Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пути морфогенеза in vitro и разработка клеточной технологии некоторых видов RAUWOLFIA (APOSYNACEAE)

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Пути морфогенеза in vitro и разработка клеточной технологии некоторых видов RAUWOLFIA (APOSYNACEAE)"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БОТАНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ им. В. Л. КОМАРОВА

На правах рукописи

УПАДХАЙЯ

Нитьянанда

ПУТИ МОРФОГЕНЕЗА IN VITRO И РАЗРАБОТКА КЛЕТОЧНОЙ ТЕХНОЛОГИИ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ RAUWOLFIA (APOCYNACEAE)

03.00.05—БОТАНИКА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1992

Работа выполнена в Ботаническом институте им. В. Л. Комарова РАН (Санкт-Петербург) и в Институте клеточной биологии и генетической инженерии (Киев) УкрАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Т. Б. БАТЫГИНА академик, доктор биологических наук, профессор Ю. Ю. ГЛЕБА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Е. А. МИРОСЛАВОВ кандидат биологических наук, доцент Л. А. ЛУТОВА

Ведущее учреждение — Саикт-Птербургский химико-фармацевтический институт.

Защита диссертации состоится « / 2 » 1992 г.

в /Ц часов на заседании специализированного ученого совета К 002.46.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических науки при Ботаническом институте имени В. Л. Комарова РАН по адресу: 197376, С.-Петербург, ул. проф. Попова, 2, БИН, зал Ученого совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ботанического института им. В. Л. Команрова РАН.

Автореферат разослан « ¿^ » (О. 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета \

кандидат биологических наук \ КигЧ П С. ЮДИНА

общая характеристика работы

актуальность темы. СКСТбМа клэток it ткакэз висепх

растениа, выращиваегаз: впэ организма нз искусственна питательных средах, позволяет ш только глубже изучить закономерности развитая репродуктивных структур, особенности (•орфогепеза и клеточной деффэрэнцпровки, но и создать, напркнер, на основа соматического энЗряогенеза (змбриоидогенеза) принципиально новые технологии дяя широкого практического применения. Это особенно важно и актуально для сохранения и размножения целого рада редких, исчезащнх и хозяастЕвнно-цэнных растений, в частности, представите-Ееа рода Rauux>ifia, вегетативные органы которых содэряат продукты гипотензивных и протавоаритшчвских препаратов (резерпин, азмалин, раунатин, раувззан и др.).

Оюдует ответить резкое сокраяршга в посуда® году природных ресурсов этих данных лекарственных растениа, низкую эффективность и трудоемкость семенного и вегетативного способов их размножения. Разработка нетрадиционных способов тиражирования особенно ценных видов поэтому является весьма актуальной, особенно дяя Индии и других стран, поставлжзкх сырье раувольфии на мировой рынок.

Исследование некоторых аспектов морфогенеза раувольфии in vitro, на основе которого и создаются бштехнолзгичвсккэ кетоды, является тают очень своевременным ' и необходим в теоретическом аспекте, так как способствует понкяанк» шханизмов развития растительных псанеа в условиях культуры и тем сакьи создает основы их целенаправленной регуляции. Изучение путей морфогенеза, их идентификация и управлэнкэ ют является одной из важнейших задач корфологии и биотехнологии

(Batyglna et al., 1978; ïlS3ereat et al., 1979; Ivans et al., 1981; Àsmlrato, 1983; ïlick et sil., 1933; Batyglna, 1984; ÍJalperin, 1986; Williams and Maheswaran, 1986; PierIk. 193?). Крош того, решение проблэа морфогенеза и рэгенорации раувольфии в культурэ тканей является Еэобходашм этапом работ по парасексуальной гибридазащш и генетической инженерш (¥аз11 et al.4, 1ЭТ9; Gleba and Sytnili, 1984; Gleba and Shlumukov, 1990), которые пока, в известной степени, сдерживают развитие этих новых направленна экспериментальной ботаники.

цель и задачи исследования, ц&яь» настоящей работы явилось изучениэ путей и особенностей морфогенеза в культуре тканей раувольфии и разработка на этой основе клеточных технологий наиболее шрсшктивных вадов. Дяя этого необходимо было решить слэдувдиэ задачи:

1) получить каллусные культуры у разных ввдов раувольфии и выявить их морфогенетическш потенции с помощь» оптимизирования питательных сред и условий выращивания;

2) провести идентификации путей морфогенеза (органогенеза и эмбриовдогенеза) с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии;

3) разработать способы массового получения растений регенератов у разных видов, раувольфии в культуре in vitro и дать практические рекомендации по методам микроклонирования;

4) апробировать метода выделения, культивирования и слияния протопластов для дальнейшего их применения в работе по парасексуальной гизрвдизации и генетической трансформации раувольфии.

научная новизна работы. Вгорвые проведена сравнительная эмбриологическая идентификация процессов морфогенеза в

каллусеых культурах у всох исслэдовзпныг видоз. Ваяапзяа таксоносштфянооть корфаязгнчэскоя реакции. Гак, показало, что у R.uomttaria рагВЯТСЭ рЗСТвННЯ ДГ^ГГ эябршкдагенэз, у П.сапахсгт- - чзрзз органогенез, у R-caffra -черэз органогенез и с:.Зр*дон£Огешз.

