Распространение возбудителя Лайм-боррелиоза в Ставропольском крае и совершенствование методов его индикации

Орлова, Татьяна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Распространение возбудителя Лайм-боррелиоза в Ставропольском крае и совершенствование методов его индикации
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Распространение возбудителя Лайм-боррелиоза в Ставропольском крае и совершенствование методов его индикации"

003471367

Орлова Татьяна Николаевна

РАСПРОСТРАНЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛАЙМ-БОРРЕЛИОЗА В СТАВРОПОЛЬСКОМ КРАЕ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЕГО ИНДИКАЦИИ

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь - 2009

2 8 МАЙ 2Ш

003471367

Работа выполнена в ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители: доктор биологических наук

Василенко Надежда Филипповна;

доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Евгений Николаевич.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

5 ; ; , 5 . г Будыка Дмитрий Александрович;

кандидат биологических наук Светлакова Елена Валентиновна.

Ведущая организация: ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский

противочумный институт» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится « А, У » ¿¿М)/^. 2009 г. в 00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д.1, корпус 2., аудитория 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан « » >МХ1^_2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета 14 "^^Л^ЬС^-л^ И.В. Ржепаковский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Лайм-боррелиоз или иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), является наиболее распространенной зоонозной природно-очаговой инфекцией, связанной скл еща.м йро да /^oí/cí .В оз бу дите л я ai и Лайм-боррелиоза (ЛБ) являются спирохеты,' вхЬдящиё:в комплекс Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) (Караваев B.C., Иванов И.Д., Рябченко A.B., Беклемишев А.Б., 2008). '

Лайм-боррелиоз широко распространен в Скандинавии и странах центральной Европы (Berglund J., Eitrem R., Ornstein К. ét al., 1995; Golde W.T., Ro-binsön-Duhn В., Stöbierski M.G. et al., 1998; Huppertz H.I., Böhme M., Standaerth S.M. et al., 1999).

На территории Российской Федерации располагается большая часть мирового ареала иксодовых клещевых боррелиозов (Горелова Н.Б., Коренберг Э.И. и др., 2001; Коренберг Э.И., 2002; Коренберг Э.И., 2003; Скачков М.В., Яковлев А.Г., Плотникова O.A. и др., 2007; Алешковская Е.С., Благов H.A., Дружинина Т.А., Шалепо Е.В., 2008; Гапонов С.П., Транквилевский Д.В., 2008; Семёнкова Л.О., Буренкова Л.А., Лопатина Ю.В., Наумов Р.Л., 2008). Исключением не является и Южный федеральный округ Российской Федерации (Пашанина Т.П., Сме-лянский В.П., Ткаченко Г.А. и др., 2008; Кормиленко И.В., Москвитина Э.А., Пи-чурина Н.Л., Бабич М.А., 2008; Котги Б.К., Заикина И.Н., 2008).

Как указано в Государственном докладе «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2005 г.», заболеваемость болезнью Лайма возросла в Российской Федерации в 2005 г. по сравнению с предыдущим годом на 16,8 %.

Попытка изучения зараженности иксодовых клещей возбудителем Лайм-боррелиоза на территории Ставропольского края была предпринята в 1996 г. (Котти Б.К., Гудиев О.Ю., 1997). С тех пор исследования в данном направлении не проводились.

Однако, многообразие ландшафтно-географических зон, климатические условия, а также широкое распространение и высокая численность иксодовых клещей способствуют возможности регистрации Лайм-боррелиоза на территории Ставропольского края.

В связи с этим, решение задач, связанных с изучением распространения возбудителя ЛБ на территории Ставропольского края, разработкой диагностических тест-систем и совершенствованием экспрессных методов его индикации с целью повышения их чувствительности и специфичности, являются своевременными и актуальными.

Цель работы: изучение распространения возбудителя Лайм-боррелиоза Borrelia burgdorferi sensu lato на территории Ставропольского края и совершенствование лабораторных экспрессных методов его индикации в полевом материале.

Основные задачи исследования: 1. Определить зараженность иксодовых клещей, диких и домашних животных возбудителем Лайм-боррелиоза на территории Ставропольского края.

2. Провести серологическое исследование сывороток крови населения Ставропольского края на наличие специфических антител к возбудителю Лайм-боррелиоза.

3. Провести исследования, направленные на выявление микст-зараженности иксодовых клещей возбудителями Лайм-боррелиоза и клещевого энцефалита.

4. Разработать биотехнологию изготовления экспериментальной диагностической иммуноферментной тест-системы для обнаружения антигена возбудителя Лайм-боррелиоза.

5. Разработать метод селективного концентрирования возбудителя Лайм-боррелиоза на сконструированном магноиммуносорбенте с последующим проведением ИФА и ПЦР.

6. Изучить диагностическую ценность разработанных экспрессных лабораторных методов при исследовании на Лайм-боррелиоз полевого материала, собранного на территории Ставропольского края.

Научная нрвизна работы. На территории Ставропольского края впервые обнаружена инфицированность возбудителем Лайм-боррелиоза иксодового клеща D. marginatus, диких и сельскохозяйственных животных; установлена микст-инфицированность лесного клеща I. ricinus возбудителями Лайм-боррелиоза и клещевого энцефалита; у населения края выявлены специфические антитела к возбудителю ЛБ, что свидетельствует о его распространении на данной территории.

Разработана биотехнология изготовления экспериментальной диагностической иммуноферментной тест-системы для обнаружения антигена возбудителя ЛБ.

Научно-методические разработки использования МИС с последующим проведением ИФА и ПЦР дополняют новыми научными данными сведения о возможности применения иммобилизованных систем, способствующих стабильности, повышению чувствительности методов и проведению эффективной индикации возбудителя ЛБ в биологическом материале.

Практическая значимость работы. Установление распространения возбудителя Лайм-боррелиоза на территории Ставропольского края является основой для разработки комплекса мероприятий по эпидемиологическому и эпизо-отологическому мониторингу, диагностике и профилактике ЛБ.

Полученные данные ориентируют клиницистов Ставропольского края на выявление случаев заболевания населения этой инфекцией.

Применение высокочувствительных МИС в сочетании с экспрессными лабораторными методами (ИФА и ПЦР) позволяет сократить время проведения исследований с 20-21 часа до 1-3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, повысить выявляемость возбудителя ЛБ в полевом материале более чем в два раза.

Показаны преимущества сочетанных методов МИС+ИФА и МИС+ПЦР перед традиционными методами индикации возбудителя ЛБ при апробации в лабораторных и полевых условиях.

Материалы научных разработок легли в основу двух методических рекомендаций «Применение магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования возбудителя Лайм-боррелиоза с последующей постановкой им-муноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ №4 от 30.05. 2008 г.); «Выявление возбудителя Лайм-боррелиоза в полевом материале с применением магноиммуносорбентов», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ №7 от 31.10. 2008 г.).

Материалы диссертации используются на курсах специализации врачей по экспресс-диагностике Лайм-боррелиоза в ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзо-

Ра.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Зараженность возбудителем Лайм-боррелиоза иксодовых клещей, инфици-рованность диких и сельскохозяйственных животных, заболеваемость людей и наличие иммунной прослойки среди населения свидетельствуют о распространении возбудителя ЛБ на территории Ставропольского края.

2. Разработанная биотехнология изготовления экспериментальной диагностической иммуноферментной тест-системы позволяет выявлять антиген возбудителя Лайм-боррелиоза в полевом материале.

3. Селективное концентрирование возбудителя ЛБ путем применения сконструированных микрогранулированных лигнинсодержащих сорбентов с магнитными свойствами позволяет максимально сконцентрировать патоген в исследуемом материале, что увеличивает чувствительность методов на несколько порядков по сравнению с традиционными ИФА и ПЦР.

4. Разработанные сочетанные методы МИС+ИФА и МИС+ПЦР могут использоваться при проведении микробиологического мониторинга природного очага с целью изучения распространения возбудителя ЛБ. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были

представлены на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств — участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств — участников содружества Независимых Государств» (Оболенск;'3-5 октября, 2006); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств — участников содружества Независимых Государств» (Волгоград, 30 сентября -2 октября, 2008); научной конференции лабораторий и отделов Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора (Ставрополь, 2008).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках НИР «Совершенствование эпидемиологического и эпизоотологического мониторинга за лихорадкой Западного Нила, геморрагической лихорадкой с почечным синдромом *и'клещевым боррелиозом в Ставропольском крае (№ Госрегистрации 01.200.7.00^25)» и научной школы: Обеспечение эпидемиологической безопасности населения страны за счет создания различных иммобилизованных систем нового поколения (магнитоуправляемые диагностикумы и липосомаль-ные лекарственные препараты направленного действия) по гранту Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации, НШ-2486.2008.7 в рамках научной темы «Создание твердофазных магнитоуправляемых тест-систем, обеспечивающих эффективный мониторинг за возбудителями опасных бактериальных и вирусных заболеваний», отражено в 16 опубликованных научных работах, в том числе 3 работы — в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного текста; состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения; иллюстрирована 12 таблицами и 18 рисунками. Список литературы включает 202 источника, из них 145 - отечественных и 57 - зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

При выполнении работы исследован клинический и полевой материал, доставленный из 27 административных территорий Ставропольского края: 59 сывороток крови лихорадящих больных; 1185 сывороток крови доноров; 3105 особей иксодорых, клещей, 1937 сывороток крови диких животных; 1036 сывороток крови сельскохозяйственных животных. .

Для получения, . водорастворимого антигенного комплекса использован корпускулярный антиген боррелий,- штамм 1р - 21 геновида Borrelia ajzelii. Для проверки специфичности полученных препаратов использовали коммерческий водорастворимый антиген ЛептоБАСА; типовые штаммы лептоспир: Leptospira Sejroe 3705, L. Pomona Pomona, L. Tarassovi LT - 82 и штаммы-сапрофиты L. biflexa Patoc \, L. biflexa Doberdo. 1, RPE; антиген трепонемный ультраозвученный сухой. Биологическим сырьем при конструировании диагностических препаратов служили иммунные сыворотки крови доноров с высокими титрами специфических антител к возбудителю ЛБ. В качестве матриц при производстве магносорбентов использовали природный отечественный алюмосиликат, магнетит, карбоксиметилированный лигнин. Водорастворимый белковый антигенный комплекс получали по методу Е.Н. Афанасьева (1984). Иммуноглобулины класса G выделяли методом фракционирования белков полиэти-ленгликолем (ПЭГ) - 6000 (Poison A., Potgieter G.M., Largier I.E., 1964). Количе-

ственное определение белка проводили по методу О. Warburg, W. Christian (1941) сравнением спектров поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989). Качество полученных водорастворимых антигенов и имунных сывороток определяли в реакции имму-нодиффузии в 1 % агарозном геле (Difco, USA) по Оухтерлони (1949). Имму-нопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Р.К. Nakane, A. Kawaoi (1974) в модификации Е.А. Ткаченко с соавт. (1982). Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике М. Clark, A. Adams (1977). Микроструктуру поверхности магносорбентов (MC) оценивали по методу Д. Фрайфелдера (1980); удельную поверхность MC - по методу A.A. Клячко-Гурвича (1961); объем и радиус пор — по методу Н.В. Кельцева (1984). Лиофилизацию препаратов проводили в камере TG — 5 (Германия).

Для подтверждения воспроизводимости и достоверности полученных результатов использовали статистические методы (Ащмарин И.П., Воробьев A.Á., 1962; Тамбовцев Е.П., Ахметкапиев С.Г., Пятницкий H.H., 1969). Зараженность клещей определяли по формуле Пуассона (Беклемишев В.Н., 1963). Математическую обработку результатов экспериментов проводили на компьютере (программа MS Office Excel ХР) (Лапач С.Н., Чубенко A.B., Бабич П.Н., 2001).

Результаты исследований и их обсуждение

Изучение распространения возбудителя Лайм-боррелиоза в Ставропольском крае

Для выяснения современной обстановки по распространению иксодовых клещей на территории Ставропольского края нами изучена иксодафауна в различных климатических и ландшафтно-географических зонах края путем сбора и определения видового состава клещей и учета их прокормителей. В течение 2006 -2008 гг. были обследованы 27 административных территорий края.

Разнообразие климата и растительности в разных ландшафтах в сочетании с хозяйственной деятельностью человека (развитое животноводство), большое количество прокормителей создают благоприятные условия для обитания иксодовых клещей. Расчлененность ландшафта определяет мозаичное распределение клещей в отдельных стациях, различие показателей их численности и зараженности возбудителями инфекционных болезней.

Сбор иксодовых клещей осуществляли с апреля по ноябрь в 2006-2008 гг. в период их активного паразитирования.

По данным наших исследований, самыми распространенными иксодовыми клещами на территории края являются Hyalomma marginatum — 36,73 %, Boophilus annulaíus - 26,02 %, Dermacentor marginatus - 10,61 %, Rhipicephalus rossicus — 9,15%, Ixodes ricinus - 7,03 %, Rh. bursa - 5,25 %.

Исследовали как единичных клещей, так и пулы, состоящие не более чем из 15 особей. При формировании пулов учитывали фазу развития клеща, место сбора, вид хозяина (в случае, если клещи сняты с животного).

Видовой состав иксодид, вызывающих ЛБ на территории Евразии, в наших сборах был представлен видом I. ricinus. Наряду с этим видом, исследовали ик-содовых клеЩей, характерных для лесостепной и предгорной ландшафтных зон: D. margindtus, D. reticulatus, Нает. punctata, Rh. rossicus. Также брали в работу эти виды из степного и полупустынного ландшафтов.

Нами сформированы и исследованы 252 пула из 3105 особей. Материалом для исследования служили суспензии клещей после соответствующей подготовки. В течение 2006 - 2008 гг. на территории Ставропольского края методом ОТ-ПЦР нами выявлены 30 положительных проб иксодовых клещей на наличие возбудителя ЛБ, что составило 11,9 ± 1,6 % от общего количества исследованных пулов (таблица 1). Наиболее высокая зараженность установлена в 2008 г. - 4,85 %, что в 15,2 раза выше, чем в 2006 г. и в 69 раз больше по сравнению с 2007 г. Установлена высокая зараженность лесного клеща I. ricinus возбудителем ЛБ - 10,7 ± 1,8 %, при этом имаго составили 88,9 %, нимфы -11,1 %. Кроме того, специфическая рРНК впервые выявлена у клеща D. marginatum- 1,2 ± 0,4 %, который широко распространен на территории Ставропольского края, что указывает на вовлечение в эпизоотический процесс других видов иксодовых клещей.

