Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Распространение и физиолого-биохимические свойства галотолерантных и галофильных метаногенов нефтяных месторождений

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Распространение и физиолого-биохимические свойства галотолерантных и галофильных метаногенов нефтяных месторождений"

^ \

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 579.S5.85I.

КУЗНЕЦОВА Вероника Геннадиевна

Распространение и физиолого-биохимические свойства галотолерантных и галофильных метаногенов нефтяных месторождений

Специальность 03.G0.Ci7 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР

Научный руководитель; доктор биологических наук СЛБеляев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В-МГорленко кандидат биологических наук АЛОбразцова

Ведущее учерехдение: кафедра биологии почв МГУ имЛ-ВЛомоносова

Защита диссертации состоится1 «-¿1991г.

в /// часов на заседании специализирдв&нного совета Д.002.64.01 в Институте микробиологии АН СССР по адресу: Н7312, гЛ1осква, проспект 60-летия Октября, д.7, корпус 2.

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

Автореферат разослан '"/К" с/^^/^гг __1991г.

Ученый секретарь специализированного совета, Ю5.н. ЛЛЛикитин

' ВВЕДЕН'!! Н

■... -»он Актуальность проблемы. Метанобразующие бактерии представлены многочисленной и морфологически разнообразной группой архебакто-рий, широко распространенной в природных экосистемах. Интерес, проявляемый к изучению метаногенов, определяется их ключевой ролью в круговороте углерода, приводящей в ряде случаев к Формированию крупных залежей метана, вплоть до промышленных месторождений. Изу -чение метаногенов нефтяних месторождений является весьма существенным для понимания их роли в анаэробной деструкции органических соединений нефтяной природы, а также в связи с исследованием то • можности регуляции микробиологической деятельности в нефтяных ме сторождениях и созданием новых биотехнологии повышения нефтеотдачи пластов.

Работами ряда авторов ( Беляев 1984, Иванов и др., ЮПВ ) показано распространение и активная современная деятельность мктл ногенов в разрабатываемых нефтяных месторождениях. Выделены чистые культуры этих бактерий ( реляев и др., 1936, Образцова и др., 1987). Однако все эги данные касались , главным образом, пластонпх жидкостей с низким содержанием солей. В связи с тем, что пластовые води большинства разрабатываемых нефтяных месторождений СССР имеют повышенную минерализацию ( от 20 до 300 г/л ), нам представляется важным изучение распространения и активности матаногенных бактерий в высокосоленых пластовых жидкостях, а также изучение физи-олого-биохимических особенностей метаногенов, выделенных из этих жидкостей.

Цель и задачи работы. Цель данной работы заключалась в изучении распространения и геохимической деятельности метаноброзуюших

бактерий в разрабатываемых нефтяных месторождениях, а также в выделении накопительных и чистых культур галофильных и галотолерант-ных метаногенов и исследовании их физиолого-биохимических свойств.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем; I. Изучить физико-химические условия закачиваемых и пластовых вод нефтяных месторождений Татарии и Западной Сибири. 2. Оценить числен. ность метаногенных бактерий и интенсивность образования метана в разрабатываемых нефтяных месторождениях. З.Выделить и описать чистые культуры галофильных и галотолерантных метаногенов, изучить их физиолого-биохимические свойства.

Научная новизна. Из разрабатываемых нефтяных месторождений вы делены и изучены чистые культуры галотолерантных метаногенных бактерий, отнесенные к роду МеЪЬапоЬасЪегШт. физиологические свойст-па изоллтов сопоставлены с экологическими условиями исслодуемых нефтяных месторождений.

Впервые было показано, что метанобразующие бактерии, изолированные из нефтяных месторождений, зкскретируют в среду полисахариды. Изучены качественные и количественные характеристики полисахарида галофилыюго метаногена МеЪЬапососсоМен еиЬа1оЬ4ик.

Дана количественная оценка геохимической деятельности метано-бразующих бактерий в разрабатываемых нефтяных месторождениях Татарской АССР и Западной Сибири и изучены условия их распространения. Установлено наличие жизнеспособных клеток метаногенных бактерий в пластовых водах нефтяных месторождений с минерализацией вплоть ди 272 г/л.

