Нафталинметаболизирующий консорциум микроорганизмов, выделенный из засоленной почвы

Ананьина, Людмила Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Нафталинметаболизирующий консорциум микроорганизмов, выделенный из засоленной почвы
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Нафталинметаболизирующий консорциум микроорганизмов, выделенный из засоленной почвы"

На правах рукописи

АНАНЬИНА Людмила Николаевна

НАФТАЛИНМЕТАБОЛИЗИРУЮЩИЙ КОНСОРЦИУМ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫЙ ИЗ ЗАСОЛЕННОЙ ПОЧВЫ

03 00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ1ьи(•■

Пермь-2007

003160777

Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель

кандидат биолотеческих наук Плотникова Елена Генриховна Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна доктор биологических наук Октябрьский Олег Николаевич

Ведущая организация

Институт микробиологии им. С Н Виноградского РАН, Москва

Защита состоится «_» _ 2007 г в_часов на заседании

диссертационного совета Д 004 01901 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу 614081, г. Пермь, ул. Голева, д 13 Факс (342)2446711

Автореферат размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http /www iegm ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан «_»_ 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

чй-корр РАН Ившина Ирина Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Широкое применение в промышленности, присутствие в побочных продуктах коксо-, газо- и нефтеперерабатывающих производств, образование при сгорании различных органических материалов (каменного угля, нефти, газа, древесины, мусора и др ) привело к повсеместному распространению полициклических ароматических углеводородов в окружающей среде Физико-химические свойства соединений этого класса (гидрофобность. высокая сорбционная способность и стабильность) способствуют их аккумуляции в природных экосистемах Кроме того, полициклические ароматические углеводороды обладают токсичным, мутагенным, тератогенным и канцерогенным действиями на живые организмы Все вышеперечисленное послужило причиной выделения соединений этого класса в категорию приоритетных поллютантов (Mumtaz et al, 1995) Основную роль в разложении соединений данного класса в природе играет микробная деструкция (Sutherland et al, 1995) В настоящее время накоплен большой объем информации о способности бактерий использовать ряд полициклических ароматических углеводородов в качестве единственного источника утаерода и энергии (Kanaly, Harayama, 2000, Habe, Omon, 2003) Наиболее изученными являются бактериальные генетические и биохимические системы катаболизма нафталина, который используется в качестве модельного соединения для изучения систем деструкции полициклических ароматических углеводородов (Воронин и др , 1989, Yen, Serdar, 1988, Bosch et al., 1999, Laune et al, 1999, Jones et al, 2003, Parales, 2003; Kulakov et al, 2000,2005)

В ряде случаев загрязнение экосистем полицивсяическими ароматическими углеводородами сопровождается засолением, которое может иметь природное или антропогенное происхождение, сформированное в результате разработки нефтяных месторождений и работы соледобывающих предприятий В этих условиях ведущими факторами формирования микробиоценозов становятся соленость среды и поллютант Микроорганизмы и их сообщества, способные к деструкции полициклических ароматических углеводородов при высокой солености среды, описаны в единичных сообщениях (Звягинцева и др , 2001; Плотникова и др., 2001, Mille et al, 1991, Dyaz et al, 2000, Hedlud et al, 2001, Kasai et al., 2002, Abed et al,

2006) Остаются малоизученными взаимодействия внутри таких сообществ, а

также механизмы регуляции их состава, метаболической активности и устойчивости к высокому содержанию солей. Проведение исследований в этой области внесет существенный вклад в разработки новых стратегий биоремедиации экстремальных экосистем

Цель работы - исследование нафталинметаболизирующего консорциума микроорганизмов, выделенного из засоленной почвы

Задачи исследования

1 Выделить стабильное/устойчивое сообщество микроорганизмов, способное использовать нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии в присутствии высоких концентраций хлорида натрия

2 Определить таксономическое положение бактерий сообщества на основе принципов полифазной таксономии

3 Изучить взаимоотношения бактерий в консорциуме при росте на нафталине в условиях высокой солености

4 Исследовать осмопротекторные соединения грамположителъных галотолерантных и грамотрицательных умеренно галофильных бактерий, изолированных из консорциума.

Научная новизна. Определен состав консорциума бактерий, осуществляющего разложение нафталина в условиях высокой солености среды (до 9 % хлорида натрия) Установлено, что в консорциум входят галотолерантные бактерии-деструкторы нафталина и галотолерантные, умеренно галофильные бактерии, не способные осуществлять разложение данного полициклического ароматического углеводорода Показано, что катаболизм нафталина в консорциуме осуществляют актинобактерии рода Rhodococcus На основании филогенетической обособленности и фенотипических отличий описаны новый род и вид Salimcola socius sp. nov, gen nov, новые виды Rhodococcus naphthalemvorans sp nov и Thalassospira permetise sp nov Показано, что представители родов Sahnicola и Rhodococcus при высокой осмолярности среды накапливают глутамат, эктоин и гидроксиэктоин, выступающие в роли внутриклеточных осмопротекторов Для представителей рода Rhodococcus подобная комбинация осмопротекторов описывается впервые Экспериментально обосновано присутствие протокооперативных взаимоотношений в консорциуме между бактериями-

деструкторами нафталина и бактериями-спутниками

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные уточняют классификацию семейства Halomonadaceae и расширяют знания о разнообразии бактерий сообщества техногенных засоленных почв (г Березники, Пермский край) Результаты исследований могут служить основой для разработки методов мониторинга биоразнообразия данного микробиоценоза Результаты, касающиеся механизмов функционирования консорциума микроорганизмов, разлагающего полициклические ароматические углеводороды при высокой солености среды, могут быть использованы для усовершенствования методов биоремедиации экстремальных экосистем Создана рабочая коллекция галотолерантных/галофильных бактерий, перспективных для использования в биотехнологии Материалы диссертации используются в лекционных курсах на кафедрах микробиологии и иммунологии, ботаники и генетики растений Пермского государственного университета

Положения, выносимые на защиту

1. Выделенное из засоленной почвы нафталинметаболизирующее сообщество микроорганизмов является многокомпонентной системой, включающей галотолерантные бактерии-деструкторы нафталина, умеренно галофильные и галотолерантные бактерии-спутники

2 На основании фенотипических характеристик и филогенетического анализа описаны новые таксоны Salimcola socius sp nov, gen nov, Rhodococcus naphthalemvorans sp nov и Thalassospira permense sp nov

3 В выделенном из засоленной почвы нафталинметаболизирующем консорциуме бактерий формируются взаимовыгодные отношения между галотолерантными бактериями-деструкторами нафталина и умеренно галофильными бактериями-спутниками

4 Умеренно галофильные бактерии-спутники и галотолерантные бактерии-деструкторы нафталина в условиях высокой солености среды накапливают низкомолекулярные органические соединения (осмопротекторы)

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы реабилитации техногенных экосистем», Астрахань, 2004,

II Международной конференции «Микробное биоразнообразие состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал», Пермь-Казань-Пермь, 2005, 9-й-10-й Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2005, 2006, Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005, Всероссийской молодежной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Москва-Пущино, 2006, IV Международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 2007

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах

Объем и структура диссертации. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 29 рисунков Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 229 литературных источника, из них 28 на русском языке и 201 зарубежный, и приложений

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации сложных органических соединений бактерий, перспективных для биотехнологии» (номер государственной регистрации НИР 0120 0406511) Исследования поддержаны грантами РФФИ (№04-04-96042-р_урал_а, №07-04-96078-р_урал_а), Программой интеграционных фундаментальных исследований, выполняемых в УрО РАН совместно с учеными СО РАН (проект «Микробные сообщества экстремальных экосистем»)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение консорциума микроорганизмов. Образцы почвы отобраны на расстоянии 10 м от солеотвала калийного комбината ОАО «Уралкалий» (г Березники, Пермский край) Для получения накопительной культуры 1 г почвы вносили в колбу объемом 250 мл, содержащую 100 мл минеральной среды Раймонда (Розанова, Назина, 1982), нафталин (1 г/л), №С1 (6 %) и инкубировали на

термостатируемом шейкере УВМТ-12-250 при 100 об/мин и 28°С до появления микробного роста Исследования проводили с сообществом (консорциумом) микроорганизмов, полученным путем многократных пересевов накопительной культуры и культивирования при вышеперечисленных условиях, обозначенным БМВЗ.

Бактериальные штаммы. Чистые культуры микроорганизмов из консорциума бактерий выделяли на полноценной агаризованной среде Раймонда, содержащей 5 г/л триптона, 2,5 г/л дрожжевого экстракта и 30 г/л КаС1 (Плотникова и др, 2001) В работе использовали 1-алотолерантные бактерии-деструкторы нафталина родов В.1го<1ососст и АпкгоЪасЬег, а также умеренно галофильные бактерии сем На1отопа<1асеае, изолированные ранее из засоленных почв (Алтынцева, 2001, Плотникова и др , 2001, 2006)

Ростовые характеристики консорциума микроорганизмов, смешанных культур микроорганизмов (модельные эксперименты) и штаммов-деструкторов изучали в периодических культурах, выращивая в колбах объемом 250 мл на орбитальном шейкере УВМТ-12-250 (100 об/мин) при 28°С В опытах но культивированию консорциума 8МВЗ на разных субстратах (нафталине, салицилате, гентизате и ацетате), а также при изучении ростовых характеристик смешанных кулмур микроорганизмов (модельные эксперименты) концентрация субстратов составляла 0,5 г/л В экспериментах по исследованию кинетики роста штаммов-деструкторов и консорциума микроорганизмов в условиях разной солености среды (0-9% ЫаС1) концентрация нафталина была равна 1 г/л Определение биомассы проводили путем измерения оптической плотности (ОП540) культуральной жидкости на спектрофотометре иУ-УшЫе ВюБрес-яши («8Ьш1а<Зги», Япония) в кювете с длиной оптического пути 0,5 см Поскольку бактерии консорциума четко различались макроморфологическими характеристиками, проведен подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) морфотипов колоний в составе микробного консорциума КОЕ определяли методом серийных разведений с последующим высевом и подсчетом колоний на агаризованной полноценной среде Раймонда, содержащей 3 % МаС1 Расчет удельной скорости роста (|х), времени удвоения и длительности /а£-фазы (Т[) производили по стандартным формулам (Нетрусов и др, 2005)

Определение таксономического положения микроорганизмов.

Морфологические и физиолого-биохимические признаки бактерий исследовали согласно стандартным методикам (Методы общей бактериологии, 1983) Для определения энзиматической активности использовали тест-системы «СИБ» (Нижний Новгород, Россия) в соответствии рекомендациям производителя Наличие миколовых кислот выявляли методом тонкослойной хроматографии (Goodfellow, Minmkin, 1985) Изомер диаминопимелиновой кислоты в продуктах кислотного гидролиза клеточных стенок определяли методом бумажной хроматографии (Becker, 1964) Препараты клеточных стенок получали по методу, описанному (Schleifer, Kandier, 1972) Состав жирных кислот целых клеток и хинонов определяли по описанным ранее методам (Zhilina et al, 1997) Нуклеотидный состав ДНК определяли по температуре ее тепловой денатурации (Owen, Lapage, 1976) Выделение тотальной ДНК проводили описанным ранее методом (Current protocols m molecular biology, 1995). Предварительную группировку штаммов бактерий осуществляли методами ДНК-типирования REP-ПЦР, ВОХ-ПЦР и ARDRA (Versalovic et al, 1994, Scortichun et al, 2002) Определение нукяеотидной последовательности гена 16S рРНК, амплифицированного с эубактериальными праймерами 27F и 1492R в термоцихлере «My Cycler» («Вю-Rad», США), проводили с применением набора реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit («Beckman Coulter», США) на автоматическом ДНК-секвенаторе CEQ 2000 XL DNA Analysis System («Beckman Coulter», США) (Гавриш и др, 2004) Последовательности 16S рДНК выравнивали с помощью программы CLUSTAL W (Thompson et al., 1994) Построение филогенетического древа производили с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer, DeWachter, 1994)

Денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГГЭ). Структуру консорциума микроорганизмов исследовали методом ДГГЭ фрагментов гена 16S рРНК, амплифицированных с применением эубактериальных праймеров 27F и 518R (Turóla et al, 2002) Праймер 27F включал 40 нуклеотидный GC-xboct (5-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3') на -конце Электрофорез был выполнен на Dcode™ Universal Mutation System («Bio-Rad», США) согласно протоколу (Muyzer et al, 1993)

Выделение и анализ осмопротекторов. Выделение осмопротекторов проводили из клеток, выращенных в минеральной среде Раймонда с разной соленостью и глюкозой в качестве субстрата Спектры ЯМР регистрировали на импульсном Фурье-спектрометре ЯМР типа WP80SY («Вгикег», Германия) (Хмеленина и др, 2000)

Статистическая обработка. Повторность опытов трехкратная При статистической обработке определяли среднюю арифметическую, стандартное отклонение, доверительный интервал, достоверность результата Для обработки результатов использовали статистический модуль Excel 5 0

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Рост сообщества бактерий в присутствии различных концентраций хлорида натрия. Исследование влияния солености среды на рост сообщества бактерий в минеральной среде Раймонда с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии показало, что максимальные значения оптической плотности культуры наблюдаются при 3 % NaCI и в отсутствие соли Увеличение концентрации хлорида натрия в среде культивирования до 9 % приводит к снижению показателей ростовых характеристик При более высоких концентрациях соли увеличения оптической плотности не зафиксировано (рис 1)

Рис 1 Динамика роста сообщества бактерий в минеральной среде Раймонда с нафталином при разных концентрациях ШС1. 1 - без соли, 2 - 3 %, 3 - 6 %, 4 - 7,5 %, 5 - 9 %

Выявленный ингибирующий эффект повышенных концентраций хлорида натрия на рост бактерий в процессе разложения токсичных ксенобиотиков, в том числе полициклических ароматических углеводородов, отмечен многими исследователями (Звягинцева и др , 2001, Плотникова и др , 2001, Mille et al, 1991) Характеристика бактерий сообщества SMB3. Из исследуемого бактериального сообщества, культивированного в жидкой минеральной среде на нафталине в присутствии 6 % NaCl, выделено семь штаммов бактерий,

обозначенных как SMB31, SMB32, SMB33, SMB34, SMB35, SMB37 и SMB38 Изолированные штаммы отличаются между собой и от выделенных ранее из почв района солеразработок бактериальных изолятов по фенотипическим и генотипическим характеристикам (ДНК-профилю REP-, ВОХ-ПЦР и ARDRA)

