития. Телкам первой группы (п=23) пересаживали морулы, второй группе (п=36) - бластоцисты, третьей группе (п=20) - мору-лу+бластоцисту (табл. 24).

Таблица 24

Приживляемость эмбрионов в зависимости от стадии их развития

Мо+Мо Бл.-Бл. Мо+Бл.

Показатель 2 эм- 2 эм- 2 эм- 2 эм- 2 эм- 2 эм-

бриона бриона бриона бриона бриона бриона

в 1 рог в 2 рога в 1 рог в 2 рога в 1 рог в 2 рога

Количество реципиентов 18 5 22 14 14 6

Число пересаженных эмбрионов 36 10 44 26 28 12

Стельных реципиентов 11 4 14 10 8 4

Процент стельности реципиентов 61,1 80 63,6 71,4 57,1 66,7

Процент стельности от

числа пересаженных эм- 30,5 40 31,8 38,5 28,6 33,3

брионов

При анализе данных, полученных в результате опыта, видно, что высокий процент стельности получен при соответствии обоих эмбрионов одной стадии развития (Мо+Мо или Бл.+Бл.).

В зависимости от числа эмбрионов, пересаженных в один или два рога матки, процент стельности был различный. Он был выше, когда две морулы аплицировали в разные рога матки (80%), и заметно ниже, когда два эмбриона пересаживали в один рог матки (61,1%). Аналогичные результаты были получены и при пересадке бластоцист (71,4 и 63,6%) и эмбрионов на разных

стадиях развития (66,7 и 57,1%). Необходимо также отметить, что при пересадке двух морул в разные рога матки процент стельности был выше, чем при соответствующей пересадке двух бластоцист (80 и 71,4%). По результатам анализа полученных данных можно заключить, что приживляемость эмбрионов повышается, когда они соответствуют друг другу по стадии развития и при пересадке их в разные рога матки реципиента.

При определении эффективности получения теляг-двоен путем пересадки половинок эмбрионов деление производили двумя методами: первый -деление осуществляли металлическим микроскальпелем под луной, без подсадки в зоны пеллюцида (в условиях производства); второй - эмбрионы делили с использованием микроманипулятора в лабораторных условиях. Полуэмбрионы после деления помещали в зоны пеллюцида. После деления эмбрионов все половинки оценивались в зависимости от их размера и морфологической характеристики. Было разделено 22 эмбриона и получено 40 нормальных половинок (90,9%).

Первым методом было разделено 10 эмбрионов и получено 18 (90%) половин, вторым - 12 эмбрионов и получено 22 половинки (91,7%). Телкам первой группы (п=8) пересаживали полуэмбрионы, разделенные первым методом, а второй группе (п=10) - полуэмбрионы, разделенные вторым методом. В обеих группах получено по 4 стельности (табл.25). Стельность реципиентов после пересадки половин эмбрионов в первой группе была выше на 10% чем во второй. В результате эксперимента получено 3 стельности двойнями - одна в первой и две во второй группе. Из 11 полученных телят 6 были из числа отелов двойнями. Выход телят в первой группе, также был несколько выше и составил 62,5%.

Таблица 25

Результаты пересадки разделенных эмбрионов

Показатель Методы деления

Первый Второй Всего

Разделено эмбрионов 10 12 22

Получено половинок (п-%) 18-90,0 22-91,7 40-90,9

Пересажено половин 16 20 36

Число реципиентов 8 10 18

Стельных реципиентов 4 4 8

Процент стельности 50,0 40,0 44,4

Получено телят 5 6 11

В том числе:

двоен 1 2 3

ОДИНЦОВ 3 2 5

Приживляемость половинок 31,2 30,0 30,6

Анализ полученных данных позволяет загслючить, что и результате деления эмбрионов без мнкроманипулятора в производственных условиях можно получить дополнительно до 40% телят. Приживляемость половинок при этом методе достигала 31,2%.

При уровне стельности 44,4% и приживляемости половинок 31,2% не снижается эффективность использования эмбриоматериала в сравнении с пересадкой целых эмбрионов.

Наиболее высокую приживляемость после деления показа™ поздние бластоцисты, уровень приживляемости половинок которых составил 45,0%.

2.9. Рост и развитие телят-трансплантатов

Нами проводился сравнительный анализ развития телят-трансплантатов различных генотипов по периодам развития 1996...1998 годов рождения. Учитывалась живая масса и среднесуточный привес телят до 3-х месячного возраста. Было сформировано 6 групп телят черно-пестрой породы (две отечественной селекции и четыре немецкого корня происхождения).

По результатам анализа установлено, что черно-пестрые телята отечественной селекции от зимне-весенних отелов 1997 года достоверно превосходили своих сверстников от осенних отелов по живой массе при рождении в среднем на 13,5 кг (Р<0,001).

Изменчивость показателей по группам не высокая и составляет соответственно 8,7 и 8,8%, что подтверждает достоверность имеющихся результатов. По живой массе в 1-месячном возрасте телята второй группы сохранили превосходство над своими сверстниками осенних отелов всего лить на 3,2 кг при недостоверной разнице, т.е. животные третьей группы развивались лучше и имели на 330 граммов больше среднесуточные привесы, что высоко достоверно (Р<0,001). До 3-х месячного возраста телята от осенних отелов сохранили превосходство по темпам развития над телятами 2-й группы и имели достоверно большие среднесуточные привесы - 997 и 851 грамм соответственно (Р<0,01), а по живой массе превзошли сверстников в среднем на 0,7 кг.

Аналогично большие темпы развития показали телята немецкой селекции от осенне-зимних отелов, в сравнении с телятами от зимне-весенних отелов. Так, в 1- месячном возрасте по живой массс они имели достоверное превосходство над животными 4-й группы fia 6,9 кг (Р<0,01); в 3-х месячном возрасте их живая масса составила соответственно 111,8 и 105,8кг.

Анализируя показатели развития телят 1998 года рождения, следует отметить, что наименьшую живую массу при рождении имели животные от зимне-весенних отелов - 24,3 кг, что достоверно ниже показателей по другим группам (Р<0,001). На самом низком уровне этот показатель сохранился и р. 3-х месячном возрасте - 105,8кг. Телята от летних отелов (5-я группа) со

средней по группам живой массой при рождении в 27,7кг получили наилучшее развитие и к 3-х месячному возрасту имели наибольшую живую массу -114,9 кг, что достоверно выше показателей 4-й группы (Р<0,05).

Следует отметить, что по всем группам за период до 3-х месячного возраста телята- трансплантаты имели среднесуточные привесы выше технологических (850 граммов), т.е. отработанная технология получения телят-трансплантатов позволяет получать высокоценный племенной молодняк в течение года вне зависимости от сезона рождения.

По результатам анализа развития телят-трансплантатов мясных пород установлено, что наименьшую живую массу при рождении и в 3-х месячном возрасте имели животные от осенне-зимних отелов - 22,8...26,1 кг и 92,4... 115,2 кг соответствешю по ангусской и герефордской породам.

Сравнивая показатели развития телят ангусской и герефордской пород от осенне-зимних отелов 1998 года установлено, что телята герефордской породы имели достоверно большую живую массу при рождении на 3,3 кг и в 3-х месячном возрасте на 22,8 кг (Р<0,005); по среднесуточным привесам превышение составило 123 грамма (Р<0,005). Следует также отмстить, что телята-трансплантаты от осенне-зимних отелов не дали минимальных технологических привесов по группам (950грамм).

Таким образом, для надлежащего использования высокоцешюго племенного материала (коров-доноров и эмбрионов) в мясном скотоводстве необходимо стремиться к исключению из практики получения телят от осенне-зимних отелов.

Нами проводился сравнительный анализ быков-трансплантатов по соб-ствешюй продуктивности в сравнении со сверстниками (табл.26).

По результатам анализа существенных различий по указанным признакам между группами быков не установлено. Так, по объему эякулята быки-трансплантаты превосходили сверстников на 0,1 мл в 1-й, 3-й и 4-й годы пользования; и в 6-й год на 0,4 мл; однако разница не достоверна (Р>0.05). Во 2-й и 5-й годы использования они недостоверно уступали сверстникам по данному признаку на 0,1 мл.

По концентрации спермиев в 1 мл лишь в 6-й год использования установлено достоверное превосходство сверстников над трансплантатами на 0,1 млрд. (Р>0,05) при среднем объеме эякулята 4,6 мл против 5 мл у трансплантатов.

Экономически важным показателем является количество полученных доз семени на 1 эякулят. По результатам анализа существенных и достоверных различий между группами быков по данному признаку не установлено.

Оплодотворяющая способность семени быков-трансплантатов и их сверстников составила примерно 57 и 60%. Достоверной разницы между группами по данному признаку не отмечено.

Таблица 26

Показатели собственной продуктивности быков-производителей

Группа быков Кол-во толов Год использования Кол-во эя- кул;шт Объем эякул. мл Общий эякул. мл Концентр. м лрд/мл Кол-во доз.шт Кол-во доз на 1 ЭЯКУЛ. шт Выживаемость^

Трансплантаты 15 1989 61,5 3,7 218,9 1,0 8193,3 133,2 17,0

Сверстники 15 30,5 3,6 112.8 1,0 3715,0 121,8 17,1

Трансплантаты 15 1990 147,9 3,9 532,0 1,0 18587,0 125,7 17,1

Сверстники 15 134,1 4,0 541,1 1,0 17404,7 129,8 17,1

Трансплантаты 15 1991 149,3 4,6 691,9 1,0 22414,6 150,1 17,1

Сверстники 15 171,1 4,5 756,7 1,0 25187,7 147,2 17,5

Трансплантаты 14 1992 73,3 4,7 330,1 1,0 10171,8 138,8 16,9

Сверстники 15 109,3 4,6 491,0 1,0 15617,1 142.9 17,2

Трансплантаты 6 1993 130,0 4,5 601,2 1,0 17261,7 132,8 16,8

Сверстники 11 125,6 4,6 588,8 1,0 17301,8 137.8 16.8

Трансплантаты 5 1994 72.5 5,0 353,3 1,0 10362,5 141,9 16,6

Сверстники 7 79,3 4,6 383,3 1,1* 12450,0 157.0 16,5

3. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ

Поддержание и совершенствование генетического потенциала быков-производителей республики в настоящее время затруднено по причине снижения продуктивности молочных стад племенных заводов, значительного уменьшения количества быкопроизводящих коров и ограниченных возможностей получения от них высококлассных ремонтных бычков.

Согласно республиканской комплексной программе ежегодная потребность страны в ремонтных бычках составляет 700 голов. По произведенным расчетам, изложенным в республиканской комплексной программе, ежегодно для постановки на элеверы недостает 376 голов ремонтных бычков.

Поэтому для ведения жесткого селекционного отбора, недостающее количество бычков можно получать в республике, причем значительно дешевле.

В США стоимость лучших племенных бычков составляет 25 ООО долларов. Минимальная стоимость 1 головы ремонтного бычка, приобретенного в Германии, составляет около 2 500 долларов США.

Исследователи Канады считают, что лидерство в создании высокопродуктивного молочного стада страна удерживает благодаря широкому вне-

дрению в производство метода трансплантации эмбрионов. В настоящее время в странах с развитым молочным скотоводством доля быков-трансплаптатов составляет 70% и более.

Учитывая тот факт, что завоз быков-производителей но импорту из-за отсутствия валютных средств ограничен, нами предложен проект получения ремонтных бычков методом трансплантации эмбрионов и обеспечение ими потребностей республики.

Согласно произведенным нами расчетам результативность практического применения трансплантации эмбрионов может быть спрогнозирована по основным показателям, приведенным в таблице 27.

Таблица 27

Эффективность разведения КРС методом трансплантации эмбрионов

Коли- Количе- Получе- Число Число Прижив По- От- Полу- Полу-

чество ство из- но эм- пригод- переса- ляе- луче- ход чено чено

коров влече- брионов ных к пе- док за мостьэ но 10% тело- быков

доно- ний в за извле- ресадке год брио- телят чек

ров год от 1 чение эмбрионов нов, %

коровы- 1 дон. от 1 дон. в

дон. год

40 320 32 144 144

50 4 4 16 800 50 400 40 180 180

60 480 48 216 216

40 640 64 288 288

100 4 4 16 1600 50 800 80 360 360

60 960 96 432 432

Затраты (в текущих ценах) на получение 1 ремонтного бычка методом трансплантации и содержание его до 3-х месячного возраста составят 16650 тыс. руб.» 666$ *

В 3-х месячном возрасте бычки передаются на элевер (г. Орша), где содержатся до 1 года, после чего поступают на госплемпредприятия республики.

Затраты на выращивание бычков на элевере составляют 10315 => 413$ (отчетные данные по элеверу за 1996 год).

Итого затраты на получение полноценного ремонтного бычка составляют 26965 тыс. руб. или около 1079$.

* Примечание: все расчеты произведены в белорусских рублях, долларах США и немецких марках. Разница курсов валют обусловлена датой сбора информации.

Расчеты экономического эффекта от получения ремонтных бычков внутри республики приведены в таблице 28.

Таблица 28

Расчет экономического эффекта от получения ремонтных бычков

Цена Количество, гол. Сумма, млн. руб. Сумма в дол. США

Ремонтные бычки, приобретенные по импорту 2500$ 376 23500 940000

Ремонтные бычки, произведенные в республике 26965 тыс. руб. / 1079 S 376 10138 405520

Экономический эффект +13362 534480

Таким образом, получение ремонтных бычков методом трансплантации эмбрионов в республике обойдется в 2,3 раза дешевле, чем закупка по импорту.