Общие переносчики и совпадение географических ареалов распространения Лайм-боррелиоза и клещевого энцефалита (КЭ) обусловливают вероятность одновременного заражения человека двумя возбудителями и развитие у него смешанной инфекций (Коренберг Э.И., 2008; Cimperman J., Maraspin V., Lotric-Furlan S. etal., 1998).

В связи с существующей проблемой нами исследованы лесные клещи I. ricinus на выявление микст-зараженности их возбудителями ЛБ и КЭ.

В результате исследования 90 пулов обнаружены три пробы I. ricinus (две — имаго, одна — нимфы), одновременно зараженные возбудителем ЛБ и вирусом КЭ, что составило 3,3 ± 0,9 % от общего числа исследованных проб. При исследовании 90 проб сывороток крови доноров, в одной из них, принадлежащей жительнице г. Ставрополя, обнаружены антитела класса G к вирусу КЭ в титре 1:400.

Для определения круга естественных носителей В. burgdorferi s.l., в той или иной мере поддерживающих эпизоотический процесс на территории Ставропольского края, нами исследованы сыворотки крови диких и сельскохозяйственных животных* в первую очередь, из тех административных районов, где обнаружена зараженность иксодовых клещей возбудителем ЛБ.

При исследовании 1937 сывороток крови диких животных методом ОТ-ПЦР специфическая рРНК обнаружена в 22 пробах (2,4 ± 0,2 %) лесных мышей и шести пробах (1,0 ±0,1 %) полевых мышей, доставленных из Советского и Александровского районов, где не только выявлена наибольшая зараженность

возбудителем Лайм-боррелиоза клещей I. ricinus в 2008 г., но и показана инфицированность клеща D. marginatus.

Положительными были также 14 проб (2,7 ± 0,4 %) крупного рогатого скота (КРС) и 17 проб (3,2 ± 0,6 %) мелкого рогатого скота (МРС), доставленных из Советского и Александровского районов. В целом, зараженность сывороток

крови сельскохозяйственных животных возбудителем ЛБ составила 3,0 ± 0,6 % (таблица 2)!

' Таблица 1

Исследовапие'клещен на наличие возбудителя Лайм-боррелиоза в Ставропольском крае (2006 — 2008 гг.) _

Ландшафтная Административная Фаза Количество Количество положи-

зона территория развития исследованных тельных пулов

клеща пулов абс; . ': %

Лесостепная г. Ставрополь имаго ... 14 7 34,6

нимфы И 2

личинки 1 0

Шпаковский р-н нимфы 1 1 100,0

Изобильненский р-н имаго 5 0 0

нимфы 1 0 ,

Петровский р-н имаго 1 0 0

Александровский р-н имаго 10 2. . 20,0

Предгорная Предгорный р-н имаго 3 1 20,0

нимфы 2 0

г. Пятигорск имаго 3 1 25,0

нимфы 1 0

г. Железноводск имаго 3 1 12,5

нимфы 5 0

г. Кисловодск имаго 112 2 1,8

нимфы 1 0

г. Ессентуки имаго 0 0

Минераловодский р-н имаго 3 0 0

Степная г. Невинномысск имаго 1 0 0

Новоалександровский имаго . . 8 0 0

р-н нимфы 2 0

Благодарненский р-н нимфы 2 0 0

Буденовский р-н имаго 1 0 0

Кировский р-н имаго 1 0 0

Андроповский р-н нимфы 2 0 0

Ипатовский р-н имаго 1 0 0

Кочубеевский р-н имаго 5 0 0

Георгиевский р-н имаго 17 0 0

Туркменский р-н имаго 1 0 0

Труновский р-н имаго 2 0 0

Советский р-н имаго 17 11 63,1

нимфы 2 1

Новоселинкий р-н имаго 3 0 0

Полупустынная Нефтекумский р-н имаго 2 0 0

Левокумский р-н имаго 2 0 0

Курский р-н имаго 5 1 25,0

Общее 252 30 11,9 ±1,6

количество

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что естественным резервуаром ЛБ в Ставропольском крае являются мелкие грызуны (лесные и полевые мыши), а также крупный и мелкий рогатый скот.

На базе кафедры инфекционных болезней ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» нами проведен анализ историй болезней больных, которым был поставлен диагноз «Иксодовый клещевой боррелиоз».

Таблица 2

Результаты исследований сывороток крови животных на наличие

возбудителя Лайм-боррелиоза

Вид животного Число исследованных проб Число положительных проб

абс. %

КРС 511 14 2,7

MPC 525 17 3,2

Лесная мышь 903 22 2,4

Полевая мышь 622 6 1,0

Полевка обыкновенная 412 0 0

Итого 2973 56 1,9 ±0,3

В 2006 - 2007 гт. в различных инфекционных стационарах Ставропольского края находились на лечении 36 больных с диагнозом «Иксодовый клещевой боррелиоз». В 2006 г. в крае зарегистрированы 12 случаев Лайм-боррелиоза, показатель заболеваемости на 100 000 населения составил 0,45. В 2007 г. заболеваемость возросла в 2,49 раза (1,12 на 100 000 населения). Случаи заболеваний в основном регистрировались в г.г. Ставрополе, Пятигорске, Кисловодске, Предгорном и Советском районах, где наиболее часто встречается клещ I. ricinus.

По мнению врачей-инфекционистов (Ткаченко Л.И., Санникова И.В., 2008), на территории края отмечено более легкое течение болезни по сравнению с клиникой, характерной для эндемичных регионов этой инфекции, что может быть обусловлено циркуляцией другого штамма возбудителя.

О степени активности природного очага ЛБ, распространенности его возбудителя можно сделать достоверное заключение по результатам серологического исследования сывороток крови населения, проживающего на территории Ставропольского края. С этой целью нами исследованы сыворотки крови доноров, полученные из ГУЗ «Ставропольская станция переливания крови» в 2006 -2008 гг.

Специфические антитела класса G выявлены в 42 пробах из 1185 исследованных. Наибольшее количество положительных проб обнаружено у доноров г. Ставрополя: в 30 сыворотках крови (3,8 %) из 791 исследованной выявлены специфические антитела класса G к возбудителю ЛБ, причем с высокими титрами (1:800 - 1:3200) - 16 проб (38,1 %). Наличие специфических IgG установлено также в образцах, полученных из Шпаковского, Ипатовского, Изобиль-ненского, Туркменского районов, г.г. Невинномысска и Буденновска. В целом уровень иммунной прослойки к возбудителю ЛБ у жителей Ставропольского

края составил 3,5% при среднем геометрическом титре IgG 459,6 (+12,5 %; -11,1%).

Таким образом, установленная нами высокая зараженность лесного клеща /.ricinus возбудителем ЛБ, вовлечение в эпизоотический процесс клеща D. таг-ginatus, рост заболеваемости и довольно высокий уровень иммунной прослойки населения Ставропольского края к этому возбудителю свидетельствуют о его распространении и указывают на то, что клещ {.ricinus является основным резервуаром и переносчиком ЛБ в данном регионе, при этом ландшафтно-географические, природно-климатические, фаунистические особенности Ставрополья способствуют формированию природного очага Лайм-боррелиоза на его территории, что требует расширенных исследований с применением современных, информативных экспресс-методов для проведения мониторинга за этой инфекцией.

Совершенствование экспрессных методов индикации возбудителя

Лайм-боррелиоза путем разработки иммобилизованных препаратов с магнитными свойствами и конструирования тест-систем

В лабораторной практике существуют методы концентрации искомого патогена: центрифугирование, фильтрация через мембранные фильтры. Особого внимания заслуживает сорбционная технология, в том числе, аффинная.

Магносорбенты с высокой сорбционной активностью синтезировали методом формирования пористой структуры носителя в пристутствии органических полимеров в соответствии с принципами, сформулированными в работе A.B. Брыкалова (1993).

В качестве основного структурного компонента, формирующего остов композиционной твердофазной матрицы, использован природный отечественный алюмосиликат (Афанасьева Е.Е., 2007; Орлова Т.Н., Афанасьева Е.Е., Афанасьев E.H. и др., 2008).

Химическое модифицирование сорбента осуществляли в присутствии кар-боксиметилированного лигнина и карбодиимида. В качестве магнитного компонента при синтезе применяли магнетит (FejO^.

Структура композиционного магносорбента представлена корпускулярной системой, которая состоит из частиц кремнезема, покрытых полимером - карбонизированным лигнином, связанных друг с другом в пространственном каркасе. Размер корпускул определяет величину удельной поверхности MC, а плотность их упаковки - объем и радиус пор.

На основе проведенных исследований определены следующие оптимальные условия получения лигнинсодержащего магносорбента: соотношение компонентов синтеза 1,5:1:1, соответственно Si02: РезО^ карбоксиметилиро-ванный лигнин; время гелеобразования - 2 ч; значение pH гелеобразования -7,0. ! '

Для придания магносорбенту биоспецифических свойств и получения маг-ноиммуносорбента (МИС) на поверхность MC иммобилизовали специфические IgG, выделенные фракционированием ПЭГ-6000 из сывороток крови людей с высокими титрами боррелиозных антител, выявленных в ИФА. Исследования

показали, что концентрация белка 2 мг/мл является оптимальной для полного насыщения антителами сорбента в объеме 0,2 мл 10 % взвеси.

Установлено, что для полного насыщения магносорбента белком достаточно 2 ч при значении pH раствора 6-7 и температуры от 22 до 37 °С.

Принципиальная технологическая схема приготовления алюмосиликатного лигнинсодержащего МИС представлена на рис. 1.

Для выявления антигена возбудителя ЛБ в полевом материале нами разработана биотехнология изготовления экспериментальной иммуноферментной тест-системы.

С целью упрощения и удешевления постановки ИФА, повышения его специфичности и чувствительности в качестве твердой фазы вместо полистироловых планшетов мы применили разработанные нами МИС при постановке «сэндвич» - варианта этого метода для обнаружения возбудителя ЛБ.

Лабораторные испытания алюмосиликатных лигнинсодержащих МИС к возбудителю ЛБ проводили с водорастворимым белковым комплексом, выделенным из корпускулярного антигена боррелий (штамм 1р-21 геновида Borrelia afzelii), полученным в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

При постановке ИФА для выявления антигена использовали ферментме-ченный конъюгат, изготовленный нами методом перйодатного окисления по Р.К. Nakane, A. Kawaoi (1974) в модификации Е.А. Ткаченко и др. (1982).

Для приготовления иммуноферментного конъюгата использовали IgG, фракционированные ПЭГ-6000 из иммунных сывороток крови людей-доноров. Специфическая активность IgG к возбудителю ЛБ, определенная в реакции радиальной иммунодиффузии, составила 1:32 - 1:64.

Полученный иммунопероксидазный конъюгат исследовали на специфическую активность и чувствительность в «сэндвич»-варианте ИФА по методике M.Clark и A.Adams (1977). При этом, рабочий титр иммунопероксидазного конъюгата составил 1:400 - 1:800. Чувствительность конъюгата по водорастворимому антигену - 15 мкг/мл (по белку).

Для контроля специфичности использовали коммерческий водорастворимый антиген Лепто БАСА (используемый для обнаружения специфических антител к лептоспирам); типовые штаммы лептоспир и штаммы лептоспир-сапрофиты; антиген трепонемный ультраозвученный сухой. При этом перекрестных реакций с лептоспирами и трепонемами не наблюдалось.

В результате проведенных лабораторных испытаний МИС к возбудителю ЛБ установлено, что величина ОП водорастворимого антигена В. afzelii превышала величину ОП отрицательного контроля в 3,2 - 3,4 раза.

Для сравнения предложенного нами сочетанного метода МИС + ИФА с традиционным иммуноферментным анализом осуществлена постановка реакции с теми же компонентами, только в качестве твердой фазы использовали полистироловые планшеты, сенсибилизированные IgG против возбудителя ЛБ в течение 18 ч при 4 °С. Время постановки ИФА с применением МИС составило 50-60 мин, а традиционным методом, учитывая 18-ти часовую сенсибилизацию микропланшетов-20-21 ч. При этом показания ОП пробы превышали вели-

чину ОГТ отрицательного контроля в 2,0 — 2,2 раза, что свидетельствовало о более высокой чувствительности ИФА с применением МИС. При раститровке водорастворимого белкового антигена показано, что чувствительность традиционного ИФА составила 15 мкг/мл, а чувствительность ИФА с МИС была выше в 64 раза и составила 235 нг/мл.

Рисунок!. Принципиальная технологическая схема получения МИС.

Полевые испытания разработанного нами сочетанного метода МИС + ИФА проведены при исследовании 2055 особей иксодовых клещей (228 пулов). Установлено, что за счет селективного концентрирования специфического антигена на поверхности МИС те пробы клещей, которые показывали сомнительный результат в ИФА в полистироловых планшетах, в сочетанном методе были положительными. Наряду с этим выявлены положительные пробы и среди тех пулов, которые давали отрицательный результат при исследовании в традиционном ИФА. Селективное концентрирование на МИС дало возможность обнаружить антиген возбудителя ЛБ в 27 пробах, в то время как в ИФА без применения МИС выявлено 10 положительных проб. Таким образом, нами подтверждено наличие антигена возбудителя Лайм-боррелиоза в 10 суспензиях иксодовых клещей и дополнительно выявлено 17 положительных проб. Применение МИС позволило повысить выявляемость инфекционного агента в 2,7 раза (таблица 3).

Таблица 3

Результаты сравнительного исследования иксодовых клещей

с целью выявления возбудителя Лайм-боррелиоза

Метод исследования Количество проведенных анализов (исследованных пулов) Количество положительных результатов

абс. %

ИФА 228 10 4,4 ± 0,9

МИС+ИФА 228 27 11,8 ±1,4

ОТ-ПЦР 252 30 11,9 + 1,6

МИС+ ОТ-ПЦР 252 56 22,2 ± 2,9

Таким образом, при использовании МИС для проведения ИФА не требовались полистироловые планшеты, сокращалось время проведения анализа, включая сенсибилизацию твердой фазы, в 9 - 10 раз, а чувствительность повышалась в 64 раза по сравнению с общепринятым ИФА.

Ничтожно малое количество боррелий в исследуемом материале существенно снижает возможность их индикации при помощи такого высокочувствительного метода, как ПЦР (Нефедова В.В. и др., 2001; Goodman J.L. et al., 1991). Кроме того, трудной задачей представляется обработка проб из окружающей среды, так как в этом случае необходимо использовать особые методические приемы, позволяющие максимально сконцентрировать искомую ДНК (рРНК) и избавиться от посторонних примесей, способных значительно снизить чувствительность ПЦР.

Для устранения этих недостатков мы объединили два метода: высокоэффективное избирательное концентрирование патогена на МИС с последующей постановкой ОТ-ПЦР.