Впэрвь» в ггЯргондогепнса кавдусной культуре и в культура корнза R.xjomitoria обнаружено обргзовзшгэ кнскгэства зйбргоадов. Разработаны условия голучзния каждусных культур и способов гапфоклональшто разетшэния с использованша различных путоз морфогенеза. Вшрвш прошдэно усвэиноэ вздэлгапэ, культйвировэнкэ и слиянеэ кезофныьных протопластов Rcanescen^ и каллусных протопластов n.vomitor-ia. Наадэны способы кинроклонального размножения у изучаэкых видов Rawoifl».

практическая эначимость. Данные, полученные по морфогенезу в культур© in vitro у различных видов раувольфзи, является теоретической основоа для разработки эффективных кязточных технологий для рода Rauwolfia.

В работа определены оптимальные условия индукции каллусных культур ввдов раувольфия с высок®! содержанием алкалоидов, показана возможность их эффективной регенерации, микроразмножения и адаптации к нестерильным условиям. Эти даннш цэнны для практической работы по генетическому улучкени» видов раувольфии, разработке методов генноз иняззнерии, криоконсервации и технологии получения искусственных семян (инкапсулированных з;,х5риовдов). Разработка подходов и способов выделения и культивирования протопластов раувольфии также важна для дальнейшего развития клеточных и генных технологий этого данного лекарственного растения.

апробация работы. 0сн0внш полошния ДИССврТаЦИИ

докладывались и обсуждались на YII ^жаународаом конгрессе по

культуре ткани и каэтак растения (Амстердам, 24-29 1еыя 1620 г.); XI Международном сишюзиуш по скбрхюлогии и охгэннону размноханин (Лзшнград, 3-7 пяля 1990); Мз:здунэродноа биотехнологическом симпозиуме (Ненова, 17-20 апреля 1891 г.); VIII Международном симпозиуме по протопластам (Упсала, Еэзция, 16-20 ишя 1991 г.) и Молодэшой конференции ботаников (Санкт-Петербург, май 1992 г.).

публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 шчатных работ и 2 сдано в печать.

структура и объем работы. Диссертация изложена на I £ ^ страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, обсуждения, заключения, выводов и списка цитированное литературы; включает £ таблиц, <="ц рисунков. Список литературы содержит О. ^библиографических ссылок.

материал и методы

Три вида рода Rcnnuolfia: R.caffra Sond., R.vomitorla АГ-z. И Rcamescens L. бЫЛИ ИСПОЛЬЗОВаНЫ В КЭЧеСТВе ОбЪвКТОВ ДЛЯ

изучения путей морфогенеза in vitro и разработки методов клеточной биотехнологии. Часть материала была любезно предоставлена доцентом С.-Петербургского химико-фармадевтического института Л.А.Николаевой.

В качестве эксплантатов для культуры каляусов in vitro использованы молодые листья (3-4 см длиной) от 3-4-лэтних растений видов рода Rmmmifia, выращиваемых ц • оранжерее Ботанического института С.-Петербурга.

Поверхность листовых эксплантатов стерилизовалась в течение 15 минут в 10% растворе NaOCl и затем 3-4 раза промывалась

диспшфованяок водой. Для получения каллусов простерилизованные листья инкубировались на средах МС (Murashige and Skoog, 1962) или Bg (Gamborg et al., 1966). Для щцукции ' каллусогенеза и морфогенеза в среду добавляли: бнЗензияаминоцурин (БАП) <0.5-2 mg/1), 2,4-дихлпрфеноуксусную кислоту (2,4-Д) (0.5-2 mg/1) по отдельности или в сочетаниях БАП (0.5-2 ng/l) с I-нафтилуксусной кислотой (НУН) (0.5-2 mg/1) или с 2,4-Д (0.5-2 Bg/1).

Для формирования множественных побегов каллусы с почками культивировали на среде с добавлэниэм БАП (0.5-1 mg/1). Укоренение побегов достигалось посла жреноса на среду МС с БУК (0.5-1 mg/1). Для получения высокого процента выхода зябриовдрв с последующим развитшм из них растений использована среда МС с добавлением зеатина (0.1-0.5 щ/1) или абсцизовой кислоты (АБК) (0.1-0.5 ng/1).

Для получения змбршидов в суспензии эмбриоидогенные каллусы культивировали в жидкой МС среде с 0.5 ng/1 2,4-Д при перемешивании на качалка.

Для изучения путей морфогенеза in vitro и идентификация возникающих структур-почек (органогенез) и (или) эиЗриоидов (эмбриовдогенез) каллусы исслэдованных видов рода ftauvotfia фиксировали в ФАА (1:1:3) дет световой никроскопии и в 2.5* глутаральдепвда дяя сканирующей электронной микроскопии (прабор марки jeol jsM-3sc>. гистологические исследования фиксированного материала проводам в соответствии с обычно принята»! методиками (Johensen, 1940; Прозина, I960; Vasll and Taall, 1982). Срезы (12 мям) готовили на ротационном микротоме. Растения исследованных видов рода namuoi/ia, полученные путец органогенеза (гемморизогенеза) или эмбриоидогенеза, гол» акклиматизации в лабораторных условиях пересаживали в горшая с

почвой в оранжэрэо, где и продолжалось дальнейшею т разв>ггао.