ВЫВОДЫ

1. Исследования выявили преимущество применения простагландина в сочетании с СЖК на 16,2% и увеличение приживляемости эмбрионов до 81,2% при точности синхронизации охоты донора и реципиента. В то время как отклонение на день раньше снижает этот покозатель до 70,0%, а на деш. позже до 55,9%. Применение эстрофана и анипроста повышает количество животных пришедших в охоту по сравнении с эстуфаланом на 15,9 и 17,9%, а уровень стельности соответственно на 21,2 и 26,1%.

2. Установленно, что стресс у животных, вызванный транспортировкой их накануне предполагаемой охоты оказывает неблагоприятное влияние на функциональную активность яичников. При этом число животных, пришедших в охоту, снижается с 90,7% до 70,0%, а количество животных без функционального желтого тела увеличивается с 21,9% до 31,8%.

3. Установлено, что уменьшение доз гонадотропинов на 15...20% не влияет на эффективность стимуляции множественной овуляции. Количество реагирующих животных колебалось от 81,8 до 94,3%. Овулирующая реакция яичников была наиболее высокой в группах, где использовались ФСГ-п и фоллитропин - 12,2 и 11,2 желтых тела на донора, соответственно.

В группе доноров герефордской породы отмечен наиболее высокий уровень полиовуляции по сравнению с черно-пестрой и абердин-ангусской:

среднее число овуляций составило 11,8, выход эмбрионов - 10,2, в т.ч. нормальных 6,9 против 9,6; 7,2; 4,6 и 10,1; 7,3 и 4,3, соответственно.

4. Наиболее объективной оценкой функциональной активности желтого тела является уровень прогестерона и эстродиола в крови животного. Установлено, что в случае, когда в крови доноров перед обработкой содержалось менее 1,0 нг/мл прогестерона ни один донор не среагировал суперовуляцией. Выход качественных эмбрионов был наиболее высоким и стабильным при уровне прогестерона в крови 2,8...2,9 нг/мл, а уровень эстрадиола 19,0...21,0 пг/мл.

5. Установлено, что количество гормональных обработок практически не влияет на количество доноров реагирующих на стимуляцию полиовуляции. В среднем этот показатель колебался на уровне 80,0...91,1%. Не отмечено существенных различий по числу овуляций (7,4... 11,1). Число извлеченных зародышей уменьшалось уже после третьей обработки. Выход полноценных эмбрионов снизился с 6,8 (3-я обработка) до 1,8 (7-я обработка), а оплодотворяемость с 94,4...98,8% до 64,3%.

6. В процессе криоконсервации установлено, что наиболее высокую сохранность показали эмбрионы отличного и хорошего качества на стадии ранней бластоцисты в присутствии 1.0 М сахарозы. Выживаемость зародышей находилась на уровне 95,0... 100%.

7. Криоконсервация эмбрионов достоверно снижает приживляемость эмбрионов с 69,8 до 55,9% при использовании глицерина и до 57,8% при использовании этиленгликоля. В целом не установлено различий в эффективности использования в качестве криопротекторов этиленгликоля и глицерина. Приживляемость эмбрионов составила 57,8 и 55,9%, соответственно. Однако приживляемость бластоцист отличного качества на 12,8% выше при замораживании в этиленгликоле по сравнению с глицерином.

8. По итогам исследований установлена достаточно высокая эффективность получения эмбрионов вне организма. При получении ооцитов из яичников доставленных с мясокомбината после убоя животного, выход жизнеспособных эмбрионов составил 34,3% при использовании трансцирвикаль-ной аспирации 36,1%; уровень стельности 44,9 и 47,4%, соответственно. По заморожецно-оттаянным эмбрионам этот показатель составил 41,6% и 42,3%, соответственно.

9. Биопсия клеток при определении пола ранних эмбрионов не оказывает достоверного влияния на дальнейшую жизнеспособность зародышей, уровень приживляемости которых составляет 55,6 против 53,0% у контроля.

10. Наиболее пригодными для деления являются ранние и поздние бластоцисты, уровень приживляемости половинок которых составил 41,7 и 45,0%, соответственно, против 38,9% при делении поздних морул.

11. При получении двоен путем пересадки эмбриона предварительно осемененному реципиенту наиболее оптимальным вариантом является

трансплантация зародыша молодым коровам в возрасте 4-х лет на второй лактации. При этом оплодотворяемость составляет 81,3%, стельность двойнями 61,5%. При получении двоен путем пересадки двух эмбрионов наиболее высокие результаты получены при пересадке по одному эмбриону в каждый рог матки. При этом зародыши должны находиться на одной стадии развития. Уровень стельности в таком случае на уровне 71,4...80,0%, в т.ч. двойней 50%.

12. Пересадка половинок эмбрионов с целью получения двойневых отелов позволяет получить дополнительно до 40% телят по сравнению с персад-кой целых зародышей.

13. Анализ динамики живой массы двоен показал, что они уступают по этому показателю телятам-одинцам (телочки на 6,0 кг, бычки на 10,0 кг), однако к 12-месячному возрасту эти показатели выравниваются. По показателям собственной продуктивности и оплодотворяющей способности достоверной разницы между группами быков-трансплантатов и их сверстсниками не установлено.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Разработанные способы ускоренного воспроизводства высокопродуктивных племенных животных рекомендуем для использования в практике разведения молочного и мясного скота.

2. Гормональную обработку коров-доноров проводить ФСГ-Н в дозе 40...50 мг и фоллитропином в дозе 1000... 1200 ЕД. Синхронизацию половой охоты у животных проводить простагландином в сочетании с СЖК в то время, когда у реципиентов и доноров в яичнике находится активное желтое тело.

3. Рекомендуем проводить криоконсервацию эмбрионов в этиленгликоле (1,5 М), что значительно сократит трудоемкость при пересадке их в производственных условиях.

4. Для увеличения числа потомков выдающихся животных рекомендуем использовать разработанные биотехнологические методы получения эмбрионов in vitro, микрохирургическое деление и определение пола эмбрионов. Использовать в производстве различные способы получения двоен, что позволит увеличить число потомков на 40-50%.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кыса И.С. Получение телят-двоен методом трансплантации. Бнотех-нологические исследования и перспективы их развития. 1 республиканская научная конференция. - 1990,- С. 54.

2. Кыса И.С., Всстфаль Я., Сивая H.H. Результаты развития целых и разделенных эмбрионов при культивировании. // Генетико-селекционные и технологические проблемы воспроизводства сельскохозяйственных животных. Научно-практическая конференция Киев, 1994. С. 85-86.

3. Кыса И. С., Вестфаль Я, Сивая H.H. Влияние возраста разделенных эмбрионов на их приживляемость. // Генетико-селекционные и технологические проблемы воспроизводства сельскохозяйственных животных. Научно-практическая конференция. Киев, 1994. С. 83-84.

4. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Сивая H.H. Практические результаты и перспективы использования трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. // Научные основы интенсивного развития животноводства. Международная конференция. Горки, 1995, С. 39.

5. Кыса И.С., Бабенков В.10., Вестфаль Я., Стая H.H., Бабенкова JI.B. К вопросу получения монозиготных двоен крупного рогатого скота. // Селекционно-генетические и биотехнологические проблемы разведения крупного рогатого скота 2 межгосударственная научно-практическая конференция. Брест, 1995, С. 64-66.

6. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Сивая H.H. Результаты и перспективы практического использования трансплантации эмбрионов. // Селекциогаю-генстические и биотехнологические проблемы разведения крупного рогатого скота. Брест, 1995, С. 31-33.

7. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова JI.B. Трансплантация эмбрионов у коров породы шаролле. // Селекционно-генетические и биотехнологические проблемы разведения крупного рогатого скота. 2 межгосударственная научно-практическая конференция. Брест, 1995, С. 33-35.

8. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Использование этиленгликоля при замораживании эмбрионов. // Новые методы селекции и воспроизводства высокопродуктивных пород и типов животных. Научно-производственная конференция. Киев, 1996, С. 304.

9. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Микрохирургическое разделение криокон-сервированных эмбрионов. // Новые методы селекции и воспроизводства высокопродуктивных пород и типов животных. Научно-практическая конференция. Киев, 1996, С. 305.

10. Бабенков В.Ю,, Кыса И.С., Бабенкова JI.B., Сивая H.H., Пронько ЛФ., Радкевич В.В., Вестфаль Я., Рошлау К. Сравнение двух способов крио-консервации эмбрионов крупного рогатого скота. // Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства. Международная научно-практическая конференция. Горки, 1996, С. 130-132.

11. Бабенков BIO., Кыса И.С., Сивая H.H., Бабенкова JI.B., Радкевич В.В., Вестфаль Я., Рошлау К Дисекция деконсервированных эмбрионов. // Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства. Международная научно-практическая конференция. Горки, 1996, С. 132-134.

12. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова JI.B., Сивая H.H., Пронько А.Ф., Радкевхр! В. В. Сравнение эффективности трансплантации эмбрионов различного происхождения. // Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства. Международная научно-пракгическая конференция. Горки, 1996, С. 184-185.

13. Кыса И.С., Семенов Б.Я. Слагаемые воспроизводства крупного рогатого скота Брест, 1997, 54 с.

14. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова Л.В., Сивая H.H., Вестфаль Я.

Влияние различных способов криконсервации и деконсервации эмбрионов па их жизнеспособность. Ч Использование трансплантации эмбрионов в селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных Международная научно-практическая конференция. Аскания-Нова, 1997, С. 6-7.

15. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова JLВ., Сивая H.H., Рошлау К.

Приживляемость свежеполученных и деконсервированных эмбрионов в

зависимости от породных особешюстей коров-доноров. // Использование трансплантации эмбрионов в селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных. Международная практическая конференция. Аскания-Нова, 1997, С. 38-39.

16. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова JI.B., Сивая H.H., Вестфаль Я., Рошлау К. Практическое применение метода дчеекции ранних эмбрионов. // Использование трансплантации эмбрионов в селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных. Международная научно-практическая конференция. Аскания-Нова, 1997, С. 36-37.

17. Кыса И.С. О бедной корове замолвите слово... Брестская облтнпо-графия, 1997, 107 с.

18. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова JI.B., Лущинская H.H., Радкевич В В., Рошлау К., Вестфаль Я. Эффективность трансплантации различных групп эмбрионов. // Конкурентоспособное производство продукции животноводства в Республике Беларусь. Международная научно-производственная конференция. Жодино, 1998, С- 93-94.

19. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова JI.B. Получение двоен методом трансплантации эмбрионов. // Сельскохозяйственная биотехнология. Международная научно-практическая конференция. Горки, 1998, С 255-257.

20. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Детерминация пола и стадия развития эмбрионов при трансплантации. // Конкурентноспособное производство продукции животноводства в Республике Беларусь. Международная научно-производственная конференция. Жодино, 1998, С. 79.

21. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Культивирование изолированных бласто-меров 4-8 - клеточных эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro. // Конкурентноспособное производство продукции животноводства в Республике Беларусь. Международная тучно-нроизводственная конференция. Жодино, 1998, С. 89.

22. Kyssa I. Л system of quality control of milk in the й-est Region of the Republic of Belarus. // Cattle Identification and Milk Recording in Central and Eastern European Countries. Warsaw, Poland, 1998, C. 39-42.

23. Кыса И.С. Биотехнология в селекции крупного рогатого скота. // Сборник научных трудов "Зоотехническая наука Беларуси", т. 34. С. 28-30.

24. Kyssa I. Consulting service on animal industries in Belorus on an example of the Brest region. // Tallinn, Estonia, 1999, C. 123.

25. Кыса И.С. Молочная река «Мухавец». Барановичская типография, 2000, 86 с.

/

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кыса, Иван Степанович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы исследований

3.2. ОПТИМИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕНИЯ И ПОДБОРА КОРОВ

ДОНОРОВ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ

3.2.1. Желательный тип скота и направление селекции

3.2.2. Признаки отбора коров-доноров и методы их измерения

3.2.3. Организация выращивания и раздоя первотелок

3.2.4. Получение высокопродуктивных животных и отбор потенциальных коров-доноров

3.3. СИНХРОНИЗАЦИЯ ПОЛОВОЙ ОХОТЫ У КОРОВ-ДОНОРОВ

И ТЕЛОК- РЕЦИПИЕНТОВ

3.3.1. Влияние синхронности охоты на эффективность эм бриотран сп л антации

3.3.2. Синхронизация охоты у доноров и реципиентов с использованием простагландинов в сочетании с СЖК

3.3.3. Синхронизация охоты у доноров и реципиентов с учетом дня эстрального цикла и состояния яичников

3.3.4. Влияние стресс-фактора на синхронизацию охоты у телок-реципиентов

3.3.5. Результаты синхронизации охоты различными простагландинами

3.4. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ГОРМОНАЛЬНОЙ СТИМУЛЯЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ У КОРОВ-ДОНОРОВ

3.4.1. Стимуляция суперовуляции с использованием различных доз и типов гонадотропинов

3.4.2. Суперовуляция в зависимости от породы коров-доноров

3.4.3. Результативность полиовуляции в зависимости от сезона года

3.4.4. Гормональный фон и его влияние на повышение эффективности трансплантации эмбрионов

3.4.5. Кратность и интервал между обработками

3.5. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ

3.5.1. Эффективность нехирургических методов вымывания эмбрионов

3.5.2. Морфологическая характеристика эмбрионов после их извлечения

3.6. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ

3.6.1. Влияние различных способов криоконсервирования и деконсервации эмбрионов на их сохранность

3.6.2. Влияние некоторых факторов при криоконсервировании эмбрионов на их приживляемость

3.7. ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ IN VITRO И ЭФФЕКТИВНОСТЬ

ИХ ПЕРЕСАДКИ

3.8. ПЕРЕСАДКА РАННИХ ЭМБРИОНОВ С ОПРЕДЕЛЕННЫМ

ПОЛОМ

3.9. ВЛИЯНИЕ ДИСЕКЦИИ НА ПРИЖИВЛЯЕМОСТЬ

ЭМБРИОНОВ

3.10. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ

ТЕЛЯТ-ДВОЕН

3.10.1. Пересадка одного эмбриона предварительно осемененному реципиенту

3.10.2. Пересадка двух эмбрионов одному реципиенту

3.10.3. Пересадка замороженно-оттаянных эмбрионов мясных пород телкам-реципиентам черно-пестрой породы

3.10.4. Методы получения монозиготных телят-двоен

3.11. РОСТ И РАЗВИТИЕ ТЕЛЯТ-ТРАНСПЛАНТАТОВ

3.12. ОЦЕНКА БЫКОВ-ТРАНСПЛАНТАТОВ ПО СПЕРМОПРОДУКЦИИ

4. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

ЭМБРИОНОВ

5. ОБСУЖДЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ускоренное воспроизводство высокопродуктивных племенных животных в молочном и мясном скотоводстве на основе новых биотехнологических методов"

В молочном и мясном скотоводстве различают четыре категории племенных животных: отцы быков, матери быков, отцы коров, матери коров. Поскольку интенсивность отбора, а вследствие этого и использование животных каждой категории различны, то и генетический вклад их в процесс популяции неодинаков. Теоретические расчеты и фактически полученные данные в ряде стран показывают, что улучшение популяции происходит за счет отбора отцов быков на 41.46%, матерей быков на 24.33%, отцов коров на 19.24% и матерей коров только на 6.7%. Приведенные данные свидетельствуют о том, что наибольший прогресс достигается за счет селекции отцов и матерей быков.