Практическая значимость. I. Данные по изучению свойств полисахарида галофильной метаногенной бактерии могут найти применение

при разработке микробиологических методов повышения нефтеотдачи в условиях высокой минерализации пластовых еод. 2. Выделенные чистые культуры метаногенных бактерия могут быть использованы длд проведения биохимических и молекулярно-биологических экспериментов.

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории микробной биогеохимии Института микробиологии АН (TCP, возглавляемой академиком АН СССР М-В.Ивановым.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма" ( Пуиино, 1989), международном симпозиуме "Биотехнология" ( Пекин, Китай, 1989 ), международной конференции "Микробиология глубоких подземных экосистем" ( США, 1990 ), международной конференции по микробиологическим методам повышения нефтеотдачи ( Оклахома, США, 1990 ).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы п статьях и 2х тезисах.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 2х глав обзора литературы, заключения по обзору литературы, Зх глав эксперимента льне я части, общего заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы изложены на 150 стр.маыинописного текста, включая 17 таблиц, 22 рисунка. Список литepatypы включает 181 наименование.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Методы полевых исследований. Объектами полевых исследований служили Бондюжское и Ромашкинское нефтяные месторождения Татарской АССР и Мыхпайское нефтяное месторождение Западной Сибири. Кол-

лекторами нефтей татарских месторождений являются песчаники и алевролиты, глубмна залегания пластов It)00-I7U0 м. Температура пластов варьирует от 30 до 40°С. Пластовые воды наследуемых участков Бондюжского месторождения представлены в основном высокоминерализованными хлоридно-кальциевыми рассолами. На этих участках минера-

2+ 2+

лизация изменялась от 6 до 272 г/л, содержание с^ и Mg достигало 19,8 и 4,2 г/л, соответственно. На Ромашкинском месторождении пластовые воды были менее минерализованы, минерализация вод из добывающих скважин составляла 8.1-32,7 г/л.

Мыхпайское нефтяное месторождение Западной Сибири характеризуется высокой температурой пластов ( 60-80°С ). Продуктивные пласты залегают на глубине 1700-1850 м. Пластовые воды этого месторождения сильно опреснены и их минерализация не превы:;;а'.т ГО г/л.

Пробы нагнетаемых вод отбирали методом обратного спмопзлнва, пластовых - из пробоотборных кранов скважин.

Измерение pH осуществляли на кондуктометре ОК-Ю4. Опредьлс ние еь проводили с помощью милливольтметра рН-150. Определение растворенного кислорода, карбонатов, ионов кальция и магния, величины общей солености осуществляли по стандартным методикам ( Резников и др., 1970, Романенко, Кузнецов, 1974 ).

Метан определяли газохроматографическим способом.

Метанобразующие бактерии учитывали на жидкой среде методом предельны): разведений ( Беляев, 1974 ). Учет метаногенных организмов проводился в соответствии с их субстратной специфичностью и на средах с- разной минерализацией. В качестве субстратов использовали; С02 + Н2; метанол; триметиламин ( ТМА ) и метанол; ацетат. Для получения накопительных, культур из слабоминерализованных плас-

товых вод использовали минеральную среду ( келе^у, 2е1кий.-/19ш ). Для получения накопительных культур из высокоминералпзованных пластовых вод была использована среда ГФ, следующего состава ( в I т.У-

М14С1- 0,5 г; Иа01 - ла г; СдС12* 2Н20 -0,3 р; М£С12ч 6Н20 - 2,4 г;

КС1- 1,0 г; к2иро4 - 0,4 г; ЭД'ГА - 0,5 г; дрожжевой экстракт -2 г» СНуСОСЖа - 0,3 г, раствор микроэлементов <■ Ва1сК е(. а1, 1979 > - 10 мл,раствор витаминов < Па1сь и и а1, 1979 >-5 млфпствор жирных кислот - 0,75 м.я, 0,2%-ннй раствор резазурина - I мл. рН среды 7,07,3. После 'тегилизацпи в каждую пробирку ( объем среды 5 мл ) вносили по 0,15 мл 10%-ного раствора Мансо^ 0,15 мл 5%-ного раствора-СзС12х 2Н2о; 0,3 мл восстановителя ( конечная концентрация цистеин-гидрохлорида-0,83 г/л, г/л ), субстрат.