Протопласты изолировали из листьев {wsp. 0.8-1 км) растения Яхапи^св^ в R.votnitoria, ПОЯуЧаНПЫХ В КУЛЬТУРО in vitro. Около 0.5 г таких листьев кзззльчали и инкубировали в 5 ил стерильного раствора фэр&ентноа скзси 2-х типов. Тш I

СОСТОЯЛ 13 Onozuke R-10 <S»rva> - а.ЗХ, Driselase <Slenusl -ЧАЯ, Macer-osyme К-10 CServa) - 0.2X, CaClgZISgO - 0.1 Е С 0.5М

раствором маннет-ола как осдарэгуляггоров. тш 2 фэрвгштиоа скэсн

состоял ИЗ OncKcuka R-10 CSex-va) - 0_23J4, Mucer-ozyme R-10 СSarvaO -0.123«, Poctolyae» (Sigma) - 0,043«, CaOlgZHgO - O.iX

и 0.7U раствора мадаигола. Дяя изоляции протопластов каллуса раствор (фэршигную СЙЗСЬ) ГОТОВИЛИ на среде Ws CMedsyesy et

»1, 1930} с Onoauka R-10 CServa> - 0.13Х, Drlselase (Sigmai -ООХ, Macerozym® R-10 <Serva> - 0.1% И O.Si paCTBOpa ЫЗНЮГГОЛа.

noose растворения клеточных оболочек суспензию протопластов фильтровали и центрифугировали при 80 х к по 3 минуты и затем прошвали 3 раза в среде vs при центрифугированию! 80 * в в течение 3 минут. После отмывки протопласты при плотности (1.5-2)*105/мл среда культивировали в среде В5 или Ej (Philips, Collins, 1980) с добавлением 2 нг/л 2,4-Д, 0.5 мг/л НУК, 0.5 ИУК, 0.2 мг/л кшетина и 0.5 М осмотиков - маннигэ или сахарозы.

Эксперименты по слиянию протопластов поводили с использованием полиэтиденгликоля ПЭГ (мм 6000) и при палочных рн и высоких концентрациях Са+2. При этом калдусные протопласты

R.canescens И МеЗОфИЛЬНЫв ЩЮТ01ШСГЫ R.vomitoria СШШИВЭЛИ В

соотношении 1:1. Продукты слияния протопластов культивировали на исходной среде щж температуре 26*.

результаты исследэоакш

1. пути морфогенеза в культуре in vitro Ravwolfta с affra. калдусогенез- Образована каллусно2 ткани пз листокс зксплзнтов было достигнуто на среде UG с различным содаркашзи НУК и БАЛ. Наилучшая индукция каллуса (84S5) отгзэчзна пря концэнтрзции НУК к ВАЛ 2 кг/л. Пэрзнчша каллус был зелзновато-бурого цвета и какпакгныа. Каздеэ 4 нодзли каллус даресевала на свеяую исходную среду. После 3-х пассжгэа кахгус становился болэе рыхлгм, быстро растугцга и зегэноватыа. органогенез сгЕкмориэсгЕНЕэз. Послэ шрэноса болз-э рыхлого, зэлэноватого каллуса на среду с 0.5 кг/л НУК и 0.5 нг/л БАЛ через 20-25 дсоа культивирования наблюдали форсированна почэк (органогенез - гехшогеЕэз) на поверхности каллуса, которыэ в дальнейшем развивались в побеги. В результате гастсшзгаческого анализа каллуса установлено образовать коноголяршд: структурных единиц органогенеза - почек.

!,'до»зствеяяоэ образовать побегов происходило на ИС-срэдэ с I мг/л БАИ. Укорененкэ (ризогенез) срезанных побегов легко достигалось при их культивировании на среде с БУК (0.5 мг/л). Растения, регенерировавшие из каллуса в результате описанных выше путеа морфогенеза, удалось усгошо адаптировать к нестерильным условиям и перенести в ораншрею БИН, гдо они показали высокий (до 78) процент выживания, эмбриоидргенез- Первичный компактный каллус после тарвого пассажа на тоа же среде, на которой он был получен, становился слабо рыхлым. Если же рыхлый каллус культивировался без пассирования длительно (до 2-х кесяцэв) на среде с 0.5 мг/л НУК и БАЛ, он переходах в морфогенное состояние. При этом на его поверхности появлялось шожество глобулярных структур. В

результате гистологического анализа морфогенного каллуса установлено, что эти образования представляют собой типичные биполярные структурные единшц змбрвоидогэвеза - змбриоида. При юревосе на безгориональнув МС-среду змбриоида (до 30*) развивались в нормальные растения. Полученные растения били шренвсены в оранжерею БШ, где они показали высокий (до 80) процент выживания и нормального развитая.

