Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Радужные вирусы комаров

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Радужные вирусы комаров"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАБОХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

Научно-исследовательский институт эпидемиологии, ^ ^ ыик^у^иологии и инфекционных болезней

- и (Ш '1323

На правах рукописи

ГОРЫБАЕВ Хисаметдин Каадыбаевич

РАДУЖНЫЕ ВИРУСЫ КОМАРОВ Специальность 03. 00. 06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Алма-Ата - 1993

Работа в основном выполнена в Институте микробиологии и вирусологии Академии наук Республики Казахстан, а отдельные этапы - в Институте молекулярной биологии и генетики Академии наук Республики Украины.

Научные консультанты: Герой социалистического труда, лауреат

государственной премии Республики Украина, академик АН РУ, д.б.н., профессор С.М.ГЕН11ЕН30Н,

Лауреат государственной премии Республики Казахстан, член-корреспондент АН ГО, д.б.и., профессор Н. Б. АХМАШШЩА

Официальные оппоненте: - доктор медицинских наук

. КАРИМОВ С.К.

доктор биологических наук ВАСИЛЬЕВА В.Л. доктор биологических наук КУООВ В.Н.

Ведушее учреждение: ШО "Вектор" ВНИИ молекулярной биологии

СО РАН(Новосибкрск).

Защита диссертации состоится " 1993 г.

в "___" часов на заседании специализированного Оовета

Д 079. 05. 01 при КИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Минздрава Республики Казахстан по адресу: 480002, г. Алма-Ата, уд. Ы.Макатаева, 34.

С диссертационным материалом можно ознакомиться в библиотеке Института. .

Автореферат разослан " _ / "________/ЦХ „ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат медицинских наук /- Н.М.Нуркина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальности проблемы. Актуальность исследования радужных вирусов, порашзюиага кровососущих комаров обусловлена рядом обстоятельств и прегде всего относительно слабой их изученностью. Пока не раскрыты ни особенности их взаимодействия с клеткой, ни гэхэкпзг.ч: рвпродуюда в изменчивости. Более того, нельзя ;;теер"'-дать и о полноте их инвентаризации, хотя известно доеоль-но большое число разновидностей, классифицируемых в самостоятельные груши:. Возникла настоятельная необходимость создания банка данных о свойстезх этого класса вирусов, о возможности ::х воздействия на других представителей энтомофауны и на поз-еоноч1птх "лвотных.

Надо полагать, что вирусы насекомых долкны отличаться от вирусов человека к квотных высокой специфичностью и экологической замкнутостью, связанной с особенностями круга хозяев и относительно небольпши радиусом их миграции. Изучение этого вопроса требует сравнительного анализа биологических свойств большого числа вирусов насекомых, населяющих различные части ' земного шара и, следовательно, накопления соответствующих давних. Поэтому узе выделение и биологическая идентификация вирусов из разных регионов претендуют на определенную актуальность. Кроме того, следует иметь в виду и народнохозяйственную значимость разрабатываемой проблемы. Лишь после тщательного, всестороннего анализа биологических свойств вирусов с установле- ■ нием их истинных хозяев мокно ставить вопрос об использовании этих вирусов для •защиты человека и тавотных от переносчиков заболеваний или вредителей сельскохозяйственных культур и ле-

сое.

Зта проблема особенно актуальна для Казахстана, имеющего огромные территории для посевоЕ сельскохозяйственных культур и пастбищ с развитой сетью поливного и орошаемого земледелия, искусственных и естественных водоемов.

Цель гг задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в выявлении очагов ирлдовируеннх инфекций кровососущих комаров в различных лащцпафтннх зонах Казахстана, всестороннем изучении биологических свойств иридовирусов с определением их возможной роли как естественных регуляторов численности кровососущих комаров.

Ставились следующие задачи:

1. Выявить предполагаемые очаги иридовирусных инфекций кровососущих: комаров, определить их ландшафтную приуроченность и экологические особенности.

2. Провести эпизоотологический анализ и изучить гистопато-логические особенности иридовирусной инфекции кровососущих комаров.

3. Исследовать морфологические и биологические свойства выделенных иридовирусов.

4. Изучить круг хозяев ирядоЕирусоЕ, экспериментальное воздействие их на другие виды яиеотных гидробионгной фауны,обитающей в одном биоценозе, а также механизмы передачи возбудителя Е естественных условиях.

5. Исследовать возможность накопления иридовирусов е препаративных количествах in vivo и in vitro.

6. Оценить возможность создания искусственных эпизоотии ирпдовирусной йнфйКЦйй ъ популяциях кровососущих комаров, наметить пути развития ш?сда вирусологического контроля численности целевых видов кровососущих комаров.

Научная.новизна,тботн. Впервые е Евразии в различных природно-климатических зонах Казахстана от трех видов кровососущих комаров ( Aedes caspius caspius , Ae.flavescens, Ae.straaineua ) выделены бирюзовые и оранневые радужные вирусы (ЕРВК и ОРВК). Пггаммы вирусов оригинальны по морфологическим к биологическим характеристикам.

Они депонированы в Государственной коллекции вирусов в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского АМНР и им присвоены номера ПШ 2202 и 1KB 2203{ кроме того,' они включены в каталог энтомопатогенных микроорганизмов, депонированных в учреждениях Восточнопалеарктической секции международной организации по биологической борьбе (Прага, 1980), а Такие в Bibliography on pathogens of medically important Arthropods,1981 (Geneva,1983).

Установлена возможность накопления вируса при интралим-©альном зарагении гусениц чешуекрылых, жесткокрылых и перепончатокрылых насекомых: большой вощинной моли, непарного, тутового и ивового шелкопрядов, совки огородной и гороховой, бракника цэнтрально-азиагского, мучного хруща, колорадского и ишьского EjTKOB, яблонебой плодожорки и $И0Ле50Ё0Й пчелы.

Невосприимчивыми к вирусу оказались кольчатые и киргизские коконопряды, крапивница, яблоневая моль и листовертка.

ВнйЕлено, что личинки комаров Ае.с.caspias, Ae.c.dorsalia, Ae.aegypti ( Ае.detritus , Ае. flave3cen3 , Ае. monthadakyi, Дд. caaachatanicua , Ае. уехапз , Ае. leucomelas, Culiseta longiareolata, Ca.alaakaen3Í3, Uraaotaenia unguiculata заражаются вирусом перорально, тогда как для других гидробионтов (яук-плавунец, стрекоза, хирономиды, мокрецы, олигохеты, дафнии, инфузории, пресноводные нематоды, личиннояднне рыбы -Oriziaa latipe3, Paeudora3bora parva, Сагазз1ив auratus; комары - Culex modeatua, Cx.moleatus, Cx.pipiena, Anophe-lea hyrcanua, An.maculipenni3 OH H9 инфокционен.

Доказано активное размножение вирусов в перевиваемых тканях культур табачной совки, колорадского жука, непарного и дубового шелкопрядов и возможности препаративного его накопления для практического использования.

Практическая ценность -работы. Депонированные штаммы используются для идентификации возбудителей и диагностики заболеваний комаров.

Высокая инфекционноеть ЕРВК и ОРЖ, выделенных из личинок кровососущих комаров, дает вознойность применять-их для снине-нкя численности вредных насекомых. Сравнительно высокая специфичность вирусов обусловливает экологическую безопасность их использования в естественных биоценозах.

Инфекционвость вирусов для колорадского жука позволяет рекомендовать их для разработки микробиологического метода защиты пасленовых культур от вредителя.

Основные положения, выноспмуе на заиитт: приоритет выделения е казахстанском регионе бирззового п оранжевого радужных вирусов комаров и изучение их биологических и физико-хигиче-ских свойств; результаты анализа патогенеза вирусной инфекции насекомых; научные основы использования, Еэдеденншс вирусое для регуляции численности кровососуящх комароЕ в республике.

Апробация -работы. Работа является фрагментом плановой IDÍP Института микробиология ж вирусологии АЛ КС в I970-I22G it. по проблемам: "Возбудители микозкнх, вирусных л бактериальных инфекций в борьбе с гнусом в условиях аридной зона Казахстана", гос.регистр, номер 74020795; "Выделение as природ! и.изучение

микроорганизмов - стимуляторов роста растеи:::' г :,;:жроорганизмов - антагонистоЕ к возбудителя!«! болезней растений и насекомых", гос.регистр.номер 73041824; "Разработать теоретические осноен использования микробиологических методов борьбы с болезнями и вредителями растений", гос.регистр.но:.:ер 01.85.0028822.

Результаты исследовании долокоен на научных конференциях Института микробиологии и вирусологии M PK (Алма-Ата, 1072, 1975, I9S2, 1985); на Всесоюзном симпозиуме "Знтомопатогеннке вирусы и их применение е сельском хозяйстве (РшеЕ,1981, IS85, 1987); на Пергой республиканской конференции "Патология членистоногих и биологические средства борьбы с Ередшми организмами (Украина, Канев, 1382); на I-ïi Всесоюзной научной конференции "Микробиологические методы защиты растений" (Молдова, Кишинев, 1976); на Международной конференции паразитологов (Болгария, Зарна, 1983); на Всесоюзной конференции "Пути совершенствования микробиологической борьбы с вредными насекомыми и болезнями растений" (Россия, Оболенск, 1986); на совместном заседании кафедры Еирусологии и лаборатории экологии и токсикологии ШУ ш.Т.Г.ШеЕченко (Украина, Киев, 1991); на заседании Ученого совета Института микробиологии и вирусологии ЛИ PK (1992) и отдела вирусологии ПИИ сгстдегдгологии,микробиологии и инфекционных болезней Î.Î3 Ri (1Э92).

Публккзтгят-;. По ».»атерпелам диссертации опубликовано 35 научных работ, е той числе 13 в центральной и зарубежной печати.

Обгон п отпуктупэ днеозтжнеш. Работа излонена на 290 страницах мсикноппсногс текста, иллюстрирована 38 таблицами и 115 рисунками. Она состоит кз введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения к выводов. Указатель литературы включает 384 источника, из mix 183 отечественных: и 201 зарубз-ннй.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Обзор литературы

Обзор отечественной и зарубепноЗ литературы состоит из трех разделов: современные предетандепня о вирусах, пораааю-щих насекомых, вирусные болезни комаров и описание ирздовиру-сов комаров.

Отмечено, что в последние годн заметно возрос интерес исследователей к разработке вирусологических методов регулирования численности нрединх насекомых, которпе предполагают использование возбудителей болезней.

2. Материалы и методы исследования .

Объектом наших исследований были бирюзовые я оранжевые радужные вирусн, выделенные из личинок комаров Ae.c.caspiua, отловленных в естественна Еодоеиах в различных регионах Казахстана.

Сбор личинок комароЕ проводился общепринятыми методами лак во время гкспеднцггл, так и при стационарных исследованиях. Собранные личп'ш: тщательно осматривали под стереоскопическим микроскопом (МБС-9). Особое внимание уделялось наблюдениям за состоянием и цветом кутикулы, прозрачностью гемолимфы.

Вирус размножали е личинках большой воищнной моли. Вирус~ содержащий материал, хранили в 50% глицерине в холодильнике.

Концентрацию и очистку Еирусннх препаратов осуществляли методой дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (10-40$). Количество Еирусного белка определяли спектрометрически по Н.Калъкару ( Kalkar ,1974).

Личинки насекомых заражали двумя методами: ■ инъекциями в гемоцель и через корм.

Для гистологического изучения инфицированные и контроль- ' нке личинки кровососов и других беспозвоночных фиксировали в жидкости Буэна и. Карнуа. Срезы окрашивали по Делафильду, ПзЯ-денга~йну и С>ёльгену (Кисели,1962; Пирс, 1962; Matta- а. Lowe, 1969; -'almeiri et al. ,1978).Для размножения вируса использовали такие культуры клеток насекомых: lumantria diapar ( SCL-d - 135), Antheraea psrnyi (MC- Ар -I), Euxoa acandens Й' Decemlineata leptinotarsa.

■Выделение ДНК проводили фенольно-детергантпым методом (Кок, 1980).

Молекулярные массы вирионов и ДНК вычисляли на основании эмпирической зависимости меаду молекулярной массой (М) и константой седиментации ( s20o ) по Пигоуту (Pitout et al^IOGS; Эйгнер, 1970).

Для вычисления константы седиментации вириона и их ДНК использовали аналитическую центрифугу ЫОМ 3170 (Венгрия).

Плавучую плотность ДНК в градиенте концентрации хлористого цезия и содержание ЕЦ-оснований в ДНК находили методом М.Манделя и Дк.Ыармура (1970).

Антигенное родство исследуемых шташов вируса с другими s иридовирусашг определяли в агаре по 0.0ухтерлоли(0исМег1опу , 1967).

Анализ иридовирусных белков проводили с пожененном вертикального электрофореза в системе Ю.Дешш ( laemli ,1970) но плаотинке полиакриламидного геля.

Электронно-микроскопические исследования вируса и его ДНК выполняли по А.1оЕптсону (1972) и Е.Уикли (1975).

3. Зццеление радужных ehpjcoe когароЕ г изучение их физико-химических и биологических свойств

Среди возбудителей заболеваний комаров наиболее распространенными яеляются радуяные вирусы. Они поражают е основном КрОВОСОСуЩИХ комаров рода Aedes, Culiseta, Paorophora, Morlопух.

Еще в 70-х гг. при обследовании поймы р.Или с ее многочисленными притоками на юго-востоке Казахстана мы обратили внимание на массовую гибель личинок комаров Ae.c.caspius от вирусной инфекции. На ультрагонких срезах личинок были обнаружены икосаэдркческие шарообразные вирионы, идентифицированные нами как бирюзовые и оранжевые радужные вирусы комароЕ (БРВ1С и OPBiQ. Размеры БРВК Ae.c.caspius составляют 180+5,4 им, ОРВК -210+4,4 нгл. Плотная центральная часть вируса представляет собой кулеопротеид диаметром - 100+1,2 вм. Вирионы имеют трехслойную оболочку толщиной 35+5,2 нм.

ЕРБК и ОРВК, ввделенные от Ае.с. caspiua , хорошо размножаются на личинках большой вощинной моли G.meiionella . Нами изучен ряд закономерностей этого процесса, показана зависимость размножения от температуры. Наиболее благоприятной для Еирусной инфекции оказалась температура 20-25°С, при которой смертность насекомых е течение 11-29 дней достигала 77,6-88,02. Инкубационный период болезни длился II-18 дней. При температу-

ре 1С-15°С гибель гусениц составляла 79,6+4,3 - 84,6+5,1^, инфекция длилась до 60 дней. Такш образом, болезнь личинок активнее развивается е условиях, близких к оптимальным для большой вощинной моли.

Исследована такка устойчивость ЕРВК и ОРВК, выделенных из большой вощинной моли, к условиям длительного хранения ж к органическим растворителям. Достаточно эффективным способом хранения вирусов оказалось содержание в кидком азоте (при температуре - 196°С) или в сухом виде в герметически закрытом сосуде при +4°С. Инфекционность вирусов после хранения в течение двух лет (320 дней) не изменилась, титр БРВК составлял Ю-6'®3

и ГО-7,48, а ОРВК в обоих случаях ГО-''0. Инфекционность ЕРБК и ОРБК Ае.с.сазр1из , хранивпшхся в 50$ глицерине при 4°С,

через 360 дней снизилась примерно на 2

ЕРВК и ОРВК Ае.с. са£гр1аз оказались нечувствительными к^ эфиру и хлороформу. 1Л)50 вируса в контроле составлял 10""® и Ю"5,8, а через 24 ч содержания вируса в эфире - 1СГ®,93 я Ю-6,53, в хлороформе - 10"6,5.

Центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы обтащенных препаратов штаммов ЕРБК и ОРВК Ае.с.саарЛиз выявило одну све'торассвиващуп зону.

СпектрофотометрическиЗ анализ материала, отобранного из градиента сахарозы, показал, что для него характерен спектр поглощения, типичный для иридонцрусов: ^26с/^-'280 = 1Д8 Для

ЕРВК и 1,2 для ОРВК.

Из табл.1 видно, что наследуемое нами ЕРБК и ОРВК, выделенные из популяции Ае.с. ca3pi.ua , имею? константы седиментации 2793 г и 3021з с молекулярными массаж 893 з 1033 магз-дальтон. Те же пташы радуяного вируса комара после пассанэй на большой еощянной моли имели константы седиментации 2750 э и 3046 Б с молекулярными гессает. 884 и 1005 мегадзльтон.

Таким образом, константе седиментации у ЕРВК и ОРВК. Ае.с. сазр!из , найденных в Казахстана, значительно вниз, чем у других радузных Еирусов насекомых (КОО з - 2200 б ). БРВК к ОРВК, выделенные из популягда Аэ.с.саа?1из , пря размножении на болопоЯ всщинноЛ моет не лзмэняэт своих физияо-хигзческих свойств.

Исследования структурных белков радутаых ЕирусоЕ показа-' ли, что они отличаются друг от друга как качествеиным, так и количественнш составом. Нами обнаружено, что ЕРВК и ОРВК Ae.c.oaspius содержат 12 белков. Молекулярная касса белков ЕРВК колеблется между II ООО - 64 500, ОРВК - II200 - 66 ООО дальтон, при этом у белков ЕРВК интенсивно окрашивались три полосы, а у ОРВК - одна полоса. Молекулярная масса интенсивно окрашенных полос у первых находятся в пределах 64 500, 18 ООО и 16 ООО, а у вторых - 17 ООО дздьтон.

При изучении белков радужных вирусов, выделенных из большой еощинной моли, также выявлены 12 полипептидов. Молекулярная масса отдельных белков изменяется у обоих штаммов от 57 500 до II 200 дальтон. Основной структурный белок сосредоточен в первой зоне - 57 500 дальтон. Отмечено некоторое отличие вирусов по подашности в полиакриламидном геле отдельных полипептидов.

В обоих случаях штаммы, выделенные от основного хозяина и перекрестно зараженных насекомых, резко отличаются по основного структурному белку и содержат меньше полипептидов,чем дру-тио радужные вирусы насекомых.

Аминокислотный состав соответствующих белковых фрагментов нами проанализирован после их гидролиза в автоматическом аминокислотном анализаторе.

11&г.ш расшифрован: 17 из 20' аминокислот ра,нужных вирусов,

вьщеленних из личинок An.c.caspius , после гидролиза при Ю5°С в течение jQ^i ч

Амькоьислотныэ составы ЕРВК и СРВК, ввделенные из комаров, отличается незначительно, хотя у первых больше лизина, аргинина, аопарагигговой кислоты и валина.

В БГВК и ОРВК, пассированных на личинках большой вопцтной молк, содержатся больше лизина, асдарагиноЕой кислоты, аргинина, серина и глюгамкновой кислоты, лзйцика, валина и аляякна.

Таким образом, количество аминокислот у исследованными нами вирусов неодинаково. Оно несколько еьез у ЕРВК н ОРВК, пассированных вз большой военной моли, по сравнению с вирусзми Ае.с. c.aspiu3 ■ при определении одинаковыми методами.

В наг/их гсслэдоваигзяк все радушие вирусы комаров дала четко^выра:гагщу» реакцию прецшттгщга с актпокгороткг.'ш ЕРВК

Таблица I.

Физико-химические свойства ЕРВК и ОРВК, выделенных из различных источников

Характерно тики

| Ае.с.сазрЛиз

ЕРВК

ОРВК

в.шеНопеНа

ЕРВК I ОРВК »

Диаметр вириона, нм

Константа седиментации вириона, з20о -(7

Молекулярная масса вирио-нов, х 10ь дальтон

Количество белков в Еирионе (ПААГ)

Содержание ДНК, % Константа седиментации ДНК, ^20°

Плавучая плотность-ДНК в градиенте СэС1, г/см3

Содержание Ш-пар по плавучей плотности в

СзС1

180

2793

893

12 13,6

67,9 141,3

1,704 42,2

210 3021 1038 12

14,1

65,0 126,5

1,709

180 2750 884 12

13,2

210 3046 1005 12

14,3

67,8 64,9 140,9 126,2

1,701 1,708 50,11 41,83 49,69

Примечание: Структура ДНК в обоих случаях линейная, двухцепочная.

ле.с.еаврХав . Б этой реакции установлена идентичность радужных вирусов, изолированных из Ае.с.сазр1ив, Ае.сагиапз, Ае.£1атевсепв, Са.ашшЗ^а, Сз.тогв^авв. - С радуншми вирусами долгоножке серологически родственные отношения не выявлены.

В этой же реакции установлены антигенные связи БРЗК и ОРЕК Ае.с.саврхиа ц бОЛЬШОЙ ВОЩИННОЙ МОЛИ.

Выделенные фэнольно-детергентным методом препараты ДНК имели типичные для иуклеиноЕых кислот характеристики: минимум поглощения при 200 вм и максимум при 300 нм и содержали крупные линейные двухнитчатые молекулы.

Из табл.1 едино такне, что ДНК, выделенные из БРВХ в ОРЗК Ае.с.саврхив и больной вощинной моли, имели сходные константы седиментации ж молекулярные массы.

Полученные данные свидетельствуют о том, что по своик ёи-зино-химическим и биологическим сеойстеэм ЕНВК и ОРВК, выделенные из кровососущих комаров Ае.с.саер1ц*з и размноженные ка личинках большой вощинной моли, относятся к семейству 1п<1оу1-г1йае и роду СЫог1г1Йотг1гиз.

4. Эпизоотологическая и гистопатологическая характеристика вирусных заболеваний комаров в Казахстане

Исследуя личинки кровососущих комаров в различных ландшафтных зонах казахстанского региона, мы обратили внимание на значительное распространение в них бирюзовых и оранжевых ра- ' дукных вирусов.

Эпизоотии отмечались I Евсевне-летний период в полупостоянных, открытых, затененных годной растительностью небольших временных водоемах, часто не имеющих хозяйственного значения. Глубина таких водоемов от 15 см до 1,5 м, прогреваемость от 3 до 30°С, вода желтоватого цвета, с различной концентрацией солей. Инфицированные ЛИЧИНКИ Ае.с.сазр1ие,Ае.Б<;га-шлеи8,Ае.£1ауевсепв весной встречались с конца марта до третьей декады мая при температуре воды 4-20°С. Летом пораженные личинки обнаруживались при температуре воды 30°С.

Наблюдения за пораженными популяциями лрепмагиналъных фаз кровососов показали, что заболевание развивается чаща всего в сильно заиленных водоемах с обилием органических примесей. Инфекция регистрировалась у личинок Ae.c.caspius с признаками поражения ЕЕВК на третьей, четвертой, реже второй возрастных стадиях, а ОРВК - только на четвертой, pesa на третьей; у личинок Ae.stramineus с поранениями EFBK - на третьей и четвертей стадиях развития. Пораженные вирусом комары встречались из года в гсд в одном и том же водоема, в отдельных или смешанных популяциях, тогда как в других водоемах их на было. В крупных водоемах пораженные личинки скапливались в прибрежной части со слабым током воды, з присутствии воднобоя. В неглубок!« вненхавдих открытых водоемах они обнаруживались на всей площади. Необходимыми условиями были хорошая инсоляция и слабое зарастание водоема.

Заболевания, вызываемые ЕРВК и ОРВК, наблвдаются в раатач-ных биотопах, в некоторых случаях в предгорных местностях, вплотную примыкающих друг к другу (4-5 км) и располокенных на расстоянии до. 600 км. Основными причинами широкого распростра-нания инфекции на различных участках в пределах даже одной зоны являются, по-видимому, биологические особенности хозяина-носителя вирусов, а также экологическая приспосабляваемость вирусов к окружающей среде. .

По нашим данным, Ae.flavescena и Ae.atrsraineua гораздо реже поражаются БЕЗЕ. В водоемах близ с.АЗдарлы (Талды-Курганская область) и Кара-агач (Алма-Атинская область), где наблюдалось массовое размножение Ae.c.caspius , ЕРВд и ОЕБК в апреле-мае поражали личинок местами до 0,?3 - 3,75$. Несмотря на гибель личинок, численность третьей и четвертой стадий DI возраста оставалась высокой и колебалась от 3,33 до 100;1 всех отловленных. Наибольшая смертность (порядка 3,755$ от ЕРШ и 1% ОРВК) отмечалась на водоемах с высокой численностьв вредителя.

Аналогичное проявление эпизоотии ЬРВК (до среди ли-

чинок установлено близ о.Казахстан Алма-А*ИЕскоЗ области.

При наблвдениях за поракеиными ЕРЗХ и ОРВК популяциями личинок Ae.C.caapiua 3 Aâ.atraalnsua выявлено, ЧТО H начале апреля численность личинок весьма мала, а заразное начало,видг^о, не могат Еызвать массового заболевания. Крома того, прогревав-

мость водоемов в этот период не настолько высока, чтобы способствовать активизации вирусных эпизоотий. С третьей декады апреля водоемы прогреваются до 15°С и личинки развиваются активно. В это время экстенсивность пораasпня личинок радужным вирусом на превышает 1-3$. Дальнейшая прогреваемость водо-яыов до 20°С и понижение уровня воды До 20-25 см способствуют

быстрому развитию личинок и массовому выплоду имаго комаров. В соответствии с этим возрастает заболеваемость популяции. Наибольшее поражение приходится на первую и вторую декады мая. Вслед за массовым поранением развиваодахся особей происходит его некоторое снижение. Во второй декаде июня встречается лишь отдельные порайонные личинки. В этот период эпизоотии прекращаются, Ч2С объясняется высыханием водоемов. В пиле и августе инфицированные личинки Ае.с.caspius встречались в водоеме, образовавшемся Еследствиэ грунтовой фильтрации поливных каналов рисовых массивов, и в водоемах, возникших за счет стока после полива полей.

Зараженные особи от здоровых отличались по внешним приз-гакам. Однако необходимо помнить, что изменения и признаки могут быть сходным при разных болезнях. Наиболее очевидные и надежные признаки заражения проявляются в изменении движений насекомых и окраски их тела, размеров и Форш, поглощения пищи

2 П0ВЗД6Н1Щ.

Пораженные БР31С и 0P3IC личинки Aq.o.caapiua на четвертой возрастной стадии развития визуально отлетались от здоровых спне-зеленнк или оранжева/., пзрвховдщпм к красный.вдетом тела. При попадании на них солнечного сеотэ пораженные личинки спалезпдровали и хорошо различались в воде на темном фоне дна. При микроскопическом исследовании инфицированных особей отмечалась вздутость сегментов различных участков тела. Изменения в головкой части были незначительными, патологические признаки ярза '¡сего Ес1ро.%"злйС5 на участках с хорэпо развитым Кировым слоем. Грудная часть личинок бала окрашопа в матово-зеленый v,te оуаикогкй црз?. Аналогичная картина наблюдалась и в сегментах бротка. Лиутрекниэ органы, как правило, не просматривались. У некоторых порайонных личинок сквозь кутикулу хорошо просле-хгсеаяЕсь шфвдгоогзнние В'грусом трксогегные клетки, в основном

на трудных сегментах. Слабо инфицированные личинка свободно передвигались, хорошо переносили транспортировку, но с развитием инфекции они становились малоподвижными, пизнеспособность резко снижалась. Перед гибелью у пораженных личинок отмечалось сжатие е "гармошку" всех сегментов брюшка. С центральной стороны груди появлялись подкутикулярные изменения в виде пятен. После гибели тело личинок, пораженных ЕРВК и ОРВК,приобретало переливающийся перламутровый оттенок. Некоторые личинки на могли полностью освободиться от личиночной шкурки и погибали, не переходя в следующую стадию развития.

В дальнейшем ткани погибшей особи постепенно размягчались и расправлялись без признаков разложения. Погибашие личинки почти все время находились на дне Еодоеыа, они периодически конвульсивно подрагивали и снимались. При разрыве кутикулы из больных личивток вытекала жидкость молочного цвета.

Интенсивность поражения вирусом личинок на второй-четвертой стадиях развития была умеренной. В первые три дня от начала наблюдения у больных особей отмечалось слабое поражение. Для этой фазы заболевания типично появление голубоватой или колтоЕэтой окраски тела и незначительной утолщенности. Личинки активно,передвигались. На 6-10-й день пораненные участки тэла постепенно увеличивались, в соответствии с этим выраженность симптомов болезни возрастала на 10-16-й день. Личинки приобретали характерный сине-зеленый или оранжевый цвет п при попадании на них солнечного света сильно опалесцировалн. Теле больной личинки увеличивалось в размерах и объеме, передвижение замедлялось. С 17-го по 25-й день интенсивность поранения личинок становились максимальной. Оея pesa поднимались на поверхность воды для дыхания, слабо реагировали ва прикосновение, часто опускались на дно и, на переходя в следущуп стадию, погибали в придонном слое водоема. В этот период по сравнению со здоровыми у зараженных особей размеры тела увеличивались в 1,3 раза, хорошо была заметна утолщенкость. Цвет тела постепенно менялся от сине-зеленого или оранжевого до матового. Последние два дня личинки прекращали дагашив, находились в придонном слоэ и при прикосновении препаровальной иглы .линь вздрагивали. Затей наступала гибель. Подобные патологические картины наблвдэлись и у ищицированшпе личинок áe.otranir.sus.

Б пораженных ирлдовирусом личинках встречались и другие энтомопатогенные микроорганизмы: микрослоридага ( тьеХоЬапха орас!Ла, Тп.вгпиИ ), бактерии (С11гсш1оЪас^ег11т1 ргскЦвЛоаит, Вас.ргоЬеиа ), грибы ( Реп1сЛ111ш1 уаг1впз, 'Раес3.1огаусез уаг1о'Ы, Coelo.-2on.yces сгхЬгоэиа ).

При гистопатологическом изучении в теле пораженных ЕРВК и ОРВК личинок комаров обнаружены фельгвн-полошггельние стро-мы в цитоплазме клеток гагроЕОЙ ткани, гиподермы и вагинальных дисков.

В отличие от здоровых пораженные жировые тела почти лишены нормально® цятоплазмзтической структуры и содержат вирогэк-ные стромы, которые зэлохены в цитоплазме клетки. Эти стромы, окрашенные фельген-лолокительно, показали,присутствие ДНК. Мировое тело, пораженное радужным вирусом, увеличивается в размере. Границы его становятся хорошо заметными. В пораженном мировом теле, примыкающем к стенке кшечника, отмечаются полный гистолиз ткани, нарушение клеточной структуры, полный ка-риолизис. Участок иироЕого тела, прилегающий к кишечному тракту, подвергается наибольшему -изменению. Инфицированное нировое тело, прилегающее к гиподерме, распадается на участки, состоящие из групп клеток, отличающихся базофялией цитоплазмы и обнаруживающих просветленное ядро, нечетко видимую ядерную мембрану. Встречаются одиночные пораненные щроЕые клетки, обычно крупных размеров, с большим количеством базофилышх гранул, сосредоточенные на периферии, с множеством вакуолей. Оболочка их часто бывает поврезденной. Пораженные клетки жирового тела, собранные в группы, монно разделить на два типа: более светлые,' с меньшей зернистостью цитоплазмы и малыш размерами Свирина 44,1 мкм и длина 31,5 мкм) и крушив (ширина 63,0 мхм и длина 50,4 мкм), с большим количеством базофильных гранул. Наиболее склонными к разрушении оказались клетки первого типа: терялись межклеточные связи, разрушалась клеточная оболочка, что приводило к диссоциации ¡игрового тела.

Кроме нирового тела значительно поражается и гиподерма. У нормальных личинок комаров она представлена обычно однородным кубическим или низкоцилиндрическим эпителием, покрытым хитиновой иптшой или кутикулой. Толщина эпителия 18,9-25,2 мкм. Больную часть клетки занимает крупное круглое ядро диаметром

от 12,6 до 18,3 мкм. Глыбки хроматина распределяются до периферии ядра. Оболочка окрашивается слабо. Хитиновая интима тесно соприкасается с эпителиальными клеткам, и ее толщина гарьирует от 9,4 до 18,9 ш$м. Интима дифференцирована на два слоя. Первый, более светлоокрашенный, прилагает непосредственно "к эпителию (эндокутикула), второй - более плотный слой (эк-зокутикула). У поражённых вирусом личинок гиподерма представлена разрозненными клетками неправильной формы или ниэкоцилиз-дрическими клетками. Наблюдается отек гиподермальных клеток, проявляющийся в увеличе^ши размеров клеток, превышающих по величине гиподермы нормальные клетки в несколько раз за счет вакуолизации цитоплазмы и образования гетерогенных гранул,заполняющих рэзбухающзе клетки. Клетки не образуют единого пласта и отходят друг от друга на расстояние 63,0-94,5-113,4 мкм. Ширина клеток 31,5-50,4 мкм, высота 12,6-25,2 мкм. Еазальныв концы клеток гиподермы имеют округлую форму. Еазальные мембраны, подстилающие гиподерму, вами не обнаружены. Подстилающий слой жирового тела отсутствует, встречаются лишь одиночные скопления шгровнх клеток. Хитиновая интима имеет толщину 3,16,3 мкм, местами она отстает от эпителиальных клеток на значительное. расстояние - от 6,3 до 8й,2 мкм.. Наблвдхается уменьшение хроматина, просветление кариоплазмы. 3 цитоплазме клеток обнаруживается интенсивная базофилия.

Патологические изменения гиподермы проявляются- и в потере межклеточных связей. Эпителий становится разобщенным. Некоторая связь монду клетками сохраняется в апикальной части, которая местами сохраняет тонкий слой кутикулы.

В большинстве клэток пораженной гаподермы ядро плохо различимо из-за увеличения цитоплазмы клеток. Однзко встречаются клетки, где ядро имеет явные патологические изменения.

В имагинальннх дисках у больных личинок мы наблюдали нарушение клеточного пласта, отхоадение нлэток друг от друта, потерю пх границ. В некоторнх клетках обнаруживались дегвнора-тивное изменение ядер, исчезновение ядерных мзмбряа з структур (карисраксис и кариоллзис). В массе сильно измененных клэток встречались крупные - толстой 25,2-Я1,5 икм и высотой 44,150,5 мкм. Клетки с интенсивной базсфшпой цигоплазш дмели большое количество гранулярного воадсгва. Ядро таких клеток

не просматривалось, в некоторых случаях оно имело небольшие размеры (9,4-12,6 мим) и содержало светлую бесструктурную кариоплазму, находилось в пикнотическом состоянии. Наблвдалось нарушение базальных мембран.

В имеющихся препаратах имагшальвыв диски были пораксены мевыпэ, чем гиподерма. Наряду с нормальными клетхаш встречались крупные фельген-полояительные сферические клетки. Кх могно рассматривать как зараженные вирусом и имеющие явно паго-ыорфологичесхие признаки; для них характерны состояние мутного набухания, некроз.

На гистологических препаратах порагсешгя клеток кипечнпка, трахеи, мышечных волокон, эноцитов и малпигиевих сосудов обычно не обнаруживали. Даке в совершенно разрушенном вирусом организме ткани этих органов оставались неповренденныг.ш.

Поражения мускулатуры нами такке не установлено. Косвенно об этом свидетельствует свободное передникенке личинок при полном поражении радукными вирусам.

У личинок Ле.с.оазр1ав четвертой возрастной стадии, подвергшихся поражению бирюзовым или оранжевым радушшм вирусом комара, наблюдаются как дегенеративные, так и регенеративные формы геноцидов. Дегенерация гемоцитов характеризуется прайму-щественно изменением строения и деформацией ядер. Зернистая структура, присущая нормальному ядру, исчезает, зерна хроматина сливаются в более или менее однородную массу. Контуры ядра становятся весьма неправильными, от его поверхности отходят различной формы и величины выступы и отростки, местами сливаки щиеся подобно сети. Ворлальная округлая форма ядра исчезает, ядра становятся деух-иди грехлопостными, конусообразно вытягиваются или распадаются на отдельные крупные глыбки, на связанные между собой.

Под влиянием вируса гемолимфа подвергается более или менее заметным изменениям. В одних случаях они проявляются в Еиде распада ж разрушения гемоцитов. В ряде других случаях отмечается появление среди гемоцитов Евсьма мелких клеточных форм и большее или меньшее число штозов.

Наличие самих мелких, т.е. наиболее молодых, клеточных форм, как и энергично делящихся ядер, должно служить показателем регенеративного процесса в крови пораженной личинки. Наб-

додается большое число митозов.

Возникновение в крови регенеративного процесса, появление мелких форм гемоцигов и делящихся ядер свидетельствует о борьбе организма с Еирусиш началом, а не о прямом действии его на форменные элементы крови. Очевидно, при поражении радужным вирусом в организме личинки происходит энергичная борьба с болезнетворным началом, что отражается в виде вспышки регенеративного процесса в гемолимфе насекомого.

Описаннш изменениям подвергаются только ыикронуклеоциты. !.'экронуклеоцитн оказываются более стойкими л не вовлекаются в процесс дегенерации, так не как и при поражении ОЕВК. Фагоциты очень чутко реагирует на физиологическое состояние организма. У инфицированных особей ядро фагоцьтов теряет зернистость и окрашивается гомогенно в розовый цгет. Цитоплазма утрачивает сетчзтость, а в дальнейшем исчезают и контуры клеток.

Зноцитоиды сохраняют присущую им структуру до гибели личинок. Цитоплазма их разрыхляется. При нарастании патологиче-. ского явления наблюдается ликноз ядер. У клеток в основном ли-зируется протоплазма и начинаются дегенерация и отмирание.

Таким образом, несмотря на кажущееся многообразие клеточных элементов гемолимфы, они представлены одними и теми из основными формами: округлые гемоциты с относительно большим ядром, составляющим главную массу клеточного тела, и тонким слоем цитоплазмы (пролеикоцигы и макронуклеоцпты - молодые и нормальные), а такие с сравнительно небольшим ядром и толстым слоем цитоплазмы (микронуклоовдти); воратеноввдные гемоциты (фагоциты) и зноцитоиды.

Кроме структуры эти формы гемоцигов отличаются и разными физиологическими свойствами. Только воретеновидные гемоциты являются истинными Фагоцитами и подвергаются дегенеративным изменениям под влиянием раздетого вируса.

Процесс дегенерации форменных элементов гемолимфы, заканчивающийся в последней стадии их разрушением и распадом, на более ранних стадиях проявляется в хроматолизе или уплотнении и деформации ядра, с одной стороны, и гомогенизации или вакуолизации и распаде цитоплазмы - с другой.

Наряду с дегенеративными явлениями в гемолимфе наблюдаются и рогеноративнне, выраженные более или менее многочислен-

нши фигурами митозов и появлением мелких (модных) клеточных форм.

5... Размножение НРБК и ОРВК в различных видах насекомых

В. качестве объектов накопления радужных вирусов (БЕВК и ОРВК) Ae.c.caepias были исдользоезны лабораторные насекомые - гусеницы большой вощинной моле ( Galleria nellcraella ). тутоЕого шелкопряда ( ВотЪух аоп ), непарного шелкопряда (Porthetria dispar ), а такие другие еиды насекомых, собранных в природе.

Полученные данные свидетельствуют о том, что' ЕЕВК и ОРВК Ae.c.caspius í/.ошю накапливать в теле многих видое насекомых, заракая их инъекцией в пзмопель. Гибель гусешщ от инфекция (66,6-100$) начиналась на 9-15 день, после инъецирования, и все ззраженные насекомые погибали на стадии гусевиц.

Наблюдения над подопытными насекомыми показали, что заболевшие гусеницы задолго до гибели становились вялыми., малоподвижными, почти не реагировали-на различные- рзздражители(свет, ирикосковекке а т.д.). По мере развития болезни, на 10-12- й день, они пераотешала питаться. У гусениц непарного шелкопряда стмочамсь тенденция мигрировать вверх по растению, при этом они актквно перемещались к наружным стенкам сосудов. Пораненные гусеницы по сравнению со здоровыми, отставали в росте. Наружные их покрозы в большинстве-случаев не меняли первоначальной окраски. Прочность и эластичность покровов сохранялись да~е при длительном хранении оссбп после гибели. Разжижкения органон и специфзгчности запаха - столь характерных признаков при других заболеваниях (бактериоз, долиэдроз) - не отмечалось. Х,хя некоторых насекомых ( е.morí) при инфицировании радужным вирусом были характерны скедуюцпе признаки: неравномерная спно-ьгто-рнолетовзл пятнистая окраска и глранорно-болне пятна, види-шр сквозь кутикулы. J.'.Korao гусеницы успевай: завить тонкослойный кокон неправильней ffop.ni. Погибшие Пронины имели необычайно lev.Tjn окраску.

• При гсюгсоошечэскод? исследовании тканей погибших нэ"бко-цщ вирус обнаруживался в дэтеплагг.-г клеток игрового тела, ги~

подерме, мышечных тканях, шэлкоотделительннх железах, трахе*, альном матрикое, а raíate в стенках кишечного тракта. В этих тканях патологические изменения на блкщались в различной стадии инфекционного процесса. Пораженные участки интенсивно окрашивались по Фельгену. Возникновение и развитие вирусной инспекции в клетках происходило не сразу. В одних клетках процесс только начинался и присутствовали лишь небольшие фельген-полокителькие фокусы, другие клетки были почти полностью заполнены ими.

По мере прогрессироЕания инфекции резервные запасы ткани уменьшались, мировых вакуолей в ней оставалось меньи , обнаруживалось большое число гипертрофированных клеток и к концу процесса пораненная ткань полностью утрачивала свою структуру и разрушалась.

Патологические изменения гемолимфы изучены нами только у гусениц большой вощинной коли, наиболее часто использованных в качестве объекта накопления радужных вирусов комаров.

Картина крови после заражения в гемоцель ЕРВК претерпевает весьма характерные изменения. Увеличивается количество родоначальник и питающих клеток (микронуклеоцитоЕ) и одновременно происходят изменения внутри них. В ядре появляется зернистость, хроматин, распадается, становится в Биде глыбок,протоплазма блекнет. В отдельных случаях удавалось наблюдать полный лизис микронуклеоцитов. Иикронунлеоциты и фагоциты почти полностью исчезают. Наряду с этими формами гемоцитов часто встречаются клетки на разных стадиях деления. Много такке клеток с компактными, интенсивно окрашенными ядрами неправильной формы. В некоторых гемоцитах ядра смещены к периферии. Па стадии гибели ядро иногда выпадало из клетки вследствие разрыва цитоплазмы. Фагоцитоидн депортируются, ядра в них становятся прозрачными.

Изучена возможность заражения ЕРВК, пассированным через гусениц большой вощинной моли ( G.meiioneiia), насекомых,принадлежащих к разным семействам отряда чешуекрылых (bepidoptera), жесткокрылых ( Coleóptera ) и перепончатокрылых (Hynenoptera).

Получены достоверные данные (табл.2), что гусоницы-кра-иивницы (300 особей), коконопряда (250 и 280), яблоневой моли (100) и дубовой листовертки (100) резистентны к БРВК. lia 7-I0íi

Таблица 2

Заракаеыосгь БРШ и ОРВК гусениц различных насеноыых

( Ияо~ /Кол-во {Кол-во.'Дни гибели \% гибе-Виды насекомых | ьу» 1» "

I (опыте ¡вируса!ло !нец |виРУса

Оа11ег1а те!1о-пе11а

ЕошЪух в: >П

Рог1;11е1:г1а с11зраг

Иатезйга рас!

11ап.о1егасае

Сазй^орасЬа gцeгcirolia

СеХегхо сеп1;га1-аэ1ае

ТепеЪхао ¡аоЦ-иог

Ьео^Хпс^арза ¿есещНпеоЛа

АдрЫпеНоп

Адрп. ьо11

8111;1а118

ЬазреигезХа рог.оаеНа

Ху1осора у!о!асае Уапезэа игЫсае

МоХасоэола поиеЪгХа

¿¡аХ.саз-ггепэе

ррауя1*и±а гтХА^пехлиз

Гог^Лх Уаг1аала

БРШ 2977 2609 10-15 18-20 87,6

ОРЕК 3850 3675 12-15 22-30 55,4

БРШ 600 502 9 21 76,0

ОРЕК 500 450 II 22 90,0

БРБК 218 174 12 21 79,8

БРШ 65 65 12 20 100

БРШ 85 85 12 22 100

БРШ 50 50 12 35 100

БРШ 150 150 II 25 100

БРШ 300 200 14 28 66,6

БРБК 2.00 200 14 26 . 100

БРШ 40 40 12 24 100

БРШ 48 48 14 28 100

БРШ 30 30 15 28 100

БРШ .300 - - - 0,0

БРБК 250 - - - 0,0

БРВК 280 - - - 0,0

БРШ 100 - - - 0,0

БРШ 100 — - - 0,0

день после заражения все гусеницы превратились в имаго. К БЕВК оказались восприимчивыми два вида совок (65 и 85 особей), иво-еого шелкопряда (50), бражника (150), мучного хрущака (300), колорадского жука (200), июньского яука.(40), плодожорки (48) и пчел (30). У всех инфицированных тусениц инфекция развивалась в течение 12-ти и 30-ти дней после заражения. Размноке-ние вируса в организме сопровондалось вялостью, снижением под-еякносги, отсутствием аппетита, в некоторых случаях наблюдался паралич. От Есех погибших гусениц выделен ЕНВК.

Таким образом, нами установлено, что радунные вирусы комаров поражают иирокий круг насекомых и способны накапливаться в них до значительных титров. Эти данные весьма ваяны не только в теоретическом, но и в практическом плане. С одной стороны, они предоставляют возможность сравнительного изучения биологических и физико-химических сеойств вирусов, размнокающихся в разных типах хозяев, с другой - повышают эффективность применения БЕВК в борьбе о вредными насекомыми.

6. Культивирование ЕНВК и ОЕВК в культуре клеток насекомых

В наших исследованиях были использованы перевиваемые культуры клеток табачной совки ( Euxoa scandena ), попарного (SCLd -135) и дубового шелкопрядов ( ЫС-Ар-1), прошэдппх свыше 80200 пассакей в Институте молекулярной биологии и генетики АЕ Украины.

Eat,и показано, что перевиваемые линии клеток непарного шелкопряда восприимчивы к оранжевому радужному вирусу комара Ae.o.caspius . Через 24 ч после заразоты появлялось большое количество клеток с очагами пораконнй, сильно внраяанноЗ ЦПД с образованием Епрогенной строш в цитоплазме клеток. Через 48 ч возникали виропласгы с гранулярным внутренним содержанием. На явно пораженных клетках наблюдались многочисленные выросты клеточной мембраны, структура цитоплазмы принимала азурннй вод. В интенсивно инфицированных и даго разрузенчнх клетках ядра оставались целыми, хотя и отмечалась группировка ядрыэек на периферии ш в центре ядра. Ядра в зара^еннпс клет~, ках клетках бнлл больше (14-21 адм), чем в нззарзглнкых (8,7-10,5 ют.»).

На 3-4-5-в сутки возникал! двухядерные клетки, происходи-' ли их деструктивкяе изменения, они вакуолизировались, увеличивалась дольчатость ядрышка, появлялось большое количество -пино-дитозных вакуолей в цитоплазме. Все это указывает на повышение клеточного метаболизма как начальную реакцию культуры на вирусную инфекцию.

Вскоре после формирования вирусной стромы клетки начинали распадаться путем отпочковывания плазматической мембраны, что характерно для заражения радукннш вирусами.

ОИЖ Ае.с.саар5_из оказался способным размножаться и в монослойной культуре клеток дубового шелкопряда. Через 23 ч после заражения среди морфологически неизмененных клеток отчетливо проявлялись округло-удлиненные клетки более темного цвета. Подавляющее большинство таких клеток имело большие размеры. Через 48 ч часть этих клеток превратилась в ДЕухядерные. В отдельных местах клеточного пласта дегенерированных клеток форли-.роваллсь цитоплазмзтическме отростки в виде "ежа" и наблюдалось отхождение цитоплазмы с эррозироваиными краями от ядра. Единичные измененные клетки были разбросаны по всему клеточному пласту или же образовывали небольшое скопление из 4-15 клеток. По мере нарастания (после 96 ч) степени дегенерации культуры клетки росли и начиналось разрушение цитоплазматических отростков. Округление клеток, образование цитоплазматических отростков и открепление от субстрата можно считать основными признаками цитопатического эффекта радужного вируса комара, заражающего клетки дубового шелкопряда.

ОРВК Ае.с.сапр1из размножался также в клетках культуры табачной совки. Первые признаки дегенерации клеток были отмечены через су-гки после инфицирования культуры. Клетки под СЕе-тсвым микроскопом стэноешшсь более контрастными. Через 48 ч в отдельных местах клеточного пласта дагенерированные клетки •л цитоплаачагичбские их отростки формировали вытянутые сетчатке фигуры. В перинуклеарных участках цитоплазан наблвдались эозинофильккэ включения, сама цитоплазма была резко Еакуолизи-ровакз. Увеличивалось и количество внутрицитоплааматических включений, эозинсфильность которых проявлялась отчетливо, " включения более крупных размеров имели сильно выраженные кон-

туры и были окрашены слабоокрашенной полосой цитоплазмы. У де-генерироЕанннх клеток отмечались длинные, неправильной формы, тонкие цитоплазматические отростки. После 96-120 ч появлялись признаки нарушения целостности клеточного пласта, образовывались островки из детенерированных клеток, множество клеточных элементов распадалось. Б некоторых пораженных клетках ядра перемещались к периферии. Большинство клеток обладало шероховатой зубчатой поверхностью, некоторые из них были удлиненной формы с многочисленными ворсинками.

К 168 ч инфекция наибольшее количество электронно-плотных вирионов ОРЗЕ Ае.о.саар1ив сконцентрировалось в межклеточном пространстве.

При заражении Т-ЕРВК Ае.с.оазраиз культуры клеток колорадского яука ( ¿ерт1по1агза decemlineata ) ГЭКЯе бЫЛИ обнару-кекы признаки специфического поранения. Через 60-72 ч монослой начал разшхляться, происходило слияние клеток, образовывались "комки", появилось большое количество клеток с сильно вырааен-ной вакуолизацией. На 4-5-е сутки отслаивались клетки от стекла, на 6-ТО-е сутки кудьтурн полностью лизировались. Множество клеток разрушлось, освободив вирусный материал. Большинство неразрушенных клеток с увеличенным ядром и сильно Еа-куолизированной цитоплазмой содержали многочисленные очаги поранения двух видов: I) окрашенные фокусы, соответствующие мес-, там скопления вирусного материала и находящиеся внутри клетки в цитоплазме; 2) подобные фокусы, в большом количестве разметающиеся ва периферии клетки, у клеточной мембраны или в многочисленных ее выростах. Указанные клетки имели вид "ежа", при эт^м ядра не разрушались, хотя и наблвдалаоь перегруппировка хроматина, который зачастую располагался на периферии ядра.

Таким образом, полученные нами данные однозначно указывают на активное размножение радужных вирусов БРВК и ОРВКАе. с.сазргиз в перевиваемых культурах клеток табачной совки, колорадского нука, непарного и дубового шелкопрядов.

Кагдый из использоваЕннх видов клеток отвечал на заражение вирусов специфическим типом реакции: приобретение формы "ека" (Ап.регцуа, L.decemliaeata ), удлинение с множеством ворсинок ( й.эсапсЗепа) и ПОЯВЛ6ВИ9 ажурНОЙ цнтоплаЗКы( Р.ЗХзраг).

7. Лабораторнне и полевые испытания БРВК и ОРВК на личинках комаров и других гвдробионтов

Лабораторные и полевые испытания ЕРВК и ОРВК еыяеили ряд закономерностей.

Установлено, что добавление е корм суспензий из 10 растертых трупов Ае.с.caspias , погибших от ЕРВК и ОРВК, Еызывзет гибель личинок Ae.c.dorsalis Е 29,5-7,5$ случаеЕ, Ае.detritus

- В 29,0-3,0$, Ae.flavescena— Е 9,5-1,3$, Ae.casachsfcanicus

- В 3,0$, Ae.leucomelas _ j 18,0-3,0$, Ae.montshadskyi - в 5,05?, Ae.cinereus - е 9,0-7,5$, Ae.simanini - е 5,0-7,0$, Ае. stramineus - Е 39,0-18,6$, Ae.vexans- Е 30,0-6,0$, Ae.aegypti

- В 6,0-4,3$, Culiseta alaskaensis - в 8.0-3,5$,Cs.lonciareolata

- в 5,5-1,5$ и Ur.unguiculata - е 10;5-8,5$. При этом наиболее чувствительными оказались личинки первой и еторой стадии Еозраста. Процент заболевания от БРВК в третьей стадии Еозрас-та у Ae.c.caspius составлял 11,0$, у'Ae.c.dorsalis - 10,5$, Ae.flavescens — 2,0$, Ae.caaachetanicua - 4,0$, Ae.leucomelas

- 5,0$, Ae.simanini _ 1,0$; от ОРВК у Ae.c.caspius, .Ae.simanini

- лишь 1,5-2,5$; у остальных видов комаров заболевания не отмечено. Все личинки кроме Ae.c.dorsalis (гибель от ЕРВК - 2,0$) оказались устойчивыми к иридовирусам в четвертой стадии развития.

Более отдаленные виды комаров: Cx.modestus, Cx.molestus • Cx.pipiena, An.maculipeimia и Anh.yrcan.ua - оказались невосприимчивыми к БРБК л ОРВК во всех возрастных стадиях.

Изучение зависимости инфекции от доз гирусов проводилось На ЛИЧИВКах рода Aedes- Ae.c.caspius, Ae.c.dorsalia, Ае. flavescena, Ae.stramineuB Ае.detritus . Обнаружено, что при дозе 5 суспендированных личинок комаров от ЕРВК погибало 1,6+0,9-15,6+0,9-15,6+0,92, а от ОРВК - 1,3+0,8-2,6+0,4$ рода Aedes . По мере увеличения дозы процент гибели личинок возрастал. При 10 суспендированных личинках он равнялся 3,6+0,4-37,6+1,2$ (БРВК) и 1,3+0,8-33,0+0,3$ (ОРВК); при 15 растертых личинках - 3,6±0,7-46,5+I,2$ (ЕРВК) и 1,6+0,8-Г7,3+2,3$ (ОРВК). Наибольшая гибель личинок наблвдалась при заражении 20 суспендированными личинками. При такой дозе смертность ли-

ЧИНОК Ae.atraraineua, Aa.c.caspius.Ae.c.dorsalis составляла от ЕРВК 52,3+1,2 - 48,3+0,9 - 41,3+1,255 и от ОРВК - 2,6+0,7 -14,6+1,5 - 15,6+3,6$.

ЛичинкиAe.fiayegcens, Ае.detritus оказались менее чувствительными к этим дозам, их гибель не превышала 9,3+1,0 и 5,3+0,7$.

Проведены лабораторные испытания путей заражения личинок. Показано, что личинки комаров не заражаются контактным путем. Инфицирование происходит алиментарно, т.е. при поедании "ин-тактных" трупиков. Очевидно, что и в природе часть погибших от иридовирусов личинок поедается здоровыми особями. Такие особи могут заболеть и стать источниками заражения.

Полевые опыты по искусственному зараяению массовых видое комаров проводились в Еыкопанных вблизи водоемов специальных шах диаметром 50 см, глубиной 30-40 см, заполняемых грунтовой водой на 20 см.

В ямы-копанки, заселенные личинками комаров первой и второй стадий возраста (плотность 3000-4000 особей), вносили ин-тактныэ и растертые, поразхенные ЕРВК личинки. Смертность личинок Ае.с.caspiua была Еьлие в той группе, в корм которой добавляли нерастертые личинки (7,3+0,3 - 19,0+1,1 против 1,6+0,4 -6,3+0,7$).

Аналогичнш способов исследовалось действие ОРВК. Его инсектицидные свойства также варьировали в зависимости от характера инфекционного, материала. Личинки Ае.с.сазр1из оказались наиболее восприимчивыми к ивтактноку материалу, т.е. к нераэ-руиенным больным личинкам (2,3+0,7 - 3,6+0,4$).

Необходимо было выяснить, как долго вирус монет сохранять свою инфенционность в естественных условиях, т.е. в веде или почве. Гш изучали степень сохранения шфекционности вируса в воде, взятой из естественного водоема, и прокипяченной.

Частота заболевания личинок Ae.c.caspius , внесенных в испытуемые образцы вод, уменьшалась с увеличением продолжительности хранения после заражения вирусом. БРВК, внесенный в прокипяченную воду, снизил инфешщонвость за 4 дня на 13,3+0,-1,3±0,9.$, ОРВК - на 6,0+1,15 - 2fCfcÍt2j5. В обнчвой, некипяченой воде ЕРВК л ОРЗК оставались звфекцпонЕШи значительно дольше и вызывали заражение спустя в дней.

Представляло интерес изучение сохранения вирулентности ЕРВК и ОРВК в затопленной почве. В этом случае БРВК и ОРВК сохраняли инфекционнооть для личинок комаров (1,2 и 2,0^)- в течение 30 мин, через 20 ч после опрыскивания вирусом почвенный материал инфекционностью не обладал.

Аналогичные закономерности инфекции в полевых условиях были характерны для БРВК и ОРВК, выделенных из большой вощинной моли.

Считается, что в естественных условиях радуяным вирусом могут заражаться не только гавкв омаров, но и другие гидро-биокты, оказывающиеся е одном биоценозе с личинками кровососущих двукрылых. В связи с этим мы предприняли ряд экспериментов по определению зараженности БРВК и ОРВК различных гвдробионтов.

Было исполь30E2S0 15 видов гвдробионтов: личиноядные рыбы, личинки хирономвд, мокрецов, нука-плаЕунца, стрекоз и коретра

- ChaoboruG sp. , а также дафнии, циклопы, гидры, олигохеты -

- Aclosoaa , два вида пресноьодных нематод, инфузории - stylo-nichia, J?ara2iaec.iu;n И Artemia salina.

Презде всего предстояло выяснить, восприимчивы ли выбранные нами гидробионти к ЕРВК и ОРВК, т.е. способен ли вирус развиваться в столь отдаленных в систематическом отношении организмах.

Исследуемых особей в течение месяца кормили 30-100 пораженными вирусом личинками.

Рыбаш (амурский чебачок. иедака, серебряный карась) были сведены почти все живые личинки комаров, пораненные иридовиру-саж. В поведении рыб, содержащихся е опытных аквариумах, никаких отклонений от нормы не наблюдалось, гибель их не отмеча-лесь, патологических изменений во внутренних органах не обнаружено.

Нами были зэракены ЗЯ5 личинок мокрецов (из рода Culicoidos), обловленных в природе. Наблюдения проводились 20 дней. Все личинки превратились в имаго. Исследовалась возможность зара-кепкя ЕРВК и- ОРЗК личичик хироногящ ( сьлгспоти.з ар j. Почти все 6<"iG ззратанны^ лйчинок вэ 24—^ день после зэрпаенпя превратились _вс взрослых особей. Не погибли 120 личинок '.кука-згн-В/НЦо ( сем. Duticidas ) и два Езда стрекоз IceM.üoenogrionidae).

зараженных суспензиями и живши пораженными личинками. Б гемолимфе этих насекомых не выявлено фельген-полокитяльных образований.

На подверглись инфекции и другие гидробионты (Daphnia nag-na, Cuolopa sp., Axtemia salina, Stylonichia mytillig, Paramae-cium caudatusi, Hudra fusca, Aelosoma sp), которые на 72 Ч помещались Ео ЕЗЕесь БРВК и ОРВК, в которую затем добавляли растертые трупы 15-20 пораженных комаров. БРВК и ОРВК, выделенные от больных личинок ле.с.саврхиз и пассированные на личинках большей вощинной моли ( G.mellonella), вызвали летальную инфекцию личинок коретры (Chaoborus sp.). -Все личинки (200),пораженные радугным вирусом, были темно-синего цвета. У них отчетливо наблюдалось небольшое вздутие сегментов груди и брюшка с едЕа заметными пятнами белого цвета. Внутренние органы, как правило, не тзосматриЕалпсь. Хабры и голова были беловатого мутного цвета. Личинки мало двигались. Они все время находились на поверхности воды в горизонтальном положении. На внешние раздражители реагировали слабо. Пораженные личинки погибали, не окукливаясь. Вылет имаго из клинически больных куколок не происходил. Гибель экспериментально зараженных личинок наблюдалась с 15-го дня заражения, но наибольший процент отмечался с 20-го по 25-й день.

Гистологическая картина характеризуется изменением жирового тела и клеток гиподермы. Отдельные их дольки гипертрофируются, тогда как другие уплотняются. Они становятся фельген-гтолонительными. Граница мировых клеток просматривается плохо. В мышечных пучках более заметна поперечная исчерченность, в грахеальных пространствах отмечается скопление творопистой лассы. Все эти изменения наблюдались перед гибелью личинок коретры ( Chaoborus ср.). Из-всех погибших от БРВК и ОРВК личинок был выделен вирусный осадок с переливающимися оттенками.

Таким образом, радужные вирусы (ЕРВК и ОРВК) способны вызвать гибель личинок кровососущих комаров рода Aedea (12 еидое), ¡Uliseta (2 вида),Uranotaenia (I вид) и некроЕОСОСущих ко-!аров - коретры (chaoborus sp. ). Для комаров рода culex (3 еи-w) и Anopheles (2-вида), некоторых личинкоядных рыб (3 вида) ! других гидробионтоЕ (II видов) вирус не инфекционен. Личинки :омаров заражаются ЕРВК и ОРВК перорально, и это, очевидно,паи-

более вероятная форма инфицирования и распространения в естественных условиях. Источником патогенного фактора при этом служат больные личинки того или иного вида кровососуших комаров, другим источником инфицирования могут быть заразившиеся, но не проявившие еще симптомов болезни личинки, которые обеспечивают новые вспышки зпизоотий. Установлено, что процент гибели насекомых зависит от дозы вносимого патогена и стадий развития личинок. Вирус оказался инфекционным через 4 дня в прокипяченой воде и через б дней в природной воде, однако утратил инфекцион-ность после задерживания в почве более 10 ч. Особо надо отметить, что БРЕК и ОРЕК, накопленные на личинках большой вощинной моли ( G.nellonella ), инфицировали личинок кровососущих комаров рода Aedes.

ВЫВОДЫ

1. В Казахстане впервые на территории Евразии нами обнаружены радужные вирусы комаров. Проведен подробный анализ физико-химических и биологических свойств выделенных штаммов. На основании полученных результатов идентифицированы два вида вирусов комаров - оранжевый (ОРВЮ и бирюзовый (ЕРШ). Они отнесены к семейству Iridoviridae Р°ДУ Chloriridorirus.

2. Установлено, что иридовирусные инфекции кровососуших комаров наиболее распространены на иго-востоке Казахстана, отличающегося от всех обследованных регионов широко развитой сетью постоянных и временных водоемов, теплым климатом, богатой водной растительностью.

3. Изучена штаммоспецифичность радужных вирусов комаров. Вирусы, выделенные от комаров'. де.с.caspias , оказались серологически родственными с радужными вирусами Ae.cantans и Culiseta moraltane, но отличались ОТ вирусов Típula paludosa.

4. Исследованы физико-химические свойства субвирусных компонентов выделенным штаммов. Установлено, что оба вируса содержат по 12 белков с молекулярной массой II000-64500 Д (ЕРБК) и II000-66000 Д (0РВЮ. ДНК этих вирусов обладает некоторыми различиями: у БРВК она седиментирует при 67,9 s имеет молекулярную массу 141,3 вД, плавучую плотность в CsCl 1,704 г/см3, содержит 49,69 ГЦ-пар, а у ОРВК седиментирует при 65,0 s имеет, молекулярную массу 143,3 кД, плавучую плотность в CsCl 1,7 г/см3, содержит 50,11 ГЦ-пар.

5. Выявлено, что ОРВК и ЕРВК помимо основного хозяина способны размножаться в 14 видах чешуекрылых, жесткокрылых, перепончатокрылых, 12 гидах Aedes, 2 видах Culiaeta , I вида Uranotaenia и Chaoborua эр. Гибель насекомых наступает на 12-30-й день после заражения при температуре 18-29°С.

G. Лабораторные и полевке эксперименты по заражении кровососущих комаров показали, что наиболее восприимчивы к радужному вирусу комаров личинки первого и второго возраста^ реже третьего. Максимальная гибель личинок комаров в эксперименте не превышала 59,0$. Вирус обладает высокой специфичностью для личинок кровососущих комаров.

7. Проведены гистопатологические исследования различных органов клеток n&teKfiWHjíj зараженных ОРВК и ЕРВК. Обнаружено, что Еирусы поражают клетки яироЕого тела, гиподермы, трахеи, мышц, шелкоотделительных желез и имагиналыгых дисков, вызывают увеличение инфицированных клеток, гипертрофию клеточных ядер, а также фрагментации и полное исчезновение цитоплазмы.

8. Изучаемые вирусы размножаются в культурах клеток насекомых Antheraea pernyi, Euxoa acandena, Lumantria diapar И Leptinotaraa decealineata.

Вирусы хорошо сохраняются в 50^ глицерине и в жидком азоте; они нечувствительны к эфиру и хлороформ ; инфзкциовность вируса в воде сохраняется в течение 5 дней, а в почве - 48 ч.

9. Показано, что к ОРВК л ЕРВК невосприимчивы некоторые виды простейших — ¿aramaeciua caudatum Ii Stylonichia muttllia, ракообразных - Daphnia ma^na, Cuclops sp. к Artemia salina, черЕОЙ - Hydra fusca if Aelosoaa sp.; членистоногих An.hjrca-пиз, Ar..naculipennia, Cx.modeatus," Cx.molestus, Cx.plpiena, ¡.ial.neustria, Mal.castrense kirghisicas, Tortrix vlridana, ï.na-llineiiua, Van.urticaa, два веда стрекоз, жук-плавунец, мокрецы и хпрономиды, личинкояднш ркбы - Carasaitia aur3tu3 gebello, Orizias latipea"Ï Pseudorasbora parva.

10. Способность ОРВК и ЕРВК с высокой эффективностью поражать многие егды кровососущих комаров, возможность накопления достаточной би.омассы Езрусов в личинках восприимчивых насекомых и культура клеток позволяет использовать эти вирусы для снижения численности комаров в естественных условиях.

II. Для подкармливания комаров вирусом рекомендуется использовать наслоение больных или мертвых личинок на поверхность воды в специальных яыах-копаннах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Радужный вирус у кровососущих комаров на юго-востоке Казахстана //Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана. -1Э71. К I?.- С.101—102 (Соавт. Дубицки® A.M.).

2. Возбудители микробных заболеваний кровососущих комаров //Регуляторы численности гнуса на югс-Еостоке Казахстана.

- Алма-Ата, 1973. - С.5-10 (Созет. Данебеков А.Е. и др.).

3. Гистологическая диагностика радужного вируса комара //Тез.докл.3-й научко-георетич.конф. молодых ученых АН Р^зССР.

- Алма-Ата, 1974, Л II. - С.166.

4. Размножение радужного вируса комара в гусеницах тутс-еого шелкопряда ( ВотЪух morí ь. ) //Тез.докл. 1-й Всесоюзн. научн.конф. "Микробиологические методы защиты растений". - . Кишинев, 1976. - С.151.

5. Культивирование радужного вируса комара в личинках большой вощинной моли //Биологически активные вещества микроорганизмов. - Алма-Ата, 1977.- С.167-171 (Соэет. Канюка В.Ю.)..

6. Гистопатология личинок Aedes stramineus , пораненных р&дуяннм вирусом комара (РБК) //Известия АН КазССР, Сер. биол. - I860.— В 5.- G.36-40.

7. Обнаружение оранжевого вируса комара (ОРВК) Aedes caspiuü oacpiun на юго-Еостоке Казахстана //Вестник AR КазССР. - 1930.- Я 7.- 0.68-70.

8. Встречаемость некоторых патогенов у компонентов гнуса в отрогах Тянь-ЙЭЕя./УДеп. в КазВИШТИ.- 1981. - № 6.- С.116 (Соавт. Девченко Н.Г.).

9. Микроорганизмы некоторых гидробионтов в местах выплода гнуса в аридной зопо Казахстана.//Деп. в КазЗИНИТИ.- 1981,-

£ 7, В 17 (Соавт. Левченко Н.Г.).

.10. О создании искусственных очагсв энтомопатогена кома-, ров в природе //-Д5П. в КазБЛЖТИ.- 1901,- £ 7. IIS (Соавт. Левченко Я.Г.).

11. Микроорганизмы компонентов гнуса в аридной зоне -Казахстане.// - Деп. в КазВИНИТИ. - 1Уа1. Ji 6116 ( Соавт. Левченко H.i.'. ).

12. Обнаружение энтомопатогенов у мошек в аридной зоне Казахстана.// - Деп. в КазВИНИТИ. - 1961. - № 6117 ( Соавт. Левченло Н.Г. ).

13. Восприимчивость личинок комаров к бирюзовому рапуа-ному вирусу комара (БРВК) // Тез.докл.конф.вирусологов Казахстана. - Алма Ата, 1962. - С. ¿47-248.

14. О смешанных заболеваниях личинок кровососущих комаров // Там же. - С. 247-248 (Соавт.Левченко Н.Г. и др.).

15. Инфицирование бирюзовым радужным вирусом комара(БРВК) различных беспозвоночных /Дез.докл. 1-й Респ.научн.конф. "Патология членистоногих и биологические средства борьбы с вредными организмами". - Канев(Украина), 1982. - С. 240.

16. Инфицирование некоторых двукрылых насекомых вирусом денсонуоеоза комара Aedes aegypti L. // Там хе,- С.240-241.

17. К фауне микроспоридии гидробионтов Казахстана //Там же.

- С. 241-242.

1Ь. Размножение радугшьш вирусов комара Aedes caspius сазр1из в гусеницах непарного шелкопряда Porthetria dispar // Тез.докл. 4-й Нац.конф. по паразитологии. - Варна(Болгария). 1983. - С. I20-I2I.

19. Применение энтомопатогенных микроорганизмов в природной популяции против комаров //-Деп. в КазВИНИТИ. - 1983.

- № 2601-ЬЗ.

20. Discovery of orange iridescent virus of mosquitoes in the larvae of Aedes сазр1из caspiu3 in the south-eastern parts of Kazakhstan // Bibliography on pathogens of medically important Arthropods. (V.H.O. Organisation mondiale della Sante, 1981. Geneva. - 1983. - VBC/83.1. - P. 17.

21. Histopathology of Aedes stramineua larvae infected

by iridescent virus of mosquitoes for natural control animal al pesta // I bid. - P. 17.

22. Обнаружение бирвзового радужного вируса комаров на севере Казахстана //Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана. - 1964.- 4. - С.49-51 (Совт. Рахиыбаева К.Т.).

23. Изучение сохраняемости активности энтомопатогенных микроорганизмов при длительном хранении //-Деп. в КазВЙШТИ.

- I960. - » 3679 - 65.

24. Инфицирование личинок комаров иридовирусом, пассирова ныы ча личинках большой вощинной моли // Макромалекулы клеток и вирусов. - Киев, I960. - С. II9-I20.

25. Использование энтомопатогенных микроорганизмов в борьбе с капустной белянкой //Тез.доклЪсесоюзн.конф. "Пути совершенствования микробиологической борьбы с вредными насекомыми и болезнями растений". - Оболенск, 19ЬЬ. - С. bl-ó¿¡. (Соавт. Макаяанова Х.К.).

2d. Изучение гемолимфы Aedes caspius caspiu3 при поражении радужным вирусом //Кровососущие двукрылые и юс контроль. - 1., 1987. - C.I29-I3Q.

27. Вирусы насекомых // Знание и труд. - 1967. - Jf> b.

- С. 30-31.

20. Эксперименты по зарахенио бирюзовым радужным вирусом личинок кровососущих комаров // Вестник сельскохозяйственной неуки Казахстана. - I9B7. II. - С.74-77.

29. Репродукция бирюзового и оранжевого радужных вирусов комара Aedes caspius caspius в гусеницах тутового шелкопряда Bombyx mori //Микробиологический журнал. - 1988. - Вып. 3,

* 60. - С. 88-92.

30. Заражение культуры клеток непарного шелкопряда Рогthe tria dispar иридовирусоы комара Aedes caspiuo caspius //Вопросы вирусологии. - 1969. - № 5. - С.ЬОЗ-ЬОЬ.

31.Распространение радужных вирусов комара Aedes caopius caspius ш юго-востоке Казахстана //Использование новых микроб-

ных препаратов в народном хозяйстве. - Алма-Ата, 1989.

- G. bó-90.

32. Изучение воздействия вируса насекомых на некоторые виды личинкоядных рыб // Там же. - С. III—113 (Соавт. Абдиль-даев М.).

33. Заражение культуры клеток насекомых радужным вирусом комара //Вирусы и вирусные заболевания. - Киев, 1990. - № 18.

- С. 91-93.

34. Штаым: бирюзовый радужный вирус комара (БРВК) ¿dea caspius caspias. Депонирован в Институте вирусологии им.Д.И. Ивановского ЫЗ РФ ГКВ » 2202.

35. Штаым: оранжевый радужный вирус комара (ОРВК) Aedes caspias caapiua. Депонирован в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ ГКВ » 2203.