О развитии метаногенов судили по приросту метала в газовой Фазе. Статистическую обработку материалов проводили по таблицам Мак Креди ( Гречушкина и др., 1976 ).

Интенсивность бактериального образования метана в изолированных пробах изучаемых вод определяли радиоизотопным методом ( Лау-ринавичус, Беляев, 1978 ).

Методы лабораторных исследований. При приготовлении сред, выделении и культивировании метанобразующих бактерий соблюдали принципы техники анаэробного культивирования ( нипеяЬе, 1969 ). Чистоту культур контролировали с помощью микроскопиргжания и посевами на среду, содержащую глюкозу.

Серологический анализ выделенных изоллтоа проводили со специфическими иммунными сыворотками К штаммам Ме1.Ьа!тЬасаег1ит Гогт1-

с!оит 40, М^ЪЬ.эпоЬасЬег1ит Гогт1с1сит МГ, Ме1ЬапоЬас*.^г1га Ьгуэп-111 МОП, М^1,ЪэиоЬас1ег1ит 1Ье1-пюаи1.о1.горЬ1с111п, Mft.hanot.rlr: ♦,Ъ**гто-

phllum, Methanobacterium thermofornilclfcum, Methanobacterium ther-moagfregans Ц Methanobacterium tharmoalcaliphilum.

Морфологию микроорганизмов изучали с помощью фазово-контраст-ного люминесцентного микроскопа "ЛЮМАМ И2" и электронного микрокопа JEM-100.

Длл выделения ДНК применяли метод, описанный Мармуром и Доти ( I9fi2 ). Нуклеотидный состав ДНК определяли по температуре плавления С ПОМОЩЬЮ СПеКТрОфОТОМеТра "Pye Unicam SP 1800".

Для изучения процессов потребления серы и взаимодействия кальция с клетками культуру выращивали на средах с соответствующими радиоактивными изотопами этих элементов. Радиоактивность просчитывали С ПОМОЩЬЮ ЖИДКОСТНОГО СЦИНТИЛЛЯЦИОННОГО счетчика "Racbeta".

Общее содержание углеводов определяли фенольным методом ( Dubois et ai, 1936 ). Качественный состав полисахарида определяли на анализаторе углеводов ьс-гоо.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

I. Распространение и геохимическая деятельность метаногенов в нефтяных месторождениях с различной соленостью пластовых жидкостей.

На Бондюжском и Ромашкинском нефтяных месторождениях Татарской АССР применяется внутриконтурное заводнение, при котором в нефтяные пласты для поддержания давления через нагнетательные скважины -закачивается вода. На обследованных участках нагнеталась вода из реки Камы.В закачиваемых водах выявлены аэробные неф-

Q Л

теокисляющие микроорганизмы ( 2,5 10 - 6 10 кл/мл ), еульфатреду-

- 7 -

о

дуцирующие бактерии ( от 10 до 10 кл/мл >, а также такие строго анаэробные микроорганизмы, как метаногены. Численность метаноге-

Q

нов довольно высока и составляла от 25 до 25 10 кл/мл. ( табл. I ). Жизнеспособные клетки метаногенных бактерий в закачиваемых водах, содержащих кислород и имеющих высокий окислительно-восстановительный потенциал, сохраняются, вероятно, за счет адсорбции на взвеси или внутри твердых частиц ( Иванов, Беляев, 1989 ), а также за счет устойчивости некоторых видов метаногенов к кислороду ( Образцова и др., 1984 ).