Как было показано выше, методом ОТ-ПЦР в 27 пробах суспензий клещей Iricinus и трех пробах D.marginatus обнаружена рРНК В. burgdorfe- ri s.l., что составило 11,9 ± 1,6 % от общего количества исследованных пулов. Сочетан-ным методом МИС + ОТ-ПЦР рРНК выявлена в 56 пробах (22,2 ± 2,9 %), из

них 1.ricinus - 51 пул, D.marginatus — пять пулов, что позволило подтвердить наличие рРНК возбудителя ЛБ в 30 пробах суспензий клещей и дополнительно выявить 26 положительных проб (таблица 3). Результаты выявления рРНК В. burgdorferi s.l. методом ОТ-ПЦР представлены на рис. 2.

Обозначения: 1-6 - исследуемые пробы без МИС

ОК — отршщтелъный контроль выделения К- контроль отрицательный К+ контроль положительный

Обозначения: 1-6-те же пробы после концентрирования на МИС OK - отрицательный контроль выделения К- контроль отрицательный К+ контроль положительный

Рисунок 2. Результаты выявления рРНК В. burgdorferi s.l. методом ОТ-ПЦР до (А) и после (В) селективного концентрирования проб суспензий клещей на МИС.

Полученные данные свидетельствуют о том, что применение МИС при проведении ПЦР-анализа позволяет на этапе подготовки проб путем многократных промываний сорбента с фиксированным на нем патогеном освобождаться от всевозможных примесей, тем самым исключая их отрицательное влияние на реакцию, что повышает число положительных находок в 1,9 раза.

Таким образом, проведенные лабораторные и полевые испытания экспериментальной иммуноферментной тест-системы для обнаружения антигена возбудителя ЛБ, а также разработанные сочетанные методы индикации МИС+ИФА и МИС+ПЦР свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности при использовании их для микробиологического мониторинга внешней среды. Это позволило нам провести более углублённое изучение природного очага Лайм-боррелиоза и уточнить распространение возбудителя инфекции в отдельных районах Ставропольского края.

выводы

1. На территории Ставропольского края установлена высокая зараженность

возбудителем Лайм-боррелиоза В. burgdorferi sensu lato (10,7 ± 1,8 %) лесного клеща Ixodes ricinus — основного резервуара и переносчика инфекции, а также впервые обнаружена инфицированность этим возбудителем иксо-дового клеща Dermacentor marginatus - 1,2 ± 0,4 %, что указывает на вовлечение в эпизоотический процесс других видов иксодовых клещей.

2. Впервые на территории Ставропольского края определена зараженность

лесного клеща I. ricinus одновременно возбудителями Лайм-боррелиоза и клещевого энцефалита (3,3 ± 0,9 %), что свидетельствует о том, что I. ricinus представляет собой фактор риска в отношении развития микст-инфекции в организме человека.

3. Установлена зараженность возбудителем Лайм-боррелиоза лесных (2,4 ±

0,2 %) и полевых мышей (1,0 ± 0,1 %) и сельскохозяйственных животных (крупного и мелкого рогатого скота) - 3,0 ± 0,6 %, являющихся естественным резервуаром инфекции на территории Ставропольского края.

4. Уровень иммунной'йрбслой&и ^сйлениг^Ставропольского края к возбуди-

телю Лайм-боррелиоза составляет 3,5'%: при среднем геометрическом титре 459,6 (+ 12,5 %; -11,1 %), что-свидетельствует о его распространении в данном регионе.

5. Разработаны биотехнология изготовления экспериментальной диагностиче-

ской иммуноферментной тест-системы для выявления антигена возбудителя Лайм-боррелиоза, обладающая высокой чувствительностью (15 мкг/мл по белку)-'и специфичностью (отсутствие перекрестных реакций с другими спирохетами), и магнитного иммуносорбента, позволяющего повысить чувствительность тест-системы в 64 раза (235 нг/мл).

6. Селективное концентрирование боррелий путем применения разработанно-

го аффинного твердофазного микрогранулированного лигнинсодержащего сорбента с магнитными свойствами позволяет повысить выявляемость возбудителя Лайм-боррелиоза в полевом материале методом ИФА в 2,7 раза, а методом ОТ-ПЦР — в 1,9 раза, сокращая время проведения анализов с 20-21 ч до 1-3 ч.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тохов, Ю.М. Изучение зараженности иксодовых клещей возбудителем Лайм-боррелиоза в Ставропольском крае / Ю.М. Тохов, К.А. Пурмак, Т.Н. Орлова, Н.Ф. Василенко // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников содружества независимых государств: Материалы VII Межгос. науч-практ. конф. государств - участников СНГ (3-5 окт. 2006 г., Оболенск, Московской обл., Россия). - Оболенск, 2006. - С. 67-68.

2. Орлова, Т.Н. Роль иксодовых клещей в формировании природного очага клещевого боррелиоза на территории Ставропольского края / Т.Н. Орлова,

Н.Ф. Василенко, И.В. Чумакова, И.В. Санникова, Г.В. Сысолятина, Ю.М. Тохов // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России: Материалы науч.-практ. конф. (21-22 марта 2007 г., г. Ставрополь). - Ставрополь, 2007. - Ч. II. - С. 47-49.

3. Орлова, Т.Н. Изучение циркуляции возбудителей клещевых боррелиозов на территории Ставропольского края / Т.Н. Орлова, Н.Ф. Василенко, И.В. Санникова, Ю.М. Тохов, К.А. Пурмак // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 26-27 апреля 2007 г. - Москва, 2007. - Т. 3. - С. 214-215.

4. Орлова, Т.Н. Выявление специфических антител к возбудителю Лайм-боррелиоза в сыворотках крови доноров / Т.Н. Орлова, Н.Ф. Василенко, E.H. Афанасьев, И.В. Санникова // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сб. науч. трудов. - Ставрополь, 2007. - С. 237-240.

5. Орлова, Т.Н. Разработка биотехнологии получения магноиммуносорбен-тов для экспресс-диагностики Лайм-боррелиоза / Т.Н. Орлова, E.H. Афанасьев, Н.Ф. Василенко // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сб. науч. трудов. - Ставрополь, 2007. — С. 240-242.

6. Орлова, Т.Н. К вопросу о биотехнологии получения антительного Лайм-боррелиозного иммуноферментного конъюгата / Т.Н. Орлова // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сб. науч. трудов. — Ставрополь, 2007. - С.243-246.

7. Орлова, Т.Н. Иксодовые клещевые боррелиозы и их лабораторная диагностика (обзор литературы) / Т.Н.Орлова // Ставрополь, 2007. — 34 с. - Биб-лиогр. - 131 назв.- Деп. в ВИНИТИ г. Москва 16.07.07, N« 727-В 2007.

8. Орлова, Т.Н. Совершенствование экспресс — диагностики Лайм-боррелиоза / Т.Н. Орлова, E.H. Афанасьев, Н.Ф. Василенко // Вестаик российской военно-медицинской академии. - СПб., 2008. - № 2 (22), — Приложение (часть 1). - С. 211 -212.

9. Орлова, Т.Н. Опыт применения магноиммуносорбента при проведении иммуноферментного анализа для обнаружения возбудителя Лайм-боррелиоза / Т.Н. Орлова, E.H. Афанасьев, Н.Ф. Василенко // Вестник российской военно-медицинской академии. - СПб., 2008. - № 2 (22). - Приложение (часть I). — С. 212-213.

10. Жарникова, И.В. Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс-диагностики различных заболеваний / И.В. Жарникова, И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, В.И. Ефременко, Е.В. Жданова, Т.В. Жарникова, Е.Е. Афанасьева, Т.Н. Орлова и др. // Вестник российской военно-медицинской академии. - СПб., 2008. - № 2 (22). - Приложение (часть I). -С. 212-213.

11. Орлова, Т.Н. Получение и свойства пригодного к иммобилизации ферромагнитного кремнезема, модифицированного карбонизированным лигнином и карбодиимидом / Т.Н. Орлова, Е.Е.Афанасьева, Е.Н.Афанасьев, И.С.

Тюменцева, Н.Ф. Василенко // Вестник Московского государственного университета. Сер. 2. Химия.-2008.-Т. 49.-№ 3.-С. 213-216.

12. Алиева, Е.В. Аффинные сорбенты для экспресс-диагностики заболеваний / Е.В. Алиева, И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, Н.Е. Афанасьев, М.П. Лавре-шин, Е.Е. Афанасьева, Т.Н. Орлова и др. // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - Курск, 2008. - № 1. - С. 5-9.

13. Алиева, Е.В. Опыт применения твердофазных иммобилизованных систем с магнитными свойствами в экспрессных иммуноанализах некоторых заболеваний инфекционной и неинфекционной природы / Е.В.Алиева,; И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, М.П. ЛаВрешин, Н.Е. Афанасьева, Т.Н: Орлова // Технологии живых систем. - Москва, 2008. - № 2-3. - Т. 5. - С. 47-50. 1

14. Орлова, Т.Н. Циркуляция возбудителя иксодового клещевого боррелиоза в Ставропольском крае / Т.Н. Орлова, Н.Ф. Василенко, E.H. Афанасьев, Б.К. Котш // Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территорий государств — участников содружества Независимых Государств» (Волгоград, 30 сентября - 2 октября, 2008). - Волгоград, 2008- С. 260-262.

15. Орлова, Т.Н. Изучение циркуляции возбудителя Лайм-боррелиоза в Ставропольском крае / Т.Н. Орлова, Н.Ф. Василенко, E.H. Афанасьев, И.В. Чумакова и др. // Проблемы особо-опасных инфекций. - Саратов, 2008. — Вып. 2 (96). -С. 20-22.

16. Орлова, Т.Н. Совершенствование лабораторных методов, применяемых для детекции возбудителя Лайм-боррелиоза / Т.Н. Орлова, Н.Ф. Василенко, E.H. Афанасьев, И.С. Тюменцева // Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (г. Киров, 2021 ноября 2008 г.).-Киров, 2008.-С. 103- 107.

Подписано в печать 21.05.2009 Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л. 1,04 Бумага офсетная_Тираж 100 экз.

Уч.-изд.л. 1,2 Заказ 28

Отпечатано в Издательско-полиграфическом комплексе Ставропольского государственного университета. 355009, Ставрополь, ул.Пушкина, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Орлова, Татьяна Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ ЦИРКУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛАЙМ-БОРРЕЛИОЗА (Обзор литературы).

1.1. Характеристика возбудителя Лайм-боррелиоза и его распространение.

1.2. Лабораторная диагностика Лайм-боррелиоза.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Клинический и полевой материал.

2.1.2. Штаммы и антигены микроорганизмов.

2.1.3. Биологическое сырье.

2.1.4. Диагностические тест-системы, использованные при проведении лабораторных исследований.

2.1.5. Оборудование и аппаратура.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Подготовка клещей для исследования методом ОТ-ПЦР.

2.2.2. Подготовка суспензий клещей для исследования методом ИФА.

2.2.3. Выделение иммуноглобулинов.

2.2.4. Методы контроля специфичности и активности антигенов и сывороток.

2.2.5. Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов.

2.2.6. Физико-химические методы.

2.2.7. Лиофилизация биологического материала.

2.2.8. Методы математической и статистической обработки полученных результатов.

Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛАЙМ-БОРРЕЛИОЗА В

СТАВРОЛЬСКОМ КРАЕ.

3.1. Ландшафтно-географическая и природноклиматическая характеристика Ставропольского края.

Видовой состав, распространение и численность

3.2. иксодовых клещей.

Зараженность возбудителем Лайм-боррелиоза ик

3.3. содовых клещей на территории Ставропольского края.

Клещевые микст-инфекции (Лайм-боррелиоз и

3.4. клещевой энцефалит) в Ставропольском крае,.

3.5. Зараженность возбудителем Лайм-боррелиоза диких и сельскохозяйственных животных.

3.6. Инфицированность боррелиями людей в Ставропольском крае.

Глава 4. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭКСПРЕССНЫХ МЕТОДОВ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛАЙМ-БОРРЕЛИОЗА ПУТЕМ РАЗРАБОТКИ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ С МАГНИТНЫМИ СВОЙСТВАМИ И КОНСТ

РУИРОВАНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМ.

4.1. Получение боррелиозного лигнинсодержащего алюмосиликатного магноиммуносорбента и его характеристика.

4.2. Разработка метода селективного концентрирования возбудителя Лайм-боррелиоза на магноим-муносорбенте с последующей постановкой ИФА

4.2.1. Разработка биотехнологии изготовления экспериментальной диагностической иммунофермент-ной тест-системы для выявления антигена возбудителя Лайм-боррелиоза.

4.3. Разработка и проведение сочетанного метода МИС + ОТ-ПЦР для индикации возбудителя

Лайм-боррелиоза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Распространение возбудителя Лайм-боррелиоза в Ставропольском крае и совершенствование методов его индикации"

Актуальность проблемы. Лайм-боррелиоз или иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), является наиболее распространенной зоонозной природно-очаговой инфекцией, связанной с клещами рода Ixodes. Возбудителями Лайм-боррелиоза (ЛБ) являются спирохеты, входящие в комплекс Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) (Караваев B.C., Иванов И.Д., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б., 2008).

Лайм-боррелиозы широко распространены в Скандинавии и странах центральной Европы (Berglund J., Eitrem R., Ornstein К. et al., 1995; Golde W.T., Robinson-Dunn В., Stobierski M.G. et al., 1998; Huppertz H.I., Schmidt H., KarchH., 1993).

На территории Российской Федерации располагается большая часть мирового ареала иксодовых клещевых боррелиозов (Горелова Н.Б., Корен-берг Э.И. и др., 2001; Коренберг Э.И., 2002; Коренберг Э.И., 2003; Скачков М.В., Яковлев А.Г., Плотникова О.А. и др., 2007; Алешковская Е.С., Благов Н.А., Дружинина Т.А., Шалепо Е.В., 2008; Гапонов С.П., Транквилевский Д.В., 2008; Семенкова Л.О., Буренкова Л.А., Лопатина Ю.В., Наумов Р.Л., 2008).

Исключением не является и Южный федеральный округ Российской Федерации (Пашанина Т.П., Смелянский В.П., Ткаченко Г.А. и др., 2008; Кормиленко И.В., Москвитина Э.А., Пичурина Н.Л., Бабич М.А., 2008; Котти Б.К., Заикина И.Н., 2008).

В 2007 году в 65 субъектах Российской Федерации зарегистрированы

2359 случаев заболеваний ЛБ (показатель заболеваемости составил 1,65 на 100 тыс. населения), что на 4, 47% больше, чем в 2006 году (2258 случаев).

В России ЛБ связан, в основном, с двумя геновидами боррелий — В. ga-rinii и В. qfzelii, которые являются основными сочленами боррелиозных паразитарных систем (Иванов И.Д., Беклемишев А.Б., 2002; Кулябина И.Б., Ко-ренберг Э.И., 2007).