Штаммы охарактеризованы по способности к росту на нафталине и полноценной среде при различных концентрациях NaCl (табл 1) Установлено, что в состав сообщества входят штаммы, которые разлагают нафталин, как в отсутствие, так и в присутствии хлорида натрия (штамм SMB37 - до 7,5 %, штамм SMB38 - до 9 %), а также штаммы, не деградирующие данное соединение (табл 1) Изоляты SMB32, SMB33, SMB37 и SMB38 способны к росту на полноценной среде Раймонда без NaCl и в его присутствии - до 10 %, а штамм SMB34 растет при концентрации хлорида натрия до 8 % в среде культивирования Вышеперечисленные бактерии отнесены к группе галотолерантных микроорганизмов Штаммы SMB31 и SMB35 растут на полноценной среде

Таблица 1

Рост бактерий в присутствии разных концентраций хлорида натрия

Штамм Содержание NaCl (%), полноценная среда * Содержание NaCl (%), минеральная среда с нафталином**

0 3 8 10 17 30 0 7,5 8 9

SMB31 - +++ +++ +++ ++ + - - - -

SMB32 +++ +++ +++ + - - - - - -

SMB33 +++ +++ +++ ++ - - - - - -

SMB34 +++ +++ +++ - - - - - - -

SMB35 + +++ +++ +++ ++ + - - - -

SMB37 +++ +++ +++ + - - +++ + - -

SMB38 +++ +++ +++ + - - +4+ +++ ++ +

Примечание * - рост на полноценной агаризованной среде Раймонда, ** - рост в жидкой минеральной среде Раймонда с нафталином, «—»— нет роста, «+» — «+++» — активность роста

Раймонда при 30 % NaCl, для оптимального роста изолятов необходимо присутствие 3-10 % NaCl в среде культивирования Таким образом, согласно классификации Кашнера изоляты SMB31 и SMB35 являются умеренными галофилами (Кашнер, 1981, Ventosa et al, 1998)

Таксономическая характеристика умеренно галофильных бактерий семейства Halomonadaceae. Умеренно галофильные бактерии SMB31 и SMB35 отличаются друг от друга по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам (табл 2)

Филогенетический анализ, основанный на сравнении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, показал, что штаммы занимают обособленное положение внутри семейства Halomonadaceae (рис 2) Изолят SMB31 группируется с Halomonas taeanensis (уровень сходства 16S рДНК - 99,8 %), а штамм SMB35 образует периферическую ветвь в подкластере, включающем роды Halomonas, Cobetia и Chromohalobacter (значение «bootstrap» - 76%) Уровни сходства 16S рДНК изолята SMB35 и видов рода Halomonas находятся в пределах от 90,6% до 95,1% Наиболее высокие величины сходства - 95,0-95,1 % -обнаружены с тремя видами рода Halomonas - Н pacifica, Н taeanensis и Н ventosae, не входящими ни в группу Halomonas sensu stricto (I группа), ни в наиболее многочисленную группу галомонад (П группа) и не группирующимися друг с другом (рис 2) В целом ряде классов микроорганизмов, в том числе протеобактерий, подобные величины сходства 16S рДНК квалифицируются как межродовые (Takeuchi et al., 2001, Evtushenko, Takeuchi, 2003, An et al, 2006)

Штамм SMB35 обладает существенными характеристиками, дифференцирующими его от видов Halomonas sensu stricto, близкородственных видов рода Halomonas и от представителей других родов семейства Halomonadaceae, среди которых необходимо выделить содержание Г+Ц-пар в ДНК, подвижность и характер расположения жгутиков, диапазон концентраций хлорида натрия, при которых возможен рост, способность гидролизовать крахмал, желатину, твин 80 и мочевину (табл 2, 3)

Выявленные фенотипические отличия, а также филогенетическая обособленность штамма SMB35 дают основание для выделения нового рода и вида, для которого предлагается название Sahmcola socius gen. nov., sp nov Нуклеотидная последовательность 16S рДНК штамма Sahmcola socius SMB35T (1433 п H ) депонирована в GenBank под номером DQ 979342.

Штамм SMB31 на данном этапе работы идентифицирован как Halomonas sp

О 07.

_UHL

lWj— H halmophila ATCC 19717 T (AJ306889)

H. almeriensis M8 T (AY858696) Mj— H- elongate ATCC 33173 T (M933S5) '— H. eurihalma ATCC 49336 T (L42620) И maura DSM13445T (AJ271864) 100 Г и. salina ATCC 49509 T (AJ2434470) H. halophüa DSM 4770х (M93353) Bj— П. orgamvorans G-16.1T (AJ616910) H koreensis SS20 T (AY382579)

- H pacifica DSM 4742 T (L42616) - H. cupida DSM 4740T (L42615)

H.ventosae AI 12T (AY268080)

[91]-- H. haloiemtrificans DSM 735 T (L04942)

Ж alimentaria DSM 15356T (AF211860) H. campaniensis 5AGTT (AJ515365)

— H. campisalis ATCC 700597 T (AF054286) -Ж halocynthiae DSM 14573 T (AJ417388)

100-II. subglaciescola DSM 4683 T (AJ306892)^

H. hatodurans DSM 5160 T (L42619)

SSL

92r Я. bolwiensis DSM 15516 T (AY245449) 100|t If neptunio DSM 15720T (AF212202) MJ I— H. variabilis DSM 3051T (AJ306893) '— И sulfidaensDSM 15722T (AF212204) Ю0Г H. venusta DSM 4743T (AJ306894)

l И hydrothermahs DSM 15725T (AF212218) — H. magadumsis DSM 15367х (X92150) H. aguamarina DSM 30161T (A,1306888) H. menduma DSM 5425 T (A J30689I) H. axialensis DSM 15723T (AF212206)

- H. pantellenense DSM 9661т (X93493) ~

- H muralis DSM 14789T (AJ320530)

- H. desiderata DSM 9502т (X92417) - H. marisflavi DSM 15357T (AF251143)

ibflJ--

ЧЙ

Й В

CI >>

s. u

_ша.

100j Ch. salexigens DSM 3043T (AJ295146)

Ch. israelensis ATCC 4398 5T (AJ295144) Ch. sarecensis DSM 15547T (AY373448) Ch. marismortm ATCC 17056 т (X87219) - Chromohalohacter sp. SMB17 ■ Ch. canadensis ATCC 43984 T (AJ295143) - Я. anOcanensis FP35T (AY489405)

-Cobetia merina DSM 47411 (AJ306890)

-loor- SMB31

L #. taeanensis DSM 16463 T (AY671975)

С/.Iixi/iyif/I ммнл CilírDlí V-Db-H* TP 1

8Sr

Sahnicola socios SMB3S V=BKM B-27,97 4 (DO 979342) Zymobacterpolmae DSM 10491T (D14555) Carmmonas nigricans CTCBSlT (Y13299)

-P. putida DSM 291T (Z76667)

Рис 2 Филогенетическое древо, построенное с использованием метода neighbor-joining, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей 16$ рДНК. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrapw-анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50 %)

Признаки, дифференцирующие штамм SMB35 и штамм SMB31 от видов рода Halomonas, имеющих наиболее высокое сходство по 16S рДНК (Я. pacifica, Н. taeanemis, Н. ventosaé), типового вида Я. elongata и видов, близких к Я. elongata (Я. halmophila, Н. almeriensis, Н. eurihalina)

Признак SMB35 SMB31 Я taeanensi/ Я paaficar Я ventosa^ Н elongata г Я halmophilar Я almeriensis8 Я eurihalmar

Расположение жгутиков, количество Оксидаза О/Т тест (глюкоза) Гидролиз желатины мочевины крахмала твина80 Полярное, 1 F + + + + н.д F Перитрихи- альнос + нд + Перигрихи- альное + О + нд + нд Латеральное или полярное, несколько -(в) О (в) + Латеральное + О -(+) -(в) нд О + + +

(5-галактозидаза - - нд - - + (в) -(в) - +

Феншшшшвдезаминаза Образование Н2Б Восстановление нитратов до нкгритов Образование кислоты ¿-арабиноза глюкоза инозит сахароза сорбит ДНКГ+Ц(мод %1 Оптимум ЫаС1, %* Пределы №С1, % Пределы рН** + + 63,0 3,0-10,0 0,5-30,0 6,0-8,0 + + + + +■ нд 3,0-10,0 3,0-30,0 6,0-7,0 нд ид. + + + нд нд нд 65,0 10,0-12,0 1,0-25,0 7,0-10,0 + ¥ 67,5 0,5-3,0 0,0-20,0 5,0-10,0 + + + 74,3 6,0-9,0 3,0-15,0 6,0-10,0 + <В) + + + + + (в1 60,5 3,0-8,0 0,0-20,0 5,0-10,0 Кв) + + + 62,9 7,5 3,0-25,0 5,0-10,0 63,5 7,5 5,0-25,0 6,0-10,0 + + 65,7 7,5 0,5-25,0 5,0-10,0

Примечание «+» - положительная реакция, «-»- отрицательная реакция, «н д » - нет данных, «в» - вариабельно, * - %, всс/объем, ** - для штаммов SMB31, SMB35 использовали буферные системы, в Других случаях рН доводили HCI и NaOH, л- цит по Lee J -С с соавт, 2005, Б-цит по Martinez-Canovas М J с соавт, 2004,3 - цит no Martínez-Checa F с соавт, 2005,г- цит rio Mata J А с соавт, 2002, Arahal D R, Ventosa А, 2006 В скобках приведены вариабельные результаты цит по Arahal D R, Ventosa А, 2006

Таблица 3

Фенотипические признаки, дифференцирующие штамм SMB35 от других родов семейства Halomonadaceae

Признак SMB35 СкготоШоЬааег* Cobetia е Carnmonasв Zymobacterf

Цвет колоний Подвижность Расположение жгутиков, количество Оксидаза С№ (глюкоза) Гидролиз желатины крахмала твина 80 мочевины Фенилаланивдезаминаза Восстановление нитратов до нитритов ДНК Г+Ц (мол %) Оптимум ЫаС1, % (в /об ) Пределы №С1, % (вУоб ) Пределы рН*** Рост при 5°С Рост при 42°С Желтый + Полярное, 1 F + + + + 63,0 3,0-10,0 0,5-30,0 6,0-8,0 Белый, желтый, кремовый, коричневый, черный (от желтого до темно- коричневого) + Полярное, субполярное, перитрихиальное (перитрихиальное) в (-) О* (О) в {-) -* Н в (+) 56,1-65,0 (62,1-64,9) 7,5-10,0 (10,0; 0,0-30,0 (1,0-30,0) 4,5-10,0 (5,0-10,0) в (+) + Кремовый + Перитрихиальное, 2-5 О + 62,0-64,0 5,0 0,5-20,0 S,0-10,0 + Белый + нд + + 56,0±0,3 4,0 0,0-8,0 нд Молочно- белый + Перитрихиальное F** нд н а 55,4-56,2 нд нд 3,0-10,0

Примечание «+» - положительная реакция, «-»- отрицательная реакция, «в» - вариабельно, «н д.» - нет данных, * - данные дня ряда видов отсутствуют, ** - факультативный анаэроб, сбраживает ряд Сахаров до этанола, *** - дяя штамма SMB35 использовали буферные системы, в других случаях pH доводили HCl и NaOH,л - ipim. по Arahal D R, Ventosa А, 2006, Quillaguaman J с соавт, 2004, Prado В с соавт, 2006, Peconek J с соавт , 2006, в скобках приведены характеристика типового вида рода Chromohalobacter mansmortui цит по Ventosa А с соавт, 1989, " - цит по Atabal DR. с соавт, 2002,в-цит noGamgaM с соавт, 1998,г -цит noOkamotoT с соавт, 1993

Таксономическая характеристика галотолерантной бактерии семейства Rhodospirillaceae. У штамма определена последовательность гена 16S рРНК, составляющая 1391 пн. Филогенетический анализ показал, что штамм является членом семейства Rhodospirillaceae и стабильно группируется вместе с представителем хемоорганотрофного рода - Thalassospira lucentensis, с которым имеет наиболее высокий уровень сходства 16S рДНК (96,7 %) (рис 3)

Подобно филогенетически близкому организму Thalassospira lucentensis штамм SMB34 является аэробом, хемоорганотрофом, клетки представляют собой оксидазо- и каталазоположительные, подвижные за счет одного полярного

жгутика, изогнутые палочки Среди преобладающих жирных кислот присутствует гексадекановая кислота.

Вместе с тем, изолят обладает физиолого-биохимическими и хемотаксономическими признаками, четко дифференцирующими его от вида Г/га/ал'505/>г/-а ¡исеМепш Наиболее значимыми из них являются наличие нитратредуктазы, положительная реакция в тесте Хью-Лейфсона, концентрации хлорида натрия (0-8 %), при которых возможен рост, преобладающие жирные кислоты (циклопропаннонадекановая, й>9-октадеценовая,

циклопропангептадекановая, гексадекановая кислоты)

0.02

JE.

дм_

92,

JJML

- Azospirillum doebereinerae GSF7Iт (AJ238567 )

- Azospirillum largomobile ACM 2041 (X90759) Azospirillum oryzae COC8T (AB185396 )

Jj-Azospirillum melmis TMCV 0552 T (DQ022958 )

Azospirillum Itpoferum ATCC 29707 (iM59061)

-Azospirillum brasdense Sp7T (X79739)

-Azospirillum hol opraefercns Au4 (X79731)

—И>

- Skermanella parooensts ACM 2045 (X90760)

- Azospirillum amazonense DSM 2787 T (Z29616)

- Azospirillum irakense KBC1T (Z29583 ) Rhodocista pehngensis 3-?T (AF523824 )

Rhodocista centenana ATCC 43720 T(D12701) Rhodospirillum centenum ATCC 43720 T (B1270'i) Inqmünus limosus AU 476T (AY043374 )

siT

• Oefluvicoccus vanus Ben 114 (AF179678)

Tistrella mobihs TISTR 1108

(AB07166S)

88r-

-4

j Qfl— Rhodovibrio sodomensis DSI (M59072)

Rhodovibrio salinarum ATCC 35394 т (M59069 ) Magnelospirillum magnelotacticum MS-1T fYlOllO) Magnelospmüum giyphiswaldettse MSR-1 (V10109)

- Phaeospirillum molischianum АГСС 14831 (M59067)

1 T

u Phaeospirillum ftilmrn NCIB 11762 T (D14433 )

—f

jm.

■ Thalassospira lucentensis QMT2 (AF358664)

-Rhodospirillum photometricum DSM 122 T (AJ222662)

Shodospirillum rubrum ATCC 11170 тф30778)

-Rhodospira trueperi AT CC 700224 (AJ001276 )

Roseospira marina CE2105T (AJ298879)

Roseospira medtosalma L1-66T (AJ000989)

631-Roseospira navarrensis SE3104 T (AJ298880 )

- Azprhizphmm caulinodans LMG 6465 т (X67221)

Рис 3. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода neighbor-joining, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей 16S рДНК. Масштаб соответствует 2 нукяеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrapw-анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50 %).