Жизнеспособные клетки аэробных и анаэробных микроорганизмов были обнаружены во всех образцах пластовых вод с соленостью вплоть до 272 г/л. Общее число бактерий, а также количество представителей отдельных групп в пластовых водах было значительно меньшим, чем таковое в нагнетаемых водах.

В своих исследованиях по выявлению численности метаногенов в высокоминерализованных пластовых водах нами были использованы среды, в которых концентрация Nací составляла 60 или 150 г/л. Исходя из литературных данных о том, что в соленых экосистемах Метиламины являются основными субстратами для метаногенеза (orem-íand et ai, 1982; Жилина, ISB3 ). для выявления жизнеспособных клеток метаногенов использовали среды, содержащие триметиламин и метанол в качестве субстратов для роста. Применение срод, близких по солености к минерализации пластовых вод и содержащих метальные соединения в качестве субстрата позволило выявить жизнеспособные клетки метаногенных бактерий в высокоминерализованных пластовых водах с минерализацией вплоть до 272 г/л.

Общее число метаногенов в пластовых водах значительно ниже.

чем в нагнетаемых и составляет 1-60 кл/мл. Оно на коррелирует с величиной минерализации вод. На данном месторождении с хлоридно-кальциевым типом пластовых вод наиболее благоприятной для выявления жизнеспособных клеток метаногенов оказалась среда, содержащая 6% Nací. Увеличение процента содержания n^ci в среде не приводи-

Таблица I.

Характеристика микрофлоры призабойной зоны нагнетательных скважин нефтяных месторождений Татарии.

Объем Углеводородо- Метаногены, кл/мл изливше- кисляюпше бак-йся воды, терии, кл/мл

м нефть CjgHg^ СО2+Н2 метанол ацетат

Скважина N 366 ( Бондюжское месторождение )

0,5 60000 25000 100 250 250

8,0 130000 6000 600 2500 6000

14,3 60000 25000 н.д* н.д. н.д.

20,6 2500 60000 6000 600 25000

27,0 25000 6000 2500 2500 2500

39,5 25000 2500 25000 1300 600

70,3. 2500 6000 130 25 60

Скважина N I2I40 ( Ромашкияское месторождение )

0 250 25 250 60

7,0 250 2500 2500 600 130

8,2 I 10 60 ' 25 60

9,3 250 60 13000 2500 600

10,4 25 25 25 25 60

12,6 25 250 60000 250 60

t—t СО ÍJ 25 250 25000 60 60

25,0 25 250 6 250 25

х-н.д. - здесь и далее означает- нет данных

ло к повышению численности выявляемых клеток. На.стандартной среде с низкой минерализацией на том же субстрете клетки метаногенов практически не выявлялись.

В пластовых жидкостях с высокой минерализацией зарегистрированы процессы современного метанообразования. Суммарная интенеив-

-Ч -Т ~т

ность метаногенеза составляла ( 18,2-437 ) 10 мкл СН^ л сут

( табл. 2 ).

Таблица 2.

Распространение метанобразуюиих бактерий и интенсивность метаногенеза в пластовых водах нефтяных месторождений Татарии.

N сква-Минерали- Метаногены, кл/мл Скорость сбра-

хины зация,г/л метанол метанол+ТМА зования метана,

С% НаС1 15% N30 1 Ю~^МКЛ_ ^СУТ~ "

Бондюжсксе месторождение

303. 6,0 600 н.д. н.д. 18,2

304 18,1 6 Н.Д. Н.д. 56

15 82,2 6 . 6 10 97

323 147,1 I 25 <1 437

283 159,0 I 60 60 1,4

365 172,5 <1 25 10 354

351 181,5 25 25 н.д. 211

352 195,8 I 25 10 127

353 207,9 I 25 <1 252

273 272,3 <1 I I 68

367 272,4 I I 10 29

Ромашкинское месторождение

12107 8,1 I 10

12108 8,6 2500 н.д.

