Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пуриновые дисахаридные нуклеозиды. Синтез и свойства

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Пуриновые дисахаридные нуклеозиды. Синтез и свойства"

На правах рукописи

КУЛИКОВА Ирина Валерьевна

ПУРИНОВЫЕ ДИСАХАРИДНЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2009

003473567

Работа выполнена в Лаборатории стереохимии ферментативных реакций

Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук С.Н. Михайлов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Т.е. Орецкая

кандидат химических наук А.Р. Хомутов

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится у. Л 5» ШОЮЗи 2009 г. в -/<£■ часов на заседании диссертационного Совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан « и .» МСЬЛ, 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета /У / / канди дат химических наук

Список использованных сокращений:

Агр - 2'-0-Р-0-рибофуранозиладенозин-5'-фосфат; BSA - N, 0-бис(триметилсилил)ацетамид;

COSY - correlation spectroscopy, методика двумерной гомоядерной корреляции; Grp - 2'-0-|3-0-рибофуранозилгуанозин-5'-фосфат;

НМВС - heteronuclear multibond correlation, методика гетероядерной корреляции дальних взаимодействий;

HSQC - heteronuclear single quantum coherence, методика гетероядерной ('Н-13С) одноквантовой кореляции;

IC50 - half maximal inhibitory concentration, концентрация ингибитора, при которой активность фермента составляет 50 % от исходной; Ру - пиридин;

ROESY - Rotating frame Overhause Effect Spectroscopy, методика двумерной протон-протонной

корреляция во вращающейся системе координат, основанная на ядерном эффекте Оверхаузера;

ТГОН - трифторметансульфоновая кислота;

TIPDS - тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил;

TMSOTf - триметилсилилтрифторметансульфонат;

ДМСО - диметилсульфоксид;

ДХЭ - 1,2-дихлорэтан;

КССВ - константа спин - спинового взаимодействия;

ПАРП - поли(АВР-рибозо)полимераза;

ТГФ - тетрагидрофуран;

ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера.

Актуальность исследовании. Дисахаридные нуклеозиды - важная группа природных соединений. Эти соединения являются структурными элементами биополимеров, таких как тРНК и поли(АОР-рибоза), входят в состав антибиотиков и других биологически активных соединений, проявляя широкий спектр биологической активности - антибактериальные, противогрибковые, гербицидные, инсектицидные, противоопухолевые и антивирусные свойства. В этих соединениях имеется дополнительный моносахаридный остаток, присоединенный к одной из гидроксильных групп нуклеозида О-гликозидной связью. Наличие дисахаридного остатка и гетероциклического основания определяет свойства соединений, родственные свойствам углеводов и нуклеозидов.

Анализ литературных данных показывает, что дисахаридные производные нуклеозидов изучены недостаточно хорошо. Это объясняется отсутствием простых и эффективных методов их синтеза. Возможны два пути получения дисахаридных нуклеозидов. Синтез может быть осуществлен конденсацией соответственно защищенного дисахарида с нуклеиновым основанием или реакцией нуклеозида с моносахаридом. Большинство нухлеозидных антибиотиков были синтезированы по первому пути. Эта схема синтеза многостадийна. Возможность использования природных нуклеозидов существенно упрощает схему синтеза. В литературе известны несколько примеров образования О-гликозидной связи из частично защищенного нуклеозида и моносахарида. Однако выходы подобных реакций не превышали 20-30% из-за образования ряда побочных продуктов.

В нашей лаборатории был разработан метод получения 2'-0-р-П-рибофуранозилнуклеозидов [Mikhailov S.N., et al, J. Carbohydr. Chem. 1997, 16, 75; Mikhailov S.N., et al, In: Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. N.Y.: John Wiley & Sons. 2006, Unit 1.14.1-1.14.19. Suppl. 27]. В отличие от предыдущих синтезов выход дисахаридных нуклеозидов на стадии конденсации составлял 70-80% и реакция протекала стереоспецифично с образованием Р-аномеров. Разработанный метод был распространен на получение и других дисахаридных нуклеозидов.

С использованием этого метода был осуществлен первый химический синтез минорных компонентов тРНК - 2'-0-р-0-рибофуранозиладенозин-5'-фосфата (Агр) и 2'-0-p-D-рибофуранозилгуанозин-5'-фосфата (Grp). Фрагмент тРНК, содержащий минорный нуклеотид Агр, синтезирован впервые.

Следует отметить, что химические методы синтеза поли(АОР-рибозы) до последнего времени разработаны не были. Полн(АОР-рибоза) вовлечена в процессы модуляции структуры хроматина, репликации, транскрипции, репарации ДНК и дифференцировки клеток. Поли(АБР-рибоз)илирование белков катализируется несколькими полимеразами, которые постоянно и в значительном количестве имеются в клетке. Основньм из этих ферментов является поли(АОР-рибозо)полимераза-1 (ПАРП-1). Она отвечает за синтез 90% поли(АОР-рибозы) в клетке. В последние годы ведутся активные поиски ингибиторов полимеразы, которая является ферментом-мишенью для

создания лекарственных препаратов. Представляется перспективным создание новых ингибиторов ПАРП-1 на основе дисахаридных нуклеозидов.

Целью работы явился синтез новых дисахаридных нуклеозидов для создания на их основе ингибиторов ПАРП-1.

В ходе исследования решались следующие задачи:

- оптимизация ранее разработанного метода гликозилироваяия, исследование устойчивости в условиях реакции N-гликозидной связи и используемых защитных групп; определение оптимальных условий проведения реакции: температуры, катализатора, времени взаимодействия и т.д.;

- синтез 2'-0-а-О-рибофуранозиладенозина - структурного элемента поли(АОР-рибозы) и его аналогов для изучения ингибиторных свойств синтезированных дисахаридных нуклеозидов в реакции, катализируемой ПАРП-1 человека.

Научная новизна и практическая значимость работы. Оптимизирован разработанный ранее метод получения дисахаридных нуклеозидов. В ходе работы синтезировано 29 новых соединений, структура которых подтверждена данными масс-спекгрометрии, УФ-, КД- и ЯМР-спектроскопии. Впервые осуществлен химический синтез структурного элемента поли(А1)Р-рибозы) 2'-0-a-D-рибофуранозиладенозина и его аналогов. В ряду синтезированных соединений обнаружены ингибиторы рекомбинантной ПАРП-1 с IC50 10'5 М. Разработка методов химического синтеза дисахаридных нуклеозидов открывает новые возможности для создания биологически активных соединений в этом ряду, расширяет возможности поиска ингибиторов ПАРП-1, которые могут оказаться эффективным при терапии ряда заболеваний.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на XIX зимней молодежной научной школе "Перспективные направления в физико-химической биологин и биотехнологии" (Москва, 2007); XV и XVI Международных конференциях "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Гурзуф, Украина, 2007,2008); XIII and XIV Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components (Czech Republic, Spindleruv Mlyn, 2005, Cesky Krumlov. 2008); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на Научной конференции молодых ученых Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельтардта РАН (Москва, 2008), на Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 г в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 it" (Москва. 2008).

