Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Радиомодифицирующие свойства тяжелой воды при острой и отдаленной лучевой патологии животных

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Радиомодифицирующие свойства тяжелой воды при острой и отдаленной лучевой патологии животных"

РГБ ОД

-' июн. г^

На правах рукописи

¿У£) /Уел^у;^ ЛсО-ОЮ

Е К И М О В А

Людмила Петровна

РЛДИОМОДИФИЦИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ТЯЖЕЛОЙ ВОДЫ ПРИ ОСТРОЙ И ОТДАЛЕННОЙ ЛУЧЕВОЙ ПАТОЛОГИИ

ЖИВОТНЫХ

Специальность: 03.00.01. - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1999

Работа выполнена в Центральном научно-исслгдователоском рентгомо-радиояогическом институте Министерство Здравоохранения РФ Научный руководитель: доктор медицинских наук,

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Бутомо Николай Викторович Доктор биологических наук, профессор Комов Вадим Петрович

институт экспериментальной медицины РАМН

Защита диссертации состоится" я C<hp-f/>4 2000 г. в_

часов на заседании Диссертационного соаета в Центральном научно-исследовательском рентгено-радиологическом институте МЗ РФ (189646, Песочный -2 , ул.Ленинградская, 70/4 ) С диссертацией можно ознакомиться в библиотека института.

Автореферат разослан * ¿9 »

Ученый секретарь Диссертационного совета

профессор А.Н.Шутко Научный консультант: доктор медицинских наук

Н.Н.Шатинина

Ведущая организация: Научно-исследовательский

Л.И.Корытова

Актуальность исследования.

Среди средств модификации острой лучевой болезни (ОЛБ) наиболее чистыми с точки зрения экологии организма являются методы физической модификации, так как они не сопряжены с введением в организм каких-либо дополнительных факторов биологического происхождения (костный мозг здорового донора, различные биостимуляторы) или химических веществ (аминотиолы, индолилалкиламины, инертные газы с целью создания гипоксии в тканях и т.д.). Однако модификация ОЛБ такими известными "физическими" факторами как холод или иммобилизация сопряжена с утратой физической и социальной активности защищаемого объекта. В конечном итоге подобные варианты физической модификации, во многом неопределенны по механизму биологической реализации, так же как и действие многих химических модификаторов (Вартанян Л.П., 1998). Наиболее интересным подходом в области физической модификации радиочувствительности представляется изотопное замещение части легкой воды организма на тяжелую, поскольку механизм физического действия дейтерия (О) на молекулярном уровне предельно прост: водородная связь в макромолекулах с дейтерием прочнее, и в силу этого вторичная структура всех макромолекул (нуклеиновых кислот, белков и особенно ферментов) в "дейтерированном" организме более устойчива. Обмен О - Н происходит быстро и равномерно во всем организме по легкообмениваемым связям групп -ЭН, -ОН, -Г\1Н2, обратное замещение происходит также полно, быстро и без последствий.(Шутко А.Н.,1967; Шутко А.Н., Шатинина Н.Н.,1972). Принципиально важным является то обстоятельство, что при изотопном замещении химический состав субстанций и сред организма не изменяется. Вместе с тем производимые дейтерием на молекулярном

уровне изменения равносильны замедлению "биологических часов", и, следовательно, могут обеспечивать феномены протекции. Побочные негативные следствия такого замещения на клеточных моделях проявляются в виде радиосенсибилизации с фактором изменения дозы (ФИД~4,5), но только при практически полном • замещении протия на-дейтерий в среде (Веп-Ниг Е., ^кНэ Е., 1980; Веп-Ниг Е. е! а1.,1980).

Исходя из изложенного, целью работы явилось изучение возможностей физической радиопротекции путем частичного изменения изотопного состава водорода в организме с использованием тяжелой воды 02О.

Задачи исследования.

1. Разработать методику применения 020 в. качестве физического протектора.

2. Оценить протективные свойства 020 при острой лучевой болезни с учетом наиболее распространенных ее синдромов и возраста животных.

3. Оценить протективные свойства й20 по критерию радиогенной лейкемизации у мышей, перенесших острую лучевую болезнь.

4. Выявить основные механизмы развития феноменов протекции, их возрастные особенности.

Научная новизна.

- Впервые представлены доказательства того, что в период изотопного замещения протия на дейтерий в организме сокращается общий объем синтеза нуклеиновых кислот и замедляется их катаболизм преимущественно в тканях с быстрым темпом клеточного обновления; ">- - впервые продемонстрирована избирательность протекгивного действия изотопного замещения только при костномозговой форме острой лучевой болезни, вызванной облучением в ЛД > 50/30;

- впервые обоснована возможность эффективной защиты дейтерием от рентгеновского излучения не только в режиме однократного, но и фракционированного воздействия;

- впервые обнаружено, что среди переживших ОЛБ защищенных дейтерием животных лейкозогенное действие радиации в отдаленном периоде проявляется в меньшей степени;

- впервые показана зависимость проявления лейкозогенного действия радиации от состояния пролиферативной активности органов лимфопоэза в момент облучения.

Научно-практическая значимость.

Результаты исследования пополняют существующий узкий список протекторов, действующих на физической основе, качественно новой .их разновидностью - изотопным протектором. Полученные количественные параметры концентрации дейтерия, дозовые пределы радиации ограничивающие эффект, возрастная специфика применения 02О необходимы для дальнейшего совершенствования методов изотопной защиты человека. Разработана и апробирована концентрационно-временная схема введения дейтерия в организм для эффективной защиты его от повторных облучений.

Положения, выносимые на защиту.

1. Радиомодификация возможна без изменения химического состава организма, его температуры и ограничения двигательной активности, а только за счет изменения энергии водородных связей после замены протия на дейтерий в легкообменивающих водород молекулярных структурах.

2. С учетом полной и быстрой обратимости изотопного обмена Н ^ й в биологических структурах, ослабление лейкозогенеза в отдаленном периоде у переживших в результате защиты острую лучевую болезнь

животных определяется только увеличением радиорезистентности лимфоидной ткани - мишени лейкозогенного действия радиации в момент облучения.

Разработанные в исследовании методы использованы при выполнении клинической тематики (N госрег.78017480), в частности для изучения аспектов метаболических связей опухоли и организма.