12158 21,5 6 10

12159 32,7 25 25

- ID -

В высокотемпературных пластах Мыхпайского нефтяного месторождения также был показан современный метаногенез и выявлены жизнеспособные клетки метаногенных бактерий. Преимущественным субстратом для выделения метаногенов служила смесь ацетата с метанолом. Численность метаногенов, использующих эти субстраты, варьирует от 10 до 1000 к л/мл. Интенсивность термофильного метаногенеза соста-. вллла 0,5-2,6 мкл СН4 л-1сут-1.

Интенсивность современного Метанообразования в высокоминерализованных водах Татарских месторождений была ниже.чем в низкоминерализованных водах Мыхпайского месторождения.однако этот процесс достигает значимых величин, и мы можем говорить о заметном вкладе метанобразуюших бактерий в круговорот углерода в соленых подземных экосистемах.

2. Характеристика культур галофильных и галотолерантных метаногенов, выделенных из нефтяных месторождений.

2.1. Характеристика палочковидных метаногенных бактерий.

Из пластовых вод изученных нефтяных месторождений нами были получены активные накопительные культуры. Штамм Тм 337 выделен из высокотемпературных пластов Мыхпайского месторождения. Первоначальная накопительная культура осуществляла превращение ацетата в метан при 60°С. Обработка этой культуры антибиотиками привела к прекращению метаногенеза на среде с ацетатом. Однако.при использовании газовой смеси COg+Hg на той же среде с антибиотиками наблюдался' активный рост и метаногенез. Таким образом, было установлено, что на среде с ацетатом развивалась термофильная синтрофная ассоциация, терминальным членом которой являлась метанобразупщая бактерия, потребляющая COg+l^.

Штамм Мв 41 выделен из опресненных вод Ромашкинского месторождения. Накопительная культура была получена на среде с СС^» % и формиатом в качестве источников углерода и энергии.

Клетки штамма Тм 337 представляют собой длинные тонкие палочки, часто образующие нити. Клетки обладают тенденцией к агрегации и иногда образуют крупные скопления. По Граму окрашиваются отрицательно.

Клетки штамма Мв 41 имеют форму длинных, тонких, слегка изогнутых палочек с закругленными концами, такасе иногда образующие нити. По Граму окрашиваются как положительные.

Изучение ультратонкого строения штамма Тм 337 выявило типичное для рода Ме1ЬалоЬас1ег1иш строение клеточной стенки, напоминающее строение клеточной стенки грамположительных эубактерий. Внешняя мембрана отсутствует, наружный слой клеточной стенки разрыхлен.

Цитохимическое окрашивание с рутением красным - специфическим красителем на кислые группы полисахаридов - позволило иденти-тифицировать внешний разрыхленный слой клеточной стенки и вещество, переходящее в среду, как полисахарид. Внешний слой клеточной стенки представляет собой микрокапсулу.

Жгутики и фимбрии у штамма Тм 337 не выявлены. Деление клеток осуществляется посредством оорлзования септы.

Изучение ультратонкого строения штамма Мв 41 также показало типичное для рода меЪЬэпоЬасЬег^ит строение клеточной стенки. По-лолительная цитохимическая реакция с рутением красным позволяет гогорить о наличии полисахаридной микрокзпсулы, материал которой

выявляется и в среде.

Жгутики и фимбрии не выявлены. Деление клеток штамма Мв 41 осуществляется путем образования септы.

Оба штамма в качестве субстрата для роста и метаногенеза могли использовать только смесь С02+ Н2- Другие субстраты не поддерживали рост и метаногрнез. Оптимальные значения рН, температуры и некоторые другие параметры представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Физиолого-биохимические свойства выделенных культур метаногенов.

м штам- Субстраты Окраска Содержание Одтимум Время генера-ма для роста по Граму Г+Ц.мол% рН Т ции, ч

Тм 337 С02+Н2

со2+н2

Ыв 41

Мсс.еи- метанол, ha 1 obiUS метиламины

34,0 7,5-8,5 65 12,9+0,5 40,8 6,8-7,2 37 23,4+0,3

43,0 6,8-7,2 37 15,1

+

Штамм Тм 337 развивается в интервале температур 30-80°с.0пти-мальная температура составляет 65°С..Оптимум рН для развития штамма Тм 337 достаточно широкий(7,5-8,5)и сдвинут в щелочную сторону. Оптимум рН для развития штамма Мв 41 более узкий и составляет 6,8-7,2. Интервал температур, в котором возможен рост штамма Мв 41 составляет 25-40°С. Оптимальная температура 37ÜC.

