Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Радиочувствительность мезенхимальных стволовых клеток и получаемых из них для целей клеточной терапии клеток-предшественников кардиомиоцитов

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Радиочувствительность мезенхимальных стволовых клеток и получаемых из них для целей клеточной терапии клеток-предшественников кардиомиоцитов"

На правах рукописи

СЕМЕНКОВА Ирина Витальевна

РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ

КЛЕТОК И ПОЛУЧАЕМЫХ ИЗ НИХ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ КАРДИОМИОЦИТОВ

03.00.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск-2008

003168699

Работа выполнена в отделении клеточной и экспериментальной лучевой терапии Государственного учреждения - Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук

Научный руководитель

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Коноплянников А Г

доктор биологических наук, профессор Рябченко Н И

доктор биологических наук, профессор Вайнсон А А

Ведущая организация - Федеральный медицинский биофизический центр им АИБурназяна ФМБА России

Защита состоится 27 мая 2008 г в 13 00 часов на заседании диссертационного совета Д 001 011 01 при Государственном учреждении - Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук по адресу

249036, г Обнинск Калужской области, ул Королева, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ - Медицинский радиологический научный центр РАМН

«»

Автореферат разослан » апреля 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Палыга Г.Ф

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аюгуальность темы исследования.

В последние годы активно проводятся исследования биологических (в том числе и радиобиологических) характеристик различных типов стволовых клеток и возможностей их применения в клинике, в первую очередь для трансплантации с целью замещения поврежденных и погибших клеток [Sell S , 2004, Penn M.S., 2007], в том числе при лечении онкологических больных после интенсивной лучевой или комбинированной терапии, в результате которой будут повреждены не только клетки злокачественного новообразования, но и нормальные клетки различных жизненно важных органов пациента При этом наиболее перспективным считается использование стволовых клеток костного мозга взрослого человека, размноженных в культуре до необходимого количества и направленных специальными индукторами в сторону дифференцировки в различные клеточные линии

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), открытые и обстоятельно изученные в лаборатории отечественного исследователя А Я Фриденштейна, в последние годы стали одним из основных исходных элементов для проведения клеточной терапии, а в недалеком будущем, несомненно, станут таким же агентом для проведения генной терапии В связи с этим актуальной становится проблема достаточно быстрой и воспроизводимой интегральной характеристики МСК и их дифференцированного клеточного потомства, производимых для целей клеточной терапии с использованием различных критериев Одним из этих критериев является клеточная радиорезистентность выращенной культуры клеток в стандартных условиях облучения В литературе, также как и в работах, проведенных в ГУ- Медицинский радиологический научный центр РАМН, есть достаточно много сведений о радиационной чувствительности клеток исходных культур МСК (начиная еще со времени, когда для их обозначения использовали термин - колониеобразующие единицы фибробластов - КОЕ-Ф), полученных из костного мозга человека и различных видов животных Клетки-предшественники гемопоэтической стромы всегда были более резистентными, чем гемопоэтические клетки-предшественники, величины их средней клеточной дозы Do при действии редкоионизирующей радиации были порядка 1,8-2 Гр и более по сравнению примерно с 1-1,3 Гр для плюрипотентных и ко имитированных гемопоэтических стволовых клеток Однако сведения о чувствительности к радиации дифференцированного в различном направлении клеточного потомства МСК практически отсутствуют Одновременно с этим биологические характеристики таких клеток и безопасность использования их в клинике изучены недостаточно, в том числе и по такому интегральному тесту, как клеточная радиочувствительность, что делает актуальным сравнительное изучение радиобиологических характеристик МСК и их начавшегося дифференцироваться в направлении кардиомиоцитов клеточного потомства

Цель работы.

Целью данной работы явилась разработка методов получения для радиобиологических исследований культур мезенхимальных стволовых клеток и выращиваемых из них клеток-предшественников кардиомиоцитов (кардиомиобласгы, КМБ) из костного мозга человека и лабораторных крыс, изучение количественных характеристик таких клеточных культур, включая их радиочувствительность при стандартном гамма-облучении в условиях in vitro и получение радиоактивно меченых с помощью технеция-99т клеточных культур для изучения способности КМБ восстанавливать поврежденный миокард у лабораторных животных

Основные задачи исследования:

- Разработать методы получения МСК и клеток-предшественников КМБ в культурах клеток костного мозга человека и крыс линии Вистар и изучить биологические характеристики МСК и КМБ, в том числе их радиочувствительность при воздействии гамма-излучения Со-60 in vitro, которые можно было бы использовать при контроле качества индивидуально получаемых культур клеток-предшественников

- Разработать метод радиоактивного мечения КМБ и использовать этот метод для количественной характеристики распределения клеток-предшественников -КМБ при их внутривенном введении лабораторным животным

- Разработать модель повреждения миокарда на экспериментальных животных (мышь, крыса) и использовать ее для оценки терапевтической эффективности процедуры внутривенной трансплантации полученных КМБ

Научная новизна.

1 Впервые разработана методика получения индивидуальных культур кардио-миобластов из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека и лабораторных животных, охарактеризованы биологические свойства полученных клеток стволового типа (радиочувствительность, распределение радиоактивно меченых клеток по тканям при системном введении, выраженность ряда специфических маркеров, кариотип, особенности роста культур, клоногенная активность, и т д), позволяющие контролировать процесс их культивирования, показана безопасность их введения в организм в отношении мутагенного, тератогенного и канцерогенного эффекта

2 Показано, что внутривенная трансплантация кардиомиобластов при тяжелой форме индуцированной адриамицином кардиомиодистрофии ослабляет проявление тяжелого поражения сердечной мышцы и ускоряет протекание и полноту репаративных процессов, как в относительно ранние сроки (2 и 4 недели после химического повреждения тканей), так и более отдаленный период - 3 и 6 мес от начала эксперимента, несмотря на низкий уровень поступления кардиомиобластов в ткани сердца, что было показано путем изучения процесса «хоминга» радиоактивно меченых технецием-99т кардиомиобластов

Практическая значимость работы.

Сведения, полученные в работе, служат экспериментальной базой для клинического применения клеток-предшественников кардиомиоцитов - КМБ, а также основой для разработки методов биологической характеристики и контроля качества клеточных культур, приготовленных из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга Материалы диссертационной работы использованы при подготовке заявки на получение разрешения Росздравнадзора МЗиСР РФ от 11 августа 2006 года за №ФС-2006/206 на применение новой медицинской технологии производства культур МСК и КМБ человека

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработаны методики получения индивидуальных культур МСК и выращиваемых из них культур клеток-предшественников кардиомиоцитов - КМБ, для которых охарактеризованы основные биологические свойства и выявлено различие в радиочувствительности, что может использоваться при контроле качества получаемых для практического применения культур мезенхимальных стволовых клеток и их более дифференцированного клеточного потомства;

- на модели индуцированной у лабораторных животных кардиомиодистрофии показан лечебный эффект системной трансплантации КМБ, который одновременно безопасен в отношении развития в ранние и отдаленные периоды неблагоприятных последствий, несмотря на низкий уровень «хоминга» КМБ в сердце, который выявлен путем использования радиоактивно меченых технецием-99т кардиомиобластов

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были представлены на I Международной конференции "Человек и электромагнитные поля" (Саров, 2003), VIII Конгрессе Международного общества по адаптационной медицине (Москва, 2006), Британско-российском совещании "Стволовые клетки, законодательство, исследования и инновации Перспективы сотрудничества России и Великобритании" (Москва, 2007)

Диссертация апробирована на научной конференции экспериментального радиологического сектора ГУ МРНЦ РАМН 26 марта 2008 г, протокол № 228

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа объемом в 91 страницу машинописи содержит введение, обзор литературы, изложение материалов проведенных исследований, обсуждение, выводы и список литературы, включающий 32 публикации отечественных авторов и 187 - зарубежных исследователей

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение культур кардиомиобластов из мезенхимальных стволовых клеток крысы и человека.

При получении для проведенных экспериментальных исследований культур КМБ из МСК источником костного мозга служили стерильные пунктаты из грудины или гребня подвздошной кости взрослых гематологически здоровых пациентов, которым проводилось плановое диагностическое исследование в клинике ГУ МРНЦ РАМН Кроме того, аналогичные культуры были поставлены с использованием клеток костного мозга крыс линии Вистар, самцов, в возрасте 2,0-2,5 мес Всего на начальном этапе работы были получены культуры от 6 доноров костного мозга и более десятка культур из костного мозга крыс

Клеточный материал брали в строго стерильных условиях (0,5 - 1,0 мл костного мозга — у человека, содержимое бедренной кости — у крысы) и переносили в культуру В качестве ростовой среды служила среда RPMI-1640, содержащая пенициллин (100 ЕД/ мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 мМ , 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA).

Культивирование проводили в пластиковых флаконах Карреля с площадью дна 25 см2, в которые вносили 5 х 10б - 107 клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды с 5% СОг Для перевода МСК в дифференцировку в направлении кардиомиоцитов использовали известный метод воздействия деметилирующим агентом - 5-азацитидином ("Sigma", USA) в конечной концентрации 3 мМ, вносимом на 24 ч на 3 сутки культивирования При достижении сливного (кон-флюэнтного) монослоя клетки пересевали с использованием 0,25% раствора трипсина в начале с той же площадью дна (25 см2), а затем при нарастании клеточной массы - в большие культуральные флаконы с площадью дна 175 см2 Такой метод позволял к концу 5-6 недели культивирования добиться получения популяции кардиомиобластов человека в количестве 100-200 млн клеток, необходимых для трансплантации в организм донора исходного костного мозга Было показано, что при необходимости использованные зарубежные среды, реактивы и посуда могут быть заменены на продукцию фирм, зарегистрированных в МЗиСРРФ

Аналогично работа велась и с исходным костным мозгом крыс линии Вистар Необходимое в этом случае для опытов общее количество кардиомиобластов порядка (1-5)х107 клеток получали в течение 4 недель культивирования

Исследование радиочувствительности МСК и КМБ.

Для получения культур МСК и кардиомиобластов в этих опытах использовали донорский костный мозг человека (мужчина, 45 лет), взятый при диагностической пункции (1 мл) и костный мозг из бедренной кости крысы линии Вистар, самца, в возрасте 2,0 мес, взятый при эвтаназии под нембуталовым

наркозом (около 107 клеток) с соблюдением условий строгой стерильности

Для изучения радиочувствительности использовали клетки человека (МСК и КМБ) и клетки крысы (МСК и КМБ) 6 пассажа от начала культивирования По 1 мл клеточной суспензии (исходная концентрация - от 103 до ЗхЮ3 клеток на 1 мл, что не приводило к созданию клеточной гипоксии в процессе облучения), находившейся при комнатной температуре в стерильных пенициллиновых флаконах, облучали на аппарате "Агат Р-2" (гамма-лучи Со60, мощность дозы 0,45 Гр/мин) в дозах 1, 2, 4, 6 и 10 Гр и через 15-20 мин после облучения высевали во флаконы Карреля с площадью дна 25 см2 Клетки инкубировали в течение 10 сут при температуре 37° С Образовавшиеся колонии клеток фиксировали этанолом, красили по Романовскому, затем проводили подсчет колоний Для обеспечения репрезентативности материалов для каждой экспериментальной точки каждого типа клеток использовали 3 повторности посева клеток в отдельные культуральные флаконы

Для количественной обработки зависимости логарифма клеточной выживаемости (^Б) от дозы облучения (Б) использовали "многомишенную, одно-ударную модель", позволяющую вычислить два параметра, характеризующих экспериментально полученную кривую "доза-эффект" - величину средней клеточной летальной дозы Б0 и величину экстраполяционного числа - п Расчеты уравнений, удовлетворяющих полученным экспериментальным данным, а также вычисление указанных параметров, характеризующих радиочувствительность стволовых клеток крыс и человека, проводили с использованием компьютерной программы "ОгщтбГ'

Дополнительные методы, использованные для биологической характеристики КМБ.

Было проведено дополнительное исследование кариотипа полученных стабильных культур кардиомиобластов и МСК человека и крыс, которое включало инкубацию делящихся клеток с колхицином и получение метафазных пластинок для микроскопии хромосом, их идентификации, подсчета и выявления возможных аберраций хромосом известными методами (Давиденкова Е Ф , 1965)

При тестировании тератогенной, канцерогенной и мутагенной активности трансплантации КМБ использовались известные методы такого тестирования [Москалев ЮИ, Стрельцова ВН, 1982, Худолей ВВ, 1984, Белицкий Г А , Худолей В В , 1986, Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (вЬР), 1992] Всего в этих опытах было использовано 254 крысы линии Вистар и 40 мышей-гибридов Р1(СВАхС57В1/6)

Методом проточной цитофлюорометрии с применением моноклональных антител, который использовался в опытах, была оценена выраженность следующих специфических маркеров — СБ 10, СБ34, СБ45, с-ки (СБ117) для полученных нами культур кардиомиобластов человека, а также оценено содержание в культуре клеток, находящихся на различных стадиях клеточного цикла,

5

которые, как известно (Elkind M M, Whitmore G T, 1967), различаются по радиорезистентности

Для изучения распределения по органам и тканям животного введенных внутривенно кардиомиобластов была использована методика радиоактивного мечения клеток с помощью технеция-99ш Для метки кардиомиобластов использовали элюат пертехнетата натрия (Na"m Тс04), полученного из генератора 99Мо/"т Тс путем элюирования физиологическим раствором. Объемная активность элюата 99шТс составляла 14,0 МБк/мл В стерильный флакон емкостью 10 мл помещали 1 мл суспензии кардиомиобластов (количество клеток составляло 1,5 х 10б). Затем во флакон добавляли 0,05 мл раствора двухлористого олова (0,02 мг) в 0,1 H соляной кислоте, 0,5 мл элюата "тТс (7,0 МБк) и 0,1 мл физиологического раствора Смесь перемешивали в течение 15 мин Реакцию проводили на ледяной бане Эффективность связывания 99шТс с клетками проверяли методом хроматографии на бумаге Filtrak-17 (Германия) В качестве подвижной фазы использовали ацетон-2 M хлорид натрия в соотношении 8 2 и 25% NH4 ОН - ЕЮН-Н20 в соотношении 1* 2* 5 Меченые КМБ вводили мышам-гибридам Fl(CBAxC57Bl/6) внутривенно, используя по 0,2 мл суспензии клеток на мышь (по 10 мКюри) Содержание метки (процент от введенного количества) измеряли, применяя колодезный детектор NZ-138 с помощью пересчетной установки NC-308 и высоковольтного блока NK-350/A через 15 мин и через 1 ч в сердце, легких, щитовидной железе, печени, селезенке, почках, крови и головном мозге животных

В работе, проведенной на 158 крысах линии Вистар, самцах в возрасте 2,5-3 мес в начале опыта и 92 мышах-гибридах Fl(CBAxC57Bl/6), самцах в возрасте 3-х мес был изучен терапевтический эффект системного введения КМБ на модели вызванной адриамицином кардиомиодистрофии, которая уже применялась в ряде исследований [Jensen RA, Acton EM, Peters JH , 1984, Danesi F et al, 2006] Крысы и мыши получали внутрибрюшинно инъекции адриамицина в общей дозе 10 мг/кг массы тела В проведенных на крысах и мышах опытах по трансплантации сингенных и ксеногенных кардиомиобластов на каждый срок исследования было 3 следующих отдельных групп (содержащих по 10-14 животных каждая)

1 Интактный контроль, 2 Воздействие адриамицина (АД), 3 АД и внутривенная трансплантация КМБ (сингенных - крыса/крыса или ксеногенных - человек/крыса, человек/мышь).

Эвтаназию животных для подробного количественного морфологического исследования проводили через 2 и 4 недели, а также через 3 и 6 мес после трансплантации клеток Действие адриамицина отдельно и адриамицина с последующей трансплантацией кардиомиобластов изучали методами количественной морфологии на продольных и поперечных срезах препаратов сердца животных (общая гистологическая и функциональная морфология миокарда), окрашенных гематоксилином и эозином, иммуноокрашенных на PCNA и им-

прегнированных методом А§>ТОК Морфометрические исследования на гистологических препаратах были выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений "ПУСТАЯ" с применением программы "МогрЬо51аг-2" и "Со1яиаШ-2"

В более ограниченных масштабах подобные исследования терапевтической эффективности кардиомиоцитов крыс и человека были выполнены также на ксеногенной модели, в которой реципиентами клеток были мыши-гибриды Р1(СВАхС57В1/6) с индуцированной адриамицином кардиомиодистрофией Кроме того, через месяц после ксеногенной трансплантации кардиомиобластов человека мышам с индуцированной адриамицином кардиомиодистрофией у них определяли содержание в мышечной ткани сердца специфических белков -металлотионеинов, уровень содержания которых позволяет оценить степень развившегося оксидативного стресса

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Общая характеристика культур МСК и КМБ.

В использованных нами условиях культивирования были найдены некоторые морфологические особенности клеточных культур в динамике Прилипшие ко дну культурального сосуда клетки начинают пролиферировать через 3-е сут при высокой исходной концентрации клеток К 7 суткам формируется сеть вытянутых фибробластоидных клеток, а к 10-14 суткам формируется сливной монослой В контрольных культурах (без добавления 5-азацитидина) клетки упаковываются "правильно", параллельно друг другу, не меняя размер и морфологию, оставаясь вытянутыми, фибробластоидными, мононуклеарными и при повторных пассажах В культурах после добавления 5-азацитидина морфология прилипающих клеток постепенно меняется. Примерно 1/3 клеток постепенно увеличивается в размерах, что приводит к нарушению "правильной" упаковки Через 2-3 недели после воздействия агента дифференцировки появляются тяжи, состоящие из 2-3 клеточных слоев, напоминающие миотрубочки, аналогично тому, как наблюдали Тот^а и соавторы [1999] в культурах клеток костного мозга крыс Клоногенный потенциал клеток, дифференцированных в направлении КМБ, после 3-го пассажа составлял примерно 30-50%

В наших условиях культивирования не было обнаружено сокращающихся, т е зрелых кардиомиоцитов, как это было показано в работе В И Шумакова и соавт [2003] Возможно, это связано с тем, что в наших условиях использовалась концентрация 5-азацитидина в 300 раз меньше, чем у данных авторов, хотя именно полученный нами тип клеток наиболее перспективен для целей трансплантации

Сравнительная радиочувствительность МСК и КМБ человека и крыс.

Дозовые кривые клеточной выживаемости МСК и КМБ представлены на рис 1

50 = 2,00 Гр №

50 = 2,99 Гр

В,Гр

" П,Гр

50 = 1,8 9 Гр

Д = 2,29 Гр

1! Д Гр

" д/>

Рис 1 Дозовые кривые выживаемости А. МСК крыс линии Вистар, Б КМБ крыс линии Вистар, В. МСК человека, Г КМБ человека

Экспериментальные данные удовлетворяют следующим уравнениям, рассчитанным методом наименьших квадратов с использованием "многомишенной, од-ноударной модели", зависимости клеточной выживаемости (Б) от дозы облучения

(О)

(50 =2,00/>,л = 0,9), (Д = 2,99/>,л = 1,2), (Д =1,89Гр,п = 2,6), (Д = 2,29/р, л = 2,1)

Полученные кривые при использовании полулогарифмической системы координат представляют для клеток крыс линии Вистар экспоненциальные зависимости (величины экстраполяционного числа для дозовых кривых выживаемости облученных МСК и КМБ значимо не отличаются от единицы), а для клеток человека - типичные 8-образные кривые с небольшим значением участка "плеча" и последующей экспонентой Значения величин средней клеточной леталь-

8

А = -0,2175-0,06

Б = -0,1455 + 0,08

В ^5" = -0,2345-0,41

Г ^¿' = -0,1905-0,32

ной дозы D0 для МСК хорошо согласуются с подобными значениями, ранее полученными для КОЕ-Ф [Friedenstem A J et al, 1981, Конопляников АГ, 1984, Imai Y, Nakao I, 1987, Shigeta С et al, 1988, Колесникова А И и др, 1992, Kreja et al, 1996] и несколько выше аналогичных значений для кроветворных стволовых клеток [Конопляников А Г, 1984] При этом, как для клеток крыс, так и для клеток человека характерно значимое повышение величины средней клеточной летальной дозы D0 в 1,2-1,5 раза при переходе от недифференцированных МСК к их более дифференцированному клеточному потомству -КМБ.