Однако, многообразие ландшафтно-географических зон, климатические условия, а также широкое распространение и высокая численность иксодовых клещей и их прокормителей способствуют возможности регистрации Лайм-боррелиоза на территории Ставропольского края.

Поскольку болезнь Лайма протекает с поражением различных органов и систем человека, характеризуется склонностью к хроническому и латентному течению, её называют «великим имитатором» различных человеческих болезней (Деконенко Е.П., Уманский А.Г., Вирич И.Е. и др., 1995). В связи с этим, лабораторные исследования являются весьма важным звеном в диагностике этой инфекции. Однако главной проблемой при этом является большое количество ложноотрицательных и ложноположительных результатов, обусловленных часто ничтожно малым количеством Borrelia burgdorferi s.l. в исследуемом материале и присутствием загрязнений различного характера, мешающих протеканию индикационных реакций (Тихвинский М.С., Воробьев А.А., Яснов С.Н. и др., 1997; Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Нестеренко Л.Н. и др., 2001; Goodman J.L., Jurkovich P., Kramber J.M. et al., 1991 и др.). По оценкам ряда специалистов, значительная часть случаев заболевания ЛБ остается не выявленной, что связано с наличием региональных различий боррелиозных паразитарных систем, с особенностями эпидемического проявления и клинико-патогенетическим своеобразием инфекции (Коренберг Э.И., 1997). В связи с этим, решение задач, связанных с изучением распространения возбудителя ЛБ на территории Ставропольского края, разработкой диагностических тест-систем и совершенствованием экспрессных методов его индикации с целью повышения их чувствительности и специфичности, являются своевременными и актуальными.

Основные задачи исследования:

1. Определить зараженность иксодовых клещей, диких и домашних животных возбудителем Лайм-боррелиоза на территории Ставропольского края.

Научная новизна работы.

На территории Ставропольского края впервые обнаружена инфициро-ванность возбудителем Лайм-боррелиоза иксодового клеща D. marginatus, диких и сельскохозяйственных животных; установлена микст - инфициро-ванность лесного клеща I. ricinus возбудителями Лайм-боррелиоза и клещевого энцефалита; у населения края выявлены специфические антитела к возбудителю ЛБ, что свидетельствует о его распространении на данной территории.

Практическая значимость работы. Установление распространения возбудителя Лайм-боррелиоза на территории Ставропольского края является основой для разработки комплекса мероприятий по эпидемиологическому и эпизоотологическому мониторингу, диагностике и профилактике ЛБ.

Материалы научных разработок легли в основу двух методических рекомендаций «Применение магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования возбудителя Лайм-боррелиоза с последующей постановкой иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ №4 от 30.05. 2008 г.); «Выявление возбудителя Лайм-боррелиоза в полевом материале с применением магноиммуносорбентов», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ №7 от 31.10. 2008 г.).

Материалы диссертации используются на курсах специализации врачей по экспресс-диагностике Лайм-боррелиоза в ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотреб-надзора.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Зараженность возбудителем Лайм-боррелиоза иксодовых клещей, инфицированность диких и сельскохозяйственных животных, заболеваемость людей и наличие иммунной прослойки среди населения свидетельствуют о распространении возбудителя ЛБ на территории Ставропольского края.

3. Селективное концентрирование возбудителя ЛБ путем применения сконструированных микрогранулированных лигнинсодержащих сорбентов с магнитными свойствами позволяет максимально сконцентрировать патоген в исследуемом материале, что позволяет увеличить чувствительность методов на несколько порядков по сравнению с традиционными ИФА и ПЦР.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств — участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств — участников содружества Независимых Государств» (Оболенск,

3-5 октября, 2006); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств — участников содружества Независимых Государств» (Волгоград, 30 сентября — 2 октября, 2008); научной конференции лабораторий и отделов Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора (Ставрополь, 2008).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках НИР «Совершенствование эпидемиологического и эпизоотологиче-ского мониторинга за лихорадкой Западного Нила, геморрагической лихорадкой с почечным синдромом и клещевым боррелиозом в Ставропольском крае (№ Госрегистрации 01.200.7.00925)» и научной школы: Обеспечение эпидемиологической безопасности населения страны за счет создания различных иммобилизованных систем нового поколения (магнитоуправляемые диагностикумы и липосомальные лекарственные препараты направленного действия) по гранту Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации, НШ-2486.2008.7 в рамках научной темы «Создание твердофазных магнитоуправляемых тест-систем, обеспечивающих эффективный мониторинг за возбудителями опасных бактериальных и вирусных заболеваний», отражено в 16 опубликованных научных работах, в том числе 3 работы - в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Орлова, Татьяна Николаевна

ВЫВОДЫ

1. На территории Ставропольского края установлена высокая зараженность возбудителем Лайм-боррелиоза В. burgdorferi sensu lato (10,7 ± 1,8 %) лесного клеща Ixodes ricinus — основного резервуара и переносчика инфекции, а также впервые обнаружена инфицированность этим возбудителем иксодового клеща Dermacentor marginatus - 1,2 ± 0,4 %, что указывает на вовлечение в эпизоотический процесс других видов иксодовых клещей.

2. Впервые на территории Ставропольского края определена зараженность лесного клеща I. ricinus одновременно возбудителями Лайм-боррелиоза и клещевого энцефалита (3,3 ± 0,9 %), что свидетельствует о том, что I. ricinus представляет собой фактор риска в отношении развития микст-инфекции в организме человека.

3. Установлена зараженность возбудителем Лайм-боррелиоза лесных (2,4 ± 0,2 %) и полевых мышей (1,0 ± 0,1 %) и сельскохозяйственных животных (крупного и мелкого рогатого скота) - 3,0 ± 0,6 %, являющихся естественным резервуаром инфекции на территории Ставропольского края.

4. Уровень иммунной прослойки населения Ставропольского края к возбудителю Лайм-боррелиоза составляет 3,5 % при среднем геометрическом титре 459,6 (+ 12,5 %; -11,1 %), что свидетельствует о его распространении в данном регионе.

5. Разработаны биотехнология изготовления экспериментальной диагностической иммуноферментной тест-системы для выявления антигена возбудителя Лайм-боррелиоза, обладающая высокой чувствительностью (15 мкг/мл по белку) и специфичностью (отсутствие перекрестных реакций с другими спирохетами), и магнитного иммуносорбента, позволяющего повысить чувствительность тест-системы в 64 раза (235 нг/мл).

6. Селективное концентрирование боррелий путем применения разработанного аффинного твердофазного микрогранулированного лиг-нинеодержащего сорбента с магнитными свойствами позволяет повысить выявляемость возбудителя Лайм-боррелиоза в полевом материале методом ИФА в 2,7 раза, а методом ОТ-ПЦР — в 1,9 раза, сокращая время проведения анализов с 20-21 ч до 1-3 ч.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современное неблагоприятное развитие эпидемиологической обстановки по Лайм-боррелиозу (иксодовым клещевым боррелиозам) в России выдвигает на первый план задачу изучения природных очагов этой инфекции и проведения своевременного эпидемиологического и эпизоотологи-ческого мониторинга. Лайм-боррелиоз является одним из самых распространенных заболеваний во многих странах мира и регионах России. Границы этой инфекции расширяются и в последние годы претерпели значительные изменения. Таким образом, актуальность проблемы остается в зоне повышенного внимании и требует подробного изучения.

По данным медицинской статистики, в Ставропольском крае, начиная с 1995 г., стали диагностировать новое природноочаговое заболевание - иксодовый клещевой боррелиоз (Лайм-боррелиоз) по клиническим признакам без лабораторного подтверждения.

Попытка изучения зараженности иксодовых клещей В. burgdorferi s.l. на территории Ставропольского края была предпринята сотрудниками Ставропольского научно-исследовательского противочумного института и ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Когти Б.К., Гудиев О.Ю., 1997; Коренберг Э.И., Горелова Н.Б., Постик Д., Котти Б.К., 1999). Клещей исследовали методом культивирования на среде BSK II с последующей индикацией с помощью ПЦР. При этом у нимф боррелии не были обнаружены, а зараженность имаго, по данным авторов, составила 15,9±5,1 %. Клещи оказались инфицированными В. garinii, В. afzelii, В. valaisiana и В. lusitaniae, причем методом ПЦР два последних геновида были обнаружены в России впервые. С тех пор исследования в данном направлении не проводились.

В настоящее время в связи с неблагополучной эпидемиологической обстановкой по Лайм-боррелиозу в соседних регионах со Ставропольем (Краснодарский край, Ростовская и Волгоградская области) (Пашанина Т.П., Смелянский В.П., Ткаченко Г.А. и др., 2008; Кормиленко И.В., Моск-витина Э.А., Пичурина Н.Л., Бабич М.А., 2008), а также регистрацией спорадических случаев заболеваний ЛБ среди населения Ставропольского края и обилием иксодовых клещей на его территории, мы поставили задачу изучить распространение возбудителя Лайм-боррелиоза в Ставропольском крае.

Для выяснения современной обстановки по распространению иксодовых клещей на территории Ставропольского края мы изучали иксодофауну в различных климатических и ландшафтно-географических зонах края, собирая и определяя видовой состав клещей, учитывая их прокормителей. В течение трех лет (2006 - 2008 гг.) были обследованы 27 административных территорий края.

Разнообразие климата и растительности в разных ландшафтах в сочетании с хозяйственной деятельностью человека (развитое животноводство), большое количество прокормителей (природных резервуаров иксодовых клещей) создают благоприятные условия для их обитания. Расчлененность ландшафта определяет мозаичное распределение клещей в отдельных стациях, различие показателей их численности и зараженности возбудителями инфекционных болезней.

По нашим данным, на территории Ставропольского края самыми распространенными иксодовыми клещами являются Н. marginatum — 36,73 %, В. annulatus — 26,02%, D. marginatus — 10,61 %, Rh. rossicus — 9,15 %, I. ricinus - 7,03 %,Rh. bursa -5,25 %.

Установлено, что лесной клещ I. ricinus, являющийся одним из самых распространенных резервуаров и переносчиков возбудителя Лайм-боррелиоза доминирует в предгорных ландшафтах, является массовым представителем в лесостепных ландшафтных зонах, встречается в степных ландшафтах. Не обнаружен этот вид нами только в полупустынной ландшафтной зоне.

Наибольшая активность нападения имаго лесного клеща происходит весной и осенью, летом она снижается, а в пойменных лесах степной зоны имаго в это время вообще не встречаются. В связи с этим сбор иксодовых клещей осуществляли с апреля по октябрь в 2006, 2007, 2008 годах, в период их активного паразитирования.

Как известно, переносчиками ЛБ на территории Евразии являются иксодовые клещи I. ricinus и I. persulcatus (Oschmann P., Kraiczy P. et al., 1999). В наших сборах присутствовал I. ricinus. Наряду с этим видом, исследовали другие виды иксодовых клещей, характерные для лесостепной и предгорной ландшафтных зон: D. marginatus, D. reticulates, Нает. punctata, Rh. rossicus. Также брали в работу эти виды из степной и полупустынной ландшафтных зон.

Нами сформированы и исследованы 252 пула из 3105 особей иксодовых клещей. Исследование суспензий клещей осуществляли с помощью тест-системы «АмплиСенс ® Borrelia burgdorferi sensu lato для выявления 16S рРНК Borrelia burgdorferi sensu lato (В. burgdorferi sensu stricto, B. afze-Hi, B. garinii) в биологическом материале» методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

В 2006 г. нами исследованы 50 пулов иксодовых клещей, собранных в трех ландшафтных зонах (предгорной, лесостепной и степной) на 16-ти административных территориях Ставропольского края. Исследовались особи всех фаз развития клеща: личинки, нимфы и имаго. Методом ОТ-ПЦР выявлены 7 положительных проб клещей I. ricinus, что составило 14 ± 1,3 % от общего числа исследованных пулов. Наибольшее количество положительных проб выявлено в окрестностях г. Ставрополя, причем две из трех положительных проб были сформированы из нимф. Нимфы (одна проба) показали положительный результат и в Шпаковском районе, граничащем с краевым центром. Три положительные пробы из Предгорного района были сформированы из имаго.

Зараженность клещей возбудителем ЛБ, вычисленная по формуле Пуассона, в г. Ставрополе составила 1,05 %, а в целом по краю 0,32 %.

Исследования 162 пулов, проведенные в 2007 г., позволили выявить рРНК возбудителя ЛБ в восьми пробах (4,9 ±0,8 %), из них шесть проб — в окрестностях г. Ставрополя, две — в г. Кисловодске. Все положительные пробы были сформированы из имаго.

Из шести положительных проб, сформированных из клещей, собранных в окрестностях г. Ставрополя, четыре пробы составили клещи I. ricinus, две — D. marginatus.

В 2008 г. эпизоотологическим обследованием были охвачены административные территории Ставропольского края, расположенные в лесостепной, степной и полупустынной ландшафтных зонах. Из 40 исследованных пулов 15 (37,5 ±6,1 %) были положительными. Высокая зараженность клещей установлена в Александровском (9,21 %) и Советском (8,14 %) районах, а также в целом по Ставропольскому краю (4,85 %). В Советском районе положительные пробы распределились следующим образом: 11 проб I. ricinus (10 имаго, одна - нимфы), одна — D. marginatus.

На других территориях края рРНК возбудителя ЛБ выявлена у клещей I. ricinus. в

Таким образом, в течение 2006 - 2008 гг. на территории Ставропольского края методом ОТ-ПЦР нами выявлены 30 положительных проб иксодовых клещей на наличие возбудителя Лайм-боррелиоза, что составило 11,9 ± 1,6 % от общего количества исследованных пулов. Наиболее высокая зараженность клещей возбудителем ЛБ установлена в 2008 г. — 4,85 %, что в 15,2 раза выше, чем в 2006 г. и в 69 раз больше по сравнению с 2007 г. Нами установлена высокая зараженность лесного клеща I. ricinus возбудителем ЛБ - 10,7 ±1,8 %, при этом имаго составили 88,9 %, нимфы -11,1 %. Кроме того, специфическая рРНК впервые выявлена у клеща D. marginatus - 1,2 ± 0,4 %, который широко распространен на территории

Ставропольского края, что указывает на вовлечение в эпизоотический процесс других видов иксодовых клещей.

О видовом расширении переносчиков возбудителя ЛБ свидетельствуют также данные, полученные Ю.А. Приходько, О.В. Никифоровой, В.А. Нагловым (2008), которые обнаружили на территории Украины зараженность В. burgdorferi s.l. не только клещей/, ricinus, но и D. reticulatus, снятых с сельскохозяйственных животных.