Основываясь на перечисленных выше данных филогенетического анализа, а также на существенных отличиях по фенотипическим характеристикам от известного вида, на настоящем этапе исследований штамм отнесен к новому виду ТЬа1а.ч$о$р1га регтеюе ер поу.

Определение таксономического положения актинобактерий рода Шюйососсив - деструкторов нафталина. Анализ хемотаксономических признаков грамположительных штаммов 8МВ37 и 8МВ38 показал, что в состав пептидогликана входит .мезо-диаминоиимелиновая кислота, в клеточной стенке

002

R wratislaviensts NCIMB130821 (237138) ""ч

S. tmtechensis RKJ30«T (AY525785) R. opacus DSM 43205т (X80630) R percolates MBS1T (X92114) IB38

R. jostii NBRC 16295т (AB046357) R. koreensis DNP5CST (AF124343) R marinonascensDSM 43752т (X80617)

--R. maanshanensts M712T (AF416S66)

--R tukisamuensis МЬ8Т (AB067734)

74 I-R Ьшкопигепж Al-22 r (AB971951)

аг-Г"1- R. erythropohs ATCC 4277 т (X81929)

1-R globerulus DSM 49S4T (X80619)

... i-RyunaanenstsYIM 700561 (AY602219)

R. luteus AT CC 35014 1 (X8I932) R fasciitis ATCC 12974 т (X81930) J

% и

R. equi ATCC 69391 (X80603)

«I-R. triatomae IMfflB RIV-0851 (AJ8540S5)

I"1-R rhodnuATCC35071 т(X81935)

-R. kmppeniiedtu K-07-23T (AY726605)

R corynebacterwuies DSM 20151т (X80615) R. phenohcusG2¥T(AX533293) IflO i- R aetherovorans 10bc312T (AF447391) и

R. ruber DSM 433381 (X80625) §

1-R zopju ATCC 51349 т (X81934) •§

- R coprophilus ATCC 29080 т (X8T928) •§

1 j-R rhodochrous DSM 43241т (X79288)

|-SMB37

4 - R gordoniae W49371 (AY233201)

j R pyridmovorans PDB9 T (AF173005) I 1R roseus ATCC 271т (X81921) J

- Corynebacterium diphtherial NCTC11397 т (X84248)

Рис 4 Филогенетическое древо, построенное с использованием метода neighbor-joining, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей 16S рДНК. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrapw-анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50 %)

Признаки, дифференцирующие штамм 8МВ37 от близкородственных видов _рода Ккойососсш_

Признак SMB37 R rhodochrousл R pyndmworansE R gordoniaeB

Цвет колоний Розовый Оранжевые- Светло- Розовый-

красные оранжевый коралловый

Гидролиз

крахмала + - - +

мочевины - + -

Образование Н23 - - + -

Восстановление нитратов + + +

до нитритов

Образование кислоты

арабиноза + - +

галактоза - - +

ксилоза + В - +

мальтоза + -о - -

маншгг + + + +

сахароза - +

Рост в среде с КаС1, %* 10 7 нд. 5

Примечание «+» - положительная реакция, «-»- отрицательная реакция, «нд» - нет данных, «в» - вариабельно, * - %, вес/объем, л - цит по Нестеренко О А и др, 1985, в скобках данные цит по Ившиной И Б, 1997, Б - цит по Yoon J -Н с соавт, 2000, " - Jones A L с соавт, 2004

выявлены миколовые кислогы Бактериальные культуры характеризуются жизненным циклом кокк-палочка-кокк. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 163 рДШС штаммов SMB37 и SMB38, составляющих 1272 пн и 1400 пн, соответственно, выявил их принадлежность к роду Rhodococcus Данные филогенетического анализа 16S рДНК штамма SMB38 показывают, что он имеет высокий уровень сходства с R. jostti (99,6%) в подкластере R erythropolis На данном этапе исследований штамм SMB38 идентифицирован как Rhodococcus sp. (рис. 4)

На филогенетическом древе штамм SMB37 попадает в подкластер R. rhodochrous, что подтверждается высоким значением «Ьооййгарл-анализа (90 %) (рис 4) Уровень сходства 16S рДНК штамма с видами этой группы составляет 97,8-98,4% В литературе имеется достаточно много сообщений (Bnglia et al, 1996, Yoon, Cho et al, 2000, Yoon et al, 2000, Goodfeflowet al, 2002, 2004, Jones et al, 2004), свидетельствующих о том, что виды рода Rhodococcus при подобных значениях сходства 16S рДНК и даже намного выше - от 99,0% до 99,5 % - имеют уровень ДНК-ДНК гомологии намного ниже 70 % - значения, рекомендованного для выделения бактериального вида (Wayne et al, 1987) С

учетом вышесказанного и существенных отличий по фенотипическим признакам (табл 4), в их числе устойчивость к соли и способность использовать нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии, штамм SMB37 представляет собой новый вид рода Rhodococcus, с предложенным названием Rhodococcus naphthalemvorans sp nov.

Штамм SMB32 - представитель группы «Arthrobacter nicotianae». Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности штамма SMB32, составляющей 1415пн, показал, что он попадает в группу «А nicotianae» рода Arthrobacter со значением «bootstrap»-aHajnea 92 %, включающую виды А nicotianae, А sulfiireus, А mysorens, А uratoxydans, А protophormiae, А rhombi, А creatinolytwus, А arüaitensis, А bergerei, А ardleyensis, А psychrolactophilus, А kerguelensis и А gangotriensis Наиболее высокое значение сходства 16S рДНК штамм имеет с vi nicotianae (99,5 %), А mysorens (99,5 %) и А aniaitensis (99,5 %)

Фенотипические данные, в том числе состав пептидогликана, в котором выявлены лизин, аланин и глугаминовая кислота в молярном соотношении 1 2 1,5, соответствующем А4а типу, характерною для артробактерий группы «А nicotianae», подтверждают результаты филогенетического анализа, сахара клеточной стенки представлены галактозой, глюкозой, рибозой, целлобиозой и маннозой Ввиду не выраженности фенотипических отличий изолята от филогенетически близких видов, на данном этапе штамм определен как Arthrobacter sp. (группа «А nicotianae»)

Штамм Microbacterium sp. SMB33. Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности 16S рДНК штамма SMB33 (1421 п.н ) показал, что он является членом рода Microbacterium Наиболее высокий уровень сходства, составляющий 99,1-99,7%, изолят имеет с представителями орнитинсодержащих видов (М maritypicum, М oxydans, М hquefaciens, М mperdae, М luteolum, М hydrocarbonoxydans, М testaceum, М aerolatum, М keratanolyticum, М paraoxydans, М resistens, М fohorum) и с одним лизинсодержащим — М oleivorans (99,2 %)

Анализ клеточной стенки показал, что в состав пептидогликана входят орнитин, глутаминовая вместе с гидроксиглутаминовой кислоты, глицин и аланин в молярном соотношении 1 1,5 2 2 Сахар клеточной стенки - галактоза

Полученные данные согласуются с результатами сравнения нуклеотидных последовательностей На данном этапе работы штамм идентифицирован как Microbacterium sp

Изучение взаимоотношений бактерий в консорциуме SMB3

Консорциум - это совокупность организмов, функционально связанных друг с другом (Manual of environmental microbiology, 2002) В представленной работе исследованы взаимоотношения бактерий-деструкторов и сопутствующих бактерий в консорциуме SMB3

Влияние интермедиатов деструкции нафталина на состав консорциума микроорганизмов. Изучена способность бактерий консорциума использовать в качестве субстратов промежуточные продукты разложения нафталина Показано, что штаммы-деструкторы нафталина рода Rhodococcus способны утилизировать салицилат, гентизат и ацетат (табл 5), что предполагает разложение нафталина родококками через салицилат по гентизиновому пути (Grund et al, 1992, Di Gennaro et al, 2001, Kulakov et al, 2005) Поскольку бактерии-спутники способны расти на интермедиатах катаболизма нафталина (табл 5), проведено исследование влияния промежуточных метаболитов деструкции нафталина на структуру консорциума SMB3 методом денатурирующего градиентного гель электрофореза и подсчетом колониеобразующих единиц Установлено, что культивирование консорциума на ацетате, салицилате и гентизате приводит к элиминации ряда бактерий, в то время как при инкубировании с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии состав консорциума стабильно сохраняется (рис 5, 6)

Наблюдаемое уменьшение биоразнообразия консорциума при смене источника углерода и энергии (нафталина на промежуточные продукты его метаболизма) можно объяснить сокращением звеньев трофической цепи, что ведет к конкуренции между бактериальными популяциями, трансформирующими одинаковый субстрат Полученные результаты доказывают, что в консорциуме присутствуют сформированные трофические связи, в которых каждый член сообщества занимает определенную экологическую нишу

Рост бактерий мл интсрмедиатах деструкции нафталина

Штамм Субст рат

салицилат (0,5 г/л) салицилат (0,25 г/л) гентюат аистят

НЫотопах Ер ЯМВ31 - - - ++

АПНгоЬааегЦ). 5МВ32 + + - ++

ШсгоЬааеНит 5р. £МВЗЗ - + ++ ++

Па/ачхтр^га регтепзе КМВ34 - - ++

8аИтсо1а ЭМВ35 - - - -и-

К. Иар1нИа1етчогап$ 5МВ37 ++ ++ ++ ++

КИос/ососсих $ р. 5МВ38 ++ ++ ++ -м-

[ 1римечание. «-» - нет рскта, «+» -«++» - активность роста.

Г? | -

1234 5 67 8 9 10

Рис. 5, ДГГЭ фрагментов 168 рДНК штаммов бактерий и консорциума БМВЗ, инкубированною на разных субстратах в минеральной среде Раймонда в присутствии 7 % ГЧ'аС!,

1 - консорциум БМВЗ (нафталин),

2 - консорциум БМВЭ (салицилат),

3 - консорциум 5М ВЗ (ацетат),

4 - штамм 5МВ38, 5 - штамм 5МВ37, 6- штамм ЭМВ35, 7 - штамм 5МВ34, 8 - штамм ЙМВЗЗ, 9 - штамм 8МВ32, 10 - штамм 5МВ31.

КОЕ/МЛ 1.00Е+08 т

1.00Е+07

1.00Е+06

1,00Е+05

1.00Е+04

1 ,ООЕ+О3

салицилат гентизат нафталин ацетат

субстрат

Рис. 6. Количество клеток бактерий консорциума 8МВЗ, выращенного на разных субстратах в минеральной среде Раймонда в присутствии 7 % КаС1 (стационарная фаза роста).

1 - штамм ЗМВ31, 2 - штамм 5МВ32, 3 - нгтамм ЭМВЗЗ, 4-.штамм 5МВ34, 5 - штамм 5МВ35,6 - штамм ЭМВЗ?, 7 - штамм ЭМВЗв.

Рост штамма Шоёососст парЫЪаЫтхогат 8МВ37 в составе консорциума и индивидуальной культуре. Исследуемый консорциум бактерий способен расти на нафталине в присутствии до 9 % №С1 (рис 1) В то же время из консорциума выделен штамм-деструктор нафталина К парЫШЫтмогат БМВ37, для индивидуальной культуры которого верхним пределом для роста в минеральной среде Раймонда на нафталине служит концентрация хлорида натрия 7,5 % (табл 1)

Сравнительный анализ характера роста штамма-деструктора БМВ37 при культивировании в составе консорциума и индивидуальной культуре показал, что наиболее высокое значение колониеобразугощих единиц штамма в индивидуальной культуре зафиксировано в присутствии 3 % НаС1 (108 КОЕ/мл), в отсутствие соли значение КОЕ на один порядок ниже (107 КОЕ/мл) (рис. 7) В обоих вариантах (отсутствие №С1 и 3 % ИаС!) количество клеток выше при культивировании штамма в составе консорциума (108 КОЕ/мл и 109 КОЕ/мл, соответственно) При выращивании штамма-деструктора 8МВ37 в составе консорциума 8МВЗ и индивидуальной культуре в присутствии 7,5% КаС1 наблюдается значительное различие в значениях КОЕ при культивировании штамма 8МВ37 в составе консорциума КОЕ на три порядка выше (108 КОЕ/мл), чем при росте в индивидуальной культуре (105 КОЕ/мл)

Таким образом, экспериментально обосновано, что на эффективность роста штамма-деструктора нафталина Я парЫИа1еппогап^ 8МВ37 в условиях высокой солености среды положительное влияние оказывают другие члены микробного консорциума 8МВЗ

КОЕ/мл 1.00Е+10

Рис 7 Количество клеток Л. парЫкаЫпюогапз 8МВ37 при

100Е+09

■г-

культивировании в минеральной среде Раймонда с нафталином в присутствии разных концентраций КаС1 (стационарная фаза роста).

1 - индивидуальная культура, 2 - в составе микробного консорциума

без соли 3 % ЫаС! 7,5 % №С|

Изучение кинетики роста моделированных смешанных культур на нафталине в условиях высокой солености среды. Для изучения взаимного влияния штаммов в консорциуме SMB3 проведены эксперименты по моделированию смешанных культур с использованием штаммов-деструкторов нафталина A naphthalemvorans SMB37, Rhodococcus sp SMB38 и умеренно галофильного штамма Halomonas sp SMB31 в следующих вариантах R naphthalemvorans SMB37 и Halomonas sp SMB31 {I), Rhodococcus sp SMB38 и Halomonas sp SMB3J {II), R naphthalemvorans SMB37, Rhodococcus sp SMB38 и Halomonas sp SMB31 (III)

Контроль качественного состава смешанных культур бактерий проводили методом денатурирующего градиентного гель электрофореза (рис 8) На элекхрофореграмме ДГТЭ 16S рДНК амгагаконов видно, что в смешанных культурах вариантовI, IIa Шприсутствует фрагмент 16S рДНК, соответствующий таковому чистой культуры Halomonas sp SMB31 В вариантах I и II присутствуют полосы, четко отличающиеся по положению в геле друг от друга и совпадающие с полосами фрагментов 16S рДНК штаммов R naphthalemvorans SMB37 и Rhodococcus sp SMB38 В треке варианта III выявлена полоса, соответствующая слабо разделенным фрагментам 16S рДНК штаммов R. naphthalemvorans SMB37 и Rhodococcus sp. SMB38.

