Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ВОСПРОИЗВОДСТВА МОЛОЧНОГО И МЯСНОГО СКОТА

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ВОСПРОИЗВОДСТВА МОЛОЧНОГО И МЯСНОГО СКОТА"

Я-ЗЗЗЧд

На правах рукописи

БЛБЕНКОВ ВЛАДИМИР ЮРЬЕВИЧ

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ВОСПРОИЗВОДСТВА МОЛОЧНОГО И МЯСНОГО СКОТА

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Дубровицы - 2004

Работа выпоЛнена во Всероссийском государственном научко-нсследовательском институте животноводства.

Научный консультант - Заслуженный деятель яауки Российской Федерации, доктор биологических наук, профессор Ю-Д.Клннскнй.

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук,

профессор Марзанов Н.С.;

- доюор биологических наук, профессор Ерохян А.С.;

- доктор биологических наук,

Рябых В. П.

Ведущее учреждение - РАМЖ

Защита диссертации состоится" У- ^ 2004 г. в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д 006.013.01 во Всероссийском государственном НИИ животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровины, ВИЖ

С щхертвцней можно ознакомиться в научной библиотеке

ч_ ..

V

Авторсфср

Учет' .

диссертационного

канд. биол. наук ( * В. П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В результате углубленных исследований в области эмбриологии млекопитающих стало возможным внедрение в практику воспроизводства сельскохозяйственных животных метода трансплантации эмбрионов, как важнейшего средства ускорения качественного улучшения и более полного использования генетических ресурсов маточного поголовья молочного н мясного скота.

В биотехнологии ускоренного размножения высокоценных племенных животных трансплантация эмбрионов является наиболее апробированным на практике, методом. Подтверждением этому служат успехи в создании высокопродуктивного молочного скота в странах Северной Америки и Европы, где до 70% быков-производителей, используемых для качественного улучшения стада, получены путем пересадки зародышей. Тем не менее, потенциальные возможности трансплантации эмбрионов в практике воспроизводства используются далеко не полностью.

Среди основных причин недостаточней реализации метода являются такие факторы экономического характера, как высокая стоимость работ, низкие цены на племенной скот, ограниченные ресурсы высокопродуктивных животных, а также многие биологические и технологические факторы, связанные с эффективностью использования метода в условиях производства.

В технологии трансплантации эмбрионов индукция полиовуляцни является звеном, от эффективности которого в большой степени зависит конечный результат. В этой области накоплен обширный материал. До настоящего времени вызывание суперовуляции остается нестабильным и малоизученным вопросом. Большое практическое значение имеют разработки упрощенных схем гормональной обработки, поиск надежных и эффективных веществ пролонгирующего действия.

Эффективность практического применения метода трансплантации эмбрионов существенно возрастает при использовании высокопродуктивных коров в качестве доноров эмбрионов в несколько раз в год. Однако данные о влиянии на реакцию яичников н состояние матки коров многократных гормональных обработок и повторных процедур извлечения эмбрионов носят разноречивый характер.

Результаты многочисленных исследований показывают, что основным недостатком инструментов, используемых для пересадки эмбрионов, является определенный предел доступной глубины рога матки вследствие его кривизны. По мнению многих исследователей, при иехирургнческой пересадке верхушка рога матки, недоступная для катетера Кассу, хотя она является наиболее оптимальным местом для аппликации зародыша [Critser J.K., Rowe R.F., 1979, 1980; Newcomb R., 1985; Овчинников A.B., 1985 и др.]. Поэтому дальнейшие разработки инструментария и сопутствующих технологических фрагментов по-прежнему остаются актуальными.

Одним из резервов увеличения производства молока и мяса является

повышение выхода

биотехнологи чески м и

методами. Несмотря на потенциальные экономические возможности, объем исследовании по получению двоен и межпородной пересадке у крупнопо рогатого скота изучен недостаточен.

Существенный прогресс достигнут 6 области криококсервировання эмбрионов. Однако жизнеспособность эмбрионов после крноконсервации существенно снижается. Поэтому большое значение имеет решение ряда вопросов, связанных с обеспечением стабильности получаемых результатов, поиск новых, менее токсичных и эффективных криофилактиков, упрощение технологии крио- и деконсервацин применительно к условиям производства.

Внедрение метода трансплантации эмбрионов в практику вызвало необходимость более глубокого изучения ряда проблем, связанных с такими важными разделами молекулярной биологии и генетики, как клеточная и генетическая инженерия, которые являются основой новых направлений в биотехнологии. Сегодня направлениями, наиболее приближенными к использованию в производстве, являются определение пола эмбрионов на предимплантацнонной стадии развития, микрохирургическое разделение бласгомеров с целью получения монозиготных близнецов и получение ранних эмбрионов на основе экстракорпорального оплодотворения ооцнтов коров.

В решении проблемы определения пола достигнуты лишь незначительные успехи, что ограничивает их практическое применение. В последние годы в литературе появились сообщения об усовершенствовании метода определения пола на основе гибридизации ДНК Y-хромосом в степени, достаточной для использования s производстве, но имеющиеся данные крайне ограничены и не подтверждены исследованиями в странах СНГ.

Одним из перспективных биотехнологических приемов является проведение микрохирургических манипуляций с доимп лактационными эмбрионами млекопитающих. Однако методы, используемые при микрохирургии зародышей, остаются сложными, трудоемкими, требующими специального дорогостоящего оборудования и поэтому их применение на практике ограничено. Необходимы дополнительные исследования, направленные на упрощение существующей процедуры разделения.

В последние годы во всем мире большое внимание исследователей уделяется разработке принципиально новой биотехнологии, сочетающей использование трансплантации эмбрионов, культивирование и оплодотворение ооцнтов in vitro. Это позволит более интенсивно использовать в воспроизводстве высокоценных племенных коров, резко увеличить генетический прогресс в популяции на основе повышения потенциала гамет в расчете на одну племенную корову и достоверной оценке генотипа [Завертяев Б.П., 1987]. Несмотря на существенные результаты, достигнутые в работах по получению эмбрионов in vitro, многие проблемы, в частности культивирование ооцнтов и зигот из-за, значительного снижения приживляемости развившихся эмбрионов, по сравнению с эмбрионами, полученными in vivo, остаются нерешенными.

Цель и задачи исследований. С целью разработки к апробации в условиях сельскохозяйственного производства новых биотехнологическнх методов

интенсификации воспроизводства молочного и мясного скота были поставлены следующие задачи; ( (

- изучить эффективность различных гонадотропинов и разработать способ стимуляции суперовуляции путем пролонгирования действия гипофизарных гонадотролннов;

усовершенствовать способы и разработать устройства для нехирургического извлечения и сбора эмбрионов;

- разработать устройство и усовершенствовать технику нехкрургической пересадки эмбрионов;

- определить эффективность межпородной пересадки эмбрионов для ускорения воспроизводства менее распространенных пород и различных способов получения двоек;

• изучить возможность использования пересадки эмбрионов в качестве биотехнического метода борьбы с бесплодием у коров с нарушениями воспроизводительных функций;

- усовершенствовать способы замораживания-оттаивания эмбрионов на основе использования новых криофнлакгиков и определить влияние породных отличий на результаты криоконсервации;

- установить достоверность определения пола на основе анализа ДНК Y-хромосом и определить влияние биопсии зародышевых клеток н процессов замораживания-оттаивания на выживаемость эмбрионов с определенным полом;

- разработать способ и устройство для микрохирургического разделения эмбрионов при получении монозиготных двоен в производственных условиях, изучить возможность разделения деконсервированных эмбрионов;

- усовершенствовать метод и определить жизнеспособность свежих и деконсервированных эмбрионов, полученных в условиях in vitro.

Объект и предмет исследования. Коровы-доноры эмбрионов, телки-реципиенты, эмбрионы, ооцнты, телята и первотелки-трансплантаты. Вещества, способы, устройства для повышения эффективности индукции суперовуляции, извлечения, разделения, пересадки и криоконсервирования биоматериала.

Научная новизна. В результате многолетних исследований на большом фактическом материале теоретически обоснованы, разработаны и апробированы в условиях производства новые биотехнологические методы интенсификации воспроизводства крупного рогатого скота различного направления продуктивности.

Разработан способ гормональной стимуляции суперовуляции путем пролонгирования действия препаратов ФСГ (приоритетная справка на выдачу патента на изобретение по заявке № а20020647 от 23.072002г., опубл. 30.03.2003 г., бюл, № 1), устройства для нерургического извлечения (патент № 1792327) и фильтрации эмбрионов (а.с. № 1704775), В целях повышения приживляемое™ эмбрионов и упрощения техники пересалки сконструирован телескопический катетер для глубокой аппликации эмбрионов (а.с-№ 1796171),

Доказано отсутствие отрицательного влияния породных отличий эмбрионов при межпородных пересадках на 5 породах крупного рогатого скота

н высокая эффективность различных способов получения двоен. Показана возможность сокращения бесплодия высокопродуктивных коров с нарушениями воспроизводительных функций путем пересадки эмбрионов.

Повышена эффективность криоконсервацни эмбрионов на основе применения нового криопротектора дисахарида трегалозы. Установлено влияние породных отличий эмбрионов на результаты криоконсервацни.

Установлена высокая степень достоверности опрелеления пола ранних эмбрионов методом, основанным на анализе ДНК У-хромосом. Доказано незначительное отрицательное влияние микробиопсии зародышевых клеток и процессов замораживания-оттаивания ка жизнеспособность эмбрионов с определенным полом. Отмечено увеличение частоты рождения монозиготных двоен после пересадки деконсервированных эмбрионов с определенным полом (9,4%), связанное с фактором самопроизвольного разделения эмбрионов в процессе эмбриогенеза, что представляет большой практический интерес.

Разработан упрощенный способ микрохирургического разделения эмбрионов в условиях производства и специальное устройство для его реализации (а.с. X® 1727819). Доказана возможность эффективного разделения деконсервированных эмбрионов.

Разработано устройство для культивирования ооцитов и эмбрионов крупного рогатого скота (патент № 1822341).

Усовершенствован метод и определена эффективность трансплантации свежих н деконсервированных эмбрионов коров, полученных на основе экстракорпорального оплодотворения ооцитов.

Практическая значцмрсть работы. Теоретически и практически обоснованные разработки новых биотехнологических методов позволяют оптимизировать их широкое и эффективное использование в интенсификации воспроизводства молочного и мясного скота.

Разработанный способ гормональной стимуляции полиовуляцин путем однократного введения ФСГ с пролонгатором позволяет отказаться от трудоемкой 8-10-кратной обработки животных при повышении выхода качественных эмбрионов на 7,5-15,2%. Способ нехирурги чес кого извлечения эмбрионов обеспечивает эффективность извлечения до 79,5%, что превышает аналогичные показатели при извлечении известными методами на 6,7 и 7,7% соответственно. Устройство для извлечения повышает выход эмбрионов на 13% по сравнению с использованием катетера "Нойштадт", Устройство для фильтрации эмбрионов исключает их потери, в 2-3 раза сокращает трудоемкость процесса поиска и время нахождения эмбрионов вне организма.

Прн нехирургической аппликации эмбрионов в верхушку рога матки с помощью разработанного устройства приживляемость свежих и деконсервированных эмбрионов повышается на 19, Зи 13,8%, соответственно.

Межпородная пересадка эмбрионов, изученная на 5 породах, обеспечивает средний уровень стельности 55,6%, в том числе при пересадке свежих эмбрионов 62,1%, деконсервированных - 50,4%, что не уступает внутрипородной пересадке н дает реальную возможность ускоренного

размножения редких и ценных пород скота, а также повышения мясной продуктивности молочного стада без увеличения поголовья коров. i

Пересадка ранних эмбрионов может быть предложена как биотехнический метод борьбы с бесплодием высокопродуктивных коров - стельность после однократной пересадки дековсервированных эмбрионов составляет 33,3%.

При использовании нового криопротеетора дисахарида трегалозы прижквляемость деконсервированных эмбрионов повышается до 54,3%, что сравнимо с пересадкой свежеполученкых эмбрионов (56,0%).

При пересадке эмбрионов на стадии морулы бычков рождается на 9,2% больше, чем при пересадке бластоцист, что установлено и теоретически обосновано в результате аналитического исследования.

Установлен высокий уровень достоверности определения пола ранних эмбрионов на основе анализа ДНК Y-хромосом (93,8%); доказано, что отрицательное влияние микробиопсии зародышевых клеток и процессов замораживаяия-еттаивания на жизнеспособность эмбрионов с определенным полом минимально (9,3%) и метод с высокой эффективностью может быть использован в производстве.

Предлагаемый способ и разработанное устройство для микрохирургического разделения эмбрионов позволяют проводить дисекцию в условиях производства без применения специального оборудования при 50%-й лриживляемостн демиэмбрионов, что позволяет получать одного теленка на каждый использованный эмбрион (100% эффективности использования эмбриоматеркала).

При получении эмбрионов in vitro использование разработанного устройства для культивирования позволяет повысить уровень дробления зигот и выход эмбрионов до 54,8 и 33% соответственно, по сравнению с применением эксикатора (23,1 и 10,5%). В технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота путем оплодотворения in vitro достигнут уровень созревания ооцитов до стадии оплодотворения 43,4% и выход биологически полноценных эмбрионов на стадии развития морула-блаегоциегга до 33% с лрижнвляемостью 34,0-50,0% при пересадке свежих и 33,3-39,1% после замораживания-оттаивания.

Впервые сравнительные научные исследования проведены на б породах крупного рогатого скота различного направления продуктивности, в ходе экспериментов получено более 1300 телят-трансплантатов б пород, в том числе 277 двоен, 56 телят после пересадки половин разделенных эмбрионов, из них 11 пар монозиготных близнецов, 35 телят с определенным полом и 51 теленок, в том числе 12 двоеи после пересадки эмбрионов, полученных in vitro. Созданы стада и группы высокопродуктивного черно-пестрого, абердин-ангусского, симментальского, герефордского и лимузинского скота. На республиканский элевер поставлено более 200 генетически ценных бычков-трансплантатов 6 пород, полученных биотехнологическим путем, для использования в широкомасштабной селекции.

s

В 1987 г. по разработанному нами проекту был создан Брестский областной центр! трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота (приказ Брестского областного агропромышленного Комитета № 358 от 7Л2.1987 г.).

