Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пути инфицирования микоплазмами растений люцерны и их влияние на образование и эффективность бобово-ризобиального симбиоза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Пути инфицирования микоплазмами растений люцерны и их влияние на образование и эффективность бобово-ризобиального симбиоза"

Р Г Б 0.А

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА пвдрн^ твуппппгп уодгнпго

гг.льсг;¡чоз"ил" ^'-Ч''! ■■-••..•-■:■ ' * ч»

г!а правах русо/

Ь'ГГ;

ПУТИ ИНФИЦИРОВАНИЯ М И КО О Л А 3 ТА А М И РАСТЕНИЙ ЛЮЦЕРНЫ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ОБРАЗОВАНИЕ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ БОБОВО-РЙЗОБИАЛЬНОГО СИМБИОЗА

Специальность 03.00.07 — м!! к р с 5!: ол о г я л

АпТППР|11РПЯТ

н Я г? V''инл. !;)• .-1"^: ^ ч> н;;ук

МОСКВА 1995

Диссертация выполнена в Московской сельскохозяйствен ной академии имени К. А. Тимирязева.

Научные руководители — доктор биологических наук профессор В. К. Шильникова, кандидат биологических наук старший научный сотрудник П. И. Иванов.

Официальные оппоненты — доктор биологических на у» профессор В. А. Шмыгля, кандидат биологических наук старший научный сотрудник Г. Ф. Хайлова.

Ведущее учреждение — ВНИИ сельскохозяйственно! биотехнологии РАСХН.

Защита состоится « » . . . . 1995 I

в .... часов на заседании специализированного совет, К 120.35.06 в Московской сельскохозяйственной академш имени К. А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета -кандидат биологических наук

Л. В. Мосиш

" Актуилнюстк м,!к<ч1ла°мы вн&мвнгт более 200 »я^ол'чтий растений (Ти11у, МничН», ц»6в). ср-ди которых наиболее распространены карликовость злаковых, рооеточность яблонь, персиков, цитрусовых, золотистость винограда и "недьминн метла" бобовых, особенно амй-рны и клевера I Пляпю * >гкзрт. . 133"'. н Поволжье, Казахстане, гр-дн^й А.д«1 результат- пирп'^иил посевов люцерны миконлазмами зарегистрировано снижение урожая зеленой массы в 8 раз, семян - а 45 раз (Горб'/нпня п ^

И;^^«. .»пи иптвп« лшлюггт от "■"■'^"--г

^.тп« е.-.егодно возрастала что, вероятно, связано с увеличением антропогенной нагрузки на экосистемы.

До сих пор не разработаны эффективные меры предотвращения ми'г^оплазмозов растений, что во многом связано с малой изученностью механизмов инфицирования растений микоплазмами.-

В связи с этим, изучение путей инфицирово.ния растений микоплазмами и особенностей взаимодействия микоплазм с растениями является акту* якн.ч* для поиска ^«¡»лспи-чух способов ь^-дотвращения микопд^^йов растений и для боле'? углубленного ЛОНКМЛНИЯ Причин, приводящих К Проявлению СИМПТОМОВ 3,-;00Л"Ва-

НИЯ.

Цель работы. Изучить воочовд<>.ть проникновения чикиплкш В растения М'-р'С ЧГрНт'Ум ,'ИСТ-му И Чг'.р.ЧКТер рЛИДНИЯ МИКОЦЛарМ на физиологическое состояние растении (с исполеэов<«Ш'.-м ЧФ-к-тивности Гк^ово-ризебиалыюго с!!мбил«а в качестве кршерип оценки) . .

Основные задачи работы. 1. Изучить возможность совместного гуг'тпв,-и-'пя "гл'чпчам с раог-ниям: яа "итат-льннч ■•р..-дах в Ч'агерн >м л-л; м 'П;;;-. ?. гь

проникновения микоплазм в растения через корневую систему в лабораторном (модельном) опыте. 3. Изучать морфо-цитолог'ичес-кие особенности растений люцерны, инфицированных микоплазмами. 4." Научить влияние м-чс-шл-к-м ни процесс сбр счдечния Собою-{.и:-У;!Гллыюго еимбиоз ч. 5, Изучить гли/шио мглчоллазм^нного заражения «а читрогсназнум активность бобово-ризобиальнсто симбиоза.

Научная новизна раооты. Впервые экспериментально установлено, что ахолеплазмы способны проникать в растения через ненарушенные корневые ткани, тормозить процесс инфицирования

растений люцерны ризобиями и влиять > на нитрогеназную актив ность бобово-ризобиального симбиоза.

• Практическое значение работу. Для совместного культи вировакия растений с микоплазмами предложена питательная сре да, приготовленная на основе растительного отвара. Получении' нами сведения о ранее"неизвестном пути проникновения микоплаз! •в растения позволят более комплексно подойти к разработке ме] борьбы с заболеванием и предотвращением зпифитотий.

Апробация работы. Основные результаты диссертации, бьш доложены на конференции молодых ученых и специалистов МСХ/ (Москва, 1991 г. ), научных конференциях в Пущино-на-Ок« (1992 г.), е Айове (США, 1992 г. ), в Барселоне (Испания, 1992 г.). .

Публикации. Основные результаты исследований представлень в печатных работах.

Объем работы. Диссертация изложена на . страницах машинописного текста, состоит из введения, .обзора литературы, 5 глав экпсриментальной части, заключения, выводов, списка литературы ( нименования, в том числе зарубежных), приложе-.ния. В работе содержится 4 таблицы, рисунков.

'Автор выражает искреннюю признательность аам. директора Казанского института биологии РАН, к. б. н. В. М. Чернову, к. б. н. Л. В. Аветисовой, ст. лаборанту Г. Б. Барановой, к. б. н. A. JL Степанову, к. б. н. 'А. А. Ваньковой за ценную помощь и консультации при выполнении работы,

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В опытах использовались: люцерна посевная Medicago sativa (семена, проростки,' растения), микоплазма Acholeplasma laidlawii штаммм А (получек из коллекции Института микробиологии и эпидемиологии им. Е Ф. Гамалея РАМН г. Москва), клубеньковые бактерии Rhizobium melilota штамм 425а (получен из коллекции ИНМИ РАН г. Москва).

Клубеньковые бактерии выращивали на гороховом отваре.

Для культивирования клубеньковых бактерий, растений люцерны и A. laidlawii использовали питательную среду на основе отвара сена (Дубинина, 1978; Ванькова, 1991).

Семяна люцерны стерилизовали по методу Нзтмана (Nutman,

1949) концентрированной серной кислотой в течение 3-4 мин. Семена проращивали при комнатной температуре.

Обнаружение микоплазм в тканях растений проводили методом ДНК-ДНК гибридизации и электронной микроскопии (Ворхсениус, Чернова, 1989; Уикли, 1975).

Изучение морфологии и ультраструктуры микоплазм в тканях

иаихсппп Щ/ЧТОидоии*! М/1инип им^иг^илип 1'Ч11 «V1111г 1 \ « 11 > 1,

Количественный учет клеток клубеньковых бактерий и мико-плазмы А. Шс11а\ш проводили методом люминесцентной микроскопии (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Нитрогеназную активность симбиозирующих растений определяли ацетиленовым методом (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). ' ' ,

Для изучение клубеньков и утолщений на корнях люцерны использовали сканирующую электронную микроскопию (Гузев с соавт, 1986).

Биометрический анализ растений и учет количества клубеньков проводили в модельных опытах.

Оценку возможного токсического влияния микоплазм на растения осуществляли с помощью тест-растения - кресс-салат (Руге, 1955).

Полученные данные обрабатывали методом дисперсионного анализа (Доспехов, 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ПОДБОР ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ СОВМЕСТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ. РАСТЕНИЙ,' МИКОПЛАЗМ И КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ.

До настоящего времени все данные о характере взаимодействия микоплазм с растениями были получены на основании анализа полевых и вегетационных опытов, что обусловлено сложностью постановки экспериментов в контролируемых лабораторных условиях.. В первую очередь, это связано С тем, что до сих пор не удавалось культивировать микоплазмы и растения на одной питательной среде. В связи с этим для достижения поставленной в работе цели, мы считали необходимым сделать упор на подбор питательной среды, пригодной для культивирования как расте-

ний, так и микоплазм, что позволило бы создать упрощенную лабораторную модель взаимодействия этих организмов.

Первой средой, использованной нами-для попытки совместного выращивания растений и микоплазм, была среда, приготовленная на основе гидролизата бычьего сердца с добавлением дрожжевого автолизата (ГВС), которая традиционно' используется для культивирования различных видов микоплазм. После высаживания проростков люцерны на среду ГБС вокруг них и особенно остатков тканей семян начинается бурный бактериальный рост. В конечном результате растения желтеют и постепенно увядают. Данный результат можно объяснить тем, что практически невозможно получить полностью стерильные семена растений и на богатой среде, которой является среда ГБС, единичные оставшиеся в тканях растений бактериальные клетки прорастают. В связи с этим, мы решили выяснить, возможность культивирования растений и микоплазм на бедной питательной среде.

В качестве бедной питательной среды была выбрана среда на основе отвара сена с добавлением витамина В/£(СО - сенной отвар). Данный субстрат использовался ранее для выделения ми-коплазмоподобных организмов из водной среды (Дубинина, 1978) и из почвы (Ванькова, 1991)\ ■ Микоплазмы, как показали работы А. А. Ваньковой, способны расти на среде СО.

Проверенные на стерильность семена люцерны помещали в колбы со средой СО. В данном случае удалось поддержать рост растений в условиях асептики в течение нескольких месяцев (до 8). Ограничивающим фактором роста растений на среде СО является недостаток влаги,, так как через 8 месяцев инкубирования сосудов с ватной пробкой при 20-22°с питательная среда высыхает. '

Необходимо было также проверить способность развития на среде СО клубеньковых бактерий, поскольку одной из задач нащей работы было создание лабораторной модели "микоплазмы и Собово-ризобиальный симбиоз".

.Посев НигоЫит теШоИ штамм 425а проводили по стандартной' методике. Через 3-е суток инкубирования при 20-22°С на поверхности плотной питательной среды СО образуются типичные колонии ризобий.

Таким образом, среда СО оказалась пригодной для культи-

вировзния как микондаз.м и клубьнькоьых бактерий, таге и люцерны. Кяагодаря ооннрухг-нным свойствам среды СО создаются все необходимые предпосылки для создания упрощенной лабораторной модели для изучения рчияния мик-пла.чм на особенности роста и |К ».'«ВИТИЯ ипокулир-'.рщжых рИЗОбИЯМН растений.

СОВМЕСТНОЕ КУЛЬТИКИРПКЛНШГ лппгены м

Г1 Мкнк.пЦйои Г11П-П-ТЛ

В связи с тем, что нами била подобрана оптимальная питательная среда для культивирования растений люцерны, микоплазм и клубеньковых бактерий, следующим этапом работы было выяснение возможности совместного культивирования рассматриваемых биологических объектов в модельном опыте, где влияние посторонних факторов сведено к минимуму.

Для постановки модельного опыта семена люцерны стерилизовали и проращивали при комнатной температуре. Проростки иноку-лировали чер^з 0 дк»й ■ •уеп<?нзи*й'А. 1ак1Ьт1 ия ряич^тн 1,6x106 кл/мл микоплмг'мч на I растение. Растения выращивали п»*»д »ячпой дневного свет а в К1;-часовом периоде и ос^ю/нии 4000 лк, при комнатной температура в плоскодошшх колбах на г«пп мл и в широких пробирках высотой 20 су. В каллой колбе и пробирке культивировалось по 1 рао гению лщчрнм. Контролем в опит»' случили растения люцерны, на зараженные микоплаэмами. . .. В течение первых 2 недель растения люцерны в модельном опыте развивались во всех нариан^ах нормально, р. начале третьей недели в колбах с люцерной и микоплазмами наблюдалось частичное , пожелтение .хнитьил люцо.рны и отставание в развитии по сравнению с контролем (неаараженные растения), к концу месяца большинство растений полностью желтели и погибали. Однако в ряде случаев, примерно 107'. проростков люцерны, заражении:* микоплазмами, ПрИобре?' I ли позитивные свойства, БЫралаюЩИеОЯ в усилении роста пи «.-равнению с контрольными растениями, утолщением отебд-й и у'.едиче-нием размеров листьев. Контрольные рас-тс-нй« в п^рнкд взгляде ли здоровыми.

Предполагая, что быстрая гибель растений люцерны может Сыть еьяйан.-* <• ЧчЖеИЧЦ-'*"-ТЬЮ МИКОПЛазм ГК) ОТНОШЕНИЮ к люцерне и угнетением за счет зтого метаболизма растений, было проведено исследование микоплазм на токсичность по отношению к растениям

методом биотеста на кресс-салате по У. Руге (1955).

Проведенный эксперимент показал, что микоплазмы не выделяют- угнетающих развитие растений веществ. Обнаруженное нами в опыте угнетение растений происходит, вероятно, вследствие подавления метаболизма растений проникшими в их ткани мико- . плазмами.

В связи с полученными результатами, нами был изменен порядок постановки модельного опыта. В последующих опытах мы, внося растения.в пробирки со средой, подращивали их 2-3 ' недели, а затем добавляли суспензию микоплазм. При такой постановке эксперимента все растения люцерны, культивируемые е ми-коплазмами, длительное время (до 8 месяцев) сохраняли жизнеспособность, так же как и контрольные растения.

ПРОНИКНОВЕНИЕ МИКОПЛАЗМ В РАСТЕНИЯ -ЧЕРЕЗ КОРНЕВУЮ СИСТЕМУ '

Для изучения возможности проникновения микоплазм в растения через корневую систему использовали вышеописанные модельные условия. Через две недели культивирования растений в питательную среду СО добавляли суспензию микоплазм таким образом, чтобы растения могли контактировать с микоплазмами только через корневую систему. В пробирки вносили суспензию клеток А. ШсИаин А, в количестве 1,бх10б кл/мл среды. Контролем в данном опыте были растения люцерны, не инфицированные микоплазмами. -

Определение проникновения микоплазм в ткань растения в лабораторном опыте осуществляли методом ДНК-ДНК гибридизации и электронномикроскопически у 3-месячных растений.

С помощью метода ДНК-ДНК гибридизации заражение растений микоплазмами может -быть определено по гибридизуемоети ДНК, выделенной из проверяемых растений, с ДНК микоплазм или с реком-бинантными плазмидами, содержащими ДНК микоплазм.

Дот-гибридизацию тотального препарата ДНК, выделенного из листьев и стеблей люцерны, проводили со следующими ДНК-аонда-ми: рА132, специфичный к А. 1а1(11а«П, рМу1б, специфичный ко всем представителям класса МэШсиА-еэ. Контролем служили стерильные растения люцерны.

Пробы ДНК, нанесенные на фильтр, содержали' ДНК, выделен-

ную из листьев люцерны, культивировавшейся совместно с мико-плазмой АЛакЯаин штамм А и ДНК, выделенную из незаряженной люцерны. Таких полос нитроцеллюлозного фильтра с пробами ДНК люцерны было две. Каждую полосу гибридизовали отдельно.

Первую полосу фильтра гибридизовали с ДНК-зондом рЛ1Р2. Вторую полосу нитроцеллюлоз,чого фильтра гибридизовали с универсальным зондом рМе16. Был получен положительный ответ на

попппо (ТЛ«ЛЛ(1 п ■ л - ТТГПГ. - — — — — . ~ л —- - -------

ровавшейся с микоплаьмой А, ^¡Лаки штамм А, что говорит о наличии ДНК микоплазмы в листьях люцерны. Полученный положительный ответ на второй полосе фильтра, при гибридизации ее универсальным зондом рМе16, также подтверждает присутствие ДНК микоплазм в листьях люцерны. Наличие на второй полосе фильтра положительного ответа в пробе ДНК, выделенной из незараженной люцерны, объясняется тем, что зонд р!^1б имеет гомологию с ДНК хлоролластов люцерны. <3>" '

Таким образом, с помощью дот-гибридизации тотального препарата ДНК листьев люцерны со всеми использованными ДНК-зондами показано, что в вариантах совместного культивирования люцерны и микоплазм, последние тестируются в тканях растений в концентрации не ниже 0,1-1,0 клеток микроорганизма на одну клетку растения. В контрольном варианте опыта микоплазмы не обнаружены. Таким образом, полученные нами результаты дот-гибридизации свидетельствую!', о способности микоплазм проникать в ткани растений через корневую систему.

Для электрюнномикроскопического исследования фиксирован листья растения. Ялектринномикроскопическое исследование срезов листовых пластин в вариантах опыта выявило типичные по морфологии и ультраструктуре клетки микоплазм в проводящих сосудах. В контрольном варианте опыта такие структуры не обнаружены.

Таким образом, мы показали, что микоплазмы проникают в ткани растений (подтверждено с помощью ДНК-ДНК гибридизации и

11И|?Г.ЛЛ1^ЛТ1Т1,.(11 ..плчг.п.т > 1 /Л. ПШ Г ГП ■ , I.'

именно корни были в опыте единственным местом соприкосновения микоплазм и растений.

Так'как мы предположили, что микоплазмы способны проникать через корни растения, следующая нли задача состояли в

том , чтобы выяснить является ли корневая зона растений благоприятной для развития микоплазм. А также, не является ли контакт микоплазм с корневыми тканями случайным.

•Для этих целей мы поместили растения люцерны и микоплазмы в чашки Петри и изучили характер развития колоний микоплазм на поверхности питательной среды. Через две недели после иноку-лирования растений микоплазмами было обнаружено, что колонии микоплазм развиваются преимущественно вокруг корней растений, образуя своеобразный ореол в виде "мутного облачка" , полностью повторяя их рисунок на поверхности питательной среды.

Таким образом, исходя из полученных результатов можно заключить, что корневые выделения растений создают наиболее благоприятные условия для. развития микоплазм, . и прикорневая область растений является оптимальным местом их обитания.

БИОМЕТРИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МОРЯОЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСТЕНИЙ ЛЮЦЕРНЫ, -КОНТАШНИРОВАННЫХ МИКОПЛАЗМАМИ.

• Исследованные нами 40 растений люцерны, выраирнные в модельном опыте, среди которых были растения, зараженные микоплазмами и растения не инфицированные, в первую неделю культивирования не имели различий. Анализ вегетативных- органов люцерны к третьей неделе опыта показал, что у растений люцерны, зараженных микоплазмами, имеются значительные отличия от контрольных растений (Табл. 1).

При ультраструктурном изучении клеток листа(в частности . фотосинтезирующей части клетки - мезофилла листа с сосудистыми пучками) у растений, контаминированных микоплазмами, выявлены глубокие изменения.

У контрольных растений, в клетках мезофилла обнаружено большое» число крупных хлоропластов со сравнительно хорошо развитой тилакоидо-гранальной системой, небольшим числом пласто-глобул. В растениях, инфицированных микоплазмами, клетки мезо1 филла выглядят "пустыми", они обеднены цитоплазмой и содержат лишь единичны^ хлороплаеты. Часть №ток некротизирована.

Различные компартмеНты клетки претерпевают существенные изменения. Ядра зараженных клеток содержат, в основном, конденсированный хроматин (в ядрах контрольных растений хроматин диспергирован), что означает значительное снижение функцио-

Биометрический анализ 30-дневных растений люцерн (модельный опыт), 20 повторностей

Таблица I

Вариант -I. Признаки

1 " I Число | стеблей 1 Число 'листьев | Число I междоузлий 1 Длина растения, ем | Размерь; 1 виста ! Длина | -¡мездоузлий| I мм |

1 |длина, мм | I 'рина, мм

Контроль (без заражения) I 1,0+0 1 5,7т0,3 I 5,0+0,3 1 1 6,3+0,9 I 5,0+0,6 1 й, 4+0,1 ! 10,8-3,7 | 1 . 1

* Инфицированные * штаммом А I 1,4+0,2 1 8,5+0,5 | .7,9+0,6 I 11,1+2,7 1 6,1+0,6 | ( ! 7+0,5 I 18,3+5,9 | 1

А. 1а)о]а*11

нальной активности ядра и является начальным этапом дестру! тивных изменений ядерных структур. Единичные хлоропласты з; раженных растений имеют слабо развитые'граны, тилакоиды етр< мы и небольшое число пластрглобул. Среди клеток мезофил. встречаются клетки со съеженным протопластом, заполненные mi коплазмоподобными образованиями - сферическими или овальны) структурами диаметром около 0,20-0,25 мкм, невысокой электро! ной плотностью И более мелкими, плотными. Эти клетки не соде) жат хлоропластов. Число митохондрий в растениях, инфицировш . них микоплазмами, заметно выше, по.сравнению с числом митс хондрий контрольных растений, причем структура их изменяв! ся в разных клетках от почти нормальной до чрезвычай плотной с пузыревидными кристами и признаками начинающей деструкции. Встречается везикулярная форма зндоплаэматическо1 ретикулума.

Таким образом, заражениечмикоплаэмами растений люцерны стерильной культуре приводит к существенным изменениям в ул! траструктуре клеток мезофилла. Очевидно, при этом происходр нарушение пластидогенеза, что ведет к резкому сокращению чис; хлоропластов. Клетки мезофилла постепенно утрачивают Фотосие тезирующие функции, некоторые из них заполняются микоплазмс подобными телами.

ВЛИЯНИЕ АХОЛЕПЛАЗМ НА ФОРМИРОВАНИЕ И НИТРОГЕНАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ СИМБИОЗА "РАСТЕНИЯ ЛЮЦЕРНЫ-RHIZOBIUM MELILOTI".

В своей работе мы считали необходимым оценить влияние ми коплазменной контаминации на физиологические особенности си»/ биозирующих растений. В качестве критерия для оценки таког влияния мы выбрали нитрогеназную активность бобово-ризобиаль ного симбиоза, считая, что данная характеристика может быт косвенным показателем физиологического состояния растения.

Чтобы оценить влияние микоплазм на симбиоз растений лк церны с клубеньковыми бактериями в модельных условиях, необ ходимо было в первую очередь выяснить характер влияния мико плазм на клубеньковые бактерии при их совместном культивирова

нии.

Совместный посев культуры микоплазм и клубеньковых бак терий газоном на питательную среду СО показал, что бактери

е оказывают видимого влияния друг на друга; фарш колоний етаются неизменными, в ряде случаев наблюдается рост колоний икоплазм поверх колоний ризобий, также без изменения форм по-ледних.

Для оценки особенностей формирования клубеньков и эффек-ивности бобоьо-ризобиального симбиоза мы совместили растения, икоплазмы и клубеньковые бактерии в модельном опыт« »а_1,п»;'-..

Пр:: растений только клубеньковыми бакте-

иями (?1гоЫит теП1ои1 ттамм 425а наблюдали характерное ис-:ривление кончиков корневых волосков в виде ручки зонтика с взличной степенью искривленности на 2-е сутки на главном кор-:е, а затем и на боковых корнях (Табл. 2). Как правило, это ¡или двуветвистые корневые волоски, причем одно ответвление 1ЫЛ0 обычно прямым,, другое искривленным. Трехветвистые формы, ютречавшиеся очень ' редко, также имели одну ьетвь корне-юго волоска - прямую. Нередко искривленная ветвь распола-'алась почти у основания и плохо просматривалась под ми-;роскопом вследствие ее маскировки окружающими корневыми ю-юеками. Инфекционные нити, идущие из такой искривленной *етви, часто направлялись не в сторону корня, а в сторону пря-юго ответвления корневых волосков, и тем самым создавали впе-ттление, что прямые корневые волоски могут инфицироваться.

Начиная с 11 дня в опытном варианте вокруг главного корня наблюдали характерное помутнение питательной срили в виде 'белого облака", связанного с развитием микоплаэм вокруг кор-1Я, что затрудняло наблюдение за образованием и подсчетом искривленных и специфически искривленных корневых волосков. На 3-7 сутки наблюдения в опытном варианте появлялись первые инфицированные корневые волоски и их количество было не более 3 га 1 растение. Такое позднее появление инфицированных корневых золосков и меньшее их количество говорят о том, что микоплазмы задерживают процесс инфицирования растения-хозяина ризобиями.

Образование клубеньков в данном варианте не происходит а течение первого месяца. Первые клубеньки у растений люцерны, шфицированных миког^лазмами и клубеньковыми бактериями мы регистрировали лишь на 2-й месяц культивирования, в то время как * контрольном варианте первые клубеньки образовывалась на 13-е

Таблица 2

Влияние И. теШои штамм 425а и А. 1а1<11аУ1ГП штамм А на корневые волоски корня растений люцерны в динамике

П о к аз а т е л ь Контроль Люцерна, инфициро- Люцерна, инфициро-

(люцерна без ванная R. meliloti ' ванная й. теШоН

инокуляции) штамм 425а штамм 425а А. 1акЛатш штамм А

1 2 3 4

* g-e cjriKH 17,0*3,2

Общее количество корневых волосков 1?75±S,4 7,0*2,2

Количество искривленных корневых - 2,0*0,7 1,0*0,8

волосков

Количество специфически искривленных - - -

корневых волосков 3-й сутки

êô,о±з,з •

Общее количество корневых волосков l87J±£6 16,0*6,2

Количество искривленных корневых 3,0*0,7 3,0+1,2 3,0*0,8

волосков

Количество специфически искривленных - - -

корневых волосков

7-е сутки- iBvÔi3,8

Общее количество корневых волосков iSTEtU 21,0*2,7

Количество искривленных корневых 5,0*1,7 10,0+2,-6 . 3,0*0,6

волосков

Количество специфически искривленных 1,0*0.7 4,0*1,7 ' -

корневых волосков

Общее количество корневых волосков 11-е сутки • I 33,0±137Г~| 16,0*4,2 27,0*5,2

Количество искривленных корневых I 4.0*1,3 I 8,0*2,1 ! 4,0*1,3

волосков !

Количества специфически иок^ив-генных |

Общее количество корневч-у волосков |

Количество искривленных ; евых |

волоско5 |

Количество специфически искривленных |

корневых голсскоэ |

Общее количество корневых волосков |

Количество искривленных корневых |

волоска? |

Количество слепичически ¡'.скривленных |

корневых волосков !

Общее количество корневых волосков |

Количество искривленных кзрн-гых |

волосков ;

Количест.-.о специфически искривленных |

корневых волосков I

3,o¿o,g

29,0+11,2 12,0±4,3

3,0¿0,9

17,0+4,9 3,0+0,6

29,0+4,5 16,0±3,5

4,0±0,8

26,0+6,8 4, 0±1,0

20,0±6,1 15,0±4,8

4,0±1,0

í?., 0+4,1 5.0+1,б

1,0±D.5

сутки культивирования. Этот факт также свидетельствует о влиянии микоплазм на процесс инфицирования растения-хозяина ризо-' бия ми.

На 21-22-е сутки на концах боковых корней растений, инфицированных микоплазмами, были замечены утолщения (вздутия), которые не обнаруживались в вариантах опыта без микоплазм.

Клубеньки на этих растениях отличались по форме от клубеньков контрольных растений люцерны1 - имели сморщенный и приплюснутый вид.

Задержка в процессе инфицирования сказалась и на уровне азотфиксирующей активности растений. На 10-е сутки азотфиксирующая активность в контроле (заражение только К. теШоН) составила 32,8 нМ/ч-растение, в то время как в варианте, где люцерна была инфицирована микоплазмой азотфиксирующая активность была равна нулю (Рис. 1). нитрогеназная активность, нМ/ч-растение

70 ———----—--

! ш гш г

Рио. 1. Азотфиксирующая активность растений люцерны в динамике.

1. - инокуляция R. meliloti штамм 425 а

2. - совместная инокуляция R. meliloti' штамм 425 а и

А. laidlawi i штамм А. Через 170 дней культивирования растений люцерны азотфиксирующая активность в контроле незначительно снизилась и qoc-

'авила 31,5 нМ/ч-растение. Измерение азотфикеирующей активности в растениях, инфицированных микоплаямой, показало, что их йотфиксирующая активность возросла до значения 14,1 нМ/ч-растение.

Через 230 дней азотфиксирующая активность в контрольном варианте опыта продолжала снижаться и составила 27,7 нМ/ч->астение. В варианте, где люцерна была инфицирована микоплаз-

Юй. азотфиклипи-штаа щшияии: ■ пппдау*"«

кикиьоа и «"""¡•»»иля ч• р<Iениг, что почти в 4 раза

ольше азотфиксирующей активности люцерны, зараженной мико-лазмой, на 170-е сутки культивирования.

Итак, можно сделать заключение, что микорлазмы, с одной тороны, задерживают процесс образования бобово-ризобиального имбиоэа, но, с другой стороны, в их присутствии формируются лубеньки, , процесс ! азотфиксации в которых происходит более-ффективно. I |

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что микоплазмы (на примере сЬо1ер1аята 1а1с11ахи) способны проникать в растения чнр-з епоьредденную корневую систему.

2. Экспериментально подтверждено (методами ДНК-ДНК гибри- „. изации и электроннной микроскопии), что ахолеплазмн, способны онтаминировать ткани растений.

3. При инфицировании люцерны микоплазмами и клубенъко-ыми бактериями замедляется Процесс образования клубеньков,

на боковых корнях образуются специфические утолщения непахотной прир'\л>! - ■ '

4. Экспериментально установлено, что микоплазмы при кон-аминации растений-люцерны значительно влияют на нитрогеназную ктивность бобово-ризобиального симбиоза: по сравнению с неза-ажеиными микоплазмами растениями процесс азотфиксации дли-эльно задерживается и только после 230 суток нитрэгеназная ктивность достоверно возрастает, превышая уровень контрольных

аоиянтов.

5. Экспериментально выявлено, что у растений люцерны, онтаминированных микоплазмами в модельном опыте, наблюдаются яачительные морфологические и ультраструктурные изменения.

6. Для совместного культивирования микоплазм, клубенько вих бактерий и растений в модельном опыте предлагается. пита тельная среда, приготовленная на основе сенного отвара.

■ Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Иванов П. И. , Хайдарова Г. А., Баранова У. Б. , Чернов. О. А. , Чернов В. М. Проникновение микоплазм в , растения чере; корневую систему //Тезисы докладов IV Всесоюзной научной кон ференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве", Пущйно, • .1992. - С. 69-70.

2. Ivanov P. I. , Haydarova G. А. , Baranova Е. N., Cherno1 V. М. , Chernova 0. A. Mycoplasmas appear out to penetrate int< plants through roots.//IX IOM Congr. , USA, 1992. P. 143.

3. Ivanov P. I. , Haydarova 6. A., Baranova E. W. , Cherno\ V. M. , Chernova 0. A. Mycoplasmas appear .out to penetrate intc plants through roots. // Mat. of 6th Inter, synp. Mycrob. Ecol. Barcelona, 1992, P. 170.