Оба штамма проявляют устойчивость к повышенной солености среды. Они выдерживают концентрации Nací в среде вплоть до 100 г/л, но активный рост и метаногенез отмечены для штамма Мв 41 до конце-

нтрации Nací 40 г/л и для штамма Тм 337 - 30 г/л. При дальнейшем повышении концентрации Nací наблюдается заметное ингибирование ме-таногенеза.

Результаты морфологических и физиологических исследований, а также данные иммунологического анализа позволили отнести выделенные штаммы Мв 41 И Тм 337 К семейству Methanobacteriaceae, к роду Methanobact-erium. На основании реакции иммунофлюоресцен-ции и субстратной специфичности штамм Мв 41 следует отнести к виду

Methaíiob^cterfum bryantii.

Выявлено большое СХОДСТВО штамма Тм 337 С Mb.thermoalcaliphi-íum по используемым субстратам, оптимуму рН, потребности в органи-чоских добавках. Однако оптимум и интервал температур, при которых возможен рост, у Mb.thermoaicaHphiium несколько ниже, а содержание ГЦ пар в составе молекулы ДНК несколько выше, чрм у Тм 337. Этот организм более чувствителен, по сравнению с Тм 337, к содо))-жению NaG1 в среде. Надо отметить, что именно Тм 337 и мьхьогшо-.-iicniiphiium-оргэшгзмы со сдвинутым в шелочную зону оптимумом рН ( до 8,5 ), имеют более низкое по сравнению с другими термофилами подержание ГЦ пар в составе молекулы ДНК: 34,0+0,1 мал% и 38,8 моль% соответственно. Однако, несмотря на схожесть фиизиолого-био-хпмических свойст, иммунологический анализ не показал наличие родства между ПТЭММОМ Тм 337 И Mb.thermoalcaliphilum.

По своей морфологии и оптимуму температуры штамм Тм 337 блп-it ffb.thprmoagsresan^. Однако, целый ряд свойств существенно отличает пголлт Тм 337 от названного вида. Штамм Тм 337 имеет 'лчее широкий оптимум рН, выдерживает более высокие концентрации к*")- Штамм Тм 337 нуждается в органических добавках в отличие от

- 14 - -

Mb.thermoaegregans. Содержание ГЦ пар в составе ДНК этих организмов также различается. В иммунологических исследованиях наблюдалось лишь слабое взаимодействие штамма Тм 337 с сывороткой к мь-thermo-

aggregans

В связи с вышесказанным систематическое положение изолята не достаточно ясно и для его уточнения требуются дальнейшие филогенетические исследования.

В рамках настоящей работы было продолжено изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств галофильного метило-трофного метаногена Methanococcoides euhalobius, ВЫДеЛеННОГО АЛЛбразцовой и др. ( 1987 ) из пластовых вод Бондюжского нефтяного месторождения.

Mcc.euhalobius является мезофильным умеренным галофилом. Оптимальная температура для роста составляет 28-37°С. Оптимальная величина pH 6,8-7,2, однако рост возможен в пределах от 5,8 до 8,0. Оптимальное содержание Nací в среде 60 ,г/л ( табл. 3 ).

Клетки Mcc.euhalobius в световом микроскопе имеют вид угловатых неправильных кокков, сильно варьируя в размерах от I до 3 мкм. Преобладающий способ деления - перетяжка. Иногда одновременно их бывает несколько. В некоторых клетках деление осуществляется особым способом, напоминающим почкообразование.