Публвкгдкя. По материалам диссертации опубликовано 7 статей.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы ( наименований). Работа изложена на 449 страницах, включает /-3 рисунков, AM схем и {£ it блиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

К настоящему времени из различных природных источников выделено более ста дисахаридных нуклеозидов и их производных. Многие иуклеозидные антибиотики по своей структуре являются дисахаридными нуклеозидами. a-D-Рибофуранозиладенозин - мономерное звено такого важного биополимера, как поли(АБР-рибоза). Дисахаридные нуклеозиды обнаружены в дрожжевых т-РНК, входят в состав простетических групп некоторых ферментов.

В ходе исследований по синтезу дисахаридных нуклеозидов, проведенных в нашей лаборатории, был осуществлен простой и эффективный синтез 2'-0-р-О-рибофуранозилиуклеозидов. Была разработана следующая методика О-гликозилирования. 1-0-Ацетил-2,3,5-три-0-бензоил-р-В-рибофуранозу 2 предварительно активировали кислотой Льюиса, для этого к раствору 1.2 ммоль рибофуранозы в 15 мл безводного ДХЭ, охлажденному до 0°С, добавляли 1.5 ммоль S11CI4 и перемешивали в атмосфере азота при 0°С 10 мин. Затем добавляли 1 ммоль N-защищенного 3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)рибонуклеозида (3',5'-(9-Т1РВ5-рибонуклеозида). Реакцию проводили при 0°С, 2 ч для пиримидиновых нуклеозидов, 7-16 ч для пуриновых производных (Схема 1, реакция i). Образующуюся при экстракции суспензию фильтровали через Hyflo Super Cel. Целевые соединения выделяли колоночной хроматографией на силикагеле. Выходы 2-0-P-D-рибофуранозилнуклеозидов 3 по разработанному методу составляли 74-82%. Реакция проходила стереоспецифично и приводила к образованию 1,2-отранс-рибофуранозилнуклеозидов [Mikhailov S.N., et al, J. Carbohydr. Chem. 1997,16, 75; Mikhailov S.N., et al, In: Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. N.Y.: John Wiley & Sons. 2006, Unit 1.14.1-1.14.19. Suppl. 27].

Jv°>!

>

4. W

тГ°н •

BzO

-I OAc

X

Hx

HO-1 n в

X

HO 0

"H'

BzO OBz 4

HO-i n B'

X

HO 0

"V

HO OH 5

BzO OBz BzO OBz

2 3

В = В' = Uta; b В = AdeB', В' = Ade; с В . SnCL(, ДХЭ, 0°С, N2,2 ч для пиримидиновых нуклеозидов, 7-16 ч для пуриновых аналогов, 74-82%; iL ВщШТГФ, 20°С, 30 мин, 85-95%; iii. 5 М NHj/MeOH, 20°С, 3 дня, 75-95%.

Схема 1. Синтез 2'-0-р-0-рибофуранозилнуклеозидов. а =CytBz, В' = Cyt; d В = Gua , В' = Gua; е В = В' = Thy. i. S

Согласно предложенному механизму, наличие 2-О-ацильной соучаствующей гругаш в моносахаридном остатке является определяющим для стереохимии протекания реакции. Образующийся ацилоксониевый ион обеспечивает образование 1,2-транс гликозидной связи. В отсутствие соучаствующей 2-О-ацильной группы обычно получается смесь аномеров.

Проведение реакции гликознлирования [2] (здесь и далее см. ссылки на стр. 22-23).

В настоящей работе проведены исследования по оптимизации разработанного в Лаборатории стереохимии ферментативных реакций метода гликозшшрования. Изучено влияние температуры, катализаторов, предварительной активации гликозилирующего агента кислотой Льюиса, чистоты исходных соединений, устойчивости N-гликозидной связи и используемых защитных групп в условиях реакции гликознлирования. Показано, что предварительная активация гликозилирующего агента не оказывает существенного влияния на выходы реакции. При использовании в реакции гликозшшрования кристаллических производных моносахаридов получены более высокие выходы, чем при использовании сиропообразных аномерных смесей.

Типичную реакцию гликознлирования проводили при 0° в атмосфере азота. Проведение реакции в атмосфере азота позволяет получить целевые соединения с более высокими выходами и уменьшить количество побочных продуктов. Более ранние исследования показали, что при комнатной температуре реакция протекает быстрее (около 30 мин), но выходы на стадии конденсации снижаются (например, в случае 2'-0-р-В-рибофуранозилнуклеозидов, с 74-82% при 0°С до 40-77% при комнатной температуре).

Изучение стабильности 3', 5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-13-Диил)нуклеозидов в условиях реакции гликозилирования [5,6].

Ранее при использовании предложенного метода для рибозилирования пиримидиновых 2',3'-ди-0-ацилнуклеозидов наблюдалось образование соответствующих 5'-0-Р-0-рибофуранозшшуклеозидов с выходами 74-78%. При замене SnCLt на триметилсилилтрифторметансульфонаг (TMSOTf) были получены аналогичные результаты. В настоящей работе исследовалась возможность использования данного катализатора при синтезе 2'-0-(5-В-рибофуранозилнуклеозидов. Следует отметить, что TMSOTf широко используется в химии нуклеозидов и имеет ряд существенных преимуществ перед SnCU. Однако, конденсация небольшого избытка рибофуранозы 2 с 3' ,5 '-O-TIPDS-уридином 1а при 0°С в ДХЭ в присутствии TMSOTf давала смесь двух продуктов. Основной продукт по спектральным характеристикам оказался идентичен защищенному 2'-<9-рибофуранозилуридину За, побочным продуктом предположительно являлся соответствующий 5'-<3-рибофуранозил-изомер 7а. В аналогичной реакции Л^-бензоил-З'^'-О-ПРОБ-аденозина lb с полностью ацшированной D-рибозой 2 в тех же условиях 5'-0-рибофуранозил-производное образовывалось в качестве основного продукта (с выходом до 50%). Образование 5'-0-рибофуранозилнуклеозидов может быть объяснено миграцией TIPDS-защитной группы в присутствии TMSOTf.

