Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПУТИ ИНФИЦИРОВАНИЯ МИКОПЛАЗМАМИ РАСТЕНИЙ ЛЮЦЕРНЫ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ОБРАЗОВАНИЕ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ БОБОВО-РИЗОБИАЛЬНОГО СИМБИОЗА

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПУТИ ИНФИЦИРОВАНИЯ МИКОПЛАЗМАМИ РАСТЕНИЙ ЛЮЦЕРНЫ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ОБРАЗОВАНИЕ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ БОБОВО-РИЗОБИАЛЬНОГО СИМБИОЗА"

А

' ' МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА

И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи МИДЯННИК Гудьшат Ароматовна

ПУТИ ИНФИЦИРОВАНИЯ МИКОПЛАЗМАМИ РАСТЕНИЙ ЛЮЦЕРНЫ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ОБРАЗОВАНИЕ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ БОБОВО-РИЗОБИАЛЬНОГО СИМБИОЗА

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Диссертация выполнена в Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева

Научные руководители — доктор биологических наук, профессор В. К. Шильникова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник П. И. Иванов.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор В. А. Шмыгля, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г. Ф. Хайлова.

Ведущее учреждение — ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

в у./— часов на заседании специализированного совета К 120 55 06 в Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет ТСХА

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА

Защита состоится « " . . » '/У^- часов на заседанш

1995 г

Автореферат разослан « . ■>

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

Мосина

; . ■ ' - I -. Актуальность. Микоплазмы вызывают более 200 заболеваний растений (îully, Vhitcomb, 1989), среди которых наиболее распространены карликовость злаковых, розеточность яблонь, персиков, цитрусовых, золотистость винограда и "ведьмины метла" бобовых, . особенно люцерны и клевера (Власов с еоавт., 1989). В Поволжье, Казахстане, Средней Азии в результате поражения посевов люцерны микоплазмами зарегистрировано снижение урожая зеленой массы в 8 раз, семя^ - в 45 раз (Горбунова с . соавт. , 1986; Власов, 1987). Потери в сельском хозяйстве от микоплаз-мозов растений ежегодно возрастают, что, вероятно, связано с увеличением антропогенной нагрузки на экосистемы. .

До сих пор;не разработаны эффективные меры предотвращения микоплазмозов растений, что во многом связано с малой изученностью механизмов инфицирования растений микоплазмами.

В связи.с этим, изучение путей инфицирования растений микоплазмами и особенностей : взаимодействия микоплазм с,растениями является актуальным для поиска эффективных способов пре-, дотвращения микоплазмозов ■ растений . и для более углубленного понимания. причин-, приводящих к проявлению симптомов заболевания. ' ' * • . , ' ' . ..

Цель работы. Изучить возможность проникновения микоплазм в растения через корневую систему и характер влияния микоплазм .на физиологическое состояние растений (с использованием эффективности бобово-ризсзбиального симбиоза в качестве, критерия оценки). - . ' . •

Основные задачи работы. 1.' Изучить' возможность совместного культивирования микоплазм с растениями на питательных средах в . лабораторном (модельном) опыте. 2. Изучить. возможность проникновения микоплазм в растения через корневую систему в лабораторном (модельном) опыте. 3. Изучать морфо-цитологичес-,кие особенности.растений люцерны, инфицированных. микоплазмами. ■4.'. Изучить влияние микоплазм, на., процесс образования • бобово-ризобиального симбиоза. Б.. Изучить влияние микоплазменного заражения. «а нитрогеназнуы активность бобово-ризобиального симбиоза. ' , '

Научная - новизна р-цутн. Впервые экспериментально установлено, что ахолеплазмы способны проникать в;растения.через ненарушенные корневые ткани. ' тормозить процесс инфицирования

ЦЕи!РАПЬНАН .

■' ■ НАУЧНАЯ ПОТЕКА

. • 1 Моск. с^ль;::охоз ачадэмии ~ - ■ ' nv:.. К. 1 i-r.4-p.jj« )i

Иис, KjA-J^SZ

- ? -

Р ют^ний люиерны рдао^иями и влиять на нотрогенааную активность Cl "ОЕО-рИ^ЙИлЛЬЧОГч, СИМбИОЗа

Практ.ыеское значение работы Для совместного культивирования растении с микопласшами предложена питательная среда, приготовленная на основе растительного огвара Полученные нами сведения о ранее "неизвестном пути проникновения микоплазм в растении позволят более комплексно подойти к разработке мер Сорьоы с заболеванием и предотвращением эпифитотий

Апробчция рчботы Основные результаты диссертации были доложены на конференции молодых ученых и специалистов МСХА (Москва, 1991 г. ), научных конференциях в Нущнно-на-Оке (1992 г.), в Айове С США, 1992 г. ), в Барселоне (Испания, 1992 г.).

Публикации Сановные результаты исследований представлены в печатных работах

Объем работы Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы ( именования, в том числе зарубежных), приложения. В работе содержится 4 таблицы, рисунков

Автор выранае? искреннюю признательность зам директора Казанского института биологии РАН, к. б н В. М. Чернову, к. б н. ЛЕ Аветисовой, ст. лаборанту Г Б Барановой, к. 0. н АЛ. Степанову, к. б. н. А. А. Ваньковой за ценьую помощь и консультации при выполнении работы

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В опьггах использовались люцерна посевная Medioago sativa (семена, проростки, растения), микопдаэма АоЬо1ер1аыпа latdlawti штаммм А (получен из коллекции Института микробиологии и эпидемиологии им. Е Ф Гамалея РАМН г Москва), клубеньковые бактерии Rftlzobium melllot¡ штамм 425« (получен из коллекции ИНМИ РАН г Москва).

Клубеньковые бактерии выращивали на гороховом отваре. Для культивирования клубеньковых б-ютерий, растений люцерны и A laidlawii использовали питательную среду на основе отвара сена (Дубинина, 1978, Ванькова, 1S91).

Семяна люцерны стерилизовала го ме~оду Катмпна (Nut--win.

1949) концентрированной серной кислотой в течение 3-4.мин. Семена проращивали при комнатной температуре. . ■

Обнаружение микоплазм в тканях растений проводили методом ДНК-ДНК гибридизации и электронной микроскопии (Борхсениус, Чернова, 1989; Уикли, 1975).

Изучение морфологии и ультраструктурн микоплазм в тканях растений проводили методом ■ электронной микроскопии (Уикли, 1975).

Количественный учет клеток клубеньковых бактерий и мико-плаэмы А. 1а1с11а«и проводили методом люминесцентной микроскопии (Методы почвенной микробиологии и биохимии/ 1991).

Нитрогеназную активность симбиозирующих растений определяли ацетиленовым методом (Методы почвенной • микробиологии и биохимии, 1991). - . *

Для изучение клубеньков и утолщений на корнях люцерны использовали сканирующую электронную микроскопию (Гузев с соавт, 1986); . / ', .,:

Биометрический анализ растений и учет количества клубеньков проводили в модельных опытах.

Оценку возможного токсического влияния микоплазм на растения осуществляли '■■ с помощью тест-растения - кресс-салат (Руге, 1955). - - , ■

Полученные- Данные обрабатывали; методом - дисперсионного анализа (Доспехов,.1979). ,' '. • \

.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ? л

- ПОДЮР ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ СОВМЕСТНОГО КУЛЬТИВИРО- • , - ВАНИЯ РАСТЕНИЙ, МИКОПЛАЗМ И КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ. До настоящего ■времени все данные о • характере;взаимодействия микоплазм с растениями были получены на основании анализа полевых,и вегетационных опытов,, что обусловлено сложностью постановки экспериментов в контролируемых лабораторных условиях.^ В первую очередь, это связано с тем, . что до сих пор не удавалось.культивировать миколлазмы и растения на одной питательной среде.: В..связи- с -этим для достижения поставленной в работе цели,, мы считали необходимым, сделать 'упор на подбор питательной , среды, пригодной для культивирования . как-расте--

ний. так и микоплазм, что позволило бы создать упрощенную лабораторную модель взаимодействия этих организмов. ■

Первой средой, использованной нами-для попытки совместного выращивания растений и микоплазм, была среда, приготовленная на основе гидролизата бычьего сердца с добавлением дрожжевого автолизята (ГБС), которая традиционно используется для культивирования различных видов микоплазм. После высаживания проростков люцерны на среду ГБС . вокруг них и особенно остатков тканей семян начинается бурный бактериальный рост. В. конечном результате растения желтеют и постепенно ' увядают. Данний результат можно объяснить тем, что практически невозможно получить полностью стерильные семена растений и на богатой среде, которой является среда ГБС, единичные оставшиеся в тканях растений бактериальные клетки прорастают. В ввязи с этим, мы решили выяснить, возможность культивирования растений и микоплазм на бедной питательной среде.

В качестве бедной питательной среды была выбрана среда на основе отвара сена с добавлением витамина В/£(СО - сенной отвар). Данный субстрат использовался ранее для выделения ми-коплазмоподобннх организмов из водной среды (Дубинина, 1978) и из почвы (Ванькова, 1991)-. Микоплазмн, как показали работы А. А. Ваньковой, способны расти на среде СО.

Проверенные на стерильность семена люцерны помещали в колбы со средой СО. В данном случае удалось. поддержать рост растений в условиях, асептики в течение нескольких месяцев (до 8). Ограничивающим фактбром.роста растений на' среде СО является недостаток влаги,, так как через 8 месяцев инкубирования сосудов с ватной пробкой при 20-22"С питательная среда высыхает. ;

Необходимо было также проверить способность развития на среде СО клубеньковых, бактерий, поскольку одной из задач нащей работы было создание лабораторной модели "микоплазмы и бобово-риэобиальный симбиоз". . - •

Лосев ¡\hizobiurr) теШои штамм 420а проводили по стандартной методике. Через 3-е суток инкубирования при 20-22°С на поверхности плотной питательной среды СО образуются ' типичные колонии ризобий. -

Таким образом,', среда СО оказалась пригодной для культи-

в1рэвания как микоплаэм и клубеньковых бактерий, так и ладр-.ны. Благодаря обнаруженным свойствам среды СО создаются все необходимые предпосылки для создания упрощенной лабораторной модели для изучения влияния микоплаэм на особенности роста и развития инокулированных риаобиями растений.

. СОВМЕСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЛХЩЕРНЫ И МИКОПЛАЭМ

. В МОЛЕЛЬНОМ ОПЫТЕ В связи с тем, что нами была подобрана оптимальная питательная среда для культивирования растений люцерны, микоплаэм и клубеньковых бактерий,-следующим этапом работы было выяснение возможности совместного культивирования рассматриваемых биологических.объектов в модельном опыте, где влияние посторонних факторов сведено к минимуму. -

',' Для ^остановки модельного опыта семена люцерны стерилизовали И проращивали при комнатной температуре. Проростки иноку-лировали через 6 дней суспензией' А. 1акЛа«11 из расчета Г,6x106 кл/мл микоплазмы на 1 растение. Растения выращивали под лампой-, дневного света в 12-часовом периоде и освещений 4000-лк, при комнатной температуре в плоскодонных колбах на 500 мл и в широких пробирках высотой.80 см. В каждой колбе и пробирке культивировалось ■ по 1. растению люцерны. . Контролем в опыте служили растения, люцерны, не зараженные микоплаэмами. • ". ' "

В течение первых. 2 недель растения люцерны в модельном •

• опыте развивались во всех, вариантах нормально. В начале треть-. ей недели в колбах с. люцерной и ,микоплаэмами наблюдалось час; тичное пожелтение . листьев люце.рны и отставание в развитии по

сравнению с контролем (незаргикенные растения),- к.концу месяца..

• большинство растений полиостью , желтели и погибали. Однако в ряде случаев,..примерно 10% проростков люцерны, зараженных микоплаэмами, - приобретали позитивные свойства, выражающиеся в усилении роста по.сравнению с контрольными растениями, ■ утолщением стеблей и. увеличением' размеров листьев. Контрольные > растения в это^-период выглядели здоровыми. -

.. . Предполагая, что быстрая гиб»пь растений, люцерны может быть СРЯЙНН.-1 е токсичн.ютьп микошиг«м-№> птн'Ж*-нию к люцерне и угнетением-за .'счет ?того метдСолНома растений, было, проведено . исследование мккоплнэм на!токсичность.по отношению к растениям

- ь -

методом биог^ста на кресс-салате по У Руге (1955).

Проваленный эксперимент показал, что микоплазмы не выделяют угнетающих развитие растений веществ Обнаруженное нами в опыт>- угнетение растений происходит, вероятно, вследствие подавления метаболиамз растений проникшими в их ткани микоплазмами.

В еьнъи с полученными результатами, нами был изменен порядок постановки модельного опыта В последующих опытах мы, внося растения в пробирки со средой, подращивали их 2-3 недели, а затем добавляли суспензию микоплазм При такой постановке эксперимента вое растения люцерны, культивируемые с ми-коплазмами, длительное время (до 8 месяцев) сохраняли жизнеспособность, так же как и контрольные растения

ПРОНИКНОВЕНИЕ МИКОПЛАЗМ В РАСТЕНИЯ ЧЕРЕЗ КОРНЕВУЮ СИСТРМУ Для изучения возможности проникновения микоплазм в растения череч корневую систему использовали вышеописанные модельные условия. Через две недели культивирования растений в пи-тааельную среду СО добавляли суспензию микоплазм таким образом, чтобы растения могли контактировать с микоплазмами только через корневую систему В пробирки вносили суспензию клеток А. 1а1с11а*п А, в количестве 1,6х10б кл/мл среды Контролем в данном опыте были растения люцерны, не инфииированные микоплазмами.

Определение проникновения микоплазм в ткань растения в лабораторном опыте осуществляли методом ДНК ДНК гибридизации и электронномикроскопически у 3-месячных растений

С помощью метода ДНК-ДНК гибридизации заражение растений микоплаамами может быть определено по гибридизуемооти ДНК, выделенной из проверяемых растений, с ДНК микоплазм или с реком-бинантными глазмидами, содержащими ДНК микоплазм

Дот-гибридизацию тотальною препарата ДНК, выделенного из листьев и стеблей люцерны, проводили со следующими ДНК-^ондн-ми рА132, специфичный к А ЫЫЫ«!!, 14:>г>. 1 п«-| и^ичный ю всем представителям класса КЫ1к.ц1еь контролем служили с*е-рильные растения люцерны

Пробы ДНК, нанесенные на Фильтр, содержали ДНУ, ьыд>-

ную из листьев люцерны, культивировавшейся совместно с мико-п лаз мой А. 1а1с11а*н штамм А и ДНК, выделенную из незаряженной люцерны. Таких полос нитроцеллмозного фильтра с пробами ДНК люцерны было две. Каждую полосу гибридизовали отдельно.. . "

Первую полосу фильтра гибридизовали с ДНК-8ондом рА132. Вторую полосу нитроцеллюлозного фильтра гибридизовали с универсальным зондом рМе1 б. Был получен 'положительный ответ на первой полосе в лунке с ДНК,, выделенной из люцерны, культови-ровавшейся с микоплазмой А. 1а1с11а*11 штамм А, , что говорит о наличии ДНК микоплазмы в листьях люцерны. Полученный положительный ответ на второй полосе фильтра,' - при гибридизации ее универсальным зондом рМе16, также подтверждает присутствие ДНК микоплазм в листьях люцерны. Наличие на второй полосе фильтра положительного ответа в пробе ДНК,; выделенной из незараженной люцерны, объясняется тем, что зонд рМг1б имеет" гомологию с ДНК хлоропластов люцерны. ф \

Таким образом, с помощью дот-гибридизации тотального препарата ДНК листьев люцерны со всеми использованными ДНК-зондами показано, 'что в вариантах совместного культивирования люцерны и микоплазм, последние тестируются в тканях растений в концентрации не ниже 0,1-1,0 клеток микроорганизма на одну клетку:растения. В контрольном варианте опыта' микоплазмы не .^обнаружены.. Таким образом, ' полученные нами результаты дот-Гибридизации свидетельствуют о способности микоплазм проникать в ткани растений через корневую систему. ..

Для электронномикроскопического исследования фиксировали листья растения. 'Электронномикроскопическое исследование срезов листовых пластин, в вариантах опыта выявило типичные по •морфологии и ультраструктуре клетки микоплазм в проводящих со; судах.. В контрольном варианте опыта такие структуры не обнаружены. : ч • , - ■ -

Таким образом, мы показали, что - микоплазмы ' проникают в ткани, растений (подтверждено с помощью ДНК-ДНК гибридизации и -электронной микроскопией) через корневую систему, так как именно корни были в опыте единственным местом соприкосновения микоплазм и растений. *'...'

Так'как мы предположили,, что микоплазмы способны проникать через корни растения, следующая . наш;-» задача., состояла в

том . чтобы выяснить является ли корневая зона растений благо-приятлой для развития микоплазм А тага®, не является ли контакт микоплазм с корневыми тканями случчйным

Для нтих целей мы поместили растения люцерны и микоплаамы в чашки П. три и изучили характер развития колоний микоплазм на поверхности питательной среды Черна две Недели после иноку-лирования растений микоплазмами было обнаружено, что колонии микоплазм развиваются преимущественно вокруг корней растений, образуя своеобразный ореол в ЕИДе "мутного облачка" , полностью повторяя их рисунок на поверхности ПИТ ^тельной среды

Таким образом, исходя и-i полученных результатов можно заключить, что корневые выделения растений создают наиболее бла-гоприятчые условия для развития микоплазм, и прикорневая область растений является оптимальным местом их обитания

БИОМЕТРИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МО?^ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСТЕНИЯ ЛЮЦЕРНЫ, КОНТАМИНИРОВАННЫХ МИКОПЛАЧМАМН Исследованные нами 40 растений люцерны, вырашрнные в модельном опыте, среди которых были растения, зараженные микоплазмами и растения не инфицированные, в первую неделю культивирования не имели различий Анализ вегетативных органов люцерны к третьей неделе опыта показал, что у растений люцерны, зараженных микоплазмами, имеются значительные отличия от контрольных растений (Табл 1).

При удътраструктурном научении клеток листа (в частности фотосинтезирующей части клетки - меосфилла листа с сосудистыми пучками) у растений, Кинтаминированных микопл 1змами, выявлены глубокие изменения

У контрольных pat тений в клетках ме=>о1>и.гла обнаружено большое-число крупных хлороплаотов со грабит*- чьно х >рож> f iî— витой тилакоидо-гранальной i истемой, не1*ольиим числом пласто-глоОул. В растениях, инфицированных микоплазмами, клетки мезофилла выглядят "Пустыми", они обеднены цитгпл 1чмой и содержат лишь единичные хлоропласту Часть к четок некротизирована

Различные комлартменты клетки претерпевают существенные изменения Ядра зараженных клеток содержат, в основном, конденсированный хроматин С в ядрах контрольных растений хром ин диспергирован), что ( знача^т значительное снижение функ-цио-

нальной активности ядра и является начальным этапом деструктивных изменений ядерных структур. Единичные - хлоропласта зараженных растений имеют слабо развитые граны, тилакоиды стро-мы и небольшое:число пластоглобул. Среди ' клеток мезофилла встречаются клетки со съеженным протопластом, заполненные ми-коплазмоподобными образованиями - сферическими или овальными структурами диаметром около 0,20-0,25 мкм, невысокой электронной плотностью и более мелкими, плотными., Эти клетки не содержат хлоропластов. Число митохондрий в растениях,, инфицирован- • . ных микоплазмами, заметно выше, по-сравнению с числом митохондрий контрольных растений, причем структура их изменяет- -ся в разных клетках, от почти1 нормальной до чрезвычайно плотной с пузыревидными кристами и признаками начинающейся деструкции. Встречается везикулярная форма эндоплазматического ретикулума . .

Таким образом, заражение микоплазмами растений люцерны в стерильной культуре приводит к существенным изменениям в ультраструктуре клеток мезофилла. ....' Очевидно,- при этом происходит , нарушение пластидогенеэа, что ведет к резкому сокращению числа хлоропластов,- Клетки мезофилла постепенно утрачивают фотосин-тезирующие функции, некоторые . из них заполняются микоплазмо-подобными телами. . • , .

^ ВЛИЯНИЕ АХОЛЕПЛАЗМ НА ФОРМИРОВАНИЕ И НИТРОГЕНАЗНУЮ АКТИВ' НОСТЬ СИМБИОЗА "РАСТЕНИЯ ЛЮЦЕРНЫ-1?Н ГСОВШМ МЕНЬОТГ'.

В своей работе мы считали необходимым оценить влияние ми-коплазменной контаминации на физиологические особенности • сим-биозирующих растений. В качестве критерия для оценки такого влияния мы выбрали нитрогеназную активность бобово-ризобиаль-ного симбиоза, -считая, что данная .характеристика : может быть , косвенным показателем физиологического состояния растения.

- Чтобы оценить влияние микоплаэм на симбиоз растений люцерны с клубеньковыми бактериями в модельных условиях, необходимо было в первую очередь выяснить характер влияния . микоплаэм на клубеньковые■бактерии при их совместном■культивировании. ■

Совместный посев культуры микоплазм и клубеньковых; бактерий газоном на питательную среду СО показал, что бактерии

не оказывают видимого влияния друг на друга: формы колоний остаются неизменными, в ряде случаев наблюдается рост колоний микоплазм поверх колоний ризобий, также без изменения форм последних

Для оценки особенностей формирования клубеньков и эффективности бобово-ризобиалъного симбиоза мы совместили растения, микоплазмы и клубеньковые бактерии в модельном опыте на полужидкой питательной среде (СО)

При инфицировании растений только клубеньковыми бактериями ШгоЫшп теШом» штамм 425а наблюдали характерное искривление кончиков корневых волосков в виде ручки зонтика с различной степенью искривленности на 2-е сутки на главном корне, а затем и на боковых корнях (Табл 2). Как правило, это были двуветвистые корневые волоски, причем одно ответвление было обычно прямым, другое искривленным Трехветвистые формы, встречавшиеся очень редко, также имели одну ветвь корневого волоска - прямую. Нередко искривленная ветвь располагалась почти у основания и плохо просматривалась под микроскопом вследствие ее маскировки окружающими корневыми волосками Инфекционные нити, идущие из такой искривленной ветви, часто направлялись не в сторону корня, а в сторону прямого ответвления корневых волосков, и тем самым создавали впечатление, что прямые корневые волоски могут инфицироваться

Начиная с 11 дня в опытном варианте вокруг главного корня мы наблюдали характерное помутнение питательной среды в виде "белого облака", связанного с развитием микоплазм вокруг корня, что затрудняло наблюдение за образованием и подсчетом искривленных и специфически искривленных корневых волосков На 3-7 сутки наблюдения в опытном варианте появлялись первые инфицированные корневые волоски и их количество было не более 3 на 1 растение. Такое позднее появление инфицированных корневых волосков и меньшее их количество говорят о том, что микоплазмы задерживают процесс инфицирования растения-хозяина ризсбиями

Образование клубеньков в данном варианте не происходит в течение первого месяца. Первые клубеньки у растений лоцерны, инфицированных микоплазмами и кл>6-ньковими бактериями мы ре-гистрировнли /ишь на 2-й месяц кутьтиЕир >ЕсШИя, в то ьремя как В конгр )."ЬЬОМ Вариант- ГерЕь- КЛуС-НЬКИ I Чр СОВЧР цЛч.Ь На 13-е

• Таблица 2

Влияние ЯтеШоШ штамм 425а и А. 1а1<11а*и штамм А на корневые волоски кория растений люцерны в динамике ■

Показатель. Контроль Люцерна, инфициро-. Люцерна, инфициро-

(люцерна без ванная Я. теШоШ ванная И, теШоШ

■ ■ ." ■ инокуляции) ■ штамм 425а штамм 425а

- : ' Г ■ А. ШсИатгН штамм А

2 1 3 . 4 ' ■ |

• ' • Обмее количество корневых волосков ' 17,0±3,2 ■ 7,0+2,2

Количество искривленных корневых ■ . . ■ • 2,0±0,7 1,0±0,8

ВОЛОСКОВ' ' ;

Количество специфически искривленных - -

корневых волосков . 3-й сутки

«

Общее количество корневых волосков ; 29,0±3,3 16,0+5,2

Количество искривленных корневых 3,0+0,?' 3,0+1,2 3,0±0,8

волосков '

Количество, специфически искривленных , * ■

корневых волосков

7-е сутки- 16>0+3,в'

Общее количество корневых волосков • 21,0+2,7

Количество искривленных корневых ' 5,0+1,? 10,012,6 . 3,0±0,6

ВОЛОСКОВ .' • " ' . 1,0+0,7 4,0±1,7

Количество специфически искривленных. -

корневых волосков - ( 11-е сутки

Обшее количество корневых волосков ЗЗЛШЗТГН 16,0+4,2 27,0+5,2

Количество искривленных корневых 4,0+1,3 8,0±2,1 ■ ',4,0+1,3

1

3 | 4

волосков

Количество специфически искривленных

Общее количество корневых волосков Количество искривленных корневых волосков ■ ,

Количество специфически искривленных корневых волосков

Общее количество корнеЕЫХ волосков Количество искривленных корневых волосков

Количество специфически искривленных корневых волосков

Общее количество корневых'волосков Количество искривленных корневых волосков • ■ '

Количество специфически искривленных / корневых волосков •

1,0±0,4 13-е сутки

ста 7э

' 4,0±1,2 1,0±0,4

— 22-е ■ сутки-'

2ЩбГ"

5,0±2,0

23-и"сутки ЗСЛабПГ"

. З.ОИД

3,0*0,9

29,0±11,2 12,014,3

3,0±0.9

29,0*4,5 1б,0±3,5.

4,010,8

20,0±б,1 15,0*4,8

4,0±1,0

17,014,9 3,СШЭ,6

26,0*6,8 4,0±1,0

12,0*4,1 5,0±1,б

1,0*0,5

сутки культивирования. Этот факт также свидетельствует о влиянии микогтлазм на процесс инфицирования растения-хозяина ризо-Оиями. ■ ' '

На 21-22-е сутки на концах 'боковых,корней растений, инфицированных микоплаэмами, были замечены утолщения (вздутия), которые не обнаруживались в вариантах 'опыта без микоплазм.

Клубеньки на этих растениях отличались' по форме от клубеньков контрольных растений' люцерньс - имели сморщенный и приплюснутый вид.

Задержка в процессе инфицирования сказалась и на уровне азотфиксирующей активности растений. На 10-е сутки азотфикси-руюшэя активность в контроле: .(заражение только К. те 1 Пои) ' составила 32,8 нИ/ч-растение, в то время как в варианте, где люцерна была инфицирована микоплазмой аэотфиксирующая активность была равна нулю (Рис. 1). , '

нитрогеназная активность, - . . . нМ/ч»растение • "___. -

701-:-;---;---

ео 60 40

эо 20

I *

ю о

. О 10 170 . 230 сутки

- ш ■ 1\ш 2 ]■'':,'■

Рис. 1. '. Аэотфиксирующая активность растений люцерны . ■ ■ в динамике. , . . • . .

, 1. .- инокуляция R. melilôti штамм 425 а.

2. - совместная инокуляция R.meliloti штамм 425 а и- .'-'•

A. laidlawi i штамм А. -Через 170 дней культивирования - растений люцерны ' аэотфиксирующая активность в контроле незначительно снизилась и сос- .

тавила 31,5 нМ/ч-растение. Измерение азотфиксирующей активности в растениях, инфицированных микоплазмой, .показало, что их азотфиксирующая активность возросла до аначения 14,1 нМ/ч-растение. ' • :'

Через 230 дней азотфиксирующая' активность в контрольном варианте опыта продолжала снижаться и. составила 27,7 нМ/ч-растение. В варианте, где люцерна была инфицирована микоплазмой, азотфиксирующая активность, напротив, продолжала увеличиваться и составила 61,2 нМ/ч*растение, что почти в 4 раза больше . азотфиксируюшзй активности люцерны, зараженной мико-• плазмой, на 170-е- сутки культивирования.

, Итак, можно сделать заключение, что микорлазш, с одной стороны,^ задерживают процесс образования бобово-риэобиаяьного симбиоза, но, с другой стороны, в их присутствии формируются . клубеньки, процесс I азотфиксации ^ в которых происходит более эффективно. •;.'!..

| ВЫВОДЫ.

1. Впервые показано, что микоплазмы . (на примере АсЬо1ер1азта 1а1с11а»|1) способны проникать в ' растения через неповрежденную корневую систему. -

,2.- Экспериментально подтверждено (методами ДНК-ДНК гибридизации и электроннной микроскопии), что ахолеплазмы, способны контаминировать ткани растений. •• -

3. При инфицировании люцерны микоплазмами и клубеньковыми бактериями замедляется йроцесс образования клубеньков, а на. боковых корнях образуются специфические утолщения неизвестной природы.

4. Экспериментально'установлено, что микоплазмы при контаминации растений'Люцерны значительно влияют на нитрогеназную активность бобово-ризобиального симбиоза: по сравнению с неза-раженными микоплазмами растениями процесс азотфиксации длительно задерживается и только после, 230^ суток нитрогеназная

; активность достоверно возрастает, превышая уровень контрольных , вариантов.

Б. Экспериментально выявлено, что у ' растений люцерны, контаминированных микоплазмами в модельном опыте, наблюдаются значительные морфологические И' ультраструктурные изменения.

6. Для совместного культивирования микоплазм,, клубеньковых бактерий и растений в модельном опыте предлагается питательная среда, приготовленная на основе сенного отвара

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Иванов П. И. , Хайдарова Г. А. , Баранова У. Б., Чернова . О. А. , Чернов Е М." Проникновение микоплазм в растения через

корневую систему //Тезисы докладов' IV Всесоюзной научной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве". ; Пувдно. -1998. - С. 69-70.

2. Ivanov P. I. , Haydarova G. А. , Baranova Е. N., Chernov V. М. , Chernova О. A. Mycoplasmas appear out to penetrate into plants through roots.//IX IOM Congr. , USA, 1992. P. 14a

• 3. Ivanov P. I., Haydarova G. A. , , Baranova E. H., Chernov V. M. , Chernova 0. A. Mycoplasmas appear out to penetrate into plants through roots.// tot. of. 6th Inter, synp. , Mycrob. Ecol. Barselona, 1992, P. 170. , ■

Объем 1 п л

~?а т 1674

Тираж 100

Издательство и типография МОХА 127550, Москва И 550 Тимирязевская ул, 44