Результаты ДГГЭ подтверждают экспериментальные данные, полученные на основе макроморфологических свойств бактерий (подсчет КОЕ) Показано, что умеренно галофильная бактерия Halomonas sp SMB31 сохраняется в составе смешанных культур при культивировании на нафталине и, более того, способна к эффективному росту (рис 9А, Б) Совместное культивирование штаммов-деструкторов с умеренно галофильной культурой Halomonas sp SMB31 значительно сокращает lag-период, увеличивает удельную скорость роста штамма Rhodococcus sp SMB38 и количество клеток штамма R naphthalemvorans SMB37 (рис. 9В) Полученные данные показывают наличие взаимовыгодных отношений между бактериями-деструкторами и бактериями-спутниками в исследуемом консорциуме при выращивании в условиях высокой солености среды Можно предположить, что подобное взаимодействие связано с обменом низкомолекулярными органическими веществами (осмопротекторами) между

íl

1 2 3 4 5 6

Рис, 8. ДГГЭ фрагментов 168 рДНК индивидуальных к сметанных Культур бактерий.

[ - смешанная культура варианта ///, 2 - смешанная культура варианта //, 3 - смешанная культура варианта /, 4 - штамм 5МВ38, 5 - штамм 5МВ37, 6 - штамм БМВЗ!.

-*— SMB37

SMB31

SMB37

5МВЭ7

SMB3Í

SMB31

5МВ37

SMB3É

SMB33

—л— SMB31

SWB38

500 Часы

Рис. 9, Рост моделированных смешанных культур и индивидуальных культур штаммов-деструкторов в минеральной среде Раймонда на нафталине в присутствии 7 % Nad

Незаштриховзнные маркеры - индивидуальные культуры штаммов-деструкторов, заштрихованные маркеры - штаммы в смешанных культурах.

бактериями. Известно, что эу б актер и и в гиперосмотических условиях синтезируют de novo или поглощают из среды культивирования осмопротекторпые соединения, что позволяет им выживать в подобных условиях (Ventosa eí al., 1998;

Roberts, 2005) На следующем этапе работы исследована способность бактерий консорциума к синтезу осмолитов

Анализ осмопротекторных соединений. Исследуемые умеренно галофильные штаммы Halomonas sp SMB31 и Sahnicola socius SMB35 в условиях высокой осмолярности среды внутриклеточно накапливают эктоин и глутамат Следует отметить, что представители разных родов одного семейства существенно различаются качественным составом осмопротекторных соединений при росте в присутствии 10% NaCl данная концентрация хлорида натрия приводит к накоплению в клетках штамма SMB35 гидроксиэктоина (табл 6) Полученные нами результаты о качественном составе осмопротекторов представителей семейства Halomonadaceae согласуются с литературными данными (Ono et al, 1999, Calderón et al, 2004, Vargas et al., 2006)

Изучение осмолитов штаммов R naphthalenworans SMB37 и Rhodococcus sp SMB38 выявило накопление в клетках эктоина, гидроксиэктоина и глутамата (табл 6) Ранее для R eryikropolis обнаружено накопление глутамата, аспартата и трегалозы при гиперосмотическом стрессе (Комарова и др, 2002) Установленный нами комплекс осмопротекторных соединений родококков описан впервые В отличие от умеренно галофильного штамма Salinicola socius SMB35 у галотолерантных изолятов SMB37 и SMB38 гидроксиэктоин обнаружен в клетках,

Таблица 6

Содержание осмопротекторных соединений у бактерий консорциума SMB3

Штамм Концентрация NaCl, %* Содержание осмопротекторов, % от сухого веса биомассы

Эктоин Глутамат Гидроксиэктоин

Halomonas sp SMB31 5 7,9 1,4 -

Halomonas sp SMB31 10 9,2 1,1 -

Salinicola socius SMB35 5 16,0 2,5 -

Salinicola socius SMB35 10 9,5 1,6 1,1

R naphthalemvorans SMB37 5 0,6 0,4 0,7

R naphthalenivorans SMB37 8 0,3 - 0,3

Rhodococcus sp SMB38 5 0,6 1,4 1,4

Rhodococcus sp SMB38 8 1,2 0,6 2,0

Примечание * - % (вес/объем) в среде культивирования,«-» - вещество не обнаружено выращенных при более низких концентрациях хлорида натрия (5 %) Следует отметить, что с возрастанием концентраций хлорида натрия в среде

культивирования в клетках штамма SMB37 снижается содержание осмолитов (табл. 6), этот факт может объяснить отсутствие роста индивидуальной культуры штамма на нафталине при высоких концентрациях хлорида натрия (8-9%), в сравнении со штаммом SMB38 (табл 1)

Результаты проведенных исследований бактериального консорциума SMB3 свидетельствуют о наличии трофических связей, поскольку, во-первых, в его состав входят как бактерии-деструкторы нафталина, так и не утилизирующие это соединение бактерии-спутники, во-вторых, использование в качестве субстратов интермедиа«® разложения нафталина приводит к изменению структуры консорциума, в то время как при культивировании на нафталине состав стабильно сохраняется. Кроме того, нами выявлены и экспериментально обоснованы взаимовыгодные отношения между бактериями-деструкторами нафталина и умеренно галофильной бактерией, которые, как предполагается, основаны на обмене осмопротекторными соединениями

ВЫВОДЫ

1 Из почвы района солеразработок выделено сообщество бактерий, использующее нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии в присутствии до 9 % NaCl Установлено, что данное сообщество состоит из двух галотолерантных штаммов-деструкторов нафталина рода Rhodococcus, а также галотолерантных бактерий родов Arthrobacter, Microbacterium и Thálassospu а и умеренно галофильных бактерий семейства Halomonadaceae, не способных к деструкции нафталина (бактерии-спутники)

2 На основании филогенетической обособленности и отличий ог представителей известных родов семейства Halomonadaceae по фенотипическим признакам описан новый род и вид Salimcola socius sp nov, gen nov

3 В соответствии с данными анализа 16S рДНК и ряду морфологических, физиолого-биохимических признаков предложен новый вид Rhodococcus naphthalemvorans sp nov. Установлено, что штамм R naphthalemvorans SMB37 растет на нафталине в присутствии до 7,5 % хлорида натрия

4. Предложен новый вид Thalassospira permense sp nov, представитель которого формирует стабильный филогенетический кластер вмесге с Thalassospira lucentensis в семействе Rhodospinllaceae, но принципиально отличается от

последнего составом жирных кислот, способностью восстанавливать нитраты, концентрациями хлорида натрия, при которых возможен рост

5 В исследуемом консорциуме сформированы протокооперативные взаимоотношения между бактериями.

6 Установлено, что рост штаммов ЗактсоЫ воаш 8МВ35, На1отопаз ер. 8МВ31, Югод-ососсия na.phthalemvora.ns 8МВ37, Ююйососсия эр. 5МВ38 при высокой осмолярности среды сопровождается накоплением в клетках органических осмопротекгоров - глутамата, эктоина и гидроксиэктоина

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Ананьина Л Н, Алтынцева О.В. Почвенные микробные сообщества, способные утилизировать нафталин при высоких концентрациях хлорида натрия//Матер II Регион конф молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии». — Пермь, 2002 —С 32

2 Ананьина Л Я, Алтынцева О В, Плотникова Е Г Почвенные галотолерантные бактерии-деструкторы нафталина//Матер 6-ой Междунар Пущинской школы-конф молодых ученых «Биология - наука XXI века» -Пущине, 2002 - С 4

3 Ананьина Л Н, Алтынцева О В., Плотникова Е Г Сообщество микроорганизмов, выделенное из почвы, загрязненной отходами производства "Уралкалий'У/Матер 2-ой Междунар конф студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология и научно-технический прогресс». — Пермь, 2003 — С 287-290

4 Ананьина Л Н, Алтынцева О.В , Плотникова Е Г Галотолерантный штамм-деструктор нафталина Юю^соссив ер БЗ-8//Матер 2-ой Регион конф молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» - Саратов, 2004. - С 35-36

5 Плотникова Е Г, Ананьина Л.Н, Алтынцева О В Природные микробные ассоциации - как основа для биоремедиации загрязненных почвЛМатер. Междунар. конф «Проблемы и перспективы реабилитации техногенных экосистем» - Астрахань, 2004. - С. 43-46

6 Рыбкина Д О., Ананьина Л Н, Зубрицкий А В , Плотникова Е Г Экстр ахромосомальная ДНК у бактерий-деструкторов ароматических соединешш//Матер 5-ой Междунар многопрофильной конф молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной науки» - Самара, 2004 - С 31-34

7 Ананьина Л Н, Алтынцева О В., Плотникова Е.Г Изучение сообщества микроорганизмов, выделенного из района солеразработок//Вестник

Пермского государственного университета Серия Биология - 2005 - Выл 6 — С 109-114.

8 Ананьина ЛН., Алтынцева О.В, Плотникова ЕГ Моделирование микробных сообществ, осуществляющих деструкцию нафталина в присутствии высоких концентраций хлорида натрия//Матер Междутар конф «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». - Саратов, 2005 -С 7

9 Ананьина Л.Н., Гавриш ЕЮ Галофильные бактерии микробного сообщества, выделенного из почв района солеразработок//Матер 9-й Пущинской школы-конф молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино, 2005 -С. 180

10 Ананьина ЛН., Гавриш ЕЮ, Евтушенко ЛИ, Плотникова ЕГ. Новый экстремальный галотолераятный грамотрицательный микроорганизм/УМатер П Междунар конф. «Мшфобное разнообразие, состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» - Пермь-Казань-Пермь, 2005 -С.9.

11. Ананьина ЛН, Гавриш Е.Ю., Плотникова ЕГ Грамотрицательные галофильные бактерии, выделенные из района солеразработок//Матер. Всерос молодежной школы-конф «Актуальные аспекты современной микробиологии» -Москва,2005 -С 5

12 Ананьина ЛН, Алтынцева О В. Осмопрогекгоры галофилышх бактерий семейства HalomonadaceaellMsetep 10-й Пущинской школы-конф молодых ученых «Биология - наукаXXI века» -Пущино, 2006 -С 179

13 Ананьина ЛН, Плотникова Б Г Изучение сообщества микроорганизмов, способного расти на нафталине в присутствии высоких концентраций NaCI, методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза//Матер Междунар школа-конф. «Генетика микроорганизмов и биотехнология». - Москва-Пущино, 2006 - С. 98

14 Плотникова Е Г, Рыбкина Д О, Ананьина Л Н, Ястребова О В , Демаков В А. Характеристика микроорганизмов, выделенных из техногенных почв Прикамья//Экология -2006.-№4 -С. 1-9

15 Ананьина ЛН, Плотникова ЕГ., Гавриш ЕЮ, Демаков В А, Евтушенко Л.И Salinicola socius gen nov, sp. nov. - новая умеренно галофильная бактерия из ассоциации микроорганизмов, утилизирующей нафталин//Микробиология -2007.-Т.76,№3 -С. 369-376

16 Ананьина Л Н, Ястребова О В , Плотникова Е Г. Галофильные бактерии сем Halomonadaceael!Мхщ> Междунар конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» — Москва, 2007 - С. 39

Ананьина Людмила Николаевна

НАФТАЛИН МЕТАШЛИЗИРУЮЩИЙ КОНСОРЦИУМ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫЙ ИЗ ЗАСОЛЕННОЙ ПОЧВЫ

АВТОРЕФЕРАТ

Лицензия ЦДХ« 11-0002

Подписано в печать 25.09.2007. Формат 60x90/16.

Набор компьютерный Усл. печ. л 1 _Тираж 100 экз Заказ № 810-к/2007

Отпечатано в типографии «Пресстайм» Адрес 614025, г Пермь, ул Героев Хасана, 105

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ананьина, Людмила Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ. t

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бактериальные системы деструкции нафталина.

1.1.1. Бактерии-деструкторы нафталина.

1.1.2. Метаболические пути деструкции нафталина.

1.1.3. Генетические системы деградации нафталина.

1.2. Механизмы галоадаптации галотолерантных и галофильных бактерий.

1.2.1. Биоразнообразие галотолерантных и галофильных бактерий.

1.2.2. Осмопротекторные соединения, синтезируемые бактериями.

1.3. Микробная деструкция токсичных органических соединений в условиях высокой минерализации среды.

1.3.1. Влияние высоких концентраций солей на микробное разложение токсичных органических соединений.

1.3.2. Галотолерантные и галофильные бактерии-деструкторы ксенобиотиков.

1.3.3. Сообщества микроорганизмов, осуществляющие разложение алифатических и ароматических углеводородов в условиях высокой минерализации среды.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Бактериальные штаммы. t 2.2. Среды и условия культивирования.

2.3. Метод накопительных культур.

2.4. Определение ростовых характеристик.

2.5. Определение таксономического положения бактерий.

2.6. Денатурирующий градиентный гель электрофорез.

2.7. Выделение и анализ осмопротекторов.

2.8. Амплификация, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ect- и паг-генов.

2.9. Статистическая обработка.

Глава 3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ ИЗ КОНСОРЦИУМА SMB3.

3.1. Таксономическая характеристика умеренно галофильных бактерий семейства Halomonadaceae.

3.1.1. Фенотипические признаки штаммов SMB31 и SMB35.

3.1.2. Генотипическая характеристика умеренно галофильных бактерий.

3.\3.Salinicolasocius - новый род и вид в семействе Halomonadaceae.

3.1.4. Определение таксономического положения штамма SMB31.

3.2. Таксономическая характеристика галотолерантной бактерии семейства Rhodospirillaceae.

3.3. Таксономическая характеристика галотолерантных актинобактерий.

3.3.1. Определение таксономического положения актинобактерий рода Rhodococcus - деструкторов нафталина.

3.3.2. Семейство Micrococcaceae. Штамм SMB32 -представитель группы "Arthrobacter nicotianae".

3.3.3. Семейство Microbacteriaceae. Штамм

Microbacterium sp. SMB33.

Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ БАКТЕРИЙ В КОНСОРЦИУМЕ SMB3.

4.1. Изучение роста консорциума бактерий SMB3 в присутствии различных концентраций хлорида натрия.

4.2. Исследование способности бактерий консорциума SMB3 > использовать в качестве ростовых субстратов различные органические соединения.

4.2.1. Деградативный потенциал штаммов-деструкторов

R. naphthalenivorans SMB37 и Rhodococcus sp. SMB38.

4.2.2. Выявление шг-генов у штаммов-деструкторов нафталина R. naphthalenivorans SMB37 и

Rhodococcus sp. SMB38.

4.2.3. Ростовые субстраты бактерий консорциума SMB3.

4.2.4. Влияние интермедиатов деструкции нафталина на состав консорциума бактерий SMB3.

4.3. Изучение взаимного влияния бактерий консорциума SMB3.