Так как определение радиочувствительности в условиях наших опытов велось в контролируемых условиях «ин витро», то это повышение радиочувствительности не связано с уровнем цитокинов, ростовых факторов или других агентов, влияющих на радиочувствительность клеток стволового типа, облучаемых в условиях «ин виво» [Конопляников А Г, 2004, Uckun F М et al, 1989], а является их собственным "имманентным" признаком По-видимому, повышение радиорезистентности стволовых клеток в процессе дифференци-ровки соответствует ранее отмеченной подобной закономерности в процессе коммитирования гемопоэтических стволовых клеток в более дифференцированные клетки-предшественники [Конопляников А Г , 1984], которое проявлялось в том, что коммитированные в определенные клеточные ростки кроветворные клетки-предшественники (КОЕ-ГМ, КОЕ-Мег и другие) были более резистентны к облучению, чем плюрипотентные КОЕ-С или КОЕ-ГЭММ [Scheding S, et al., 1996] Для мезенхимальных стволовых клеток подобный феномен не был известен, хотя близким к нему является наблюдение, согласно которому КОЕ-Ф, которые формируют, так называемые, "рыхлые колонии", обладают большей радиорезистентностью, чем КОЕ-Ф, которые формируют "плотные" колонии [Kolesnikova A.I, et al, 1995]

Обычно принято считать, что клеточная радиорезистентность часто обуславливается большей активностью репликативных и репаративных ферментов [Конопляников А Г, 2004], а для начального этапа дифференцировки стволовых клеток этот процесс обычно совмещен с активацией пролиферации клеток, ранее находившихся в стадии пролиферативного покоя (Potten С S et al, 2006) Другое, неальтернативное объяснение наблюдаемого эффекта может заключаться в том, что в пролиферирующей популяции КМБ в связи с началом диф-ференцировочных процессов возрастает доля клеток, которые находятся в радиорезистентных стадиях клеточного цикла (к ним, как известно [Elkmd М М, Whitmore G Т, 1967], относятся клетки, находящиеся в ранней стадии G! и в S-стадии клеточного цикла) В проведенных опытах удалось проверить это предположение и выявить хорошую корреляцию в сравнительном изменении радиорезистентности покоящихся МСК и КМБ и в изменении пролиферативной структуры популяций этих двух типов клеток в процессе роста культуры

Следует отметить, что обнаруженные феномены, несомненно, можно использовать и в практике получения культур мезенхимальных клеток и их дифференцирующегося потомства, предназначенных для трансплантации при проведении клеточной терапии, применяя показатели клеточной радиочувствительности и распределения клеток по стадиям клеточного цикла в качестве интегральных показателей степени дифференцировки выращенных в культуре стволовых клеток и для обеспечения контроля качества при массовой постановке таких аутологичных культур у различных пациентов

Распределение клеток культур МСК и КМБ по стадиям клеточного цикла.

При изучении клеток культур кардиомиобластов методом проточной ци-тофлюорометрии было показано, что они, как и МСК, относятся к СБЮ'0" СЭ34- С045" с-ки~, что характерно для стволовых клеток мезенхимального проис-хождения Эта характеристика была постоянной для всех изученных индивидуальных культур человека и крыс

Методом проточной цитофлюорометрии также было изучено распределение клеток в экспоненциальной фазе роста на 6-ом пассаже культур МСК и КМБ по стадиям клеточного цикла (табл 1), так как известно [Е1ктс1 М М, Шштоге в Т, 1967], что нахождение клеток в разных стадиях клеточного цикла приводит к изменению их радиочувствительности

Таблица 1 Распределение клеток 6-го пассажа культуры МСК и КМБ

по стадиям клеточного цикла

Тип культуры Доля клеток в Со №х - периоде, % Доля клеток в Б-периоде, % Доля клеток в С2 + М - периодах, %

МСК 46,1 ± 1,6 35,4 ± 1,5 18,5 ±1,2

КМБ 51,9 ±1,6 42,0 ±1,6 6,1 ±0,8

Как можно видеть, существенные различия двух типов культур связаны с сокращением доли клеток в фазах 02 и митоза у клеток, дифференцирующихся в направлении кардиомиобластов Так как стадии 02 и М характеризуются повышенной радиочувствительностью, то полученные прямые данные измерения величин Ц) (составляющих соответственно для культур МСК и КМБ крыс линии Вистар 2,00 Гр и 2,99 Гр, а для тех же культур человека -1,88 Гр и 2,29 Гр), хорошо коррелируют с результатами, характерными для изменения распределения по стадиям клеточного цикла Несомненно, что данный эффект отражает общую закономерность повышения клеточной радиорезистентности в процессе специфической дифференцировки, связанную с усилением активности ферментативных систем, обеспечивающих пролиферативную и репаративную функции клеток в системах клеточного обновления [Цыб А Ф и соавт, 2004] Аналогичная картина изменения активности ферментативных систем под влиянием активации нескольких транскрипционных регуляторов наблюдается в процессе дифференцировки чело-

веческих эмбриональных стволовых клеток в кардиомиоциты [Lev S, Kehat I, Gepstein L , 2005, Passier R, Mummeiy С , 2005, Penn M S , 2007]

Исследование кариотипа МСК и КМБ.

На заключительном этапе получения культуры клеток (4 недели после начала культивирования) дополнительно было проведено исследование кариотипа МСК и КМБ с определением содержания диплоидных и полиплоидных клеток в этих двух типах культур, полученных из костного мозга крыс Результаты этого исследования представлены в табл 2

Таблица 2 Количество диплоидных и полиплоидных клеток в культурах __крысиных МСК и КМБ_

Тип культуры 2п (42 хромосомы) %, М ± m 4п (84 хромосомы)%, М ± m

МСК 87 ±7 13 ±7

Кардиомиобласты 71 dt 11 29± 11

Как можно видеть, процесс дифференцировки плюрипотентных МСК в направлении кардиомиоцитов сопровождается повышением доли полиплоидных клеток в популяции, что также характерно для миогенной дифференцировки клеток в целостном организме [Хэм А, Кормак Д, 1983] и подтверждает наличие подобного дифференцировочного процесса и у клеток культуры МСК, обработанных 5-азацитидином В свою очередь, процесс такой дифференцировки, как показано в наших опытах, ведет к изменению клеточной радиочувствительности

Результаты тестирования мутагенного, канцерогенного и тератогенного эффекта трансплантированных кардиомиобластов.

Возможное мутагенное действие сингенных кардиомиобластов, введенных в/в крысам за 24 ч до эвтаназии, изучали по выходу хромосомных аберраций в клетках костного мозга Было показано, что введение КМБ крысам не повышает уровень спонтанного образования хромосомных аберраций в костном мозге Аналогичные результаты были получены в опытах по введению мышам алло-генных КМБ (крыс и человека) Это свидетельствует о том, что введение сингенных и аллогенных КМБ не приводит к повышению уровня спонтанного мутирования в пролиферирующих клетках нормальных тканей

При проведении опытов по изучению возможного канцерогенного действия трансплантированных разными способами (внутримышечно, подкожно, под капсулу почки, внутривенно, внутрибрюшинно) животным КМБ при 6 месячном наблюдении ни в одном случае не было обнаружено опухолевого роста При помещении КМБ в диффузную камеру, вшиваемую в брюшную полость крыс, через

11

3 мес в этих камерах также не было обнаружено опухолевого роста, что хорошо согласуется с результатами работ АЛ Фриденштейна и Е А Лурии [1980]

При изучении в опытах на крысах линии Вистар возможного влияния введения крысиных кардиомиобластов на течение беременности, родов, эмбриогенез, тератогенез и постнатальный онтогенез потомства первого поколения такой высокочувствительный биотест не выявил повреждающее действие длительного введения (в течение первых 20 сут первой беременности крыс) КМБ, полученных из МСК аутологичного костного мозга

Распределение в органах и тканях сингенного и ксеногенного организма меченых Тс99га кардиомиобластов.

Радиоактивно меченые КМБ крыс использовались для оценки доли клеток, достигающих сердечной мышцы крыс через 1 ч после в/в введения этих клеток интактным половозрелым крысам линии Вистар Результаты 3-х независимых опытов показали, что это значение составляет 1,4 ± 0,3%, что по порядку величины близко к подобной оценке, полученной для МСК крыс, которые были промечены индием-111 [Gao J et al, 2001]

Таблица 3 Распределение 99шТс-кардиомиобластов, полученных из МСК костного мозга человека, в организме интактных мышей-гибридов Fl(CBAxC57Bl/6)

(% от введенного уровня радиоактивности)

№ Ткань или орган (доля Через 15 мин после Через 60 мин после

от массы тела, %) введения введения

1 Кровь (7,2) 10,2 ±1,24 9,86 ±2,14

2 Щитовидная ж-за (0,1) 0,020 ± 0,003 0,018 ±0,003

3 Легкие (0,6) 8,49 ±1,24 8,88 ±2,93

4 Печень (3,8) 22,8 + 2,50 22,5+4,24

5 Почки (1,2) 23,9 ±2,64 22,0 ± 2,64

6 Селезенка (0,3) 1,35 ±0,22 1,34 ±0,24

7 Головной мозг (1,1) 0,041 ± 0,005 0,035 ± 0,005

8 Сердце (0,5) 0,28 ± 0,04 0,22 ± 0,04

В таблице 3 приведены результаты опытов, в которых изучено распределение в различных органах и тканях организма мышей радиоактивной метки, связанной с КМБ человека Как можно видеть, наибольшая радиоактивность в этом случае зарегистрирована в печени, почках, крови и легких В сердце мышей поступление кардиомиобластов человека через 1 ч после в/в введения клеток ниже - 0,22 ± 0,04%, чем в аналогичных опытах по введению крысам ауто-логичных кардиомиобластов, но эта величина значимо выше, чем поступление таких клеток в щитовидную железу Низкий уровень радиоактивности в щитовидной железе одновременно подтверждает прочную связь радиоактивной мет-

ки и КМБ в данный период, так как известно, что "свободная" радиоактивная метка 99шТс после попадания в организм может избирательно накапливаться в этом органе

Терапевтическое действие трансплантированных кардиомиобластов в модели индуцированной адрнамицином кардиомиодистрофии.

В опытах, которые были посвящены изучению терапевтического эффекта трансплантированных КМБ с использованием модели индуцированной адриа-мицином (АД) кардиомиодистрофией, было обнаружено, что через две недели после окончания введения АД в миокарде подопытных крыс выявляются морфологические признаки токсико-дистрофических изменений В этот же срок на препаратах, иммуноокрашенных на РСКА, регистрируется угнетение пролиферации кардиомиоцитов и соединительнотканных элементов, наблюдается дезорганизация структуры ядра кардиомиоцитов и клеток стромы

Через две недели после затравки и введения КМБ подопытным крысам гис-топатологический рисунок миокарда крыс мало отличается от наблюдаемого при действии только одного адриамицина На гистологических препаратах отчетливо просматриваются очаговые дистрофические изменения со стороны кардиомиоцитов Вместе с тем, у животных этих групп в субэпикардиальных зонах левого и правого желудочков определяются изменения со стороны мик-роциркуляторного русла и в периваскулярной строме В просвете капилляров и периваскулярно появляются небольшие группы клеток с ярко выраженной реакцией на РСЫА Вокруг капилляров отмечается повышенное содержание перицитов В ядрах кардиомиоцитов этой группы крыс увеличиваются размеры ядрышек и усиливается базофилия саркоплазмы В зонах миокарда, пораженных адриамицином, визуализируется частичное восстановление поперечной исчерченности и миофибриллярной структуры мышечных волокон

Через четыре недели после начала опыта при введении только одного адриамицина в сердце подопытных животных определяются морфологические признаки как токсико-дистрофических изменений, так и начинающейся репара-тивной регенерации миокарда При введении КМБ репаративные процессы в миокарде значительно усилены Подтвервдением этому служит статистически достоверное увеличение размеров кардиомиоцитов и рост их пролиферативной и/или репаративной активности, а также частичное восстановление исходной гистологической картины сердечной мышцы В этот срок удалось выявить картины кариокинеза миоцитов сердечной мышцы крыс в случае трансплантации КМБ и проведения дополнительной терапии

Описанные морфологические изменения в течение 2 и 4 недель после начала опыта получили подтверждение и при проведении количественных морфологических измерений При этом по ряду использованных показателей выявлены статистически значимые различия эффекта терапии поврежденной сердечной мышцы трансплантацией КМБ с действием одного только адриамицина (особенно по мас-

се сердца, по индексу PCNA кардиомиобластов и стромы и по средней площади среза кардиомиобластов) Подобные результаты по лечебному эффекту трансплантации ксеногенных человеческих КМБ были получены также и при использовании мышей, получавших адриамицин, в качестве реципиентов клеток

В более поздние сроки наблюдения (3 и 6 мес от начала опыта) при введении крысам с индуцированной кардиомиодистрофией КМБ, полученных из ау-тологичного костного мозга, большинство различий между группами животных сглаживаются, однако, различие по такому интегральному показателю, как масса сердца, сохраняется (полное восстановление массы сердца в 3 группе до уровня контроля и неполное восстановление в случае действия только одного адриамицина). При этом в случае воздействия только одного адриамицина сохраняется картина перманентной клеточной гибели, о чем сообщали ранее и другие авторы [Jensen R А et al, 1984, Danesi F et al, 2006]

Известно [Tomita S et al, 1999, Keefe DL et al, 2001], что повреждающее действие адриамицина на сердце реализуется в условиях развития значительного "оксидативного стресса" В опытах по изучению содержания особых белков - металлопротеинов в сердечной мышце мышей, получавших только адриамицин или трансплантацию ксеногенных КМБ после введения адриамицина, было показано, что трансплантация клеток через месяц после начала опыта ведет к ослаблению проявлений оксидативного стресса (табл 4)

Таблица 4 Содержание металлотионеинов в тканях сердца мышей (мкг/г) через месяц после введения адриамицина и трансплантации человеческих кардиомиобластов

(в группах по 4-5 мышей)

№ Группа Содержание металлотионеинов (мкг/г)

1. Интактный контроль 17,94 ±0,68

2 Адриамицин 27,59 ± 0,58

3 Адриамицин + кардиомиобласты 24,60 ± 0,32*

* - значимое различие (р<0,05) с группой 2

Таким образом, результаты комплексного количественного морфо-функционального анализа свидетельствуют о том, что в сердечной мышце животных, получивших инъекции адриамицина, терапевтический эффект введения сингенных КМБ проявляется в стимуляции пролиферации как кардиомиобластов, так и стромальных элементов, что приводит к восстановлению исходной гистологической картины миокарда Наблюдаемые на начальном этапе эффекты, по-видимому, связаны с событиями, которые развертываются в периваску-лярной строме миокарда Не исключено, что своеобразный "трофический " эффект, регистрируемый при применении кардиомиоцитов, реализуется также че-

14

рез микроциркуляторное русло и, возможно, он связан также с усилением не только регенерации кардиомиоцитов и стромальных элементов, но усилением ангиогенеза Такая трактовка полученных данных хорошо согласуется с современными представлениями о природе репаративных процессов в поврежденной сердечной мышце, индуцированных трансплантацией МСК или их дифференцированного потомства [Penn М S , 2007]

Полученные в данной диссертационной работе материалы позволили количественно охарактеризовать КМБ, получаемые путем непродолжительной обработки высаженных в культуру клеток костного мозга 5-азацитидином в начальный период культивирования МСК Было обнаружено, что в процессе дифференцировки этого типа стволовых клеток взрослого организма в направлении кардиомиоцитов повышается их радиорезистентность, что может использоваться как один из интегральных количественных показателей при контроле качества получаемых для целей клеточной терапии культур стволовых клеток При сравнительном изучении МСК и КМБ охарактеризованы и ряд их других биологических свойств, а также показана безопасность введения КМБ в организм в плане их возможного мутагенного, тератогенного и канцерогенного действия На модели индуцированной кардиомиодистрофии, вызванной введением крысам и мышам адриамицина, показано лечебное действие сингенных и ксе-ногенных трансплантаций КМБ, полученных из костномозговых МСК Эти данные создают научный фундамент для начала клинических испытаний методов клеточной терапии пациентов с поражениями сердечной мышцы различного генеза, что согласуется с направлением аналогичных работ, проводящихся в последние годы в нашей стране и за рубежом [Цыб А Ф и др, 2004, Копор-lyannikov A.G et al, 2007, Penn M S , 2007]

ВЫВОДЫ

1 Разработана методика получения индивидуальных культур клеток-предшественников кардиомиоцитов (кардиомиобластов) из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека и крыс и охарактеризованы их биологические свойства (радиочувствительность, распределение радиоактивно меченых клеток по тканям при системном введении, выраженность ряда специфических маркеров, кариотип, особенности роста культур, клоногенная активность и др), показана безопасность их введения в организм в отношении мутагенного, тератогенного и канцерогенного эффекта

2 Показано, что дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток костного мозга двух изученных видов в направлении кардиомиобластов приводит к повышению клеточной радиорезистентности по тесту клонообразования в культуре с увеличением величины средней клеточной летальной дозы D0 с 2,00 Гр до 2,99 Гр (МСК и КМБ крыс линии Вистар) и с 1,89 Гр до 2,29 Гр (МСК и КМБ человека) На примере дифференцировки МСК в направлении кардиомиоцитов получили дальнейшее развитие представления о характере изменения

радиочувствительности плюрипотентных стволовых клеток при их начавшейся дифференцировки в определенном направлении, что может использоваться в процессе своеобразного «контроля качества» культур, получаемых для целей клеточной терапии

3 Трансплантация крысам линии Вистар кардиомиобластов, полученных культивированием и дополнительной обработкой специфическим индуктором кар-диомиогенной дифференцировки (5-азацитидином) мезенхимальных стволовых клеток костного мозга взрослых крыс той же линии, при тяжелой форме индуцированной кардиомиодистрофии ослабляет морфологические проявления поражения сердечной мышцы и ускоряет протекание и полноту репаративных процессов, как в относительно ранние сроки (2-4 недели после повреждения тканей мышцы), так и более отдаленный период - 3 и 6 мес от начала эксперимента При этом репаративные процессы индуцируются при относительно невысоком уровне попадающих в сердце и другие органы и ткани клеток-предшественников, что было подтверждено результатами изучения «хоминга» в организме радиоактивно меченых с помощью Те-99ш кардиомиобластов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Коноплянников А Г, Колесникова А И, Южаков В JB., Бандурко Л H, Павлов В В, Коноплянникова О А, Лепехина Л А, Кальсина С Ш, Семенкова И В, Пет-риев В M, Петрова Г А, Ключ В Е, Сморызанова О А Использование импульсного электрического поля с определенными параметрами для повышения эффективности трансплантации кардиомиобластов в организм животных с индуцированной адриамицином кардиомиодистрофией" Тезисы докладов Международного совещания "Человек и электромагнитные поля" -г Саров -2003 - С 19-20

2 Семенкова И В , Колесникова А И, Лепехина Л А, Кальсина С.Ш, Агаева Е В , Коноплянников А Г Различия в радиочувствительности мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крыс и человека и полученных из них кардиомиобластов//Цитокины и воспаление, 2005 -Т 4,№2 - С 112

3 Цыб А Ф, Коноплянников А Г., Колесникова А и, Павлов В В , Каплан M А, Пасов В В , Поповкина О Е , Курпешева А.К, Даниленко А А, Южаков В В , Замулаева И А , Селиванова Е И, Коноплянникова О А, Ключ В Е, Пег-риев В M, Лепехина Л А, Кальсина С Ш, Семенкова И В , Агаева Е В , Бандурко Л H, Коноплянников M А, Проскуряков С Я Использование мезенхимальных стволовых клеток аутологичного костного мозга для получения клеточных культур, пригодных для трансплантации при терапии различных заболеваний//Цитокины и воспаление, 2005 -Т 4, №2 - С 113-114

4 Konoplyanmkov A G, Petrov V N, Smoryzanova О А, Semenkova IV Suppression of oxidative stress as one of adaptogemc mechanisms in therapeutic action of mesenchymal stem cells or cardiomyoblasts transplantations // In Vin World Congress International society for adaptive mediane (ISAM) - Moscow, Russia, 2006 -P 79.

5 Цыб А Ф, Рошаль JIМ, Южаков В В , Коноплянников А Г, Сушкевич Г Н, Бандурко Л Н, Ингель И Э , Семенова Ж Б , Коноплянникова О А, Лепехина Л А, Кальсина С Ш, Верховский Ю Г, Шевчук А С , Семенкова И В Морфо-функциональное изучение терапевтического эффекта аутологичных мезенхи-мальных стволовых клеток при экспериментальной диффузной травме головного мозга//Клеточные технологии в биологии и медицине, 2006 -№3 - С 157-163

6 Konoplyanmkov A G , Lepechma L А, Kalsma S S , Semenkova I, et al Development of methods for medical application of autologous mesenchymal stem cells (MSC), produced from their cardiomyoblast, and also conditioned media of MSC for therapy of various diseases // In "Proceedings of the British-Russian workshop in association with the European Commission «Stem cells policy, research and innovations European Union - Russian Federation Perspectives» ", 2007 - P 86-90

Подписано к печати 16 04 2008 г Формат 60x84/16 Уел п л 1,0 Тираж 100 экз Заказа 15 Отпечатано в ГУ «ВНИИГМИ-МЦД», 249035, Обнинск, ул Королева, 6

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семенкова, Ирина Витальевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ, ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЕ ПОТЕНЦИИ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ (Обзор литературы)

1.1. Сравнительная характеристика МСК среди других типов стволовых клеток взрослого организма

1.2. Дифференцировочные потенции МСК в культуре и целостном организме

1.3. Терапевтический эффект МСК и их дифференцирующегося клеточного потомства при поражениях сердечной мышцы

1.4. Радиочувствительность МСК

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Получение культур кардиомиобластов из мезенхимальных стволовых клеток крысы и человека

2.2. Исследование радиочувствительности МСК и КМБ

2.3. Анализ кариотипа КМБ

2.4. Тестирование тератогенной, канцерогенной и мутагенной активности трансплантации КМБ

2.5. Метод проточной цитофлюорометрии для выявления специфических маркеров клеток стволового типа и оценки распределения клеток в популяции по фазам цикла

2.6. Методика мечения КМБ с помощью Тс-99ш

2.7.Схема экспериментов по изучению эффективности трансплантации КМБ на моделях индуцированной адриамицином кардиомиодистрофии у крыс и мышей

2.8. Тестирование жизнеспособности клеток культур МСК и КМБ при хранении при низкой температуре (2-4° С) и после замораживания в жидком азоте

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Общая характеристика культур МСК и КМБ

3.2. Сравнительная радиочувствительность МСК и КМБ человека и крыс

3.3. Распределение клеток культур МСК и КМБ по стадиям клеточного

Цикла

3.4. Исследование кариотипа МСК и КМБ

3.5. Результаты тестирования мутагенного, канцерогенного и тератогенного эффектов КМБ

3.6. Распределение в органах и тканях сингенного и ксеногенного организма меченых Тс-99ш кардиомиобластов

3.7. Терапевтическое действие трансплантированных кардиомиобластов в модели индуцированной адриамицином кардиомиодистрофии

3.8. Жизнеспособность МСК и КМБ при хранении в криобанке

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 65 Выводы 70 Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Радиочувствительность мезенхимальных стволовых клеток и получаемых из них для целей клеточной терапии клеток-предшественников кардиомиоцитов"

Актуальность темы исследования.

В последние годы активно проводятся исследования биологических характеристик различных типов стволовых клеток и возможностей их применения в клинике, в первую очередь, для трансплантации с целью замещения поврежденных и погибших клеток [Sell S., 2004; Penn M.S., 2007], в том числе при лечении онкологических больных после интенсивной лучевой или комбинированной терапии, в результате которой будут повреждены не только клетки злокачественного новообразования, но и нормальные клетки различных жизненно важных органов пациента.

При этом наиболее перспективным считается использование стволовых клеток костного мозга взрослого человека, размноженных в культуре до необходимого количества и направленных специальными индукторами в сторону дифференцировки в различные клеточные линии, включая клетки-предшественники гемопоэтической стромы, остеоциты, хондроциты, гепатоциты, миоциты скелетных мышц, кардиомиоциты, нейральные клетки [Цыб А.Ф. и др., 2004, Dezawa М., Hoshino М., Ide С., 2005]. Использование этих клеток будет способствовать восстановлению соответствующих поврежденных тканей.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), открытые и обстоятельно изученные в лаборатории отечественного исследователя А.Я.Фриденштейна, в последние годы стали одним из основных исходных элементов для проведения клеточной терапии, а в недалеком будущем, несомненно, станут таким же агентом для проведения генной терапии. В связи с этим актуальной становится проблема достаточно быстрой и воспроизводимой интегральной характеристики МСК и их дифференцированного клеточного потомства, производимых для целей, клеточной терапии с использованием различных критериев. Одним из этих критериев является клеточная радиорезистентность выращенной культуры клеток в стандартных условиях облучения. В литературе, также как и в наших собственных работах, есть достаточно много сведений о радиационной чувствительности клеток исходных культур МСК (начиная еще со времени, когда для их обозначения использовали термин - колониеобразующие единицы фибробластов - КОЕ-Ф), полученных из костного мозга человека и различных видов животных (мыши, крысы, морские свинки, собаки и др.). Клетки-предшественники гемопоэтической стромы всегда были более резистентными, чем гемопоэтические клетки-предшественники, величины их средней клеточной дозы Do при действии редкоионизирующей радиации были порядка

1,8-2 Гр и более по сравнению примерно с 1-1,3 Гр для плюрипотентных и коммутированных гемопоэтических стволовых клеток. Можно полагать, что именно по этой причине является эффективной трансплантация клеток костного мозга или очищенных концентратов гемопоэтических стволовых клеток при лечении острого лучевого поражения организма, подвергшегося действию ионизирующей радиации в «костномозговом» диапазоне доз общего облучения, так как пересаженные стволовые кроветворные клетки обеспечиваются полноценным «микроокружением» за счет выживших при данных дозах облучения стромальных стволовых клеток костного мозга, обладающих большей радиорезистентностью. В тоже время, сведения о чувствительности к радиации дифференцированного в различном направлении клеточного потомства МСК практически отсутствуют. Одновременно с этим, биологические характеристики таких клеток и безопасность использования их в клинике изучены недостаточно, в том числе и по такому интегральному тесту, как клеточная радиочувствительность, что делает актуальным сравнительное изучение радиобиологических характеристик МСК и их начавшегося дифференцироваться в направлении кардиомиоцитов клеточного потомства.

Цель работы. Целью данной работы явилась разработка методов получения для радиобиологических исследований культур мезенхимальных стволовых клеток и выращиваемых из них клеток-предшественников кардиомиоцитов (кардиомиобласты,. КМБ) из костного мозга человека и лабораторных крыс, изучение количественных характеристик таких клеточных культур, включая их радиочувствительность при Г стандартном гамма- облучении в условиях in vitro и получение радиоактивно меченых с помощью технеция -99т клеточных культур для изучения способности КМБ восстанавливать поврежденный миокард у лабораторных животных.

Основные задачи исследования:

- Разработать метод получения МСК и клеток-предшественников кардиомиоцитов - КМБ-в культурах клеток костного мозга человека и крыс линии Вистар и изучить биологические характеристики МСК и КМБ, в том числе их радиочувствительность при воздействии гамма-излучения Со-60 in vitro, которые можно было бы использовать при контроле качества индивидуально получаемых культур клеток-предшественников.

- Разработать метод радиоактивного мечения КМБ и использовать его для количественной характеристики распределения клеток-предшественников - КМБ при их внутривенном введении лабораторным животным.

-Разработать модель повреждения миокарда на экспериментальных животных (мышь, крыса) и использовать ее для оценки терапевтической эффективности процедуры внутривенной трансплантации полученных КМБ.

Научная новизна.

1. Впервые разработана методика получения индивидуальных культур кардиомиобластов из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека и лабораторных животных; охарактеризованы биологические свойства полученных клеток стволового типа (радиочувствительность, выраженность ряда специфических маркеров, кариотип, особенности роста культур, клоногенная активность, распределение радиоактивно меченых клеток по тканям при системном введении), позволяющие контролировать процесс их культивирования; показана безопасность их введения в организм в отношении мутагенного, тератогенного и канцерогенного эффекта.

2. Показано, что внутривенная трансплантация кардиомиобластов при тяжелой форме индуцированной адриамицином кардиомиодистрофии ослабляет проявление тяжелого поражения сердечной мышцы и ускоряет протекание и полноту репаративных процессов, как в относительно ранние сроки (2 и 4 недели после химического повреждения тканей), так и более отдаленный период - 3 и 6 месяцев от начала эксперимента, несмотря на-низкий уровень поступления кардиомиобластов в ткани сердца, что было показано путем изучения процесса "хоминга" радиоактивно меченых технецием-99т кардиомиобластов.

Практическая значимость работы. Сведения, полученные в работе, служат экспериментальной базой для клинического применения клеток-предшественников кардиомиоцитов - КМБ, а также основой для разработки методов биологической характеристики и контроля качества клеточных культур, приготовленных из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Материалы диссертационной работы использованы при подготовке заявки на получение разрешения Росздравнадзора МЗиСР РФ от 11 августа 2006 года за №ФС-2006/206 на применение новой медицинской технологии производства культур МСК и КМБ человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработаны методики получения индивидуальных культур МСК и получаемых из них культур клеток-предшественников кардиомиоцитов - КМБ, для которых охарактеризованы основные биологические свойства и выявлено различие в радиочувствительности, которое может использоваться при контроле качества получаемых для практического применения культур мезенхимальных стволовых клеток и их более дифференцированного клеточного потомства;

- на модели индуцированной у лабораторных животных кардиомиодистрофии показан лечебный эффект системной трансплантации КМБ, который одновременно безопасен в отношении развития в ранние и отдаленные периоды неблагоприятных последствий.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на I Международной конференции "Человек и электромагнитные поля" (г. Саров, 2003), VIII Конгрессе Международного общества по адаптационной медицине (г. Москва, 2006), Британско-российском совещании "Стволовые клетки: законодательство; исследования и инновации. Перспективы сотрудничества России и Великобритании" (г. Москва, 2007)". Диссертация апробирована на конференции экспериментального сектора ГУ МРНЦ РАМН 26 марта 2008 г. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГУ «Медицинский радиологический научный центр» РАМН по темам: 1. Разработка методов С культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и его эквивалентов у лабораторных животных и человека, создание экспериментальной модели,их трансплантации и специфического воздействия на микроокружение стволовых клеток при> лечении заболеваний, связанных с повреждением кардиомиоцитов, включая повреждения сердца у онкологических больных, подвергающихся химиолучевой терапии, и подача заявки для проведения ограниченных клинических испытаний (2002-2005 гг., № гос. i регистрации 01.20.03 03637 ); 2. Экспериментальные и клинические исследования по разработке и ограниченным клиническим испытаниям методов клеточной терапии, основанных на применении культур мезенхимальных стволовых клеток у пациентов с поражением жизненно важных органов, в том числе у больных после лучевой и химиотерапии (2006-2009 гг., № гос. регистрации 0120.0 602178).

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Семенкова, Ирина Витальевна

выводы

1. Разработана методика получения индивидуальных культур клеток-предшественников кардиомиоцитов (кардиомиобластов) из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека и крыс, охарактеризованы биологические свойства полученных клеток стволового типа (радиочувствительность, распределение радиоактивно меченых клеток по тканям при системном введении, выраженность ряда специфических маркеров, кариотип, особенности роста культур, клоногенная активность и др.); показана безопасность их введения в организм в отношении мутагенного, тератогенного и канцерогенного эффекта.

2. Показано, что дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток костного мозга двух изученных видов в направлении кардиомиобластов приводит к повышению клеточной радиорезистентности по тесту клонобразования в культуре с увеличением величины средней клеточной летальной дозы Do с 2,00 Гр до 2,99 Гр (МСК и КМБ крыс линии Вистар) и с 1,89 Гр до 2,29 Гр (МСК и КМБ человека).

Таким образом, на примере дифференцировки МСК в.направлении кардиомиоцитов получили дальнейшее развитие представления о характере изменения радиочувствительности плюрипотентных стволовых клеток при их начавшейся дифференцировке в определенном направлении, что может использоваться в процессе своеобразного "контроля качества" культур, получаемых для целей клеточной терапии.

3. Трансплантация крысам линии Вистар кардиомиобластов, полученных культивированием и дополнительной обработкой специфическим индуктором кардиомиогенной дифференцировки (5-азацитидином) мезенхимальных стволовых клеток костного мозга взрослых крыс той же линии, при тяжелой форме индуцированной кардиомиодистрофии ослабляет морфологические проявления поражения сердечной мышцы и ускоряет протекание и полноту репаративных процессов, как в относительно ранние сроки (2-4 недели после повреждения тканей мышцы), так и более отдаленный период - 3 и 6 месяцев от начала эксперимента.

При этом репаративные процессы индуцируются относительно невысоким уровнем попадающих в сердце клеток-предшественников, что было подтверждено результатами изучения "хоминга" в организме радиоактивно меченых с помощью Те-99ш кардиомиобластов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семенкова, Ирина Витальевна, Обнинск

1. Белицкий Г.А., Худолей В.В. Краткосрочные тесты в системе выделения карциногенных для человека химических соединений. // Вопросы онкологии, 1986, т. 32, №4, стр. 3-11.

2. Бонд В. Желудочно-кишечный синдром. В кн.: «Сравнительная клеточная и видовая радиочувствительность. М., Атомиздат, 1974, стр. 159-166.

3. Ван Беккум Д. Трансплантация костного мозга и частичная защита организма для оценки выживаемости популяции клеток. В кн.: «Сравнительная клеточная и видовая радиочувствительность. М., Атомиздат, 1974, стр. 141-158.

4. Давиденкова Е. Ф. (ред.) Хромосомные болезни человека. JL, Медицина, 1965, 188 стр.

5. Зяблицкий В.М., Конопляников А.Г., Масленникова P.JI., Романовская В.Н. Количественные закономерности миграции стволовых кроветворных клеток. // Радиационная биология, 1980, т.20, № 3, стр. 368-372.

6. Источники, эффекты и опасность ионизирующей радиации: Доклад Научного комитета ООН по действию атомной радиации Генеральной Ассамблее за 1988 г. с, прилож., т.1, (пер. с англ.). М., Мир, 1992, 552 стр.

7. Конопляников А.Г. Радиобиология стволовых клеток. М., Энергоатомиздат, 1984, 120 стр.

8. Конопляников А.Г. Клеточные основы радиационных эффектов человека. В кн.: «Радиационная медицина», т.1, М, ИздАТ, 2004, стр. 189-277.

9. Конопляников А.Г., Рудакова С.Ф. Радиочувствительность клеток костного мозга морских свинок, формирующих колонии фибробластов в монослойных культурах. //Радиобиология, 1973,т. 13, № 1,стр. 138-140.

10. Кузьменко Г.Н., Панасюк А.Ф., Фриденштейн А.Я., Кулагина Н.Н. Радиочувствительность клеток костного мозга, формирующих колонии фибробластов)Б монослойных культурах. // Бюлл. эксп. биол. и мед., 1972, т. 73, № 10, стр. 94-97.

11. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Клинникова М.Г., Молодых О.П. Ультраструктурные проявления нарушений регенерации кардиомиоцитов после воздействия доксорубицина. Морфология, 2005, т. 128, № 4, стр. 81-84.

12. Михайлова Г.Ф. Анализ результатов цитогенетических исследований населения, проживающего на радиоактивно-загрязненных территориях после чернобыльской аварии. //Автореф. докт. дисс., Обнинск, 2007, 32 стр.

13. Москалев Ю.И., Стрельцова В.Н. Лучевой канцерогенез в проблеме радиационной защиты. М., Энергоатомиздат, 120 стр.

14. Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP). М., 1992, 78 стр.

15. Румянцев А.Г., Масчян А.А. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей. М., изд. МИА, 2003, 912 стр.

16. Стрелин Г.С., Ярмоненко С.П. Процессы восстановления в облученном организме. В кн.: «Пострадиационная репарация», М., Атомиздат, 1970, стр. 264-313.

17. Фесенко В.П. (отв. ред.). Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.", 2000; Римедиум, 288 стр:

18. Фриденштейн А.Я:, Лурия E.AVКлеточные основы кроветворного микроокружения. М., Медицина, 1980, 216 стр.

19. Фриденштейн'А.Я:, Чайлахян Р.К;, Лалыкина К.С. О фибробластоподобных клетках в культурах кроветворной ткани морских свинок. // Цитология, 1970, т. 12, №9, стр. 1147-1155.

20. Худолей В.В. Характеристика современных мутагенных тестов для выявления канцерогенов окружающей среды: // Успехи соврем, биологии,. 1984', т. 32, №2, стр. 177-192.

21. Хэм А., Кормак Д; Мышечная ткань. В кн. «Гистология» (пер. с англ.), 1983, Mi,. Мир, т. 3, стр. 241-291.

22. Чайлахян Р.К., Фриденштейн А.Я., Васильев А.В. Формирование клонов в монослойных культурах костного мозга и селезенки. // Бюлл. эксп. биол. и мед., 1970, т. 69, № 2, стр. 94-98.

23. Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А. Радиобиология человека и животных. М., Высшая школа, 2004, 552 стр.

24. Abedin M., Tintut Y., Demer L.L. Mesenchymal stem cells and the artery wall. I I Circulation Res., 2004, v. 95, n. 7, pp.671-676.

25. Abramson S., Miller R.G., Phillips R.A. The identification in adult bone marrow of pluripotent and restricted stem cells of the myeloid and lymphoid systems. // J. Exp. Med., 1977, v. 145, n. 6, pp. 1567-1579.

26. Anversa P., Kajstura J., Leri A., Bolli R. Life and death of cardiac stem cells: a paradigm shift in cardiac biology. // Circulation, 2006, v.l 13, n.l 1, pp. 1451-1463.

27. Anversa P., Leri A., Rota M., Hosoda Т., Bearzi C., Urbanek K., Kajstura J., Bolli R. Concise review: stem cells, myocardial regeneration, and methodological artifacts. Stem Cells, 2007, v.25, n.3, pp.589-601.

28. Baxter M.A., Wynn R.F., Jowitt S.N., Wraith J.E., Fairbairn L J., Bellantuono I. Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion.// Stem Cells, 2004, v.22, n.5, pp. 675-682.

29. Berger M.G., Veyrat-Masson R., Rapatel C., Descamps S., Chassagne J., Boiret-Dupre N. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. // Stem Cells, 2006, v. 24, n.12, pp. 2888 -2890.

30. Bichay T.J., Roy R.M. Modification of survival and hematopoiesis in mice by tocopherol injection following irradiation. // Strahlenther. Onkol., 1986, v. 162, n. 6, pp. 391-399.

31. Bieback K., Kliiter H. Mesenchymal stromal cells from umbilical cord blood: // Curr. Stem Cell Res .Ther., 2007, v. 2, n. 4, pp. 310-323.

32. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells. // J. Orthop. Res., 1991, v. 9, п., pp. 641-650.

33. Caplan A.I., Bruder S.P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. // Trends Mol. Med., 2001, v. 7, п., pp. 259-264.

34. Caspi O., Gepstein L. Potential applications of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. // Ann. N.Y. Acad.' Sci., 2004; v. 1015, п. 1, pp. 285 298.

35. Caspi O., Gepstein L. Stem cells for myocardial repair. // Eur. Heart J. Suppb, 2006, v.8, Suppl. E, pp. 43-54.

36. Chalmers A.I., Bentzen S.M., Buffa F.M. A general framework for quantifying the effects of DNA repair inhibitors on radiation sensitivity as a function of dose. // Theor. Biol. Med. Model., 2007, n. 4, pp. 25-31.

37. Chamberlain G., Fox J., Ashton В., Middleton J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. // Stem Cells, 2007; v. 25, n. 11, pp. 2739 2749.

38. Chien K.R. Lost and found: cardiac stem cells therapy revisited.// J. Clin. Invest., 2006, v. 116, n. 7, pp. 1838-1840.

39. Cognet P. A., Minguell J ,J. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells. // J. Cell Physiol., 1999, v. 181, n.l, pp.67-73.

40. Dai W., Hale S. L., Martin B: J., Kuang J.-Q., Dow J. S., Wold L. E., Kloner R. A. Allogeneic mesenchymal stem cell transplantation in postinfarcted rat myocardium: short- and long-term effects. // Circulation, 2005, v. 112, n. 2, pp. 214 223.

41. Danesi F., Malaguti M., Nunzio M.D., Maranesi M., Biagi P.L., Bordoni A. Counteraction of adriamycin-induced oxidative damage in rat heart by selenium dietary supplementation. J. Agric. Food Chem., 2006, v. 54, n. 4, pp. 1203-1208.

42. Deans R.J., Moseley A.B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Exp. Hematol., 2000, v. 28, n. 8, pp. 875-884.

43. Dengler T.J., Katus H.A. Stem cell therapy for the infarcted heart ("cellular cardiomyoplasty"). // Herz, 2002; v. 27, n.7, pp. 598-610.

44. Dezawa M., Hoshino M., Ide C. Treatment of neurodegenerative diseases using adult bone marrow stromal cell-derived neurons. // Expert Opinion on Biological Therapy, 2005, v. 5, n.4, pp. 427-435.

45. Down J.D., Boudewijn A., van Os R., Thames H.D., Ploemacher R.E. Variations in radiation sensitivity and repair among different hematopoietic stem cell subsets following fractionated irradiation. // Blood, 1995, v. 86, n. 1, pp. 122-127.

46. Elkind M.M., Whitmore G.T. The radiobiology of cultured mammalian cells. N.-Y. -London Paris, Gordon & Breach Sci. Publ., 1967, 616 pp.

47. Feng S.W., Yao X.L., Li Z., Liu T.Y., Huang W., Zhang C. In vitro bromodeoxyuridine labeling of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells. // Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 2005, v. 25, n. 2, pp. 184-186.

48. Friedenstein A.J. Stromal mechanisms of bone marrow: cloning in vitro and retransplantation in vivo. // Haematol. Blood Transfus., 1980, v.25, pp. 19-29.

49. Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Gerasimov U.V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. // Cell Tissue Kinet., 1987, v. 20, n. 3, pp. 263-272.

50. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. // Cell Tissue Kinet., 1970, v.3, n. 4, pp. 393-403.

51. Friedenstein A.J., Latzinik N.V., Gorskaya U.F., Sidorovich S.Y. Radiosensitivity and postirradiation changes of bone marrow clonogenic stromal mechanocytes. // Int. J. Radiat .Biol. Relat .Stud. Phys. Chem. Med., 1981, v.39, n.5, pp.537-546.

52. Friedenstein A.J., Latzinik N.W., Grosheva A.G., Gorskaya U.F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. //Exp Hematol., 1982, v.10, n.2, pp.217-227.

53. Fukuda K. Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stem cells for cardiovascular tissue engineering.// Artif. Organs. 2001, v.25, n.3, pp. 187-93.

54. Gao J., Dennis J.E., Muzic R.F., Lundberg M., Caplan A.I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. // Cells Tissues Organs, 2001, v. 169, n. 1, pp. 12-20.

55. Gepstein L. Cardiovascular therapeutic aspects of cell therapy and stem cells. // Ann. N.Y. Acad. Sci., 2006, v. 1080, n. 1, pp. 415 425.

56. Ghilzon R., McCuIloch C.A., Zohar R. Stromal mesenchymal progenitor cells. // Leuk. Lymphoma, 1999, v.32, n.3-4, pp. 211-221.

57. Guettier C. Which stem cells for adult liver? // Ann Pathol., 2005, v. 25, n. l,pp.v33-44.

58. Guo Z., Yang J., Liu X., Li X., Hou C., Tang P.H:, Mao N. Biological features of ' mesenchymal stem cells from human bone marrow; //Chin: Med:; J- (Engl):, 2001, v.l 14, n.9, pp. 950-953. ;;

59. Hall E.J:, Giaccia A.J. Radiobiology for the radiologist. Lippincott Williams& Wilkins, 2006,546 pp.

60. Hamada H., Kobune M., Nakamura K., Kawano Y., Kato K., Honmou O., Houkin K., Matsunaga Т., Niitsu Y. Mesenchymal stem cells (MSC) as therapeutic cytoreagents for gene therapy.// Cancer Sci., 2005, v.96, n.3, pp. 149-156.

61. He Q:, WaniC., Li G. Concise review: multipotent mesenchymal stromal cells in blood.* // Stem Cells, 2007, v. 25, n. 1, pp. 69-77.

62. Henning R.J., Abu-Ali H., Balis J.U., Morgan M.B., Willing A.E., Sanberg P.R. Human umbilical cord blood mononuclear cells for the treatment of acute myocardial infarction. // Cell Transplant., 2004, v. 13, n. 7-8, pp. 729-739.

63. Hermans J. Techniques for thyroid imaging. // Ann. Endocrinol. (Paris), 1995, v.56, n.5, pp. 495-506.

64. Imai Y. Nakao I. In vivo radiosensitivity and recovery pattern of the hematopoietic precursor cells and stem cells in mouse bone marrow. // Exp. HematoL, 1987, v. 15, n.8, pp. 890-895.

65. Jendelova P., Herynek V., DeCroos J., Glogarova K., Andersson В., Hajek M., Sykova E. Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles. //Magn. Reson. Med., 2003, v. 50, n. 4, pp. 767-776.

66. Jensen R.A., Acton E.M., Peters J.H. Doxorubicin cardiotoxicity in the rat: comparison of electrocardiogram, transmembrane potential, and structural effects. J. Cardiovascular Pharmacol. 1984, v. 6, n.l, pp. 186-200.

67. Kadivar M.', Khatami S., MortazavLY., Shokrgozar M.A., Taghikhani M., Soleimani M. In vitro cardiomyogenic potential of human1 umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. //Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, v. 340, п., pp. 639647.

68. Kang Y.J., Li G., Saari J.T. Metallothionein inhibits ischemia-reperfusion injury in mouse heart. //Am. J. Physiol., 1999, v. 276, n. 3, pp.993-997.

69. Kawada H., Fujita J., Kinjo K., Matsuzaki Y., Tsuma M., Miyatake H., Muguruma Y., Tsuboi K., Itabashi Y., Ikeda Y., Ogawa S., Okano H., Hotta Т., Ando K, Fukuda K.

70. Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. //Blood, 2004, v.104, n.12, pp.3581-3587.

71. Keefe D.L. Anthracycline-induced cardiomyopathy. Semin. Oncol., 2001, v. 28, n. 4, suppl. 12, pp. 2-7.

72. Kolesnikova A.I., Konoplyannikov A.G., Hendry J.H. Differential sensitivity of two predominant stromal progenitor cell subpopulations in bone marrow to single and fractionated radiation doses. // Radiat. Res., 1995, v. 144, n. 3, pp. 342-345.

73. Kunter U., Rong S., Djuric Z., Boor P;, Muller-Newen G., Yu D:, Floegc J. Transplanted1 mesenchymal stem cells accelerate glomerular healing in experimental-glomerulonephritis.//J. Am. Soc. Nephrol., 2006, v. 17, n. 8, pp. 2202-2212.

74. Lazarus H;M:, Кос O.N., Devine S.M;, Gurtin Pr, Maziarz R:T., HollandfHvK., ShpallI

75. E.J., McCarthy PI, Atkinson K., Cooper B:W., Gerson«S:E.,.Eau^ih>MiJ'.vLoberiza?.

76. Lev S., Kehat I., Gepstein L. Differentiation pathways in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. // Ann. N.-Y. Acad: Sci., 2005; n.1047, pp.50-65.

77. Lindvall О., Kokaia Z., Martinez-Serrano A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-how to make it work. //Nat. Med., 2004, v. 10, Suppl; pp. 42-50.

78. Ma N„ Ladilov Y., Kaminski A., Piechaczek C., Choi Y.H., Li W., Steinhoff G., Stamm C. Umbilical cord blood cell transplantation for myocardial regeneration. //

79. Transplant. Proc., 2006, v. 38, n. 3, pp. 771-773.

80. Ma N., Ladilov Y., Moebius J.M., Ong L, Piechaczek C., David A., Kaminski A., Choi.

81. Y.H., Li W., Egger D., Stamm C., Steinhoff G. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived' cells. // Cardiovasc. Res., 2006, v. 71, n. 1, pp. 158-169.

82. Mahmood A., Lu D:, Chopp M. Treatment of traumatic brain injury in adult rats with intravenous administration of human bone marrow stromal cells. // Neurosurgery, 2003, v. 53, n. 3, pp. 697-702.

83. Meijne E.I., Ploemacher R.E., Vos O., Huiskamp R. The effects of graded doses of 1•j

84. MeV fission neutrons or X rays on the murine hematopoietic stroma. // Radiat. Res., 1992, v. 131, n.3, pp. 302-308.

85. Meirelles L.S., Chagastelles P.C., Nardi N.B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. // J. Cell Sci., 2006, v. 119, n. 11, pp. 22042213.

86. Millard R.E, Blackett N.M. Radiosensitivity and recovery of two murine haemopoietic progenitor cell populations following gamma rays and neutrons. // Acta Haematol;, 1981, v. 66, n. 4, pp. 226-232.

87. Mimeault M., Batra S.K. Concise review: recent advances on the significance of stem cells in tissue regeneration and cancer therapies. // Stem Cells, 2006, v. 24, п. 11', pp. 2319-2345.

88. Nauta A. J., Fibbe W. E. Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells. // Blood, 2007; v. 110, n.10, pp.3499 3506.

89. Nikkels P.G., de Jong J.P., Ploemacher R.E. Radiation sensitivity of hemopoietic stroma: long-term partial recovery of hemopoietic stromal damage in mice treated during growth. // Radiat. Res., 1987, v. 109, n. 2, pp. 330-341.

90. Noth U., Osyczka A.M., Tuli R., HickokN.J., Danielson K.G., Tuan R.S. Multilineage mesenchymal differentiation potential of human trabecular bone-derived cells. // J. Orthop. Res., 2002, v.20, n. 5; pp. 1060-1069.

91. Ohnishi S., YasudaT., Kitamura S., Nagaya N. Effect of hypoxia on gene expression of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and mononuclear cells. // Stem Cells, 2007, v. 25, n. 5, pp. 1166-1177.

92. Olivier E.N., Rybicki A.C., Bouhassira E.E. Differentiation of human embryonic stem cells into bipotent mesenchymal stem cells. // Stem Cells, 2006, v. 24, n. 8, pp. 19141922.

93. Owen M., Friedenstein A.J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. // Ciba Found. Symp., 1988, v.136, pp. 42-60.

94. Papayannopoulou Т., Craddock C. Homing and trafficking of hemopoietic progenitor cells. // Acta Haematol., 1997, v. 97, n. 1-2, pp. 97-104.

95. Papayannopoulou Т., Priestley G.V., Bonig H., Nakamoto B. The role of G-protein signaling in hematopoietic stem/progenitor cell mobilization. // Blood, 2003, v. 101, n.12, pp. 47-39-4747.

96. Penn M.S. (Ed.) Stem cells and myocardial regeneration. Totowa, Humana Press, 2007, 316 pp.

97. Phinney D.G., Isakova I. Plasticity and therapeutic potential of mesenchymal stem cells in the nervous system. Current Pharmaceutical Design, 2004, v. 11, n. 10, pp. 12551265.

98. Piersma A.H., Ploemacher R.E., Brockbank K.G., Nikkels P.G., Ottenheim C.P. Migration of fibroblastoid stromal cells in murine blood. // Cell Tissue Kinet., 1985, v.18, n. 6, pp. 589-595.

99. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal*R.K., Douglas R., Mosca J:D., Moorman M.A, Simonetti D.W., Craig S., Marshak DR. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. // Science, 1999, v. 284, n. 5411, pp. 143-147.

100. Porada C.D., Zanjani E.D., Almeida-Porad G. Adult mesenchymal stem cells: a pluripotent population with multiple applications. // Curr. Stem Cell Res. Ther., 2006, v. 1, n. 3, pp. 365-369.

101. Potten C.S., Clarke R.B., Wilson J., Renehan A'.G. (Eds.)'Tissue stem cells. Taylor & Francis Group, LLC, 2006, N.-Y., London, 404 pp.

102. Potten C.S., Hendry J.H. (Eds.) Cytotoxic insult to tissue. Effects on cell lineages. Edinburgh-L.-Melbourne-NY, Churchill Livingstone, 1983,422 pp.

103. Potten C.S., Owen G., Booth D. Intestinal stem cells protect their genome by selective segregation of template DNA strands. // J. Cell Science, 2002, v. 115, n. 11, pp. 23812388.

104. Pouzet В., Hagege A.A., Vilquin J.T., Desnos M., Duboc D., Marolleau J.P., Menasher

105. P. Transplantation of autologous skeletal myoblasts in ischemic cardiac insufficiency. // J Soc Biol., 2001, v.195, n.l, pp. 47-49.

106. Prockop D.J., Gregory C.A., Spees J.L. One strategy for cell and gene'therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proc. Natl: Acad. Sci. U S A, 2003. v. 100, Suppl l,pp.l 1917-11923.

107. Querido E, Chartrand P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. // Methods Cell Biol., 2008, v. 85, pp. 273-292.

108. Ratajczak M.Z., Kucia M., Majka M., Reca R., Ratajczak J. Heterogeneous populations of bone marrow stem cells are we spotting on the same cells from the different angles? // Folia Histochemica et Cytobiologica, 2004, v. 42, n. 3, pp. 139-146.

109. Reyes M., Verfaillie C.M. Turning marrow into brain: generation of glial and neuronal cells from adult bone marrow mesenchymal stem cells. // Blood, 1999, v. 94, supph 1, pp. 377a.

110. Ringe Ji, Haupl Т., Sittinger M. Mesenchymal stem cells for tissue engineering of bone and cartilage. // Med. Klin. (Munich), 2003, v. 98, Suppl 2, pp.35-40.

111. Rivera F.J., Sierralta W.D., Minguell J.J., Aigner L. Adult hippocampus derived soluble factors induce a neuronal-like phenotype in mesenchymal stem cells. // Neurosci. Lett., 2006^ v. 406, n. 1-2, pp. 49-54.

112. Sabatier L., Lebeau J., Dutrillaux B. Chromosomal instability and alterations of telomeric repeats in irradiated human fibroblasts. // Int. J. Radiat. Biol., 1994, v.'66, n.5, pp.611-613.

113. Sarugaser R., Lickorish D., Baksh D., Hosseini M.M., Davies J.E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. // Stem Cells, 2005, v.23, n. 2, pp. 220-229.

114. Satija N.K., Gurudutta G.U, Sharma S., Afrin F., Gupta P., Verma Y.K., Singh V.K., Tripathi R.P. Mesenchymal stem cells: molecular targets for tissue engineering. // Stem Cells Dev., 2007, v. 16, n.l, pp. 7-23.

115. Shi S., Gronthos S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. // J. Bone Miner. Res., 2003, v.l8, n.4, pp. 696-704.

116. Shigeta С., Tanaka K., Oguma N., Kamada N., Ohkita T. Radiation sensitivity of human bone marrow fibroblast colony forming unit (CFU-F) to various radiation sources. // J. Radiat .Res. (Tokyo), 1988, v.29, n.3, pp. 182-188.

117. Smith C.S. Hematopoietic stem cells and hematopoiesis. // Cancer Control, 2003, v. 10, n. l,pp. 9-16.

118. Smits A.M., van Vliet P., Hassink R!J., Goumans M.J., Doevendans P.A. The role of stem cells in cardiac regeneration. J. Cell. Mol. Med., 2005, v.9, n.l, pp. 25-36.

119. Song L., Webb N.E., Song Y., Tuan R.S. Identification and functional analysis of candidate genes regulating mesenchymal stem cell self-renewal and multipotency. // Stem Cells, 2006, v. 24, n. 7, 1707-1718.

120. Sotiropoulou P.A, Perez S.A, Salagianni M, Baxevanis C.N, Papamichail M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. // Stem Cells, 2006, v. 24, n. 2, pp. 462-471.

121. Stoick-Cooper C. L., Moon R. Т., Weidinger G. Advances in signaling in vertebrate regeneration as a prelude to regenerative medicine. // Genes & Dev., 2007, v. 21, n. 11, pp. 1292- 1315.

122. Studeny M, Marini F.C., Champlin R.E., Zompetta C., Fidler I.J., Andreeff M. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as vehicles for interferon-beta delivery into tumors. // Cancer Res., 2002, v. 62, n.13, pp.3603-3608.

123. Suzuki K., Martuza В., Suzuki N., Smolenski R.T., Yacoub M.N. Intracoronary infusion of skeletal myoblasts improves cardiac function in doxorubicin-induced heart failure. // Circulation, 2001, v.104; n.12, suppl.l, pp. 1213-1217.

124. Taupin P. OTI-OIO Osiris Therapeutics/JCR Pharmaceuticals. // Curr. Opin.Investig. Drugs, 2006, v.7, n.5, pp. 473-481.

125. Till J.E., McCulloch, E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. //Radiat. Res., 1961, v. 14, n. 2, pp. 213-222.

126. Till J.E., McCulloch, E.A. Early repair processes in marrow cells irradiated and proliferating in vivo. //Radiat. Res., 1963, v. 18, n. 1, pp. 96-105.

127. Toma C., Pittenger M.F., Cahill K.S., Byrne B.J., Kessler P.D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. // Circulation, 2002, v. 105, n.l, pp. 93-98.

128. Tomita S., Li R.K., Weisel R.D., Micle D.A., Kim E.J., Jia Z.Q. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. // Circulation, 1999, v. 100, suppl. 19, pp. 247-256.

129. Tsai M.-S., Lee J.-L., Chang Y.-J., Hwang S.-M. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second-trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. // Human Reproduction, 2004, v. 19, n.6, pp.1450-1456.

130. Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells and cell-based tissue engineering. // Arthritis Res. Ther., 2003, v.5, п., pp. 32—45.

131. Uckun F.M., Gillis S., Souza L., Song C.W, Effects of recombinant growth factors on radiation survival of human bone marrow progenitor cells. // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.,1989, v.l6, n.2, pp.415-35.

132. Vaananen H.K. Mesenchymal stem cells. //Ann Med., 2005, v. 37, n. 7, pp.469-479.

133. Vermuri M.C. (Ed.) Stem cell assays. Totowa, New Jersey, Humana Press, 2007, 400 pp.

134. Wakitani S., Saito Т., Caplan A.I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995, v. 18, п., pp. 1417-1426.

135. Wang S.Bi, Hendry J.H., Testa N.G. Sensitivity and recovery of stromal progenitor cells (CFU-F) in mouse bone marrow given gamma-irradiation at 0.65 Gy per day. // Biomed. Pharmacother.,1987, v. 41, п. 1, pp. 48-50.

136. Wang J.A., Fan Y.Q., Li C.L., He H., Sun Y., Lv B.J. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells transplanted into damaged rabbit heart to improve heart function. // J. Zhejiang Univ. Sci. В., 2005, v. 6, n. 4, pp. 242-248.

137. Withers H.R. The effect of oxygen and anaesthesia on radiosensitivity in vivo о epithelial cells of mouse skin. // Brit. J. Radiol., 1967, v. 40, n. 473, pp. 335-343.

138. Withers H.R., Elkind M.M. Dose-survival characteristics of epithelial cells of mouse intestinal mucosa. // Radiology, 1968, v. 91, n. 5, 998-100.

139. Xu W., Zhang X., Qian H., Zhu W„ Sun X., Hu J., Zhou H., Chen Y. Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro. // Exp. Biol. Med., 2004, v.229, n.7, pp. 623-631.

140. Yoon J., Min B.G., KimsY.H., Shim W.J., Ro Y.M., Lim D.S. Differentiation, engrafitment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. // Acta Cardiol., 2005, v. 60, n. 3, pp. 277-284. '

141. Zhao Y., Burikhanov R., Qiu S., Lele S.M., Jennings C.D., Bondada S., Spear В., Rangnekar V.M. Cancer resistance in transgenic mice expressing the SAC module of Par-4. // Cancer Res., 2007, v.67, n.19, pp. 9276-9285.

142. Zhou R., Acton P.D., Ferrari V.A. Imaging stem cells implanted in infarcted myocardium. // J. Am. Coll. Cardiol., 2006, v. 48, n. 10, pp. 2094 2106.

143. Zhou R., Thomas D.H., Qiao H., Bal H.S., Choi S.R., Alavi A., Ferrari V.A., Kung H;F., Acton P.D. In vivo detection of stem cells grafted in infarcted rat myocardium. // J. Nucl. Med., 2005, v. 46, n. 5, pp. 816-822.

144. Zimmet J.M., Hare J.M. Emerging role for bone marrow derived mesenchymal stem cells in myocardial regenerative therapy. Basic Res. Cardiol., 2005, v. 100, n. 6, pp; 471-481.

145. Zur P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I:, Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. Human adipose tissue is source of multipotent stem cells. // Mol. Biol. Cell, 2002, v. 13, n. 12, pp. 4279-4295.t