Научная новизна и практическая значимость исследований подтверждены 3 авторскими свидетельствами, 2 патентами на изобретения и 3 рационализаторскими предложениями. Получена приоритетная справка на получение патента на изобретение пролонгирования действия ФСГ (2003, бюл. №1,с. 16).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета Брестской областной государственной с.-х. опытной станции (Пружаны, 1988-1993); республиканских конференциях: "Интенсификация производства в отраслях агропромышленного комплекса на основе использования методов биотехнологии'' (Минск, 1989), "Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота" (Жодино, 1989), "Биотехнология и воспроизводство в животноводстве" (Горки, 1991): расширенном заседании отдела биотехнологии БелНИИЖ (Жодино, 1993); межгосударственных научно-практических конференциях: "Генетнко-сеяекционные и технологические проблемы разведения сельскохозяйственных животных" (Киев, 1994), "Селекционно-генетические и би»технологические проблемы разведения крупного рогатого скота" (Брест, 1995), "Новые методы селекции и разведения высокопродуктивных пород и типов животных" {Киев, 1996); международных конференциях: "Научные основы интенсивного развития животноводства" (Горки, 1995), "Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства" (Горки, 1996), "Использование трансплантации эмбрионов в селекции и разведении сельскохозяйственных животных" (Аскания-Нова, 1997), "Конкурентоспособное производство продукции животноводства в республике Беларусь" (Жодино, 1998), "Сельскохозяйственная биотехнология" (Горки, 1998, 2001). "Интенсификация производства продуктов животноводства" (Жодино, 2002); заседании научной конференции международного общественного объединения "Восток-Запад" (Минск, 2003).

Реализация результатов исследований. Исследования проведены в 19862003 г.г. в рамках республиканских научных программ: "Межотраслевая комплексная республиканская программа по приоритетным направлениям развития агропромышленного комплекса" (ВКГОКП № госрегистрации 01.8601311552), "Трансплантация эмбрионов в животноводстве Республики Беларусь на 1993-2000 г.г." (ВКГОКП № 1997482); областных программ по развитию животноводства в период с 1990 по 2003 г.г.. Основные положения и практические предложения использованы при подготовке 4 методических рекомендаций. Результаты научных исследований внедрены и используются в лаборатории по трансплантации эмбрионов РСУП "Брестплемпредпрнятие", госплемзаводах и племхозянствах "Луч", "Дружба", "Мухавец", "Видомля", "Закозельскин", колхозах "Советская Белоруссия", "Молодово", "Октябрь", "Красная звезда" Брестской области, СПК "Агрокомбннат "Снов" и УП "Агрокомбннат "Ждановичи" Минской области.

.За работу "Внедрение и практическое использование биотехнологии трансплантации эмбрионов в племенном скотоводстве" в< 1987 г. присувдека иремия МК ВЛКСМ, МОС НТО и МОС ВОИР в области науки, техники, производства и педагогической деятельности.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

- эмбриопродуктивность коров-доноров различных пород;

- стимуляция суперовуляции у коров-доноров одной инъекцией препаратов ФСГ с пролонгатором;

- эффективность длительного использования в качестве доноров эмбрионов коров различного направления продуктивности;

- разработка технологических аспектов повышения эффективности нехирургического извлечения эмбрионов;

• зависимость прнживляемости от места аппликации эмбриона в роге матки и специальное устройство для трансцервикальной пересадки;

- межпородная пересадка и получение двоен;

- влияние криопротектора и породных отличий эмбрионов на их жизнеспособность после деконсервировацнн;

• достоверность определения пола на основе анализа ДНК Y-хромосом;

- разработка метода разделения эмбрионов при получении монозиготных близнецов в применении к условиям производства;

- жизнеспособность свежих и деконсервированных эмбрионов, полученных путем экстракорпорального оплодотворения ооцитов коров;

Отбяикованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 48 научных работ, из них 3 авторских свидетельства, 2 патента на изобретения, 1 приоритетная справка на получение патента н 1 рекомендация. Материалы научных исследований были использованы при разработке 4 методических рекомендаций: "Технология трансплантации эмбрионов в молочном и мясном скотоводстве" (Жодино, 1996, 34 е.); "Криоконсервирование эмбрионов крупного рогатого скота" (Жодино, 1997, 19с.); "Биотехнология воспроизводства крупного рогатого скота на основе оплодотворения ооцитов коре« вне организма {in vitro)" (Жоднно, 1999, 15 е.); "Технология получения эмбрионов крупного рогатого скота вне организма (in vitro) н долговременного их хранения" (Жодино, 2001,17 с.).

Объем и структура диссертаиии. Диссертация изложена на 234 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования н их обсуждения, практических предложений производству, списка использованной литературы и предложений производству. Диссертация содержит 55 таблиц а 49 рисунков. Список литературы включает 494 источника, из которых 282 иностранных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

*

Научные исследования проведены в 1986-2003 годах во Всероссийском НИИ животноводства, Брестском областном центре трансплантации эмбрионов "Майск", областной лаборатории трансплантации эмбрионов РСУП "Брестплемпредприятие", госплемзаводах "Луч", "Дружба", "Нача", п л ем совхозах "Закозельский", "Мухавец", "Видомля", колхозах "Советская Белоруссия", "Октябрь", "Молодово" и "Красная звезда" Брестской области, госплемзаводе "Россь" Гродненской и агрокомбкнатах "Снов" и "Ждановичи" Минской областей, а также в ряде хозяйств б областей Украины. Лабораторная часть исследований по новым направлениям биотехнологии проводилась совместно с лабораторией племпредприятия RPN (г.Ферден, Германия).

В качестве доноров многократно использовали 580 клинически здоровых нелактирующих коров б пород различного направления продуктивности в возрасте 4-10 лет: черно-пестрый молочный скот (голштины) с удоем по наивысшей лактации 6189-11407 кг молока с содержанием жнра 3,63-4,82%, молочно-мясные симменталы с продуктивностью 5246-7429 кг молока жирностью 4,02-4,79 %, мясные породы - абердин-ангусская, гереф орд екая, шаролезская и лимузинская. В качестве реципиентов - черно-пестрые телки случного возраста с живой массой 340-400 кг.

Для стимуляции суперовуляцни использовали гипофизарные гонадотропины 4-х типов: фоллитролин (Литва), ФСГ-супер (Россия), ФСГ-п (США), Фоллнкотропин (Чехия).

Гормональную обработку коров-доноров проводили по 4-дневным схемам путем 8-кратного введение препаратов в убывающих дозах с интервалом 12 часов, начиная с 9-12 дня астрального цикла, с последующей инъекцией аналогов простагландина F2c< н 3-кратным искусственным осеменением.

Проведены исследования по пролонгированию действия ФСГ-супер и ФСГ-n с помощью поливинилового спирта (ПВО) (в качестве лекарственного вещества используется, например, в крове- и плазмозаменителях).

Всего было проведено 136 обработок. Полученные результаты сравнивали с обработкой препаратами ФСГ в дозе 50 мг без ПВС при 8-кратном введении (179 обработок).

Извлечение эмбрионов проводили нехирургичесетш путем на 7-8 день индуцированного полового цикла. При извлечении использовали двухканальные катетеры производства фирмы "Нойштадт" (Германия) и разработанное нами телескопическое устройство.

При этом применяли 3 способа извлечения: 1 - порционно с помощью цгарнцов Фоллея объемом 60 мл; 2 - самотеком через замкнутую систему латексных трубок; 3 - разработанной нами системой, позволяющей в процессе вымывания регулировать объем вводимой среды в зависимости от индивидуальных размеров рога матки.

Бнотехнологические методы интенсификации воспроизводства крупного рогатого скота

Рис Ь ОБЩАЯ СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве промывной среды применяли сбалансированный солевой раствор Дюльбекко с добавлением сыворотки крови теленка или бычьего альбумина и антибиотиков в общем объеме от 150 до 400 мл на один рогматкн.

Извлеченная среда пропускалась через фильтры: эмбриоконцентратор (Германия) с размером ячеек менее диаметра эмбриона и разработанной нами конструкции.

Среда из фильтров в поисках эмбрионов просматривалась под бинокулярным микроскалом при 60-кратном увеличении в чашках Петри! с разлинованным дном. Эффективность извлечения оценивалась по числу вымытых зародышей относительно реакции яичников. В общем объеме исследований проведено 978 нехирургических извлечений, получено 7568 зародышей, из числа которых 4685 пригодных для трансплантации. Качество эмбрионов определяли по морфологическим признакам в соответствии с Инструкцией ВИЖ [1984] и Руководством для работы по пересадке эмбрионов П.Кауффольда, И.Таммз и др.[1990].

Пересадку эмбрионов проводили ректоцервикальиым методом металлическим катетером производства фирмы "Нойштадт" (Германия) н сконструированным нами специальным гибким устройством.

В общем объеме исследований было проведено 3072 пересадки свежими и замороженно-стгтаяиными эмбрионами.

При межпородной пересадке использовали эмбрионы 6 пород: черно-пестрой, симментальской, абердин-ангусской, герефордской, шаролезской и лимузинекой. Реципиентами служили телки черно-пестрой породы.

При получении двоен, помимо внутри породных пересадок, в экспериментальных целях был проведен ряд трансплантаций разнопородными эмбрионами, в том числе пересадки двух эмбрионов различных пород одному реципиенту. Всего биотехнологическим путем было получено 274 двойни и 3 тройни.

Совместно с племпредпрнятием ИРЫ (Германия) был проведен эксперимент с целью установления степени достоверности метода определения пола 6-8-суточных эмбрионов, основанного на гибридизации ДНК У-хромосом, а также влияния микробиопсии зародышевых клеток и процессов крио- и деконсервацнн на жизнеспособность эмбрионов с определенным полом. В процессе эксперимента было осуществлено 87 пересадок и получено 35 телят с заведомо определенным полом.

При получении монозиготных двоен путем микрохирургического разделения ранних эмбрионов использовали 2 метода: 1 - простейший, усовершенствованны Й в отдельных элементах, с применением микроманипулятора и одного инструмента - микроножа, изготовленного из режу шей кромки лезвия безопасной бритвы; 2 — разработанный нами принципиально новый метод, по технике исполнения максимально приближенный к условиям производства.

При использовании 1 метода эмбрионы разделяли в капле среды Дюльбекко без сыворотки крови, что создавало электростатическое поле между зоной пеллюцида эмбриона и дном пластиковой чашки Петри. При этом условии эмбрион не выскальзывает из-под ножа в процессе разделения -отпадает необходимость использования второго инструмента, - микроприсоски для фиксации эмбриона.

Для осуществления 2 метода было разработано специальное устройство -тонкий стеклянный капилляр, через который эмбрион стеклянной нитью проталкивается к режущей кромке микроножа, расположенного у выходного

отверстия капилляра и простым надавливанием рассекается на две равных половины. Использование устройства позволило существенно упростить процедуру, исключить применение мнкроманипулятора и проводить дисекцию эмбрионов в условиях ферм.

Всего в экспериментах было разделено 90 эмбрионов, получено после культивирования 160 пригодных демиэмбрионов, проведено 92 пересадки и получено 56 телят, в числе которых 9 пар монозиготных близнецов.

Совместно с немецкой фирмой RPN были проведены исследования по экстракорпоральному оплодотворению ооцитов коров и получению ранних эмбрионов "in vitro". Для этого использовали фолликулярные ооциты, выделенные из антральных фолликулов яичников коров, убитых на мясокомбинате. Культивирование полученных ооцитов проводили в синтетической питательной среде ТС-199 с эстральной сывороткой КРС (5%), бычьим сывороточным альбумином (5мг/мл), гентамицином (50мкг/мл) и гормональными добавками (ФСГ, ЛГ, эстраднол). Ооциты культивировали в чашках Петри под слоем минерального масла в эксикаторе и в опытном образце разработанного устройства в условиях 5% СОг при рН 7,3-7,5 и температуре 3$,5°С в течение 24 часов.

Оплодотворяли ооциты в период достижения ими стадии мейоза метафазы 2 заморожен но-оггаян ной спермой (после капацнтацин сперматозоидов) в стандартном растворе Тироде (Sigma) с добавлением бычьего сывороточного альбумина, гентамицина и пирувата натрия в чашках Петри с лунками под минеральным маслом в течение 18-20 часов. После совместного культивирования со сперматозоидами яйцеклетки отмывали в среде для культивирования и помещали в среду для культивирования эмбрионов (среда ТС-199 с 20% фетальной сыворотки КРС и 50 мкг/мл гентамицина).

Эмбрионы, развившиеся в культуре до стадии морулы-бластоцисты, пересаживали реципиентам или подвергали глубокому замораживанию с последующей деконсервацней и пересадкой.

В ходе экспериментов было получено 1680 ооцит-кумулюсных комплексов от 57 коров, убитых на мясокомбинате. До стадии морулы-бластоцисты развилось 289 ооцитов. В общем объеме исследований осуществлено 114 пересадок эмбрионами, полученными "in vitro", родился 51 теленок, в том числе 12 двоен, из которых одна монозиготная.

В исследованиях по крноконсервированию использовали эмбрионы, полученные от хоров-доноров б пород: молочные черно-пестрой, молочно-мясные симментальской, мясные абердик-анрусской, герефордской, шароле и лимузинской. Перед замораживанием проводили 3-ступенчатую эквилибрацию эмбрионов в растворах глицерина (ГЛ) возрастающей концентрации (3,3 - 6,6 -10%). Замораживание проводили на программном замораживатепе ЗЭМ-4 (Украина) в режиме охлаждения от 20°С до -36°С со скоростью охлаждения от 1,0 до 0,3°С/мнн и спонтанным сидингом при -7°С в течение 2 минут, затем в контейнерах переносили в жидкий азот при -196°С.

Был также использован метод криоконсервации с использованием в качестве криопротектора эти ленгли коля (ЭГ): эмбрионы одноотапно

выдерживали в 1,5М растворе ЭГ в течение 5-10мни и замораживали в режиме охлаждения от -6 до -36°С со скоростью 053°С/мин с последующим переносом в азот.

Деконсервацию эмбрионов проводили в два этапа: Юсек на воздухе и 20сек в водяной бане при температуре 25°С. При замораживании в ГЛ криопротектор удаляли 4 способами; 1 способ — 3-ступенчато в растворах ГЛ убывающей концентрации; 2 способ - 4-ступенчато в растворах ГЛ убывающей концентрации в присутствии 0,ЗМ сахарозы (С); 3 способ, предложенный нами, включал 4-ступенчатую эквилибрацию в растворах ГЛ понижающейся концентрации аналогично 2 способу, но в присутствии нового криофилактика дисахарида трегалозы (ТГ) в 0,ЗМ концентрации (в отличие от сахарозы, молекула которой состоит из 2 остатков - а-О-глюкозы и й-Ц-фруктозы, молекула трегалозы включает 2 остатка а-О-глюкозы); 4 способ - в 1 ступень в 1,0М растворе С в течение Юмин с последующей отмывкой в ФБС. При использовании ЭГ криопротектор не удаляли, пайетты встряхивали н после смешивания содержимого проводили прямую пересадку.

В общем объеме исследований было подвергнуто криоконсервации 2080 эмбрионов и произведено 1240 пересадок эмбрионами после деконсервацик.