4.3.1. Рост штамма R. naphthalenivorans SMB37 в составе консорциума SMB3 и индивидуальной культуре при разных концентрациях хлорида натрия.

4.3.2. Изучение кинетики роста моделированных смешанных культур бактерий на нафталине в условиях высокой солености среды.

Глава 5. АНАЛИЗ ОСМОПРОТЕКТОРНЫХ СОЕДИНЕНИИ.

5.1. Осмопротекторы умеренно галофильных штаммов

Halomonas sp. SMB31 и Salinicola socius SMB35.

5.2. Осмопротекторы галотолерантных штаммов-деструкторов R. naphthalenivorans SMB37 и

Rhodococcus sp. SMB38.

5.3. Детекция ес/-генов у бактерий семейства

Halomonadaceae.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нафталинметаболизирующий консорциум микроорганизмов, выделенный из засоленной почвы"

Актуальность проблемы. Широкое применение в промышленности, присутствие в побочных продуктах коксо-, газо- и нефтеперерабатывающих производств, образование при сгорании различных органических материалов (каменного угля, нефти, газа, древесины, мусора и др.) привело к повсеместному распространению полициклических ароматических углеводородов в окружающей среде. Физико-химические свойства соединений этого класса (гидрофобность, высокая сорбционная способность и стабильность) способствуют их аккумуляции в природных экосистемах. Кроме того, полициклические ароматические углеводороды обладают токсичным, мутагенным, тератогенным и канцерогенным действиями на живые организмы. Все вышеперечисленное послужило причиной выделения соединений этого класса в категорию приоритетных поллютантов (Mumtaz, 1995). Основную роль в разложении соединений данного класса в природе играет микробная деструкция (Sutherland et al, 1995). В настоящее время накоплен большой объем информации о способности бактерий использовать ряд полициклических ароматических углеводородов в качестве единственного источника углерода и энергии (Kanaly, Harayama, 2000; Habe, Omori, 2003). Наиболее изученными являются бактериальные генетические и биохимические системы катаболизма нафталина, который используется в качестве модельного соединения для изучения систем деструкции полициклических ароматических углеводородов (Воронин и др., 1989; Yen, Serdar, 1988; Bosch et al, 1999; Laurie, Lloyd-Jones, 1999; Jones etal., 2003; Parales, 2003; Kulakov et al, 2000,2005).

В ряде случаев загрязнение экосистем полициклическими ароматическими углеводородами сопровождается засолением, которое может иметь природное или антропогенное происхождение, сформированное в результате разработки нефтяных месторождений и работы соледобывающих предприятий. В этих условиях ведущими факторами формирования микробиоценозов становятся соленость среды и поллютант. Микроорганизмы и их сообщества, способные к деструкции полициклических ароматических углеводородов при высокой солености среды, описаны в единичных сообщениях (Звягинцева и др., 2001; Плотникова и др., 2001; Mille et al., 1991; Dyaz et al, 2000; Hedlud et al, 2001; Kasai et al, 2002; Abed et al, 2006). Остаются малоизученными взаимодействия внутри таких сообществ, а также I механизмы регуляции их состава, метаболической активности и устойчивости к высокому содержанию солей. Проведение исследований в этой области внесет существенный вклад в разработки новых стратегий биоремедиации экстремальных экосистем.

Цель работы - исследование нафталинметаболизирующего консорциума микроорганизмов, выделенного из засоленной почвы.

Задачи исследования

1. Выделить стабильное/устойчивое сообщество микроорганизмов, способное использовать нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии в присутствии высоких концентраций хлорида натрия.

2. Определить таксономическое положение бактерий сообщества на основе принципов полифазной таксономии.

3. Изучить взаимоотношения бактерий в консорциуме при росте на нафталине в условиях высокой солености.

4. Исследовать осмопротекторные соединения грамположительных галотолерантных и грамотрицательных умеренно галофильных бактерий, изолированных из консорциума.

Научная новизна. Определен состав консорциума бактерий, осуществляющего разложение нафталина в условиях высокой солености среды (до 9 % хлорида натрия). Установлено, что в консорциум входят галотолерантные бактерии-деструкторы нафталина и галотолерантные, умеренно галофильные бактерии, не способные осуществлять разложение данного полициклического ароматического углеводорода. Показано, что катаболизм нафталина в консорциуме осуществляют актинобактерии рода Rhodococcus. На основании филогенетической обособленности и фенотипических отличий описаны новый род и вид Salinicola socius sp. nov., gen. nov., новые виды Rhodococcus naphthalenivorans sp. nov. и Thalassospira permense sp. nov. Показано, что представители родов Salinicola и Rhodococcus при высокой осмолярности среды накапливают глутамат, эктоин и гидроксиэктоин, выступающие в роли внутриклеточных осмопротекторов. Для представителей рода Rhodococcus подобная комбинация осмопротекторов описывается впервые. Экспериментально обосновано присутствие протокооперативных взаимоотношений в консорциуме между бактериями-деструкторами нафталина и бактериями-спутниками.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные уточняют классификацию семейства Halomonadaceae и расширяют знания о разнообразии бактерий сообщества техногенных засоленных почв (г. Березники, Пермский край). Результаты исследований могут служить основой для разработки методов мониторинга биоразнообразия данного микробиоценоза. Результаты, касающиеся механизмов функционирования консорциума микроорганизмов, разлагающего полициклические ароматические углеводороды при высокой солености среды, могут быть использованы для усовершенствования методов биоремедиации экстремальных экосистем. Создана рабочая коллекция галотолерантных/галофильных бактерий, перспективных для использования в биотехнологии. Материалы диссертации используются в лекционных курсах на кафедрах микробиологии и иммунологии, ботаники и генетики растений Пермского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту

2. На основании фенотипических характеристик и филогенетического анализа описаны новые таксоны Salinicola socius sp. nov., gen. nov., Rhodococcus naphthalenivorans sp. nov. и Thalassospira permense sp. nov.

3. В выделенном из засоленной почвы нафталинметаболизирующем консорциуме бактерий формируются взаимовыгодные отношения между галотолерантными бактериями-деструкторами нафталина и умеренно галофильными бактериями-спутниками. ► 4. Умеренно галофильные бактерии-спутники и галотолерантные бактерии-деструкторы нафталина в условиях высокой солености среды накапливают низкомолекулярные органические соединения (осмопротекторы).

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции "Проблемы и перспективы реабилитации техногенных экосистем", Астрахань, 2004; II Международной конференции "Микробное биоразнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал", Пермь-Казань-Пермь, 2005; 9-й-10-й Пущинских школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 2005, 2006; Всероссийской молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии", Москва, ' 2005; Всероссийской молодежной школе-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология", Москва-Пущино, 2006; IV Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 2007.

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 29 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 229 литературных источника, из них 28 на русском языке и 201 зарубежный, и приложений.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ананьина, Людмила Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Из почвы района солеразработок выделено сообщество бактерий, использующее нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии в присутствии до 9% NaCl. Установлено, что данное сообщество состоит из двух галотолерантных штаммов-деструкторов нафталина рода Rhodococcus, а также галотолерантных бактерий родов Arthrobacter, Microbacterium и Thalassospira и умеренно галофильных бактерий семейства Halomonadaceae, не способных к деструкции нафталина (бактерии-спутники).

2. На основании филогенетической обособленности и отличий от представителей известных родов семейства Halomonadaceae по фенотипическим признакам описан новый род и вид Salinicola socius sp. nov., gen. nov.

3. В соответствии с данными анализа 16S рДНК и по ряду морфологических, физиолого-биохимических признаков предложен новый вид Rhodococcus naphthalenivorans sp. nov. Установлено, что штамм R. naphthalenivorans SMB37 растет на нафталине в присутствии до 7.5% хлорида натрия.

4. Предложен новый вид Thalassospira permense sp. nov., представитель которого формирует стабильный филогенетический кластер вместе с Thalassospira lucentensis в семействе Rhodospirillaceae, но принципиально отличается от последнего составом жирных кислот, способностью восстанавливать нитраты, концентрациями хлорида натрия, при которых возможен рост.

5. В исследуемом консорциуме сформированы протокооперативные взаимоотношения между бактериями.

6. Установлено, что рост штаммов Salinicola socius SMB35, Halomonas sp. SMB31, Rhodococcus naphthalenivorans SMB37, Rhodococcus sp. SMB38 при высокой осмолярности среды сопровождается накоплением в клетках органических осмопротекторов - глутамата, эктоина и гидроксиэктоина.

129

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время информация о деструкции токсичных ксенобиотиков, в том числе полициклических ароматических углеводородов, при высокой солености среды в значительной степени ограничена. В большинстве публикаций рассматриваются свойства отдельных штаммов-деструкторов ПАУ, однако в природе бактерии являются членами сообществ, поэтому представляет интерес исследования биоразнообразия и взаимоотношений бактерий в биоценозах, сформированных под воздействием перечисленных выше факторов. Охарактеризованные сообщества микроорганизмов, разлагающие поллютанты в условиях высокой солености среды, выделены из морей, лиманов, литоральных зон, морских осадков и пластовых вод нефтедобычи. Видовой состав данных микробных сообществ разнообразен и нестабилен, поскольку зависит от факторов окружающей среды. Показано, что внесение углеводородов в экосистему приводит к увеличению отношения численности углеводородокисляющих бактерий к общему числу аэробных гетеротрофных бактерий (Hood et al., 1975; Daane et al., 2001). В морских экосистемах доминируют бактерии класса Gammaproteobacteria родов Alcanivorax, Cycloclasticus, Marinobacter, Marinobacterium/Neptunomonas, Thalassolituus, Vibrio, Pseudoalteromonas, Marinomonas и Halomonas (Melcher et al., 2002; Yakimov et al., 2005), присутствуют представители классов Alphaproteobacteria, Bacilli и Actinobacteria (Zhuang et al., 2003; Hernandez-Raquet et al., 2006). Исследование бактериальных сообществ, выделенных из почв или пластовых вод с высоким уровнем минерализации районов нефтедобычи, выявило отличие в доминирующих родах от морских экосистем. Доминирующим по количеству родов является класс Actinobacteria, выделяются также представители классов Gammaproteobacteria и Bacilli (Милехина и др., 1991, 1998; Назина и др., 2002; Kleinsteuber et al, 2006).

Исследован консорциум бактерий, растущий на нафталине в присутствии до 9% NaCl, выделенный из засоленной почвы. В состав консорциума входят семь штаммов бактерий классов Gammaproteobacteria (семейство Halomonadaceae), Alphaproteobacteria (семейство Rhodospirillaceae) и Actinobacteria (рода Arthrobacter, Microbacterium и Rhodococcus), при этом доминирующим по количеству представленных родов является класс Actinobacteria. Для ряда штаммов проведено более точное определение таксономического положения. Вследствие чего были предложены новые таксоны видового и родового рангов: Rhodococcus naphthalenivorans SMB37 sp. nov., Thalassospira permense SMB34 sp. nov., Salinicola socius SMB35 gen. nov., sp. nov. Полученные данные согласуются с результатами исследований другого сообщества микроорганизмов SMB1, также выделенного из почв района соледобычи (г. Березники, Пермский край), в состав которого входили галотолерантные бактерии-деструкторы класса Actinobacteria (родов Arthrobacter и Brevibacterium (Brevibacterium permense sp. nov.)) и умеренно галофильный микроорганизм класса Gammaproteobacteria (семейство Halomonadaceae) (Алтынцевой, 2001).

Представляет интерес тот факт, что в результате применения метода накопительных культур, обеспечивающего преимущественное развитие галотолерантных или галофильных бактерий-деструкторов, выделен консорциум бактерий, в состав которого входят как галотолерантные штаммы-деструкторы нафталина Rhodococcus naphthalenivorans SMB37 и Rhodococcus sp. SMB38, так и не утилизирующие данное соединение галотолерантные микроорганизмы Arthrobacter sp. SMB32, Microbacterium sp. SMB33, Thalassospira permense SMB34, а также умеренно галофильные бактерии Halomonas sp. SMB31 и Salinicola socius SMB35, использующие промежуточные продукты окисления нафталина - бактерии-спутники. Современные исследования взаимодействий между членами микробных сообществ, осуществляющих деструкцию токсичных ксенобиотиков, чаще обращены на трофические связи между ними (Милехина и др., 1991, 1998; Коронелли и др., 2000). В частности, S. Tagger с коллегами (1990) исследовали сообщество микроорганизмов, состоящее из девяти штаммов, из которых только два были способны расти на нафталине, а семь штаммов сохранялись в составе ассоциации за счет окисления метаболитов разложения нафталина штаммами-деструкторами (формиата, ацетата, пирувата, пропионата и сукцината). Практически отсутствуют данные по изучению обратных связей между бактериями-спутниками и бактериями-деструкторами, которые обусловлены физиологической заинтересованностью бактерий-спутников в стимулировании жизнедеятельности бактерий-деструкторов. Ранее, при изучении сообщества SMB1 (Алтынцева, 2001), было обнаружено, что бактерии-деструкторы в индивидуальной культуре способны к росту на нафталине в присутствии меньших концентраций хлорида натрия, чем в составе сообщества. В результате проведенных нами экспериментов установлено, что в исследуемом консорциуме SMB3 помимо трофической зависимости бактерий-спутников от бактерий-деструкторов присутствует обратная связь. Данное утверждение подтверждают результаты сравнительного анализа роста штамма R. naphthalenivorans SMB37 на нафталине в условиях высокой солености среды при культивировании в составе консорциума и индивидуальной культуре: на эффективность роста штамма-деструктора SMB37 положительное влияние оказывают другие члены микробного сообщества. Кроме того, эксперименты по моделированию смешанных культур бактерий показали, что при росте на нафталине при высокой солености среды галофильная бактерия Halomonas sp. SMB31 стимулирует рост бактерий-деструкторов. Проанализировав полученные результаты, было высказано предположение, что веществами, стимулирующими рост бактерий-деструкторов, могут быть низкомолекулярные соединения (осмопротекторы). Широко известно, что одним из механизмов адаптации бактерий к высоким концентрациям солей является накопление в клетках ряда совместимых веществ (Комарова и др., 2002; Опо et al., 1999; Alvarez et al., 2004; Calderon et al., 2004; Vargas et al., 2006). В результате исследований способности умеренно галофильных бактерий и галотолерантных бактерий-деструкторов консорциума к синтезу осмопротекторов выявлено, что преобладающим осмопротектором у галофильных бактерий является эктоин, а у родококков - накапливающиеся примерно в одинаковом соотношении эктоин, гидроксиэктоин и глутамат. Для представителей рода Rhodococcus подобная комбинация осмопротекторов описывается впервые.