По мнению Э.И. Коренберга (2008), в настоящее время перестала существовать отдельная проблема иксодового клещевого боррелиоза и клещевого энцефалита.

В последние годы появились сообщения о микст-инфекциях, переносимых клещами I. ricinus, у которых в организме одновременно присутствуют представители различных микроорганизмов: Borrelia burgdorferi s.l., Babesia microti (возбудитель бабезиоза), Anaplasma phogocytophila (возбудитель гранулоцитарного эрлихиоза человека), риккетсий и ряд других (Алешковская Е.С., Благов Н.А., Дружинина Т.А., Шалепо Е.В., 2008; Sweeney C.J., Ghassemi М., Agger W.A., Persing D.H., 1998; Walker D.H., 1998; Belongia E.A., 2002).

В связи с существующей проблемой нами исследованы лесные клещи I. ricinus с целью выявления микст-зараженности их возбудителями Лайм-боррелиоза и клещевого энцефалита. При этом обнаружены три пробы I. ricinus (две — имаго, одна — нимфы), одновременно зараженные возбудителем ЛБ и вирусом клещевого энцефалита (КЭ), что составило 3,3 ± 0,9 % от общего числа протестированных проб.

В связи с полученными результатами мы провели серологическое исследование сывороток крови доноров на наличие специфических IgG к вирусу КЭ. Иммуноферментный анализ 90 проб сывороток крови доноров позволил в одной из них, принадлежащей жительнице г. Ставрополя, выявить антитела класса G к вирусу КЭ в титре 1:400.

Таким образом, нами впервые на территории Ставропольского края определена зараженность лесного клеща одновременно возбудителями Лайм-боррелиоза и клещевого энцефалита, что обусловливает вероятность одновременного заражения человека двумя возбудителями (ЛБ и КЭ) и развитие у него смешанной инфекции (Cimperman J., Maraspin V., Lotric-Furlan S. et al., 1998).

Для определения круга естественных носителей В. burgdorferi s.L, в той или иной мере поддерживающих эпизоотический процесс на территории Ставропольского края, нами были исследованы сыворотки крови диких и сельскохозяйственных животных, в первую очередь, из тех административных районов, где обнаружена зараженность иксодовых клещей возбудителем Лайм-боррелиоза.

При исследовании 1937 сывороток крови диких животных методом ОТ-ПЦР специфическая рРНК обнаружена в 22 пробах (2,4 ± 0,2 %) лесных мышей и шести пробах (1,0 ± 0,1 %) полевых мышей, доставленных из Советского и Александровского районов, где не только выявлена наибольшая зараженность возбудителем Лайм-боррелиоза клещей I. ricinus в 2008 г., но и показана инфицированность клеща D. marginatus.

Положительными были также 14 проб (2,7 ± 0,4 %) крупного рогатого скота из 511 исследованных и 17 проб (3,2 ± 0,6 %) мелкого рогатого скота из 525 исследованных, доставленных из Советского и Александровского районов. В целом, зараженность сывороток крови сельскохозяйственных животных возбудителем ЛБ составила 3,0 ± 0,6 %.

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что естественным резервуаром ЛБ в Ставропольском крае являются мелкие грызуны, а также крупный и мелкий рогатый скот.

На базе кафедры инфекционных болезней ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» нами был проведен анализ историй болезней больных, которым был поставлен диагноз «Иксодовый клещевой боррелиоз».

В 2006 - 2007 гг. в различных инфекционных стационарах Ставропольского края находились на лечении 36 больных с диагнозом «Иксодовый клещевой боррелиоз». В 2006 г. на территории края зарегистрированы 12 случаев Лайм-боррелиоза, показатель заболеваемости на 100 000 населения составил 0,45. В 2007 г. заболеваемость возросла в 2,49 раза (1,12 на 100 000 населения). Случаи заболеваний ИКБ в основном регистрировались в г.г. Ставрополе, Пятигорске, Кисловодске, Предгорном и Советском районах, где наиболее часто встречается клещ I. ricinus.

При поступлении в стационары Лайм-боррелиоз был заподозрен только у 27,8 % больных, остальные поступали с диагнозом: «ОРВИ, укус клеща». Большая часть больных заразилась на даче или приусадебном участке.

В 83,3 % случаев зарегистрировано острое течение ив 16,7 % - хроническое. Безэритемная форма ИКБ отмечена у 16,7 % пациентов, у половины больных была выявлена классическая кольцевидная эритема.

Почти у всех болезнь начиналась с лихорадочно-интоксикационного синдрома. Все больные предъявляли жалобы на слабость, зуд, жжение в области высыпания, головные боли. Причем, при безэритемных формах лихорадочно-интоксикационный синдром был более выражен.

При объективном обследовании больных отмечалась бледность кожных покровов, гиперемия ротоглотки, у некоторых пациентов выявлен регионарный лимфаденит. При хроническом течении ИКБ у половины пациентов отмечено поражение крупных суставов в виде моноартритов. Поражения центральной или периферической нервной системы, а также сердца не были выявлены.

Лабораторно диагноз подтверждался обнаружением антител классов IgM и IgG. Антитела класса IgM к Borrelia burgdorferi выявляли с помощью тест-системы «Боррелия-IgM-TecT» производства ЗАО «ЭКОлаб», г. Электрогорск. Для определения IgG к возбудителю болезни Лайма использовали тест-систему «Лайм-Бест» производства ЗАО «ВекторБест», г. Новосибирск.

По мнению врачей-инфекционистов (Ткаченко Л.И., Санникова И.В., 2008), на территории Ставропольского края отмечено более легкое течение болезни по сравнению с клинической картиной, характерной для эндемичных регионов этой инфекции, что может быть обусловлено циркуляцией другого штамма возбудителя.

О степени активности природного очага Лайм-боррелиоза, распространенности его возбудителя можно сделать достоверное заключение по результатам серологического исследования сывороток крови населения, проживающего на территории Ставропольского края. С этой целью нами исследованы сыворотки крови доноров, полученные из ГУЗ «Ставропольская станция переливания крови» в 2006 — 2008 гг.

Антитела к возбудителю Лайм-боррелиоза в сыворотках крови доноров выявляли методом ИФА с использованием тест-системы «Лайм-Бест» ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), представляющей собой набор, основой которого являются рекомбинантные антигены Borrelia burgdorferi s.l., иммобилизованные на поверхности лунок полистиролового планшета.

Специфические антитела класса G выявлены в 42 пробах из 1185 исследованных. Наибольшее количество положительных проб обнаружено у доноров г. Ставрополя: в 30 сыворотках крови (3,8 %) из 791 исследованной выявлены специфические антитела класса G к возбудителю ЛБ, причем с высокими титрами (1:800 - 1:3200) - 16 проб (38,1 %). Наличие специфических IgG установлено также в образцах, полученных из Шпаков-ского, Ипатовского, Изобильненского, Туркменского районов, гг. Невин-номысска и Буденновска.

Средний возраст доноров в г. Ставрополе составил от 20 до 25 лет, в основном - это студенты учебных заведений. Профессиональная принадлежность доноров других административных территорий напрямую не связана с работой в лесных массивах или животноводстве (учитель, инженер, электрик и др.). Средний возраст этих категорий лиц находился в пределах от 35 до 45 лет.

В целом уровень иммунной прослойки к возбудителю ЛБ у жителей Ставропольского края составил 3,5% при среднем геометрическом титре IgG к возбудителю ЛБ 459,6 (+12,5 %; - 11,1 %).

Таким образом, нами установлена высокая зараженность лесного клеща I.ricinus возбудителем Лайм-боррелиоза и впервые установлена ин-фицированность этим возбудителем клеща D.marginatus, что указывает на вовлечение в эпизоотический процесс других видов иксодовых клещей. Кроме этого, рРНК возбудителя Лайм-боррелиоза выявлена в пробах сывороток крови диких и домашних животных, которые являются резервуаром этой инфекции в природе. Отмечен рост заболеваемости, выявлены специфические антитела у населения Ставропольского края к возбудителю ЛБ. Эти данные свидетельствуют о распространении В. burgdorferi s.l. и указывают на то, что клещ I.ricinus является основным резервуаром и переносчиком этой болезни в данном регионе, при этом ландшафтно-географические, природно-климатические, фаунистические особенности Ставрополья способствуют формированию природного очага Лайм-боррелиоза в данном регионе.

Кроме этого, впервые в Ставропольском крае выявлена микст-инфицированность лесного клеща I. ricinus возбудителями Лайм-боррелиоза и клещевого энцефалита.

В связи с этим необходимо дальнейшее проведение мониторинга за численностью иксодовых клещей. Обследование клещей, диких и домашних животных на носительство возбудителя ЛБ, позволят прогнозировать возможность инфицирования людей, проживающих на энзоотичной территории края. Все это свидетельствует о необходимости совершенствования экспрессных методов детекции возбудителя ЛБ.

Лабораторные методы диагностики Лайм-боррелиоза и индикации его возбудителя в полевом и клиническом материале можно условно подразделить на две группы: методы, направленные на выявление антигенов, ДНК (рРНК) ЛБ, и методы обнаружения специфических антител.

Лабораторная диагностика Лайм-боррелиоза с помощью иммуно-ферментного анализа в российских медицинских учреждениях практически не проводится из-за отсутствия доступных и надежных отечественных коммерческих тест-систем. Импортные иммуноферментные тест-системы имеют низкую чувствительность применительно к диагностике ЛБ в нашей стране из-за существенных антигенных отличий российских изолятов возбудителей ЛБ от западно-европейских и североамериканских (Караваев B.C., Иванов И.Д., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б., 2008).

С целью совершенствования экспрессных методов индикации возбудителя Лайм-боррелиоза в полевом материале нами разработана биотехнология изготовления экспериментальной диагностической иммунофермент-ной тест-системы для выявления антигена возбудителя ЛБ и иммобилизованных препаратов с магнитными свойствами.

В качестве основного структурного компонента, формирующего остов композиционной твердофазной матрицы, нами использован природный отечественный алюмосиликат (Орлова, Т.Н., 2007; Орлова Т.Н., Афанасьева Е.Е., Афанасьев Е.Н. и др., 2008).

Химическое модифицирование сорбента осуществляли в присутствии карбоксиметилированного лигнина и карбодиимида. В качестве магнитного компонента при синтезе применяли магнетит (БезОД

Структура композиционного магносорбента представлена корпускулярной системой, которая состоит из частиц кремнезема, покрытых полимером - карбонизированным лигнином, связанных друг с другом в пространственном каркасе. Размер корпускул определяет величину удельной поверхности МС, а плотность их упаковки — объем и радиус пор.

Для оптимизации структурных характеристик композиционных маг-носорбентов проведены исследования по варьированию состава компонентов синтеза (алюмосиликат, карбоксиметилированный лигнин, магнетит), а также по изучению влияния времени гелеобразования и рН среды на величину удельной поверхности сорбентов, объем и радиус пор.

На основе проведенных исследований определены следующие оптимальные условия получения лигнинсодержащего магносорбента: соотношение компонентов синтеза 1,5: 1:1, соответственно Si02: Fe304* карбоксиметилированный лигнин; время гелеобразования — 2 ч; значение рН гелеобразования - 7,0.

Магносорбенты, исследованные в биологическом микроскопе при увеличении в 100 раз, представляют собой высокодисперсные микрогранулы неправильной формы с выраженными магнитными свойствами, обладающие хорошей смачиваемостью и эффективным оседанием в растворе, отсутствием склонности к конгломерации.

Для придания магносорбенту биоспецифических свойств и получения магноиммуносорбента (МИС) на поверхность МС иммобилизовали специфические иммуноглобулины класса G, выделенные фракционированием ПЭГ-6000 из сывороток крови людей (доноров) с высокими титрами боррелиозных антител, выявленных в ИФА.

Установлено, что для полного насыщения магносорбента белком достаточно 2 ч при значении рН раствора 6-7 и температуры от 22 до 37 °С.

С целью упрощения и удешевления постановки иммуноферментно-го анализа, повышения его специфичности и чувствительности в качестве твердой фазы вместо полистироловых планшетов мы применили разработанные нами МИС при постановке «сэндвич» - варианта этого метода для обнаружения возбудителя Лайм-боррелиоза. При этом были определены оптимальные параметры постановки ИФА, чувствительность и специфичность тест-системы, проведено сравнение модифицированного метода МИС+ИФА с методом постановки реакции в полистироловых планшетах.

Лабораторные испытания полученных нами пяти серий алюмоси-ликатных лигнинсодержащих МИС к возбудителю Лайм-боррелиоза проводили с водорастворимым белковым комплексом, изолированным из корпускулярного антигена боррелий (штамм 1р-21 геновида Borrelia afzelii), который любезно предоставлен ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Для его извлечения мы сочли целесообразным использовать щадящий режим дезинтеграции микробных клеток с помощью ультразвуковой дезинтеграции в сочетании с водно-солевой экстракцией и последующим осаждением белка (Афанасьев Е.Н., 1984; Афанасьев Е.Н., Таран И.Ф., Тюменцева И.С., 1986; Афанасьев Е.Н., 2000).

При постановке ИФА для выявления антигена использовали фер-ментмеченный конъюгат, изготовленный нами методом перйодатного окисления по Р.К. Nakane, A. Kawaoi (1974) в модификации Е.А. Ткаченко и др. (1982). Для получения иммуноферментного коньюгата использовали иммуноглобулины класса G, фракционированные ПЭГ-6000 из сывороток крови людей-доноров, у которых в ИФА с помощью тест-системы «Лайм-Бест» были выявлены антитела к возбудителю ЛБ в высоких титрах. Специфическая активность IgG к возбудителю ЛБ, определенная в реакции радиальной иммунодиффузии, составила 1:32.

Полученный иммунопероксидазный конъюгат исследовали на специфическую активность и чувствительность в «сэндвич»-варианте ИФА по методике M.Clark и A.Adams (1977).

Рабочий титр иммунопероксидазного конъюгата составил 1:400 -1:800. Чувствительность конъюгата по водорастворимому антигену — 15 мкг/мл (по белку).

Для контроля специфичности использовали коммерческий водорастворимый антиген Лепто БАСА (используемый для обнаружения специфических антител к лептоспирам), полученный из ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН; типовые штаммы лептоспир.- Leptospira Pomona, L. Sejroe 37 05, L, Tarassovi LT — 82 и штаммы-сапрофиты L. Biflexa Doberdo 1, полученные из лаборатории эпидемиологии (группы лептоспироза) СтавНИПЧИ; антиген трепонемный ультраозвученный сухой, производства Филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Аллерген», г. Ставрополь.

Штаммы лептоспир обеззараживали путем добавления формалина до 2 %-ной конечной концентрации с последующей экспозицией не менее 12 ч при комнатной температуре (СП 1.3. 1285-03). Перекрестных реакций с лептоспирами и трепонемами не наблюдалось.