Образование 5'-0-рибофуранозилуридина в качестве побочного продукта при конденсации 3',5'-O-TIPDS-уридина 1а с рибофуранозой 2 описывалось ранее [Markiewicz W.T., et at, Nucleosides

Nucleotides 1998, 17, 411]. При проведении реакции в ДХЭ при 20°С через 30 мин образовывалась смесь 2'-0-рибофуранозил- и 5'-0-рибофуранозил-производных в соотношении 4:1. Структуру побочного продукта удалось подтвердить проведением встречного синтеза, в котором в качестве исходного соединения использовался 2',3'-0-Т1Р08-уридин 6а. Соединение 6а получали взаимодействием 1,3-дихлор-тетраизопропилдисилоксана и 5'-0-монометокситритилуридина с последующим удалением тритильной защитной группы [Markiewicz W.T., J. Chem. Res. (S) 1979,24].

NSi-OOH J OO L BzO OBz I 00 I HO OH HO OH

F3CS020SiMe3

HO-Si-O-Si , H

Схема 2. Миграция TIPDS-защитной группы в присутствии TMSOTf, ее использование для синтеза 5'-0-рибофуранозилнуклеозидов. Предполагаемый механизм изомеризации и образования продуктов разложения, a B=Ura, b B=AdeBz, с B=CytBz, d B=GuaiBu, f B=Ade, g B=Cyt. i. TMSOTf, ДХЭ (MeCN), 0°C, N2, 1,5-4 ч, 55-90%; ii. B=AdeBz: рибофураноза 2, TMSOTf, ДХЭ, 0°C, N2, 20 ч, 60%; Hi. ВщШТГФ, 20°C, 20 мин; 5 M NHj/MeOH, 20°C, 3 дня, 84%.

Изомеризация 3',5'-0-ТПте-нуклеозидов в 2',3'-0-ТОТ)8-нуклеозиды также происходит в безводной кислой среде (мезитиленсульфокислота, диметилформамид, 20°С, 6-10 ч, выход 30-60%) [Verdegaal С.Н.М, et al, Tetrahedron Lett 1980, 21, 1571]. Для более детального изучения этого процесса, в ходе данной работы исследовалась изомеризация 3', 5'-0-ТШ)8-нуклеозидов la-d,f,g в присутствии TMSOTf. При воздействии 2-3-кратного избытка TMSOTf на 3', 5'-ОТ1РВ8-нуклеозиды la-d,f,g в ДХЭ при 0°С в атмосфере азота изомеризация протекала достаточно быстро (1,5-4 ч). Соответствующие 2', З'-О-ПРОЭ-производные 6a-d,f,g выделяли с выходом 55-90% (Табл. 1). Важно отметить, что в случае пуриновых нуклеозидов изомеризация протекала с существенно более высокими выходами 72-90%. В случае уридинового производного реакция сопровождалась образованием значительного количества продуктов разложения (до 20%).

Полученные данные согласуются с предложенным ранее механизмом изомеризации (Схема 2), по которому сначала под воздействием кислоты происходит разрыв связи Si—О при первичной 5'-гидроксигруппе, после чего происходит образование 2',3'-0-Т1Р08-нуклеозидов [Markiewicz W.T., Bartoszuk A., Bull. Polish Acad. Sei. 1984, 32,453]. Равновесие смещено в сторону 2',3'-производных 6 за счет большей термодинамической стабильности образующегося семичленного внутримолекулярного цикла по сравнению с восьмичленным в исходных нуклеозидах la-d,f,g.

Таблица 1. Изомеризация 3',5'-0-Т1Р08-нуклеозидов 1 в присутствии TMSOTf (ДХЭ, 0° С). Условия реакции и выходы 2',3 '-O-TIPDS-нуклеозидов 6.

Основание, В Количество TMSOTf, экв. Выходы нуклеозидов 6,% Время реакции, ч Rf нуклеозидов 1 (система) Rf нуклеозидов 6 (система)

a B=Ura 2 55 1.5 0.35 (А) 0.24 (А)

b B=AdeBZ 3 90 3.0 0.36 (А) 0.41 (А)

с B=CytBZ 2 60 4.0 0.34 (А) 0.43 (А)

d B=Gua'BU 3 74 2.0 0.30 (А) 0.28 (А)

f B=Ade 3 72 4.0 0.28 (В) 0.29 (В)

gB=Cyt 3 55 2.0 0.16(B) 0.12 (В)

Система А: СН2С12 - ЕЮН 98:2; система В: СН2С12 - ЕЮН 95:5.

Структура полученных изомеров ба-й,^ была подтверждена данными *Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии. Был проведен сравнительный анализ ЯМР-спектров исходных 3',5'-0-Т1Р08-нуклеозидов и продуктов изомеризации в ДМСО-сЦ. Сигналы вторичных 2'-

гидроксигрупп в спектрах нуклеозидов находятся в области более слабого поля (дублет, 5.60-

5.69 м.д.) и характеризуются константам спин-спинового взаимодействия (КССВ) ^г;оя=3.9-4.8 Гц. За счет спин-спинового взаимодействия с обоими протонами СНг-группы свободные первичные 5'-гидроксигруппы нуклеозидов ба-(1,^ в спектрах проявляются в виде дублета дублетов или триплета в области 5.15-5.33 м.д. Сравнение КССВ показало, что для 3',5'-0-Т1РО8-нуклеозидов константы достаточно малы, в то же время имеют значения около 8 Гц. В случае 2',3 '-0-ПРОЭ-нуклеозидов 6а-<)^ Ау и имеют более близкие значения, при этом сумма КССВ J¡\2^ и для нуклеозидов обеих серий примерно одинакова, 9.0-9.6 Гц.

В ходе дальнейших исследований было изучено влияние температуры, времени взаимодействия, катализатора и соотношения реагентов на протекание реакции изомеризации (Табл. 2). Изомеризация нуклеозидов 1 в присутствии 1 эквивалента ТМБОТГ при 0°С происходила существенно медленнее, чем при использовании 2-3 эквивалентов катализатора (Табл.2, реакции 1-3). При увеличении количества катализатора, времени взаимодействия и температуры (ср. Табл. 1 и 2) наблюдалось

образование продуктов разложения с более низкими значениями Яг = 0.25-0.15 (система СН2СЬ -ЕЮН 98:2), предположительно 3' и г'-О-ИРБв-производных (Схема 2).

Также было показано, что превращение 1—>6 может катализироваться трифторметансульфоновой кислотой (ТГОН), но этот катализатор менее эффективен, поскольку вызывает существенное разложение (до 75%, ДХЭ, 0°С, 24 часа, Табл. 2, реакции 6-8). Процесс изомеризации 3',5'-0-ТШ)8-нуклеозидов 1 был изучен и в присутствии таких катализаторов как БпСЦ и эфират трехфтористого бора (ВРз^гО) (Табл. 2, реакции 9-19). Образование продукт миграции 6а, сопровождавшееся разложением, наблюдалось только в случае уридинового производного 1а (Табл. 2, реакции 11-13), В случае остальных нуклеозидов по данным ТСХ

обнаруживались следовые количества (<2%) продуктов миграции 6 (Таблица 2, реакции 14-19).

Таблица 2. Изомеризация 3',5'-0-ТШ)8-нуклеозидов 1. Влияние температуры, времени взаимодействия, катализатора и соотношения реагентов. Соотношение нуклеозидов 1,6, и продуктов разложения, определенное при помощи ТСХ и ПМР-спектроскопии.

Субстрат Условия реакции 6,% 1,% разложение, %

1 1Ь 3 экв. ТМЭОТ^ ДХЭ, 0°С, 24 ч 80 2 18

2 1Ь 2 экв. ТШОТТ, ДХЭ, 0°С, 24 ч 85 2 13

3 1Ь 1 экв. ТМвОТ^ ДХЭ, 0°С, 24 ч 50 55 5

4 1а 1 экв. тавОТЬ МеСЫ, 20°С, 24 ч 60 15 25

5 1Ь 1 экв. ТМБОТ^ МеСЫ, 20°С, 24 ч 45 50 5

6 1а 1 экв. ТГОН, ДХЭ, 20°С, 3 ч 30 55 15

7 1а 1 экв. ТГОН, ДХЭ 20°С, 24 ч 15 10 75

8 1с 1 экв. ТГОН, ДХЭ, 20°С, 24 ч 10 50 40

9 1а 1 экв. ВР3-ЕЮЕ1, ДХЭ, 0°С, 24 ч 7 75 18

10 1Ь 1 экв. ВРз-ЕЮЕг, ДХЭ, 0°С, 24 ч 0 80 20

11 1а 1 экв. ЭпСЦ, ДХЭ, 0°С, 24 ч 35 60 5

12 1а 1 экв. 8пС14,ДХЭ, 20°С, 24 ч 70 20 10

13 1а 1 экв. 8пС14, СНзСИ, 20°С, 24 ч 65 20 15

14 1Ь 1 экв. 8пС14,ДХЭ,0°С*, 24 ч 2 95 3

15 1Ь 1 экв. ЭпСЦ, МеСКГ, 20°С, 24 ч 5 90 5

16 1с 1 экв. БпСи, ДХЭ, 0°С*, 24 ч 0 97 3

17 И 1 экв. БпСЦ, ДХЭ, 0°С*, 24 ч 2 95 3

18 К 1 экв. БпСЦ, ДХЭ, 0°С*, 24 ч 0 97 3

19 1К 1 экв. ЭпСи, ДХЭ, 0°С*, 24 ч 0 97 3

♦аналогичные результаты получены и при 20°С

Проведение реакции конденсации 3',5'-0-ТШ>8-нуклеозидов с полностью ацилированной

рибофуранозой при 0°С в присутствии ЭпСЦ является оптимальным и позволяет получать

соответствующие производные дисахаридных нуклеозидов с высокими выходами.

Было показано, что изомеризация 3',5'-0-Т1РВ8-нуклеозидов 1 в присутствии ТМБОТГ может

быть использована для получения 5'-0-рибофуранозилнуклеозидов. Так, нами был получен 5'-0-

8

рибофуранозиладенозин 7Ь (Схема 2). К нуклеозиду 1Ь в ДХЭ при 0°С добавляли 2 эквивалента ТМБОТГ (Схема 2, реакция I). Через 12 часов, когда по данным ТСХ реакция изомеризации закончилась, к реакционной смеси добавляли рибофуранозу 2 и выдерживали реакционную смесь при 0°С 20 часов (Схема 2, реакция И). 5'-0-Рибофуранозиладенозин 7Ь был выделен с 60% выходом. Последующее удаление защитных групп позволило получить 5'-0-Р-0-рибофуранозиладенозин 8Ь, по спектральным характеристикам идентичный дисахаридному нуклеозиду, полученному ранее, исходя из 2',3'-б>-изопропилиденаденозина [МкЬаПоу Э.Ы., е! а1, Еиг. X ОгСкет. 1998, И, 2193].

Проведенные исследования позволили установить, что 3',5'-0-Т1РОЗ-нуклеозиды 1 в присутствии ТМвСПТ эффективно (с выходом 55-90%) изомеризуются в 2',3'-0-Т1Р08-производные 6. В присутствии ЭпСЦ и ВРз^гО 3',5'-0-Т1Р08-нуклеозиды 1 значительно более стабильны. Только в случае уридинового производного 1а наблюдалось образование заметного количества продукта изомеризации 6а (до 35% при проведении реакции при 0°С и до 70% при 20°С). Таким образом, было показано, что оптимальным для реакции гликозилирования 3',5'-О-ИРОБ-нуклеозидов 1 является проведение реакции при 0°С и использование в качестве катализатора ЭпСЦ.

Синтез 3'-0-{5-0-рибофуранозил-2'-дезоксиаденозш1а [1].

Разработанный метод гликозилирования был успешно применен для получения пиримидиновых аналогов 3'-0-р-0-рибофуранозил-2'-дезоксирибонуклеозидов. Конденсация 5 '-0-трет~ бутилдифенилсилил-тимидина 9а с рибофуранозой 2 приводила к образованию дисахаридного нуклеозида 10 с выходом 79% (Схема 3). После удаления защитных групп получали дисахаридный нуклеозид 11с высоким общим выходом.

Однако, при аналогичной реакции небольшого избытка ацилированной рибофуранозы 2, активированной впСи, с 5'-0-защищенным Л'6-бензоил-2'-дезоксиаденозином 9Ь при 0° С была получена сложная смесь продуктов. Схожие результаты были получены и при использовании производного 2'-дезоксиаденозина 9с (схема 3). Это может объясняться неустойчивостью и возможной аномеризацией Л-гликозидной связи в условиях реакции гликозилирования. Было решено более подробно исследовать данную реакцию конденсации, установить структуру основных продуктов и механизм их образования.

Анализ полученных смесей был проведен с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). После стандартной обработки реакционные смеси для удаления защитных групп обрабатывали тетрабутиламмонийфторидом (Вщ№), а затем раствором в МеОН. ВЭЖХ анализ позволил определить основные продукты реакции: аденин, аденозин 17 (основной продукт реакции в обоих случаях), дисахаридные нуклеозиды 18 и 19 (Схема 3). При этом при гликозилировании лЛбензоил-2'-дезоксиаденозина 9Ь преимущественно образовывался а-аномер дисахаридного нуклеозида 19 (соотношение продуктов 17:18:19 составило 51:3:13), а в случае

незащищенного производного 9с - соответствующий р-аномер 18 (соотношение продуктов 39:31:4), Это объясняется меньшей устойчивостью Л^-гликозидной связи в случае Д^-ацилированных производных аденозина по сравнению с незащищенными производными.

tBuPh2SiO-i 0

Vi

но

BzO

Ас

BzO OBz

tBuPhjSiO—| 0 |hy НО— Т^У

nçj

и

BzO

BzO OBz HO OH

10 11

\ «y] "Чр

Bz0n .0. I о 0 8

У ♦ BZÛ^0Ï + Bzo-n о I

BzO OBz 12

'C

H H

BzO OBz BzO OBz

13 R = tBuPh,Si 14

15 R = H

14 -!

18 -*-»1

ноп jde HO-n

л - V M

-LOJ О о A

yj ♦ +

HO OH 17

HO OH 18

HO OH 19

Схема 3. Получение 3'-0-Р-0-рибофуранозил-2'-дезоксирибонуклеозидов. a B=Thy, b B=AdeEz, с B=Ade. i. SnCU, ДХЭ, 0°C, N2> 1.5-3 ч; ii. Bu^NF/ ТГФ, 20°C, 40 мин; iii. 5M NHj/ MeOH, 20°C, 3 дня; iv. AdeBz, N, 0-бис(триметилсилил)адетамид (BSA), TMSOTf, MeCN, 70°C, 2.5 ч.

На следующим этале изучалась аномеризация 5'-0-защшценного Л^-бензоил-2'-дезоксиаденозина 9Ь в присутствии 8г,СЦ (Схема 4). Реакцию проводили в ДХЭ при 0° С в течение 1 часа. О прохождении реакции судили по появлению на ТСХ пятна с Rf 0.47, характерного для а-аномера 20 (для исходного ß-аномера 9Ь Rf 0.30, система CHjCh-EtOH, 95:5). На хроматограмме также появлялось пятко с Rf 0.16, соответствующее Л^-бензоиладенину. Увеличение времени ьзаямодейстзм привода? к полвтеу разложению исходного нуклеозида и преимущественному

10

образованию //-бензоиладенина. Повысить выход а-аномера 20 (с 25% до 50%) удалось добавлением к реакционной смеси //-бензоиладенина. Выделение соединения 20 проводили при помощи колоночной хроматографии на силикагеле. Удаление защитных групп, осуществленное в два этапа (Схема 4, реакции и и ш), приводило к соединению 22.

Исследована устойчивость полностью защищенного производного 2'-дезоксиаденозина 9(1 в условиях реакции гликозилирования (Схема 4). З'-О-Триметилсилильное производное 9й оказалось стабильным в присутствии БпСЦ в ДХЭ при 0° С в течение 3 часов. Из этого можно сделать вывод, что №гликозидная связь в 2'-дезоксиаденозине 9Ь с незащищенной З'-ОН группой менее стабильна, чем в З'-О-защищенном производном 9(1. Поскольку известно, что БпСЦ способен образовывать комплексы как с атомами азота гетероциклических оснований, так и с гидроксильными группами, нами был предложен механизм реакции аномеризации, изображенный на Схеме 4. Комплекс, образуемый БпС1) с гетероциклическим основанием и свободной ОН-группой нуклеозида в случае Р-аномера менее стабилен, чем в случае а-аномера, поэтому равновесие реакции смещается в сторону образования а-нуклеозида.

Схема 4. Аномеризация производных 2'-дезоксиаденозина. Предполагаемый механизм аномеризации. b В =AdeBz, R = Н; d B=AdeBz(™s) , R = TMS. i. AdeBz, SnCL,, ДХЭ, 0°C, N2, 1 ч, 50%; ii. 5M Шз/МеОН, 3 дня; iii. BU4NF/ ТГФ, 40 мин, 51%, общий на две стадии: ii и iii.

Для синтеза 3'-0-р-0-рибофуранозил-2'-дезоксиаденозина 18 был использован известный метод трансгликозилирования [Yamaguchi Т., Saneyoslii М., Chem. Pharm. Bull 1984, 32, 1441]. В качестве донора дисахаридного остатка был выбран З'-О-Р-О-рибофуранозилтимидин 10, акцептора - JV6-бензоиладенин (Схема 3, реакция iv). В ходе реакции, катализируемой TMSOTf, была получена смесь Р-13 и а-аномеров 14. Эти соединения имеют близкие значения Rf (0.60 система СН^СЬ-ЕЮН, 98:2), и разделение аномеров осуществляли после удаления 5'-0-силильной защитной группы (Схема 3,

tBuPh2SiO

Н Вг

реакция ii). Частично защищенные производные 15 и 16 имеют значения Rf 0.32 и 0.26 соответственно (система СНгСЬ-ЕЮН, 95:5) и разделение их колоночной хроматографией на силикагеле позволило получить соединения 15 и 16 с выходом 22% и 45% соответственно. Последующее дебензошшрование давало аномеры 18 и 19 (Схема 3, реакция iii) с хорошим выходом.

Структура и чистота полученных соединений подтверждались данными ЯМР-, УФ-, КД-спектроскопии и масс-спектрометрии. ЯМР-спектры дисахаридных нуклеозидов являются достаточно сложными, что связано с наличием двух рибофуранозных остатков. Некоторые сигналы удалось рассчитать непосредственно из ЯМР-спектров. Отнесение сигналов остальных протонов было сделано сравнением с данными ЯМР-спектроскопии родственных нуклеозидов и ранее синтезированных дисахаридных нуклеозидов при помощи спектров двойного резонанса и спектров двумерной гомоядерной корреляции (COSY). |3С-ЯМР-спектры были отнесены подобным образом с использованием спектров гетероядерной 'Н-13С-корреляции (HSQC).

Аномерная конфигурации полученных 3'-0-р-В-рибофуранозил-2'-дезокси-р-аденозина 18 и его а-аномера 19 была определена методом ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) (Табл. 3). В случае р-аномера 18 подавление сигнала Н-1' давало характерную величину ЯЭО (2.1 %) на Н-4' и нулевой эффект на З'-протоне нуклеозидного фрагмента (Табл. 3). Протоны H-2'a и H-2'b были отнесены как "вверх" (npo-S) и "вниз" (npo-R) протоны соответственно. Величины ЯЭО на H-2'a и H-2'b для обоих аномеров соответствовали литературным данным: ¡/ис-ориентированные по отношению к Н-1' протоны (H-2'b в случае р-аномера 18 и H-2'a в случае а-аномера 19) характеризовались ббльшими величинами ЯЭО [Rosemeyer Н., et al, Nucleosides Nucleotides 1989, 8, 587]. В спектре они располагались следующим образом: H-2'a - более слабопольный сигнал, H-2'b - более сильнопольный. Как видно из Таблицы 3, в случае а-аномера 19 ЯЭО на Н-3' имеет незначительную величину, что соответствует литературным данным.

ЯЭО (%) для нуклеозидов 18 и 19 при подавление

Р-аномер а-аномер

Ж "T$L

ко Н„ r6 Н„

№рибофураноза

* Величина ЯЭО выражена в процентах увеличения площади пика.

** Н-2'а и Н-2'Ь отнесены как "вверх" (про-Б) и "вниз" (про-Я) протоны соответственно.

Таблица 3. Данные экспериментов по изучению Н-1'.*

Протон1** Р-аномер (18) а-аномер (19)

Н-4' 2.1 -

Н-3' <0.5 -

H-2'a <0.5 3.6

H-2'b 5.0 0.9

Анализ ЯМР-спектров полученных дисахаридных нуклеозидов 13-16,18,19 показал наличие в этих соединениях двух рибофуранозных фрагментов, соединенных ¡З-гликозидной связью (для дополнительного рибофуранозного остатка Jv,r < 0.5 Гц). Для соединений 13-14, 15-16 и 18-19, имеющих различную аномерную конфигурацию нуклеозидного фрагмента, принципиально различались КССВ Jr,ra и Jr.n (Табл. 4). Согласно эмпирическому правилу, в спектрах 2'-дезокси-р-нуклеозидов сумма Jnb+ Ji-гъ обычно больше, чем для а-нуклеозидов. Как видно из Таблицы 4, это правило соблюдается и в случае полученных дисахаридных нуклеозидов. В Таблице 4 в качестве примера приведены фрагменты спектров нуклеозидов 15Ь и 16Ь. Видно, что для ß-нуклеозида сигнал Н-2'Ь проявляется в виде дублета дублетов и характеризуется константами J\\n =5.3 Гц, Jy,n <0.5 Гц и Ji-a =-13.4. Величина КССВ Jrj't =5.3 Гц характерна для взаимного у^с-расположения протонов Н-Г и H-2'b; Зузъ <0.5 Гц характерна для транс-расположения протонов H-2'b и Н-3' [Davies D.B. Progress in NMR Spectroscopy 1978, 12, 135]. В случае а-нуклеозида сигнал H-2'b протона проявляется в виде уширенного дублета и характеризуется константами Jr.n =2.5 Гц, Jyj% <0.5 Гц и Jyajb =-14.4 Гц, характерными для транс-расположения как с протоном Н-Г, так и с Н-3'. В спектрах всех изученных а-аномеров 14b, 16Ь, 19,20, 21, 22 и соответсвующих ß-аномеров 13b, 15b, 18, 9 наблюдаются такие же закономерности.

Таблица 4. Отличительные особенности ПМР-спектров а- и р-2'-дезоксинуклеозидов на примере спектров дисахаридных нуклеозидов 15Ь и 16Ь (300 МГц, CDCI3,25 °С).

ß-нуклеозиды, соединение 15Ь а-нуклеозиды, соединение 16b

JlTa+JlH > JlTa+Jnt

Jvr* Jyrb СуммаКССВ •Л'2'a JvTb Сумма КССВ

9.6 Гц 5.3 Гц 14.9 Гц 7.0 Гц 2.5 Гц 9.5 Гц

HO-, О f®Sz н"2'адвд 1QI H-2'Ьдд Jnt R=2,3,5-Tpn-0-Bz- JrQ?A' рибофураноза Jу, п н H-2'a дцд Я H-2'b уд Т-\МеВг г -л с RO Нь Jr.n-25, R»2,3,6.tp«-0-BZ- Ji-aj'b—MA, рибофураноза jrn <0.5

6. 3 6. 2 (РР"! H-2'a 1 H-2'b Jit KJL 3.0 2.8 2. i ( ppml (. 11 S. 30 (ргя) Ht>UC 2.3 2.6 ( рря)

КД-спектры соединений 18 и 19 согласовались с данными, приведенными в литературе [Yamaguchi Т., Saneyoshi М., Chem. Pharm. Bull 1984, 32, 1441], что также подтверждает их

13

аномерную конфигурацию. Как и природный 2'-дезоксиаденозин, (3-аномер дисахаридного нуклеозида 18 характеризовался отрицательным Котгон-эффектом ДБгыим = -0.85; для а-аномера 19, так же как для а-2'-дезоксиаденозина, наблюдался положительный эффект Дб2б)нМ = +3.80.

УФ-спектры полученных 2'-дезокси-а-аденозина 22 и дисахаридных Р- и а- нуклеозидов 18 и 19 при различных значениях рН соответствовали спектрам природного 2'-дезоксиаденозина, что подтверждает место присоединения углеводного остатка к гетероциклическому основанию (по Анатому). Молекулярная масса полученных соединений была подтверждена наличием в масс-спектрах пиков соответствующих молекулярных ионов.

Таким образом, исследования по синтезу 3'-0-р-0-рибофуранозил-2'-дезоксинуклеозидов показали, что при рибозилировании 5'-0-трет-бутилдифенилсшшл-^-бензоил-2'-дезоксиаденозина (9) в присутствии ЭпСЦ в ДХЭ при 0°С наблюдается его эффективная аномеризация. Это может быть объяснено неустойчивостью Л'-гликозидной связи в Л6 -ацилированных производных аденозина в присутствии кислот Льюиса. Для получения 3'-0-(Ш-рибофуранозил-2'-дезоксиаденозина (18) и его а-аномера 19 был успешно использован метод трансгликозилирования.

Синтез 2'-0-а-0-рибофуранозилиуклеозидов [4].

2'-0-а-В-Рибофуранозиладенозин 29Ь является структурным элементом поли(АОР-рибозы). Сложность синтеза 2'-0-а-Б-рибофуранозиладенозина заключается в том, что нуклеозид и дополнительный рибозный остаток должны быть связаны 1"—>2' гликозидной связью, имеющей а-конфигурацию. В ходе работы впервые был осуществлен стереоселективный синтез У-О-а-Т)-рибофуранозиладенозина 29Ь (Схема 5) и его пиримидинового аналога - 2'-0-а-0-рибофуранозилуридина 29а, исходя из производных 2'-0-а-В-арабинофуранозилнуклеозидов 24а,Ь.

Соответственно защищенные 2'-(?-а-П-арабинофуранозилнуклеозиды 24а,Ь получали по разработанному методу конденсацией небольшого избытка 1-0-ацетил-2,3,5-три-О-бензоил-(5-Б-арабинофуранозы 23 с 3',5'-0-Т1Р08-нуклеозидамн 1 а,Ь в присутствии БпСЦ. Реакция протекала в мягких условиях (0°С, ДХЭ, 30 ч в случае аденозинового производного, 3 ч в случае уридинового) (Схема 5, реакция ¡). О-Гликозилирование протекало стереоспецифично, с образованием а-гликозидной связи. Наличие в присоединяемом сахаре соучаствующей 0-бензоильной группы обеспечивало образование 1,2-тракс-арабинофуранозидов. Выход целевых соединений 24а,Ь составил 63 и 62% соответственно.

О-Дебензошшрование проводили с использованием раствора МеСЖа в метаноле (Схема 5, реакция и). Для селективной защиты 3',5'-ОН-групп арабинозы в соединениях 25 а,Ь использовали защитную группу Маркевича. При комнатной температуре реакция протекала довольно медленно, поэтому реакцию проводили при 35°С (Схема 5, реакция ш). Ключевой стадией синтеза стало

14

обращение конфигурации при С-2" дополнительного моносахаридного остатка, которое было осуществлено по методу Робинса окислением - восстановлением [Hansske F., Madej D., Robins M. J, Tetrahedron 1984, 40, 125]. Для окисления 2"-OH группы защищенного соединения 26 выбрали процедуру с использованием системы ДМСО - Ас20 (Схема 5, реакция iv). Восстановление кето-группы соединения 27 проводили NaBH* (Схема 5, реакция v). Поскольку атака гидрид-иона происходит с пространственно менее затрудненной стороны фуранозяого кольца, восстановление протекало стереоселективно, с образованием a-D-рибофуранозного производного 28. После удаления защитных групп были получены 2'-0-а-0-рибофуранозиладенозин 29Ь и 2'-0-a-D-рибофуранозилуридин 29а с хорошими общими выходами (Схема 5, реакции vi, viii). Для изучения и сравнения физико-химических свойств, были также синтезированы Т-0-a-D-арабинофуранозилнуклеозиды 30 а,Ь (Схема 5).

Схема 5. Синтез 2'-0-а-0-рибофуранознлнуклеозидов. а В = В' =Ura, b В = AdeBz, В' = Ade. i. SnCL,, ДХЭ, 0°C, N2, а 3 ч, b 20 ч, 62-63%; ii. 0,1 M MeONa/MeOH, 10°C, 40 мин, 47-67%; iii. ClSi(iPr)2OSi(iPr)2Cl, Py, 35°C, 20 ч, 69-72%; iv,v ДМСО, Ac20, 24 ч; NaBH4, ЕЮН, 0°C, 1 ч, 69-85%; vi. BujNF/ ТГФ, 20°C, 1 ч, 86% (29a); vii. Только для B=AdeBz: NHj/MeOH, 20°C, 2 дня, 85-90% общий, на две стадии: vi и vii (29,30b)

Структура полученных соединений была подтверждена данными ЯМР- и УФ-спектроскошш и масс-спектрометрии. !Н ЯМР-спектры дисахаридных нуклеозидов (Рис. 1) достаточно сложны. Отнесение сигналов в спектрах соединений 24-26 и 28 удалось осуществить при помощи спектров

BzO

В'

двойного резонанса и спектров COSY, а также сравнением со спектрами родственных нуклеозидов.

15

|3С ЯМР-спектры были отнесены подобным образом с использованием спектров ЩрС (пример Рис. 2).

Анализ спекгров 2'-0-<х-0-арабинофуранозилнуклеозидов 26а,Ь и 30а,Ь и 2'-0-а-0-рибофуранозилнуклеозидов 28а,Ь и 29а,Ь показал, что обращение конфигурации при С-2 атоме в пентафуранозном остатке приводит к значительным изменениям значений КССВ. Взаимное трансрасположение атомов НГ-Н2' и Н2'-Н3' в 2'-0-а-/)-арабинофуранозилнуклеозидах 26а,Ь и 30а,Ь изменяется на г/нс-расположение в 2'-0-а-£)-рибофуранозилнуклеозидах 28а,Ь и 29а,Ь. В Таблице 5 для сравнения приведены данные ЯМР-спектроскопии для 2'-0-р-П-рибофуранозиладенозина 5Ь и 2'-О-а-Б-арабинофуранозиладенозина ЗОЬ и 2'-0-а-В-рибофуранозиладенозина 29Ь. В случае «-£>-рибофуранозного производного 29Ь для дополнительного углеводного остатка ^^-=4.2 Гц, J2',з^- 6.2 Гц и 2.7 Гц, в случае а-£>-арабинофуранозного ЗОЬ - 1.6, 3.5 и 6.0 Гц, соответственно, и те же константы для [НЭ-рибофуранозного производного 5Ь равны 0,4.6 и 7.5 Гц.

Таблица 5. Химические сдвиги (5, м.д.) и КССВ (Гц) в 'Н-ЯМР-спекграх 2'-0-ß-D-рибофуранозиладенозина 5Ь, 2'-0-а-О-арабинофуранозиладенозина ЗОЬ и 2'-0-a-D-рибофуранозиладенозина 29Ь (500 МГц, D20,27°С).