Проведенных исследований раскрывают протокооперативную основу отношений между бактериями в изучаемом бактериальном сообществе, что позволяет рассматривать его в качестве консорциума - совокупности организмов, имеющих функциональную связь друг с другом (Manual of environmental microbiology, 2002). В случае исследуемого консорциума бактерии-деструкторы в процессе разложения нафталина в условиях высокой солености среды выделяют в культуральную среду метаболиты, которые используются в качестве субстратов сопутствующими бактериальными штаммами. В свою очередь, галофильные и галотолерантные бактерии-спутники при выращивании в условиях высокой солености могут выделять в среду культивирования стимулирующие рост бактерий-деструкторов соединения, в частности, осмопротекторы. Все члены консорциума получают выгоду от совместного сосуществования. Дальнейшие исследования функционирования консорциума микроорганизмов, разлагающего нафталин при высокой солености среды, будут способствовать пониманию детальных основ механизмов взаимодействия бактерий в сообществах и разработке методов биоремедиации экстремальных экосистем.

128

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ананьина, Людмила Николаевна, Пермь

1. Алтынцева О.В. Галотолерантные бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов: Диссертация на соискания ученой степени к.б.н. / О.В. Алтынцева. - Пермь, 2001. - 139 с.

2. Бердичевская М.В. Особенности физиологии родококков разрабатываемых нефтяных залежей / М.В. Бердичевская // Микробиология. -1989.-Т. 58, Вып. 1.-С. 60-65.

3. Воронин A.M. Клонирование генов Pseudomonas putida, ответственных за первые этапы окисления нафталина в клетки Escherichia coli / A.M. Воронин, Т.В. Цой, И.А. Кошелева // Генетика. 1989. -Т. 25, Вып. 2. - С. 226-237.

4. Гавриш Е.Ю. Три новых вида бревибактерий Brevibacterium antiquum sp. nov., Brevibacterium aurantiacum sp. nov. и Brevibacterium permense sp. nov. / Е.Ю. Гавриш, В.И. Краузова, H.B. Потехина и др. // Микробиология. - 2004. - Т. 73, № 2. - С. 218-225.

5. Жилина О.А. Взаимодействие в модельных сообществах нефтеокисляющих микроорганизмов и их спутников, неспособных к окислению углеводородов / О.А. Жилина, О.В. Гейдебрехт, В.К. Плакунов // Тез. Всерос. молодежной школы-конф. Москва, 2005. - С. 24.

6. Звягинцева И.С. Влияние солености среды на деструкцию нефтяных масел нокардиоподобными бактериями / И.С. Звягинцева, М.Н. Поглазова, М.Т. Готоева и др. // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 6. - С. 759-764.

7. Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях / Д. Кашнер. -М.: Мир, 1981.-365 с.

8. Комарова Т.И. Роль низкомолекулярных азотистых соединений в осмотолерантности бактерий родов Rhodococcus и Arthrobacter / Т.И. Комарова, Т.В. Коронелли, Е.А. Тимохина // Микробиология. 2002. - Т. 71, №2. - С. 166170.

9. Ю.Коронелли Т.В. Внеклеточные метаболиты углеводородокисляющих бактерий как субстраты для сульфатвосстанавливающих / Т.В. Коронелли, Т.И. Комарова, О.В. Поршнева и др. // Прикл. биохимия и микробиология. -2001.-Т.31,№5.-С. 469-472.

10. П.Кузнецов В.Д. Streptomyces albiaxalis sp. nov.; новый деградирующий углеводороды нефти вид термо- и галотолерантных Streptomyces /

11. B.Д. Кузнецов, Т.А. Зайцева, JI.B. Вакуленко и др. // Микробиология. 1992. -Т. 61.-С. 62-67.

12. Кулакова А.Н. Мутанты плазмид биодеградации нафталина, детерминирующие окисление катехола по мета-пути / А.Н. Кулакова, A.M. Воронин // Микробиология. 1989. - Т. 25, Вып. 2. - С. 298-304.

13. Куличевская И.С. Окисление углеводородов нефти экстремально галофильными архебактериями / И.С. Куличевская, Е.И. Милехина, И.А. Борзенков и др. // Микробиология. 1991. - Т. 60, Вып. 5. - С. 860-866.

14. Н.Матвеева Н.И. Осморегуляция в клетках углеводородокисляющих бактерий из нефтяных месторождений Татарии / Н.И. Матвеева, Ю.А. Николаев, Н.А. Воронина и др. // Микробиология. 1993. - Т. 62, № 5.1. C. 835-842.

15. Методы общей бактериологии / Пер. с англ.; под ред. Ф. Герхардт и др. М.: Мир, 1983. - Том 1, 2, 3.

16. Милехина Е.И. Углеводородокисляющая микрофлора заводняемых нефтяных месторождений Татарии с различной минерализацией пластовых вод / Е.И. Милехина, И.А. Борзенков, Ю.М. Миллер и др. // Микробиология. 1991. -Т. 60, Вып. 4. - С. 747-755.

17. Милехина Е.И. Эколого-физиологические особенности аэробных эубактерий нефтяных месторождений Татарстана / Е.И. Милехина,

18. И.А. Борзенков, И.С. Звягинцева и др. // Микробиология. 1998. - Т. 67. -С. 208-214.

19. Назина Т.Н. Филогенетическое разнообразие аэробных сапротрофных бактерий из нефтяного месторождения Дацина / Т.Н. Назина, А.А. Григорьян, С.Ян-Фен и др. //Микробиология. -2002. -Т. 71, № 1.-С. 103-110.

20. Нестеренко О.А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / О.А. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. Киев: Наук. Думка, 1985. -336 с.

21. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, JI.M. Захарчук и др. М.: Академия, 2005. - 608 с.

22. Плакунов В.К. Взаимосвязь кинетики роста и дыхания у родококков в присутствии высоких концентраций солей / В.К. Плакунов, В.Г. Арзуманян, Н.А. Воронина и др. // Микробиология. 1999. - Т. 68, № 1. - С. 40-44.

23. Плотникова Е.Г. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок / Е.Г. Плотникова, О.В. Алтынцева, И.А. Кошелева и др. // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 1. - С. 61-69.

24. Плотникова Е.Г. Характеристика микроорганизмов, выделенных из техногенных почв Прикамья / Е.Г. Плотникова, Д.О. Рыбкина, JI.H. Ананьина и др. // Экология. 2006. - № 4. - С. 1-9.

25. Розанова Е.П. Углеводородокисляющие бактерии и их активность в нефтяных пластах / Е.П. Розанова, Т.Н. Назина // Микробиология, 1982. -Т. 51.-С. 324-348.

26. Скрябин Г.Н. Окисление нафталина штаммом Pseudomonas putida, несущим мутантную плазмиду / Г.Н. Скрябин, И.И. Старовойтов, А.Н. Борисоглебская и др. // Микробиология. 1978. - Т. 47. - С. 273-277.

27. Смирнов В.В. Бактерии рода Pseudomonas / В.В. Смирнов, Е.А. Киприанова. Киев: Наук, думка, 1990. -234 с.

28. Хмеленина В.Н. Синтез осмопротекторов галофильными и алкалофильными метанотрофами / В.Н. Хмеленина, В.Г. Сахаровский, А.С. Решетников и др. // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 4. - С. 465-470.

29. Цой Т.В. Клонирование и экспрессия гена Pseudomonas putida, контролирующего катехол-2,3-оксигеназную активность в клетках Escherichia coli/Т.В. Цой, И.А. Кошелева, B.C. Замараев и др. //Генетика. 1988. - Т. 24, №9.-С. 1550-1561.

30. Abbott B.J. The extracellular accumulation of metabolic products by hydrocarbon-degrading microorganisms / B.J. Abbott, W.E. Gledhill // Adv. Appl. Microbiol. 1971. -V. 14. - P. 249-388.

31. Abed R.M.M. Bacterial diversity of a cyanobacterial mat degrading petroleum compounds at elevated salinities and temperatures / R.M. M. Abed, A. Al-Thukair, D. de Beer//FEMS Microbiol. Ecol. -2006. V. 57. - P. 290-301.

32. Aislabie J. Aromatic hydrocarbon-degrading bacteria from soil near Scott base, Antarctica / J. Aislabie, J. Foght, D. Saul // Polar. Biol. 2000. - V. 23. -P. 183-188.

33. Alva V.A. Phenol and catechol biodegradation by the haloalkaliphile Halomonas campisalis: influence of pH and salinity / V.A. Alva, B.M. Peyton // Environ. Sci. Technol. 2003. - V. 37. - P. 4397-4402.

34. Alvarez H.M. Physiological and morphological responses of the soil bacterium Rhodococcus opacus strain PD630 to water stress / H.M. Alvarez, R.A. Silva, A.C. Cesari et al И FEMS Microbiol. Ecol. 2004. - V. 50. - P. 75-86.

35. An D.S. Shinella granuli gen. nov., sp. nov., and proposal of the reclassification of Zoogloea ramigera ATCC 19623 as Shinella zoogloeoides sp. nov. / D.S. An, W.T. Im, H.C. Yang et al // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. - V. 56. -P. 443-448.

36. Andreoni V. Detection of genes for alkane and naphthalene catabolism in Rhodococcus sp. strain 1BN / V. Andreoni, S. Bernasconi, M. Colombo et al II Environmental Microbiology. 2000. - V. 2. - P. 572-577.

37. Annweiler E. Naphthalene degradation and incorporation of naphthalene-derived carbon into biomass by the thermophile Bacillus thermoleovorans /

38. E. Annweiler, H.H. Richnow, G. Antranikian et al 11 Appl. Environ. Microbiol. -2000. V. 66, № 2. - P. 518-523.

39. Arahal D.R. Proposal of Cobetia marina gen. nov., comb, nov., within the family Halomonadaceae, to include the species Halomonas marina / D.R. Arahal, A.M. Castillo, W. Ludwig et al II Syst. Appl. Microbiol. 2002. - V. 25. - P. 207211. '

40. Arahal D.R. The Family Halomonadaceae / D.R. Arahal, A. Ventosa//The Prokaryotes: Chapter 3.3.28 / Eds. Dworkin M. et al 3rd edn. New York: Springer-Verlag.,2006.-P. 811-835.

41. Arahal R.D. Phylogeny of the family Halomonadaceae based on 23S and 16S rDNA sequence analyses / R.D. Arahal, W. Ludwig, K.H. Schleifer// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. - V. 52. - P. 241-249.

42. Ashok B.T. Isolation and characterization of four polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria from soil near an oil refinery / B.T. Ashok, S. Saxena, J. Musarrat // Lett. Appl. Microbiol. 1995. - V. 21. - P. 246-248.

43. Bartholomew G.W. Influence of spatial and temporal variations on organic pollutant biodegradation rates in an estuarine environment / G.W. Bartholomew,

44. F. K. Pfaender // Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V. 45. - P. 103-109.

45. Bastos A.E.R. Salt-tolerant phenol-degrading microorganisms isolated from Amazonian soil samples / A.E.R. Bastos, D.H. Moon, A. Rossi et al II Arch. Microbiol. 2000. - V. 174. - P. 346-352.

46. Becker B. Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates / B. Becker, M.P. Lechevalier, R.E. Gordon et al II Appl. Microbiol. 1964. - V. 12. - P. 421-423.

47. Abdelkafi, L. Casalot et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. -V. 57. - P. 23072313.

48. Bertrand J.C. Biodegradation of hydrocarbons by an extremely halophilic archaebacterium / J.C. Bertrand, M. Almallah, M. Acquaviva et al. II Lett. Appl. Microbiol. 1990. -V. 11. - P. 260-263.

49. Bosch R. Complete nucleotide sequence and evolutionary significance of a chromosomally encoded naphthalenedegradation lower pathway from Pseudomonas stutzeri AN10 / R. Bosch, E. Garcia-Valdes, E.R.B. Moore // Gene. 2000. - V. 245. -P. 65-74.

50. Bosch R. Genetic characterization and evolutionary implications of a chromosomally encoded naphthalene degradation upper pathway from Pseudomonas stutzeri AN10 / R. Bosch, E. Garcia-Valdes, E.R.B. Moore // Gene. 1999. - V. 236. -P. 149-157.

51. Bosch R. NahW, a novel, inducible salicylate hydroxylase involved in mineralization of naphthalene by Pseudomonas stutzeri AN 10 / R. Bosch, E.R.B. Moore, E. Garcia-Valdes // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 2315-2322.

52. Bourquin A.W. Distribution of bacteria with nitrilotriacetate-degrading potential in an estuarine environment / A.W. Bourquin, V.A. Przybyszewski // Appl. Environ. Microbiol. 1977. - V. 34. - P. 411-418.

53. Briglia M. Rhodococcus percolatus sp. nov., a bacterium degrading 2,4,6-trichlorophenol / M. Briglia, F.A. Rainey, E. Stackebrandt et al. II Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. - V. 46. - P. 23-30.

54. Buchan A. Key aromatic-ring-cleaving enzyme, protocatechuate 3,4-dioxygenase, in the ecologically important marine Roseobacter lineage / A. Buchan, L.S. Collier, E.L. Neidle et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. -P. 4662-4672.

55. Calderon M.I. Complex regulation of the synthesis of the compatible solute• Tectoine in the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens DSM 3043 / M.I. Calderon, C. Vargas, F. Rojo et al. II Microbiology. 2004. - V. 150. - P. 30513063.

56. Carrasco I.J. Salsuginibacillus kocurii gen. nov., sp. nov., a moderately halophilic bacterium from soda-lake sediment / I.J. Carrasco, M. C. Marquez, Y. Xue et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. -V. 57. - P. 2381-2386.

57. Chang H.-C. Novel organization of the genes for phthalate degradation from Burkholderia cepacia DBOl / H.-C. Chang, G.-J. Zylstra // J. Bacteriol. 1998. -V. 180.-P. 6529-6537.

58. Clements W.H. Accumulation and food chain transfer of fluoranthene and benzoa.pyrene in Chironomus riparius and Lepomis macrochirus / W.H. Clements, J.T. Oris, Т.Е. Wissing//Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1994. - V. 26. - P. 261266.

59. Colquhoun J.A. Novel rhodococci and other mycolate actinomycetes from the deep sea / J.A. Colquhoun., J. Mexson, M. Goodfellow et al. II Antonie van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74. - P. 27-40.

60. Daane L.L. Isolation and characterization of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria associated with the rhizosphere of salt marsh plants / L.L. Daane, I. Harjono, G.J. Zylstra et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2001. -V. 67.-P. 2683-2691.

61. Dagher F. Comparative study of five polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacterial strains isolated from contamibated soils / F. Dagher, E. Deziel, P. Lirette et al. II Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43. - P. 368-377.