Внутриклеточных мембранных образований не выявлено. Среди включений можно отметить электронно-плотные гранулы полифосфатов. Полифосфатподобные включения отмечались также и у других . метилотрофных галофилов, например У Mlb.Uridai-ius < Koning, Stet-tкг, 1902 J, Mc.halophllus (ЧерНИ И Др., 1986), Ms.mazei ШТЭММ 47

( Ратнер и др., 1989 ). По Граму окрашиваются отрицательно. При

внесении детергентов додецилсульфата натрия и тритона Х-ГОО в количестве 0,01% клетки мгновенно лиэировались, что указывает на присутствие белка в составе клеточной оболочки. При проведении цитохимической реакции на полисахариды с альциановым синим обнаружено, что в составе клеточной стенки присутствует и полисаха-ридный компонент. Верхний слой клеточной стенки имеет тенденцию к слущиванию и полисахаридный компонент выявляется не только в клеточной стенке, но и в среде.

Субстратами, поддерживающими рост и метаногенез мсс. еиьа-1оЫиз, являются только метанол и метиламиныБ качестве источника серы культура может использовать только цистеин.

В ходе настоящей работы установлено, что важная роль в обеспечении активной жизнедеятельности и ригидности клеток изучаемого нами организма принадлежит ионам двухвалентных металлов, а

9+ о.

именно с-а*- п ме6- . Оптимальная концентрация с^с12 в среде составляет 10 г/л . Оптимальная концентрация мес12 составляет 2,4 г/л.

п.

При перенесении клеток в среду, лишенную ,уже через I час . отмечается изменение формы клеток. Клетки теряют свою нативную полигональную форму и превращаются в правильные кокки. Такая культура не жизнеспособна и через некототорое время лизируется. Отсутствие сай в среде, однако,не влияло на энергетические функции организма.

О I

Известно, что потребность в ионах са особенно в таких боль-• ншх количествах не характерна для метилотрофных галофильных организмов, И ЭТО СВОЙСТВО ЯВЛЯеТСЯ ОСОбеННОСТЬЮ Мсс.еиЬл1оЫч2.

В лабораторных условиях было показано, что все описанные метапобразуищие культуры, выделенные из нефтяных месторождений.

б ходе своего развития образуют полисахариды. Более подробно был изучен полисахарид Mac.euhaloblus. На электронных микрофотографиях видно, что полисахарид экскретируется в среду и образует пленку, к которой прикреплены клетки микроорганизма. По всей видимости, в природных условиях полисахаридная пленка решает задачу прикрепления клеток в пространстве, связывая их в единую популяцию.

Суммарная продукция полисахарида при росте Mcc.euhaiobius на среде с тримотиламином составляет 155 мг/г белка.

Были получены препараты полисахарида из культуральной жидкости и из клеток Mcc.euhaiobius. Анализ препаратов показал, что они имеют идентичный состав и состоят из глюкозы и маннозы в соотношении 3:2. Были изучены некоторые свойства полученного полисахарида. Он увеличивал вязкость вод рассольного типа. Так, при концентрации полисахарида 0,09% вязкость раствора, содержащего 15% NaCi и 0,5% Саах2, увеличивалась с ( 1,005+0,005 ) Ю-4 до ( 14,113 ±0,005 ) Ю-4 н сек/м2. Известный и широко используемый полисахарид ксантан в диапазоне концентраций 0,01-0,08% в растворе той же минерализации выпадет в осадок.

Полисахарид Mcc.euhaiobius обладает хелатирующими свойствами. Он связывает ионы Са из растворов с концентрациями от 10 M и выше. В деионизованной Еоде и в растворах с концентрацией СаС12 меньше Ю_3М происходит десорбция Са^"*" г.- раствор .

Полученный препарат полисахарида устойчив в высокоминерализованной среде в отличие от болыдинства известных бактериальных ■ полисахаридов, которые имеют низкую вязкость или в значительной степени ее снижают при повышении общей минерализации среды. Суб- ■ стратами для fro получения служат мзтанол или метиламины, что так-

- 17 -

же выгодно отличает его от известных биополимеров.