Статистическую обработку результатов исследований проводили по методике П.Ф.Рокицкого (1973) с использованием компьютерной техники.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Эмбрнопродуетивность коров-доноров различных пород

Величина индуцированной полиовуляции у животных разных пород различна и зависит от их генетически обусловленной плодовитости и особенностей гормонального статуса. В целом считается, что мясной скот реагирует на введение экзогенных гонадотропннов в большей степени, чем молочный.

В наших исследованиях изучалась эффективность стимуляции полновуляции и получения эмбрионов у коров-доноров 5 пород (табл, I): I группа (п=319) - молочный скот - черно-пестрые голштнны, 2 группа (п=27) -молочно-мясные симменталы, 3 (п=136), 4 (п=55) и 5 (п=43) - мясные породы -абердин-ангусская, герефордская и шаролезская соответственно [26,42,44].

Как показали результаты исследований, симментальский и шаролезский скот лучше других пород реагировал суперовуляцией на введение экзогенных гонадотропннов: 92,6 и 88,4% от числа обработанных животных. В 1, 3 и 4-й группах этот показатель практически не отличался и находился в пределах 78,2 - 80,9%. Самой низкой извлекаемостью отличались коровы абердин ангусской породы. В этой группе было получено 69,6% зародышей от числа овуляций, тогда как в других группах в пределах 75,1-85,2%- Это было связано с тем, что коровы абердин-апгусскон породы отличаются повышенной возбудимостью, подвержены стрессам, слабо реагируют на премндикацию, в связи с чем относительный выход зародышей часто ниже ожидаемого даже но сравнению с молочным скотом.

. Таблица 1

Зависимость результатов суперовуляции от породных | отличий коров-доноров

Показатели Порода коров-доноров

черно-пестрые I симменталы 2 абердян-ангусы 3 гере-форды 4 шароле 5

Обработано коров-доноров, гол. 319 27 136 55 43

Реагировало суперовуляцией, п - % 256-80,2 25-92,6 110-80,9 43-78,2 38-88,4

Положительн.по изв-леч. доноров, п - % 193-75,3 21-84,0 79-71,8 28-65,1 28-73,7

Овуляций в среднем на донора П,5 ±0,68*** 17,0*1,94 11,2±0,55 12,2±1,28 *• 12Д±0,95 »♦

Получено зародышей в среднем на донора 9,4±0,71 ** 14,5±2,31 7,8±0,6 »»« 10,1±1,42* 9,2±1,1**

% от числа овуляций 81,1 85.2 69,6 82.5 75,1

в т.ч.: - пригодных 6,3±0,58 9,3*1,69 5,5±0,48 6,6±1,08 ** 7,0±1,0б +*

в % отношении 67,4 64,1 70,2 65,0 76,7

- дегенерированных 1,0±0,22 1,0±0,43 0,9±0,19 1,9±0,43 1,1 ±0,32

В% 11Д 7,2 11,5 18,7 12,4

- яйцеклеток 2,0±0,26* 4,2±0,89 1,4±0,22 ** 1,6±0,39 *** 1,0±0,3

в % 21,4 28.7 18,2 16,2 10,9

Оплодотворяемость яйцеклеток, % 78,6 71,3 81,8 83,7 89,1

") ______^_

* Р<0,05 ** Р<0,01 ***Р<ЩЮ1

Разница в числе овуляций между 2-Й группой (симменталы) и I, 3, 4 и 5-й группами была достоверной (Р<0,001; 0,001; 0,01 и 0,01) и составляла 17,0 против 11,5; 11,2; 12,2 и 12,2 в среднем на донора соответственно. Средний выход эмбрионов, в том числе пригодных, был также наиболее высоким во 2-й группе - 14,5 и 9,3 против 9,4; 7,8; 10,1; 9,2 и 6,3; 5,5; 6,6; 7,0 в 1, 3, 4, 5-Й группах при уровнях достоверности Р<0,01; 0,001; 0,05; 0,01 н Р<0,01; 0,001; 0,01; 0,01 соответственно.

В то же время, высокий уровень суперовуляции у симменталов сопровождался снижением ошюдотворяемости яйцеклеток до 71,3% по сравнению с другими группами доноров, в которых этот показатель находился в пределах 78,6 - 89,1%. Увеличение числа неоплодотворенных яйцеклеток в группе симменталов по сравнению с 1, 3, 4 и 5-й группами было достоверно выше: Р<0,05; 0,01; 0,001; 0,001 соответственно.

В группе коров-доноров породы шзроле был наиболее высокий относительный выход пригодных эмбрионов: при 7,0 в среднем на донора их

количество от общего числа эмбрионов и яйцеклеток составляло 76,7%, что превышало этот показатель в других группах на 6.5 -12,6%.

В результате проведенных исследований установлено достоверное преимущество симментальского скота комбинированного направления продуктивности канадской селекции по сравнению с молочным и мясным скотом по всем показателям эффективности стимуляции суперовуляции. Высокоэффективным было также использование коров-доноров породы шароле и герефордов. Наименее эффективным, по сравнению с другими породами, было использование коров абердин-ангусской породы. По результатам суперовуляции и выхода зародышей достоверного преимущества коров мясного направления продуктивности перед молочным скотом не установлено.

3.2. Эффективность стимуляции суперовуляцн» при однократной инъекции препаратов ФСГ с пролонгятором

При всех преимуществах гипофизарных гонадотропинов перед плацентарными их существенными недостатками являются трудоемкость обработки и стрессовое воздействие на животное многоразовых инъекций гормонов, в связи с чем поиск эффективных пролонгаторов представляет особый интерес.

Нами на протяжении ряда лет проводились исследования по пролонгированию действия гипофизарных гонадотропинов с помощью полимера поливинилового спирта (ПВС) [4,10,16,33,43].

Опыты проводились на 4 группах коров-доноров. В 1-й (п=89) н 3-Й (п=90) контрольных группах животных обрабатывали ФСГ-супер (Россия) и ФСГ-п (США) соответственно, по классической 4-дневнон схеме путем 8-кратных инъекций препаратов в обшей дозе 50ед. Арморовского стандарта. Во 2-й (пя113) и 4-Й (п=23) опытных группах ФСГ-с и ФСГ-п растворяли в 12%-й суспензии ПВС в физрастворе в полной активной дозе и вводили однократно подкожно с помощью кровобрательной иглы в 10-15 см за хвостовым телом лопатки и в 20-30 см ниже верхней линии хребта животного. Инъекции простагландина и осеменение проводили аналогично 4-дневной схеме.

Как в 1 и 2, так в 3 и 4 группах высокая суперовуляторная реакция была близка иа одном уровне н составляла 84,3 и 36,7% и 91,1 и 91,3% от числа обработанных животных при среднем числе овуляций 133 н 12,4 и 11,8 и 14,2 соответственно (табл. 2).

Выход эмбрионов и яйцеклеток в среднем на донора в 1 и 2 группах, где использовался ФСГ-супер практически не отличался — 10,8 и 10,5 соответственно. Однако среднее число пригодных эмбрионов в опытной группе было больше, чем в контрольной на 1,4 (8,1 против 6,7). Качество эмбрионов достоверно (Р<0,001) повышалось (на 15,2%) за счет высокодостоверного (Р<0,001) увеличения оплодотворясмости: количество неоплодотворекных яйцеклеток в опытной группе было меньше, чем в контрольной на 12,2% при Р<0.05. В процентном отношении от общего числа зародышей количество дегенерировалиых эмбрионов и иеоплодотво репных яйцеклеток в опытной

группе снижалось: 6.7 и 16,1% против 9,7 и 28,3% соответственно при I достоверной разнице (Р<0,05; 0,001). »

Таблица 2

Эффективность стимуляции сунеровуляцни у коров-доноров при однократном введении препаратов ФСГ с пролонгатором Г1ВС

Показатели Препарат, схема обработки

ФСГ-супер ФСГ-п

8-кратно однокр. 8-кратно однокр.

Обработано доноров, гол. 89 113 90 23

Реагировало суперовуляцией, п - % 75 - 84,3 98-86,7 82-91,1 21 - 91,3

Среднее число овуляций 13,3±1,15 12,4±0,78 11,8±0,73 14Д±2,1

Получено зародышей, всего 626 75 9 600 208

- в среднем на донора 10,8± 1,21 10,5±0,8 8,8±0,75 12,2±2,23

в % от числа овуляций 81,0 84.9 74,9 86.3

в том числе: пригодных 6,7«,66 8,1 ±0,67 5,9±0,66 9,2±1,8*

% от общего числа 62,0 77,2*** 67,5 75,0*

дегенернрованных 1,0*0,23 0,7±0,25 1,6±0,25 0,9±0,5

% 9,7 6,7* 18,1 7,7***

яйцеклеток 3,0±0,67 1,7±0,42* 1,3 ±0,24 2,1*0,62

% 28,3 16,1*** 14,3 17,3

Оплодотворя емость яйцеклеток, % 71,7 «3,9*** 85,7 82,7

*Р<1,05 ***Р<0,001.

В 4 группе, где животных обрабатывали ФСГ-п с пролонгатором, было получено значительно большее число зародышей по сравнению с 3 группой, где ФСГ-п вводили 8-кратно: 12,2 против 8,8 в среднем на донора, что было связано с более высоким уровнем суперовуляции (14,2 против 11,8) и нзвлекаемостью эмбрионов и яйцеклеток - 86,3 против 74,9%. Соответственно большим было н число пригодных эмбрионов в среднем на донора - 9,2 против 5,9 при Р<0,05. Качество эмбрионов также зависело от схемы обработки: количество нормальных эмбрионов от общего числа зародышей в опытной группе было достоверно (Р<0,05) выше и составляло 75,0% против 67,5% в контроле.

Качество эмбрионов в опыте повышалось за счет заметного снижения чиста дегенернрованных эмбрионов в 4-й опытной группе по сравнению с 3-й контрольной - 7,7 против 18,1% - разница высокодостоверна (Р<0,001). Оолодотворяемость яйцеклеток между группами практически не различалась -82,7 и 85,7%.

Таким образом, при пролонгировании действия ФСГ-супер и ФСГ-п, качество эмбрионов повышается в первом случае за счет повышения оплодотворяемости, во втором, вследствие снижения процента дегенерации эмбрионов.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о несомненном преимуществе стимуляции суперовуляции пролонгированной формой ФОР по уровню суперовуляции к качественному составу эмбрионов при значительном снижении затрат труда и стрессового воздействия на животное по сравнению с общепринятым 8-кратным введением препаратов.

На новое техническое решение "Стимулятор пролонгации ФСГ для суперовуляции у коров-доноров" получена приоритетная справка на выдачу патента по заявке № 20020647 от 23.07.2002 г (опубл. 30.03.2003 г., бюл_№1).

3.3. Многократное использование коров-доноров различных пород

Реальная возможность ускорения генетического прогресса в относительно короткие сроки значительно повышается при использовании коров в качестве доноров эмбрионов многократно.

Таблица 3

Изменение основных показателей эмбриопродуктивности коров-доноров различных пород в зависимости от кратности индукции полиовуляции

Изменение показателей с кратностью обработок у

Показатели коров-доноров различных пород

Черно- Сим мента Абердин- Герефорд Шаро-

пестрая льская . ангусская екая лезская

Число коров в группе 48 14 32 20 24

Количество обработок 19 10 15 8 5

Уровень супер- стабиле повыша стабиле стаби- повы-

овуляции н ется н лен шается

Общий выход зароды- повыш. повыша стабиле стабиле повыша

шей и яйцеклеток с 12-й ется я* н ется

Количество сниж-ся сниж-ся сниж-ся снижает повыша

пригодных эмбрионов с 15-й* с 9-й с 10-й ся ется

Количество ста- повыш. повыш. повыш. снижа-

дегенеркро ванных эмбрионов бильно* с 6-й С 10-й* с 6-й ется

О плодотворяемость сниж-ся сниж-ся сниж-ся снижает повыша

яйцеклеток с 13-й* с 9-й с 9-й СЯ ется

Примечание. В таблице приведена общая тенденция изменения основных показателей. Значком * отмечены изменен!« показателей с высокой вариабельностью.

О наших исследованиях многократно использовались коровы-доноры 5 пород: молочной (голштины), молочно-мясной (симменталы) и мясной -абердин-ангусы, герефорды и шароле [I, 18, 26). Результаты анализа полученных данных приведены в таблице 3.

Согласно приведенных в таблице выводов, наиболее приемлемые результаты были получены при многократном, в течение года, использовании шароле. Однако эти данные ограничены кратностью обработки (5) и могут

измениться с увеличением их числа. Черно-пестрые доноры до 12-Я обработки имели относительно стабильные результаты, с 12-й по 19-ю обработки выход эмбриопродукции повышался, что свидетельствует о возможности их положительного использования на протяжении 4-5 лет. Животные симментальской и абердин-ангусской пород показывали положительные результаты до 9 и 10 обработок соответственно, или в течение 2-2,5 лет использования.

В то же время коровы-доноры герефорды уже после первой обработки имели снижение результатов по всем основным показателям и это снижение было стабильным, что, вероятно, связано с породной чувствительностью к экзогенным гонадотропинам и может служить причиной ограниченного использования в качестве доноров в течение длительного срока.

3.4. Разработка технологических аспектов повышения эффективности пеки руртч ее кого извлечения эмбрионов

Результаты получения эмбрионов нехирургическим путем зависят от целого рада факторов, среди которых большое значение имеют способы вымывания, конструкция используемых инструментов и последующие этапы по сбору и обнаружению зародышей. Известно, что эффективность вымывания доимплантационных зародышей нехирургическим путем уступает хирургическим методам и по различным данным составляет от 40 до 76% [Lampeter Von W.W., 1977; Сергеев Н.И., 1966].

В наших исследованиях для повышения эффективности и ускорения процесса вымывания был модифицирован способ кехирургического извлечения, апробирование которого в сравнительном аспекте с известными было проведено на 3 группах коров-доноров. В 1-й (п=237) и 2-й (п=134) группах зародыши извлекали общеизвестными способами — соответственно с помощью шприцов Люэра и самотеком через замкнутую систему трубок. В 3-й ipynne (п=452) применяли модифицированный способ (табл. 4) [10,20,25].

В 1-й группе, где использовались шприцы Люэра, число доноров положительных по извлечению эмбрионов было ниже, чем во 2-й и 3-Й группах (84,4% против 94,0 и 91,2% соответственно). Разница между 1-й и 3-й группами была достоверной при Р<0,01.

При среднем числе овуляций соответственно по группам 11,1; 11,3 и 11,3 в 3-й группе был наиболее высокий уровень извлекаемое™ - 79,5% зародышей и яйцеклеток от общего числа овуляций против 72,8 и 71,8% в 1-й и 2-й группах соответственно (разница достоверна при Р<0,001). При практически одинаковой суперовуляторной реакции по группам среднее число полученных эмбрионов в 3-й группе было заметно выше, чем в 1-й и 2-й: 9,4 против 8,0 и 8,6 соответственно.