62. Dagley S. Catabolism of aromatic compounds by microorganisms / S. Dagley // Adv. Microbiol. Phisiol. 1971. - V. 6. - P. 1-21.

63. Dagley S. The bacterial degradation of catechol / S. Dagley, D.T. Gibson // Biochem. J. 1965. - V. 95. - P. 466-474.

64. Defrank J.J. Purification and properties of an organophosphorus acid anhydrase from a halophilic bacterial isolate / J.J. Defrank, T.-C. Cheng // J. Bacteriol.-1991.-P. 1938-1943.

65. Denome S.A. Metabolism of dibenzothiophene and naphthalene in Pseudomonas strains: complete DNA sequence of an upper naphthalene catabolicpathway / S.A. Denome, D.C. Stanley, E.S. Olson et al II J. Bacteriol. 1993. -V. 175.-P. 6890-6901.

66. D'Souza-Ault M.R. Roles of N-Acetylglutaminylglutamine amide and glycine betaine in adaptation of Pseudomonas aeruginosa to osmotic stress / M.R. D'Souza-Ault, L. Tombras Smith, G.M. Smith // Appl. Environ. Microbiol. 1993.-V. 59.-P. 473-478.

67. Dyaz M.P. Isolation and characterization of novel hydrocarbon-degrading euryhaline consortia from crude oil and mangrove sediments / M.P. Dyaz, S.J.W. Grigson, C.J. Peppiatt et al II Mar. Biotechnol. 2000. - V. 2. - P.522-532.

68. Dyksterhouse S.E. Cycloclasticus pugetii gen. nov., sp. nov., an aromatic hydrocarbon-degrading bacterium from marine sediments / S.E. Dyksterhouse, J.P. Gray, R.P. Herwig et al II Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. - V. 45. - P. 116-123.

69. Eaton R.W. Bacterial metabolism of naphthalene: constraction and use of recombinant bacteria to study ring clavadge of 1,2-dihydroxynaphthalene and subsequent reactions / R.W. Eaton, P.J. Chapman // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. -P. 7542-7550.

70. Emerson D. Haloferax sp. D 1227, a halophilic archaeon capable of growth on aromatic compounds / D. Emerson, S. Chauhan, P. Oriel et al. II Arch. Microbiol. 1994. -V. 161.-P. 445-452.

71. Euzeby J.P. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (formerly list of bacterial names with standing in nomenclature (LBSN)). 2007.

72. Franzmann P.D. A chemotaxonomic study of members of the family Halomonadaceae / P.D Franzmann., B.J. Tindall // System. Appl. Microbiol. 1990. -V. 13.-P. 142-147.

73. Franzmann P.D. Halomonadaceae fam. nov., a new family of the class Proteobacteria to accommodate the genera Halomonas and Deleya / P.D. Franzmann, U. Wehmeyer, E. Stackebrandt // Syst. Appl. Microbiol. 1988. -V. 11.-P. 16-19.

74. Fuenmayor S.L. A gene cluster encoding steps in conversion of naphthalene to gentisate in Pseudomonas sp. strain U2 / S.L. Fuenmayor, M. Wild, A.L. Boyes et al. I I J. Bacteriol. 1998. - V. 180 - P. 2522-2530.

75. Gakhar L. Structure and increased thermostability of Rhodococcus sp. naphthalene 1,2-dioxygenase / L. Gakhar, Z.A. Malik, C.C.C.R. Allen et al. II J. Bacteriol. 2005. - V. 187. - P. 7222-7231.

76. Galinski E.A. Isolation and structure determination of a novel compatible solute from the moderately halophilic purple sulfur bacterium Ectothiorhodospira marismortui/E.A. Galinski, A. Oren//Eur. J. Biochem. 1991. - V. 198. - P. 593598.

77. Garcya M.T. Halomonas organivorans sp. nov., a moderate halophile able to degrade aromatic compounds / M.T. Garcya, E. Mellado, J.C. Ostos et al // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. - V. 54. - P. 1723-1728.

78. Garriga M. Carnimonas nigrificans gen. nov., sp. nov., a bacterial causative agent for black spot formation on cured meat products / M. Garriga, M.A. Ehrmann, J. Arnau et al II Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. - V. 48. - P. 677-686.

79. Garrity G.M. Class I. Alphaproteobacteria class, nov. / G.M. Garrity, J.A. Bell, T. Lilburn // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. Brenner D.J. et al 2rd edn. New York: Springer, 2005. - P. 1.

80. Garrity G.M. Class III. Gammaproteobacteria class, nov. / G.M. Garrity, J.A. Bell, T. Lilburn // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. Brenner D.J. et al. 2rd edn. New York: Springer, 2005. - P. 1.

81. Garsia-Valdes E. New naphthalene-degrading marine Pseudomonas strains / E. Garsia-Valdes, E. Cozar, R. Rotger et al II Appl. Environ. Microbiol. 1988. -V. 54.-P. 2478-2485.

82. Gauthier M.J. Marinobacter hydrocarbonoclasticus gen. nov., sp. nov., a new, extremely halotolerant, hydrocarbon-degrading marine bacterium /

83. MJ. Gauthier, В. Lafay, R. Christen et al II Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. - V. 42. -P. 568-576.

84. Gibson D.T. Aromatic hydrocarbon dioxygenases in environmental biotechnology / D.T. Gibson, R.E. Parales // Current Opinion in Biotec. 2000. -№11.-P. 236-243.

85. Gibson D.T. Desaturation, dioxygenation, and monooxygenation reactions catalyzed by naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain 9816-4 / D.T. Gibson, S.M. Resnick, K. Lee et al II J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 26152621.

86. Goodfellow M. Chemical methods in bacterial systematics / M. Goodfellow, D.E. Minnikin. Academic Press, 1985. - P. 410.

87. Goodfellow M. Rhodococcus aetherivorans sp. nov., a new species of methyl t-butyl ether-degrading actinomycetes / M. Goodfellow, A.L. Jones, L.A. Maldonado et al II Syst. Appl. Microbiol. 2004. - V. 27. - P. 61-65.

88. Goodfellow M. Transfer of Tsukamurella wratislaviensis Goodfellow et al 1995 to the genus Rhodococcus as Rhodococcus wratislaviensis comb. nov. / M. Goodfellow, J. Chun, E. Stackebrandt et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004 -V. 52. -P.749-755.

89. Goodfellow M. Transfer of Tsukamurella wratislaviensis Goodfellow et al 1995 to the genus Rhodococcus as Rhodococcus wratislaviensis comb. nov. /

90. M. Goodfellow, J. Chun, E. Stackebrandt et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2002.-V. 52.-P. 749-755.

91. Grant W.D. Life at low water activity / W.D. Grant // Phil. Trans. R. Soc. Lond. 2004. - V. 359. - P. 1249-1267.

92. Grimm A.C. NahY, a catabolic plasmid-encoded receptor required for chemotaxis of Pseudomonas putida to the aromatic hydrocarbon naphthalene / A.C. Grimm, C. S. Harwood // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 3310-3316.

93. Grund E. Catabolism of benzoate and monohydroxylated benzoates by Amycolatopsis and Streptomyces spp. / E. Grund, C. Knorr, R. Eichenlaub // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - P. 1459-1464.

94. Grund E. Naphthalene degradation via salicylate and gentisate by Rhodococcus sp. strain B4 / E. Grund, B. Denecke, R. Eichenlaub // Appl. Environ. Microbiol. 1992. -V. 58. -P. 1874-1877.

95. Habe H. Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria / H. Habe, T. Omori // Biosci. Biotech. Biochem. 2003. -V. 67.-P. 225-243.

96. Haddad S. Cloning and expression of the benzoate dioxygenase genes from Rhodococcus sp. strain 19070 / S. Haddad, D.M. Eby, E.L. Neidle // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. - P. 2507-2514.

97. Hedlund B.P. Polycyclic aromatic hydrocarbon degradation by a new marine bacterium, Neptunomonas naphthovorans gen. nov., sp. nov. / B.P. Hedlund, A.D. Geiselbrecht, TJ. Bair et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. -P. 251-259.

98. Hedlund B.P. Vibrio cyclotrophicus sp. nov., a polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)-degrading marine bacterium / B.P. Hedlund, J.T. Staley // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. - P. 61-66.

99. Hernandez-Raquet G. Molecular diversity studies of bacterial communities of oil polluted microbial mats from the Etang deBerre (France) / G. Hernandez-Raquet, H. Budzinski, P. Caumette et al. // FEMS Microbiol. Ecol. -2006.-V. 58.-P. 550-562.

100. Hinteregger C. Halomonas sp., a moderately halophilic strain, for biotreatment of saline phenolic waste-water / C. Hinteregger, F. Streichsbier // Biotechnol. Lett. 1997. - V. 19. - P. 1099-1102.

101. Hood M.A. Microbial indicators of oil-rich salt marsh sediments / M.A. Hood, W.S. Bishop, J.R. Bishop et al. II Appl. Microbiol. 1975. - V. 30. -P. 982-987.

102. Ibekwe A.M. Characterization of microbial communities and composition in constructed dairy wetland wastewater effluent / A.M. Ibekwe, C.M. Grieve, S.R. Lyon // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 50605069.

103. Imhoff J.F. Osmoregulation and compatible solutes in eubacteria / J.F. Imhoff// FEMS Microbiol. Rev. 1986. - V. 39. - P. 57-66.

104. Jones A.L. Rhodococcus gordoniae sp. nov., an actinomycete isolated from clinical material and phenol-contaminated soil / A.L. Jones, J.M. Brown, V. Mishra et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. - V. 54. - P. 407-411.

105. Joon J.H. Halomonas marisflavae sp. nov., a halophilic bacterium isolated from the Yellow Sea in Korea / J.H. Joon, S.H. Choi, K.C. Leeet al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. - P. 1171-1177.

106. Jukes Т.Н. Evolution of protein molecules / Т.Н. Jukes, C.R. Cantor // Mamallian protein Metabolism / Ed. Munro H. N. New York: Academic press, 1969. -P. 21-132.

107. Kanaly R.A. Biodegradation of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria / R.A. Kanaly, S. Harayama // J. Bacteriol. -2000. V. 182. - P. 2059-2067.

108. Kanaly R.A. Rapid mineralization of benzoa.pyrene by a microbial consortium growing on diesel fuel / R.A. Kanaly, R. Bartha, K. Watanabe et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 4205-4211.

109. Kasai Y. Bacteria belonging to the genus Cycloclasticus play a primary role in the degradation of aromatic hydrocarbons released in a marine environment / Y. Kasai, K. Kishira, S. Harayama // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68. -P. 5625-5633.

110. Khmelenina V.N. Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilic methanotrophs / V.N. Khmelenina, M.G. Kalyuzhnaya, V.G. Sakharovsky et al. // Arch. Microbiol. 1999. - V. 172. - P. 321-329.

111. Kleinsteuber S. Population dynamics within a microbial consortium during growth on diesel fuel in saline environments / S. Kleinsteuber, V. Riis, I. Fetzer et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72. - P. 3531-3542.

112. Kuhlmann A.U. Osmotically regulated synthesis of the compatible solute ectoine in Bacillus pasteurii and related Bacillus spp. / A.U. Kuhlmann, E. Bremer // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68. - P. 772-783.

113. Kulakov L.A. Cloning and characterization of a novel cw-naphthalene dihydrodiol dehydrogenase gene (narQ) from Rhodococcus sp. NCIMB 12038 / L.A. Kulakov, C.C.R. Allen, D.A. Lipscomb et al. II FEMS Microbiology Letters. -2000.-V. 182.-P. 327-331.

114. Kulakov L.A. Web-type evolution of Rhodococcus gene clusters associated with utilization of naphthalene / L.A. Kulakov, S. Chen, C.C.R. Allen et al II Appl. Environ. Microbiol. -2005. -V. 71. P. 1754-1764.

115. Kurkela S. Cloning, nucleotide sequence and characterization of genes encoding naphthalene dioxygenase of Pseudomonas putida strain NCIB9816 / S. Kurkela, H. Lehvaslaiho, E. T. Palva et al II Gene. 1988. - V. 73. - P. 355-362.

116. Laffineur K. Bacteremia due to a novel Microbacterium species in a patient with leukemia and description of Microbacterium paraoxydans sp. nov. / K. Laffineur, V. Avesani, G. Cornu et al II J. Clin. Microbiol. 2003. - V. 41. -P. 2242-2246.

117. Larkin M.J. Purification and characterisation of a novel naphthalene dioxigenase from Rhodococcus sp. Strain NCIMB 12038 / M.J. Larkin, C.C.R. Allen, L.A. Kulakov et al. //J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 6200-6204.

118. Laurie A.D. The phn genes of Burkholderia sp. strain RP007 constitute a divergent gene cluster for polycyclic aromatic hydrocarbon catabolism / A.D. Laurie, G. Lloyd-Jones // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 531-540.

119. Lee J.-C. Halomonas taeanensis sp. nov., a novel moderately halophilic bacterium isolated from a solar saltern in Korea / J.-C. Lee, C. Jeon, J.-M. Lim et al 11 Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. - V. 55. - P. 2027-2032.

120. Lentzen G. Extremolytes: natural compounds from extremophiles for versatile applications / G. Lentzen, T. Schwarz // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2006.-V. 72.-P. 623-634.

121. Lim L.H. The contribution of traffic to atmospheric concentration of polycyclic aromatic hydrocarbons / L.H. Lim, R.M. Harrison, S. Harrad // Environ. Sci. Technol. 1999. - V. 33. - P. 3538-3542.

122. Lopez-Lopez A. Thalassospira lucentensis gen. nov., sp. nov., a new marine member of the alpha-Proteobacteria / A. Lopez-Lopez, M. J. Pujalte, S. Benlloch et al // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. - V. 52. - P. 1277-1283.

123. Louis P. Characterization of genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine from Marinococcus halophilus and osmoregulated expression in

124. Escherichia coli / P. Louis, E.A. Galinski // Microbiology. 1997. - V. 143. -P.1141-1149.

125. Luz M. A Rhodococcus species that thrives on medium saturated with liquid benzene / M. Luz, F. Paje, B.A. Neilan et al. II Microbiology. 1997. -V. 143.-P. 2975-2981.

126. Manoj K. A halotolerant and thermotolerant Bacillus sp. degrades hydrocarbons and produces tensio-active emulsifying agent / K. Manoj, L.V. Sisto Materano, A. Ilzins et al II J. Microbiol. Biotechnol. 2007. - V. 23. - P. 211-220.

127. Manual of environmental microbiology. Editors: Christon J. Hurst, Ronald L. Crawford, Guy R. Knudsen, Michael J. Mclnerney, Linda D. Stetzenbach. -ASM Press, 2002.-1138 p.