Для проведения сравнительного анализа предложенного нами соче-танного метода МИС + ИФА с традиционным иммуноферментным анализом осуществлена постановка ИФА с теми же компонентами, только в качестве твердой фазы использовали полистироловые планшеты, сенсибилизированные иммуноглобулинами класса G против возбудителя ЛБ в течение 18ч при 4 °С. Время постановки ИФА с применением МИС составило 50-60 мин, а традиционным методом, учитывая 18-ти часовую сенсибилизацию микропланшетов - 20 - 21 ч. При этом показания ОП пробы превышали величину ОП отрицательного контроля в 2,0 - 2,2 раза, что свидетельствовало о более высокой чувствительности ИФА с применением МИС. При раститровке водорастворимого белкового антигена показано, что чувствительность традиционного ИФА составила 15 мкг/мл, а чувствительность ИФА с МИС была выше в 64 раза и составила 235 нг/мл.

Полевые испытания разработанного нами сочетанного метода МИС + ИФА были проведены при исследовании 2055 особей иксодовых клещей (228 пулов). Результаты исследований показали, что за счет селективного концентрирования специфического антигена на поверхности МИС те пробы клещей, которые показывали сомнительный результат в ИФА в полистироловых планшетах, в разработанном нами сочетанном методе были положительными. Наряду с этим выявлены положительные пробы и среди тех пулов, которые давали отрицательный результат при исследовании в «сэндвич»-варианте ИФА. Использование селективного концентрирования на магноиммуносорбенте дало возможность обнаружить антиген возбудителя Лайм-боррелиоза в 27 пробах, в то время как в ИФА без применения МИС выявлено 10 антигенсодержащих проб. Таким образом, нами подтверждено наличие антигена возбудителя Лайм-боррелиоза в 10 суспензиях иксодовых клещей и дополнительно выявлено 17 положительных проб. Применение МИС позволило повысить выявляемость инфекционного агента в 2,7 раза (Алиева Е.В., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Афанасьев Н.Е. и др., 2008; Алиева Е.В., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Лаврентии М.П. и др., 2008; Орлова Т.Н., Афанасьев Е.Н., Василенко Н.Ф., 2008).

Таким образом, при использовании МИС для проведения ИФА не требовались полистироловые планшеты, сокращалось время проведения анализа, включая сенсибилизацию твердой фазы, в 9 - 10 раз, а чувствительность значительно повышалась по сравнению с общепринятым ИФА.

Разработанная экспериментальная иммуноферментная тест-система для выявления антигена возбудителя Лайм-боррелиоза генотипа В. afzelii в «сэндвич»-варианте ИФА и сочетанном методе МИС+ИФА, обладающая высокой чувствительностью и специфичностью, открывает перспективы изготовления иммуноферментных тест-систем для обнаружения возбудителя ЛБ других генотипов, а также комбинированного препарата для выявления антигенов комплекса В. burgdorferi s. L

Главной проблемой при проведении ПЦР-диагностики Лайм-боррелиоза является большое количество ложноотрицательных результатов, часто ничтожно малое количество боррелий в исследуемом материале, что недостаточно для надежной индикации методом ПЦР (Нефедова

В.В., Коренберг Э.И., Нестеренко JI.H. и др., 2001; Goodman J.L., Jurkovich Р., Кг amber J.M. et al., 1991). Кроме того, трудной задачей представляется обработка проб внешней среды, так как в этом случае необходимо использовать особые методические приемы, позволяющие избавиться от посторонних примесей, способных значительно снизить чувствительность ПЦР, и максимально сконцентрировать искомую ДНК (РНК) (Тихвинский М.С., Воробьев А.А., Янов С.Н. и др., 1997).

Для устранения этих недостатков мы объединили два метода: высокоэффективное избирательное концентрирование патогена на магноимму-носорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

На наличие возбудителя Лайм-боррелиоза исследованы 3105 особей клещей, объединенных в 252 пула.

Методом ОТ-ПЦР в 27 пробах суспензий клещей l.ricinus и трех пробах D.marginatus обнаружена рРНК В. burgdorferi s.L, что составило 11,9 ± 1,6 % от общего количества исследованных пулов. Сочетанным методом МИС + ОТ-ПЦР рРНК выявлена в 56 пробах (22,2 ± 2,9 %), из них l.ricinus — 51 пул, D.marginatus - пять пулов, что позволило подтвердить наличие рРНК возбудителя клещевого боррелиоза в 30 пробах суспензий клещей и дополнительно выявить 26 положительных проб.

Полученные данные свидетельствуют о том, что применение МИС при проведении ПЦР-анализа позволяет на этапе подготовки проб путем многократных промываний сорбента с фиксированным на нем патогеном освобождаться от всевозможных примесей, тем самым исключая их отрицательное влияние на реакцию, что повысило число положительных находок в 1,9 раза (Алиева Е.В., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Афанасьев Н.Е. и др., 2008; Орлова Т.Н., Афанасьев Е.Н., Василенко Н.Ф., 2008а).

Таким образом, сконструированная нами экспериментальная диагностическая иммуноферментная тест-система для выявления антигена возбудителя Лайм-боррелиоза и разработанные сочетанные методы индикации

МИС + ИФА и МИС + ОТ-ПЦР позволили провести более углубленное изучение природного очага Лайм-боррелиоза и уточнить распространение возбудителя инфекции в отдельных районах Ставропольского края.

Результаты наших исследований легли в основу двух методических рекомендаций «Применение магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования возбудителя Лайм-боррелиоза с последующей постановкой иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ №4 от 30.05. 2008 г.); «Выявление возбудителя Лайм-боррелиоза в полевом материале с применением магноимму-носорбентов», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ №7 от 31.10. 2008 г.).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлова, Татьяна Николаевна, Ставрополь

1. Алексеев, А.Н. Система клещ-возбудитель и ее эмерджентные свойства / А.В. Алексеев. СПб. -1993. - 204 с.

2. Алешковская, Е.С. Клещевые микстинфекции (иксодовый клещевой боррелиоз и гранулоцитарный эрлихиоз человека) в Ярославской области / Е.С. Алешковская, Н.А. Благов, Т.А. Дружинина, Е.В. Ша-лепо // Эпидемиол. и инфекц. болезни. — 2008. № 2. — С. 6-8.

3. Алешковская, Е.С. Иксодовый клещевой боррелиоз и гранулоцитарный анаплазмоз человека в Ярославской области / Е.С. Алешковская, Н.А. Благов, Е.В. Шалепо // Вестник РВМА. 2008. - Прилож. 2 (22). - Ч. II. — С.602-603.

4. Алиева, Е.В. Совершенствование методов лабораторной диагностики дизентерии: Автореф. дис. . канд. мед. наук. / Е.В. Алиева. -Ростов-на-Дону, 1996. 27 с.

5. Алиева, Е.В. Разработка кампилобактериозных аффинных маг-носорбентов для обследования объектов внешней среды / Е.В. Алиева // Вестник СГУ. Ставрополь, 2005.- Вып. 42.- С. 163-166.

6. Ананьева, Л.П. , Клинико-серологическое изучение болезни Лайма на северо-западе СССР / Л.П. Ананьева, Э.И. Коренберг, И.А. Скрипникова и др. // Мед. паразитол. 1990. - №6. - С.28-31.

7. Ананьева, Л.П. Стадийное течение Лайм боррелиоза у больных с мигрирующей эритемой в дебюте / Л.П. Ананьева, В.Г. Барскова, И.А. Скрипникова, А.С. Стир // Проблемы клещевых боррелиозов. М. - 1993. - С. 66-72.

8. Ананьева, Л.П. Болезнь Лайма — системная инфекция с кожными проявлениями / Л.П. Ананьева, И.А. Скрипникова // Вестн. дерматологии и венерологии 1995. - №1. - С. 32-36.

9. Афанасьев, Е.Н. Сравнительная характеристика антигенной структуры рода Brucella: Дис. . канд. мед. наук / Е.Н. Афанасьев. Саратов, 1984. - 173 с.

10. Афанасьев, Е.Н. Антигенная структура бруцелл. Сравнительная оценка методов выделения водорастворимых антигенов бруцелл / Е.Н. Афанасьев, И.Ф. Таран, И.С. Тюменцева//ВИНИТИ 12.09.86 г, № 6635-В.

11. Афанасьев, Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): Автореф. дис. . докт. мед. наук / Е.Н. Афанасьев. — Ростов, 2000. — 45 с.

12. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. — Л., 1962. С. 16-26.

13. Бабкин, А.В. Клинико-иммунологическая характеристика поздних кожных проявлений иксодового клещевого боррелиоза в СевероЗападном регионе России: Автореф. дис. . канд. мед. наук / А.В. Бабкин. -С-Пб., 1998.-28 с.

14. Базиков, И.А. Разработка новых препаратов для экспрессных методов диагностики сифилиса: Дис. . доктора мед. наук / И.А. Базиков. Ставрополь, 2000. - 200 с.

15. Балашов, Ю.С. Организм иксодовых клещей как среда обитания возбудителей трансмиссивных болезней / Ю.С. Балашов // Паразитол. сб. 1987. - Вып. 34. - С. 48-69.

16. Беклемишев, В.Н. К изучению зараженности клещей переносчиков энцефалита методом биопробы / В.Н. Беклемишев // Вопросы вирусологии. - 1963. - №2. - С. 240 - 242.

17. Бойко, В.А. Иксодовые клещи в лесах Среднего Поволжья (Лесостепная зона) / В.А. Бойко, В.Г. Ивлиев, А.С. Аюпов. — Казань, 1982 г.,-147 с.

18. Бондаренко, А.Л. Клинико-эпидемиологические и лабораторные особенности раннего периода Лайм-боррелиоза в Кировской области / А.Л. Бондаренко, С.В. Аббасова, Е.Г. Тихомолова и др. // Мед. паразитол. -1997.-№4.-С. 18-21.

19. Бондаренко, А.Л. Боррелиозная инфекция как возможная причина развития дилатационной кардиомиопатии в эндемичном регионе / А.Л. Бондаренко, Е.И. Тарловская, Е.Г. Тихомолова, Т.В. Жолобова // Эпидемиол. и инфекц. болезни. — 2007. № 4. — С. 37-38.

20. Брыкалов, А.В. Получение биопрепаратов на основе методов аффинной сорбции и иммобилизации: Дис. . д-ра хим. наук / А.В. Брыкалов. Санкт-Петербург, 1993.- 330 с.

21. Ванеева, Л.И. Изучение сорбционной способности полисти-рольных планшетов, используемых в иммуноферментном анализе / Л.И. Ванеева, И.Ю. Гридчина, О.Н. Пантелеев и др. // ЖМЭИ. № 9. - 1989. -С. 86-89.

22. Венгеров, Ю.Я. Инфекционные болезни / Ю.Я. Венгеров, Т.Э. Мигманов, М.В. Нагибина. М.: Энциклопедия, 2004. - 496 с.

23. Воробьева, Н.Н. Клиника, лечение и профилактика иксодовых клещевых боррелиозов / Н.Н. Воробьева. Пермь, 1998. - 132 с.

24. Го, Н.Н. Иммуноферментный анализ / Н.Н. Го. М., 1988.131 с.

25. Горелова, Н.Б. Первая изоляция Borrelia burgdorferi sensu stricto в России / Н.Б. Горелова, Э.И. Коренберг и др. // Журн. микробиол. — 2001.-№4.-С. 10-12.

26. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2005 году». М., 2006. - С. 181.

27. Громыко, Ю.Н. Особенности клиники и терапии Лайм-боррелиоза с преимущественным поражением нервной системы на поздних стадиях болезни в Северо-Западном регионе России: Автореф. дис. . канд. мед. наук / Ю.Н. Громыко. С-Пб., 1996. - 28 с.

28. Грядских, Д.А. Синтез композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и их технологическое использование при изготовлении чумных иммунобиологических препаратов: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Д.А. Грядских. Ставрополь, 2004. - 22 с.

29. Деконенко, Е.П. Клинико-эпидемиологическая характеристика клещевой кольцевидной эритемы / Е.П. Деконенко, Ю.К. Смирнов, К.Г. Уманский // Мед. паразитология и паразитар. болезни.- 1986.- № 3.-С. 75-79.

30. Деконенко, Е.П. Полиморфизм клинических проявлений при Лайм-боррелиозе / Е.П. Деконенко, К.Г. Уманский, Л.В. Куприянова // Клинич. медицина 1991. - Т.69. - № 4. - С.68-73.

31. Деконенко, Е.П. Основные синдромы неврологических нарушений при Лайм-боррелиозе / Е.П. Деконенко, А.Г. Уманский, И.Е. Вирич и др. // Терапевт, арх. 1995. - Т.67. -№11.- С.52-53.

32. Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. -М.: Мир, 1991. С. 326.

33. Ефременко, Д.В. Совершенствование экспрессивных методов индикации микробактерий туберкулеза: Автореф. дис. . канд. мед. наук / Д.В. Ефременко. Ставрополь, 2005. — 20 с.

34. Иванова, Г.П. Разработка клинико-лабораторной диагностики и лечение иксодового клещевого боррелиоза у детей: Автореф. дис. . канд. мед. наук / Г.П. Иванова. С-Пб., 1998. - 28 с.

35. Иванов, К.С. Об особенностях клинической диагностики и лечения клещевого боррелиоза (болезни Лайма) / К.С. Иванов, B.C. Антонов, В.И. Саламатов и др. // Воен.-мед. журн. 1988. - № 8. - С. 40-43.

36. Кельцев, Н.В. Основы адсорбционной техники / Н.В Кельцев. -М.: Химия, 1984. С.280.

37. Кишкун, А.А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике / А.А. Кишкун. М.: МИА. - 2006. - 536 с.

38. Клячко-Гурвич, А.А. Методы определения удельной поверхности / А.А. Клячко-Гурвич. М.: Изд-во АН СССР. - 1961. - № 10. - С. 1885.

39. Коренберг, Э.И. Что такое природный очаг /Э.И. Коренберг. — М.: Знание, 1983.-64 с.

40. Коренберг, Э.И. Серологическое выявление болезни Лайма в СССР / Э.И. Коренберг, В.Н. Крючечников, Е.П. Деконенко и др. // Журн. микробиол. 1986. - № 6. - С. 111-113.

41. Коренберг, Э.И. Материалы по распространению болезни Лайма в СССР / Э.И. Коренберг, С.В. Щербаков, В.Н. Крючечников // Мед. паразитол. 1987. - № 2. - С. 71-73.

42. Коренберг, Э.И. Выявление и первые результаты изучения болезни Лайма на северо-западе СССР / Э.И. Коренберг, Ю.В. Ковалевский, Р.И. Кузнецова и др. // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. — 1988. -№ 1.-С. 45-48.

43. Коренберг, Э.И. Серологическое обследование реконвалесцен-тов и членов их семей при Среднеазеатском клещевом боррелиозе / Э.И. Коренберг, Д.М. Муртазаев, С.В. Щербаков и др. // Мед. паразитол. — 1988. № 4. - С. 80-81.

44. Коренберг, Э.И. Передача Borrelia burgdorferi от нимф и имаго у клеща Ixodes persulcatus schulze / Э.И. Коренберг, С.В. Щербаков, Ю.В. Ковалевский и др. // Доклады АН СССР. 1988. - № 302 (3). - С. 759-760.

45. Коренберг, Э.И. Первые итоги и задачи изучения болезни Лайма в СССР / Э.И. Коренберг // Вестник академии медицинских наук СССР. -1990.-№6.-С. 52-56.

46. Коренберг, Э.И. Опыт серологического обследования сельского населения эндемичной по боррелиозу Лайма территории / Э.И. Коренберг, М.И. Калинин, И.А.Скрипникова, Л.М. Солдаткина // Мед. паразитол. 1990.-№ 3. - С. 15-16.

47. Коренберг, Э.И. Зараженность клещей Ixodes persulcatus возбудителями болезни Лайма и клещевого энцефалита одновременно / Э.И. Коренберг, С.В. Щербаков, Г.Г. Баннова и др. // Паразитология. — 1990. № 24 (2). - С. 102-105.

48. Коренберг, Э.И. Основные черты эпидемиологии болезни Лайма на северо-западе СССР / Э.И. Коренберг, Р.И. Кузнецова, Ю.В. Ковалевский и др. //Мед. паразитол. 1991. - № 3. — С. 14-17.

49. Коренберг, Э.И. Методические указания по эпидемиологии, диагностике, клинике и профилактике болезни Лайма /Э.И. Коренберг. — М.: 1991.-61 с.

50. Коренберг, Э.И. Болезнь Лайма: Лекция / Э.И. Коренберг // Мед. паразитол. 1993. - № 1. - С. 48-51.

51. Коренберг, Э.И. Болезнь Лайма / Э.И. Коренберг // Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. М.: Медицина, 1993а. - Т.2. -С. 387-391.

52. Коренберг, Э.И. Проблема болезни Лайма в России / Э.И. Коренберг // Проблемы клещевых боррелиозов. М., 19936. - С. 13-21.

53. Коренберг, Э.И. Таксономия, филогенетические связи и области формирования спирохет рода Borrelia, передающихся иксодовыми клещами / Э.И. Коренберг // Успехи современной биологии. 1996. - № 116 (4).-С. 389-406.

54. Коренберг, Э.И. Иксодовые клещевые боррелиозы — новая группа заболеваний человека / Э.И. Коренберг, В.Н. Крючечников // Журн. микробиол. 1996. - № 4. - С. 104-108.

55. Коренберг, Э.И. Инфекции группы Лайм боррелиоза иксодовые клещевые боррелиозы в России / Э.И. Коренберг // Мед. паразитол. — 1996а.-№3.-С. 14-18.

56. Коренберг, Э.И. Резервуарные хозяева и переносчики боррелий возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов в России / Э.И. Коренберг, Н.Б. Горелова, Д. Постик и др. // Журн. микробиол. 1997. - № 6. — С. 36-38.

57. Коренберг, Э.И. Новые для России виды боррелий — возможные возбудители иксодовых клещевых боррелиозов / Э.И. Коренберг, Н.Б. Горелова, D. Postic, Б.К. Котти // Журн. микробиол. 1999. - № 2. - С. 3-5.

58. Коренберг, Э.И. Взаимоотношения возбудителей трансмиссивных болезней в микстинфицированных иксодовых клещах (Ixodidae) / Э.И. Коренберг// Паразитология. 1999. - Т. 3. - вып. 4. - С. 273-289.

59. Коренберг, Э.И. Непрямая реакция иммунофлюоресценции в лабораторной диагностике иксодовых клещевых боррелиозов / Э.И. Коренберг, В.В. Николенко, Н.Н. Воробьева и др. // Мед. паразитол. — 2000. -№ 3. — С. 9-16.

60. Коренберг, Э.И. Изучение и профилактика микст инфекций, передающихся иксодовыми клещами / Э.И. Коренберг // Вестник РАМН. -2001. -№ 11.-С. 41-46.

61. Коренберг, Э.И. Боррелиозы / Э.И. Коренберг // Частная эпидемиология. Руководство для врачей. М., 2002. - № 2. - С. 20-24.

62. Коренберг, Э.И. Основные черты природной очаговости иксодовых клещевых боррелиозов в России / Э.И. Коренберг, Н.Б. Горелова, Ю.В. Ковалевский // Паразитология. 2002. - № 36 (3). - С. 177-187.

63. Коренберг, Э.И. Иксодовые клещевые боррелиозы: основные итоги изучения и профилактики в России / Э.И. Коренберг, Н.А. Забродин. Материалы научно-практической конференции. — Ижевск: ООО Ижтех-носервис, 2002а. - С. 165-175.

64. Коренберг, Э.И. Иксодовые клещевые боррелиозы / В.И. Покровский, Г.Г. Онищенко, Б.Л. Черкасский. Эволюция инфекционных болезней в России в XX веке. М.: Медицина, 2003. - С. 376-386.

65. Короткое, Ю.С. Обследование очагов болезни Лайма и клещевого энцефалита в северной части Московской области в 2007 г. / Ю.С. Короткое, Л.А. Буренкова, А.И. Каира и др. // Вестник РВМА. 2008. -Прилож. 2 (22). -Ч. II. - С. 587-601.

66. Котти, Б.К. Иксодовые клещи Ставрополья и его окрестностей / Б.К. Котти, О.Ю. Гудиев Н Мед. паразитол. 1997. - № 4. - С. 36-37.

67. Котти, Б.К. Иксодовые клещи (Acari: Ixodidae) на Северном Кавказе / Б.К. Котти, И.Н. Зашеина // Материалы IV Всероссийского Съезда Паразитологического общества при Российской академии наук. — С-Пб. -2008.-Т. 2.-С. 92-95.

68. Кравчук, Л.Н. Серозные менингиты при боррелиозе Лайма / Л.Н. Кравчук, Ю.В. Кувшинов, В.Д. Серговская и др. // Журн. невропатол. и психиатр. 1992. - Т. 92. - С. 41-44.

69. Кравчук, Л.Н. Клинические варианты Лайм-боррелиоза в Кемеровской области / Л.Н. Кравчук, Э.И. Коренберг, М.И. Калинин, В.А. Сысолятин // Мед. паразитология и паразитарные болезни. 1993. -№ 1. — С. 29-30

70. Крючечников, В.Н. Хроническая мигрирующая эритема, или болезнь Лайма новый клещевой спирохетоз / В.Н. Крючечников // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1985. - № 9. — С. 101-109.

71. Крючечников, В.Н. Обоснование возможности применения непрямой реакции иммунофлюоресценции для серологической диагностикиклещевых боррелиозов / В.Н. Крючечников, Э.И. Коренберг, С.В. Щербаков и др. // Мед. паразитол. 1985. - № 6. - С. 39-42.

72. Крючечников В.Н., Горелова Н.Б., Щербаков С.В. Идентификация боррелий и итоги изучения изолятов возбудителя болезни Лайма из России и сопредельных стран / Э.И. Коренберг (ред.). Проблемы клещевых боррелиозов. М., 1993. - С. 45-55.

73. Крючечников, В.Н. Простой тест для серологической верификации боррелиоза / В.Н. Крючечников // Мед. паразитол. 1998. - № 4. -С. 35-37.

74. Кулябина, И.Б. Borrelia garinii важнейший возбудитель иксо-дового клещевого боррелиоза в России / И.Б. Кулябина, Э.И. Коренберг // Материалы IX съезда Всерос. науч.-практ. общ. эпидемиол., микробиол. и паразитол.-2007.-Т. 3.-С. 193-194.

75. Лапач С.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Exel: Экспериментальные исследования. Клинические испытания. Анализ фармацевтического рынка / С.Н. Лапач, А.В. Чубенко, П.Н. Бабич. К.: Морион, 2001. - 407 с.

76. Лобзин, Ю.В. Эпидемиология, этиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика иксодовых клещевых боррелиозов. Рекомендации для врачей / Ю.В. Лобзин, А.Г. Рахманова, B.C. Антонов и др. — С-Пб., 2000.

77. Лобзин, Ю.В. Лайм-боррелиоз (иксодовые клещевые боррелиозы) / Ю.В. Лобзин, А.Н. Усков, С.С. Козлов. М.: Изд-во Фолиант, 2000. -160 с.

78. Манзенюк, И.Н. Клещевые боррелиозы (болезнь Лайма). Пособие для врачей /И.Н. Манзенюк, О.Ю. Манзенюк. — Кольцове, 2005. -85 с.

79. Матущенко, А.А. Предварительные результаты эколого-эпидемического изучения болезни Лайма в Западной Сибири / А.А. Матущенко, С.А. Рудакова, Э.И. Коренберг // Мед. паразитол. 1988. - № 3. — С. 30-33.

80. Маркелов, М.Л. Иммуночип для диагностики Лайм-боррелиоза и сифилиса / М.Л. Маркелов, Е.Ю. Капотова, И.Н. Манзенюк и др. // Материалы IX съезда Всерос. науч.-практ. общ. эпидемиол., микробиол. и паразитол. 2007. - Т 3. - С. 62-63.

81. Мешандин, А.Г. Проблемы потери активности сорбированых лигандов в гетерогенном иммуноферментном анализе / А.Г. Мешандин, Л.И. Ванеева, Т.А. Даргеева // ЖМЭИ. № 4. - 1994. - С.52-55.

82. Москвитина, Г.Г. Присутствие боррелий в кишечнике и слюнных железах спонтанно зараженных взрослых клещей Ixodes persulcatus schulze при кровососании / Г.Г. Москвитина, Э.И. Коренберг, Л.Я. Горбань // Мед. паразитол. 1995. - № 3. - С. 16-20.

83. Москвитина, Г.Г. О частоте генерализованной инфекции у взрослых голодных клещей рода Ixodes в очагах боррелиозов России и

84. США / Г.Г. Москвитина, Э.И. Коренберг, Э. Спилман, Т.В. Щеголева // Паразитол. 1995. - № 29 (5). - С. 353-360.

85. Нафеев, А.А. Эколого-паразитологические предпосылки распространения иксодовых клещевых боррелиозов в очагах с различной ландшафтной приуроченностью / А.А. Нафеев // Мед. паразитол. и парази-тарн. болезни. 2007. - № 2. - С. 46-49.

86. Неймарк, Н.Е. Синтетические минеральные адсорбенты и носители катализаторов /Н.Е. Неймарк. Киев: Наукова Дума, 1982. -С. 15-19.

87. Непрямая реакция иммунофлюоресценции в лабораторной диагностике иксодовых клещевых боррелиозов / Коренберг Э.И., Николенко

88. B.В., Воробьева Н.Н. и др. // Мед. паразитол. 2000. - № 3. - С. 9-15.

89. Николенко, В.В. Определение боррелиозных антител у пациентов с безэритемной формой иксодовых клещевых боррелиозов в непрямой реакции иммунофлюоресценции / В.В. Николенко, Н.Н. Воробьева // Науч. Сессия ПГМА. 2000. - С. 92-93.

90. Онищенко, Г.Г. Специфическая индикация патогенных биологических агентов / Г.Г. Онищенко, С.Д. Кривуля, Ю.М. Федоров и др. // Практическое руководство. М., 2006. — С. 39.

91. Орлова, Т.Н. К вопросу о биотехнологии получения антительного Лайм-боррелиозного иммуноферментного конъюгата / Т.Н. Орлова // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сб. науч. трудов. Ставрополь, 2007. - С. 243-246.

92. Орлова, Т.Н. Совершенствование экспресс диагностики Лайм-боррелиоза / Т.Н. Орлова, Е.Н. Афанасьев, Н.Ф. Василенко // Вестник российской военно-медицинской академии. - СПб. - 2008. - № 2 (22). -Приложение (часть I). - С. 211-212.

93. Пак, С.Г. Инфекционные болезни / С.Г. Пак, Б.К. Данилкин, Е.В. Волчкова, М.Н. Алленов. М.: МИА, 2008. - 368 с.

94. Петрищева, Г.В. Эколого-паразитологические предпосылки распространения клещевых боррелиозов в Оренбургской области / Г.В. Петрищева // Вестник РВМА. 2008. - Прилож. 2 (22). - Ч. II. - С.603-604.

95. Петрищева, П.А. Продолжительность существования природных очагов клещевого спирохетоза / П.А. Петрищева // Мед. паразитол. — 1961. № 30 (4). - С. 439-442.

96. Плаченов, Т.Г. Разработка конструкции поромеров для изучения структуры пористых тел методом вдавливания ртути / Т.Г. Плаченов // Журн. практ. химии. 1965. - Т. 28. - № 3. - С. 245-253.

97. Практическая химия белка. — М: Мир, 1989. — С. 22-23.

98. Природная очаговость болезней: Исследования института Гамалея РАМН / Под ред. проф. Э.И. Коренберга. М.: Русаки, 2003. - С. 99121.

99. Рахманова, А.Г. Инфекционные болезни / А.Г. Рахманова, В.К. Пригожина, В.А. Неверов. М.-СПб., 1995. - С. 23.

100. Резник, Е.П. Современное состояние очагов клещевых боррелиозов на юге Туркменской ССР / Е.П. Резник, Э.И. Коренберг, В.Н. Крючечников // Мед. паразитол. 1983. - № 61 (3). - С. 28-30.

101. Сиротина, Е.П. О эпидситуации по Лайм-боррелиозу на территории Липецкой области / Е.П. Сиротина, Н.Ю. Зубова, В.Ф. Дроздова // Вестник РВМА. 2008. - Прилож. 2 (22). - Ч. II. - С. 601-602.

102. Скрипникова, И.А. Результаты клинико-серологического обследования 60 пациентов с Лаймской болезнью / И.А. Скрипникова, Л.П. Ананьева, В.Г. Барскова // Терапевт, арх. 1992. - Т. 64. - №5. - С.93-98.

103. Скрипникова, И.А. Антитела к возбудителю болезни Лайма у больных миокардитом и дилатационной кардиомиопатией / И.А. Скрипникова, М.Ю. Самсонова, Е.Л. Насонов и др. // Клинич. медицина. 1993. -Т.71.-№2.-С. 38-41.