Таким образом, из нефтяных месторождений был выделен и изучен ряд культур метаногенов, способных развиваться в соленых средах и образовывать в таких условиях соединения( COg, СН^, полисахариды), известные как активные агенты нефтевытесненил. Полученные данные могут быть использованы при разработке биотехнологий повышения нефтеотдачи пластов.

ВЫВОДЫ

I. Установлено, что метанобразующие бактерии широко распространены в нефтяных месторождениях Татарии и Западной Сибири, имеющих различную минерализацию вод. Численность метаногенов варьирует в пределах 1-2500 клеток на мл и не коррелирует с величиной ми-черэлизацтш пластовых жидкостей.

?. Активный метаногенез обнаружен в Бысокоминерализованных пластовых водах с соленостью вплоть до 272 г/л. В высокоминерали-иг-обзнных низкосульфатных пластовых водах выявлены жизнеспособные клетки метаногенных бактерий.

3. Показано, что интенсивность бактериального метакогенеза в пластовых жидкостях нефтяных месторождений Татарии составляет ( 18,2-470 ) I0"3 мкл СН4 л-1сут-1. В Мыхпайском месторождении Западной Сибири интенсивность современного бактериального образования метена достигает 0,68-9,46 мкл СН^ л~*сут"^.

4. Из пластовых вод с невысокой минерализацией были выделены чистые культуры галотолерантных метанобразуютих бактерий, отнесенные К РОДУ Methanobacterium.

5. Изучены физиолого-биохимические и морфологические хяракт*-

ристики облигатного умеренно-галофильного метаногена Methanococco-

2+ 2+

ides euhaiobius. Показано, что потребность В ионах и Mg сос-

2+

тавляет 68 мЫ и 12 мМ соответственно; катионы са обеспечивают ригидность клеток метаногена.

6. В лабораторных экспериментах показано, что метаногенные бактерии, выделенные из нефтяных месторождений, содержат полисаха-ридный компонент как в клеточной стенке, так и экскретируют его в среду. Изучены свойства полисахарида галофильного метаногена ме-thanococcoides euhalobius. Установлено, ЧТО ЭТОТ ПОЛИСаХарИД уве~ личивает вязкость рассолов, близких по ионному составу к высокосоленым пластовым водам.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Чарахчьян ИЛ., Митюшина JIJI., Кузнецова BJ1., Беляев С.С. Морфология И ультраструктура Met.hanococcoides euhalobius и РОЛЬ кальция в его морфогенезе// Микробиология- 1989- Т.58, В.5.-С.825-830.

2. Чарахчьян ИЛ., Кузнецова BJ1., Митюшина JIJ., Беляев С.С. Особенности строения клеточной стенки метанобразующей галофильной

бактерии Methanococcoides euhalobius// ВсесОЮЗНйЯ КОНфереНЦИЯ "Регуляция микробного метаболизма". Тез.докл- Пуцино- 1989- С.22-23

3. Чарахчьян И Л., Кузнецова ВТ., Митюшина JIJI., Беляев С.С. 7+

Роль Ca в структуре клеточной стенки галофильного метаногена м*-UianoGoccoides euhalobius// Микробиология.- 1991.- T.6G.- В.Т

4. Charakchiari I.A., Kuznetsova V.O., Belyaev S.S., Ivanov M.V. Polysaccharids of met hanogenic halopMIir archaebhci.eria Methano-

. - 19 -

coccoides euhaloblus// Abstract« of conference "BIGB'90".- China.-1989.- P.216.

5. Belyaev S.S., Charakhchian I.A'., Borzenkov I.A., Mllyokhl-na E.I., Kuznetsova V.Q. Activity of microbial processes In stra-tal waters of oil field// Proceedings of conference "Microbiology of the Deep Subsurface".- USA- 1990,- in press.

6. Belyaev S.S., Charakchian I.A., Kuznetsova V.O., Strict anaerobic bacteria and their possible contribution to the enhancement of oil recovery// Proceedings of MEOR Conference.- Oklahoma, USA.- 1990- in press.

Подл, к П8Ч. 13,03,91г. Тираж 100 Заказ 43

ВНИПИ труда в стр-во Госстроя СССР