Согласно программе селекции разработанной БелНИИЖем и одобренной НТС Минсельхозпрода Республики Беларусь, в хозяйствах Республики Беларусь при традиционных методах разведения скота необходимо иметь 3280 быкопроизводящих коров.

При использовании биотехнологических методов их численность можно сократить в 5.7 раз. В этом случае поголовье коров составит 580 голов. Однако их качество должно соответствовать самым высоким требованиям, предъявляемым к матерям быков.

Биотехнологические методы открывают огромные возможности в разведении и воспроизведении крупного рогатого скота, как с точки зрения повышения эффективности племенной работы, так и воспроизводства скота. В области селекции биотехнологические методы обеспечивают более интенсивное размножение животных с высокой генетической ценностью, сокращают генерационный интервал, позволяют интенсировать селекцию матерей быков, являются важным фактором ускорения процесса качественного улучшения популяции сельскохозяйственных животных, обеспечивают более полное использование генетических ресурсов маточного поголовья /111, 139, 145, 180, 197/.

Трансплантация эмбрионов направлена на ускорение селекции крупного рогатого скота при создании высокопродуктивных стад, быстрое и широкое распространение редких и исчезающих пород, ускоренное создание выдающихся коров-рекордисток в целях использования их как матерей будущих быков-родоначальников линий /158,206, 210, 342/.

Две третьих быков-производителей, используемых для искусственного осеменения в странах с развитым животноводством Северной Америки и Западной Европы, получены методом трансплантации эмбриона, а на некоторых станциях искусственного осеменения, их доля достигает 70-80%.

Маточное поголовье через своих сыновей оказывает значительное влияние на крупные популяции скота. Естественным путем от коровы получают по одному теленку в год, при вероятности рождения 50% бычков. В связи с этим большое значение приобретает получение быков-производителей от меньшего числа, но более ценных в генетическом отношении коров /328/.

Генетический эффект от трансплантации эмбрионов достигается прежде всего за счет улучшения точности оценки племенной ценности матерей, на основе повышения интенсивности отбора среди матерей отцов и матерей.

При трансплантации эмбрионов для получения следующего материнского поколения можно из популяции отобрать лишь 10% лучших коров, в то время как при традиционных способах воспроизводства матерями следующего поколения является 100% коров. Сокращение доли матерей со 100% до 10% в результате использования эмбриотрансплантации возможно при условии ежегодного получения 10 телят от каждой коровы-донора. При таком отборе интенсивность селекции может усиливаться в 9 раз.

Еще более значительное ускорение темпов воспроизводства высокопродуктивных племенных животных можно получить при использовании таких биотехнологических методов как микрохирургическое деление эмбрионов, определение пола, оплодотворение ооцитов in vitro и клонирование эмбрионов /305/.

Таким образом, биотехнологические методы могут быть использованы:

- для ускоренного создания высокопродуктивных селекционных стад;

- для ускоренного создания выдающихся семейств коров-рекордисток в целях использования их как будущих матерей быков-родоначальников линий;

- для интенсивного размножения семейств или линий путем пересадки эмбрионов определенного пола;

- для увеличения выхода телят путем пересадки двух эмбрионов, с целью получения двоен;

- для получения идентичных двоен;

- для сохранения и быстрого распространения редких и исчезающих пород;

- для создания банка эмбрионов и накопления генетического материала с последующей пересадкой.

При интенсивном использовании коров, ежегодно до 30% животных выбывает из основного стада по целому ряду причин. Среди этих коров находятся очень ценные животные. Метод трансплантации эмбрионов и в этом случае может дать неоценимую пользу, так как позволяет от таких генетически ценных животных дополнительно получать высокоценных потомков. При использовании таких коров до 4.5 раз в год, можно иметь не менее 10. 12 телят.

Даже при такой сравнительно небольшой интенсивности использования выдающейся по продуктивности коровы в качестве донора эмбрионов, всего лишь за 2 года от нее можно заложить высокоценное семейство и иметь достаточное количество племенных быков.

Несложные расчеты показывают, что, отобрав 50 коров, в прошлом рекордисток стада, и используя их в течении нескольких лет, только в качестве доноров, можно ежегодно от каждой получать минимум 16 полноценных эмбрионов и при приживляемости 50% от этой группы коров, можно иметь 180 телочек и 180 быков в год.

Таким образом, за очень короткий период времени от 50 рекордисток можно создать высокопродуктивное селекционное молочное стадо численностью 360-540 коров. При этом госплемпредприятие (элевер) может быть пополнено таким же количеством высокоценных, в племенном отношении, ремонтных бычков.

В последние годы в мировой практике и в науке, биотехнологии уделяется много внимания как одному из фундаментальных биологических методов исследования воспроизводительных функций у животных. Животные, полученные биотехнологическим путем и имеющие общую наследственность представляют исключительную ценность и позволяют более точно анализировать проблемы физиологии, биохимии, генетики, иммунологии, воспроизводства, изучать влияние генетических кормовых факторов на эмбриональное развитие зародыша, определить причины гибели эмбрионов в предимпланта-ционный и имплантационный периоды.

Использование в животноводстве метода получения идентичных и разнояйцевых близнецов позволяет повысить выход потомства, дает возможность максимально использовать ценных коров-доноров, решает задачу точной оценки быков-производителей по качеству потомства, снижает себестоимость метода трансплантации эмбрионов.

Получение животных желательного пола является важной проблемой и имеет большое практическое значение. Это особенно важно для молочного скота, где главный признак - молочная продуктивность - относится к признакам, ограниченным полом и проявляется лишь у коров. Поэтому возникает задача регулирования соотношения полов.

Усилия исследователей направлены на определение пола эмбриона в возрасте 6-8 дней развития с помощью цитологических и иммуногенетиче-ских методов. С помощью этих методов определение пола возможно с точностью до 95%.

Особый интерес вызывает повышение темпов селекции за счет извлечения из яичников ооцитов, их культивирование и оплодотворение вне организма (in vitro). Ограниченное использование огромного резерва ооцитов сдерживает широкое применение трансплантации эмбрионов. В последние годы этот метод в ряде стран развивается очень интенсивно. Сегодня разработаны специальные инструменты и оборудование, позволяющие при жизни у коровы извлекать ооциты из яичников еженедельно, даже при первой половине стельности. Метод достиг такого уровня развития, что позволяет получать ооциты и после оплодотворения культивировать до поздней бластоци-сты, которые успешно могут быть пересажены или заморожены.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Кыса, Иван Степанович

ВЫВОДЫ

1. Исследования выявили преимущество применения простагландина в сочетании с СЖК на 16,2% и увеличение приживляемости эмбрионов до 81,2% при точности синхронизации охоты донора и реципиента. В то время как отклонение на день раньше снижает этот покозатель до 70,0%, а на день позже до 55,9%. Применение эстрофана и анипроста повышает количество животных пришедших в охоту по сравнении с эстуфаланом на 15,9 и 17,9%, а уровень стельности соответственно на 21,2 и 26,1 %.

2. Установленно, что стресс у животных, вызванный транспортировкой их накануне предполагаемой охоты оказывает неблагоприятное влияние на функциональную активность яичников. При этом число животных, пришедших в охоту, снижается с 90,7% до 70,0%; а количество животных без функционального желтого тела увеличивается с 21,9% до 31,8%.

3. Установлено, что уменьшение доз гонадотропинов на 15.20% не влияет на эффективность стимуляции множественной овуляции. Количество реагирующих животных колебалось от 81,8 до 94,3%. Овулирующая реакция яичников была наиболее высокой в группах, где использовались ФСГ-п и фоллитропин - 12,2 и 11,2 желтых тела на донора, соответственно.

В группе доноров герефордской породы отмечен наиболее высокий уровень полиовуляции по сравнению с черно-пестрой и абердин-ангусской: среднее число овуляций составило 11,8, выход эмбрионов - 10,2, в т.ч. нормальных 6,9 против 9,6; 7,2; 4,6 и 10,1; 7,3 и 4,3, соответственно.

4. Наиболее объективной оценкой функциональной активности желтого тела является уровень прогестерона и эстродиола в крови животного. Установлено, что в случае, когда в крови доноров перед обработкой содержалось менее 1,0 нг/мл прогестерона ни один донор не среагировал суперовуляцией. Выход качественных эмбрионов был наиболее высоким и стабильным при уровне прогестерона в крови 2,8.2,9 нг/мл, а уровень эстрадиола 19,0.21,0 пг/мл.

5. Установлено, что количество гормональных обработок практически не влияет на количество доноров реагирующих на стимуляцию полиовуляции. В среднем этот показатель колебался на уровне 80,0.91,1%. Не отмечено существенных различий по числу овуляций (7,4. 11,1). Число извлеченных зародышей уменьшалось уже после третьей обработки. Выход полноценных эмбрионов снизился с 6,8 (3-я обработка) до 1,8 (7-я обработка), а оп-лодотворяемость с 94,4.98,8%» до 64,3%.

6. В процессе криоконсервации установлено, что наиболее высокую сохранность показали эмбрионы отличного и хорошего качества на стадии ранней бластоцисты в присутствии 1.0 М сахарозы. Выживаемость зародышей находилась на уровне 95,0. 100%.

7. Криоконсервация эмбрионов достоверно снижает приживляемость эмбрионов с 69,8 до 55,9% при использовании глицерина и до 57,8% при использовании этиленгликоля. В целом не установлено различий в эффективности использования в качестве криопротекторов этиленгликоля и глицерина. Приживляемость эмбрионов составила 57,8 и 55,9%, соответственно. Однако приживляемость бластоцист отличного качества на 12,8% выше при замораживании в этиленгликоле по сравнению с глицерином.

8. По итогам исследований установлена достаточно высокая эффективность получения эмбрионов вне организма. При получении ооцитов из яичников доставленных с мясокомбината после убоя животного, выход жизнеспособных эмбрионов составил 34,3% при использовании трансцирвикальной аспирации 36,1%; уровень стельности 44,9 и 47,4%, соответственно. По замо-роженно-оттаянным эмбрионам этот показатель составил 41,6% и 42,3%, соответственно.

9. Биопсия клеток при определении пола ранних эмбрионов не оказывает достоверного влияния на дальнейшую жизнеспособность зародышей, уровень приживляемости которых составляет 55,6 против 53,0% у контроля.

10. Наиболее пригодными для деления являются ранние и поздние бла-стоцисты, уровень приживляемости половинок которых составил 41,7 и 45,0%, соответственно, против 38,9% при делении поздних морул.

11. При получении двоен путем пересадки эмбриона предварительно осемененному реципиенту наиболее оптимальным вариантом является трансплантация зародыша молодым коровам в возрасте 4-х лет на второй лактации. При этом оплодотворяемость составляет 81,3%, стельность двойнями 61,5%. При получении двоен путем пересадки двух эмбрионов наиболее высокие результаты получены при пересадке по одному эмбриону в каждый рог матки. При этом зародыши должны находиться на одной стадии развития. Уровень стельности в таком случае на уровне 71,4.80,0%, в т.ч. двойней 50%.

12. Пересадка половинок эмбрионов с целью получения двойневых отелов позволяет получить дополнительно до 40% телят по сравнению с персад-кой целых зародышей.

13. Анализ динамики живой массы двоен показал, что они уступают по этому показателю телятам-одинцам (телочки на 6,0 кг, бычки на 10,0 кг), однако к 12-месячному возрасту эти показатели выравниваются. По показателям собственной продуктивности и оплодотворяющей способности достоверной разницы между группами быков-трансплантатов и их сверстсниками не установлено.

228

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Разработанные способы ускоренного воспроизводства высокопродуктивных племенных животных рекомендуем для использования в практике разведения молочного и мясного скота.

2. Гормональную обработку коров-доноров проводить ФСГ-П в дозе 40.50 мг и фоллитропином в дозе 1000. 1200 ЕД. Синхронизацию половой охоты у животных проводить простагландином в сочетании с СЖК в то время, когда у реципиентов и доноров в яичнике находится активное желтое тело.

3. Рекомендуем проводить криоконсервацию эмбрионов в этиленгликоле (1,5 М), что значительно сократит трудоемкость при пересадке их в производственных условиях.

4. Для увеличения числа потомков выдающихся животных рекомендуем использовать разработанные биотехнологические методы получения эмбрионов in vitro, микрохирургическое деление и определение пола эмбрионов. Использовать в производстве различные способы получения двоен, что позволит увеличить число потомков на 40-50%.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кыса, Иван Степанович, Дубровицы

1. Амарбаев A.M., Шихов И.Я., Аббасов Б.Х. Дальняя транспортировка эмбрионов коров и их межпородная пересадка. Вестник с.-х. науки Казахстана. 1982, №8, С. 62-63.

2. Андалюкевич В.В. Эффективность использования животных британо-фризской породы в селекции черно-пестрого скота: Авт. дис. канд. с.-х. наук.//Жодино, 1992. 113 с.

3. А. с. 897 274. Устройство для пересадки эмбрионов у крупного рогатого скота / О.Я. Черных, М.И. Прокофьев, В.М. Петрунина, Г.П. Маленко, В.П. Кононов (СССР). Бюл. N2 /. Открытия. Изобретения. 1982. -N2. С. 18.

4. Байтлесов Е.У. Криоконсервирование к морфологическая оценка эмбрионов коров мясного скота // Автореф. дкс. канд. биол. наук. Дубровицы, 1992.-24 с.

5. Бахитов К.И., Плешкина К.И. Эндокринный контроль полиовуляций у крупного рогатого скота. // Нейроэндокринная регуляция воспроизводства и продуктивности сельскохозяйственных животных. Боровск, 1983. - Т. 27.-С. 12-20.

6. Бекиш Ф.В. Селекционно-генетическая оценка быков белорусской популяции черно-пестрого скота и пути повышения эффективности их использования: Автореф. дис. канд. с.-х. наук. Жодино - 1995. - 18 с.

7. Березовой A.C., Кравченко Д.Н., Березовая Л.Г. Изучение роста и развития телят-близнецов // Животноводство. 1983. - № 10. - С. 19-20.

8. Биккулов A.C., Сейдалитов С.С., Коваленко Т.П. и др. Нехирургическая трансплантция эмбрионов крупного рогатого скота в условиях молочного комплекса. Сельскохозяйственная биология, 1983, № 10. С. 51-54.

9. Бич А.И. Повышение генетического потенциала молочной продуктивности черно-пестрого скота в СССР // Бюллетень ВНИИРГЖ. Л., 1986. - В. 87. -С. 3-9.

10. Бич А.И., Сакса Е.И. Создание новых высокопродуктивных заводских типов черно-пестрого скота // Создание новых пород сельскохозяйственных животных: Сб. тр. / Всесоюз. акад. с.-х. наук им. В.И. Ленина. М.: Агро-промиздат, 1987. - С. 22-30.

11. Борисова Т.Ф. Хозяйственно-полезные признаки черно-пестрой и гол-штинской пород разных генотипов. // Эффективность использования гол-штинского скота. -М., 1986. С. 81-89.

12. Бугров А.Д. Организация пунктов по трансплантации эмбрионов // Живот-новодсво, 1987. № 6. - С. 54-55.

13. Бугров А., Коркин В. Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. Тез. докл. Тарту, 1986.-С. 7-8.

14. Бугров А.Д., Невинный H.A. Приживляемость эмбрионов в зависимости от качества желтого тела реципиента // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. Тезес. докл. Жодино. 1989. С. 101-102.

15. Букарова В., Плаксеев А., Ефремова Н. Глубокое замораживание эмбрионов крупного рогатого скота и овец // Сб. науч. тр. Т. 44. Дубровицы, 1983. - С. 59-62.

16. Букаров И.В. Оценка качества зародышей крупного рогатого скота в связи с трансплантацией // Матер. Рес. конф., "^арту. 1986. С. 184-182.

17. Вильсон В., Зуев Н. Синхронизация охоты у коров и телок // Животноводство, 1984.-№ 5.-С. 40-41.

18. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. // М. Наука, 1972. 102 с.

19. Влияние простагландинов на воспроизводственную функцию крупного рогатого скота / Дьяконов Е.В., Горячев В.В., Щелова H.H., Булгаков Р.И. // Эндокринология и трансплантация зигот сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1982.-С. 164-167.

20. Воронцова М., Тарадайник Т., Дронин А. Опыт трансплантации эмбрионов // Молочное и мясное скотоводство. 1988. - № 3. - С, 19-20.

21. Вызывание суперовуляции у крупного рогатого скота с целью получения зародышей для трансплантации // Прокофьев М.И., Рябых В.П., Бахитов К.И., и др. // Эндокринология и трансплантация зигот сельскохозяйственных животных, М.: Колос, 1982. С. 42-53.

22. Голубец JI.B., Будевич А.И. Содержание гормонов в крови коров-доноров при вызывании суперовуляции. // Актуальные проблемы развития АПК, Горки, 1990.-С. 146.

23. Гор дон А. Контроль воспроизводства сельскохозяйственных животных. Москва В.О. "Агропромиздат", 1989.-415 с.

24. Гормоносинтезирующая способность желез внутренней секреции у коров-доноров при вызывании полиовуляции. / Челецкий М.И., Шаловило С.Г., Шаран Н.И. и др. // Тез. докл. начн.-произв. конф. Львов. 1988. - С. 9899.

25. Григорьева Т.Е., Рыжов Б.В., Кононов Г.А. Суперовуляторная реакция яичников у коров и телок на введение гормональных препаратов: Сб. на-учн. тр., Ленингр., 1979. № 55. - С. 21-24.

26. Гринь М.П. Состояние и направление племенной работы в молочном скотоводстве Белоруссии. // Совершенствование пород и создание высокопродуктивных стад сельскохозяйственных животных. Жодино, 1983. - С. 311.

27. ЗГГузеватый O.E. Созревание и оплодотворение in vitro ооцитов коров в фолликулярной жидкости // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота/Тез. докл. Жодино, 1989.-С. 89-91.

28. Гуляева А.Я. Хозяйственно-полезные признаки помесей в зависимости от их генотипа. // Разведение, кормление, технология содержания и продуктивность жвачных животных в условиях Западной Сибири. Омск, 1988. -С. 4-8.

29. Даровских В.Е., Сергеев Н.И. Суперовуляция и оплодотворяемость яйцеклеток у крупного рогатого скота в зависимости от серии гонадотропина

30. СЖК) // Архив эксперим. Вет. и медицины. Лейпциг, 1982. 36. - № 1. -С.71-75.

31. Дмитриев В.Б. Применение эндокринологических методов в зоотехнии // Животноводство. 1985. -№ 5. С. 22-24.

32. Дозревание ооцитов в гомологичной фолликулярной жидкости / Голубев А., Забелин Н., Кузьмина Т., Шагахметова Г. // Актуальные проблемы биологии в животноводстве. Тез. докл. Боровск, 1995. - С. 176.

33. Довгопол В., Игнатенко В. Сравнительная оценка эффективности инструментов для нехирургического извлечения эмбрионов у коров красной степной породы // Тез. докл., Харьков, 1988. С. 66.

34. Дронин А.П., Смыслова H.H. Сравнение двух способов гормонального вызывания суперовуляции у коров-доноров. // Труды ВИЖа. Применение метода трансплантации эмбрионов в селекции сельскохозяйственных животных, Дубровицы, 1988. С. 21-23.

35. Дыбан А.П., Сокирина Т.Г. Изучение доимплантационного развития однояйцевых близнецов. Опыты на зародышах мышей // Отногенез, 1981. Т. 12,-№2.-С. 130-139.

36. Захарова В.В. Хозяйственно-полезные призанки черно-пестрого рогатого скота различного происхождения в условиях Западной Сибири: Автореф. дис. канд. с.-х. наук. Новосибирск, 1990. - 23 с.

37. Зверева Г.В., Хомин С.П., Осыскеев В.К. Физиологические аспекты воспроизводительной функции высокопродуктивных коров. // Республиканская научная конференция. Институт Лесостепи и Полесья. / Тезисы докладов /21-22 сентября, Харьков, 1988. С. 69.

38. Ибрагимов Ю. Факторы влияющие на эффективность гормонального вызывания суперовуляции, качество и приживляемость эмбрионов при трансплантации. // Тез. докл., Жодино, 1989. С. 47.

39. Извлечение и пересадка зародышей у крупного рогатого скота нехирургическим способом. В.Г. Белевич, М.И. Прокофьев, В.Я. Черных и др. // Эндокринология и трансплантация сельскохозяйственных животных, М. 1982. -С. 53-71.

40. Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. / Н.И. Сергеев, В.Л. Мадисон, O.K. Смирнов. М. 1984. С. 13-16.

41. Инструкции по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Рос-агрпром СССР, ВАСХНИЛ, Москва, 1987. 96 с.

42. Кабира Культивирование и оплодотворение яйцеклеток in vitro. // Повышение эффективности продуктивных и племенных качеств сельскохозяйс-венных животных. Ленинград, Сборник научных трудов., 1990. - С. 1721.

43. Каганская В.В., Свиридов Б.Е. Культивирование ооцитов коров с фолликулярными клетками. // Проблемы развития биотехнологии в животноводстве. Тезисы докладов, Дубровицы, 1990. - С. 14

44. Калашников А.П. Кормление и содержание молочного скота в летний период. //Молочное и мясное скотоводство. 1989. № 3. - С. 36-41.

45. Карпич А.Г. Хозяйственные и биологические особенности черно-пестрого скота различной кровности по голштинской породе: Автореф. дис. канд. с,-х. наук. Пушкин, 1986. - 21с.

46. Квасницкий A.B., Мартыненко H.A., Близнюченко А.Г. / Трансплантация эмбрионов и генетическая инженерия в животноводстве. К.: 1988. - 264 с.

47. Квасницкий A.B. Новое в физиологии размножения животных. Москва, 1950.-С. 104.

48. Кива М.С. Продуктивность коров, приносящих двойни и влияние на нее двойневых отелов // Научн. Тр. УСХА. 1976. - вып. 157. - С. 113-115.

49. Кива М.М. О характере взаимосвязи между молочной продуктивностью и двойневостью симентальской и красной степной пород. // Научн. тр. УСХА. 1980. - вып. 250. - С. 52-56.

50. Кива М.С. Многоплодие коров, его параметры биологические особенности и хозяйственное значение // Пути увеличения производства и улучшения качества продукции земледелия и животноводства Белая Церковь. -1980.-С. 98-100.

51. К изучение уровня полиовуляции и качества эмбрионов при применении ФСГ -Пи фоллигона / Ахмедов Н.М., Эюбов И.З., Керимов Т.А. и др. // Изв. АН УзССР. Сер. биол. н. 1986. - № 6. - С. 42-46.

52. Кирилова Н.И., Лебедев В.И., Бабенков В.Ю. Влияние кратности суперовуляции коров-доноров на качество эмбрионов // Животноводство. 1986. -№10.-С. 45.

53. Клецко Н.Г., Мадич A.B. основы микроманипуляции с эмбрионами животных. // Бюл. научных работ ВИЖа, 1988. вып. 89 - С. 44-48.

54. Клецко Н.Г. Разделение эмбрионов и пересадка ядер как метод клонирования эмбрионов крупного рогатого скота. // Бюл. научных работ ВИЖа, 1988.-вып. 89. С. 48-52.

55. Клецко Н.Г., Волынчук В.Ф., Методические подходы к клонированию эмбрионов млекопитающих // Бюл. научных работ ВИЖа. 1982. - вып. 65. -С.22-23.

56. Клинский Ю.Д. Биотехника воспроизводства стада на крупных фермах и комплексах. // Животноводство, 1984. № 7. - С. 24.

57. Кпинский Ю.Д., Башкеев Е.Д., Даровских В.Е. Методы гормональной регуляции воспроизведения с.-х. животных при промышленной технологии // Гормоны в животноводстве: Об. наун. тр. М., 1977. С. 112-125.

58. Клинский Ю.Д., Истомина Л.А, Шихов И .Я. Оплодотворение ооцитов млекопитающих вне организма. / Сельское хозяйство за рубежом, 1984. -№ 3. С. 49-53.

59. Коновалов Н.Г., Сергеев Н.И., Шихов И.Я. Разработка методов подготовки доноров и реципиентов к трансплантации зародышей у крупного рогатого скота // Гормоны в животноводстве: Бюл. науч. работ. Дубровицы, 1981. -Вып. 64. С. 36-42.

60. Константинов A.B. Цитогенетика. // Мн., "Вышэйшая школа", 1971. 296 с.

61. Красовская О.В. Трансплантация яйца кролика в матку другого животного // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1936. Т. 15. - № 2. - С. 326-329.

62. Кузьмина Т.Н., Завертяев Б.П., Шагаме-това Г.А. Перспективы использования тканевой культуры фолликулов для созревания ооцитов коров вне организма. // Проблемы развития биотехнологии в животноводстве. Тезисы докладов, Дубровицы, 1990 - С. 22-24.

63. Курыкин Е. Эффективность различных технологий вымывания эмбрионов // использование метода трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота: Тез. докл., Сигулда, 1988. С. 4-6

64. Кыса И.С. Получение двоен методом пересадки половинок эмбрионов. Информационный бюллетень. Брест, 1989. № 46-89 - 4 с.

65. Кыса И.С. Применение метода трансплантации эмбрионов в программе разведения высокопродуктивных животных в племазводе "Луч" Брестской области Информационный бюллетень. Брест, 1989. - № 19-89 - 4 с.

66. Кыса И.С. Влияние стрессов на синхронизацию охоты и приживляемость эмбрионов, информационный бюллетень. Брест, 1989. -№ 20-89 4 с.

67. Кыса И.С., Вестфаль Н., Сивая H.H. Результаты развития целых и разделенных эмбрионов при культивировании. // Матер1али науково-практично! конференций "Генетико-селекцшш та технолопчш проблеми вщтворення сшьскогосподарьских тварин. Кит, 1994. С. 85-86.

68. Кыса И.С. О бедной корове замолвите слово. Брест, 1997. - 106 с.

69. Кыса И.С., Вестфаль Н., Сивая H.H. Влияние возраста разделенных эмбрионов на их приживляемость. // Матер1али науково-практично! конференцп "Генетико-селекцшш та технолопчш проблеми вщтворення сшьскогосподарьских тварин. Кшв, 1994. С. 85-86.

70. Кыса И.С., Семенов Б.Я. Слагаемое воспроизводства крупного рогатого скота. Брест, 1997. 54 с.

71. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова JI.B. Получение двоен методом трансплантации эмбрионов. // Материалы Международной научно-практической конференции "Сельскохозяйственная биотехнология". Горки, 1998.-С. 255-257.

72. Лебедев В.П., Ибрагимов Ю., Шейкин И.В. Гормональное вызывание суперовуляции у коров доноров разными препаратами // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. Тез. докл. Жодино, 1989. - С. 69-70.

73. Лешкевич А. А. Прогнозирование эффективности трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота. Автореф. дисс. на соиск. ученой степени канд. с.-х. наук. - Жодино, 1993. - 24 с.

74. Лопырин А.И., Лошнова Н.В., Карпов П.Я. Опыт межпородной пересадки зародышей // Сельская зоотехния, 1950. № 8. - С. 50-64.

75. Лубош Г. Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота в производственных условиях. // Международный сельскохозяйственный журнал, 1987.-Xs 14.-С. 82-85.

76. Мадисон В.В., Мадисон В.Л. Трансплантация эмбрионов в практике разведения молочного скота. М.: Агропромиздат, 1988. - С. 128.

77. Мадисон В.В. Применение трансплантации эмбрионов в госплемзаводе "Заря коммунизма" // Труды ВИЖа. Применение метода трансплантации эмбрионов в селекции сельскохозяйственных животных. Дубровицы, 1988. -С. 57-60.

78. Мадисон В.Л., Гавриков A.M., Сальникова И.М. Выбракованные коровы-доноры эмбрионов // Животноводство. 1986. № 5. - С. 48.

79. Мадисон В.В. Опыт организации работ по трансплантации эмбрионов в условиях хозяйств. // Бюл. науч. работ, вып. 87. Дубровицы, 1987. - С. 5759.

80. Мадисон В.Л., Сальников И.М., Тарасюк Н.И. Результаты криоконсерви-рования, дальней транспортировки и пересадки замороженно-оттаянных эмбрионов крупного рогатого скота. // Бюл. научн. работ, вып . 87. Дубровицы, 1987.-С. 47-49.

81. Мальцева M.B. Криоконсервирование эмбрионов в паеттах с применением сахарозы // Животнодство. 1989. - № 7 - С. 41.

82. Мазепкин С.А., Федюпжин А.Ф., Сукачева Л.П. Замораживание эмбрионов крупного рогатого скота. // Проблемы развития биотехнологии в животноводстве. Тез. докл. Всесоюзн. научн.-техн. совещ. Дубровицы, 1990. -С. 59-60

83. Медведев Г.Ф. Факторы, влияющие на стельность коров и телок в синхронизированный половой цикл // Животноводство, 1985. № 6. - С. 7-8.

84. Методические рекомендации по гормональному вызыванию полиовуляции у крупного рогатого скота / Н.И. Сергеев, A.A. Некрасов, A.B. Овчинников, Н.И. Смыслова Дубровицы, 1983. - 19 с.

85. Методические указания по использованию французской технологии трансплантации эмбрионов / Н.З. Жильцов, П.П. Кундышев и др. М., 1986. -С. 2.

86. Методические рекомендации по гормональному вызыванию полиовуляции у крупного рогатого скота / Сергеев H.H., Дронин A.M., Смыслов Н.И., Мальцева И.В. Дубровицы, 1987. - 19 с.

87. Методические рекомендации по криоконсервированию эмбрионов крупного рогатого скота, овец и кроликов // Подгот Сергеев Н.И. Нетеча В.И., Мазепкин С Л. - 1987 - 23 с.

88. Методические рекомендации по гормональному вызыванию суперовуляции у коров-доноров при трансплантации эмбрионов. / Сергеев Н.И., Дронин А.П., Смыслова Н.И., Мальцева Н.В. // Дубровицы, 1988. 22 с.

89. Методические рекомендации по использованию технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота в племенных хозяйствах. Решетникова Н.М., Малиновская В.А., Малиновский A.M., Мороз Т.А. и др. А.: 1988.-21 с.

90. Методические рекомендации по гормональному вызыванию суперовуляции у коров-доноров при трансплантации эмбрионов. Сергеев Н.И., Дронин А.П., Смыслова Н. И., Мальцева И.В. - Дубровицы, 1991. - 128 с.

91. Методические рекомендации по изготовлению и применению микроинструментов для микроманипулирования с эмбрионами млекопитающих и Никитин В.А., Гольдман ИД., Клецко Н.Г., Волынчук В.Ф. ВИЖ. - М., 1980.-24 с.

92. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. -М.: Сельхозиздат, 1962. С. 169-595.

93. Многократное использование коров-доноров для извлечения эмбрионов. // Соловский Н.С., Слипченко С.Н., Лапина М.Н., Витол В.А. // Проблемы развития биотехнологии в животноводстве. Тез. докл., Дубровицы, 1990. -С. 72-73.

94. Мороз Т.А. Влияние биологически активных веществ на эмбриональную выживаемость у животных. // Труды конференции молодых ученых ЛСХИ, 1986. / Ленинград, 1987. С. 264-265.

95. Мюйрсепп П., Хинт Р. Причины низкого количества и качества эмбрионов при суперовуляции // Трансплантация эмбрионов у крупного рогатого скота: Тез. докл. Таллин, 1986. - С. 20-21.

96. Набока И.П. Селекция как фактор интенсификации молочного скотоводства. // Тр. ЛСХА. 1988. - В. 245. - С. 26-32.

97. Научные проблемы и пути внедрения тарнсплантации эмбрионов крупного рогатого скота / O.K. Смирнов,JO.Д. Клинский, Н.И. Сергеев и др. // Вестник с.-х. Науки, 1980.-№ 11.- С. 73-83.

98. Нежданов А.Г., Соловьев H.A. Гормональная функция яичников в течении полового цикла // Ветеринария. 1986. № 4. - С. 56-58.

99. Некрасов A.A., Смирнов А.О., Новгородов А.Н. Уровень полиовуляции и качество эмбрионов в зависимости от гонадотропина // Трансплантация эмбрионов в молочном скотоводстве и овцеводстве. Дубровицы, 1985. С. 10-12.

100. Немилов A.B. Гистология и эмбриология домашних животных М.: Сель-хозгиз. 1934.-С. 27-30.

101. Нетеча В.И. Современная технология криоконсервирования эмбрионов // Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. / Сб. научн. тр.-М:, 1988.-С.81.

102. Никитин В.А. Техника изготовления микроинструментов для исследований клеток под микроскопом. -Пущино, 1986. 123 с.

103. Никитченко H.H., Плященко С.И., Зеньков A.C. Адаптация, стрессы и продуктивность сельскохозяйственных животных. Мн.: Ураджай. - 1988.-200 с.

104. Никоян П.Е. Хориогонин, рилизинг-гормон и овуляция у коров и тёлок // Ветеринария. 1981.-№ 10.-С. 47-48.

105. Овчинников A.B. Уровень полиовуляции у коров-доноров в зависимости от размера яичников и состояния желтого тела // Эндокринология и трансплантация зародышей сельскохозяйственных животных. Дубровицы, 1983. -С. 74-78.

106. Овчинников A.B. Результаты нехирургической трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота Трансплантация эмбрионов в молочном скотоводстве и овцеводстве. Дубровицы, 1985. С. 25-28.

107. Овчинников A.B., Смыслова Н.И. уровень суперовуляции и качество эмбрионов при применении ФСГ-П, ГСЖК маротропина и фоллигона // Трансплантация эмбрионов в молочном скотоводстве и овцеводстве. Дубровицы, 1985. - С. 16-18.

108. Павлов В.А. Физиология воспроизводства крупного рогатого скота. М.: Россельхозиздат, 1984. С. 208.

109. Панов Б.J1.Использование быков голштинской породы для улучшения популяции черно-пестрого скота в Кемеровской области. // Разведение жвачных животных в Сибири. 1988. - С. 13-17.

110. Пацевичюте В. Геналогия, продуктивность и качесвто молока черно-пестрого скота ФРГ. // Тр. Лит. Ветакадемии и Лит.НИИ ветеринарии. 1987.-6 с.

111. Пелехатый Н., Савчук И., Синаженский Э. Продуктивные качества молока черно-пестрого скота разного происхождения. // Молочное и мясное скотоводство. 1990. - № 3 - С. 30-31.

112. Передера К.Б. суперовуляция и получение эмбрионов от разных пород круного рогатого скота // Научно-технический бюл. НИИ животноводства Лесостепи и Полесья УССР. 1982. № 35. - С. 56-59.

113. Плященко С.И., Сидоров В.Т. Естественная резистентность организма животных. Ленинград, Колас, 1979. - 182 с.

114. Плященко С.И., Сидоров В.Т. Стрессы у сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат, 1987. - 190 с.

115. Плященко С.И., Сидоров В.Т., Трофимов А.Ф. / Получение и выращивание здоровых телят. -Мн.: Ураджай, 1990. 193 с.

116. Погодаев С.Ф., Гречко Ю.Ф. Удой коров разных типов голштинизиро-ванной черно-пестрой породы. // Зоотехния, 1992. -№11-12.-С. 7-10.

117. Поляков П.Е., Иванова Н.И. Основные направления совершенствования пород молочного скота: Обзор. М., 1985. - 50 с.

118. Прозора К.И., Таравский С.С., Соколова Г.А. Комплексная оценка животных различных генотипов по голштинской породе. // В кн.: Селекция молочного скота и промышленные технологии. М.: Агропромиздат, 1992. -С. 55-59.

119. Прокофьев М.И. Поулчения высокопродуктивных коров методом трансплантации эмбрионов // Выведение коров для молочных комплексов. М.: Колос, 1981.-С. 209-226.

120. Прокофьев М.И. Регуляция размножения сельскохозяйственных животных. Л.: Наука. 1983. С. 98-99.

121. Прохоренко П.Н., Логинов Ж.Г. Голштино-фризская порода скота. Л.: Агропромиздат, 1986.-238с.

122. Рэфф Р., Кофмен Т. Эмбрионы, гены и эволюция: Пер. с англ. М.: Мир, 1986.-404 с.

123. Савельев В.И., Акулич Л.И. Влияние голштино-фризских быков на хозяйственно-полезные признаки коров черно-пестрой породы. // Интенсификация производства молока и говыдины: Сб. науч. тр. Горки, 1985. - В. 130.-С. 50-53.

124. Самарютель Я.Ю. Зависимость количества и качества эмбрионов от сроков использования коров в качестве доноров после отела. // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. / Тез. докл. Жодино, 1989. - С. 78.

125. Самоделкин А.Г., Гавриков А.М., Сергеев Н.^.Й/ Трансплантация эмбрионов в мясном скотоводстве. -М.: АОЗТ "Зоосалон", 1996. С. 15-18.

126. Самоделкин А.Г. Герефорды агрофирмы "Толмачева", экологическая биотехнология их содержания и воспроизводства" М.: "Идеал", 1998. 45 с.

127. Сергеев Н.И., Клинский Ю.Д. Результаты трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота в СССР // Архив экспериментальной ветеринарии и медицины. Лейпциг, 1982. 36. № 1. - С. 55-60.

128. Сергеев Н.И. Хирургическая техника и результаты получения и пересадки эмбрионов крупного рогатого скота // Архив экспериментальной ветеринарии и медицины. Лейпциг, 1982. 36. -№ 1. С. 71-75.

129. Сергеев Н.И. Получение двоен путем трансплантации эмбрионов осемененным коровам-реципиентам // Докл. ВАСХНИЛ. 1986. № 4. - С. 26-28.

130. Сергеев Н.И., Шихов И.Я. Эффективность гормонального вызывания овуляции у коров и телок-доноров в зависимости от сезона года // Животноводство, 1983. -№ 12. С. 53.

131. Сергеев Н.И., Мадисон В. Использование метода трансплантации в животноводстве // Международный сельскохозяйственный журнал. 1985. № 6.-С. 6.

132. Сергеев Н.И., Гавриков A.M. Симпозиум по трансплантации // Животноводство. 1986.-№ 4. С. 62.

133. Сергеев Н.И., Шихов И.Я. Рождение двоен при трансплантации двух эмбрионов. // Докл. ВАСХНИЛ. 1980. -№ 12. С. 24-26.

134. Сергеев Н.И., Лиепа Л.П., Гредзепе. Трансплантация крупного рогатого скота в колхозе "Ревите" Латвийская ССР. // Ветеринария, 1986. С. 15-16.

135. Сергеев Н.И., Некрасов A.A., Смыслова. Эндокринные аспекты механизма "Материнского опознания беременности" в связи с приживляемо-стью эмбрионов при трансплантации // Сельскохоз. биол. 1986. - № 13. -С. 11-18.

136. Сергеев Н.И., Смыслова Н.И., Смирнов O.A. Влияние некоторых факторов на уровень суперовуляции и качество эмбрионов у коров-доноров. // Биотехнология в животноводстве. Дубровицы, 1987. - С. 38-40.

137. Сергеев Н.И., Амарбаев А. В.М. Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. - Алма-Ата, Кайнар, 1987.-158 с.

138. Сергеев Н.И., Мадисон В.Л., Лебедев В.И. Методические рекомендации по многократному использованию коров в качестве доноров при трансплантации. Дубровицы, 1988. - 13 с.

139. Смирнов O.K., Сергеев Н.И. Состояние и перспективы исследований по трансплантации эмбрионов в молочном м мясном скотоводстве и освце-водстве. Дубровицы, 1985. - С. 3-6.

140. Смыслова Н.И. Результаты суперовуляции у коров-доноров в зависимости от исходного гормонального фона. // Трансплантация эмбрионов у крупного рогатого скота: Тез.докл., Таллин, 1986. - С. 18-20.

141. Смыслова Н И., Ефремова M. Н., Петряков Ю.Н. Приживляемость эмбрионов в зависимости от гормонального профиля крови телок-реципиентов. // Биотехнология в животноводстве. Бюл. научн. работ, вып. 87. Дубровицы, 1987. - С. 38-40.

142. Смыслова Н.И., Бушманов В. Влияние некоторых факторов на жизнеспособность замороженно-оттаянных эмбрионов // Бюл. научн. работ, вып. 104. ВИЖ, 1988.-№ 89. С. 26-28.

143. Соколовская И.И. Пересадка зигот ,7 Проблемы оплодотворения с.-х. животных. М., 1957. С. 220-229.

144. Спрингович H. Н., Стурутис З.К. Анализ содержания простегерона в крови доноров и реципиентов. // Использование метода трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Тез. докл. Сигулда, 1988. С. 18-20.

145. Стрекозов Н.И., Чернушенко В.К., Цысь В.И. Интенсификация молочного скотоводства России / Смоленск, 1997. С. 134-137.

146. Тарасенко Н.В., Крохин В.А. Однократное использование коров для получения эмбрионов. // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота: Тез. докл. -Жодино, 1989. С. 54-56.

147. Техника микроманипуляций с эмбрионами млекопитающих / Клецко Н.Г., Гольдман И.Л., Валынчук В.Ф., Никитин В.А. 2 Всесоюзный симпозиум по иммунол. Воспроизвод. Тез. докл. М., 1980. С. 147-149.

148. Томсон З.Г., Менчукрва С.Г., Корбут Л.В. Хараетеристика коров черно-пестрой породы разных генотипов. // Повышение эффективности производства молока и говядины: Сб. науч. тр. Горки, 1989. - С. 27-32.

149. Трансплантация зигот у крупного рогатого скота М.И. Прокофьев, A.A. Алиев, В.П. Рябых и др. // Вестник с.-х. науки. 1977. № 6 - С. 85-94.

150. Трансплантация оплодотворенных яйцеклеток у крупного рогатого скота. Ю.Д. Клинский, Н.И. Сергеев, В.Е. Даровских и др. // Ветеринария. 1980,-№5.-С. 51-53.

151. Троцинский Ю.В. Эффективность разведения черно-пестрого скота при использовании животных различных генотипов: Автореф. дис. канд. с.-х. наук. -Жодино, 1996. 20 с.

152. Трошко O.E., Артюшкова В.А. Питательные среды для жизнеобеспечения ооцитов и зародышей крупного рогатого скота. Сельскохозяйственная биология, 1985,-№ 12.-С. 100-108.

153. Физиологические аспекты воспроизводительной функции высокопродуктивных коров / Зверева Г.В., Хомин С.П., Осыскин В.Н. и др. // Республиканская научная конференция. Институт Лесостепи и Полесья, Харьков, 1988.-С. 69.

154. Фонбрюн М. Методы микроманипуляции. М: Инлитиздат, 1951. - 167 с.

155. Хилькевич С.Н., Алибаев P.M. Эффективность использования лакти-рующих и выбракованных коров в качестве доноров эмбрионов. // Биотехнологические приемы в технологии трансплантации эмбрионов. Биол. научн. работ, - вып. 104. Дубровицы, 1991. - С. 12-14.

156. Хилькевич С.Н. Теория и практика интенсификации воспроизводства крупного рогатого скота. // Автореф. дис. на соиск. учен. степ. докт. биол. наук. Дубровицы, 1994. 37 с.

157. Шеховцов С.Ю., Шеховцева Е.Ю. Многократное использование коров-доноров. // Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота. Тез. докл. - Жодино, 1989. - С. 102-103.

158. Шипилов B.C. Полнее использовать биологические возможности маток // Животноводство. 1985. -№ 10. С. 28.

159. Щеглов Е.В., Солдатов А.П., Сперанский А.П. Совершенствование комплексной оценки крупного рогатого скота. // В кн.: Система СЕЛ ЭК в решении продовольственной Программы СССР. Рига: Зинатне, 1986. - С. 75-81.

160. Эндокринная реакция у коров при различных способах вызывания суперовуляции. М.И. Прокофьев, К.И. Бахитов, Б.П. Рябых и др. // Сельскохозяйственная биология. 1980. № 2. - С. 302-306.

161. Эрнст Л.К. Итоги и перспективы дальнейших исследований по трансплантации зародышей у крупного рогатого скота // Эндокринология и трансплантация зигот с.-х. животных. М. 1982. С. 3-15.''bf;

162. Эрнст JI.K., Сергеев Н.И. Результаты применения простагландина для синхронизации охоты у коров-доноров и телок-реципиентов // Молочное и мясное скотоводство. 1984. № 3. - С. 29-32.

163. Эрнст Л.К. Научно-технический прогресс в животноводстве // Животноводство. 1985.-№ 11. С. 2.

164. Эрнст Л.К., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. Москва, ВО Агропромиздат, 1989. - 302 с.

165. Якусевич A.M. Использование голштинской породы при совершенствовании черно-пестрого скота Белоруссии. // Проблемы интенсификации производства молока: Тез. науч.-произв. конф. Мн., 1991. - Ч. 1. - С. 810.

166. Якусевич A.M., Гринь М.П., Бекиш Р.В. Молочная продуктивность гол-штинизированных коров. // Научные основы развития Животноводства в БССР.-Мн., 1988.-В. 18.-С. 114-120.

167. Allrich R.D. Relation ships amond ovulation rate serum concentration of estradiol and estrous behavior in seperovulated heifers. // J. " Animal Scienses", 1987, 65, 1,220 /

168. Anderson G.B., Gupps, P.T. Bilateral embryo transfer. Proc. 69th Ann. Meet. Amen. Soc. Amm. Sci. 1977, 332 (Abs) /

169. Aoyagi, Y.; Konishi, M.; Takedomi, Effect of lipid rich bovine serum albumin on direct transfer of frozenthawed bovine embryos. // Theriogenology, 1996, 45, 165-166.

170. Aurah, T. Multiple binths in Norwegian cattle. Acta, Agric; Scand, 1974, 24, 207-210.

171. Beatty R.A. Sex determination in farm and laboratory animals: a review. // VetRec, 1972 -90-243.

172. Becker W., Pinneiro L. Ovariant respouse to superovulation in dairy cows // Theriogenology, 1996, V. 25. -N26. P. 785-793.

173. Bilton, R.J. Preservation of embryos of the large domestic species. // Proc. 9th Int. Congr. Anim. Reprod. and A. I., Madrr (1980), Vol. 2, 245-253.

174. Bicton R., Moore N. Effects of ice seeding and of freezing and thawing rate on the development of sheep imbyos stored at 196°C. // Theriogenology, 1976, 6635.

175. Bennet Y.P., Rowson L.E.A. The use of radioactive eggs in syudies of egg transfer and transport in the femde reproductive tracts. // Proc. 4th. Int. Congr. Anim. Reprod. The Hague, 1961. -No. 2. - P. 360-366.

176. Betteridge K. Embryotrausfer in farm animals // Monigr., 1977. V. - 16. P. 1-9.

177. Betteridge K.Y. An historical look at embryo tansfer. // J. Reproduction fertilization., 1981, 1-13.

178. Borland, R.M.; Biggers, J.D. and C.P. Lechene Kinetic aspects of rabbit blas-tocoele fluid accumulation: An application of electron probe microanalysis. // Dev. Biol., 1976. 1-8.

179. Boland, M.P. and Gordon I. Twinning in lacting fresian cows by non surgical egg transfer. Vet. Rec. 1978, 103, 241.

180. Booman P. Sexing of boving primilation embryos. // Advansed in animal breeding. 1988. 119-123.

181. Boyd H., Reed H.C.B. Investidation into the incedence and causes of intenlity in dary cattle. -Br. Vet., 1961,1. 117, P. 18-35.

182. Bhattacharya, P., Prabhu, S.S. and Chatteriee. Twin and multiple Indian cattle. Z. Tierz. Zucht. Biol. 1956, 66, - 301-305.

183. Cacheiro L. Geriach R., Cacherio N., Cropcey L. Bovint embryo curvival after freezinf and thawing // Theryogenlogy, 1983, - V 19. - № 1. - P. 237-239.

184. Cady, R.A. and Van Vleck, L.D. Factors affecting twinning and effects of twinning in Holstein dary cattle. J. Anim. Sci. 1978, 46, 950-956.

185. Camp H.Jang-Diss. Untersuchung udth Einfluss faktoren auf den Embryotrausfer beiv Rind. Hannover, 1989. - 60

186. Christen, H.R. Chemie. Sauerlander Verlag, Aarau, 1976. P. 261-263.

187. Chupin, D. And Saumand, Y. New attemps to decrease the variability of ovarian response to PMSG in cattle. Ann. Biol. Anim. Bioch. Biophys. 1979, 19, 1489-1498.

188. Conceptus development in superovulation beef heifers. Bellows, R.A., Kitto, G.P., Raudel, R.D., Short, R.E, and Varner, L.W. J. Ania. Sei. 1974, 39, 198 (Abs).

189. Cook, R. The Bucks county qumtulets. 1948. 39 346-348.

190. Deep freezing of embryos in the large domestic species. // 9 th Int. Congr. Anim. Reprod. and A.I., Madrid, Vol. 2, 255-261.

191. Diez, C.; Le Bourhis, D.; Heyman, Y. Effekt of partial lipid removal in vitro produced bovine zygotes on further development in vitro and on the freezing tolerance of blastocysts. // Thenogenology, 1996, 5, 166-167.

192. Diller, K.R. Te influence of controlled ice nucleation on regulating the thermal history duiring freezing. // Cryobiology, 1985, 22, 268-281.

193. Dlaver D.R. Biogenic anime regulation of bovine lutera progesterone production in vivo. // J. Reproduction and fertilisation, 1987, 80, N. 2., P. 517-522.

194. Donaldson L.E., Ward D.N. Effect of buteinizing hormone and embryo production in superovulation cows. // J.Veterinary Record. 1986. - Vol. 119. - P. 625 -626.

195. Egg transfer in the cow sinchronization regulirments / Rauson L.E.A., Läuson R.A.S., Baker A.A. // J. Reprod. Fert. 1972. - Vol.36. - S. 667-673 / Elsden P. // Inch vet. news, 1985, december, 37-43.

196. Elsden, R.P.; Seidel, G.E. Jr.; Takeda, T. and G.D. Farrand Field experiments with frozen-rhawed bovine embryos transferred nonsurgically. // Theriogenology, 1982, 17, 1-9.

197. Embryo transfer-key element for a prospective animal production. // Embryo Transfer Newsletter, 1988, 6,1-3.

198. Falge, ; rommel, P. und R. Johanns Tiefgefriekonservierung von Embryonen mit dem programmgesteuerten Einfrierferat Cryocell 2040. // Tag. Ber. Akad. Landwirtsch. - Wiss. DDR, Berlin, 1986,252, 113-121.

199. Feminity in cattle and Superovulatiry response / Crister V.K., Gunselt R.C, Rowe P.F. et all. // Theryogenology, 1979. Vol.11. -N.l. - P. 94.

200. Freeman A.E. Results of holstein breed comparisons in European countries // Sc.Holstein science rep. Holstein - Friesian assoc. Of America. Ames, Yowa, 1984.-P. 18-31.

201. Frim, J. and P. Mazur Interacrions of cooling rate, warming rate, glycerol concentration, and dilute procedure on the viability of frozen-thawed human granulocytes. // Cryobiology, 1983, 20, 657-676.

202. Gardner R.L. Edwards R.G. Control of the sex ratio at term in the rabbit by transfering sexed blastocests. Nature, Land. 1968 218 - 346-349.

203. Gorlach, A.A., Empryotransfer beim Rind / von Albert Gorlach. Stuttgart: Enke, 1997.

204. Gordon I. And Boland M.P. Towards cattle twins by egg transfer. World. Rev. Amm. Prod. 1978. 14(2), 9-23

205. Gordon I. Cattle twinning by egg transfer in cattle, E.E.C. Seminar, Camb. 1976.-P. 319-505.

206. Gordon I., Williams G.L. and Edwards I. The use of PMS in the induction of pregnancy in the cow. Journ. Agric. Sei. Camb. 1962. 59, 143-198.

207. Gordon I. And Boland M.P. Embryo transfer and twinning in cattle. Vet. Sei. Commun. 1979. 3(3), 177-186.

208. Gordon I. And Boland M.P. Cattle twins by egg transfer. Jr. Vet. J. 1979. 33, 79-94.

209. Greve T. // Nord Vet meg, 1983, 35.1,408-421.

210. Greve R. Non-Surgical egg transfer in the cow. Proc. 27th Ann., Meet. European Association Anim. Prod. Zurich, Aug. 1976., 23-26, 1-7. Hasler I. Et al. // Theriogenology, 1987, 27, 1, 139 168.

211. Hanenberg E. Wagtcndouk A. Comparison of 3, 4, Jday interval between oocyte collection for in vitro embryo production results. // Theryogenology, 1997, Vol. 47, N. 1, P. 351.

212. Hahn, J. Die unblutige Eigewinnung beim Rind unter Berucksichrigung der Vorbereityng der Sprndertiere und der Entwicklung im Eileiter ynd Gebarmutter. // Dtsch. tierarztl.Wschr, 1978, 85,113-152.

213. Hartman C., Lewis W., Miller F. First finding of tubal ova in the cow together with notes on estrus // Anat. Ree. 1931. - V. 48. - P. 267-276.

214. Hasler, J.F.; Hürtgen, P.J.; stokes, J.E. and Z.Q. jin (1996) Influence of tine of exposure to glycerol or ethylene glycol on the survival of frozen-thawed bovine I VF embryos. // Theriogenology, 1996, 45, 172-173.

215. Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster mother. // Proc. R. Soc. Lond. Biol. Sei., 1891, 48, 457-459.

216. Heape, W. Furter note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster mother. // Proc. R. Soc. Lond.Sei., 1897, 62, 178-183.

217. Hendy C.R., Bowman J.C. Twinning in cattle. Anim. Breed. Abstract., 1970., 38., p. 22-37.

218. Heyman V. Facteura de variation du transfert d'embryons par voie cervicale chez les bovins. // Reprod. Bovins anoestrus post-partum. Transplant. Embyon-naire C.R. journals. Inf. UNCEJA-ITEB, mars 1982. - Paris, 1983. P. 105-111.

219. Holy L. Plantassing Zwiligsproduktion unter Nutzung des embryotransfers beim rind // Tiezucht. 1986, - Bd. 40. - N. 5 - S. 306.

220. Hormonalni profil krav po aplikaci substance P-FSH a follicotropinn inj / Spota Riha J., Sevcik В., Richova D., Karlach V., Olsa T., Ledicky. // Biologizace a chemizace Zivosisna vyroba / 1988. T. 24. - № 4. - S. 293-305.

221. Hu Mingim, Wu Xueging. // Xinme shoyi xuebao = Acta vet.et.zootech.sin. -1985 -26 N6-487-495.

222. Introduction of twinning in beef heifens bilateral embryo transfer. Anderson, G.B., Gurro P.T., Grost N. And Horton, M.B. J. Anim. Sei. 1978, 46, 449-452.

223. Ishida T., Sakai Y. Gryopreservation of bovine embryos in the medium with glycerol (1.4 M) a suerose // Japan J. Anim. Reprod. 1989. - V.35 - № 3 - P. 125-129.

224. Jackowski, S.C. und S.P. Leibo Response of fertilized mouse ova to freezing and thawing as a function of permeation by glycerol. // Cryobiology, 1976, 13, 646 (Abstr.).

225. Jackowski, S.C.; leibo, S.P. and P. Mazur Glycerol perméabilités of fertilized and unfertilized mouse ova. // J. of exp. Zoology, 1980,212, 329-341.

226. Janowitz, U. Untersuchungen zu Eigtlußfaktoren auf den Transfererfolg bei Empfangern im Rahmen des Embryotransfer beim Rind. // Diss., Gießen, 1994, P. 302-307.

227. Janowitz, U. Und A. Görlach Durchbruch beim Auftauen von Embryonen. // Tierzüchter, 1994, 46, 24-25.

228. Kasai, M.; NIWA, K. and A. Iritani Protective effect of sucrose on the survival of mouse and rat embryos stored at 0°C. // J. Reprod. Fertil., 1983, 68, 337-338.

229. Kica I.C. Одержання телят-двшнят методом трансплантаци. // Матер1али 1 республшанськай науковай конференцп "Б1технолопчш дослщження i перспективы ïx розвитку" Льв1в 1990 - С. 53.

230. Kliewer R. Balanced breeding programs. Holstein - Friesian World. - 1979. -V. 76.-N14.-P. 172-173.

231. König J. Ergebnisse und Perspektiven der Steperyng biologischer prozesse sowie zelltechnicsher methoden bei der torpflamzung londneirtechafticher Zucht-tiore. // J. Tierucht 1987, 41, N. 8, 362-364.1. MJ'l

232. Küsters, G. Tiefgefrierversuche mit Rinderembryonen unter besondere Berücksichtigung der Ausverdünnungsmethoden. // Diss, Hannover, 1983. P. 171-175.

233. Kuo, Y.H. and J.C. chiang Survival rate offrozen swine embryos in vitro. // Artan, 1991,155-156.

234. Kyssa I.S. A system of quality control of milk in the Brest Region of the Republic of Belarus. // Cattle Identification and Milk in Central and Eastern European Countries. War saw, Poland. 23 august 1998. P. 39-42.

235. Lange, H. Macht ein neuer TG-Verfahren den Embryotransfer attraktiber? // Vortrag; FET-d, Tagung (9./10. Juni) 1994, P. 18-20.

236. Lange H. Gryopreservation of bovine embryos and demi-embryos using eth-yleng-glycol for direct trausfer after thawing., Cryobiology, 1993. V. 1. - P. 183-191.

237. Lehn-Jensen, H.; Greve, T. and A.P. navas Two step freezing of cow rmbryos in 1, 4 M Glycerol. // Theriogenology, 1981, 15, 427-234.

238. Lehn-Jensen H., Greve T. Deep freezing of cattle rmbryos utilizing different frezing curves and cryoprotectauts // Jutem. Congress. Anim. Reprod. and Art. Jusemm. 1982. - V. 5. - P. 631-635.

239. Lehn-Jensen, H. and T. Greve Surbibal of cow blastocysts utilizing short freezing curbes. // Nord. Vet. Med., 1981, 33, 523-529.

240. Lehn-Jensen H., Rail W. Cryonicroscopie observations of cottle embryios during freezing and thawing // Theryogenology, 1983. - V. 10. - № 2. - P. 263-277.

241. Leibo, S.P. Fundamental cryobiology of mouse ova and embryos. In: Elliot, K. and J. Whelan (Hrsg.) // The freezing of mammalian embryos, Ciba Fnd. Symp. No. 52, Elsevier, Amsterdam, 1977, 69-96.

242. Leibo, S.P. and P. Masur Methods for the preservation of mammalian embryos by freezing. In: J.C. Daniel, Jr. (Hrsg.) // Methods in mammalifn rehroduktion. Akademik Press, New York, 1978, 179-20!.

243. Leibo, S.P.; mcgrath, J.J. and E.G. Cravalho Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilised mous ova as a function of cooling rate. // Cryobiology, 1978, 15, 257-271.

244. LEIBO, S.P. Water permeability and its activation energy of fertilized and unfertilized mouse ova. // J. Membrane Biol., 1980, 53, 179-188.

245. Leibo, S.P. Introductions to embryo freezing. In: Zeilmaker, G.H. (Hrsg.) // Frozen storage of laboratory animals. Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1981, -P. 371-373.

246. Leibo, S.P. Preservation of ova and embryos by freesing. // In: Brackett, B.G.; Seidel, C.E. and S.M., Seidel (Hrsg.): New technologies in animal breesing. Acf-demic Press, New York, 1981,127-139.

247. Leibo, S.P. Field trial of one-step frozen bovine embryos transferred non-surgically. // Theriogenology, 1983,19,139 (Abstr.).

248. Leibo, S.P. United States Patent No: 4, 380, 997. Embryo transfer method and apparatus. // Assignee: Rio Vista Internat. Inc. San Antonio, Tex., Appl., 1983, no. 251, 696.

249. Leibo, S.PA one-step-methos for direct non-surgycal transfer of frozen-thawed bovine embryos. // Theriogenology, 1984, 21, 767-790.

250. Leibo, S.P Field trial of one-step diluted frozen-thawed bovine embryos: An udate. // Theriogenology, 1985, 23, 201.

251. Leibo, S.P. Chilling and freezing sensitivity of «reassembled» in vitro-derived boivine embryos. // Theriogenology, 1995, 43, 265.

252. Levin, R.L. and T.W. Miller An optimum method for the introduction on removal of permeable cryoprotectants: Isolated cells. // Cryobiology, 1981, 18, 3248.

253. Lieman P., Tulka Y. Pregnancy rate after synckronuos and asynchronous transfer of frozen thwed barne embryos /7 Anim. Reprod. Sei. - 1986. - Vol. 11, -N. 3. -P. 181-186.

254. Lindsell C.E. Seperovulation in cows with FSH beginning in early dusters. // Dept. Of herd medecine and theriogenology Western College of Veterinary Medecine University of Saskatcheneaen, 1987.

255. Looney, C.R.; Broek, D.M.; Gue, C.S.; Funk, D.J. and D.C. Faber Fild experiences with bovine embryos frosen-thawend in etylene glycol. // Teriogenology, 1996,45,170.

256. Maijala K. And Syvarjavi J. On the possibility of developing multiparous cattle by selection. Z. Tierarzuchtg Zuchr. 94,126 -150.

257. Mariana J.G. and Nguyen, Huy N. Folliculogenesis in the cow. // Annals of biology, Animal Biochemistry andBiophsics. 1973, 13, 211.

258. Markette K.L., Seidel G.E. Estimation of embryonionie losses in baeine embryo transfer recipient from progesterone profiles and nettuns to estras. // Theryogenology, 1985, Vol. 23. -N. 1, 45-62.

259. Marletoft R.J. Superovulation in the cono usin a Synchromate B cow implant // Dep. Of Medicine and theriology Western College of Veterinery Madecine University of Saskatchewan, Canada. 1987

260. Massip, A.; Van der Zwalmen, P.; Ectors, F.; Coster, R.DE; Ieteren, C.D. and C. Hanzen Deep freezing of cattle embryos in glass ampules or french straws. // Theriogenology, 1979,12, 79-84.

261. Mazur P. Freezing and low-temperature storage of living cells. // In: Muhlbock, 0. (Hrsg.) Proceedings of the workshop on basic aspects of freeze preservation of mouse strains. Fischer Verlag, Stettgart, New York, 1974.

262. Mazur P. Slow freezing injury in mammalian cells. In: Elliot, K., u. J. Whelan (Hrsg.): The freezing of mammalian embryos. // Ciba. Fndn. Symp. No.52, Elsevier, Amsterdam, 1977, N. 52.-P. 311-315.

263. Mazur P.Fundamental aspects of the freezing of cells with emphasis on mammalian ova and embryos. // 9th Intern. Congr. Anim. Reprod. and Artif. Insem., Madrid 1980, Vol. 1,99-114.

264. Merry, D.A.; Allen, R.L.; Krag, K. and R.W. WRIGT Jr. Sucrose dilution of frozen mouse embryos: Interaction of glycerol and sucros concentrations. // Theriogenology, 1983, 20, 325-332.

265. Mittersill, U.; Gobber, H. und Kurzthaler Vorlafige Ergebnisse mit Direk-transfer von tiefgefrorenen Rinderembryonen. // Vortrag: Aet-d Tagung (9./1 O.Juni) Mariensee, 1994, P. 222-236.

266. Modifuing factors of fertility after different oestrous treatments in beef cattle. In, control of Reproduction in the cow. Mauleon P., Chupin D., Pelot J. And Aguer D. European Economic Community Seminar. (Galway), 1978, 531-545.

267. Moststs L. Hahn I. Experimental production of identical twin mice. Dtsch. Tierarztl. Woch., 1978, 85, 242-244.

268. Mulvehhill P. And Sreenan J.M. Improvement of Fertility after different oestrous teatment with PMSG and progestagen. // Journal of Reproduction and Fertility. 1977., 50., 323-325.

269. NelsOn L., Saidel G. Elsden, Bowen K., Superovulation of cows using folliele stimulating hormone and prostaglanding F2 alfa // Theryogenology. 1979. - V. 2. - № 1 - P. 104.

270. Newcomb R., Christie W.B and Rowson L.E.A. fetal survival rate after the surgical transfer of two bovine embryos. // Journal of Reproduction and reproduction. 1980., 59, 31-36.

271. Niemann H., Sacher B., Usaessen T. Pregnancy rates relative to recipient plasma progesterone levels on the day of nonsurgical transfer of frosen / thawed bovine embryos. // Theriologenology, 1985, N. 23., Vol. 4., P. 631-639.

272. Niemann, H.; Dopke, H.; Sacher, B. und E. Schilling Tiefgefrieren von Rinderembryonen im Plasticstraws mit Ausverdünnung des Gefrierschutzmittels surch Sucrose. //Zuchthygiene, 1981,16, 201-205.

273. Niemann, H.; Smidt., Tifgefrieren von Rinderrmbryonen. Methoden und Einflußfaktoren // Laudbauforsch. Volkenroole. 1985. - Bd. 35. - № 4. - S. 205211.

274. Niemann, H. Cryoprezervation of bovine embryos in the field. // Embryo Transfer Newsletter, 1990, 8, 5-7.

275. Niemann, H. und Mernecke, B. Embryotransfer und assoziierte // Biotechniken bei landwirtschaftlichen Nutztieren. Ferdinand Enke Verlag, Stuttgart., 1993.

276. Niemann, H. Embryotransfer: Welche Fortschritte die Forschung macht. // Tierzüchter, 1994, 9, 8-10.

277. Nohner, H.P. Versuche zur Tiefgefrierkonservierung von Rinderembryonen unter besonderer Berücksichtigung berschiedener Ausberdünnungsverfahren. // Diss, Hannober., 1986, P. 34-40.

278. Non surgicalcollection and transfer of bovine embryos. / Habn Y., Roselnis R., Romanobski W., Scheiden U. // Archives Andrologia. - 1980. -N. 5., - P. 106.

279. Osil Y.R. Production of identical twins by bisection of blastocysts in the cow. // Journal of reproduction and fertility. 1983. Vol. 69. - N. 3. - P. 463-468.

280. Over 5 years expirience in sexing of bovine morule and during routine embryotransfer. Roshlau K., Roshlau D., Reselins R., Dexne N., Michaelis U., Strenl R., Unicki P. // Theryogenology, 1997, P. 311-313.

281. Overull efficicucy of an experimental ovum pick-up Programm in Cattle. Don-nay J., Roover R., Langenductt A., Massip A., Dessy F. // Theryogenology, 1997,-Vol. 47.-N. l.-P. 256.

282. Paulyshym V., Braithneaite M., Mapletoff R.L. Effects on FSH dose on superovulation repose in cull beef cows. // Department of Hers Medecine and The-riology. Western college of Veterinary Medecine, University of Saskatchewan, Canada, 1987.-P. 48-51.

283. Polasek M. Superovulace u krav a ruatelka. // Zinocis na vyraba, 1984, 29, 12, 1059-1068 (CSSR)/

284. Prather R. Nuclear tranplatation in bovine embryos. // Theriologenology, 1986, N.25.,N. 1,P. 189.

285. Prospect "Mapiehurst ova transplans the oldest transfesfer company in the United States" Nelson L., Seidal G., Bowen K. et. al. // Sugested post calving care of prospective donor wes. 1986. - 71 p.

286. Prospect "Ova Transfer by Mapiehurst" Maplehurts embryosels, 1987. 25 p.

287. Rail, W.F. and G.M. Fahy Vitrification: A new approach to embryo cryopre-servation. // Theriogenology, 1985, 23,220.

288. Rail W., Fany G., Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification //Nature, 1985, P. 573-575.

289. Ralph y. Embryo viabiliti and development after prosteglandin E2 (PGE2) addition to the semen and progesterone (Pn) solcoseryl and PGE2 to the transfer medium. // Theriogenology, 1984, 21,1, 274.

290. Recovery and Trensfer of embryos by non-surgical procedures in lactating dairy cattle. Brand A. Acerts M., Zaayer D., Oxendr W. Jn, Control of Reproduction in the cow. Galway, Screnan I. Ed. 1978 P. 531-533.

291. Renard J.P., Heyman V., and du Mensil du Buisson R. Unilateral and bilateral cervical transfer of bovine embryos cervical blastocyst. // Theriogenology. 1977. -7.- 189-194.

292. Renard, J.P.; Heyman, Y. and J.P. Ozil Congelation de l'embryon bovin: Une nouvelle merhode de décongélation pour le transfert cervical d'embryons conditionnés une seule fois. // Ann. Méd. Vét. 1982, 126, 23-32.

293. Renard, J.P.; Heyman, Y.; Leymonie, P. and J.-P. PLAT Sucrose dilution: A technique for fïtld transfer of bovine embryos frozen in the straw. // Theriogenology, 1983,19,145.

294. Renard J.P., Ozil J.P. and Heyman Y. The use of embryo transfer in the field for incneased cald cros in beef and dairy cattle. // Animal Reproduction Science 1979.-2.353-361.

295. Revefening Rl.J. and al. Synchronization of oestrus with PGF2 in beef cattle. // Journal Animal Science 47. 999 - 1003, 1978.

296. Riha J. Vztach kvalityci / corpus lutenium / k zabrezavam prjevkun njprenozu embryi u skotu // Zivocisna Vyroba, 1987. -32.-3. S. 227-231.

297. Rocosou L.M. Embryo transfer in the sheep; The significance of synchronizing oestrus in the donor and recipient animal. L Reprod Fert., 1966. 11. 207-212.

298. Rowson L.E.A. The role of reproductive research in animal production. // Journal of Reproduction and fertility. 1971.-26.- 113 126.

299. Rowson L.E.A., Lawson R.A.S., Moor R.M. Production of twine cattle by EGG tarnsfer. // Journal of Reproduction and fartility. 1971. vol.25. - N.2. p. 517-523.

300. Rowson L.E.N., Moor R.N., Lawson R.A.S. Fertility following egg transfer in the cow: a effect of method medium and Fertility. 1969. Vol. 18. - P. 517-523.

301. Rutletge Y.Y. Twinning in cattle. Journal of Anim Science., 1975., 40. - P. 803-815.

302. Scanion P.T., Gordon I., Sreeman J.M. Multiple ovulations multiple pregnancies and multiple births in Irish cattle. // Irish Department of Agriculture. Fresh, 1974. 70, p.2 -18.

303. Scalon P.T. Gordon I. and Sreeman J.M. Multiple Ovulations, Multiple Pregnancies and Multiple births in Irish cattle. /7 Journal departmant Agriculture. Irish Republic, 1974-70.-P. 45-61.

304. Sheg B., Ollis G., Jacobson M. Pregnancies following long distance transport and transfer of frozen embryos // Con. J. Anim. Sei. 1977. - V. 57. - N. 3 - P. 801-802.

305. Scheer P. Knelpunten en kansen in de Friese Veetokkerij. 1974. - N. 12. - S. 710-718.

306. Scheiwe, M.W. und G.Rau Biokältetechnik: Verfahren der Getfrierkonser-vierung in der Medizin. // Chem. Ing. - Techn., 1981, 53, 787-797.

307. Schneider H.Y.Y., Castleberry R.S. and Griffen J.L. Commercial aspects of bovine embryo transfer. // Theriogenology 1980. 13 (1), 74-85.

308. Schneider, U.; and P.Mazur Osmmotic consequenses of cryoprotectant permeability and its relation to the survival of frozen / thawed embryos. // Theriogenology, 1984,21,68-79.

309. Schonmuth S. Et al. Ergebnisse der Milchrindzuchung unter Kreuzungsbedingungen//Archiv fur Tierzucht. 1980. -B. d23. -H. 4. - S. 227-235.

310. Schuberth, W. Tiefgefrerversuche mit Rindermbryonen zur methodichen Verbesserung der Kryoprotektion, der Ausverdünnung und des Auftauvorganges. // Diss. Hannover, 1984. -P. 45-47.

311. Schuttler H. Top Production cow the Century. Holstein-Friesian World. -1979,-V. 76.-N. 14-P. 172-173.

312. Schwartz, G.J. and K.R. Diller Osmotic response of individual cells duiring freezing. // Cryobiology, 1983, 20, 61-77.

313. Seidal G.E. Application of Embryo Presentation and Transfer. // Animal Reproduction Laboratory, Colorado State, University, Fort Collins, Colorado 80, 523,1985.

314. Sexing 2-week old surgical transfer; preliminary meyhods and results. Hare W., Mitchel D., Betteridge K Eaglesomem., Randall G. // Theiogen, 1976, 5, 243-253.

315. Sreenan J.M. and Buhan D. Embryo survival development at vamous stages of gestation after bilateral egg transfer in the cow. // Journal of Reproduction and Fertility. 1976, 47 127-128.

316. Sreenan J.M. Embryo transfer for the induction of twinning in cattle. In, Embryo transfer in Farm Animals. K.I. Betteridge, Ed. Canada Dept. Agric. Monograph. 1977.-76 p.

317. Sreenan J.M. Non Surirgical egg recovery and transfer in the cow. // The Veterinary Record. 1978. - 102. - 58-60.

318. Sreenan J.M. New Breeding techniques in the suckler hend. // Irish Farmer Journal. 1977 b 29 (16), 28-29.

319. Sreenan J.M. Non surgical embryotransfer in the cow. // Theriogenology 1978.9 (1), 69-83.

320. Sreenan J.M. Increasing the calf crop: synchronisation and twin calving. // Irish Farmer Journal. 1979. 31 (7), 46 -47.

321. Sreenan J.M. Possibility for the improvement of reproductive effciency in cattle. // Journal the future of Beef Production in the European Community, European Economic Community Seminar, Albano-Ferme, Italy, 1979,191-217.

322. Sreenan J.M., Diskin M.G. and Mc Donagh, T. Introduction of twin calves Bynon-surgical embryo transfer. A field trial. The Veterinery Record. 1981. -109, 127-128.

323. Stout J.Milking shorthorn J. 1982. - V. 62 - N. 4. - P. 30.

324. Suzuki T., Shimokira T., Fujiyama M. Transfer of bovine frozen embryos by one step straw method // Japan J. Anim. Reproduct., 1983. V.29 - № 3. - P. 162-163.

325. Swanson G.Y.T. The genetic improvement of dairy cattle in Engl end and Wales Communications Y.N.Y.A. // Yist.nac. de investigacioner agrarias Ser.: Producton animal. 1987,-N. 11.-P. 53-61.

326. Szell, A. and Shelton Sucrose dilution of glycerol from mouse embryos frozen rapidly in liquid nitrogen vapour. // J. Reprod. Fertil 76, 401-408.

327. Tervit H.R., Rowson, L.E.A., and Brand A. Synchronisation of oestrus in cattle using a prostaglandin F2 analogue (JCJ 79939) // Journal Reprod. And fertility. 1973.34. 179 -181.

328. Testart Y. Godard, C. And du Mesnil du Buisson, Transvaginal transplantation of an extra egg to obtain twinning in cattle. // Theriogenology, 1975, 4, 4. -163.

329. Tnimonier J. Synchronisation a osstrus m combination. // Annals of Biology, Animal Biochemistry and Fertility., 15, 437-449, 1975.

330. Trounson A., Branol A., Ferts M., Nou-curgical transfer of deep-frozen bovine embryos //Theryogenology. 1978,-V.10.-№ l.-P. 111-115.

331. Vandeplasse N., Butaye R. And bouters R. Twin bearing capacity of the uterus in heifers and cows. Dtsch. Tierarztl. Wschr. 1979., 85., 470 -473.

332. Voelkel, S.A. and Y.X. Hu Direct transfer of frozen-thawed bovine embryos. // Theriogenology, 1992, 37, 23-35.

333. Weinze, K.F. Kryobiologisce Aspekte 1er Spermakonservierung. In: Künstliche Besamung bei Nutztieren. Busch, W.; Lohle Ö, K.; Peter, W. (Hsgb.) (Ii-Auflage). Gustav Fischer Verlag, Jena, Stuttgart, 1991, P. 157-161.

334. Weldt D.E., Woody H.D, Duletow W.R. Induction of multiple ovulation in the cow with single injection of FSH and HCG. // Journal of reproduction and Fertility. 1975, 44, P. 583-586.

335. Wettstein F. Hend book records of twinning in cattle. // Agrartud. Szle., 1947, 1,326-338.

336. Whittingham, D.G. Survival of mouse embryos after freezing and thawing. Nature, 1971,233, 126.

337. Whittingham, D.G.; Leibo, S.P. and P.Mazur Survival of mouse embryos frozen to 196° C and -269° IIC. Scitnce, 1972, 178,411-414.

338. Whittingham, D.G.; Wood, M.; Farrant, J.; LEE, H. and J.A. HALSEY Survival of frozen mouse embryos after rapid thawing from -196° C. // J.Reprod. Fertil, 1979,56,11-21.

339. Whittingham, D.G.; Sensitivity of mouse embryos to the rate of thawing. Zeil-maker G.H. (Hrsg.): The frozen storage of laboratory animals. // Fischer Berlag Stuttgart/New York. 1981 P. 237-241.

340. Willadsen, S.M.; Polge, C.; Trouson, A.O. Transplantation of sheep and cattle embryos after storage at -196° C. In Elliot, K. and J. Whelan (Hrsg.) // The freezing of mammalian embryos. Ciba Foundation Svmp., 1977, N. 52, Elsevier, Amsterdam, 190-201.

341. Willadsen, S.M.; Polge, C.; and L.E.A. Rowson In vitro storage of cattle embryos. // Control of reproduction in the cow. // Verlag Nijhoff, Den Haag., 1978, -P. 81-90.

342. Willadsen, S.M.; Polge, C.; and L.E.A. Rowson: The viability of deep frozen cow embryos. J. Reprod. Fertil, 1978, 52, 391-393.

343. Willadsen, S.M.; The viability of early cleavage stages containing half the normal of blastomeres on the sheep. // J. Reprod. Fertil, 1980, 59, 357-362.

344. Willadsen, S. Lehn-Lensen H., Tehilly C. The production of presected parentage by micromanipulation of non-surgically collected cow embryos // Theryogenology, 1981, 15,23-29.

345. Willet E.L. Successful transplantation of a fertilised bovine ovum. // Science. -1951,-Vol. 113.-P. 247.

346. Wilmut J., Rowson L. The succesful low temperature preservation of mouse and cow embryos // J. Reprod. AndFert, 1973. V. 33. - P. 352-353.

347. Wilmut, I. and L. E.A. Rowson Experiments on low-temperature preservation of cows embryos. // Vet. Rec., 1973, 92, 686-690.

348. Wilmut, I., Rowson L. The successful low temperature preservation of mouse and cow embryos // J.Reprod and Fert. 1973. - V. 33. - P. 352-353.

349. Wilmut, I., Animal breeding: a role of embryo-preservation // Spon., 1973. V. 16.-P. 99.

350. Wmtenberger-Torres S., Popescu P. Transfer of cow blastocysts after sexing. Thenogen, 1980, 14,309-318.