128. Margesin R. Biodegradation and bioremediation of hydrocarbonsin extreme environments / R. Margesin, F. Schinner // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2001.-V. 56.-P. 650-663.

129. Marr L.C. Characterization of polycyclic aromatic hydrocarbons in motor vehicle fuels and exhaust emissions / L.C. Marr, T.W. Kirchstetter, R.A. Harley et al II Environ. Sci. Technol. 1999. - V.33. - P. 3091-3099.

130. Martin D.D. Osmoadaptation in Archaea / D.D. Martin, R.A. Ciulla, M.F. Roberts // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 1815-1825.

131. Martinez-Canovas M.J. Halomonas ventosae sp. nov., a moderately halophilic, denitrifying, exopolysaccharide-producing bacterium / M.J. Martinez-Canovas, E. Quesada, I. Llamas et al II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. - V. 54. -P. 733-777.

132. Martlnez-Checa F. Halomonas almeriensis sp. nov., a moderately halophilic, exopolysaccharide-producing bacterium from Cabo de Gata, Almeria, south-east Spain / F. Martlnez-Checa, V. Martinez-Canovas, I. Llamas et al II Int. J.

133. Syst. Evol. Microbiol. -2005. -V. 55. P. 2007-2011.

134. Martins L.O. Accumulation of mannosylglycerate and di-myo-inositol-phosphate by Pyrococcus furiosus in response to salinity and temperature /

135. L.O. Martins, H. Santos // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 32993303.

136. Mata J.A. A detailed phenotypic characterisation of the type strains of Halomonas species / J.A. Mata, J. Martinez-Canovas, E. Quesada et al. II System. Appl. Microbiol. 2002. - V. 25. - P. 360-375.

137. McMinn E.J. Genomic and phenomic differentiation of Rhodococcus equi and related strains / E.J. McMinn, G. Alderson, H.I. Dodson et al. И Antonie van Leeuwenhoek. 2000. - V. 78. - P. 331-340.

138. Mille G. Effect of salinity on petroleum biodegradation / G. Mille, M. Almallah, M. Bianchi et al. II Fres'enius J. Anal. Chem. 1991. - V. 339. -P. 788-791.

139. Mumtaz M. Toxicological profile for polycyclic aromatic hydrocarbons / M. Mumtaz // U.S. department of health and human services. 1995. - 487 p.

140. Nagata S. Intracellular changes in ions and organic solutes in halotolerant Brevibacterium sp. strain JCM 6894 after exposure to hyperosmotic shock / S. Nagata, K. Adachi, H. Sano // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 68. -P. 3641-3647.

141. Nakayama H. Ectoine, the compatible solute of Halomonas elongata, confers hyperosmotic tolerance in cultured tobacco cells / H. Nakayama, K. Yoshida, H. Ono et al. II Plant. Physiol. 2000. - V. 122. - P. 1239-1248.

142. Nicholson C.A. Aerobic biodegradation of benzene and toluene under hypersaline conditions at the Great Salt Plains, Oklahoma / C.A. Nicholson, B.Z. Fathepure // FEMS Microbiol. Lett. 2005. - V. 245. - P. 257-262.

143. Nicholson C.A. Biodegradation of benzene by halophilic and halotolerant bacteria under aerobic conditions / C.A. Nicholson, B.Z. Fathepure // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - P. 1222-1225.

144. Oesterhelt D. Decomposition of halogenated hydrocarbons by halophilic bacteria / D. Oesterhelt, H. Patzelt, B. Kesler // Patent DE19639894 1998.

145. Okamoto T. Zymobacter palmae gen. nov., sp. nov., a new ethanol-fermenting peritrichous bacterium isolated from palm sap / T. Okamoto, H. Taguchi, K. Nakamura et al. II Arch. Microbiol. 1993. - V. 160. - P. 333-337.

146. Ono H. Characterization of biosynthetic enzymes for ectoine as a compatible solute in a moderately halophilic eubacterium, Halomonas elongate / H. Ono, K. Sawada, N. Khunajakr et al. //J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 91-99.

147. Onraedt A. Dynamics and optimal conditions of intracellular ectoine accumulation in Brevibacterium sp. / A. Onraedt, B. Walcarius , W. Soetaert et al. И Commun. Agri. Appl. Biol. Sci. 2003. - V. 68. - P. 241-246.

148. Oren A. Bioenergetic aspects of halophilism / A. Oren // Microbiol, and Molec. Biol. Rev. 1999. - V. 63. - P. 334-348.

149. Oren A. Microbial degradation of pollutants at high salt concentrations/ A. Oren, P. Gurevich, M. Azachi et al. II Biodegradation. 1992. - V. 3. - P. 387398.

150. Owen RJ. The thermal denaturation of partly purified bacterial deoxyribonucleic acid and its taxonomic applications / RJ. Owen, S.P. Lapage // J. Appl. Bacteriol. 1976. - V. 41. - P. 335-340.

151. Parales R.E. Aspartate 205 in the catalytic domain of naphthalene dioxygenase is essential for activity / R.E. Parales, J.V. Parales, D.T. Gibson //

152. J. Bacteriol.-1999.-V. 181.-P. 1831-1837.

153. Parales R.E. Regioselectivity and enantioselectivity of naphthalene dioxygenase during arene cw-dihydroxylation: control by phenylalanine 352 in the a subunit / R.E. Parales, S.M. Resnick, C.-Y. Yu et al II J. Bacteriol. 2000. - V. 182. -P. 5495-5504.

154. Parales R.E. Substrate specificities of hybrid naphthalene and 2,4-dinitrotoluene dioxygenase enzyme systems / R.E. Parales, M.D. Emig, N.A. Lynch et al. II J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 2337-2344.

155. Parales R.E. The role of active-site residues in naphthalene dioxygenase / R.E. Parales // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 30. - P. 271-278.

156. Patel T.R. Bacterial cys-dihydrodiol degidrogenase of Pseudomonas putida /T.R. Patel, D.T. Gibson // J. Bacteriol. 1974. - V. 119. - P. 879-888.

157. Patrauchan M.A. Catabolism of benzoate and phthalate in Rhodococcus sp. strain RHA1: redundancies and convergence / M.A. Patrauchan, C. Florizone, M. Dosanjh et al. II J. Bacteriol. 2005. - V. 187. - P. 4050-4063.

158. Pfening N. Higher taxa of the phototrophic bacteria / N. Pfening, H.G. Truper// Int. J. Syst. Bacteriol. 1971. - V. 21. - P. 17-18.

159. Prabhu J. Functional expression of the ectoine hydroxylase gene (thpD) from Streptomyces chrysomallus in Halomonas elongate / J. Prabhu, F. Schauwecker, N. Grammel et al //Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - P. 3130-3132.

160. Resnick S.M. Diverse reactions catalyzed by naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp strain NCIB 9816 / S.M. Resnick, K. Lee, D.T. Gibson // J. Ind. Microbiol. 1996. - V. 17. - P. 438-457.

161. Rhykerd R.L. Influence of salinity on bioremediation of oil in soil / R.L. Rhykerd, R.W. Weaver, K.J. Mclnnes // Environ. Pollut. 1995. - V. 90. -P. 127-130.

162. Roberts M.F. Organic compatible solutes of halotolerant and halophilic microorganisms / M.F. Roberts // Saline Systems. 2005. - P. 1-30.

163. Rossello-Mora R.A. Comparative biochemical and genetic analysis of naphthalene degradation among Pseudomonas stutzeri strains / R.A. Rossello-Mora, J. Laluoat, E. Garoia-Valdes // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 966972.

164. Schippers A. Microbacterium oleivorans sp. nov. and Microbacterium hydrocarbonoxydans sp. nov., novel crude-oil-degrading gram-positive bacteria /

165. A. Schippers, К. Bosecker, С. Sproer et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. -V. 55.-P. 655-660.

166. Shen F.-T. Gordonia soli sp. nov., a novel actinomycete isolated from soil / F.-T. Shen, M. Goodfellow, A.L. Jones et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2006.-V. 56.-P. 2597-2601.

167. Shen X.-H. Functional identification of novel genes involved in the glutathione-independent gentisate pathway in Corynebacterium glutamicum / X.-H. Shen, C.-Y. Jiang, Y. Huang et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71. -P.3442-3452.

168. Simon M.J. Sequences of genes encoding naphthalene dioxygenase in Pseudomonas putida strains G7 and NCIB9816-4 / M.J. Simon, T.D. Osslund, R. Saunders et al. II Gene. 1993. - V. 127. - P. 31-37.

169. Sims J.L. Approach to bioremediation on contaminated soil / J.L. Sims, R.H Sims, J.E. Matthews // Haz. Waste Haz. Matter. 1990. - V. 7. - P. 117-149.

170. Siron R. Environmental factors influencing the biodegradation of petroleum hydrocarbons in cold seawater / R. Siron, E. Pelletier, C. Brochu // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1995. -V. 28. - P. 406^16.

171. Soddell J.A. Gordonia defluvii sp. nov., an actinomycete isolated from activated sludge foam / J.A. Soddell, F.M. Stainsby, K.L. Eales et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. - P. 56. - P. 2265-2269.

172. Stapleton R.D. Biodegradation of aromatic hydrocarbons in an extremely acidic environment / R.D. Stapleton, D.C. Savage, G.S. Sayler et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1998.-V. 64 - P. 4180^184.

173. Stringfellow W.T. Comparative physiology of phenantrene degradation by two dissimilar Pseudomonas isolated from a cresoat-contaminated soil / W.T. Stringfellow, M.D. Atken // Can. J. Microbiol. 1994. - V. 40. - P. 432-438.

174. Suen W.-T. Isolation and preliminary characterization of the subunits of the terminal component of naphthalene dioxygenase from Pseudomonas putida NCIB 9816-4 / W.-T. Suen, D.T. Gibson //J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 5877-5881.

175. Tagger S. Preliminary study on relationships among strains forming a bacterial community selected on naphthalene from a marine sediment / S. Tagger, N. Truffaut, J. Le Petit // Can. J. Microbiol. 1990. - V. 36. - P. 676-81.

176. Takeuchi M. Rhodococcus jostii sp. nov., isolated from a medieval grave / M. Takeuchi, K. Hatano, I. Sedla et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. -V. 52.-P. 409-413.

177. Takizawa N. Nucleotide sequences and characterization of genes encoding naphthalene upper pathway of Pseudomonas aeruginosa PaKl and Pseudomonas putida OUS82 / N. Takizawa, T. Iida, T. Sawada et al. II J. Biosci. Bioeng. 1999. - V. 87. - P 723-731.

178. Talibart R. Transient accumulation of glycine betaine and dynamics of endogenous osmolytes in salt-stressed cultures of Sinorhizobium meliloti / R. Talibart, M. Jebbar, K. Gouffi et al. //Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. -P. 4657-4663.

179. Tombras Smith L. An osmoregulated dipeptide in stressed Rhizobium meliloti / L. Tombras Smith, G. M. Smith // J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 47144717.

180. Vargas C. Ectoines as compatible solutes and carbon and energy sources for the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens / C. Vargas, M. Jebbar, R. Carrasco et al. Ill Appl. Microbiol. -2006. -V. 100. P. 98-107.

181. Ventosa A. Biology of halophilic aerobic bacteria / A. Ventosa, J.N. Joaquhn, A. Oren. // Microbiol. Molec.Biol. Rev. 1998. - V. 2. - P. 504-544.

182. Ventosa A-. Biotechnological applications and potentialities of halophilic microorganisms / A. Ventosa, J.J. Nieto // J. Microbiol. Biotechnol. 1995. - V. 11. -P. 84-95.

183. Versalovic J. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction / J. Versalovic, M. Schneider, F.J. de Bruijn et al. I I Meth. Cell. Mol. Biol. 1994. - V. 5. - P. 25-40.

184. Vreeland R.H. Halomonas elongata, a new genus and species of extremely salt-tolerant bacteria / R.H. Vreeland, C.D. Litchfield, E.L. Martin et al. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. - V. 30. - P. 485-495.

185. Ward D.M. Hydrocarbon biodegradation in hypersaline environments / D.M. Ward, T.D. Brock // Appl. Environ. Microbiol. 1978. - V. 35. - P. 353-359.

186. Yamamoto S. Salicylate hydroxylase, a monooxygenase requiring flavin adenine dinucleotide. I. Purification and general properties / S. Yamamoto, M. Katagiri, H. Maeno et al. // J. Biol. Chem. 1965. - V. 240. - P. 3408-3413.

187. Yen K.M. Genetic of naphthalene catabolism in pseudomonads. CRC / K.M. Yen, C.M. Sedar // Crit. Rev. Microbiol. 1988. - V. 15. - P. 247-268.

188. Yoon J.-H. Rhodococcus koreensis sp. nov., a 2,4-dinitrophenol-degrading bacterium / J.-H. Yoon, Y.-G. Cho, S.-S. Kang et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol.-2000.-V. 50.-P. 1193-1201.

189. Yoon J.-H. Rhodococcus pyridinivorans sp. nov., a pyridine-degrading bacterium / J.-H. Yoon, S.-S. Kang, Y.-G. Cho et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2000.-V. 50.-P. 2173-2180.

190. You I.-S. Nucleotide sequence analysis of the Pseudomonas putida PpG7 salicylate hydroxylase gene (nahG) and its З'-flanking region / I.-S. You, D. Ghosal, I.C. Gunsalus//Biochemistry. 1991.- V. 30.-P. 1635-1641.

191. You I.-S. Nucleotide sequence of plasmid NAH7 gene nahR and DNA binding of the nahR product / I.-S. You, D. Ghosal, I.C. Gunsalus // J. Bacteriol. -1988.-V. 170.-P. 5409-5415.

192. Zhilina T.N. Desulfonatronovibrio hydrogenovorans gen. nov., sp. nov., an alkaliphilic, sulfate-reducing bacterium / T.N. Zhilina, G.A. Zavarzin, F.A. Rainey et al. H Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - V. 47. - P. 144-149.

193. Zhou N.-Y. nag genes Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism / N.-Y. Zhou, S.L. Fuenmayor, P. A. Williams I I J. Bacteriol. 2001. -V. 183. - P. 700-708.

194. Zhuang W.-Q. Importance of gram-positive naphthalene-degrading bacteria in oil-contaminated tropical marine sediments / W.-Q. Zhuang, J.-H. Tay, A.M. Maszenan et al. II Lett. Appl. Microbiol. 2003. - V. 36. - P. 251-257.

Информация о работе

Ананьина, Людмила Николаевна
кандидата биологических наук
Пермь, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Нафталинметаболизирующий консорциум микроорганизмов, выделенный из засоленной почвы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы