Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПУТИ МОРФОГЕНЕЗА IN VITRO И РАЗРАБОТКА КЛЕТОЧНОЙ ТЕХНОЛОГИИ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ RAUWOLFIA (APOCYNACEAE)

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "ПУТИ МОРФОГЕНЕЗА IN VITRO И РАЗРАБОТКА КЛЕТОЧНОЙ ТЕХНОЛОГИИ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ RAUWOLFIA (APOCYNACEAE)"

4-3 060£

российская академия наук

БОТАНИЧЕСКИ!) ИНСТИТУТ им. В. JI. КОМАРОВА

На правах рукописи

УПАДХАЙЯ Ннтьянанда

ПУТИ МОРФОГЕНЕЗА IN VITRO И РАЗРАБОТКА КЛЕТОЧНОЙ ТЕХНОЛОГИИ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ RAUWOLFIA (APOCYNACEAE)

03.00.05— БОТАНИКА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1992

Работа выполнена в Ботаническом институте им. В. Л. Комарова РАН (Санкт-Петербург) и в Институте клеточной биологин и генетической инженерии (Киев) УкрАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Т, Б, БАТЫГИНА академик, доктор биологических наук, профессор Ю. Ю, ГЛЕБА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Е. А. МИРОСЛАВОВ кандидат биологических наук, доцент Л. А. ЛУТОВА

Ведущее учреждение — Санкт-Птербургскнй химико-фармацевтический институт.

Защита диссертации состоится * /<Р » ЧОЛ-^рХ 1992 г.

в часов на заседании специализированного ученого совета

К 002,46.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических науки при Ботаническом институте имени В, Л. Комарова РАН по адресу: 197376, С.-Петербург, ул. ча, 2, БИН, зал Ученого совета.

С а. ■ озни. гтеке Ботанического нн-

ститу .ч^манрова РАН

еферат разослан 1992 г.

Ученый секпетарь спей": 1нзирог ¡юго совета кандидат б;: ¿гнческих наук

О. С. ЮДИНА

общая характеристика работы

актуальность темы Систека клеток и тканей высшие растений, выращиваемых вне организма на искусственных питательных средах, позволяет не только глуби» изучить закономерности развития репродуктивных структур, особенности морфогенеза и клэточног диМвренодровкк, но и создать » например, на основе соматического эмбриогенеза (эмбриоацогенеза ) принципиально новые технологии джя широкого практического применения. &го особенно важно и актуально для сохранения и размножения целого ряда редких, исчезали*! и хозянственно-дэкных рисгениа, в частности, представшее лев рода Rouwoi/io. вегетативные органы которых содержат продукта гипотензивных и противоэрнгшическнх препаратов (резерпин, асмзлин, раунатин, раувззан и до. ).

Следует отметить резкое сокращен» в последние года природных ресурсов этих ценных лекарственных растенив, низкую эффективность и трудоемкость семенного и вегетативного способов их разюшшния. Разработка нетрадиционных способов тиражирования особенно денных водэв поэтому является весы» актуальной, особенно для Индии и других стран, тставляоцих сырье раувольфии на мирово! рынок.

Исследование некоторых аспектов морфогенеза раувольфии in vitro, на основе которого и создаются биотехнологпескяв методы, является также очень своевременным'и необходимым в теоретическом аспекте, так как способствует пошманно механизмов развития растительных тканей в условиях культуры и тем самым создает основы их целенаправленно* регуляции. Изучение путей морфогенеза, их иденпфжзция и управление ими являются одно* из ваднешних задач морфологии и биотехнологии

ЦЕНТРАЛЬНАЯ JHAiMl-IAR САМОТЕКА. Моск. сел, t .» . v.s^eMtm

{Betyglna et al., 19Г8; Tisaereat et al., 1ЭТ9; Ivans et el., 1961; Аяиtrato, 1963; Flick et al., 1983; Betygina. 1964; Halperin, 1966; *Ш1вюз and Maheswaran, 1986; Pierüc, 1937). Кроив того, решение проблей морфогенеза и регенерации раувольфш в культуре тканей является необходимым этапом работ по пара сексуально* гиЗридязации и гепетичоскоя инженерии (Vas11 et al., 1979: Gleba and SytaUt, 1934; Glebe and ShluaukOT, 1990), которые тка, в известное стешни, сдерживают развитие этих новых направлений экстрментальной ботаники.

i» и задачи исследования, Цэдь» настоящей работа явилось изучение путей и особенностей морфогенеза в культуре ткане* раувольфии я разработка на этой основе клеточных технологий наи5олее перспективных валов. Для этого необходимо было решить слвдунщяэ задачи;

I) получить каллусные культуры у разных видов раувольфии и выявить их иорфогеяетическив потенции с помощь» оптимизирования питательных сред и условна вырашивания; Z) провести идентификацию путей морфогенеза (органогенеза и эмбриовдогенеза) с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии;

3) разработать способы массового получения растений регенерантов у разных видов, раувольфии в культуре in vitro и дать практические рекомендации по методам микроклонирования;

4) апробировать метод) выделения, культивирования и слияния протопластов для дальнейшего их применения в работе по парасексуэльной гиЗрмдизании и генетической трансформации раувольфии.

научная новизна работы. Впервые проведена сравнительная эмбриологическая идентификация процессов морфогенеза г

каллусиьгх культурах у вое: иеслэдрванных видов. ЕЫявлтеа таксовосшщфиаость морфологической реакции, так, показано, что у K.uomitoria развитие растений вдет через

ЭИЗрИОКДОГЭНвЗ, У - через ОрГЭЯОгеНбЗ, у Kjcaffra -

через органогенез и эибрвоидргенез.

Впервые в эмбриовдогенноя каллусной культурв я в культуре корней ¡(.vomitona обнаружено образованна множества эибривдов. Разработаны условия тшучения каддусных культур и способов микроклонзльного размножения с использованием различных путек морфогенеза. Впервые проведено усшшвое ваделэнлз. культивирование и слияние мезофиляьных протопластов R.tonMc»ni И КЗЛЛуСНЫХ npOTOIUaCTOB «.wjmítoT-ía. НаЯДЭШ способы микроклонального разяноиения у изучаемых видав Rauwoin».

практическая эначимость. Данные, полученные ш морфогавезу в культуре in vitro у различных видов раувольфяи, явлются теоретической основой дия разработки эффективных клеточных

технологий для рода «шпияяо.

. В работе определены отггимальные условия индукции каллусных культур видав раувольфии с высотам содержанием алкалоидов, показана возможность их эффективвой регенерации, микроразмножения и адаптации к нестерильным условиям. Эти данные ценны для практической работы по генетическому у лучше ни» видов раувольфии, разработке методов генной инженерии, криоконсервации я технологии получения искусственных семян (инкапсулированных эмбриоидов). Разработка подходов и способов выделения и культивирования протопластов раувольфии также важна для дальнейшего развития клеточных и генных технологий этого ценного лекарственного растения.

апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на VII Международном конгрессе по

культуре ткани и клеток растении (Амстердам, 24-29 изая 1990 г.); XX Международном симпозиума по эййршлогии и сведенному размножению (Ленинград, 3-7 воля 1990); йенщуяародаом биотехнологическом симпозиуме (Женева, 17-20 апреля 1991 г.): 7III Международном симпозиуме по протопластам (Угоала, ¡Наедая, 16-20 ишя 1981 г. > и Молодежной конференции ботаников (Сашгг-Лвтербург, май 1992 г, >.

публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ и 2 сдано в начать.

структура и объем рабат Диссертация изломана на | £ S страницах мэшшшисвого текста и состоит из введения, S глав, осуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы; включает £ таблиц, рисунков. Список

литературы содержит ^ ^"^биЗлиографичвскга ссылок.

МАТЕРИАЛ И МЕТОда

Три нидя рода Koubiolfiai ftcaTTr* Sorul, R.vomltori» Afz. и в.оя1м»м l. били исшльзованы в качестве обЪеетов для изучения путей морфогенеза in vitro и разработки методов клеточной биотехнологии. Часть материала была любезно предоставлена доцентом С.-Петербургского хмнико-фармацавтического института Л.А.Николаевой.

В качестве эксплантатов для культуры каллусов tn vitro использованы молодые листья (3-4 си длиной) от 3-4-л&тних растений видав рода выращиваемых ч оранжерее

Ботанического института С.-Петербурга.

Поверхность листовых эксплантатов стерилизовалась в течение 15 минут в 10» растворе KaQCl и затем 3-4 раза щюмывалась

ч

двстапроваиво! водя. Дм осидогаи клыусов простершваванныв листья ииуйировалшь не среда К (Muraahlge and Skoog, 1962) или Bg (Gatfxrg et al.. 1968). Дм индукции ' к&ыусогеаеэа я морфагааева в среду добавлям: б-бензилаиинопурин (БАП) (0.5-2 ng/l), 2,^-ддлсрфеноу ксу сную кислоту (2.4-Д) (0.5-2 ig/1) го отдельности или в сочетавши БАП <0.5-2 с I-нафтилуксусно! кислого! (ВТК) (0.5-2 Bg/1) или с 2,4-Д (0.5-2

Дм формирования мноаественных побегов каллусы с почками кулътишфовали на сред» с добавлением БАП (0.5-1 Mg/1). Укоренение побегов достигаюсь шел» шреноса на среду MC с БУК (0.5-1 ig/l). Джя получения высокого процэнта выхода эмбриовдов с госледуящн развитием из них растеши использована среда НС с добавление* эеатина (0.1-0.5 ng/l) или абсциаово« кислоты (АБК) (0.1-0.5 Bg/1).

Для получения эмЗриоидов в суспензии эибрноидогенные надкусы культивировали в жидко! МО среде с 0.5 Bg/1 2,4-Д ЩИ геремемиванми sa каталке.

Для изучения путев морфогевега in vit.ro и идентификации возникали! структур-почек (органогенез) и (или) эибрюидов < эибриоидогевез ) каллусы исследованных видов рода *«woifta фиксировали в ФАА (1:1:3) для светово* микроскопии и в 2.5* глутаральдегаде дня сканирумрш электронно« микроскопии (прибор марки JBOL JSM-39C). гистологические исследования фиксированного материала проводили в соответствии с обычно принятыш методиками (Johansm, t940; Црозина, I960; Tasil and Veen, 1982). Срезы <12 мкм) готовили на ротационном микротоме. Растения исследованных виде» рода лтпмодео, полученные путям органогенеза (гемморнэогенеза) или эмбриоидогевеза, юсяа акклютизацин в лабораторных условиях шресамвали в горшки с

шчвся в оранжерее, где и продолжалось дальне tree их разшггмэ. фотопласты изолировали из листьев (вир. 0.6-1 ш)

РЗСТ9НИЕ Клалмсм« ■ t-umfiorlii, ПЩЧВНВШ В КУЛЪТУрв 1л

vitro, окаю 0.5 г таких листьев измельчали я ивкуйяровадж в 5 ил стерильного раствора ферментно« смеси 2-х типов. Тип I

СОСТОЯЛ ИЗ Onoxuke Ifc-iO <S»rva) - О.a*. Drlsvlm CSls«ta> -0.4X, Mac»rosyms R-IO <Ssrv*> - 0.24, Оя&^-ЪЯгР - OlJ с 0.5H

раствором макшггода как осморвгуляторов. тип г ферментное смэси

СОСТОЯЛ ИЗ Опохикя R-10 CS»rv«> - 0-2ЖЧ, Macwozym* R-10 cs»rv*> -0.12sx, (siem*> - 0.0-43ч, caoi^mgo - o.ix

и 0.7M раствора маннитола для изоляции протопластов каллуса раствор (ферментную смесь) готовит иа среде vg <м»зсу*жу

al, 1980> с Onoxuk» R-10 CS»rv») - 0.1ЭЧ, Drlnla» (Sltrn«> -

о.2х, M>c»roxyiM R-io (s*rva) - o.ix и O.SH растворе маншггола. После растворения кяеточных оболочек суспензию протопластов фильтровали и центрифугировали при 80 х t по 3 минуты и затеи промывали з раза в среде wg при шнтрифаггировагиии 80 * с в течение 3 кинут. После отиывки протопласты при плотности среды культивировали в среда Bg или Ej (Philips,

Collins, 1960) с добавлением 2 мг/л 2,4-Д, 0.5 кг/л НТК, 0.5

*

ИУК, 0.2 мг/л кинетина и 0.5 М оснотиков - машите или сахарозы.

Эксперименты по слиянию протопластов проводили с использованием полизтилэнгликоля ПЭГ (км 6000) и при щелочных рн и высоких концентрациях Са+2. При этом каллусные протопласты И мезофихьныэ протопласты Rx>omítori,a смешивали в соотношении 1:1. Продуты слияния протопластов культивировали на исходам среде при температуре 2в*.

результаты исследовант

1. пути морфогенеза в культуре in mitro jtarwolfia caffro.

каллусогенез. Образование каллусно« ткани ив листовых зксшантов было достигнуто на среда НС с различным содержащем НУК и БАЛ. Нэидршая индукция каллуса (84%) отжачена при концентрации НУК и БАЛ 2 иг/л. Первичный камус был зеленовато-бурого цвета и компактам. Квящые 4 ведали каллус пересевали на свежую исходную среду. После 3-х пассаяей каллус становился более рыхлым, быстро растуши и эелэаоватьи,

ОРГАНОГЕНЕЗ СГЕММСРИЭОГЕНЕЗЭ. ÜOCJB ШрвНОСЗ бОЛвв рЫХДОГО,

зеленоватого каллуса на среду с 0.5 иг/л БУК и 0.5 иг/л БАЕ через 20-25 две« культивирования нзблодали формирование почэк (органогенез - тимогевез) на поверхности каллуса, которые в дальнейшем развивались в побеги. В результате гистологического анализа каллуса установлено образован» моношляршх структурных единиц органогенеза - почек.

Множественное образование побегов происходила га ИС-среде с I кг/л БАЛ. Укоренение (ризогевез) срезанных побегов легко достигалось при их культивировании на среде с БУК (0.5 иг/л>.

Растения, регенерировавшие из каллуса в результате описанных

*

выое путей морфогенеза, удалось усшшно адаптировать к нестерильным условида и шревестн в оранжерею БИН. где они показали высокий (до 78) продант выживания. эмвриондогенеэ. Первичный компактный каллус посла первого пассажа на той яе среде, на которой он был получен, становился слабо рыхлым. Если же рыхла каллус культивировался без пассирования длительно (до 2-х месяцев) на среде с 0.5 иг/л НУК и БАЛ, он переходах в морфогенное состояв». Щк этом на его поверхности появлялось множество глобулярных структур. В

результат» гжгголоптсюго мчнвв» морфогенного каллуса гспкалвво, тго зт* образования тфвдставлягг собо* тишпвые Йпюлцрш» структурные едав« змвркщдогвввва - гмбркшщ. Щж перевосе на Даегсфмпнаавдую МС-среду эмбрюяда (до 30t) резвавапоь в нормальные растеяия. подучеты» растет были перенесены в ораиюраю Б1Ш. где от дакззаля высоки* (до 80) процент вышивания ж нормального развита.

2. ПУТИ М0Р4СГЕИЕЭЛ В КУЛЬТУГК in vitro Kamwol/ta

kajwcotehe». ворпрованш sauycos к листов« зшшптов происходит Tpt их культивировании на средах MC m Bg е добавками в разных концентрациях 2,4-Д (0,5-2 иг/л). Интдвщкя каллусов навидается через 12-1Б два« культивирования ва'сраде с 2,4-Д. Если концентрация 2,4-Д была 0.5-1 ыг/л, то теши роста камусов был низкими на обоих средах. Щеренное тело халлусов даю индуцировано щх концентрации 2.4-Д 1.5 мг/л.

260-300. мг сырого веса каллусно* ткани было тлучево поел» 4-х аэдель культивирования на среде МО с 2 мг/л 2.4-Д. В то аа время на среде Bg с тон ж самоа гормонально* добавкой интенсяваость роста к&иусов была значительно шпе (60 9 >, чек на среде КС (63*). Оэреоначально на обеих средах жалхусы были компактная, сдезнстшн н светло-зеленого цвета. Посла дох пассаме* ва то* ж само* среде каллусы становились более мялом« в приобретали зелены* цвет. Мягкие и задевна каллусы, растуияэ на средах MC к В^ с 2 кг/л 2,4-Д, далее юресамивалн на среда с последовательно уменьмэпмряся концентрат»* 2.4-Д (от наиэшяюй до ниаам: 1.5-1-0.5 мг/л). Шеи» вггоро*. пересадки каиусы, рэстуи» на среде с I иг/л 2,4-Д, сравнительно быстро росли, отличались по форю к более интенсивно! зелено* окраске, чем ва среде Bg, ссдеркацэ* ту «а самую кондентрацж 2,4-Д. Через 15-20 две* культивирования

е

рыхлю, быстро растущие каллусы es среде КС были охарактеризованы как морфогавше. Однако каллусы на среде Qg даю при низко« концентрации 2,4-Д <141.5 кг/л) не выглядели рыхлыми и не обнаруживали признаков морфогенеза. эмбриоидогенез* Рыхлые каллусы на среде МС с добавлением I кг/л 2,4-Д были названы нами как иорфогенвы» - зибриодагенные каллусы. При культивировании талан каллусов на среде МС с добавлением 0,5 мг/л 2,4-Д пролиферация клеток эмфжздлогенных каллусов становилась более обширное в через 10-12 давя культивирования наблхщзлксь многочисленны» более активные, рыхлые эмбриоцдогенные клеточные комплексы (ЭКК). Посла недельного культивирования розовонЗвл« глобулярные структуры были обнаружены на поверхности ЭКК. Чэрез 15-20 дне* культивирования фактически вся поверхность ЭКК была покрыта многочисленными глобулярньми образованиями. Эти зародлиеполэб-вые глобулярные структуры были названы эмбрионцами (соматическими зэродашэми). После одного месяца культивирования в данных условиях мы не обнаружили образования ЭКК из эмбриондогенных каллусов, но наблсщалн эмбрновду ва разных стадиях развития (глобулярные - сердечковвдные - торвдавищвые}. В том случае, когда глобулярные эмбриоиды не были своевременно шрвсажеш на свежую среду, они изменяли дает, становились бурыми и прекращали дальнейшее развитие.

При пэре несению! на свекую среду МС с 2,4-Д <0,5 мг/л) эти эмбриоиды (шициалии которых возникали вз • ЭКК) далее. не развивались и не превращались в растения. Ори условии культивирования глобулярных ■эмбриовдов группами (по 50 в груше) на среде МС без ауксина около в2К (табл. I) таких эмбрюидов развивались в полноценные растения. Около 80S таких растений были пересажены в горюй с почвой ж культивировались в

условиях оранжереи, При шращизаЕКЯ на базгормональвоз среде ЦС одиночных эмбриоидов толысо 20% из ззи развивались в нормальные растения,

Дзй получения баззе высокого прошита развития эмбриовдов в нормальные растения они выращивались группами (по SO в каждой груш») на среде MC с добавками различных ишцэнтрация зоатина <0.1, 0.3 ИЛИ 0.5 МГ/Л) 1Ш1 ABA <0,1, 0.3 ttfit 0,5 МГ/л). Процент развития эмбриоидов был около 70 при 0.5 мг/л зеатина в среде, в то время как при 0.1 или 0.3 иг/л зеатина в среде доля развития эмбриоидов в растения была дане меньше таковой на безгормонально! среде <табл. I >. Однако процент растеши, успешно пересаженных и развивающихся в почве, бал почти одинаков при условии их предаествувщвго развития на безгормональной и зеатин-содеркэшеа средах. Добавление ABA в среду задерживает раза-тт семядолей и приводит к образовании аномальных растений, Иногда были обнаружены многочисленные аномалии в эмбриоидогенезе, такие как образование множественных семядолей и добавочных корней. Эмбриовды бурого цвета, не проявляющие способности к прорастанип, также культивировали группами по 50 пгг. на среде MC с добавкой 0.5 мг/л эеатяиа и возраставшей концентрацией сахарозы (от 3$ до 835). Представляет интерес тот фант, что эмбриоида бурого цвета могли развиваться в нормальные растения лишь при наличии в среде сахарозы. Соответственно 34Ж и 27$ эмбриоидов бурого цвета могли развиваться в нормальные растения.

вторичньп эмбриондсгенеэ. При перенесении глобулярных эмбриоидов (первичных эмбриоидов) на среда, лишенные ауксина или с зеахииом 0.5 мг/л с целыо получения растений, наблюдали образование новых эмбриоидов непосредственно на первичных эмЗршвды. Такие эмбриовду мы назвали вторичными.

Формирование вторичных эюрдоидав было обнаружено тэга» у основания растения, развивавшихся кз горвнчных эиЗриоэдоз, Дал&а продолжалось образование змбриовдов новьа генерации вторичных1 зиЗриовдоз. Кспользул технику культивировать эмЗркоцдов нескольких гвЕэрациг, оказалось возможный получать а поддерживать зкбрмоида в течений даух лзт их культуры бзз утраты морфогенных потеящй.

таблица 1. раэгитое щльк растения из эшриоидэв, растушх на беэгсркинальной НС-СРЕда и на мс-среде с различны« содержанием эеатина

Число Состав % эмбриощцэв. % рзстоккг.

пмОршидов среда развившихся ПрИШВПИХСЯ

в культуре в нормальные в почве

растения

2500 КС (без гормонов) 62 во

1500 МО + 0.1 мг/л зэатина 44 ао

1500 МС + 0.3 мг/л зватика 48 80

1500 МС + 0.5 мг/л зеатина 70 80

подбор суспенэионноя культуры. 100 иг сыроа навески быстрорастущих нз среде с I мг/л 2,4-Д морфогенных каллусов культивировали в жвдкоа среде КС с 0,5 мг/л 2,4-Д. Щюбиркк затем помещали на ротационную качалку (120 odop/мин) и выдерживали на свету при темгюратуре 25* С. Через лее ведали в каждую пробирку добавляли по 20 ил свежей среда. Через 4 ведали культивирования суспензия состояла из груш розово-белых глобулярных зародышевых структур - эиЗриоидов. Число глобулярных змбриоидов быстро увеличивалось в этих условиях. В процессе образования и развития эмйриоидов в суспензионно! культуре можно отметить несколько фаз: экспоненциальную, линетаую.

стационарную в, наконец, затухаетую. Максимальное число глобулярных эиЗриоидрв было обнаружено на 10 неделе, а через 12 «вдаль отмечалась тенденция к уменьшен» образования эмбриоидов. Сформировавшийся эмбриоида промывали в свежея среде НС без ауксина н затем их культивировали на среде, лишенное ауксина или с эеапшом 0.5 кг/л. На этой среде они развивались в нормальные растения, проходя все стадии развития эмбраюидов. Тагам образом, мы смогли подобрать сусшнзионную культуру для массового получения эмбргоидов из морфогенных - эмбрнодогенных каллусов.

Гистологически* анализ морфогеншх - вмЗрмоадогекннх каллусов.

В результате гистологических исследований эмбриоидогенных каллусов с помощь» световой микроскопии установлено, что клетки эмбриоидогенных каллусов неоднократно делятся, форгаруя иерисгаматическую ткань, определяемую (Ве1у£1па ег а!., 19Т8)как эмбриондогенныа клэггочнык комплекс (Э9СК>. Исследование цитологических препаратов это« ткани показало, что клетки ЭКК мелкие, округл» или овальные сгустоя шггоплазмоа содержат крупное ядро с ядрыпком, мелкими вакуодяки и многочисленны«! крахмальными зернами. Кащща отдельны» ЭКК отчужден от окружающих тканей и поверхности темньм материалом. Последовательные деления к организация некоторых клеток из' ЭКК приводят к образование округли ига удлиненных зародяе подобных структур - эмбриоидов. Наблцщжггся также многочислэнные глобулярные эмбриоида. Начало ж дают прешу^ственно одиночные клетки ЭКК, возникшего посла нескольких деления клеток эмбриодогенного каллуса. ЭКК иницищруггея рано, и глобулярные эмбриоида проходят оердечковвдную и тортедоввдную стадии через 15-20 дней культивирования.

Развитие змбриовдов происходит асинхронно в результате

этого эмбрюида as разных стадиях, вкжгаая глобулярные, сердвчковидаые и торовдовидаые, могут соседствовать драг с другой. Интересно отметить наличие сусшнзора у змбрпонаов на ранних стадиях развития, однако у эмбрнощдов, переходящих к сердечковкдной и тороадовидвой стадии, суспензор уме дегеверировал. На гоздвей стадии эмбриоидэгевеза семяцолн были отчетливо выражены, цэнтральная проводащая система, корневой и стеблевой апексы были хорош водны. Ни на однос из стадий развития не было обнаружено контактов проводящей системы эмбриокцов с материнской тканью. В целом последовательность стадий развития эмбриоядов согоставима с таковой у зиготических зароядоеи.

Гистологических анализ змбщюишгенных каллусов показал значительное сншение запасов крахмала в швтгсе, особенно в период формирования глобулярных змбриовдэв из ЭКК. По мере развития эмбрновда крахмальные зерна исчезали.

Исследование эмбриоидогеншл каллусов с помояью СЭМ показало наличие на га поверхности скоплэних эмбряоидов. Как глобулярные, так и оердэчковидные эмбряоиды. вероятно, могут возникать из поверхностных клеток каллуса. С помощью СЭМ были такие обнаружены аномальные эмЗриодш, тающие мнояесгво семядов! (поликотилия).

э. пути морфогенеза в культуре in vitro rauwolfl* сшняш.

каллусогенез. Экспланты листьев, культивируемые на среда МС баз гормонов, не проявляет никаких признаков каллусообразовання. Добавление цигокинина БАЛ <0.5-2.0 мг/л) также не индуциируегг каких-либо морфогеватичаских реакций. (Хггииальное количество каллусов развивалось на среда НС с 2,4-Д <1.5-2.0 мг/л) + БШ <2 мг/д) и НУК <1.5-2.0 мг/л) + БАП <2 мг/л). На основании морфологических дяддит были отобраны каляусы, наиболее хорошо

растущвз ьа обеих средах, да посладущего юзучвЕкя их да&Фэренвдаши. Первоначально эти каллусн были компактные, зеленовзто-бурого щюта. В результате последовательных пассатаа эти каллусов па свежую сред' того же состава они становились рыхликн, сьетло-зэленого дчотз.

органогенез с гекморюогенеээ. ЗЯТОК эти рКЦШ кзллусы ЙйКЕ гаресвмешы за среда, содерасэщ» последовательно уменьшяющйэся концентрации 2,4-Д и НУК (1.5, 1,0 к 0.5 кг/л) с БАП (0.5 иг/л) У каллусов, вырацзиныг на среде 2,4-Д и БАП, при гюресадко на среду с низкими концентрашумк 2,4-Д и БАП набвдзлось скжизкз морфогенетечзского потенциала, продолжавшееся при последовательных пассажаг. Очень редко формировались корни, но если каллусы со среды НУК и БАП шреводилм на среду с умзньознноз концзяграцвэЕ КУК до 0.5 кг/л, они т^глобретали морфогенетические способности. Чзрез 15-20 дней культивирования на среде с НУК (1,0 или 0.5 мг/л> и ВАЛ (0.5 кг/л) на поверхности каллусов появлялись зеленые почки (геммы), которые развивались в побеги. Гистологическ® исследования морфогэиных каллусов с помощью светового микроскопа подтвердило, что регенерация растений из таких каллусов осуществляется только через один путь морфогенеза - через гемморизогенез. Особо следует отметить, что прокомбиальные клетки приморция почки обычно связаны с проводящей системой (ПС) каллуса. Развившиеся элементы проводящей системы были рассеяны ш каллусу и выглядели как кольцевые структуры. Образование змбриовдов на таких морфогенных каллусах не было обнаружено.

Максимальное количество формирующихся почек было получено на среде МС с НУК (0.5 мг/л) и БАП (0.5 мг/л). Последовательное формирование корней в среде, индуцирующей геммогевез, было спорадическим. Размножение побегами было возможна* при

культивирования на среде МС с 1,0 иг/л ЕАП. Чэрез 3-4 задали культивирования наблюдали мнотственвов образование золеных побегов. При культивировавши побегов на безгсрмоиальнос среде в течение длительного периода (2 месяца) наблюдали массовое образования коркея в их баэальной части. Более быстрое (з точение 15 дней) появление корней происходило » если возникающие in vuro побеги были срезаны и выращивались далее на разбавлзшой вдвое среде МС с 0.5 иг/л НУК, Развитие и удишеш» побегов продолжается вплоть дэ I8-IÔ педель культивирования при условии их выращиазняя на разбавленной вдвое среде КС, лишенной ростовых гормонов. Таким образом, удалось добиться кассового размножения растений этого ввдя. Укоренившиеся растения были пересажены в горшки с почвой и перенесены из лабораторных условий в ораняерею; около 808 растений вшило после акклиматизации. Растения продолжали нормально развиваться в оранжерея! БШ С.-Петербурга. Полученные растения в дальнейшем будут исследованы на содержание алкалоидов.

л. культура юоляи-юннык протопластов и соматическая п4бридюа1дня fi. cumnxiu и R.xjomitoria,

Б результате испытания различных ферментных смесей были отобраны нанЗодее подходящие растворы дня изоляции протопластов

из мезофилла листа и ¡¡.vomitoria, 3 тзкж© из

каллуешп клеток R.t*>míforfa. Изолированные протопласты культивировали на жидких средах В5 и Ej с ростовыми стимуляторами. Наилучшие результаты были получены на среде Ej- с добавлением 2 мг/л 2,4-Д, 0.5 мг/Л НУК, 0,5 мг/ ИУК. 0.2 мг/Л кинша с 0.5 M маннитолом. В этой среде первые деления fj&tok наблюдали через 7-10 дней культивирования. Постепенно в среде данного состава через 5-6 недель обнаруживалась пролиферация

клеточных клонов <протоклоны и мюфоколонш). Эффективность деления протопластов достигала 23-24%. Развиваиаиеся колонии клеток были перенесены на агар-аелнтиновую среду Е1 с 0.25 или 0.5 иг/л 2,4-Д для дальаеапего роста и дифференциации. Протопласты мезофилла листа и каллуса культивировали на среде Е1 с добавкой

некоторых гормонов, как и Через 8-10 дней после

начала культивирования наблюдали первые клеточные деления как в культуре протопластов мезофилла листа, тек и в культуре протопластов каллуса. Через 6-7 недель культивирования клеточные клоны становились заметными среди протопластов Мезофилла, эффективность деления достигала 14-15*. однако этот показатель для протопластов каллуса был не более &-10К после первого деления, Для дальнежпего роста и развития колонии клеток были переведены на агар-желатииовую среду с 0.25-0.5 мг/л 2,4-Д.

Продукта слияния протопластов я.еапкеми с л,чот«ог<а культивировали на средах Е£ и Первые клеточные деления были обнаружены только на среде Е^ через 12-14 дней культивирования. Через 4-5 недель на это! во среде эффективность деления клеточных клонов составляла 12-14*. Затеи развивающиеся колонии клеток пересаживали на агар-шелатиновую среду для дальнейшего роста. Пр»#енениэ разработанной нами техники слияния протопластов культуры может быть использовано для проведения работ по соматической гиЗридизавди и генной инженерии с далью улучшения полезных свойств видов рода ко»»!/».

СХЕМА МДОО*« КАЛЛУСОГЕНВЭЛ И РеГС№РА1И4 РАСТЕЮЯ ОРГАКСГЕНЕЭ - ШМОРЮОГЕтэ У БоюЛ. И Ял

И ЭШГИОИДСГЕНЕЭ У 5оп4.

Листовые зкспланты

Культура 28 ДВе!

среда ИС + 2 иг/л НУК и 2 иг/л БАП

Компактный (активно растут первичны*) каллус

| 1-ья пасс» 28 две« среда КО + 2 иг/л НУК и 2 иг/л БАЛ

Слабо рмтид каллус

Баз шресадщ среда НО ■»■ 0.5 мг/л НУК и 0.5 иг/л БАП

80 две«

28

2-л ж 3-1 пассами (а НС + 2 иг/л и 2 иг/л БАП

Глобулярные эмбдодо

21 день Развит» растени

Пересадка на безгошоналъную НС среду ^^

Сильно рт,т каллус

| 4-ы» пассам 21 дань | среда НС + 0.5 мг/л

|НУК ИО.5 МГ/Л ВАЛ *

Почки

НС + I ИГ/Л

28

Множественные побеги

15

Пересадка побегов 0.5 МГ/Л НУК

Кореи и пал» растения

21 дэяь,

Перенос растениа-регенерантов в горвки после акклш&тизашю в камере

схема ждата^и каллусогеиеза и развитие- растении через з^вриоидогенез у к. иояштчо.

Листовые эксплаяты

Культе 28 двез< среда МС + 2 мг/л

ги-а

Компакта, светло-зелень» каллус 28 днеа

1-1 и 2-й пассажи среда МС + 2 мг/л 2,4-Д

28 даее | Слабо рыхлый зелены* каллус

5-1 пвссаж

среда МС + 1.5 мг/л

2,4-Д

28 дае1

Раыы* каллус 21 день

Быстро растущий рыхлый каллус <эмбршидогеяюл каллус) 15 Даев

4-2 пассаж

среда МС + 1.0 кг/д

2,4-Д

5-й пассаж

среда МС + 0.5 мг/л

2,4-Д

Глобулярные эмбриоида

21 день

Безгориовальнзя КС среда

и среда МС с зеатином <0.1,0.3,0.5 мг/л)

Развитие растений ................

28 дней |

Перенос развивающихся растений в горшки после акклиматизации в камере

Вторичные эшЗриоида

1в

вьвода

1. Разработаны условия получения к культивировало! морфогеншл каллусов трех перспективных видов рода раувольфмм

КлюжИог^а И КлапнсаМ)

2. Ьдарвые проведена идентификация путей морфогенеза в каллусных культурах всех изученных видев, свидетельствующая о гзксоносдацифичности морфогэветнческих реакций в роде кли^охл*. так, у идентифицированы органогевез к эибраоидогвнез, у к™«1е«и - только органогенез (гемюриво-генез}, а у - эмбриоидогвнез.

3. Впервые в халлусноя культуре у *лют«ог<<1 Оыло получено массовое количество эмбриовдрв и вторичных змбриоидов на рваных стадиях развития. Кроме того, были получены эибриоида в культуре корней,

4. Идентификация путей морфогенеза и опгидзянщя сред позволили управлять морфогенезом у различных видов а<плио/<о. 5то дало возможность отработать рекомендации для массового получения реге&ерантов,

5. Наедены условия получения и культивирования мезсфшьлых протопластов к сол.гс.л!, мезофкхльных и каллусных протопластов я.^отИоПа. Проведены успешные опыты по их слиянию и получению развивающихся микрокаллусов соматических межвидовых гибридов.

в. № примере представителей рода е<™»1Яо показана важность и необходимость сравнительного морфолого-эмбрюлогичвского анализа при создании клеточных технологий размножения редких и хозяйственно-данных растении.

Приношу свою сердечную благодарность коллегам дабЬраторяи эмбриологии БИН" РАН Санкт-Петербурга, Института клеточной биологик и генетической инженерии УкрАН Киева и С.-Петербургского химико-фармацевтического института.

СПИОСК РАБОТ, СПУВЯКШАШШС ПО МАТЕРИАЛАМ ДОСЕРТА!*«.

1,K.Dpedhj8jr,A.TU.)laltt>T0ychuli,I.I.SiMBroT and T.B.Batyglna. Hftryoldogeoesla and plantlet regeneration In leaf callus cultures oi caffra Sonc5. VII International Congress

on Plant Tissue Culture, Held at Awterdaa.Jime 24-29,1990.1990.Abstr.p.271.

г.К.ОрейЬуа/ and T.B.Batyglna. Ifcbryolfogenesls and geneorhlzogeoesla in ftouwoi/io. П International ajaposiin Eabryology and Seed Reproduction,Leningrad. JUly 3-7,1990.1990. Abatr. p.178.

3.H.Upfidbnr,i.T.№lebenko,0.;.XidQereta and i.A.iostenyUK. Culture oi шезорЬуН protoplasts at * con»««« L.Physlologia Plan tarns 1991,82(1 ).A19.

4. И.Б. Кириченко, Н.Упадханя, О.Ф.Лобарец, И.А.Костенюк Культивирование неэофнлльных протопластов *«пп«>(/*а с«п«с«l. Доклада Авадипш Наук УССР, серия А. 1991. N 1: 125-127.

5.N.Upadbyay end T.B.Batyglna. Developments of plantlets Xroa cultured tissues ot L.In: Betygina et al. (eds). Ргос. И International syiposlum on «bryology and seed reproditeUon. Leningrad. July 3-7,1990.St,Petersburg.Katfca.199e. 578—579.

6.A.Iu.ltek0TeychuK,N.Upedhyay and A.V.Seeenoya. Hornoml regulation oi eobryoldogenesls.In: Batyglna et al (eda).Proc. XI Inter.Syep.on enbryology and Seed reproduction. Leningrad. JUly 3-7, 1990. St,Petersburg. Nayta. 1992.339-340.

7.N.0pedhyay,A.ru.liaXoTeychuK,L.A.HlXolaeTa and T.B.Batyglna. Organogenesis and somatic eabryogenesls In lest callus cultures oi xmiMoi/fa caffra. Sond. Jour. Plant. Pbyslologj. 1992. 140(2). 218-222.

8.T.B,BatKSina and M.Upadhyay.: in vitro norphogenetic

»

potential oí fining/ia spp. XII International Congress on sexual plant reproduction-July 19-23,1992.Ûhio.CSA..Abstr. t992.p 5.

S.N.Kpadiiyay and T.B.Batygina. Progresa ol plant regeneration system oî a wooây ^pocynowa»,ln: Proc, International syaip.cn transplant production ays teat. Yokohama. Japan. Angus t 23-28,1992. Acta Horticultarie.1992.iln press).

IO.N.Upadhyay and T.B.Batygina. Emüryoidogenes 13 of R<nn»ifia vomitoria Aíz. ttrrougi lest callus culture.In; Prac.IUCARPIA Syrnp.Angers,îranee,July 6-11,1992.1992{ln press).

Подписано к печати £3. . Заказ . Тираж /ЙЗа^

формат бумаги 60x84 1/16, печ.л. Бесплатно.

[¡и - 3 "Ленуприздата".

19П04 Ленинград, Литейный пр., дом № 55.