2. пути морфогенеза в культуре in vitro Ramuotfia vomitoria.

кадлусогенез. Фориированиэ каллусов и листовых эксплантов происходит при их культиаированиии на средах МС или Bg с добавками в pama концентрациях 2,4-Д (0.5-2 иг/л), инициация каллусов наблюдается таре» 12-16 дней культивирования на среде с 2,4-Д. Если кондентрация 2,4-Д была 0.5-1 кг/л, то тейпы роста каллусов были низкими на обоих средах. Умеренное число каллусов было индуцировано при ковцэитращи 2,4-Д 1.5 иг/л.

250-300. кг сырого веса каллусноя ткани было получено шслэ 4-х недель культивирования на среде МС с 2 иг/л 2,4-Д. В то ив время на среде Bg с той я» самоа гормональной добавкой интенсивность роста каллусов была значительно ниве (50 X ), чек на среде МС (63Ж) .Первоначально на обеих средах каллусы были компактными, слизистыми и светло-зеленого цвета. Посла двух пассажей на той яе самоа среде каллусы становились болэе мягкими и приобретали зелзныи цвет. Мягкиэ и звлэаые каллусы, растущие на средах МС и Bg с 2 иг/л 2,4-Д, далее шресакивали на среда с последовательно уменьшающейся концентрацией 2,4-Д (от наивысшей до низина: 1.5-1-0.5 мг/л). Посла второй. пересадки каллусы, растущиэ на среде с I мг/л 2,4-Д, сравнительно быстро росли, отличались ш форме и болэе интенсивной зеленой окраске, чем на среде Bg, содержащей ту se саму» концентрацию 2,4-Д. Через 15-20 дней культищювания

рыхлые, быстро растущие каллусы на среде МС были охарактеризованы как морфогенныэ. Однако каллусы на среде В^ даже при низкой концентрации 2,4-Д (1-0.5 кг/л) не выглядели рыхлыми и не обнаруживали признаков морфогенеза. эмбриоидогенеэ. Рыхлые каллусы на среде МС с добавлэниэм I мг/л 2,4-Д были названы нами как морфогенные - зкбриодогенвда каллусы. Яри культивировании таких каллусов на среде МС с добавлением 0,5 мг/л 2,4-Д пролиферация клеток змбригащогенных каллусов становилась более обширной и через 10-12 дней культивирования наблюдались многочисленные более активные, рыхлые эмбриоидогенные клеточные комплэксы (ЭКК). После недельного культивирования розово-белые глобулярные структуры были обнаружены на поверхности ЭКК. Через 15-20 дней культивирования практически вся поверхность ЭКК была покрыта многочисленными глобулярными образованиями. Эти зародышеподоб-ные глобулярные структуры были названы змбриоидаш (соматическими зародышами). После одного месяца культивирования в данных условиях мы не обнаружили образования ЭКК из змбриовдогенных каллусов, но наблюдали змбриоида на разных стадиях развития (глобулярные - сердечковидные - тортедоввдные). В том случае, когда глобулярные змбриоида не были своевременно шресажены на свежую среду, они изменяли цвет, становились бурыми и прекращали дальнейшее развитие.

При пзренесениии на свежую среду МС с 2,4-Д (0.5 мг/л) эти эмбриоиды (инициалии которых возникали из • ЭКК) далее. не развивались и не превращались в растения. При условии культивирования глобулярных • змбриовдов группами (по 50 в группе) на среде МС без ауксина около 62% (табл. I) таких эмбриоидов развивались в полноцэнные растения. Около 80% таких растений были шресажены в горшки с почвой и культивировались в

условиях оранжереи. При Еаравдшаааи па Свзгормояаяьвш среда üC одиночных зкбраовдов только 203 ьз se раззнвалксь в норкалыа» растения.

Для получения болзо высокого процента развития ЕКбрИОЗДОВ в нормальные растения, они выращивались группами (по 50 в кгздра группе) на среде НС с добавками различных концзвлрацаз сватана (0.1, 0.3 или 0.5 иг/л) или ABA <0.1, 0.3 или 0.5 мг/л). Процент развития з:,5бршвдов был около 70 при 0.5 мг/л зэатша в среда, в то время как при 0.1 иди 0.3 кг/л заапша в среда доля развития знбриовдрв в растения была дай» кеньсе таковоа на базгоркональноз среда (табл. I). Оддако продает растении, успешно пересаженных и развивающихся в почве, был почти одинаков . при условии их предаесгауюзэго развития на безгормональнои и зеатин-содаржащэй срэдах. Добавлзниз ABA в среду задэркиваэт развитие самядолэа и приводят к образования аномальных растений. Иногда были обнаружены многочисленные аяоналии в эмбриоидогенезе, такие как образование миох»ствэееых семядолей и добавочных корява. Эыбриокды бурого цвета, но проявляющие способности к прорастанию, такие культивировали группами по 50 иг. на среда КС с добавкой 0.5 мг/л зеатина и возрастающей концентрацией сахарозы (от 33Ü до 8%). Представляет интерес тот факт, что эыбриоида бурого цвета могли развиваться в нормальные растения лишь при налички в среде 6-4% сахарозы. Соответственно 34% и ?Л% змбриоидов бурого цвзтг могли развиваться в нормальные растения.