104. Смирнов, Ю.К. О лечении больных кольцевидной эритемы, возникающей после присасывания клеща / Ю.К. Смирнов, В.В. Владимирова, К.Г. Уманский // Журн. невропатологии и психиатрии. 1977. - №2. - С. 182-185.

105. Стир, А.С. Лаймовская болезнь спнрохетозная инфекция, переносимая клещами / А.С. Стир // Терапевт, арх. - 1987. - Т.59. - № 4. -С. 32-34.

106. Сухоруков, A.M. Изучение сорбционных свойств полистироловых планшетов, используемых в иммуноферментном анализе / A.M. Сухоруков, A.M. Пономарева // ЖМЭИ. 1987. - № 9. - С. 18-22.

107. Тамбовцев, Е.П. Методы статистической обработки результатов серологических исследований / Е.П. Тамбовцев, С.Г. Ахметкалиев, Н.Н. Пятницкий // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1969. -№10.-С. 26-31.

108. Фоменко, Н.В. Выделение ДНК боррелий, циркулирующих в Новосибирской области / Н.В. Фоменко, Н.Н. Ливанова, Е.В. Романова и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2008. - № 7. — С. 22-28.

109. Черногор, Л.И. Клинико-лабораторная характеристика иксодо-вого клещевого боррелиоза в Прибайкалье / Л.И. Черногор, Е.В. Арбатская, Г.А. Данчинова и др. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. - № 6. - С.60-62.

110. Шальнев, В.А. Ландшафты Северного Кавказа: эволюция и современность / В.А. Шальнев. Ставрополь: Изд-во СГУ, 2004. - 265 с.

111. Шаханина, К.Л. Выбор критериев пригодности твердофазных носителей на основе полистирола для проведения иммуноферментного анализа / К.Л. Шаханина, А.А. Соколенко, И.П. Павлова и др. // ЖМЭИ. -№9.-1987.-С. 8-11.

112. Шетекаури, С.А. Эпидемиологическая характеристика иксодовых клещевых боррелиозов в Красноярском крае / С.А. Шетекаури, Н.М. Марьина, Д.В. Солохина // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. - № 1. - С.78-80.

113. Шувалова, Е.П. Инфекционные болезни. — 3-е изд. перераб. и доп / Е.П. Шувалова. М.: Медицина. - 1990. - 558 с.

114. Afzelius, A. Verhandlungen der dermatologicher Gesselschaft zu Stokholm, December 1909 / A. Afzelius // Arch. Dermatol. Syph. 1910. - Vol. 101.-P. 405-406.

115. Afzelius, A. Erythema chronicum migrans / A. Afzelius // Acta Demi. Venerol. 1921. - Vol. 2. - P. 120-125.

116. Agre, F. The value of early treatment of deer tick bites for the prevention of Lyme disease / F. Agre, R. Schwartz // Am. J. Dis. Child. 1993. -Vol. 147. - P. 945-947.

117. Anderson, J.F. Spirochetes in Ixodes dammini and mammals from Connecticut / J.F.Anderson, W. Magnarelli, W. Burgdorfer et al. // Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1983. - Vol. 32. - P. 818-824.

118. Anderson, J.F, Peromyscus leucopus and Microtus pennsylvanicus simultaneously infected with Borrelia burgdorferi and Babesia microti / J.F. Anderson, R.C. Johnson, L.A. Magnarelli, et al. // J. Clin. Microbiol. 1986. -Vol. 23.-№ l.-P. 135-137.

119. Asbrink, E. Early and late cutaneous manifestations in Ixodes-borne boiTeliosis (erythema migrans borreliosis, Lyme borreliosis) / E. Asbrink, A. Hovmark // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1988. - Vol. 539. - P.4-15.

120. Asbrink, E. Clinical manifestations of Acrodermatitis chronica Atrophicans in 50 Swedish Patients / E. Asbrink, A. Hovmark, I. Olsson // Zbl. Bakt. Hyg. 1. Abt. Orig. A. 1986.-Bd. 236. - № 12. -P.743.

121. Baig, Sh. Anti-Borrelia burgdorferi antibody response over the course of Lyme neuroborreliosis / Sh. Baig, T. Olsson, K. Hansen et al. // Infect. Immun. 1991. - Vol. 59. - P. 1050-1056.

122. Baig, Sh. Predominance of borrelia burgdorferi specific В cells in cerebrospinal fluid in neiroborreliosis / Sh. Baig, T. Olsson, H. Link // Lancet. 1989. - Vol. 2. - № 8654. - P. 71-74.

123. Baranton, G. Delineation of Borrelia burgdorferi sensu stricto, Bor-relia garinii sp. nov., and group VS461 associated with Lyme borreliosis / G. Baranton, D. Postic, I. Saint Girons et al. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. -Vol. 42.-№3.-P. 378-383.

124. Barbour, A. The biological and social phenomenon of Lyme disease / A. Barbour, D. Fish // Science. 1993. - Vol. 260. - P. 1610-1616.

125. Barbour, A. Lyme disease spirochetes share a common surface antigenic determinant defined by a monoclonal antibody / A. Barbour, S. Tessier, W. Todol// Infect. Immun. 1983. - Vol. 41. - P. 795-804.

126. Bianchi, G. Geographic diversity of Lyme borreliosis / G. Bianchi, G. Rovetta // Annals Rheumatic Diseases. 1993. - Vol. 52. - № 5. -P. 213-217.

127. Blake, M.S. Purification and partial characterization of thi major onter membrane protein of Neisseria gonorrhoeae / M.S. Blake, E.C. Gotschlich // Infect. Immun. 1982. - Vol. 36. - № 1. - P. 277-283.

128. Burgdorfer, W. Lyme disease: a tick-borne spirochetosis / W. Burgdorfer, A. Barbour, S. Hayes et al. // Science. 1982. - Vol. 216. -P. 1317-1319.

129. Burgdorfer, W. Erythema chronicum migrans a tick-borne spirochetosis / W. Burgdorfer, A. Barbour, S. Hayes et al. // Acta Trop. - 1983. -Vol. 40.-P. 79-83.

130. Clark, M. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus / M. Clark, A.Adams // J. Gen. Virol. 1977. - V.36. - №3. - P. 475-483.

131. Comstock, L.E. Characterization of Borrelia burgdorferi invasion of cultured endothelial cells / L.E. Comstock, D.D. Thomas // Microb. Pathol. -1991. Vol.10. - № 2. - P. 137-148.

132. Craft, J.E. Lyme disease: A newly identified infectious disorder / J.E. Craft // Keio J. Med. 1986. - Vol.36. - № 1. - P.52-52.

133. Dever, L.L. In vitro activity of vancomycin against the spirochete Borrelia burgdorferi / L.L. Dever, J.H. Jorgensen, A.G. Barbour // Antimicrob Agents Chemother. 1993. - Vol. 37. - P.l 115-11121.

134. Duray, P.H. Clinical pathologic correlations of Lyme disease / P.H. Duray //Rev. infect. Dis. 1989. - Vol.11 (6). - P. 1487-1493.

135. Golde, W.T. Robinson-Dunn В., Stobierski M.G. et al. // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36.-P. 338-341.

136. Goodman, J.L. Molecular detection of persistent Borrelia burgdorferi in theurine of patients with active Lyme disease / J.L. Goodman, P. Jur-kovich, J.M. Kramber, R.C. Johnson // Infect. Immun. 1991. - Vol. 59. -№ l.-P. 269-278.

137. Hansen, K. Lyme neuroborreliosis: Improvements of the laboratory diagnosis and a survey of epidemiological and clinical features in Denmark 1985 1990 / K. Hansen // Acta Neurologica Scandinavica. - 1994. - Vol. 89. -№ 151.-P. 6-44.

138. Herzer P. Joint manifestations of Lyme borreliosis in Europe / P. Herzer // Scand. J. Infect. Dis. 1991. - Vol. 77. - P. 55-63.

139. Humair P.-F., Postic D., Wallich R., Gem L. // Zbl. Bacteriol. -1998. Vol. 287. - P. 521-538.

140. Huppertz, H.I. Detection of Borrelia burgdorferi by nested polymerase chain reaction in cerebrospinal fluid and urine of children with neuroborreliosis / H.I. Huppertz, H. Schmidt, H. Karch // Eur. J. Pediatr. 1993. -Vol. 152.- №5. -P. 414-417.

141. Hyden, D. Acute "idiopathic" peripheral facial palsy: clinical, serological, and cerebrospinal fluid findings and effects of corticosteroids / D. Hyden, M. Roberg, P. Forsberg et al. // Am. J. Otolaryngol. 1993. - Vol. 14. -№3. - P. 179-186.

142. Intercellular bacterial infections / Eds. Pechere J.-C., first edition. -1996.-187 p.

143. Izquierdo, G. Validity of positive anti-Borrelia antibodies in patients with neuroborreliosis / G. Izquierdo, J. Aguilar // Neurologia. 1992. -Vol.7. - № 7. - P. 198-199.

144. Jacobson, D.M. Frequency and clinical significance of Lyme sero-positivity in patients with isolated optic neuritis / D.M. Jacobson, J.J. Marx, A. Dlesk//Neurology. 1991. - Vol. 41. - № 5. - P. 706-711.

145. Kaell, A.T. Occurrence of antibodies to Borrelia burgdorferi in patients with nonspirochetal subacute bacterial endocarditis / A.T. Kaell, P.R. Re-decha, K.B. Elkon et al. // Ann Intern Med. 1993. - Vol.119. - № 11. -P. 1079-1083.

146. Kaiser, R. Intrathecal antibody synthesis in Lyme neuroborreliosis: use of recombinant p41 and a 14-kDa flagellin fragment in ELISA / R. Kaiser, C. Rasiah, G. Gassmann et al. // J. Med. Microbiol. 1993. - Vol. 39. - № 4. -P. 290-297.

147. Kolmel, H.W. Correlation between neurologic disease and Borrelia burgdorferi antibodies in 800 paired serum/cerebrospinal fluid samples / H.W. Kolmel, P. Neumann, R. Lange // J. Neurology. 1992. - Vol. 63. - № 10. -P. 619-624.

148. Levin, J.M. In vitro susceptibility of Borrelia burgdorferi to 11 antimicrobial agents / J.M. Levin, J.A. Nelson, J. Segreti et al. // Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 1993. - Vol. 37. - №7. - P.1444-1446.

149. Logigian, E.L. Chronic Neurologic Manifestations of Lyme Disease / E.L. Logigian, R.F. Kaplan, A.C. Steere // New Engl. J. Med. 1990. -Vol. 323.-P. 1438-1444.

150. Lyme Borreliosis and Tick-Borne Encephalitis / Eds. Oschmann P., Kraiczy P. et al. Bremen, 1999. - Germany. - 144 p.

151. Ma, Y. Intracellular localization of Borrelia burgdorferi with in human endothelial cells / Y. Ma, A. Sturrock, J. Weis // Infect. Immun. 1991. -Vol. 59.-№2.-P. 671-678.

152. Mancardi, G.L. Borrelia burgdorferi infection and Guillain-Barre sindrome / G.L. Mancardi, M. Del Sette, A. Primarera // Lancet. 1989. - Vol. 2. - № 8669. - P. 985-986.

153. Matschke, H.-J. Durch Zecken ubertragene neurologische Krank-heiten / H.-J. Matschke // Z. ges. inn. Med. 1987. - № 7. - P. 192-195.

154. Mursik, V.P. Zeckenspirochatosen / V.P. Mursik // Munch, med. Wschr. 1984. - Bd. 126. - № 47. - P. 1415-1416.

155. Nakane, P.K. Peroxidase-labelled antibody a new method of conjugation / P.K. Nakane, A. Kawaoi // J.Histochem. Cytochem. 1974. - V.22. -№4.-P. 506-508.

156. Pfister, H.W. Lyme borreliosis: Basic science and clinical aspects / H.W. Pfister, B. Wilske, K. Weber // Lancet. 1994. - Vol. 343. - № 8904. -P. 1013-1016.

157. Poison, A. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of higth molecular weigh / A. Poison, G.M. Potgieter, J.E. Largier et al. // Bio-chem. Biophis. Acta. 1964. - Vol. 82. - P. 463-475.

158. Ralin, D.W. Lyme disease / D.W. Rahn, S.E. Malawista // West. J. Med. 1991. - Vol. 154. - № 6. - P. 706-714.

159. Rahn, D.W. Malawista S.E. Lyme disease: recommendations for diagnosis and treatment / D.W. Rahn, S.E. Malawista // Ann.Intern.Med. -1991a. Vol.114. - № 6. - P. 472-481.

160. Reimers, C.D., de Koning J., Neubert U. et al. Borrelia burgdorferi myositis: report of eight patients / C.D. Reimers, J. de Koning, U. Neubert et al. // J. Neurol. 1993. - Vol. 240. - № 5. - P. 278-283.

161. Satz, N. Immunology and diagnostic test results in Lyme borreliosis / N. Satz // Schweiz Med Wochenschr. 1992. - Vol. 122. - № 47. -P. 1779-1791.

162. Sigal, L.H. Lyme disease: a world-wide borreliosis / L.H. Sigal // Clin. Exp. Rheumatol. 1988. - Vol. 6. - № 4. - P. 411-421.

163. Shiokawa, T. Lyme disease with the triad of neurologic manifestations / T. Shiokawa, M. Hasegawa, M. Yamazaki et al. // Rinsho Shinkeigaku. -1991. Vol. 31. -№ 5. - P. 561-563.

164. Steere, A.C. Lyme disease (see comments) / A.C. Steere // New Engl. J. Med. 1989. - Vol.321. - № 9. - P. 586-596.

165. Steere, A.C. Clinical definitions and differential diagnosis of Lyme arthritis / A.C. Steere // Scand. J. Infect. Dis. 1991. - Vol. 77. - Suppl. -P. 51-54.

166. Steere, A.C. The overdiagnosis of Lyme disease / A.C. Steere, E. Taylor, G.L. McHugh et al. // JAMA. 1993. - Vol. 269. - № 14. -P. 1812-1816.

167. Watanakunakorn, C. Lyme arthritis with subarticular cyst formation in metacarpal and metatarsal bones / C. Watanakunakorn, Toliver J.Jr. // South. Med. J. 1992. - Vol. 85. - № 2. - P. 187-188.

168. Wilske, B. Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe / B. Wilske // Vector Borne Zoonotic Dis. 2003. - Vol. 3. - P. 215-227.

169. Zhang, W.F. Sero-epidemiology of Lyme disease in an endemic area in China / W.F. Zhang, J.H. Zhao // Microbiol. Immunol. 1994. - Vol. 38, № 7. - P.505-509.- ч

Информация о работе

Орлова, Татьяна Николаевна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Распространение возбудителя Лайм-боррелиоза в Ставропольском крае и совершенствование методов его индикации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы