Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗДЕЛЕНИЕ ЭМБРИОНОВ МЕТОДОМ МИКРОХИРУРГИИ И ПОЛУЧЕНИЕ ОДНОЯЙЦЕВЫХ И ХИМЕРНЫХ ТЕЛЯТ ПРИ НЕХИРУРГИЧЕСКОЙ ПЕРЕСАДКЕ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "РАЗДЕЛЕНИЕ ЭМБРИОНОВ МЕТОДОМ МИКРОХИРУРГИИ И ПОЛУЧЕНИЕ ОДНОЯЙЦЕВЫХ И ХИМЕРНЫХ ТЕЛЯТ ПРИ НЕХИРУРГИЧЕСКОЙ ПЕРЕСАДКЕ"

всвлжшй одаи тетдоеото кРАсюш эвиши 1иГЩКН№СЛЩ06ЛТ£ШЖИИ ИНСТИТУТ шшотшиодстм

. . На правах рукописи

:МАДИЧ Алла Всеволодовна

'• удк 612.646.02

РАзшвниБ ЭМБРШШВ мшщда

И ШЮГЧЕНИЕ ОДЮЯЛШШХ И ХИШРШХ ТЕМГ пги

нехируршшской пересадке ; :':.'■-■.

03,00.13. - Физиология человека к животных

."-/• АВТО РЕ »ВРАТ диссертации на соискание ученой степени . кшишд&те биологических наук /

Дуаровмш.ИосксвскоАосУьастм 1969 гад;, -л.;

'-а ' с' 4 ^ с с^/

С/ССС&кЛССхЖ^^^Р®ртаиионная работа выполнена в центре трансплантации - ■ ' ^ . эмОриЗнов сельскохозяйственных жшюткых Всесоюзного ораека Тру^ ч ■ - дового Красного Знамени научно-исследовательского института животноводства, > , ■ „■■ . -

Научный руководитель - доктор биологических наук,

... профессор Н.И.СВРШЗ

■ Официальные оппонент - доктор биологических наук

Б.ЗЗ.СМОИЯ№МШ - ' У .: , ■ - кандидат биологических наук

Н.С.СТРЕЛЬЧЕНКО

Ведущее учреждение - Украинский даучно-исследователъо-

■ I, кий институт по племенному делу - в животноводстве. 1;

'. - - ' Защита диссертации состоится "

/¿¿-¿у-^-И— 1939 г. ;

в часов на заседании специализированного Совета

Д. 020.16.02. при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени , научно-исследоиательском институте животноводства. ■

Адрес: 142012, ДуОровшш, Подольского района. Коскоаской .-■ , • " области.' -. " ■ :■;. . - Ч-:- ' ■ .'■■■'./

С диссертацией мокно ознакомиться в бийиютеке \ -

Авторефехот разослан • ^С^/^/^-дэвЭ г. -.

Ученый сек1жтарь . '. _ ; ,

■ спеигшлкзи^киаюго Соисто - ' ■.

. кгит.цаг' (¡/.схлск-.чсагах наук •. 1;.И.1:МИГ.'.Н '

;*1. ОНДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛБОШ

1.1, Актуальность. Трансплантация вмбрионов позволяет иоду- • чать от швоЗсашоГвдесятки раз болью потомства, чей ори использовании традиционных методов воспроизводства. Это отдогаает вироииевозможност* для интенсификации селекции. Однако, в салу рекомйднантной изменчивости трудаа получать аналогичных по генотипу животных. Преодолеть его стало воэмаешш, используя методы клонирования зародышевых клетокшйрионов.

Одним из методов квонировавия является разд&лвиие эмбрионов на отдельные йлаотомеры методой микрохирургия. Эмм путем предполагается повисать выход потомства за счет получения идентичных даоен. раск^ть отваещ» влияния наследственных факторов наразвп-тяе шр$0фунш10нлльных реакций у. животных. (з.и.иптавеи ж др. 1979,13в1,Т..!.»Ш1ала к др. 1982,1984, А.СоПвсЬ " X др. 1986). '

Агрвгацжя целых здйрионсв или их половин предполагает развитие нового направления в области микроианипузшций — получение химер, предотавдяпцих собой аналитический инструмент зксперименталь-ноа шЗраолсшии ж генетикн раэвития (А.к.тагко11вк1 1961, о.в.г»ь*11у ' ■ и др, 1964).

СоэддяиервкоиЗинаятнтдаСн конструирование олаэыид от крыло, возможность объеданеиияметодов микрохирургии вибрионов и рв-1ии»3ннированм дщ дш1воопронзводст&а трансгенных иивотньц (А.ПЛмйанндр, 1986,1687; К,Г.Газарян,1988,й.С,Ра1ти«г * др. 1982,1986, Й.В.СЬигсЬ 1985,1987).

В связи о принцжтмиаяо! возможность» получения генетически идентичных, стнвртгт ж траисготмх хивотльи представляет Содъоую ахтуальнсють дальне!иая разработке микршашшулякионной -гвгшхж к приемов корохирургви на эмбрионах рааднтгаа видов салъскохогяА-

| . -I' I

>: •'.,-• . !

ственных животных.

1.2. Цель и задачи исследований, Целю ивследованнй явм^ освоение и усовершенстаовшшетехнюш н методов мекрохярургю|1 вмбрионемн животных» юучешгв вдяяши раздгшах факторов на звй неспособность мщфоыаншухяро ванных еыбрпоиов» получение идентичных двоен, химерных телят и трансгенннх ЖНВОТВЫХ. В соответствии о эти» били поставлены следупцие задачи: ¡

- усове рввнствовать метода разделения и агрегации вмЗрисн»

нов; ; ' :.'..;" '■■ ■ . .:

- изучать вянянве отешэд развития, качества гатакткых и

разделенных эмбрионов, методов ж твидам делания;

- определить еф$еятявнооть иехнру^'яческой пэресадкй раздв ленных эмбрионов по одной половине разным регдошеитам яподвз одному реципиенту в сдав рог илк в oda pora катка; :

- выяснить вовможность деления ваморокенно-огтаяншх риоаов а влияние глубокого эаыоражившшя аа жизнеопособноск. шяромаяипулнроваяных эягот; ■ .■■"■'■*

- определить техническую возможность введения генннх кон- ; струкцка в эарошши седьскахоэяйственикх'жив'ишпс на разных втек днях развития»

1.3. Неу^зд.ровдзн^. Усове■ршенотяоядмм техника я Методы Д9* лекия эмбрионов. их е1гега1^, идуч0ш1условш1^ вдшшш!е на пр^ жявляемость разделенных я агрегированных эмбрионов. Вперше в нашей стране получены однояйцевые близнеда и телята-хлме ja, а такие телята и ягнята от пересадки эмбрионов после; мюфошгьеи^ ций чуяеродних генов; внесены вовне технические и конструктив нне решения в методику кловироваяия:зародаш»эа на ранних стад)^

ях развития.' ■ „\ • :-.■'.'-■..4 ■ '

1.4. ГГрмдич^кая значимости„работу. Разработан;иомплек-

шскроинструмеитов в методов, которые могут бить использована для шпагеаяяя микрохирургических операций на ранних ембртонах сельскохозяйственныхживотных.

т-в- ATTByîffîtl WfTft- Основные положения диссертация доло-жаш ва:

- научяо-ыетодичесних конференциях центра трансплантации вибрионов сельскохозяйственных животных и заседаниях ученого Совета БИЗа, 1966 В 1969 гг.1

- У1 конференции молодах ученых "Разработка методов биоинже-нэрва в животноводстве для совершенствования продуктивных и технологических качеств сельскохозяйственных животных", г.Пушкин, июнь 1987 г*; '

- ХХХХ и ХПХ1 научно-методических вмференциях молодых ученых в аспирантов ШСа, 1987, ISÔ8 гг.;

- Республиканской научной конференции "Состояние а перспективы развития биотехнологии в животноводстве", г.Харьков, IS86r.

1.6. Объем работц. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текот&, содержит 10 таблиц, 21 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, екстериментальной части, обсуждения, выводов и предложений, списка литературы, включапцего 191 источник, из них 165 на иностранных языках.

г. материал и метода иссшсшшй

. Работа выполнена в центре трансплантации вибрионов ШИа в соответствии в планом ваучно-исследоватальоких работ в период с сентября 1886 года по май 1988 года*

Исследования вели» в трех направлениях с целы) получения монозиготных близнецов, хишр » г^аасгешшх животных на эмбрионах коров* * овец.

В опытах no Искусственному пояучбшпо идентичных бднэввцов: л химер в качестве доноров эмбрионов попользовали коров черно--построй, красной датской, аЛрлгрской и симментальской породи Эмбрионы извломлн аехирургическии способом на 5 (для агрегацкя) или 6-7 (для деления) день посла искусственного осеменения доноров.

Интродукцию гена горюна роста проводили в оплодотворенные яйцеклетки или еыбриош коров черно-пестрой породи ж овцематок порода финский ландрае. \

Б качестве реципиентов использовали животных тех же пород. Система для микроыаштуляций включает инвертироваиныЯот»-реомикроскоп " L*ltz Diaiu* 22% машшулядионюШ блок, оостоящий из двух манипуляторов, и два икъекционво-всайнвакишх устройства, Использовали набор микроинструмантов, которью изготавливали самостоятельно с учетом особенностей микрохирургических методов.

Микроманипуляции проводили о помощью манипулятора в . чашке -Натря под отереомикроскопс« ш вручну» в капле среда на предметном стекле о лункой под лупой в зависимости от метода, на , эмбрионах хорошего н отличного качества» при соответствии отшил развития с возрастом.

. Рабочее средой служка фосфатно-солевой буфер ймьбекко о добавлением 20 % фетельной сыворотки плода и антибиотиков. -

Для разделения эмбрионов использовалитехналогия, состоящую из последовательных этапов: а) фиксация эмбрионе; б) вскри-* тие зоны пеллюпдда; в) экстракция внутренней клеточной массы; г) разделение пополам клеточного комплекса; д) подготовка пустой зоны пеллюцвда; е) подсадка половин в пустые оболочка. ■■ Пустые зоны пеллюцида готовили из неоплодотворенных яйце-

клеток или дегенерировавшее эмбрионов коров и хранили в рабочей сред» до цемента использования,

Фиксацию эмбриона осуществляю с помощью отрицательного давления в удерживающей пипетке создаваемого шгьекционно-вс асы-вапщ| механизмом.

. Оболочку рассекали опусканием микронока шш ме тадлической иглы в медиалъну» плоскость эмбриона,,одновременно разделяя внутреннюю кяеточную массу, шш проколом зоны и поступательными движениями кшфоинструиента внутрь зародыша.

После окончания деления инъекционной штеткой извлекали одру нэ половин * подсаживали в пустую зону пеллкцида. При налгал цитоплазматичесхих мостиков между половинами осуществляли экстракцию всей внутренней клеточной массы инъекцией рабочей среда в иерЕвитеиошовое пространство эмбриона. Повторным делением удаляли бластомерные соединения и поочередно переносили половины в пустые золы. .

В эксперименте использовали четыре метода деления, В 1-й -эмбрионн делили металлической иглой вручную под луной с последующим заключением наловив в пустые оболочки при помощ микроманипулятора. Во 3-й - внутриклеточную массу разделяли мшеро-вояом вместе с оболочкой или через прокол зоны на мжреманипуляторе. Одну половину извлекали и переносили в пустую зону, вторая оставалась в собственной ободочке. В 3-й - применяли метод вертикального сечения эмбрионов металлической иглой без подсадки половин в зоны. В 4-м методе обе половши после деления оставляли в собственной зоне делдпцгда.

Условием правильного деления считали ыинжцалшоа ц овладевав бластомеров и получение симметричных половин.

Извлечение внутренней клеточной пассы, разделение и агрога-

штю половин в зоне пеллюцнда осуществляли о помощь» микромаяицу-ляторо.

В экспериментах по переносу чужеродной ДНК в ембрюнн коров и овец использовали генные конструкции предоставленные институтом молекулярной биологии АН СССР.

Ген горюна роста инъецировали в виде линейной форда плаэ-мпды рис-19 . состоящей из промотора гена шгааяотионеина (МГ-1) мыши, структурной части гена гормона роста быка или человека я з'- яетраяслируемой области вируса зу 40. Количество генокошй, инъецированных в один эмбрион, варьировало от 500 до 2500^ .

Трансплантацию разделенных и агрегированных ембрионов коров проводили нехирургически & ИЕСилатервтьный рог матки {при одно- . сторонней пересадке) или в оба рога матки (при билатеральной).

Эмбрионы и зиготы коров с интродукцией чужеродного геиа гормона роста пересаживали аналогично нехирургически и хирургически в воронку яйцевода. Элбряоны овец пересаживали хирургически в . верхушку рога матки по 2-3 эмбриона в каждой рог. .

Генетический контроль происхождения приплода осуществляли ; иммунологической экспертизой групп крови животных..Экспериментальные данные обрабатывали методами вариационной статистики.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ШСЛВДСВАВДЛ . ' . .

3.1. Тран^^Т^^иЦ -рпзаалентмд ^рродут).-В вксперимевте использовали 51 компактную морулу и ранит блаотоцисту нехирургически извлеченные от 34 коров-доноров. После' оценки качества морфологически отличные эмбриона составили 25,5 хорошие - 43,1 %, условно годные - 31,4 Я.

В результате деления получили 87 половин;(85,3 ¡0 из которых

II одиночных в 36 шжозхготшос пар были включены в эксперимент i вновь оценены по качеству» Процентный выход "отличных" и "хороших" половин составил 28,7 и 4I,4 Jf. "Условно годные" половили (23,9 %) трансплантировали преимущественно в паре о "отличными" и "хорошими" или о дегенерированным эмбрионом о целью увеличения паточно-эмбрионального сигнала.

После пересадки половин "отличного" и "хорошего": качества .< стельными стали 57,9 и 15,4 % реципиентов, соответственно. Из . них 4 - двойням от трансплантации "отличных" половин. Пересадка "условно годных" половин привела к I одинцовоЙ стельности {12,Б*Ь • -

. С целью выяснения возможности использования заморокенно-

- -оттаянных вмбрионов -в вксперимент по делению включили 2 оттаян- i ныв морущ в 9 йдаотодаст (тайл.1).

■ , От перэоадки 20 половин получено 4 отедьности, что составило 33,3 % от всех рещпшентов с эаыорояеино-оттаяняыш половинами.

Пересадка разделенных ыорул а бластсцист привела соответственно к 38,5 и 22,2 % стельности. Белее высокие регуляционные способности внйрионов в ст адии, компактной ыорулы подтверждаются

■ и количеством двуплодних стельностей. Все четыре двойни лолуче-' ны от разделенных иорул.

В результате делении эмбрионов разными методами было поду-чеко II, 33, 31 и 12 половин или 78,6; 82,5; 86,1 и IDO % соответственно ÍTeAs.2). В первом методе из 9 реципиентов 2 (22,2

- стали отельными и калдай отелился одним теленком.

Кесткая фиксация »мбриона удерживамцей шшеткой, деление иод стереоьшфоскопом {2-ой метод) позволили получить 36,4 % стельяостей-И три пары монозиготны1' двое и из S телят.

От цересааки эмбрионов рассеченных металлической иглуа

Таблица I

Уровень стельности от пересадки разделенных свежеподученных и замороженно-оттаянных эмбрионов разных стадий развития ■ "

1Сэежеполучен-IЗаыорсжеино-I 1ныэ -оттаянные 1

{ МП |И1. «II у

Разделено эмбрионов 23 17 2

Получено половин 38 29 3

Процент от числа разделенных 82,6 85,3 75,0

Пересажено половин 34 29 3

Число реципиентов 24 17 2

из них стельных 9 3 I

Процент 37,5 17,6 ' 50,0

Получено телят 10 3 2

в том числе двойневьк в . - 2

одинцов 4 3 . - .

II

Всего

МП

211

9

17

94,4 17 10

3

30,0 3

25 41 '

26 46

82,0 88,5

37 * 46

26 27

10 6

38,5х 22,2

12х ' 6 а

4' 6

х Р <0,05, Здесь и далее МП - поздние морулы,

' вц - ранние бластоцистн,.'-

(3-й метод) 16 реципиентам 2 {12,5 %) стали стельными я принесли по одному теленку. После деления эмбрионов в собственной зоне без удаления половин (4-й метод) получен наивысший процент, стельности (66,7 %). От 4 стельных реципиентов была получена одна доойая и три одлнцовнх отела. .

Раэлптная техника деления определенно повлияла на имплантацию половин от свежеполученйнх и замороженно-оттаянних эмбриолог (20,6 против 25,0 %) (табл.З, 4). Наиболее высокая пргсиявляе- .

Тайшца 2

Вшшяз шкш даленкя да прилтляемость половин аиЗриоЕов разных стадий развитая

Методу "»»и

Показатель

■Л - металлической!П - шкроножом (Иглой вручную с {с лсщсадкой б ¡подсадкой в зош {зови на адкрсщ-, ¡на шпфшагашуля- \ авдуляторэ

. - штамтёс'кой|1У - щщровсжоы ■ ИГЛОЙ вручаю бвЗ I на "ШКрОМаНЩуЛЯ-подсадки в зови (торе йеэ гавлече-|ЮИ ПОЛОВИН ИЗ 80-

-{ ИИ }в11 [ Ш N I { МП {В11 } ИП ! ви

Разделено гмОрионс© 4 3 10 10 в 10 з 3

Получено ПОЛОВИН 6 5 к 17 13 18 6 е

Посажено половин 6 5 15 17 10 18 6 6

Число репшшентов 5 4 12 Ю 6 10 3 3

Стельных решшш- тов 1 и - %) 1-20,0 I -25,0 7-58,3 I -10,0 I -16,7 1-10,0 1-33,3 3 -100,0

Получено телят I I 8 " I I I г 3

9 ГШ числе двойяевых 6 _ г _

ОШВШОВ I I 2 I I I - 3

Прижяввяэмость по-ЛОШГ ЗНОрИОНОВШ 1в,7 20,0 53,3 5,5го 10,0 5,6 33,3 16,7

I « р < 0,001

Таблица 3

Влияние метода деления на приживляемость сважеполучениюс эмбрионов

!_---Методы деления

Показатель ■ ( т —!—1— ■ -¡всего

_-__I_Д т ■ 1 17 -I

Разделено эмбрионов 6 18 13 3 40

Получено половин ' ■ .

(п - %) 3-75,0 30-83,3 23-84,6 6-100,0 67-83,7

Пересажено половин 9 29 19 6 ' 63

Число реципиентов 7 20 II 3 41

Отельных реципиентов

(п.-¡¡Г 1-14,3 в-40,0 2-18,2 1-33,3 1&-29,3

Получено телят I 9 2 • I 13 в том числе

двойяевнх - 6 - - 6

одиниов I 3-2 .1 7

винЖэмбрионовЬС??™0" 11,1 31,0 10,5 16,7 -:20,6

■■, Таблица 4 Влияние метода деления на приживляемостъ эамороженно-оттаянтис вибрионов

Показатель . 1-■ ПтЯ^Л^СТШ ---'Всего

_. I ! ! Д { ДГ ■■ - [ -

Разделено эмбрионов I 2 5 .3 II Получено половин

(а- %) а-100,0 3-75,0 9-- £0,0 6 -100,0 20-90,9

Пересажено половин 2 3 9 6 20

Число реципиентов 2 2 5 3 12 Стельннх гештиен- '

тов (п.- %У 1-50,0 - . - 3-100,0 4-33,3

Получено телят, I - 4 5 в том' числе

двойневнк . - — - .2 2' • ■

одшшов . I % ■■" 3

ПрюксАчясмость половин эмбрионов (3) 50,0 .. . - ./'■ - 66,7 25,1'

■мостьполовин от эамороженно-оттаяшшх эмбрионов вероятно связана о различной интенсивностью использования более щадящего 4-го метода. Так если свежеполученнах вибрионов им было разделено то эеморсоенно-оттаянннх - 27 ? (Р< 0,01). В итоге от пересавки пар половин эамораивнно-оттаяншя амОрионов подучено 100 ^ стель-ностей, а от свежеполученшх - 33,3 ['■■

Несмотря на положительные сторонн 4-го метода, он не око-; соботвует получению максимально допустимого количества идентичных потомков. Недостаточно высокая лреоявляемость го П методе, при относительно большом уровне двойневости, является, скорее • всего. причиной действия субъективных факторов. При вноокой квяди-фикедии оператора и приобретении профессиональных нввнков в техника деления разными методами ети погрешности могут быть устранены.

Относительно способа пересадки бнли предпринята;три варианта! обе половины пересаживали одному реципиенту в одинрог мат- кн кпсллйтерадгннй яичнику с аалгкм телом или в оба маточных рога, половинку лучшего качества — в ипснлатеральннй, худаего *• в контрлатеральный к разним реципиентам по одной - в ипсилатераль-* ныЯ рог матки (табл.5).

Стельность была получена как от-сдаюсторонней трансплантации обеих половик в один маточный рог реципиента (33,3?), так и от пересадки пбловин даум разным реципиентам (39,1 К). Всего 2 стельности (13,3 #), одна из которых привела к рождению двой- -ни, било полученоот билатеральной пвресадки ЗО половин. Уровень. -стельности от односторонней трансплантации половин оказался на 23,5 % выше,' чемпри пересадке двух половин в разные рога матки одному реципиенту (Р<0,05).

. ' Из 53 реципиентов 54,7 % пришли в охоту в срок,; стела сталь-

Таблица 5

Цршшвляемооть половин эмбрионов щщ односторонней и двусторонней пересадке

•Одноотороняяя

Показатель

¡две половины ¡в один рот. [матки

|Двусторонняя ¡две половши

одна половина в один рог [в оба рога матки [матки

Пересажено.половин 30

Число реципиентов 15 .

№ Г™' 5 - 33,3 Получено телят 6

в том числе двойневых одикцов

2 4

БИЯ ЭМбрИОНОВ

х Р < 0,05

20,0

23 23

9 - 39,1х

9

4 Б

39,1*

"30 15

2 - 13,3

3

2 . I

10,0

ными 30,2 % а у 15,1 % эотруо <5)и зарегистрирован через 34-64 дня.

От пересадки воловин эмбрионов разделенных на стадии морулы получены четыре идентичные двойни. Десять реципиентов стали стельными в результате имплантации одинцошх половив.

Всего от пересадки разделенных эмбрионов получено I? телят.

3.2, Пересадка агрегированных зародышей

Назначенные на агрегации вибрионы представляли собой мору-ды хорошего в отличного качества предкомпактной стадии развития состоящие из 6-14 бластомеров.

Химерна эмбриона создавали комбинацией половив внутренних

клеточных шов двух ыя трех разделенных эмбрионов, полученных от доноров контрастных пород. В результате шкромакипуляций из 14 интщсткых ранних ыорул было скшотруировано ? химерных эмбрионов. Огаостороиняя трансплантация их в ипоилатеральный рог матки такому же количеству синхронизированных телок черко-пест-рой порода привела к 3 (42,8 ?) отельноотям, которие закончились отелами.

Две телочки оказались химерами по крови, третья телочка,подученная от трансплантации агрегированных частой клеточных мало трех эмбрионов от доноров черно-пеотрой, ейрвирскоа и симманталь-окой пород - явная химера по окраске коаного покрова. Шсокая приживляемость агрегированных эмбрионов доказывает возможность создания химер крупного. рогатого скота агрегацией ранних морул без использования реципиента-посредника, при, немедленной пересадке их после мккромашшуляций.

З.з. Перенос генов с помотыо микроиньекпий ДНК

9 экспериментах по введению зонированных генов горюна роста быка и человека было использовано 82 эмбриона крупного рогатого скота и 42 эмбриона овец разных стадий развития.

Прижиаляеыость свежеподученных эмбрионов коров в сравнении о замороженно-оттаяшшми после микроинъенций в них ДНК - последовательностей. и непосредственной пересадки реципиентам имела преимущество как в целом по эксперименту (Р < 0,05), так и в отдельных случаях (табл.6).

, Число жизнеспособных морул и бластоцист составило 22,4 и 30,3 . соответственно, при недостоверной разнице между ними.

. Интересным оказался факт большей приышляемосги эмбрионов подвергнутых шкроиньекцаи гена гормона роста быка, чем микро-

-16. Таблица 6

Приживляемость вибрионов крупного рогат огоскота после иихровиьвкпда чужеродных генов * '

Показатель

Mil

I Замороженно- jjfcero

___"Г-оттатние __}

B1I } MIX { B1I [

• С.тдн.шишалйета-йпа

Пересажено вибрионов 13 II , 7 • 4 35

Число реципиентов 8 10 7 . 3 2в

Стельных ташпыген-

tOB^Írí- %) 6-62,5 -. 4-40,0 2 -28,6 - П-39,3

Порчено телят 5. . 4 I '- 10

8вйрвонов'ШЬ . 38,5 36,4 28,6 - 31,4

С уенрм.уорм^ра роста человека- '

Пересажено вмбрио- ^ 15. ? 3' 47

Число реципиентов 17 15 7 3 -." ' 42

Стельных ■реципиентов I) Э-17,6 6-40,0 1-14,3 - 10-23,8

Получено телят 2 I - ■ в

, 13,6 40,0 14,3 - ч 21,3

Приживляемомь вибрионов (%)

инъекции гена гормона роста человека» .

Центрифугирование II оплодотворенных яйцеклеток (15000 в , 3 шн) для выявления про нуклеусов не оказало отрицательного влияния на их жизнеспособность, Сйша из них с инъекцией гена гормона роста человека после 24-часового культивирования la vitro прижилась и развилась в нормальный плод. .

В результате одно— и двусторонних пересадок 70 реципиентам получека 21 стельность, что составило 30,0 %. Причем, ни одна яэ

билатеральных пересадок не привела к желаемому результату, три стельности закончились абортами на 5 к 7 месяце. Один теленок родился мертвим, две телочки погийли на первом меояце жизни. Сохранность телят составила 82 и 60 ? о инъекцией гена горяона роста быка » 'человека, соответственно.

Из 42 вятй-шестидяевныхвибрионов овец 13 модул пересадили' непосредственно поола Микроинъекций гена гормона роста бниа двум реципиентам £ оба маточных рога ао Э эмбриона в каждый. - Пять таких ыорул прошлись к развились в аортальное потомство (38,5 %). Оотальные емйрионы после инъекций были1 заморожены в жидком азоте. Поаяе оттаивания и оценки качеотва, годными к пересадка оказалась 23 (79,3 %), в тоычп&яе 19морул я 4 йлаотоцистн,которые били пересажены пяти реципиентам;, Суягтми отали две овцематку которые окотились пятью ягнятами. , .

. Уровень приживляемости свежеполучешшк эмбрионов бил вше заморояенно-оттаянных, однако разница оказалась недостоверной.

3.4. ¡Еитактериотика тантмтпя животных ролученных от папе-' . ляпни ацдрионов. подваргнутих Микромю-яюш« дужегюд-

' ШОШ : . .

Изучение интенсивности роста животных осуществляли взвешиванием: телят-помесячно, ягнят-ежедекадно ^ *

Изучение динамики роста овец показало, что из 10 полученных ягнят два животных (баранчики * 5 к * 6) росли в течение першее шести, месяцев жизни значительно быстрее остальных, развивавшихся на одном уровне, в результате чего ока скорее достигли половой эролости. . "■*

■■ Подробный'анализ результатов взвешиваний.показал, что баранчик Л 5'имел преимущество по сравнению о сябсами и полусиб-:

- 18 - • ■ ' сами sa счет наибольшей живой иаосы ори рождении и высокого темпа роста в первый месяц жизни. в последующих двух месяцах его относительный прирост Сил незначителен и меньше среднего показателя по группе. -Выпаивание сернокислого топка в двухме- ' сячнои возрасте не оказало никакого воздействия на интенсив-., нооть* развития животного.

При небольшой живой массе щи рождении баранчик К $ В первый месяц жизни имел 251. г среднесуточного прироста, что в два раза дольше среднего показателя по группе. В конце третьего месяца жизни интенсивность роота достигла наивысшего уровня, а живая масса в 1,6 раза превышала живу» маосу сверстников. На 4 месяце относительный прирост уменьшился о 58 до 26 %, а к полуго-: довел ому возраоту отал меньше среднего показателя по груше. В 6-месячный период его относительный прирост был на 50 % выше показателя сябоов в полусийсов. С возрастам различия вмасое постепенно уменьшались И к годовалому возраоту исчезли полностью. Таком образом, ускорение роста барана * 6 имело временный характер и найлвд&дось только в молодом возрасте.

У двух из 10 ягнят рост был сильно заторможен. Один баранчик погиб в возрасте I месяца, а ярочка была в 2-3 раза меньше своих сверстниц. Потомки второго поколения, полученные естественной случкой овец рожденных из эмбрионов с чужеродной ДНК не проявили никаких отклонений.'

У телят повышенной интенсивности роста не обнаружено. Некоторые животные отставали в развитии, однако в возрасте 8-10 месяцев они достигали той же живой массы, что и обыкновенные Трансплантаты.

4. ВЫВОДЫ

1. На пряживляемость половин вибрионов оказывает отчетливое влияние качество половин полученных в результате деления. Получено 57,9 % стельности после пересадки половин отличного к 15,4 % хорошего качества, 12,5 % - условно годных.

2. Раздвлетае шбрионов о использованием четырех методов ■' обеспечивает приблизительно одинаковые результаты приживляемоо-ти половин ембртопов при вехирургической пересадке. Решающее значениепри, этом имеет дифференцированный подход в выборе ник-рохирургичеоках инструментов для делении эмбрионов разных стадий развития. •

3. Деление эмбрионов внутри зоны пеллидда без извлечения половин нецелесообразно, так как не способствует довышешш уровня стельности на одного донора, а случаи образования монозиготных двоен носят непредсказуемый, случайный характер.

4. Различия в жизнеспособности между двумя половинами одного . эмбриона увеличиваются о повышением разница в объеме половин. Осторожная техника деления, минимальные клеточные,потерн, . получение сиидетричных половин, отсутствие деструкции их внутренней- клеточной массы и пикиотических клеток - основное условие успешной прижлвляемости в матке реципиента после пересадки.

: 5. Двойная пересадка половин о использованием дегенериро-ванного .'вибриона или разрушенной половинки способствует усилению эмбрионального сигнала и повыше: ого уровня приживляемости по-,, ловив. ;. .

6. Для достижения приемлемых результатов при трансплантации разделенных и агрегированных эмбрионов реюаицее значение имеет освоение оборудования л постоянная тренировка оператора.Создание

химерных животных крупного рогатого окота возможно агрегацией половин и отделышхклеток ранних морул.

7. Введение чужеродных генов в эмбрионы коров и овец, как свежеполуче кшв так в заыороженяо-оттаянные,' а такжекриокон-сервирование зародышей после мшгроинъекций не снижает их жизнеспособность.

5. ПРШИЧВСКИЕ ПЩ1ШШШ

I. Дня разделения вибрионов рекомендуется использовать ранние и поздние морулы (6,5-7 дней), для агрегации - ранние морулц (5-5,5 дней).

Применять для этой цели микроножи о металлическим лезвием и подсадку половин в пустые зоны деллюцида на микроманипуляторе.

По теме диссертации опубликованы следующие работы;

1. Клецко H.H., Мадич A.B. Получение идентичных телят -- двоен от пересадки половин эмбрионов // Докл.' ЕАСШИ.-М., . 1988,- * 12.- С.22-24. ' . ' '

2. Кяецио Н.Г,, Мадич A.B. Основы микроманапуляцай .овибрионами животных // Еюл,научн.работ ВИЖа,- внп.ВЭ.-Дубровицн, 1988.- С. 44-47.

3. Кледао Н.Г., Мадич A.B. Разделение шбрпонов крупного ; рогатого скота и их трансплантация о цель» получения ноноэигот-ных близнецов // Состояние и перспективы развития биотехнология в животноводстве: Тез.докл. Республ.ваучн.кадф.-¿[врьков,1938,-С.77-78.

4. Ыадзгч А.Б. Некоторые вопросы техники' шкроыатшулявдЯ

с вибрионами животных // Разработка методов Сиоинженеряив ли- ■

вотноюдотве для сове pueнствовалия продуктивных в технологически! качеотв сельскохозяйственных хивотвт Иатер^лы 71 конференции иоигодыхученых.-Лвшшгред,1987,-<!.45-46.

5» Ыадич A.B. Методы микрохирургического деления вмЗрио-нов крупного рогатого окота,- Инфодеашонннй лноток Л 414-68. 'ЫособлЦНТИ, 1988.

6. МадичА.В. Инъекция чужеродных генов в шйряоны янвот-ных.- №$орЮДконныЙ леоток Л 415-88. ЫоооблЩГИ, 1988,

Д - 32056.Подписано в печать 17.01;89г. Заказ. 1087 Формат 80x84/15 Тираж 100 Ротапринт

Москва .Б.Харитоньевский пер. ,21. Типографи ВМШШК,