Апробация работы. Результаты доложены на конференциях: "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях" (С-Петербург, 1992), "Современные достижения медицинской радиологии" (С-Петербург, 1993), "Актуальные вопросы медицинской радиологии" (С-Петербург, 1998).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 53 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований с их обсуждением, завершается работа заключением и выводами. Библиографический указатель включает 15 отечественных и 16 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 11 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Эксперименты проведены на 770 мышах самцах, из них 550 межлинейные гибриды (CBAxC57BI)F^ в возрасте 2, 4 или 6 месяцев и 220 мышей линии C57BI в возрасте 1, 3 или 4 месяца. Все животные - из питомника лабораторных животных РАМН "Рапполово".

С целью изотопного замещения части легкой воды в организме животных на тяжелую использовали растворы тяжелой воды (D20, Изотоп, СССР) в качестве питьевой. Применяли растворы с концентрацией D20 от

2,5% до 99,9%. Время, необходимое для создания в организме животных требуемой концентрации D20 вычисляли согласно (А.Н.Шутко, 1967).

■ В зависимости от целей эксперимента по достижении заданной концентрации D20 в организме тяжелую воду заменяли на обычную, либо некоторое время продолжали ее поступление в виДе воды, имеющей концентрацию D20, равную заданной. В последнем случае достигнутая заданная концентрация поддерживалась неизменной в течение требуемого времени.

В контрольных группах животных вместо тяжелой воды использовали бидистиллированную (Н20). После отмены "дейтерирования" переходили на потребление водопроводной воды в контрольной и опытной группах.

Облучение животных проводили рентгеновским излучением на аппарате РУМ-17 (200 кВ, 15 мА, фильтры 0,5мм Си, I мм AI) при фокусном расстоянии 50 см. Средняя мощность поглощенной дозы, определяемая на парафиновых фантомах с погрешностью ± 5%, на протяжении всего срока выполнения работы не выходила за пределы 0,76-0,86 Гр/мин. Мышей, потреблявших D20 (опытных) и потреблявших бидистилированную воду (контрольных), облучали одновременно.

Регистрацию выживаемости, средней продолжительности жизни (СПЖ), массы Тела животных проводили путем ежедневных наблюдений и измерений. После естественной гибели или усыпления эфиром животных вскрывали, органы отделяли от дополнительной жировой и соединительной тканей и взвешивали. Факт злокачественного перерождения Лимфоидной ткани констатировали на основании признаков, описанных в руководстве "Pathology of tumors in laboratory animals". С целью уточнения злокачественной природы гиперплазии у части

экспериментальных животных проводили гистологический анализ по Дела-Порта (1979) срезов органов (тимуса, селезенки, сердца, печени и поЧек), фиксированных сразу после выделения в Ю% растворе формалина. При микроскопическом исследовании учитывали характер изменений ткани в целом и особенности клеток.

Основные параметры исследования приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Схема изучения протектавного эффекта Э20.

Параметры исследования Острая лучевая болезнь (кишечный синдром, костномозговая гибель) Отдаленные последствия (лейкозогенное действие радиации)

Дозы облучения • 6,5 -12 Гр 1,75 Гр х 4

Временной режим облучения' Однократно 1 фракция в неделю

Сроки наблюдения 30-60 суток до 16 месяцев

Критерии Средняя продолжительность жизни (СПЖ), выживаемость Весовые характеристики тимуса и селезенки, выход лимфом, их морфология

Количество животных 415 257

Для исследования состояния обменных процессов производили

радиометрический контроль выведения из организма животных (контрольных и опытных) метки иод 125-дезоксиуридина. Использование в качестве детектора пластмассового сцинтиллятора колодезного типа 854773(Венгрия)с объемом рабочей камеры равной 1,5 литра обеспечивало измерения радиоактивности отдельной мыши в геометрии, близкой к 4 «тт. В качестве регистрирующей системы был применен сцинтилляционный гамма-спектрометр фирмы АСЕС (Бельгия).

Физиологический раствор, содержащий 0,9 МБк иод-125-дезоксиуридина, вводили внутрибрюшинно. По данным ежедневных

измерений строили индивидуальные зависимости клиренса, которые подвергали графическому анализу в полулогарифмической системе координат, и результаты описывали в виде индивидуальных экспоненциальных зависимостей:

■ = А е"*- 11 + В е"*- 21 + С е"^ 3

Исследование параметров роста и развития экспериментальной перевиваемой опухоли при частичном изотопном замещении организма дейтерием проводили на мышах гибридах (С57В1хСВА)Р1. В качестве экспериментальной опухолевой модели использовали опухоль легкого мышей - солидную форму аденокарциномы бронха РЛ-67, привитую в мягкие ткани правой стопы. Размер опухоли определяли прижизненно и ежедневно специальным устройством (Климович В.Б.,1978) или посмертно - взвешиванием. С целью определения количества и размеров метастазов проводили микроскопию легких, предварительно заполненных индийской тушью (\Л/ех1ег Н.,1966).

Для статистической обработки материала использовали I -критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, формулу Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

При рассмотрении постоянных кривых клиренса метки иод-125-дезоксиуридина (табл.2) в ряду: контрольные животные, "дейтерированные" до 8% и 25%, обнаруживается достоверное уменьшение количества утилизировавших метку быстрообновляющихся тканей (компартмент В) от 0,98 до 0,31 и 0,15. Это означает остановку клеточных циклов в фазах, предшествующих синтезу, а также в фазу самого синтеза. Это утверждение может быть распространено и на менее представительный компартмент С, так как он тоже достоверно сокращается под влиянием дейтерия с 0,032 до 0,021 и 0,0144.

Таблица 2.

Результаты графического анализа индивидуальных зависимостей исчезновения меченного иод-дезоксиуридина из организма "дейтерированных" мышей (величины параметров уравнения клиренса метки):

С + = А е~ V + в е'х2 * + С е'

Константы

индивид. Концентрация Б^О в организме животного

зависи-

мостей 0% 8% 25%

А - 0,667 0,830

X | - =0,17час"1 =0,17час~1

В 0,984±0,30 0,312±0,0965 0,154±0,0197

X г> 1,206±0,048 сут."1 0,748±0,076 сут."1 0,889±0,074 сут."1

С 0,032+0,0022 0,021±0,0027 0,0144±0,0024

■ X ■ 7 0,0783±0,0051 сут."1 0,0902+0,0063 су1\"1 0,0854+0,0012 Сут."1

Согласно приведенным данным, сокращение объема синтетической активности в нуклеиновом обмене является фундаментальным биологическим следствием попадания дейтерия в организм. "Дейтерирование" приводит также к резкому замедлению скорости биологического выведения меченного уридина в виде продуктов катаболизма группы быстрообновляющихся тканей. Замедление проявляется в достоверном снижении констант скоростей X 2 ДО 62-74% от значения констант контрольных животных.

Резюме. Вероятной биохимической предпосылкой для проявления радиопротективных свойств дейтерия на клеточном уровне служит замедление метаболизма макромолекул, в частности нуклеиновых кислот.

Тем не менее при однократном облучении животных в дозе, вызывающей 100% гибель в течение первых 6 дней, достоверного протективного действия тяжелой воды выявить не удалось. В отличие от кишечной формы лучевой болезни костномозговая форма гибели может

быть существенно модифицирована тяжелой водой по критерию 60-дневной выживаемости (таблица 3).

Таблица 3.

Модификация тяжелой водой 60-дневной смертности животных, облученных в дозах среднелетального диапазона.

ЛД ä 50% ЛД < 50% '

Концент- Животные, Р СПЖ Животные, Р СПЖ

рация погибшие разл. погибшие разл.

D20 в через 60 через 60

организме суток суток

животных после после

на момент облучения облучения

облучения,

% к-во % к-во %

25 19 32 <0,001 12,2+0,26 2 16

о- 40 66 11,3+0,49 2 16

16 6 25 0,04 14,6±2,0 3 33 19,5±6,5

0 11 61 14,9±1,9 2 25 12

10 8 50 0,04 2,4+0,84 2 33 -

0 14 82 13,0+1,65 3 43 14,5±5,5

Важно отметить, что проявление защитного эффекта тяжелой воды наиболее наглядно при дозах облучения ЛД/gQ > 50%, что соответствует (Бесядовский P.A. и др., 1978) ОЛБ III степени. При меньших дозах, как показывает таблица 3, наблюдать этот эффект с достоверностью затруднительно. Попытка воспроизведения защитного эффекта при концентрации D20 2,5% также не привела к успеху, хотя облучение было произведено в дозе, вызывающей гибель 100% животных при СПЖ 9,7±0,31(п=30).

Резюме. В условиях наших экспериментов удалось констатировать достоверное защитное влияние D20 при костномозговой форме гибели в

диапазоне концентраций 25-10% и только в отношении . животных, облученных однократно в дозах £ ЛД50.

Особенности защитного действия дейтерия при фракционированном облучении неполовозрелых животных изучали в связи с высокой их радиочувствительностью и наиболее отчетливым проявлением у них лейкозогенного действия радиации в отдаленные сроки. Избранное фракционированное воздействие радиации состояло из 4 фракций тотального равномерного облучения в дозе 1,75 Гр (мощность 0,86 Гр/мин), разделенных недельными перерывами. Тяжелую воду (80%) включали в рацион животных за 4 дня до начала их облучения. К началу облучения равновесная концентрация дейтерия достигала 25%, после чего ее поддерживали, на этом уровне до последнего дня облучения путем применения 25% й20 в качестве питьевой (рис.1 А). В эксперименте использовали 1 месячных мышат С57В1, отобранных по весу в диапазоне 13-14 г. Результаты экспериментов представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, при указанных условиях была установлена непригодность непрерывного применения тяжелой воды качестве протектора из-за ее потенциирующего эффект радиации действия. Поэтому была разработана прерывистая схема протективного использования 020. Новая схема применения 020 в период фракционированного облучения мышат (рис.1 В) обеспечивала отсутствие токсичности при самостоятельном применении Р20 в течение эксперимента а также приводила к исчезновению гибели животных при комбинированном применении облучения и потребления й20 как в период совместного действия этих факторов на организм мышат, так и в течение 2-месячного периода после конца облучения (таблица 5).

Таблица 4.

Количество выживших мышат после фракционированного облучения в 4 х 1,75 Гр и в условиях постоянного потребления 020 в течение 25 суток (традиционная схема "дейтерирования", рис 1А)

Условия эксперимента Время: после начала потребления . 090,(после конца облучения), сутки Вероятность различий, р

А 0(-25) В 25(0) С 55(30) Д 85(60) АВ:ВС ВС:СД

1 .Контроль 20 20 20 20

2. Облучение 4x1,75 Гр 20 17 11 11 0,11

3. Потребление О,О 20 19 12 12 0,016

4. Облучение на фоне потребления 090 20 3 2 2 0,10 -

Вероятность различий по формуле Фишера 'АВ 1/2' -АВ 1/3 ' -АВ 1/4<0,001 ВС 1/2=0,005' ВС 1/3=0,003 ВС 1/4=0,005 СД 1/2 -СД 1/3 - . СД 1/4 -

.На рисунке 1 иллюстрируются различия между новой прерывистой

схемой и прежней непрерывной схемой.

Рис.1. Динамика концентрации 020 в жидкостях тела животных при непрерывном (А) и периодическом (В) поступлении тяжелой воды в организм.

Таблица 5.

Количество выживших мышат после фракционированного облучения 4 х 1,75 Гр и в условиях применения разработанной схемы прерывистого "дейтерирования"(рис 1 В).

Условия, эксперимента Время после начала потреб; 090 (после конца облучения гения I, сутки Вероятность • различий ,р

А 0(-25) В 25(0) С 55(30) д 85(60) АВ-.ВС ВС-.СД

^Потребление о,о 20 20 20 20

2. Облучение 4 х 1,75 Гр 20 17 11 11 0,11

З.Облучение на фоне потребления й9о 20 19 17 17 - -

Вероятность различий по формуле Фишера АВ 1:2 -АВ 1:3 -АВ 2:3 - ВС 1:2=0,003 ВС 1:3 -ВС 2:3=0,07 СД 1:2' -СД 1:3 -СД 2:3 -

На основании данных таблицы 5 можно утверждать, что

достоверное летальное действие фракционированной схемы облучения мышат (ЛД45/30) существенно ослабляется при сочетании фракционированного облучения и новой прерывистой схемы введения 02О в юный организм.

Резюме. У неполовозрелых животных чувствительность к токсическому действию дейтерия значительно выше, чем у взрослых, и поэтому радиопротективный эффект изотопа удается продемонстрировать только при таких режимах его поступления в организм, которые обеспечивают наивысшую защитную концентрацию лишь на короткий период - только во время действия радиационного фактора. В промежутках между облучениями для получения феномена защиты необходимо резкое снижение концентрации дейтерия с такой интенсивностью, которую позволяют темпы естественного обновления воды в организме.

. Среди молодых животных, оставшихся в живых после окончания периода острых последствий воздействия фракционированного облучения (81-85 дней с момента начала эксперимента согласно таблице 5), был произведен учет гибели и органных изменений в отдаленный период (через 3 и более месяцев после начала эксперимента). В таблице 6 суммированы результаты такого учета, включая животных из группы биологического контроля, не подвергавшихся воздействию облучения или 02<Э и не обнаруживавших гибели в течение первых трех месяцев от начала эксперимента. Во второй вертикальной колонке таблицы 6 показано отношение количества погибших в отдаленном периоде животных к общему количеству переживших первый трехмесячный период. Учитывали погибших мышей в отдаленном периоде.в срок от 3 до 9. месяцев с начала эксперимента.

Статистическая обработка данных выживаемости показала, что самостоятельного влияния периодического потребления дейтерия в отдаленном периоде не удается обнаружить (сравнить группы 1 и 3 таблицы 6), тогда как фракционированное облучение достоверно увеличивало гибель до 82% (таб.6,2) по сравнению с 15-20%, наблюдающимися в группах без лучевого воздействия (таб.6,1) или среди потреблявших тяжелую воду периодически (таб.6,3). При сочетании "дейтерирования" и облучения радиационная гибель в отдаленном периоде снижается с 82% до 47% (таб.6,4). Хотя статистически это снижение не достаточно очевидно (р=0,06), тем не менее оно сопоставимо с гибелью необлученных животных, потреблявших только 020 (р=0,06), и, следовательно, уменьшение радиационной компоненты поздней гибели при облучении на фоне дейтерия представляется возможным.

Таблица 6.

Отдаленные результаты фракционированного облучения юных животных, защищаемых тяжелой водой.

Группы Гибель после СПЖ (срок Масса вилочковой

животных, 3-х месяцев от определения железы у животных,

условия начала массы тимуса), погибающих в

эксперимента облучения, % дни после начала отдаленном

облучения периоде, мг

1. Без

воздействия 15 ( 3/20) 143±10,6 37,3±5,4

2. Облучение

4x1,75 Гр 82 ( 9/11) 174± 11,1 484,8±70,4

з. о2о

периодически 20 ( 4/20) 153,5±6,2 13,5±2,7

4. 020

периодически 47 ( 8/17) 161 + 10,3 97,5±32,2

в сочетании с

облучением

1/2<0,001 1/2 - 1/2<0,001

1/3 - 1/3 - 1/3=0,012

Р 2/3=0,003 2/3 - 2/3<0,001

2/4=0,06 2/4 - 2/4<0,001

3/4=0,06 3/4 - 3/4=0,03

Среднестатистические сроки наступления гибели в отдаленном периоде не отличались для животных из различных групп таблицы 6. Таким образом, можно заключить, что увеличение количества погибающих

животных в отдаленном периоде после фракционированного облучения не сопровождается сокращением их жизни.

При весовом исследовании органов погибающих животных выявляется 10-кратное увеличение массы вилочковой железы в отдаленном периоде после облучения по сравнению с контролем (табл.6,1-2). Данный феномен рассматривается как признак лейкемизаци (Deila-Porta G. et al.,1979). Важно отметить, что у облученных животных, которые пережили 9-месячный срок наблюдения и были усыплены

произвольно в качестве дополнительного контроля, увеличения массы вилочковых желез не выявлено.

На фоне потребления тяжелой воды феномен радиогенной гиперплазии вилочковой железы достоверно (р<0,001) уменьшался в 5 раз (табл.6.,2-4). Данный факт коррелируете весьма вероятным уменьшением процента гибнущих животных в позднем периоде после протектмвного использования тяжелой воды и заставляет предположить, что пострадиационная гибель мышей в отдаленном периоде может быть связана с величиной пострадиационной гиперплазии тимуса. Причиной уменьшения пострадиационной гиперплазии железы у защищенных дейтерием животных несомненно является модификация ростовых процессов в ней только в основном во время облучения и, может быть, в течение сравнительно короткого периода после него. Элиминация цейтерия из организма после 4-й фракции облучения происходила с юлупериодом примерно 3 дня. Предположение о формировании поздних эффектов дейтерия за счет его действия на момент облучения подтверждается сопоставлением результатов взвешивания желез в <онтрольной группе и группе животных, получавших только тяжелую воду 5ез облучения (табл.6,1-3). Сопоставление позволяет заключить, что прерывистое употребление тяжелой воды необлученными животными в оном возрасте приводит к тому, что даже через 8 месяцев после отмены «отопа вес вилочковой железы остается сниженным по сравнению с сонтрольными значениями более чем в 2 раза (р=0,012). Таким образом, гяжелая вода представляется эффективным ингибитором естественного эазвитая тимуса в юном возрасте, что, по-видимому, и определяет ее ¡войства как эффективного протектора от проявлений радиогенного 1ейкоза мышей. Свойство вилочковой железы юных животных замедлять

свое развитие под влиянием дейтерия представляется уникальным, поскольку ни один из других исследованных органов, большинство из которых по характеру митотической активности - покоящиеся (селезенка, сердце, легкие, печень, почки) не обнаруживали достоверных изменений при воздействии 020 у тех же животных.

Резюме. Результаты раздела позволяют заключить, что противолейкозное действие дейтерия (в варианте радиационного патогенеза) в юном возрасте основано на свойстве изотопа ингибироватъ физиологическое развитие вилочковой железы. Тяжелая вода, которая будучи с полным правом охарактеризованной как цитостатический агент в общефизиологическом смысле, в конкретной патогенетической ситуации формирования отдаленных последствий радиационного воздействия обеспечивает протективный эффект именно по цитостатическому механизму.

Иные особенности протективного действия й20 обнаружены в отдаленном периоде у половозрелых животных. В таблице 7. представлены результаты изучения протективного действия дейтерия в отдаленном периоде после фракционированного облучения (4x1,75 Гр) животных линии С57В1 в возрасте 3 месяца.

Результаты показывают, что облучение приводит к увеличению гибели животных в отдаленном периоде с 21%(контроль) до 90% с р 0,001. Однако , использование прерывистой схемы дейтерирования в процессе облучения не ослабляет, в отличие от юных особей, индуцированную радиацией позднюю гибель зрелых животных.

Важно отметить, что у взрослых животных патология селезенки, а не тимуса в отдаленном периоде является ведущим симптомом. Среди падших животных достоверно увеличен процент селезенок с массой,

Таблица 7.

Отдаленные результаты радиозащитного применения 020 у мышей, облученных фракционированно в возрасте 3 месяца.

Соотношение Соотношение Средняя

Группы Гибель падших и падших продолжи-

животных, • животных усыпленных усыпленных тельность

условия после 3 с аномальной с аномальной жизни

эксперимента месяцев массой массой животных,

от начала селезенки тимуса дни с

облучения, ко всем ко всем начала

% падшим и падшим экспери-

усыпленным,% усыпленным,% мента-

1. Без

воздействия 21(4/19) 10(1/10) 10(1/10) 252±9,4

2. Облучение

• 4x1,75 Гр 90(9/10) 56(5/9) • 33(3/9) • 224+1,2

3. о2о

периодически 64(23/36) 7(2/27) 4(1/27) 225+13,9

в сочетании

с облучением

1/2=0,001 1/2=0,05 1/2 - 1/2 -

Р 1/3=0,001 1/3 - 1/3 - 1/3 -

2/3 - 2/3=0,005 2/3=0,04 2/3 -

В качестве верхнего предела нормальной массы органа принимали значение М+бп"1, равное 172 мг для селезенки и 46 мг для тимуса.

выходящей за верхний предел средних значений нормы М+бп~1 для возрастного контроля. Аналогичное сопоставление для вилочковой железы не позволяет утверждать, что данный орган вовлекается в лейкемический процесс при облучении животных 3-месячного возраста. Известный факт прогрессивной инволюции тимуса с возрастом (Кемилева 3.,1984) вполне объясняет упомянутые особенности.

Комбинированное воздействие облучения и тяжелой воды ликвидирует с высокой степенью достоверности (р=0,005) феномен радиогенного увеличения массы селезенок (табл.7,2-3).

К аналогичному выводу можно прийти и на основании результатов экспериментов с животными в возрасте 6 месяцев.

Мыши - межлинейные гибриды (СВАхСдуВ!)^, подвергавшиеся облучению в возрасте 6 месяцев в присутствии или отсутствии дейтерия, достоверно различались по критерию соотношения животных, погибающих в отдаленный период с аномально большими или нормальными селезенками

С целью уточнения результатов в группе взрослых животных были проведены выборочные гистологические обследования погибших особей. Гистологически было подтверждено наличие малигнизации у 6 из 6 (100%) обследованных животных после облучения их в прерывистом режиме без дейтерия, и .только, у 2. из 7 (29%) обследованных, получавших тяжелую воду в качестве питьевой перед каждой фракцией облучения (модифицированный режим потребления). Таким образом, уменьшение радиогенного процесса малигнизации среди защищенных дейтерием зрелых животных по результатам выборочного гистологического анализа подтверждается р=0,015. Следует отметить, что так же как для 3-месячных животных и в зрелой возрастной группе не удалось обнаружить какие-либо радиогенные различия по массе вилочковой железы при варьировании экспериментальных условий.

Резюме. Как видно из приведенных данных основной мишенью радиационной лейкемизации у мышей зрелого возраста служит селезенка, и дейтерий может проявлять обнаруженные антилейкозогенные свойства на уровне данного органа вероятно в связи с увеличением физиологической роли тимусзависимых зон селезенки в период возрастной инволюции самого тимуса.

Наряду с основным выводом о снижении лейкозогенного действия радиации в результате снижения радиочувствительности нормальных тканей после дейтерирования интактных животных можно утверждать, что тяжелая вода также замедляет, по крайней мере, начальные этапы развития опухолевой ткани (рис.2).

нн о

6 □ ■ +

5 ■

4- ■ • ■ ■ . /

3 2 1 //у- //Ж"

2 4 6 о 10 12 14 16 18 20 <У™

Рис.2. Особенности роста экспериментальной опухоли РЛ-67 в условиях дейтерирования организма.

По оси абсцисс - время после перевивки опухоли, сутки; по оси ординат - размер опухоли, мм, у мышей предварительно выведенных на содержание 020 в тканях организма до 20%(0 - о), 30%(! - ■), 40%(0 - □) по сравнению с группой животных, получавших ^0(0 - в).

Однако это замедление, даже при постоянном присутствии дейтерия, не способно предотвратить развитие опухоли и гибель от нее животного.

ВЫВОДЫ

1. Увеличение содержания дейтерия в водной фазе организма взрослых и неполовозрелых мышей до 20-50 атомарных % в период однократного или фракционированного облучения тела снижает смертность только от острой лучевой болезни III стадии.

2. Удлинение времени нахождения тяжелой воды в организме с целью защиты от фракционированного облучения приводит к появлению токсического действия изотопа.

3. Увеличение содержания дейтерия в организме животных только на время действия радиации при фракционированном облучении ослабляет проявления пострадиационного лейкозогенеза.

4. Противолейкозное действие дейтерия реализуется неизбирательно, путем торможения физиологической пролиферативной активности вилочковой железы или метаболически активных зон селезенки в момент облучения.

5. Основу радиопротективного действия дейтерия на биохимическом уровне составляет его способность ингибировать метаболизм и катаболизм нуклеиновых кислот в группе быстрообновляющихся тканей.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Шатинина H.H., Екимова Л.П., Шутко А.Н. Защитные свойства тяжелой (дейтериевой) воды при радиационном поражении мышей //Тезисы докладов X научной конференции "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях", Санкт-Петербург, ноябрь 1992,- С. 212-213.

2. Шутко А.Н., Екнмоза Л.П., Шаталина H.H., Васильеаз М.Ю. Профилактическое действиэ дейтерия при радиогенных лимфомах //Тезисы докладов X научной конференции "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях", Соккг-Петербург, ноябрь 1992.- С. 219221.

3. Ешмова Л.П.. Шутко А.Н. Об условиях реализации редисмодифицирующего эффеста тяжелой воды // Тезисы научней конференции, поезпщенной 7Блатию основания Института "Современные достижения медицинской радиологии", Санкт-Петербург, ноябрь 1593.- С. 280-281.

4. Даев С.П., Екимозя Л.П., Шутко А.Н.. Смирнова С.М.. Гояееа И.Ш.. Легеза В.И. Сравнительная характеристика радиозащитного дейстокя тяжёлой воды (ОтО) и классического радиопротектора - цистамина // Тезисы научной конференции "Актуальные вопросы медицинской радиологии", Санкт-Петербург, июнь 1998.- C.3G7.

Б. Жзковко Е.Б., Екимоаа Л.П., Дееэ С.Г!., Шутко А.Н., Галеев И.Ш., Легеза В.И. Патогенетическое исследование действия тяжелой г.оды(ОтО) и облучения з клетках костного мозга мышей // Тезисы научной конференции "Актуальные вопросы медицинской радиологии", Санкт-Петербург, июнь 19S8.-C.3S9.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Екимова, Людмила Петровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биомодифицирующие свойства Б20:.

1.1.1. Радиосенсибилизирующие эффекты И20.

1.1.2. Радиозащитные эффекты 020.

1.2. Ингибирующее действие Б20 при опухолевом 11 росте.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Животные.

2.2. Изотопное замещение воды в организме.

2.3. Источники, условия облучения и общая схема исследования.

2.4. Функциональные и морфологические методы исследования.

2.4.1. Контроль общего состояния. подопытных животных.

2.4.2. Радиоизотопный анализ состояния обменных процессов в организме.

2.4.3. Исследование параметров развития экспериментальной перевиваемой опухоли.

2.5. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Основные изменения метаболического статуса организма при употреблении тяжелой воды.

3.2. Протективные свойства тяжелой воды при острой лучевой болезни.

3.2.1. Кишечная форма гибели.

3.2.2. Костномозговая форма гибели взрослых животных

3.2.3. Особенности защитного действия дейтерия при облучении неполовозрелых животных.

3.3. Протективное свойство дейтерия при лейкозогенном действии радиации.

3.3.1. Молодые животные.

3.3.2. Взрослые животные.

3.4. Противоопухолевое действие дейтерия.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Радиомодифицирующие свойства тяжелой воды при острой и отдаленной лучевой патологии животных"

Актуальность исследования. Среди средств модификации острой лучевой болезни (ОЛБ) наиболее чистыми с точки зрения экологии организма являются методы физической модификации, так как они не сопряжены с введением в организм каких-либо дополнительных факторов биологического происхождения (костный мозг здорового донора, различные биости мулятбры) или химических веществ (аминотиолы, индолилалкиламины, инертные газы, с целью создания гипоксии в тканях и т.д.). Однако модификация ОЛБ такими известными "физическими" факторами как холод или иммобилизация сопряжена с утратой физической и социальной активности защищаемого объекта. В конечном итоге, подобные варианты физической модификации во многом неопределенны по механизму биологической реализации, так же как и действие многих химических модификаторов (Вартанян Л.П.,1998). Наиболее интересным подходом в области физической модификации радиочувствительности представляется изотопное замещение части легкой воды организма на тяжелую, поскольку механизм физического действия дейтерия (D) на молекулярном уровне предельно прост: водородная связь в макромолекулах с дейтерием прочнее, и в силу этого вторичная структура всех макромолекул (нуклеиновых кислот, белков, особенно ферментов) в "дейтерированном" организме более устойчива. Обмен D —> Н происходит быстро и равномерно во всем организме по легкообмениваемым связям групп -SH, -ОН, -NH2, обратное замещение происходит также полно, быстро и без последствий (Шутко А.Н., 1967; Шутко А.Н., Шатинина H.H., 1972). Принципиально важным является то обстоятельство, что при изотопном замещении химический состав различных субстанций и сред организма не изменяется. Вместе с тем производимые дейтерием на молекулярном уровне изменения равносильны замедлению "биологических часов", и, следовательно, могут обеспечивать феномены протекции. Побочные негативные следствия такого замещения на клеточных моделях проявляются в виде радиосенсибилизации с фактором изменения дозы(ФИД~4,5) но только при практически полном замещении протия на дейтерий в среде (Ben-Hur Е., Riklis Е., 1980; Ben-Hur Е. et al.,1980).

Исходя из изложенного, целью работы явилось изучение возможностей физической радиопротекции путем частичного изменения изотопного состава водорода в организме с использованием тяжелой воды Б20.

Задачи исследования.

1. Разработать методику применения Б20 в качестве физического протектора.

2. Оценить протективные свойства 020 при острой лучевой болезни с учетом наиболее распространенных ее синдромов и возраста животных.

3. Оценить протективные свойства Б20 по критерию радиогенной лейкемизаций у мышей, перенесших ОЛБ.

4. Выявить основные механизмы развития феноменов протекции, их возрастные особенности.

Научная новизна.

-Впервые представлены доказательства того, что в период изотопного замещения протия на дейтерий в организме сокращается объем общего синтеза нуклеиновых кислот и замедляется их катаболизм преимущественно в тканях с быстрым темпом клеточного обновления;

-впервые продемонстрирована избирательность протективного действия изотопного замещения только при костномозговой форме острой лучевой болезни, вызванной облучением в летальных дозах (ЛД > 50/30);

-впервые обоснована возможность эффективной защиты дейтерием от рентгеновского излучения не только в режиме однократного, но и фракционированного воздействия;

-впервые обнаружено, что при защите дейтерием у переживших ОЛБ животных, лейкозогенное действие радиации в отдаленном периоде проявляется в меньшей степени;

-впервые показана зависимость проявления лейкозогенного действия радиации от состояния пролиферативной активности органов лимфопоэза в момент облучения.

Научно-практическая значимость. Результаты исследования пополняют существующий узкий список протекторов, действующих на физической основе, качественно новой их разновидностью -изотопным протектором. Установленные количественные параметры концентрации дейтерия, дозовые пределы радиации, ограничивающие его защитный эффект, возрастная специфика действия Б20 необходимы для дальнейшего совершенствования методов изотопной защиты человека. Разработана и апробирована концентрационно-временная схема введения дейтерия в организм для эффективной защиты его от повторных облучений.

Положения, выносимые на защиту.

1. Радиомодификация возможна без изменения химического состава организма, его температуры и ограничения двигательной активности, а только за счет изменения энергии водородных связей после замены протия на дейтерий в легкообменивающих водород молекулярных структурах.

2. С учетом полной и быстрой обратимости изотопного обмена Н - Б в биологических структурах, ослабление лейкозогенеза в отдаленном периоде у переживших в результате защиты острую лучевую болезнь животных определяется только увеличением радиорезистентности лимфоидной ткани - мишени лейкозогенного действия радиации в момент облучения.

Разработанные в исследовании методы использованы при выполнении клинической тематики (№ госрег.78017480).

Апробация работы. Результаты доложены на конференциях: "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях" (С-Петербург, 1992) , "Современные достижения медицинской радиологии" (С-Петербург, 1993), "Актуальные вопросы медицинской радиологии" (С-Петербург, 1998).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 53 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований с их обсуждением, завершается работа заключением и выводами. Библиографический указатель включает 15 отечественных и 16 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 11 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Екимова, Людмила Петровна

ВЫВОДЫ

1. Увеличение содержания дейтерия в водной фазе организма взрослых и неполовозрелых мышей до 20 - 50 атомарных % на время однократного облучения тела снижает смертность только от острой лучевой болезни III степени.

2. Удлинение времени нахождения тяжелой воды в организме с целью защиты от фракционированного облучения приводит к появлению токсического действия изотопа.

3. Увеличение содержания дейтерия в организме животных только на время действия радиации при фракционированном облучении ослабляет проявления пострадиационного лейкозогенеза.

4. Противолейкозное действие дейтерия реализуется неизбирательно, путем торможения физиологической пролиферативной активности вилочковой железы или метаболически активных зон селезенки в момент облучения.

5. Основу радиопротективного действия дейтерия на биохимическом уровне составляет его способность ингибировать метаболизм и катаболизм нуклеиновых кислот в группе быстрообновляющихся тканей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как показало наше исследование, вероятной биохимической предпосылкой для проявления радиопротективных свойств дейтерия на клеточном уровне служит замедление метаболизма нуклеиновых кислот. Важно отметить, что в силу молекулярно-физической природы эффекта он принципиально отличается от известных радиозащитных феноменов иммобилизации, охлаждения или наркоза (Ке1гег Н.1.,1976 ) тем, что в отличие от последних возникающая при действии дейтерия ингибиция митозов не сопровождается утратой активного поведения. Сохранение всех функций организма при защите дейтерием, полная обратимость состояния дейтерирования т.е. отсутствие вредных последствий после выведения изотопа из организма (Лобышев В.И.,1978) выводят дейтерий на первое место среди известных физических протекторов.

Поскольку в условиях наших экспериментов удалось констатировать достоверное защитное влияние Б20 в диапазоне концентрации 25-10% для животных, облученных однократно в дозах > ЛД50, но только в пределах костномозговой формы гибели, можно полагать, что ингибиция митотической активности не является абсолютным условием для развития эффекта защиты, а лишь предпосылкой для его реализации при наличии благоприятных цитокинетических условий в той или иной пролиферирующей системе. В данном случае такой системой является кроветворение.

Об этом свидетельствует и другой обнаруженный нами факт -получение радиозащитного эффекта при фракционированном облучении юных животных в дозах костномозгового диапазона. У неполовозрелых животных чувствительность к токсическому действию дейтерия оказалась значительно выше, чем у взрослых. Поэтому радиопротективный эффект изотопа удается продемонстрировать у них только при таких режимах поступления дейтерия в организм, которые обеспечивают наивысшую защитную концентрацию лишь на очень короткий период действия радиационного фактора. В промежутках между облучениями для получения феномена защиты было необходимо резко снижать концентрацию дейтерия с такой максимальной интенсивностью, которую позволяли темпы естественного обновления воды в организме. Необходимо отметить, что разработанная для юного возраста схема дейтерирования в условиях повторных облучений вполне применима и для защиты взрослых так как для этого какие либо препятствия теоретического плана отсутствуют.

Таким образом тяжелая вода, будучи цйтостатическим, а следовательно и патологическим агентом в общефизиологическом смысле, в то же время способна обеспечивать протективный эффект в конкретной патогенетической ситуации а именно при формировании последствий радиационного воздействия проявляя и реализуя патологические свойства цитостатика.

Важным результатом работы является выяснение того, что противолейкозное действие дейтерия в варианте радиогенного патогенеза в юном возрасте основано на свойстве изотопа ингибировать пролиферацию, обеспечивающую физиологическое развитие высокочувствительной клеточной мишени действия радиации (Романцев Е.Ф.,1972) - вилочковой железы. Последняя, как известно, обеспечивает ростовые функций детского организма (Кемилева З.Д984).

Вполне закономерным следствием известной утраты роли тимуса с возрастом выглядит обнаруженный факт изменения "мишени" радиационной лейкемизации с тимуса на селезенку у мышей зрелого возраста по сравнению с неполовозрелыми. Вполне вероятно, что дейтерий проявляет антилейкозогенные свойства на уровне селезёнки в связи с увеличением физиологической роли тимус-зависимых зон данного органа в период возрастной инволюции самой вилочковой железы.

Наряду с основным выводом о снижении лейкозогенного действия радиации в результате снижения радиочувствительности нормальных тканей после дейтерирования интактных животных можно утверждать, что тяжелая вода также замедляет по крайней мере начальные этапы развития опухолевой ткани. Тем не менее, для того, чтобы демонстрировать феномен прямого действия изотопа на опухоль, потребовалось поддержание его концентрации в организме в течение времени, во много раз превышающего время пребывания дейтерия в экспериментах по защите. Таким образом, не отвергая теоретической возможности прямого ингибирования опухолевого роста, в нашем случае следует все таки прежде всего ✓ ориентироваться на сдерживание радиационного лейкогенеза в

49 основном за счет снижения радиочувствительности биологического объекта в момент облучения. Такая же точка зрения была уже сформулирована С.Н. Александровым (1981) задолго до обнаружения защитных свойств изотопного замещения водорода в организме, однако используя этот новый - изотопный - вариант защитного действия мы смогли еще раз подтвердить ее.

50

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Екимова, Людмила Петровна, Санкт-Петербург

1. Александров С.Н. Проффнлактика радиогенного сокращения продолжительности жизни // Мед. радиология,- 1981.- Т. 26,- № 3,- С. 71-79.

2. Аронов С. Изотопные методы в биохимии// М.- Из-во Ин.Литер,- 1959.- 154 с.

3. Бесядовский P.A., Иванов К.В., Козюра А.К. Справочное руководство для радиобиологов // М- Атомиздат,- 1978,- 92 с.

4. Вартанян Л.П.,Пустовалов Ю.И,Горнаева Г.Ф. К вопросу о механизме действия химических радиопротекторов// Тезисы научной конференции "Актуальные вопросы медицинской радиологии", Санкт-Петербург, июнь 1998.-С. 361.

5. Кемилева 3. Вилочковая железа // пер. с болг. А.Н.Иванова,-М,- Медицина,- 1984,- 220 с.

6. Климович В.Б. О применении реакции отека стопы в фундаментальных и прикладных иммунологических исследованиях // Сб. трудов Всес. конф. "Теоретическая иммунология практическому здравоохранению", Таллинн, 1978,-С. 127-128.

7. Лобышев В.И., Калиниченко Л.П. Изотопные эффекты D20 в биологических системах // М,- Наука,- 1978,- 13 с.

8. Матылевич Н.П., Король Б.А., Нелипович П.А., Афанасьев В.Н., Уманский С.П. Ингибирование Д20 интерфазной гибели тимоцитов // Радиобиология,-1991,- Т.-31- № 1,- С. 27-32.

9. Романцев Е.Ф., Блохин В.Д., Жуланова З.И., Кащеенко Н.Р., Филиппович И.В. Радиационная биохимия тимуса под ред. Е.Ф. Романцева У/ М.- Атомиздат,- 1972,- 176 с.

10. Урбах В.Ю. Математическая статистика для биологов и медиков // М,- АН СССР,- 1963,- 324 с.

11. Шатенштейн А.И., Яковлева Е.А., Звягинцева E.H., Варшавский Я.М., Израилевич Е.А., Дыхно Н.М. Изотопный анализ воды // М,- АН СССР,- 1957,- 236 с.

12. Шутко А.Н. Исследование механизмов ранних нарушений процесса всасывания и обмена воды в организме при воздействии ионизирующей радиации с помощью дейтерия // Автореф. канд. дисс.- Л,- 1967.

13. Шутко А.Н. Исследование механизмов ранних нарушений процесса всасывания и обмена воды в организме при воздействии ионизирующей радиации с помощью дейтерия // Канд. дисс.- Л.- 1967.

14. Шутко А.Н. и Шатинина Н.Н. Способ исследования кинетики взаимодействия компонентов раствора //Авт. свид. N469918 с приор. от12.07.1972.

15. Altermatt Hans J., Gebbers Jan-Olaf, Laissue Jean A. Heavy water delay growth of human carcinoma in nude mice // Cancer. -1988.- V.62.- N 3,- P. 462-466.

16. Ben-Hur E., Utsumi H. and Elkind M.M. Potentially Lethal and DNA Radiation Demage: Similarities in Inhibition of Repair by Medium Containing D2O and by Hypertonic Buffer // Rad.Res,-1980.-V. 84.-N l.-P. 25-34.

17. Ben-Hur E. and Riklis E. Deuterium Oxide Enhancement of Chinese Hamster Cell Response to у Radiation // Rad.Res.- 1980,- V. 81.-N2.-P. 224-235.

18. Delia Porta G, Chieco-Bianhi L, Pennelli N. Tumors of the haematopoietic system. Path, of tumors in lab. animals.V II Tumors of the mouse. Ed.V.S. turusov, Lyon.-1979.- P. 527-545.

19. Duchesne J., Mosora F., Rinne M., Dress A. The Effect of Heavy Water on the Organic Free Radical Content in Rat Liver and Kidney : Consequences for Senescence and Cancer // J. theor. BioL-1978.- V. 71.- N 2.- P. 275-278.

20. Kaplan H.S. Influence of age on susceptibility of mice to the development of Lymphoid tumors after irradiation // J. of the National Cancer Inst.- 1948 V. 9.-.N 1.- P. 55-56.

21. Keizev H.J. Protection of haemopoietic steam cells during cytotoxic treatment // Proc. of Radiobiological Inst, of Organization for Health Research TNO, Rijswijk, Niderlands.- 1976.- P.137.

22. Lacroix M., Mosora F. Biological effect of deuterium and other stable isotopes // Isotope Rations as Pollutant Source and Behav. Indie.- Vienna.- 1975.- P. 383-386.

23. Laissue J.A., Burki H,, Berchtold W. Survival of tumor-bearing mice exposed to heavy water or heavy water plus methotrexate // Cancer Res.- 1982.-V. 42.-N3.-P. 1125-1129.53

24. Laissue J.A., Altermatt H.J. Bally E., Gebbers J.-O. Protection of mice from whole body gamma irradiation by deuteration of drinking water: hematologic finding // Exp. Hematol.1987.- V. 15.- N 2- P. 177-180.

25. Laissue J.A., Altermatt H.J., Berchtold W., Blattmann H., Gebbers J.-O., Michel F., Zimmermami A., Suter T. Radioprotective effects of heavy water // Jahresber. 1985. Schweiz. Inst. Nuklearfoch.-Yilligen.- s.a.- Med. 39-42.

26. McPhee D.,Pye J.,Shortman K. The differentiation of T lymphocytes. Y.Evidence for intrathymic death of most thymocytes // Thymus.-1979.- V. l.-P. 151-159.

27. Powers E.L. Is the water shell about the "target" involved in radiation effects in cells // Proceedings of the Fourth Symposium on Microdosimetry, Yerbania Pallanza, Italy, 24-28 September 1973.-Brussels.- P. 607-624.

28. Teller P. Cancers: le miracle de l'eau lourde // J. int. med.1988.-V. 88.-N 114.- P. 38.

29. Ujeno Y., Takimoto K. Deuterium isotope effect on radiation damages to mammalian cells //Annu. Repts Res. React. Inst. Kyoto Univ.- 1980.- 13.- P. 62-66.

30. Wexler H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases // J.Natl Cancer Inst.- 1966.- V. 36.- N 4.- P. 641-644.