Полученные результаты свидетельствуют о преимуществе модифицированного способа извлечения перед общеизвестными как по среднему числу эмбрионов на донора, так и по выходу зародышей от числа овуляций.

При нехирургическом вымывании эмбрионов в процессе попеременного введения и удаления среды просвет рога матки периодически сжимается н стенки рога закрывают отверстия катетера, препятствуя выводу среды с эмбрионами.

Таблица 4

Эффективность извлечения эмбрионов у коров-доноров тремя с пособам и__

Показатели Группы животных

1 2 3

Оперировано животных, гол. 237 134 452

Положит, по извлечению доноров от числа оперированных, п -% 200-84,4 126 - 94,0 412-91,2**

Общее число овуляций 2212 1509 4883

Число овуляций в ср. на донора 11,1± 11,3* 11,8±

Число извлеченных зародышей 1610 1083 3883

в среднем на донора 8„0± 8,6± 9,4±

в % от числа овуляции 72,8 71,8 79.5 ***

** Р<0,01 *"Р<0,001

Нами был разработан и изготовлен опытный образец устройства для извлечения эмбрионов у крупного рогатого скота, имеющий специальные распорные дуги, препятствующие сжатию стенок рогов матки в процессе вымывания (патент № 1792327, 1993, бюл. №4) [14,25],

Разработанное устройство апробировали при извлечении эмбрионов у 71 донора (опытная группа) в сравнении с контрольной группой (п= 137), в которой эмбрионы извлекали при помощи наиболее часто используемого специалистами на практике двухканального катетера "Нойштадт" (Германия). Результаты производственной проверки представлены в таблице 5.

Одним из показателей эффективности извлечения эмбрионов является процент положительных по вымыванию доноров, то есть тех суперовулнровавших животных, егг которых в процессе извлечения были получены эмбрионы. В опытной группе этот показатель был на 7,3% выше, чем в контрольной - 92 против 84,7% соответственно при недостоверной разнице.

Основной показатель - общее число полученных зародышей н яйцеклеток, в опытной группе был достоверно (Р<0,001) выше на !3% - 80,9 против 67,9%. Таким образом, при равном числе овуляций в контроле (12,5) н опыте (12,4), в опыте получили на 1,5 зародыша больше, чем в контроле - 10 против 8,5 в среднем на донора.

Таблица 5

( Эффективность извлечения эмбрионов разработанным устройством

Показатели Группы животных

Контрольная Опытная

Оперировано доноров, голов 137 71

Положительных по извлечению доноров, п-% 116-84,7 66-92,0

Число овуляций 1446 818

Овуляций В ср. на полож. донора 12,5 ±0,64 12,4 ±0,67

Получено эмбрионов и яйцеклеток, п-% от числа овуляций 982-67,9 662-80,9***

в ср. на положительного донора 8,5 ±0,99 10,0 ±0,7

*** Р<0,001

Полученные нами практические результаты подтверждают теоретические предпосылки о более высокой эффективности вымывания эмбрионов при помощи устройства с распорными пластинами.

В последние годы для выделения эмбрионов в ограничением объеме маточного смыва многие специалисты применяют эмбрнофильтры, которые позволяют оперативно удалить избыток среды без зародышей путем ее фильтрации. Однако недостатком существующих конструкций является то, что ситечко в процессе фильтрации забивается примесями в виде сгустков слизи и спущенного эпителия, что часто приводит к потерям эмбрионов.

С целью устранения этого недостатка нами был разработан и сконструирован эмбрнофильтр принципиально иной конструкции (а.с. № 1704775,1991, бюл. № 2). В отличие от известных устройств маточный смыв не пропускается через разделительное ситечко, а поступает под него и фильтруется постепенно - посторонние примеси не забивают ячейки, что ускоряет процесс отбора и исключает потери эмбрионов [11,25].

Опытный образец устройства прошел производственную проверку при извлечении эмбрионов у 73 коров-докоров (опытная группа). В контрольной группе (п=71) использовался эмбриоконцентратор германского производства. Результаты эксперимента представлены в таблице 6.

В опытной группе зародыши были получены от 67 коров-доноров из 73 обработанных (91,8%), что было на 5,9% выше, чем в контрольной группе (85,9%). Среднее число овуляций в контрольной и опытной группах составляло 12 и 113 соответственно. Однако в результате поиска в среднем на донора было получено практически одинаковое число эмбрионов (8,7 и 8,8) за счет более высокой извлекаемое™ в опытной группе - 72,2 и 77,9% от числа овуляций в контроле и опыте соответственно прн достоверной (Р<0,01) разнице.

Разделительные ситечки фильтров подвергали многократному промыванию сильной струей жидкости. В контрольной группе было дополнительно обнаружено в общей сложности 33 зародыша (4,5% от числа овуляций), фактически утерянных после обычной процедуры сбора. Эмбрионы находили

тем чаще, чем больше посторонних примесей находилось в смыве. В опытной группе после аналогичной процедуры эмбрионов не обнаружили.

Таблица б

Эффективность отбора эмбрионов при использован и и

Показатели Группы животных

Контрольная Опытная

Оперировано доноров, гол. 71 73

Доноров, полож. по извлечению, (п-%) 61-85,9 67-91 ,Ъ

Общее число овуляций 734 761

- в среднем на положит, донора 12,0 ± 0,62 11,3 ±0,79

Вымыто эмбрионов и янцекл., (п-%) 530-72,2 593-77,9**

- в среднем на положит, донора 8,7 ± 0,03 8,8 ± 0,84

Обнаружено эмбрионов после промывания фильтра, (п-%) 33-4,5% -

Вымыто зародышей всего, (п-%) 563-76,7 593-77,9

- в среднем на донора 9,2 ± 0,63 8,8 ±0,84

** Р<0,01

Таким образом, в контрольной группе общее число зародышей после повторной процедуры промывания фильтра составило 563, или 9,2 в среднем за извлечение. Процент вымытых эмбрионов от числа овуляций повысился до 76,7%, что практически не отличалось от результативности в опытной группе -77,9%.

Сравнительный анализ результатов исследований позволяет заключить, что предлагаемый эмбриофильтр в силу конструктивных особенностей позволяет исключить потери эмбрионов в процессе их отбора, в отличие от эмбриоконцентратора германского производства, использование которого не исключает потерь эмбрионов из маточного смыва, достигающих 4,5%.

3.5. Устройство оля глубокой аппликации эмбрионов трансцерв икал ьным путем

Основным недостатком катетера Кассу, наиболее часто используемом при пересадках эмбрионов, является определенный предел доступной глубины рога матки вследствие его кривизны. По мнению многих исследователей, при нехирургической пересадке верхушка рога матки, недоступная для катетера Кассу, является наиболее оптимальным местом [Critser J.K.., Rowe R.F., 1979, 1980; Newcomb R., 1985; Овчинников A.B., 1985].

Нами было сконструировано и апробировано на практике телескопическое гибкое устройство, позволяющее производить аппликацию эмбрионов непосредственно в верхушку рога матки без риска травмирования эндометрия [13,19, 23,24,25] (а.с. № 179617!, 1993, бюл.№ 7).

Использование разработанного устройства позволило существенно повысить прижнвляемостъ эмбрионов и подтвердить зависимость этого фактора от места аппликации в роге матки. Было установлено (табл. 7), что при пересадке по

одному свежеполученному эмбриону в верхушку рога матки телки-реципиента показатель приживляемое™ возрастает до 71,4% по сравнению о пересадкой в середину рога катетером фирмы "Ноиштадт" (51,9%)-достоверно при Р<0,001. Аналогичная закономерность наблюдалась и при использовании деконсервированных эмбрионов: соответственно 59,2 против 45,4% (Р<0,01)-

Как видно из приведенных данных, результаты пересадки в середину рога матки лишь в малой степени зависели от типа инструмента - уровень стельности при пересадке свежеполученных и замороженно-опаянных эмбрионов базовым и разработанным устройствами составляет 51,9 и 53,3% и 45,4 и 50,0% соответственно - достоверных различий между группами не установлено. Некоторое преимущество гибкого устройства по сравнению с жестким катетером связано, вероятно, с меньшим риском травмирования эндометрия матки.

Таблица 7

Прижнвл ясность эмбрионов в зависимости от места аппликации в роге матки

реципиента и типа инструмента

Использованы эмбрионы Тин инструмента Место аппликации в роге матки Показатели

Пересадок Стельных %

Свежие Катетер "НоЙштадт Середина 661 343 51,9

Новое устройство Середина 30 16 53,3

тоже Верхушка 70 50 71,4***

Деконсер-виро ванные Катетер "Нойштаат Середина 603 274 45,4

Новое устройство Середина 28 14 50,0

тоже Верхушка 108 64 59,2**

**Р<0,01 ***Р<0,001

Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что при нехирургической пересадке наиболее высокий уровень стельности обеспечивается аппликацией эмбрионов в верхушку рога матки реципиентов, что может быть достигнуто с помощью разработанного телескопического гибкого устройства и составляет 71,4% при пересадке свежих и 59,2% деконсервированных эмбрионов, что соответственно на 19,5 н 13,8% выше, чем лри пересадке базовым устройством - катетером "НоЙштадт" жесткой конструкции, ограничивающей доступную глубину рога матки.

З.б. Эффективность межпородной пересадки эмбрионов при получении мясных телят в молочном стаде

В исследованиях по межпородной пересадке использовались свежие и деконсервированные эмбрионы 5 пород: герефордская, абердин-аигусская, симментальская, шаролезская н лнмузинская. Полученные результаты

сравнивали с внутрипорсщной пересалкой черно-пестрым реципиентам .. идентичных по породе эмбрионов [8, 10,25, 26,35,38,41]. |

Анализ влияния на приживляемость состояния эмбрионов в зависимости от их породной принадлежности приведен в таблице 8.

Таблица 8

Прижнвляемость эмбрионов при межпородной пересадке в зависимости от их состояния и породной принадлежности

Породная прк-надл. эмбрионов Состояние эмбрионов Число реципиентов Стельных реципиентов Приживляемо сть, %

Герефорд екая свежие деконсерв. 23 29 14 14 60,9 483

Абердин-ангусская свежие деконсерв. 59 136 31 66 52,5 48,5

Симментальская свежие деконсерв. 56 34 34 15 60,7 44,1

Шаролезская свежие деконсерв. 10 б 6 3 60,0 50,0

Лнмузинская свежие деконсерв. 4 26 2 12 50.0 46.1

В среднем по межпордной свежие деконсерв. 152 231 87 ПО 57,2 47,6

Черно-пестрая свежие деконсерв. 761 568 409 274 53,7 48,2

Прижнвляемость свежеполученных эмбрионов породы герефорд, симментал и шароле при пересадке черно-пестрым реципиентам была существенно выше по сравнению с внутрипородной пересадкой: 60,9, 60,7 и 60% против 53,7% соответственно. Лнмузинская порода в расчет не принималась из-за недостаточного числа пересадок. Исключение составили эмбрионы абердин-ангусской породы, прижнвляемость по которым не имела отличий от аналогичной пересадки внутри породных эмбрионов: 52,5 против 53,7%. В уровне прнжнвляемости свежих эмбрионов достоверной разницы между группами не установлено.

После пересадки замороженно-оггаянных эмбрионов прижнвляемость заметно снижалась по всем группам реципиентов, но между группами существенных различий не имела и составляла от 44,1 до 50% при межпородной, против 48,2% при внутрипородной пересадке. Это доказывает отсутствие отрицательного влияния на выживаемость эмбрионов их породной принадлежности.

Более значительное снижение стельности после деконсервации мясных эмбрионов, по сравнению с молочными, косвенно свидетельствует том, что эмбрионы мясных пород хуже переносят условия криоконсервации: снижение стельности при внутрипородной пересадке свежих и замороженно-оттаянных эмбрионов составляет 5,5%, тогда как при межпородной пересадке от 10 до 16,6%.

Полученные результаты показывают, что при межпородной пересадке породная принадлежность эмбрионов не оказывает отрицательного влияния на их выживаемость у промежуточных матерей. При пересадке интактных эмбрионов герефсрдской, симментальской и шаролезской пород этот показатель выше, чем при внутрипородной пересадке на 7,2; 7,0 и 6,3% соответственно.

Таким образом, межпородная трансплантация эмбрионов может быть одним из наиболее эффективных рычагов ускоренного воспроизводства менее распространенных пород крупного рогатого скота, что особенно актуально в мясном скотоводстве.

3.7. Получение разнояйцевых двоен путем внутрипородной н межпородной пересадки эмбрионов

Важным резервом увеличения производства молока и мяса может стать повышение выхода телят за счет получения двоен биотехнологическими методами. При этом увеличение производства говядины может быть обеспечено без увеличения поголовья коров. Развитие простой и надежной технологии получения двоен в мясном н молочном скотоводстве позволит удешевить мясную продукцию при увеличении обеспечения мясом.

В наших исследованиях при получении двоен использовались эмбрионы 4 пород: маточные (голштины), молочно-мясные (симменталы) и мясные (абердин-ангусы и герефорды) [9,19,21,38].

При получении внутрипородных двоен черно-пестрым тел кам-реци л ментам пересаживали по 2 идентичных породе реципиентов свежеполученных (п*=358) или замороженно-оттаянных {п=!40) эмбриона соответственно 179 и 70 реципиентам на 7 или 8 день полового цикла с учетом стадии развития эмбрионов. В сравнительном аспекте с пересадкой одного эмбриона, пересадка двух эмбрионов одному реципиенту повышала уровень стельности на 6,1% при пересадке свежих (59,8 против 53,7%) и на 11,8% деконсервнрованных эмбрионов (60,0 против 48,2% - достоверно при Р<0,05) (табл.9).

Таблица 9

Зависимость стельности реципиентов от состояния и числа пересаженных эмбрионов при внутрипородной пересадке

Показатели Свежеполученные | Деконсервированные

1 эмбрион 2 эмбриона| 1 эмбрион 2 эмбриона

Число реципиентов 761 179 I 568 70

Пересажено эмбрионов 761 358 568 140

Стельных реципиентов 409 107 | 274 42

Процент стельности 53,7* 59,8 | 48,2 60,0*

* Р<0,05

При пересадке замороженно-оттаянных эмбрионов по одному на реципиента уровень стельности снижался, по сравнению с пересадкой свежеполученных эмбрионов, на 5,5% (48,2 против 53,7% - разница достоверна при Р<0,05). В то же время, при пересадке реципиентам по два эмбриона этот показатель не зависел от их состояния (свежие или деконсервироваиныс) и составлял 59,8 и 60% соответственно.

В таблице 10 приводятся результаты получения внутри породных двоен путем и пси латеральной переездки двух свежих или декон сервированных эмбрионов. Показатели частоты рождения двоен, прнживляемости эмбрионов и выхода телят после пересадки соответственно свежих и деконсервированных эмбрионов практически не различались н составляли соответственно 48,9 и 48,4%, 41,3 и 39,0% и 1,49 и 1,4$ в среднем на отел.

Таблица 10

Приживляемость и результаты получения двоен при внутрипородной

пересадке свежеполученных н деконсервированных эмбрионов

Показатели Свежепол ученные Декон сер вированн ые В среднем

Число стельных реципиентов 107 42 149

Отелилось реципиентов 90 31 121

- в том числе двойнями, п-% 44-48,9 15-48,4 59-48,8

Пересажено эмбр. на полученные отелы 324 11S 442

Получено телят 134 46 180

Приживляемость эмбрионов, % 41.3 39,0 40,7

Получено телят на один отел 1,49 1,48 1,49

Получено телят на один эмбрион 0,4! 0,39 0,41

Таким образом, полученные результаты показывают, что при пересадке реципиенту двух эмбрионов потенции к развитию замороженно-отгаянных эмбрионов не уступают свежеполученным, что подтверждает важное значение числа эмбриональных клеток в повышении жизнеспособности эмбрионов н возникновении беременности.

В целом получение двоен путем пересадки реципиентам по два эмбриона в один маточный рог является высокоэффективным методом, позволяющим при 60%-й стельности получать около 50% двоен, что обеспечивает выход до 1,5 телят на един отел, или 0,41 теленка на один пересаженный эмбрион. Это в 1,5 раза больше, чем при пересадке реципиентам по одному эмбриону при 50%-й прижи в ляемости.

Другим методом получения двоен является пересадка эмбрионов предварительно осемененным реципиентам в контрлатеральный или и пси латеральный по отношению к желтому телу янчннка рог матки.

В наших исследованиях подсадку эмбрионов проводили контрлатерально в условиях фермы осемененным реципиентам-телкам (п=68) на 7 или 8 день после искусственного осеменения. Полученные результаты сравнивали с пересадкой двух эмбрионов интактным телкам (п=70). В обоих случаях для пересадки использовались деконсервированные эмбрионы со стадией развития, соответствующей стадии полового цикла реципиентов (табл.11).

Таблица 11

л Эффективность получения внутри породны к двоен при пересадке

деконсервировакных эмбрионов интактным и предварительно осемененным _реципиентам_

Показатели Группы реципиентов

Интактные Осемененные

Число реципиентов 70 68

Число стельных реципиентов 42 43

Уровень стельности, % 60,0 63,2

Учтено отелов 31 35

в том числе двойневых, п-% 15-48,4 11-31,4

Пересажено эмбрионов на полученные отелы 118 120

Приживляемость эмбрионов от числа пересаженных, % 40,0 38,3

Получено телят 46 46

Получено телят на один отел 1,48 1,31

Уровень стельности при пересадке одного эмбриона осемененным реципиентам практически не отличался от пересадки двух эмбрионов интактным реципиентам: 63Д и 60,№ соответственно. Однако число отелов двойнями в первом случае было на 17% меньше - 31,4 против 48,4%, что мы связывали с приживляем остью эмбрионов. На этот показатель оказывает влияние целый ряд факторов, среди которых немаловажное значение имеет место аппликации зародыша. Доказанным считается факт снижения выживаемости эмбрионов при пересадке в контрлатеральный, то есть противоположный яичнику с желтым телом, рог матки. Кроме того, считается установленным, что 40% и более двойневых стельностей может быть получено при высокой оплодотворяемое™ (60-70%) телок после искусственного осеменения. При низкой, на уровне 45-50%, оплодотворяемости получают только 20-25% двоен [Эрнст Л.К., Сергеев Н.И., 1989]. В хозяйстве, где проводились пересадки эмбрионов искусственно осемененным телкам-реципиентам оплодотворяемость от первого осеменения не превышала 55%.

Таким образом, пересадка эмбрионов осемененным телкам при получении искусственных двоен дает возможность при стельности 63,2% получать 31,4% двойневых отелов и выходе 1,31 теленка на один отел в среднем. Эги показатели могут быть выше при более высоком индексе оплодотворяемости в целом по стаду.

При получении межпородных двоен в наших исследованиях использовались 4 группы эмбрионов двух мясных пород; свежие (п=60) и декон сервированные (п=64) герефордов и свежие (п=122) н деконсервированные (п=58) абердии-аигусов (табл. 12).

Таблица 12

Результаты получения межпородных двоен в зависимости

Показатели Породная принадлежность эмбрионов

Герефордская А бердин-ан гусская

Свеж. З/о В сред. Свеж. З/о В сред.

Число реципиентов 30 32 62 61 29 90

Стельных реципиентов 19 18 37 40 18 58

% стельности 63,3 56.2 59,7 65,6 62.0 64,4

Число отелов 17 35 32 17 49

- в том числе отелов двойнями, п-% 9-50,0 9-52,9 18-51,4 17-53,1 6-35,3 23-46,9

Пересажено эмбрионов на полученные отелы 58 62 120 106 56 162

Получено телят 27 26 53 49 23 72

Прижнвляемость эмбрионов, % 46,5 41,9 44,2 46,2 41,1 44,4

Получено телят на один отел 1,5 1,53 1,51 1,53 1,35 1,47

Получено телят на пересаж. эмбрион 0,46 0,42 0,44 0,46 0,41 0,44

Пересадку проводили черно-пестрым телкам-реципиентам по два свежих или деконсервированных эмбриона в один маточный рог путем однократного трансцервикального введения инструмента.

При пересадке эмбрионов абердин-ангусской породы отмечалось некоторое преимущество в среднем уровне стельности, по сравнению с эмбрионами герефордов - 64,4 против 59,7%. Причем, эта тенденция сохранялась как в отношении свежих, так и деконсервнрованных эмбрионов. В то же время, выход двоен у ангусов снижался до 46,9% против 51,4% у герефордов, что объяснялось более низкой приживляемое тью замороженно-оггаянных эмбрионов - 41,1% у анисов против 46,5% у герефордов и, соответственно, выходом двоен - 35,3 и 52,9% у ангусов и герефордов соответственно.

Полученные данные свидетельствуют о более низкой выживаемости деконсервнрованных эмбрионов абердин-ангусской породы в процессе раннего эмбриогенеза: если разница между уровнем стельности и прижнвляемостью деконсервнрованных эмбрионов породы герефорд составляла 14,3% (56,2 против 41,9%), то у ангусских эмбрионов понижалась более значительно - на 20,9% (62 против 41,1%).

При изучении влияния двойневых отелов в сравнении с одинцовыми на репродуктивные функции реципиентов и сохранность молодняка было установлено, что в группе животных, стельных двойнями (п=165) число абортов

. увеличивается на 3,5% по сравнению со стельными одинцами (п=848) - 10,3 1 против 6,8% соответственно (табл. 13) (учтены стельности и отелы с зафиксированными данными).

Таблица 13

Репродуктивные функции реципиентов, стельных __двойнями и одинцами

Показатели Отелы

одннцом двойней

Число стельных реципиентов 848 165

Абортировало реципиентов (п-%) 58-6,8 17-10,3

Число отелов (п-%) 790-93,2 148-89,7

Родилось телят, всего 790 296

из них: - живых (п-%) 740-93,7*** 253-85,5

- мертворожденных (п-%) 50-6,3 43-14,5***

Пало телят (п-%) 19-2,3 9-3,6

Деловой выход телят на 1 первотелку 0,91 1,65

Сохранность телят (п-%) 721-91,3*** 244-82,4

Средний выход телят на 1 реципиента 0,85 1,48

*** Р<0,001

Число мертворождений часто было связано с трудными отелами и в случае рождения двоен составляло 14,5% по сравнению с рождением одинцов (6,3%). Разница статистически достоверна (Р<0,001). Процент падежа в первые 3 дня после рождения был практически одинаковым, но в целом за счет повышенного числа абортов и мертворождений сохранность телят в группе двоен была на 8,9% ниже, чем в группе одинцов 82,4 против 91,3% соответственно - разница высокодостоверна (Р<0,001).

Несмотря на ряд негативных факторов, сопутствующих двойной стельности, использование трансплантации эмбрионов с целью получения двоен может быть весьма эффективным. Такой основной показатель, как средний выход телят на стельного реципиента, в группе двоен почти в 2 раза выше, чем в группе одинцов —1,48 против 0,85 соответственно.

3.8. Эффективность использования нового крионротектора и жизнеспособность эмбрионов в зависимости от способов крно- н дсконсервацнн

В наших исследованиях был проведен сравнительный анализ влияния на жизнеспособность эмбрионов способов крио- и декоисервации при и использовании различных криофилактнков 3, 6,28,30,32,36,37,41,48].

В экспериментах учитывали 6 групп эмбрионов. В 1, 2, 3 и 4 группах эквилибрация эмбрионов перед замораживанием проводилась в 3 ступени в растворах глицерина возрастающей концентрации и замораживание в режиме быстрого охлаждения до -36°С с последующим помещением в жидкий азот. В 5 группе эмбрионы одноэтапно выдерживали в 1,5М растворе этилен гликоля и

охлаждали в быстром режиме с -б°С до -36°С. Во всех случаях конструктивные ( особенности программного устройства (ЗЭМг4) обеспечивали спонтанный сидни г при -6...-ТаС в течение 2 минут. В 6-й группе пересадки проводились свежими эмбрионами.

После оттаивания эмбрионов в 1,2, 3 и 4 группах криопротектор удаляли 4 способами: 1 группа - трехступенчато в растворах глицерина понижающейся концентрации; 2 - то же в присутствии 0,ЗМ сахарозы; 3 - то же в присутствии 0,ЗМ раствора нового криофилактика трегалозы; 4 - од поэтапно в 1,0М растворе сахарозы. В 5 группе после оттаивания пайетту встряхивали и проводили прямую пересадку без предварительного удаления этилен гликоля (табл. 14),

Таблица 14

Жизнеспособность эмбрионов при различных условиях _крио-и деконсервации_

Группы эмбрионов Сохранность эмбрионов Прнживляемость эмбрионов

оттаяно сохранилось % пересадок стельных %

1 387 341 88,1 231 110 47,6**

2 299 278 93,0 258 131 50,7

3 121 116 95.9"* 81 44 54,3

4 52 47 90,4 45 19 42.2*

5 - - - 62 28 45Д

в среднем 928 846 91,2 677 332 49,0***

6 - свежие - - - 1183 663 56,0

* Р<0,05 ** Р<0,01 *** Р<0,001 Наиболее высокий уровень сохранности и приживляемостн эмбрионов

95,9 и 54,3% соответственно, был отмечен в 3 группе, где использовался новый непроникающий криопротектор дисахарид трегалоза. Показатель приживляемостн был сравним с пересадкой свежих эмбрионов при недостоверной разнице - 54,3 и 56,0% соответственно. Статистически достоверные различия в приживляемостн установлены между 1-Й, 4-й, в среднем по деконсервированным и 6-й группами (Р<0,01; 0,05; 0,001).

Высокие результаты были получены при добавлении к растворам глицерина 0,ЗМ сахарозы - 93,0 сохранности и 50,7% приживляемостн (2 группа).

Сохранность и прнживляемость эмбрионов после оттаивания прн выведении крнопротектора традиционным способом (растворы глицерина понижающейся концентрации) и при одноступенчатом в 1,0М растворе сахарозы были ниже: 88,1 и 47,6% и 90,4 и 42,2% в 1-й и 4-Й группах соответственно. Разница в сохранности эмбрионов между 1-й и 3-Й группами была высокодостоверной (Р<0,00,1).

Таким образом, использование нового непроникающего криофилактика трегалозы для ускорения выведения глицерина и более равномерного поступления воды в клетку, имеет преимущество перед традиционными способами.

Высокие результаты показал метод криоконсервацни эмбрионов при использовании криопротектора эти ленгли коля (5 группа) - уровень приживляемости эмбрионов составил 45,2%. Особый интерес этот способ представляет применительно к условиям производства, поскольку позволяет отказаться от использования дорогостоящего оборудования, свести к минимуму существующую процедуру деконсервацин и сократить затраты времени от оттаивания до пересадки с 25 до 5 минут.

3.9. Достоверность идентификации пола 7-суточных эмбрионов на основе анализа ДНК У-хромосом и жизнеспособность эмбрионов с определенным полом при крноконсервацкн

Метод, основанный на гибридизации ДНК специфических участков У-хромосом для идентификации мужских эмбрионов получил свое практическое развитее в 90-х годах и на сегодня является наиболее эффективным. Его точность в лучших лабораториях достигает 95% при уровне стельности 55,6% по свежим и 44,4% по декоисервированным эмбрионам [ЯозЫаи К, & а!., 1997].

Нами совместно с племпредприятием КТО (Германия) были проведены исследования по изучению влияния процессов микробиопсии и замораживания-оттаивания на жизнеспособность эмбрионов с определенным полом, а также степень надежности метода определения пола на основе анализа ДНК У-хромосом [45].

Пол определяли у 155 7-суточных эмбрионов на стадии поздней морулы. При этом пол был идентифицирован у 120 эмбрионов, что составило 77,4% эффективности.

При замораживании эмбрионов с определенным полом проводили 3-ступенчатую эквилибрацию в растворах глицерина повышающейся до 10% концентрации, после чего охлаждали до -35°С со скоростью охлаждения 0,5°С в минуту и погружали в жидкий азот. Оттаивание осуществлялось в 2 этапа: 10 сек на воздухе, затем 20 сек в водяной бане при 25°С. Глицерин удаляли в обратной последовательности в присутствии 0,ЗМ раствора сахарозы.

В результате пересадки 87 эмбрионов с определенным полом стельность установили у 36 реципиентов, что уступало пересадке деконсервированных интактных эмбрионов, замороженных и оттаянных по аналогичной методике, на 9,3% (41,4 против 50,7%) и свидетельствует о некотором отрицательном влиянии микробнопсии на жизнеспособность деконсервированных эмбрионов, но статистически достоверной разницы между группами не установлено (табл. 15). Приживляемость мужских и женских эмбрионов в эксперименте практически не отличалась и составляла 41,4 и 41,2% соответственно.

В результате растела 32 реципиентов, которым пересадили по одному эмбриону с определенным полом, родилось 35 телят (табл. 16), из которых три монознготных двойни (бычки), что составило 9,4% от числа отелов. Известно, что спонтанное возникновение идентичных двоен крайне редкое явление. По данным Гордона А. [1988] рождение таких двоен составляет одно на 1000 отелов. Очевидно, прокол зоны пеллюцида и отторжение клеток трофобласта при микробиопсии, а также процессы замораживания-оттаивания в присутствии

глицерина и сахарозы оказывают стимулирующее влияние на спонтанное разделение эмбрионов и возникновение) однояйцевых двоен. Возможность искусственного индуцирования этого процесса у крупного рогатого осота может иметь большое практическое значение.

Таблица 15

Результаты пересадки замороженно-оттаянных интактных _эмбрионов и эмбрионовс определенным полом_

Группы эмбрионов, число пересадок Пересажено эмбрионов Стельных реципиентов Приживляем ость эмбрионов. %

с биопсией - 87 87 36 41,4

в т.ч.: мужские - 70 70 29 41,4

женские - 17 17 7 41.2

интактные - 258 258 131 50,7

Таблица 16

Достоверность определения пола на основе анализа _ ДНК У-хромосом__

Пол эмбрионов Всего отелов Родилось телят Двоен (ингемнна-ция), п-%

всего бычков телочек (п-% ошибки)

Мужской 25 28 26 - 2-8,0 3 - 12,0

Женский 7 7 - 7-0,0 -

Всего 32 35 26 9-6.2 3-9,4

Из 32 отелов 25 были получены от пересадки эмбрионов, пол которых определили как мужской. В результате 23 отелов родились бычки, но 2 отела закончились рождением телочек. От пересадки женских эмбрионов (7 отелов) родилось 7 телочек. Таким образом, пол был верно определен в 30 случаях из 32 - достоверность определения пола составила 93,8%.

Данные, полученные в рамках производственного эксперимента, показывают, что метод определения пола ранних эмбрионов крупного рогатого скота на основе гибридизации ДНК У-хромосом является наиболее надежным по сравнению с известными методами; его точность составляет 93,8% при уровне прижив ляемости деконсервированных эмбрионов 41,4%.

3.10. Способ н устройство для микрохирургического разделения ранних эмбрионов при получении монфзнготных близнецов

Возникновение в естественных условиях монозиготных близнецов, как отмечалось ранее, явление очень редкое и не превышает 0,01%. Поскольку причины спонтанного разделения эмбрионов до настоящего времени не выяснены, для повышения многоплодия определилось новое перспективное направление в биотехнологии - искусственное получение идентичных близнецов с помошью микрохирургических методов.

В настоящее время микрохирургия доимп лантационных зародышей вступает в фазу использования в практических программах по воспроизводству и селекции крупного рогатого скота.

В наших исследованиях методика разделения эмбрионов была максимально приближена к условиям производства [7,9,10,12,25,27,29,31,34,38,41]. Для разделения эмбрионов пополам (днсскция) использовали два способа. По 1 способу дисскцию осуществляли с помощью единственного инструмента -микроножа, закрепленного в держателе переносного мнкромаиипудятора, что обеспечивало контролируемое перемещение ножа в горизонтальной и вертикальной плоскостях. По разработанному нами 2 способу было сконструировано специальное устройство (а.с. № 1727819) [12].

С использованием 1 способа разделили 61 эмбрион и получили 116 равноценных половин, что составило 95,1% от числа максимально возможных (122). Полученные половинки на 60 мин переносили в среду для кратковременного культивирования. По окончании культивирования начало процесса компактизации зародышевого комплекса было отмечено у 105 половинок (90,5%), которые по 1 или по 2 были пересажены реципиентам.

Таким образом, эффективность дисскции эмбрионов при использовании I способа составила 86,1%: из 122 максимально возможных было получено 105 пригодных для трансплантации демнэмбрионов.

С помощью разработанного устройства разделили 22 эмбриона и получили 43 половинки (97,7%), после культивирования которых 42 (97,7%) были пригодными для трансплантации. Эффективность разделения эмбрионов по 2 способу составила 95,4% (из 44 возможных получили 42 пригодных демиэмбриона), что было выше по сравнению с 1 способом на 9,3% (Р<0,05).

Полученные демкэмбриоиы по 1 или по 2 пересаживали в один маточный рог телок-реципиентов. Результаты трансплантации сравнивали с пересадкой свежеполученных интактных эмбрионов при тех же условиях (табл. 17).

Таблица 17

Результаты трансплантации демиэмбриоиов _по сравнению с интакшыми_

Показатели Демиэмбрионы Интактные эмбрионы

1 способ 2 способ по 1 по 2

по 1 по 2 по 2

Число реципиентов 23 41 21 913 270

Пересажено эмбрионов или демиэмбриоиов 23 82 42 913 540

Стельных реципиентов 12 27 13 497 166

Уровень стельности, % 52,2 65,8 61,9 54,4 61,5

При пересадке реципиентам по I демиэмбриону приживляемость снижалась на 2.2% по сравнению с псресаакой 1 и нтакткого эмбриона - 52,2% против 54,4%. В то же время, после пересадки 2 демиэмбриоиов в один маточный рог 41 реципиенту по 1 способу стельность была установлена у 27 голов (65,8%), что было несколько выше, чем при пересадке 2 интактных

эмбрионов. (61.5%). Пересадка 2 полуэмбрнонов по 2 способу неэффективности (61,9%) не отличалась от пересадки интактных эмбрионов (61,5%). Вероятно, процедура разделения эмбрионов на ранних стадиях развития и экстремальные условия in vitro в определенной степени повышают резистентность и потенции последующего развития демиэмбрионов,

В результате экспериментов по разделению свежеполученных зародышей было получено 50 телят, в том числе 8 пар монозиготных близнецов. В сравнительном аспекте трансплантация демиэмбрионов как но 1, так и по 2 на одного реципиента оказалась экономически более выгодной, чем пересадка ннтактных эмбрионов.

3.11. Эффективность получения н трансплантации свежих и деконсервнровжнных эмбрионов крупного рогатого скота на основе экстракорпорального оплодотворения ооцнтов

В последние годы разработке принципиально новой биотехнологии, сочетающей использование трансплантация эмбрионов, культивирование и оплодотворение ооцитов in vitro, уделяется большое внимание исследователей во всем мире. Решение этой проблемы позволит более интенсивно использовать в воспроизводстве высокоценных племенных коров, резко увеличить генетический прогресс в популяции на основе повышения потенциала гамет в расчете на одну племенную корову и достоверной оценке генотипа [Завертяев Б .П., 1987].

Метод получения эмбрионов на основе экстракорпорального оплодотворения ооцитов коров включает ряд последовательных этапов: получение яичников и извлечение ооцнтов, отбор ооцнтов, способных возоновить мейоз в искусственных условиях, создание условий для созревания ооцитов, капацнтация спермы, оплодотворение и культивирование зигот до стадии морулы - бластоцисты.

В наших исследованиях яичники от высокопродуктивных коров отбирались в момент убоя животных на мясокомбинате. Ооциты извлекали методом рассечения фолликулов лезвием безопасной бритвы в растворе Дюльбекко с 1% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 10 ед./мл гентамицнна и 1 едУмл гепарина. Для культивирования отбирали ооциты без видимых признаков дегенерации, с многослойным плотным кумулюсом, гомогенной ооплазмон, равномерно заполняющей прозрачную оболочку. Культивирование проводили в среде ТС-199 с добавлением 25 мМ/л буфера Хепеса и 10 ед./мл гентамицнна. Для повышения выхода ооцнтов со стадией развития метафаза-2 в качестве биологически активной добавки использовалась инактивированная при 56°С сыворотка крови от суперовулировавших коров в 20%-й концентрации.

Необходимое поддержание постоянного рН на уровне 7,2-7,4, 5%-ного СО;, температуры 38°С и влажности 98% осуществлялось с помощью модификации опытного образца разработанного устройства с заданными параметрами культивирования (патент № 1822341, 1993, бюл. №22).

Всего .было прокультивировано 740 ооцнтов. Через 24 часа культивирования стадии развития зрелой яйцеклетки достиг 321 оодит (43,4%).

Оплодотворение проводили замороженно-оттаянной спермой после предварительной капацитации сперматозоидов. Капацитацию осуществляли в модифицированном растворе Тироде (Sigma) с концентрацией гепарина 50 мкг/мл. В среду для оплодотворения добавляли суспензию спермиев и совместное культивирование проводилось в течение 18 часов. Оплодотворенные яйцеклетки культивировали в течение 7-11 суток.

При культивировании яйцеклеток эффективность использования разработанного устройства сравнивали с эксикатором, в котором необходимые условия обеспечивались механическими методами. Результаты исследований представлены в таблице 18.

Таблица 18

Эффективность получения эмбрионов in vitro с использованием

различных систем для iq шьтивирования

Система культивирования Оплодот ворено ооцитов, п-% Уровень дробления, п-% Выход морул, п-% Выход бластоцист, п-% Итого морул-блас-тоцист, п-%

Эксикато Р 372 86-23,1 27-7,2 12-3,2 39-10,5

Новое устройство 321 176-54,8*** 69-21,5*** 37-11,5** 106-33,0***

**Р<0,01 ***Р<0,001

Через 96 часов в культурапьной среде присутствовали 2-, 4-, 8- и 16-бластомерные эмбрионы, через 120 часов появлялись ранние и поздние морулы, через 192 часа - поздние и экспандированные бластоцисты, через 264 часа -бластоцисты, вышедшие из зоны пеллюцнда. Необходимо отметить неравномерность процесса дробления, поскольку в каждый конкретный момент времени в среде присутствовали эмбрионы разных стадий развития.

Как показал сравнительный анализ, эффективность использования разработанного устройства для культивирования была существенно выше, чем при использования простого эксикатора. Так, уровень дробления составлял 54,8 против 23,1% при высокой степени достоверности (Р<0,001). Из 321 зиготы, прокультивированной в новом устройстве, стадии развития морулы и бластоцисты, пригодных для трансплантации, достигли 106 зигот, или 33% против 10,5% при использовании эксикатора. Разница была также высокодостоверной (Р<0,(Ю1). В устройстве для культивирования выход морул и бластоцнет составил 21,5 и 11,5% соответственно. Разница по сравнению с эксикатором (7,2 н 3,2%) была достоверна соответственно при Р<0,001 и 0,01.

Эмбрионы, полученные in vitro от генетически ценных коров пересаживали теякам-реципнектам с синхронизированным циклом. Всего было пересажено 106 эмбрионов на стадии морулы и бластоцисты: 12 реципиентам пересадили по 1 эмбриону отличного и хорошего качества (1-я группа), 47 реципиентам 2-й

группы пересаживали по 2 эмбриона с некоторыми отклонениями от нормы в ипсилатеральный рог матки (табл. 19). Для сравнения были использованы результаты пересадки эмбрионов, полученных in vivo.

Таблица 19

Эффективность пересадки свежих эмбрионов, полученных _in vitro в сравнении с эмбрионами in vivo_

Происхожден ие и число эмбрионов на 1 реципиента Пересажено эмбрионов, всего Количество реципие нтов Стельных реципиентов, п-% Учтено отелов в т.ч. отелов двойнями п-%

in vitro 1 12 12 6-50,0 6 1-16,7

2 94 47 16-34,0 16 9-56,2

in vivo 1 761 761 409-53,7 392 3-0,8

2 358 179 107-59,8*** 90 44-48,9

*** Р<0,001

Как показали результаты пересадки, прижнвляемость отличных и хороших эмбрионов, полученных in vitro, не уступала аналогичному показателю у эмбрионов, полученных in vivo - при пересадке реципиентам по одному эмбриону уровень прижнвляемостн составлял 50 и 53,7% соответственно при недостоверной разнице. В то же время, уровень стельности при пересадке двух эмбрионов с некоторыми отклонениями от нормы в первом случае был на 25,8% ниже, чем во втором -34 против 59,8% - разница достоверна при Р<0,001. Это свидетельствуете том, что дегенеративные изменения, отмеченные у эмбрионов in vitro, имеют тенденцию к дальнейшему развитию в значительно большей степени, чем у эмбрионов in vivo. Однако число двоен при пересадке эмбрионов in vitro было даже несколько выше, чем эмбрионов in vivo - 56,2 и 48,9% соответственно (разница недостоверна). В результате 6 отелов от пересадки реципиентам по одному эмбриону in vitro была получена одна двойня в результате самопроизвольного разделения эмбриона.

С целью определения влияния процессов крио- и деконсервацин на жизнеспособность эмбрионов, полученных вне организма, были проведены исследования по оттаиванию и пересадке эмбрионов, доставленных из племпредприятия RPN (г.Ферден, Германия), в сравнении с эмбрионами in vivo, замороженными в условиях нашей лаборатории.

Методы замораживания-оттаивания в обоих случаях были аналогичными. Эмбрионы замораживали в 1,4М глицерине после поэтапной эквнлнбрации в растворах глицерина повышающейся концентрации. Оттаивание проводили в три ступени в растворах глицерина понижающейся концентрации в присутствии 0,3 М сахарозы. Сравнительный анализ жизнеспособности деконсервированных эмбрионов приведен в таблице 20.

Как показали результаты оттаивания, в группе эмбрионов, полученных in vitro, уровень сохранности был на 18,2% ниже, чем у эмбрионов, полученных in vivo - 93 против 74,8% при высокой достоверности (Р<0,001). Уровень стельности после пересадки деконсервированных эмбрионов in vitro также

существенно уступал эмбрионам in vivo: 38,2 против 50,7%, но различие было недостоверным. i t

Таблица 20

Жизнеспособность деконсервированых эмбрионов, _полученных in vivo и in vitro___

Метод получения эмбрионов Оттаяно эмбрионо в Сохранили жизнеспособно сть, п -% Число пересадок Число стельных реципиентов, п-%

in vivo 299 278-93,0*** 258 131-50,7

in vitro 135 101-74,8 55 21-38,2

*** Р<0,001

При пересадке разного числа деконсервированных эмбрионов различного происхождения (полученных in vivo и in vitro) в показателях стельности и рождения двоен, в отличие от пересадки свежих эмбрионов, имела место существенная разница (табл. 21).

Так, при пересадке по 1 или по 2 эмбриона in vitro уровень стельности был близким по значению и составлял соответственно 33,3 и 39,1%. Аналогичные показатели по эмбрионам in vivo были значительно выше - 48,2 и 60%. Разница между группами в уровне стельности при пересадке двух эмбрионов была статистически достоверной (Р<0,001). Разница в жизнеспособности эмбрионов обеих групп особенно наглядна при учете двойневых отелов. Так, в результате 15 отелов после пересадки эмбрионов in vitro было получено только 2 двойни (19,8%), тогда как при аналогичной пересадке свежих эмбрионов этот показатель составлял 56,2% (данные табл.19). Это свидетельствует о более низкой выживаемости эмбрионов in vitro по сравнению с эмбрионами ¡n vivo, число двоек после пересадки которых было на 28,6% выше (48,4%) -достоверно при Р<0,05.

Таблица 21

Зависимость стельности от числа деконсервированных эмбрионов

in vitro и in vivo, пересаженных одному реципиенту

Пересажено Пересаже Число Число в том числе

эмбрионов но реци- стельных Учтено отелов

1 реципи- эмбрионо пиен- реципиентов, отелов двойнями,

енту в, всего тов п-% п-%

in vitro I 9 9 3-33,3 2 ■

2 92 46 18-39,1 15 2-19,8

in vivo 1 568 568 274-48?2 не учит. не учит.

2 140 70 42-60,0*** 31 15-48.4*

* Р<0,05 ***Р<0,001 Результаты исследований по получению и пересадке эмбрионов, полученных путем экстракорпорального оплодотворения ооцитов, показали, что их жизнеспособность, в том числе в условиях крио- и деконсервации, уступает эмбрионам, полученным методом трансплантации. Уровень стельности при пересадке свежих 7-9-сугочных эмбрионов, полученных in vitro, составил 37,3%

(22/59), тогда как при пересадке эмбрионов in vivo - 54,9% (516/940). Аналогичные показатели при »пересадке деконсервированных эмбрионов составляли 38,2% (21/55) и 49,5% (316/63S) соответственно.

Таким образом, технология получения эмбрионов крупного рогатого скота на основе оплодотворения яйцеклеток в культуре in vitro позволяет получать до 33% биологически полноценных эмбрионов на стадии развития морула-бластоциста с прижнвляемостью 34,0-50,0% после пересадки свежих и 33,339,1% от пересадки после замораживания-оттаивания.

4. ПРАКТИЧЕСКОЕ ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ускоренное размножение мясного скота абердин-ангусской породи в хозяйствах Брестской области. Новым стратегическим направлением в странах с развитым животноводством является сокращение численности молочных коров при одновременном развитии мясного скотоводства. Это связано с ростом валовых надоев молока за счет повышения продуктивности коров и вынужденным сокращением дойного стада, что, в свою очередь, ведет к сокращению производства говядины. Ее недостаток покрывают за счет разведения мясных пород.

В Белоруссии, особенно в полесской зоне Брестской области имеются самые благоприятные условия для развития мясного скотоводства, поскольку полесские земли могут быть привлечены к ведению данной отрасли без больших капиталовложений. В ряде хозяйств Брестской области уровень продуктивности дойного стада находится в пределах 2000 кг молока, что связано с хроническим недостатком кормов, изношенностью оборудования, недостатком рабочей силы. В этой связи повышение эффективности отрасли возможно за счет организации мясного скотоводства.

Для условий Брестской области наиболее приемлемой для разведения является абердин-ангусский мясной скот, который отличается малоплодностью и легкостью отелов, высокой приспособляемостью к климатическим условиям и неприхотливостью к кормам.

В связи со сложной экономической ситуацией приобретение быков-производителей по импорту крайне сложная проблема, решение которой представляется возможным при использовании биотехнологических методов, в частности трансплантации эмбрионов.

В 1995 году из Головного селекционного центра Украины (г. Переялав-Хмельницкий) было завезено 23 телки случного возраста чистопородных абердин-ангусов канадской селекции для использования в качестве доноров эмбрионов. Одновременно завезли сперму высококлассных ангусских быков Камнл и Ранг» для осеменения доноров. В последующем для прилития свежей крови из-за рубежа завозилась сперма других быков, а также замороженные эмбрионы. Путем межпородной пересадки было получено 73 высокоценных ремонтных бычка и 85 телочек, положивших начало формированию чистопородного поголовья абердин-ангусов.

В результате целенаправленной работы по программе ускоренного I создания чистопородных стад мясного скота с использованием современных селекционных и бнотехнологических методов уже к 2003 году в полесской зоне Бресткой области (колхозы "Молодово" и "Красная звезда" Ивановского района) было сформировано два мясных стада абердин-ангусской породы, в которых в настоящее время насчитывается более 1000 голов.

Размножение крупного рогатого скота различных пород биотехно.чогическими методами с целью обеспечения племпредприятий Республики Беларусь генетически ценными быками~произеодителями. Согласно плану племенной работы с черно-пестрой породой крупного рогатого скота в Республике Беларусь требуется ежегодно поставлять на элевер не менее 758 ремонтных бычков. Для этого необходимо иметь окало 4000 потенциальных быкопроизводящих коров. Такого их количества в республике нет.

Анализ селекционной ситуации показывает, что для ведения жесткого селекционного отбора, комплектации элеверов республики ремонтными бычками и получения высококлассных быков-улучшателей недостающее их количество может быть получено при использовании метода трансплантации эмбрионов. Практический вклад Брестской области в выполнение республиканской племен кой программы является наиболее весомым. Ежегодно на элеверы республики поступает до 30 и более ремонтных бычков черно-пестрой, симментальской, абердин-ангусской, герефордской и лимузинекой пород. В 1999 г. было реализовано 42 бычка со средней продуктивностью матерей-доноров по наивысшей лактации 8888 кг молока с жирностью 4,37%. В 2001 г. средняя продуктивность матерей составила 9435 кг -4,13%, а в 2002 г. уже 10537 кг жирностью 4,14%, Бычков было продано соответственно 34 и 25 голов. Всего в период с 1996 по 2003 г.г. на элевер поступило 193 ремонтных бычка от высокоценных родителей. В настоящее время в целом по республике в 6 госплемпредприятиях от общего числа быков-производителей до 10-18% составляют быки-трансплантаты. Из этого числа около 80% получены в Брестской областной лаборатории по трансплантации эмбрионов.

По своему вкладу в получение ремонтных бычков Брестская областная лаборатория по трансплантации эмбрионе« находится на уровне крупнейших племзаведов республики "Россь" и "Кореличи", а по наследственным качествам этих бычков значительно выше. На сегодняшний день в Брестском госплемпредприятии на проверке по качеству потомства находится 10 быков-трансплантатов, или 15,4% от общего числа быков-производителей (65 голов). Об их генетическом потенциале можно судить по происхождению. Так, у 6 быков линии Рефлекшн Соверинг общий отец - бык Менол № 389192, по происхождению немецкий голштин, продуктивность матери которого по 6-й лактации составляет 13145 кг молока с содержанием жира 5,03%. Продуктивность матерей, коров-доноров, 8500-11141 кг молока жирностью 3,83-4,13%, От других быков-трансплантатов симментальской, абердин-ангусской, герефордской лнмузинской пород, получают сперму для искусственного осеменения племенных мясных стад ряда племзаводов, в частности "Приозерный" и "Дружба" Бресткой области и для промышленного

. скрещивания низкопродукгивного молочного стада. Племзавод "Дружба" имеет I также быков-лимузинов, полученных методом трансплантации, для естественного покрытия коров.

Создание групп молочного и мясного скота « хозяйствах Брестской области. Использование трансплантации эмбрионов в интенсификации воспроизводства крупного рогатого скота в Брестской области позволило создать в ряде хозяйств высокопродуктивные группы молочного скота, которые используются для качественного улучшения стала. В число таких хозяйств вошли племзаводы и племхозяйетва "Луч11, "Дружба", "Мухавец", "Октябрь", "ЗакозельскиЙ" и некоторые другие, Племзавод "Дружба", помимо высокопродуктивного молочного скота, специализируется на разведении симментальской, лимузинской и шаролезской пород. С использованием биотехнологии трансплантации эмбрионов здесь обновлено и значительно увеличено поголовье снмменталов комбинированного направления продуктивности с высоким генетическим потенциалом путем пересадки эмбрионов от коров-доноров симментальской породы со средней продуктивностью 6858 кг молока и содержанием жира 4,15%. Увеличено стадо мясной породы лимузин с использованием канадской селекции путем завоза и пересадки замороженных эмбрионов из Головного селекционного центра Украины. Группы симментальского скота созданы также в племхозяйстве "Октябрь".

Следует отметить, что полученный в исследованиях чистый генетический материал может быть использован для дальнейшей работы с целью повыше-ния продуктивных качеств молочного н мясного стада.

ВЫВОДЫ

1. Установлена высокая эффективность стимуляции полиовуляции гипофнзарными гонадотропинами различного типа - фоллитропина (Литва), ФСГ-супер (Россия), ФСГ-п (США) и фолликотропина (Чехия). Наиболее высокие результаты были получены при использовании фолликотропина; выход качественных эмбрионов составил 75,0%, или 8,1 в среднем на донора. Аналогичные показатели при использовании первых трех препаратов находились в пределах 67,4-67,6% и 5,9-6,3 соответственно [2,10,19,20,21,22, 25,29,42,4412. Разработанный способ стимуляции суперовуляции у коров при однократном введении препаратов ФСГ с пролонгатором поливиниловым спиртом позволяет повысить качество эмбрионов в зависимости от типа ФСГ на 7,5-15,2% и увеличить выход пригодных эмбрионов на 1,4-3,3 в среднем на донора при 8-кратном снижении затрат труда и стрессового воздействия на животное по сравнению с общепринятым 8-кратным введением препаратов [4, 10,16,33,431.

3. По эффективности стимуляции пелиовуляции не установлено преимущества мясных пород абердин-ангусской, герефордской и шаролезской перед чсрно-псстрым молочным скотом: соответственно при среднем числе овуляций 11,2; 12,2 и 12,2 прошв 11,5 выход качественных эмбрионов составил

5,5; 6,6 и 7,0 против 6,3 на донора. Повышенной реакцией.на введение экзогенных »гонадотропинов отличаются молочно-мясные кимментаяы канадской селекции, аналогичные показатели у которых составляют 17,0 и 9,3 соответственно [26,42,44].

4. Повышение кратности гормональных обработок не оказывает заметного влияния на суперовуляторную реакцию и общий выход зародышей, но отмечается нестабильное снижение их качества. Эти показатели в значительной степени зависят от породных и индивидуальных отличий животных. При многократном использовании черно-пестрых коров-доноров положительные результаты получены на протяжении 4-5 лет, коровы симментальской и абердин-ангусской пород могут использоваться в течение 2-2,5 лет, после чего отмечается снижение качества эмбрионов, использование в течение года шаролезского скота было наиболее эффективным. У коров-доноров герефордской породы отмечается снижение основных показателей уже после 1-й обработки, что ограничивает возможность их многократного использования [1,2,10,18,26,42,44].

5. При применении модифицированного способа вымывания эмбрионов по сравнению с известными сокращаются затраты времени на одну операцию при повышении извлекаемое™ эмбрионов на 6,7-7,7%. Разработанное устройство для нехирургического извлечения повышает эффективность получения эмбрионов на 13% и в 2 раза сокращает время на одну операцию по сравнению с двухканальным катетером "Нойштадт". Разработанный эмбркофнльтр исключает потери и в 2-3 раза сокращает трудоемкость процессов поиска и оценки качества эмбрионов [10,11,14,20,25].

6. Разработанное гибкое телескопическое устройство для пересадки эмбрионов позволяет повысить приживляемость свежих и деконсервированных эмбрионов на 19,5 и 13,8% по сравнению с использованием базового устройства, катетером "Нойштадт": 71,4 и 59,2% против 51,9 и 45,4% соответственно [13,19,23,24,25].

7. Установлено, что при межпородной пересадке породная принадлежность эмбрионов не оказывает отрицательного влияния на приживляемость и превышает этот показатель по сравнению с внутрипородной пересадкой: уровень стельности при пересадке свежих эмбрионов по симментальской породе составляет 60,7%, герефордской - 60,9%, шаролезской - 60,0% против 53,7% по черно-пестрой. Приживляемость деконсервнрованных эмбрионов при межпородной пересадке находится на одном уровне с внутрипородной [8,10,25,26,35,41].

8. При ипсилатеральной пересадке реципиенту двух эмбрионов уровень стельности составляет 59,8% при выходе двоен 48,8%, что позволяет получать до 1,5 телят на один отел. Контрлатеральная пересадка эмбрионов предварительно осемененному реципиенту обеспечивает 63,2% стельности, но число двойневых отелов снижается до 31,4%, что зависит от показателя оплодотворяемости от первого осеменения по хозяйству в целом. При межпородной пересадке эмбрионов герефордов и абердин-ангусов с целью получения двоен стельность и выход двоен не снижаются по сравнению с

внутри породной пересадкой: 59,7 н 64,4% и 51,4 и 46,9% против 59,8 н 48,8% соответственно [9,19,21,38). <

9. При получении разнопородных двоен имеет место доминирующее влияние чужеродных эмбрионов По отношению к эмбрионам, идентичным породе реципиента, выражающееся в повышении выживаемости после нехирургической пересадки. Приживляемость эмбрионов герефордов н снмменталов при одновременной пересадке с черно-пестрыми эмбрионами заметно выше последних и составляет 41,9 и 40% против 30,2 и 30% соответственно [9,38].

10. Установлено, что трансцервикальиая пересадка декоисервнрованных эмбрионов позволяет получать более 30% стельностей у коров с нарушениями воспроизводительных функций неясной этнологии {5,17,46].

11. Применение нового непроникающего криофилактика дисахарнда трегалозы для уменьшения осмотического шока при деконсервации более эффективно по сравнению с традиционным использованием сахарозы: сохранность эмбрионов и стельность составляют 95,9 и 54,3% против 93 и 50,7% соответственно, что не уступает пересадке свежеполученных эмбрионов (56% стельности) [3,6, 10,28,30,32,36,37,41,48].

12. При нехирургической пересадке эмбрионов на стадии развития поздней морулы бычков рождается достоверно на 10,4% больше, чем телочек, при пересадке поздних бластоцист, напротив, на 8% больше телочек, чем бычков [40,47].

13. Установлено, что достоверность определения пола 6-8-суточных эмбрионов методом, основанным на анализе ДНК специфических участков У-хромосом составляет 93,8%. Микробиопсия н процессы замораживания-оттаивания снижают жизнеспособность эмбрионов на 9,3%: приживляемость эмбрионов с определенным поломи интактных после деконсервации составляет 41,4 против 50,7% соответственно [45].

14. Микрохирургическое разделение эмбрионов с помощью разработанного устройства существенно упрощает и ускоряет процедуру разделения н по эффективности не уступает методу разделения с помощью сложной микроманнпуляционной техники: стельность при пересадке реципиентам по 2 демнэмбриона составляет 61,9 и 65,8% соответственно (при пересадке 2 интактных эмбрионов 61,5%). Для разделения с равным успехом могут использоваться свежеполученные и деконсервированные эмбрионы: при пересадке реципиентам двух свежих или деконсервированных полуэмбрионов стельность составляет 65,8 и 66,7% соответственно [7, 9, 10, 12, 25, 27, 29,31, 34,38,41].

15. Технология получения эмбрионов крупного рогатого скота путем оплодотворения ¡п VI(го позволяет достичь уровня оозревания ооцитов до стадии оплодотворения 43,4%, получать до 33% биологически полноценных эмбрионов на стадии развития морула-бластоциста с приживляем остью при пересадке 1 и 2 эмбрионов 50-34% при пересадке свежих и 33,3-39,1% после замораживания-оттаивания соответственно [39].

16. При получении эмбрионов in vitro использование разработанного устройства для культивирования позволяет повысить уровень дробления зигот к выход эмбрионов до 54,8 и 33% соответственно, по сравнению с применением эксикатора (23,1 и 10,5%) [15].

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Для повышения эффективности индуцирования попиовуляцин, выхода и качества эмбрионов у коров-доноров при сокращении затрат труда и стрессового воздействия на животное рекомендуется однократное подкожное в области лопатки введение препаратов ФСГ в суспензии поливинилового спирта,

2. Для нехирургнческого извлечения и сбора эмбрионов предлагаются усовершенствованный способ и разработанные устройства, позволяющие повысить выход эмбрионов от числа овуляций до 80,9%, в 2-3 раза снизить трудоемкость процесса, потери эмбрионов и время нахождения их вне организма.

3. Предлагается телескопическое устройство для трансцервикальной пересадки, которое позволяет проводить аппликацию эмбрионов в верхушку рога матки без риска травмирования эндометрия и повышает прижнвляемость при пересадке свежих и деконсервнрованных эмбрионов до 71,4 и 59,2% соответственно, что на 19,5 и 13,8% выше, чем при использовании базового инструмента, катетера фирмы "НоЙштадт".

4. Пересадка эмбрионов может быть использована как биотехнический метод борьбы с бесплодием у высокопродуктивных коров с нарушениями воспроизводительных функций.

5. При получении монозиготных двоен предлагается устройство для микрохирургического разделения эмбрионов, использование которого позволяет проводить разделение эмбрионов в условиях ферм с эффективностью, не уступающей использованию дорогостоящей микроманипуляционной техники.

СПИСОк* ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кириллова В.Л., Лебедев В.И., Бабенков В.Ю. Влияние кратности суперовуляцин коров-доноров на качество эмбрионов. / Животноводство, 1986. • № 10, с. 45-46.

2. Мадисон В.В., Мэдисон Л.В., Бабенков В.Ю., Лыгина О.П., Сураевэ Т.Н. Внедрение и практическое использование биотехнологии трансплантации эмбрионов в племенном скотоводстве. - М. —1987, 83 с.

3. Бабенков В.Ю., Бабенкова Л. В. Допустимость изменений режима замораживания эмбрионов. //Зоотехния. - 1991. - Хг 11, с. 62-63.

4. Бабенков В.Ю. Стимуляция суперовуляции у коров одной подкожной инъекцией ФСГ в суспензии поливинилового спирта, // Зоотехния. - 2003. - № 8 - С. 27-29,

A4

5. Бабенков В.Ю. Опыт использования трансплантации эмбрионов как биотехнического, метода борьбы с бесплодием высокопродуктивных коров. //Ветеринарная медицина Беларуси. - 2003. - Ks 3 - С. 30-31,

6. Бабенков В.Ю., Кыса И.О., Бабенкова Л.В., Сивая H.H., Пронысо А.Ф., Радкевкч В.В., Вестфаль Я., Рошлау К. Сравнение двух способов криоконсервацни эмбрионов крупного рогатого скота. // Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства: сб. науч. тр. БСХА. - Горки. - 1996, с. 130-132.

7. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Сивая H.H., Бабенкова Л.В., Радкевич В.В., Вестфаль Я., Рошлау К. Дисекция деконсервирован ных эмбрионов. // Акт. пробл. ннтенс. разе, животное,: сб. науч. тр. БСХА. - Горки,-1996, с. 132-134.

8. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Сивая H.H., Пронысо А.Ф., Радкевич В.В. Сравнение эффективности трансплантации эмбрионов различного происхождения. И Акт. пробл. разв, животное.: сб. науч. тр. БСХА. - Горки. - 1996, с. 184-185.

9. Бабенков В.Ю. Получение лвоен крупного рогатого скота с использованием биотехнологических методов. // Уч. зап. Витебской гос. акад. ает. мед, - 2000. - Т.36, ч,1 -с. 126-127.

10. Бабенков В.Ю. Использование трансплантации эмбрионов в воспроизводстве крупного рогатого скота Бресткой области. // Зоотехническая наука Беларуси. -Минск, 2000.- Т.34 - с. 62-67.

П. A.c. 1704775 СССР, МКИ5 А 61 Д 19/02. Устройство для сбора эмбрионов животных. / Бабенков В.Ю., Бабенкова ДВ. - Ks 4820659/15 (030032); Заявл. 15.03.90; Опубл. 15.09.91, Бюл. J6 2 // Огкр. Изобр. - 1992. - № 2.

12. A.c. 1727819 СССР, А 61 Д 19/02. Устройство для разделения эмбрионов животных /Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В. - № 4807032; Заявл. 15.02.90; Опубл. 22.12.91, Бюл. № 15 //Огкр. Изобр. -1992.- № 15.

13. A.c. 1796171 СССР, А 61 Д 19/04 Устройство для трансплантации эмбрионов. /Бабенков В.Ю.. Бабенкова Л.В. -Кг 4769683; Заявл. 19.12.89; Опубл.8.10.92, Бюл. № 7 // Откр, Изобр. -1993. - Jfe 7.

14. Патент СССР Кг 1792327. Устройство для нехирургического извлечения эмбрионов у животных. / Бабенков В.Ю., Булев ич И.И., Бабенкова Л.В. // Откр. Изобр. 1993, бюл. №4.

15. Патент СССР № 1822341, Устройство для культивирования эмбрионов животных. / Кононенко В.Л, Романов Ю.Д., Бабенков В.Ю., Васин В.Т. // Откр. Изобр. 1993, бюл. №22.

16. Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Якубец Ю.А., Гоколов В.П. Стимулятор пролонгации фоллинулостимулирующего гормона для суперовуляции у коров-доноров. // Заявка Ks а20020647 от 23.07.2002 г. на выдачу патента на изобретение с приоритетом по дате. Опубл. 30.03.2003 г., бюл. Ks 1,с. 16.

17. Рекомендации по воспроизводству крупного рогатого скотаУ Кыса И.О., Семенов Б.Я., Голубец Л.В., Заглубоцкая В.Г., Казакевич В.М., Боршцук А.М., Бабенков В.Ю., Семечко А.П. - Барановичн. - 2001,80 с.

18. Бабенков В.Ю. Влияние многократности вызывания суперовуляцин ФСГ-л и нехирургического извлечения на воспроизводительную способность коров-доноров. //Науч.-техн, прогресс в живот».; тр. 5 конф. ученых и спец., 1986.

19. Бабенков В.Ю., Будевич И.И. Влияние некоторых факторов на результативность нехирургической трансплантации эмбрионов в скотоводстве. // Интенсификация производства в отраслях агропромышленного комплекса на основе использования методов биотехнологии: тез. док. науч. конф. - Минск, 1989, с. 39-40.

20. Будевич И.И., Бабенков В.Ю. Эффективность использования новых 6 иатехнологичесхих приемов при j-ран спланташ и эмбрионов. // Интенсиф. произв. в отраслях агропр. компл. на основе использования методов биотехнод.: тез, докд. науч. конф.-Минск, 1989, с. 40-41.

21. Бабенков В.Ю. Эффективность нехнрургнческон трансплантации эмбрионов. // Транспл. эмбр. кр, рог. скота: тез. докл. науч.-метод. сов. - Жодино. - 1989, с.63-65.

22. Бабенков В.Ю. Совершенствование способа индуцирования суперовупяцин у коров-доноров. И Биотехнология и воспроизводство в животноводстве: тез .докл. иауч.-практ, конф.. - Горкн. - 1991, с. 4-6,

23. Бабенков В.Ю., Семечко А.П. Эффективность трансиервикальной пересадки эмбрионов с помощью нового инструмента. // Биотехн. и воспр. в животн.: тез. докл. науч.-практ. конф. - Горкн. -1991, с. 6-8.

24. Бабенков В.Ю. Инструмент нового типа для нехнрургическоб пересадки эмбрионов, И Генетико-селекционные и технологические проблемы разведения с.-х. животных: тез. докл. науч.-практ. конф. - Киев. - 1994, с. 73-74.

25. Бабенков В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова Л.В, Сивая H.H. Результаты н перспективы практического использования трансплантации эмбрионов. U Селекционно-генетические и биотехнологические проблемы разведения кр. рог. ск.: тез. докл. 2 межгос, науч.-практ. конф.-Брест. - 1995, с, 31-33.

26. Бабенков В.Ю., Кыса И.О., Бабенкова Л.В. Трансплантация эмбрионов у коров породы шаролс. U Селекц.-геиет. и биотехн. проблемы развел, кр. рог. ск.: тез-докл. 2 меж гос. науч.-практ. конф,—Брест. — 1995, с. 33-35.

27. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Вестфаль Я., Сивая H.H., Бабенкова Л.В. К вопросу получения монозиготных двоен крупного рогатого скота. Н Селекц.-генет. и биотехн. пробл. развед. кр. рог. ск.: тез. докл. 2 мсжгос. науч.-практ. конф. - Брест. -1995, с. 64-66.

28. Бабенков В.Ю. Влияние способа оттаивания на жизнеспособность деконсервированных эмбрионов. Н Научные основы интенсивного развития животноводства: тез докл. междун, конф.-Горки. —1995, с. 13.

29. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Сивая H.H. Практические результаты и перспективы использования трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. // Научные основы интенсивного развития животноводства: тез докл. междун. конф, - Горки. - 1995, с. 39,

30. Бабенков В.Ю., Кыса И.О. Использование этиленгликоля при замораживании эмбрионов. И Новые методы селекции и разведен и* высокопродуктивных пород и типов животных: матер, науч.-практ, конф. —Киев, —1996, с. 304.

31. Бабенков В.Ю., Кыса И. С. Микрохирургическое разделение криоконсервированных эмбрионов. // Нов. мет. сел. и разе, высоко пр. пород и типов животных: матер, науч.-практ. конф,-Киев. - 1996, с.305.

32. Бабенков В.КХ, Кыса И.С., Бабенкова Л .В., Сивая H.H., Вестфаль Я. Влияние различных способов криоконсервации и деконсервации эмбрионов на их жизнеспособность. Н Использ. трансп. эмбр. в сел. и разе. с.-х. жнвотн.: матер, межд. науч.-практ. конф. - Аская ил-Нова. - 1997, с. 6-7.

33. Бабенков В.Ю., Токолов В.П., Монсеенко С.И. Пролонгирование действия ФСГ поливиниловым спиртом. // Использ. трансп. эмбр. в сел. и разв. с.-х. животн.: матер, межд. науч.-практ. конф. - Аскания-Нова. —1997, с. 8-9.

34. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Сивая H.H., Вестфаль Я., Рошлау К. Практическое применение метода днеекции ранних эмбрионов. // Использ. трансп.

эмбр. в сел. и разе. с.-х. животн.: матер, межд. науч.-практ. конф. - Аскания-Нова, -1997, с. 36-37.

35. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Сивая H.H., Рошлау К. Приживляемость свежепол ученных н декоисервированвых эмбрионов в зависимости от породных особенностей коров-доноров. // Иеподьз. трансп. эмбр. в сел. к разе. с.-х. жнвотн.: матер, межд. науч.-практ. конф- - Аскания-Нова. - 1997, с. 38-39.

36. Бабенкой В.Ю., Кыса И.С., Бабенкова Л.В., Лущинская H.H., Рошлау К., Вестфаль Я. Совершенствование методов замораживания-оттаивания эмбрионов. // Конкуре нтносп. произв. продукции животное, в Респ. Беларусь: сб. тр. межд. науч.-произв. конф.-Жодино, - 1998, ч. 1,с. 89,

37. Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В. Использование дксахарида трегалозы при декоисервации эмбрионов. И Сельскох. биотехн.: мат. межд, науч.-практ. конф. — Горки. -1998, е.182-184.

38. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В. Получение двоен методом трансплантации эмбрионов. It Сельскох. биотехн.: мат. межд. науч.-практ. конф. -Горки.-1998, с. 255-257.

39. Бабенков В.Ю., Кыса И.С Культивирование изолированных бластомеров 4-8-клеточных бластомеров крупного рогатого скота, полученных in vitro. // Конкурентное!!, произв. ирод, животн. в Респ. Беларусь: сб. тр. междун. науч.-произв. конф. - Жодино. - 1998, ч. I, с, 89.

40. Бабенков В.Ю, Кыса И.С, Детерминация пола и стадия развития эмбрионов при трансплантации. I! Конкурентно«!, произв. продукции животное, в респ. Беларусь: сб. тр. междун. науч.-произв, конф.—Жодино. -1998, ч, 2, с. 79.

41. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова Л.В., Лущинская H.H., Радкевщ В.В,, Рошлау К., Вестфаль Я, Эффективность трансплантации различных групп эмбрионов. // Кон курс нтносп. произв. продукции животн. в Респ. Беларусь: сб. тр. междун. науч.-практ. конф. - Жодино. - 1998, ч. 2, с. 93-94,

42. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Стимуляция суперовуляции у коров-доноров различных пород. // Сельскох. биотехн.: матер, 2 междун. науч.-практ. конф. — Горки. -2001,с. 349-350.

43. Бабенков В.Ю., Якубец Ю.А., Бабенкова Л.В., Кыса И.С, Пролонгирование действия гипофиз арных гонад отропннов при стимуляции суперовуляции у коров-доноров. И Сельскох бнотехн.: матер. 2 междун. науч.-практ. конф,- Горки. - 2001, с. 351-353.

44. Бабенков В.Ю., Жук Н.Ф. Стимуляция суперовуляции у коров-доноров различных пород. // Интенсифик. произв. продуктов животноводства: матер, межа, науч.-произв. конф. - Жодино. - 2002, с. 6.

45. Бабенков В.Ю. Определение пола эмбрионов крупного рогатого скота методом гибридизации ДНК Y-хромосом. И Иитенсиф. произв. пред, животн.: мат. межд. науч.-произв. конф, - Жодино. - 2002, с.7.

46. Бабенков В.Ю., Жук Н.Ф., Черневский НА. Пересадка эмбрионов крупного рогатого скота как биотехнический метод борьбы с бесплодием. // Интенсиф. произв. прод. животн.: мат. межд. науч.-произв. конф. - Жодино. -2002, с. 8.

47. Бабенков В.Ю. Зависимость соотношения полов при трансплантации от стадии развития эмбрионов. / Ветер, газ. - 1997, № 1 (35).

48. Кыса И.С., Бабенков В.Ю., Бабенкова JI.B,, Сивая H.H. Влияние некоторых факторов на эффективность деконсервацни эмбрионов. / Ветер, газ. -1997, № 6(40).

Издательство РУЦЭБТЖ 142132, Московски обл., Подольский р-н, аДубровшщ Тел. {8 - 27) 65-14-24, (8 - 27) 6S-U-07

Сдано в набор 12.04.2004. Подднс«но « печать 13.04.2004 _Заказа g. П«ч. л. 2.1. Тираж 100 уо._