вторичнья эмбриоидогенеэ. при перенесении глобулярных эяЗриовдов (первичных зкбриовдов) на среды, лишенные ауксина или с зеатином 0.5 мг/л с целью получения растений, наблюдали образование новых эмбриоидов непосредственно на первичных экбриовдах. Такие эмбриоида мы назвали вторичными.

С-ср'лроЕЕшл вторичны: Е-'бргюздов было обнаругзко тгетп у ОЗЕОВЗНИГ! иЗСТОШЙЕ, рЗЗЕИВБЖЦПСЯ 13 шрвкчнкг ЗХЗСИХлПрВ. Двлоо продолжалось образована с"5р":оттдов новые тирана щ вторичных' гг.гбрхоцдрв. "спользуя тахнггс* культткфовапгз зкбрчоцдов кзсяольтзс гсаэргци, оказалось возиоквыя получать п годздгкпать сггЗргетида в течангз дсуг .тэт кг культур: Сзз угрзты корфогзянкг потеящт.

таблица 1. разеитиз цжк растения из 2нериовдоз, растуез-ег на

ЕЕзгсг>нонлльноя ь'с-среде и на мс-средб с раэличнш

содержании зеатина

Чксла С!остав

гггйрттапдов срэды

в культурэ

Ж 8?зЗрюидоз, % рэстонп:,

развквгнхся пркжвзахся

в нормальные в гочЕв растения

2500 КС (без готжонов) 02 СО

1503 МО + 0.1 иг/л коз-пша 44 СО

1500 1.5С + 0.3 иг/л зеатина 49 80

1500 ПО + 0.5 иг/л зоа-пяга 70 Ш

по.д5ор суспензионной культуры. 100 гиг сыроз навэсви быстрорастущих на срэде с I нг/л 2,4-Д норфаготасг каллусов культивировали в жидкой срэде ИС с 0.5 иг/л 2,4-Д. Пробирки затем помещали на ротащганную качалку <120 обор/шш) и кыдэр^явзли на свету при тетявратурэ 25° С. Черэз две недели в каждую пробирку добавляли по 20 ал сввяюп среда. Чэроз 4 недели культивирования суспензия состояла из групп розово-чЗэлгх глобулярных зародышевых структур - эмбркоидов. Число глобулярных эмбриовдов быстро увеличивалось в этих условиях. В процессе образования и развития змбриовдов в суспензионной культуре можно отметить несколько фаз: экспоненциальную, линейную,

стационарную и, наконец, затухающую. Максимальное число глобулярных эмбриоидов было обнаружено на 10 неделе, а через 12 яедель . отмечалась тенденция к уменьшению образования эягЗриоидов. Сформировавшиеся змбриоида промывали в свежея среде МС без ауксина и затем их культивировали на среде, лишенное ауксина или с зеатином 0.5 мг/л. На зтоа среде они развивались в нормальные растения, проходя все стадии развития змбриовдов. Таким образом, мы смогли подобрать суспензионную культуру для массового получения эмбриоидов из морфогенных - эмбриодогенных каллусов.

Гистологический анализ иорфогенних - змбраоидогенных каллусов.

В результате гистологических исследований эмбриоидогенных каллусов с помощью световой микроскопии установлено, что клетки змбриовдогенных каллусов веодаократно делятся, формируя меристематическую ткань, определяемую (Ва1ув1ла ег а1., 1978)как змбриовдогенныа клеточный комплекс (ЭКК). Исследование цитологических препаратов это« ткани показало, что клетки ЭКК мелкие, округлые или овальные сгустой цитоплазмой содержат крупное ядро с ядрышком, мелкими вакуолями и многочисленными крахмальными зернами. Каждый отдельный ЭКК отчужден от окружающих тканей и поверхности темным материалом. Последовательные делания к. организация некоторых клеток из ЭКК приводят к образованию округлых или удлиненных зародышеподобных структур - змбриовдов. Наблюдаются также многочисленные глобулярные змбриоида. Начало им дакгг преимущественно одиночные клетки ЭКК, возникшего после нескольких делений кяэток змбриодргенного каллуса. ЭКК инициируются рано, и глобулярные змбриоида проходят сврцэчковидную и торпедовидвую стадии через 15-20 даея культивирования.

Развитие эмбриоидов происходит асинхронно в результате

этого эмбриоида на разных стадиях, включая глобулярные, сердечковадные и торгодовидаые, могут соседствовать друг с другом. Интересно отметить наличие сусданзора у эмбриоидов на ранних стадиях развития,однако у энбриовдов, переходящих к сердвчковидноа и торпэдовидноа стадии, суспэнзор уяе дегенерировал. На позднее стадии змбриоидогенэза семядоли были отчетливо выражены, цэнтральнзя проводящая система, корневое и стеблевой апексы были хорошо видны. Ни на одной из стадий развития не было обнаружено контактов проводявзеа системы эмбриоидов с материнской тканью. В целом последовательность стадаа развития эмбриоидов сопоставима с таковой у зиготических зародышей.

Гистологические анализ эибпиоидогенных каллусов показал значительное снижение запасов крахмала в клетке, особенно в период формирования глобулярных эмбриовдов из ЭКК. По мере развития эмбриоида крахмальные зерна исчезали.

Исследование эмбриовдогенных каллусов с помощью СЭМ показало наличие на их поверхности скоплэяиа эмбриоидов. Как глобулярные, так и серяэчковидные эмбриоида, вероятно, могут возникать из поверхностных клеток каллуса. С помощью СЭМ были также обнаружены аномальные э?эЗриоида, имепцэз множество семядолей (поликотилия).

3. ПУТИ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ in vitro Rauvolfia eaneecena.

каллусогенеэ. Эксплавгш листьев.культивируемые на среде МС без гормонов, не проявляют никаких признаков каллусообразования. Добавжниэ цитокинина БАП (0.5-2.0 иг/л) также не ивдуциирует. каких-либо морфогенетических реакций. Оптимальное количество каллусов развивалось на среде МС с 2,4-Д (1.5-2.0 иг/л) + ВАЛ (2 мг/л) и НУК (1.5-2.0 мг/л) + БАП (2 мг/л). На основании морфологических данных были отобраны каллусы, наиболее хорошо

растус^з ей обета сродзг, для шакэдущзго ¡¿зучзгзк ц-дайоронцкачая. Первоначально зтк калдусн бяхи кохпшгш^, ззхэшвато-бурого цвэта. в результате хюслэдрватвльных пасссгг-1 зла каллусов па севшую сроду того ¡>;э состава они станоЕж;.зь рсшькк, сеотдэ-зэл5ного дзета.

сргансгеняз стасюриэагЕнгээ. Зата; эти ригжга каллусы оыл.; трэсеззга па срада, содэркацкз послэдовательго рэньшйсег.-эся кокцзнтргци: 2,4-Д к ЮН (1.5, 1.0 к 0.5 иг/л) с БАП <0.5 кг/л) У каллусов, варащзшзг: на среда 2,4-Д к БАП, цр*: горесадеэ не сроду с шззкикп концмпрацишк 2,4-Д к БАП н&блздзлось сшззли;-Еорфоганатгазского потенциала, продолаав^ееся при послэдэва-тельных пассаааз:. Очень редко формировались корни, но есл;: каллусы со среда НУК и БАП тореводйля на сродг с укэпьоэннос. концэЕтращйзг, НУК до 0.5 гх/л» иш пр;:сбштал:. моррогенетическиз способности. Чзрез 15-20 даай культивирован:::; на стадо с НУК (1.0 или 0.5 иг/л) к БАП (0.5 кг/л) кг поверхности каллусов появлялись зелзныэ почта: (гемш), котошо развивались в побеги. Иютрлогическкз ксслздования корфогенныг. каллусов с покощьв сотового микроскопа подтвердило, что регенерация растениг из таких каллусов осуществляется только через один путь морфогенеза - через гокноризогеязз. Особо слэдует откатить, что прококбиальные клзтки праюрдия почт; обычно связаны с проводящей системой (ПС) каллуса. Развнвигася елошнти проводящее системы были рассеяны по каллусу к выглядели как кольцевые структуры. Образование эибркоидрв на таких корфогенных каллусах не было обнаружено.

Максимальное количество формирующихся почек было получено на среде МО с НУК (0.5 мг/л) и БАП (0.5 мг/л). Последовательное фориирование корней в среде, индувдрутацей геммогенез, было спорадическим. Размножение побегами было возможным щ)и

:г7л-ьт.!в:|роззЕ:Е1 на срэдз КС с 1.0 иг/л БЛП. "гроз "ультгжфсваекя забодали яесгястгэяеоэ образовал» гэляявс добогсз. Псч ку^тьтжпрозапяиа побегов яа бзагорглозаякоз ерэгэ з -тонне длительного периода (2 ?.:зсгцз) зеб.^эдз.тл ~зссогсэ сбрззоЕзго-гя ипрко! з базэльнсг часта. Болгэ Снстрсэ (з 15 двза) пояагзига кораеп яео::с;од:уэ, зега Еогжягггэ -:?» и«»-о побега Сыля ерззаны и £«фа?явэлксь яхяя на рггбгвлкшо:? вдаоз ерзгэ !.*С с 0.5 ;т/л НТК. Разз^пэ п :/дппош:о побогов ззрэдалзготся вплоть дэ 16-10' годтш> гсульпшггрозззЕО! грп условия вырггдаягя па рзебгзззнаоз здзое срзд;е "С, .иг-зтшез ростовых гср".:опов. Тэгса образе:!, ждалось добиться кассового разгзогхягая рзстеппз этого езда. Укорэнивхэся рэстэхпгя были горэсжаны з горал с гочвоа л перенесены из лабораторных услсвпз з ергнгзрзв; около 803 растэнкз сикало псагэ аюшгитгкщга. Растеши пролезала нормально развиваться в оранжереях Б1Ш С.-Пэтербь'ргз. Полученные раствшш з даляэгаея будут яссгздввззн га содержание алкалоидов.

4. КУЛЬТУРА изоляционные ПРОТСЛЛАСТСП И СОМАТИЧЕСКАЯ

ГИБРИДИЗАЦИЯ К. ссп&з-селгг И КмотЫсЫа.

В результате испытания различных фэрггеетпых емзееа б*лп1 отобраны наиболее подходящие растворы дет изехляцкя протопластов из мезофилла листа К-сапезсепя и П.иепИоЫа, а т31спэ каддусных клзток я.оот«ог1а. Изолкровашшэ протопласты культазирозали на кшдких средах В5 и Е-[- с ростовкет стимулятора?,ш. Нглдучяке результата были получены на ерэдэ Е^ с добавлением 2 нг/л 2,4-Д, 0.5 мг/л НУК, 0.5 тяг/ МУК, 0.2 яг/л кинина с 0.5 М ианниголон. В этой ерэде горвыэ далзнкя едвток наблодал! через 7-10 дней культивирования. Постопзгшо з среда данного состава через 5-6 недель обнаруживалась пролгфграцая

о

клеточных клонов (протоклоны и микроколошш). Эффективность деления протопластов достигала 23-24%. Развивающиеся колонии клеток были перенесены на агар-желатиновую среду Ej с 0.25 или 0.5 иг/л 2,4-Д для дальнейшего роста и дифференциации. Протопласта мезофилла листа и каллуса R.uomnoria культивировали на среде Ej с добавкой некоторых гормонов, как и R.ccm®sc«m^. Через 8-10 даей гослз начала культивирования наблюдали дарвые клеточные делэния как в культуре протопластов мезофилла листа, так и в культуре протопластов каллуса. Через 8-7 недель культивирования клеточные клоны становились заметными среда протопластов мезофилла, эффективность деления достигала 14-15Ж, однако этот показатель для протопластов каллуса был не более 8-10Ж посда первого деления. Для дальнейшего роста и развития колонии клеток были шреведены на агар-желатиновую среду с 0.25-0.5 мг/л 2,4-Д.

Продукты СЛИЯНИЯ протопластов ft-canascons С R.vomitor~ia культивировали на средах Е£ и В5. Первые клеточные деления были обнаружены только на среде Ej через 12-14 дней культивирования. Через 4-5 недель на этой же среде эффективность делении клеточных клонов составляла 12-142. Затеи развивающиеся колонии клеток пересаживали на агар-желатиновую среду для дальнейшего роста. Црименениэ разработанной нами техники слияния протопластов культуры может быть использовано для проведения работ по соматической гибридизации и генной инженерии с целью

улучшения тлезных свойств видов рода Rauvolfia.

СХЕМА ИНДУКЦИИ КАЛЛУСОГЕНЕЭА И РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИИ ЧЕРЕЗ»

ОРГАНОГЕНЕЗ - ГЕММОРИЭОГЕНЕЭ У R.caffra ЗопЛ И Я<сап*яс*пх I И ЭМБРИОИДОГЕНЕЭ У Я.са//гв Бог*!

Листовые зксгшшты

Культура 28 дней

среда МС + 2 мг/л НУК и 2 «г/л БАЛ

Компактный (активно растущий первичный) каллус

28 д ней

1 1-1 ср<

1 й

1-ый пасса» среда МС + 2 мг/л НУК 2 мг/л БАП

Слабо рыхлый каллус 1

Без шресадая среда МС + 0.5 мг/л НУК и 0.5 мг/л БАП

60 дней

28 д ней

2-* и 3-« пассажи среда КС + 2 мг/л НУК и 2 кг/л БАП

Глобулярные эибриовды

21 день Развитие растений

Пересадка на безгоркональную МС среду

28 дней |

Скяьно рыхлый каллус

I 4-ый пассаж 21 день I среда НС + 0.5 мг/л 1НУК и 0.5 мг/л БАП

Почки

1

да МС + I мг/л

28 д ней

Множественные побеги

Пересадка побегов

15 даеа

для укоренения среда 1/2 МС + 0;5 мг/л НУК

Корни и целые растения

21 день,

Перенос растений-регенерантов в горшки после акклиматизации в камере

схема индукции каллусогенеэа к развитие растении через эмзриоидогенез у к. мотиозна.

Листовые зксплаиты

Культуре 28 даеа. свода ыС + 2 иг/л 2Т4-Д

Комиаетныг, светло-зеленый каллус 28 даэ й

1-й и 2-й пассаан среда МО + 2 иг/л 2,4-Д

28 дае£ | Слабо рыхлый ээлэный каллус

3-й пассан

среда КС + 1.5 шг/л

2,4-Д

28 днэс

Рыхлый каллус 21 день

Быстро растущий рыхлый каллус <зрлЗрковдогешыа каллус) 15 даен

4-й пасск;:

среда МО + 1.0 гас/л

2,4-Д

5-й пассаа

среда МО + 0.5 нг/л

2,4-Д

Глобулярные зибриоида

21 день

Безгориональвая МО среда или среда МС с зеатииок (0.1,0.3,0.5 кг/л)

Развитвэ растений 28 дней |

Вторичные эмбриовд

Перенос развивающихся растений в горшки после акклиматизации в камере

вшоды

1. Разработаны условия получения и культивирования корфогеняых каллусов трех перспективных еддов рода раувольфзи яха//га,

Í2.vomitoria И Axonescens.

2. Бтрвыэ проведана яданттфгаацяя путей корфогенеза в каллуспых культурах всех изученных видов, свзсвзтельствукдзя о гахсоноспзщфгшоста гторфодаштаческих рзавдя з рода

-¿auwolfia. Так, у R.caffra ЦДЗНТП^ИиЗфОВЗЕЫ ОртаНОГеЕвЗ Я

зибркоидогвнвз, у a.con»scens - только органогенез (пгетзркго-гвнез), а у a.vomitoria - зябриивдоговаз.

3. Бшрвш 3 каллусноа хсультурэ у ¡¡.vomitoria было получено массовое количество зибриовдов и вторичных згэбрпоэдов на разных стадиях развития. Хро:*е того, были получены эмбрялдды в культуре корнеа.

4. Ниэнпфясацяя ауте а морфогенеза и оггпяпзацяя сред ПОЗВОЛИЛИ упраВЛЯТЬ М0р|)0ГеЕ330М У раЗЛИЧНЫХ ВИДОВ üauwofia. Это дало возшхзшсть отработать рекомендации для кассового получения рогенерантов.

5. Нааданы условия получения и культивирования газофплльних протопластов я.сапвясоп&, кезоф&альных и каллусных протопжастоз

^.vomitoria. Проведаны усшшныэ опьгш по их слиянию и получэнезз развивающихся микрокадлусов соматических межвидовых гаЗрядов.

6. На примере представителей рода Rauwoifta показана вкягость и необходимость сравнительного норфолого-зкйриологического анализа при создании клеточных технологий размножения редких и хозяйственно-ценных растений.

Приношу свою сердечную благодарность ксшйгам лаборатории эмбриологии БИН~ РАН Санкт-Петербурга, Института клеточной биологии и генетической инженерш УкрАН Киева и С.-Петербургского химико-фармацевтического шстатута.

список работ, спувликованньи по материалам диссертации.

1 .M.Dpadhyay.A.Yu.Kakoveychuk.I.I.ShaaroT and T.B.Batyglna. Emtxryoldogenesis and plantlet regeneration In leaf callus cultures of Kauwoifia aa/fra sond. VII international Congress on Plant Tissue Culture. held at Amsterdam,June 24-29,1990.1990.AbStr.p.271.

S.N.Upadhyay and T.B.Betyglna. Entoryoldogenesls and genniorhlzogenesIs In RouwoiM XI International symposium Embryology and Seed Reproductlon.Lenlngrad. July 3-7,1990.1990. Abstr. p.178.

3.N.l^adhyayJ.y.Klrlchenko,0.F.Lubaret3 and I.A.KostenyuK. Culture of mesophyll protoplasts of r. cmese«*. L.Pfcyslologla Plantarum 1991,82(1 ).A19.

4. И.В. Кириченко, Н.Упадхаая, О.Ф.Лобарец, И.А.Костешак Культивирование мезофилльных щхггопластов Rauwolfia canoscons L Доклады Академии Наук УССР, серия А. 1991. N 1: 125-127.

5.N.Upadhyay and T.B.Batyglna. Developments of plantlets from cultured tissues of «.сопмевп® l.In: Batyglna et al. (eds). Ргос. XI International symposium on embryology and seed reproduction.Leningrad. July 3-7,1990.St .Petersburg.Nayfta. 1992. 578—579.

6.A.Yu.Matooveycbult,H.Opedhyay and A.V.Seaenova. Hormonal regulation of embryoidogenesls.In: Batyglna et al (eds).Proc. XI Inter.Symp.on embryology and Seed reproduction. Leningrad. July 3-7, 1990. St.Petersburg. Nayka. 1992.339-340.

7.N.Upadhyay,A.Yu.MakoveychuK.L.A.Nilcolaeva and T.B.Batyglna. Organogenesis and somatic eobryogenesla in leaf callus cultures Of Rauwolfia cajfra. Sond. JOUT. Plant. Physiology. 1992. 140(2). 218-222.

8. T.B.Batyglna and N.Upadhyay.: In vitro morphogenetic

potential of xauwai/ia 3pp. XII International Confess cn sexual ' plcnt reproduction.July 19-23,1592. CMo.GS A. .Abatr. 1S?2.p 5.

S.N.Upsdhyay end T.B.Eatygina. Progress of plant regeneration sy3tca or a seedy ^pocynaceoe.in: Proc. International syœp.cn transplant production sy3tea.Yokohama. Japsn.Ausust 23-28,1992. Acta Horticultarle.1992.(in press).

IO.N.Upadhyey and T.B.Eatygina. Esbryoidogenesi3 ol Rauwoifia vomitoria Afz. through leal callus culture.In; Proc.EUCARPIA Synp.Angers,Trance,July 6-11,1992.1992(In pres3).