Соединение 5Ь ЗОЬ 29Ь

Фрагмент Ado ß-Rib Ado а-Ага Ado a-Rib

Н-1'№.г) 6.01 д (6.4) 4.95 с (<0.5) 6.01 д (6.3) 4.85 д (1.6) 6.03 д (6.2) 4.98 д (4.2)

Н-2'№.з<) 4.67 дд (5.2) 4.02 д (4.6) 4.68 дд (5.1) 3.99 дд (3.5) 4.70 дд (5.1) 3.97 дд (6.2)

Н-3' (У,-. 4) 4.44 дд (3.2) 3.88 дд (7.5) 4.40 дд (3.1) 3.80 дд (6.0) 4.41 дд (3.1) 3.93 дд (2.7)

Н-4'(/о'„) 4.19 двд (2.7) 3.71 двд (3.7) 4.18 двд (3.5) 3.99 ддд (3.3) 4.19 ддд (2.7) 4.09 ддд (3.5)

н-5ч/га«) 3.82 дд (-12.8) 3.21 дд (-12.4) 3.73 дд (-12.9) 3.64 да (-12.4) 3.80 дд (-12.9) 3.57 дд (-12.4)

3.75 дд (3.6) 2.64 дд (6.8) 3.82 дд (2.7) 3.53 дд (5.8) 3.72 дд (3.5) 3.50 дд (4.7)

Н-8 8.24 q 8.23 с 8.17 d

Н-2 8.40 с 8.39 с 7.97 с

Для соединения 29 Ь был проведен ряд дополнительных ЯМР-экспериментов с использованием методик гетероядерной корреляции дальних взаимодействий (НМВС) (Рис. 2) и двумерной протон-протонной корреляции, основанной на ЯЭО (ДОЕвУ). Так, наличие между углеводными остатками гликозидной связи 2' - 1" было подтверждено НМВС-спектроскопией (Рис. 2). Четко видно взаимодействие между атомами С-1" и Н-2' и между атомами Н-1" и С-2'. На ЯОЕБУ-спектре , соединения 29 Ь хорошо видны кросс-пики между атомами Н-1" и Н-2" и Н-3", что указывает на цис-ориентацию этих протонов и, соответственно, на наличие в данном соединениии а-Б-рибофуранозного фрагмента.

6Г9191 -r-006191 Jn 89'9Ul A 6V6UlJ 00Ш1 -p 969081 -f Q IP01S1-1 = О 8СШ1 -s 1 oími-f essmJ mioi-т-69'cmJ

H-1" Rib

trçsn-

SS19PZ-

H-r Ado

09ЖС-691111-

H-2

H-8

¿SS60

8096V

f

<o o. -S

Рисунок 2.Ш(2С (вверху) и НМВС-спектры для соединения 29 Ь ф2,0 27°С, 500 МГц).

А<НГ

Н1'А

С5'А С5'-

СЗ'

СЗ'А

С2'

С2'А

С4*

С4'А

С1'А

СГ

НГ Н2'А НЗ'А Н4'А Н4' Дз> Н5'А Н5'

_1_-__А_л-Л.—иХДд.

Н1'А

Сб'А С5'~

СЗ1

СЗ'А

С2'

С2'А

С4'

С4'А

С1'А

НГ Н2 А НЗ'А Н4'А Н4' Н5'А Н5' _I..................О ,. .Д_А—Д_«)ии__лЦи_

Кроме того, сравнение ЯМР-спектров соединения 29 Ь со спектрами дисахаридного нуклеозида, полученного путем ферментативного гидролиза поли(АОР-рибозы), приведенное в Таблице 6, показало, что спектры этих соединений практически идентичны.

Таблица 6. Сравнение 'Н-ЯМР спектров полученного 2'-0-аЛ)-рибофуранозиладенозина 29 Ь с литературными данными. Химический сдвиг (м.д.) и КССВ (/, Гц) (ДМСО-ёб).

Фрагмент Ado a-Rib

Хим. сдвиг (КССВ) 29 b* Лит. данные** 29 Ь* Лит. данные**

Н-ГЙ'г) 6.04 д (5.6) 6.03 д (5.9) 4.88 д (4.0) 4.89 д (4.2)

Н-2 -(J,.,.) 4.78 дд (5.2) 4.81м (4.7) 3.83 дд (6.2) 3.85 м (н.о)

H-3'ftw) 4.32 дд (3.7) 4.33 дд (3.0) 3.78 дд (2.5) 3.81 м (н.о)

W-4'Уг.Уа) 4.00 дпд (3.7) 4.01 м (н.о) 3.95 ддд (2.5) 3.96 м (н.о)

H-5'a ji) 3.70 дд (-12.2) н.о 3.16 дд (-11.9) н.о

H-5'b(J<yi) 3.57 дд (3.4) н.о 3.16 дд (4.4) н.о

Н.о - не удалось определить, сигналы перекрываются сигналом воды. *27°С, 400 МГц,

**25°С, 360 МГц [Ferro A.M., Oppenheimer N.J., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1978. 75. 809]

В результате проведенных исследований впервые был осуществлен стереоселективный синтез 2'-О-а-О-рибофуранозиладенозина 29Ь с хорошим общимлыходом. Универсальность разработанного метода была подтверждена успешным синтезом 2'-0-а-В-рибофуранозилуридина 29а по выбранной схеме.

Ингибирование поли(АОР-рибозо)полнмеразы-1 человека днсахаридными нуклеозндами -производными структурного элемента поли(АОР-рибозы) [13,14].

В ходе проведенных совместно с Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН исследований изучено влияние на активность ПАРП-1 различных дисахаридных нуклеозидов. Для определения ингибиторных характеристик дисахаридных нуклеозидов в реакции поли(АОР-рнбозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП-1, была использована тест-система, основанная на полимеризации меченного тритием по адениновому остатку В качестве показателя эффективности ингибирования использовали значение 1С50.

Как видно из Таблицы 7, среди 2'-0-р-В-рибофуранозилнуклеозндов ингибиторами оказались производные тимидина и гуанозина. При этом значение ГС50 для 2'-0-Р-0-рибофуранозилгуанозина вдвое превышает 1С50 Для 2'-0-р-О-рибофуранозилтимидина. 5'-0-Рибофуранозное производное гуанозина не оказывает влияния на активность ПАРП-1 в концентрации 1 мМ. Тимидиновые производные ингибируют фермент со значениями Ю50 от 0,05 мМ до 0,02 мМ. Причем, наименьшие значения Ю50 оказались у З'-О-рибофуранозилтамидина 11, (ГС50 0,07 мМ) и его окисленного

производного (Ю50 0,02 мМ). Среда производных адешиина незначительную ингибирующую активность проявил только 3-0-р-О-рибофуранозил-2-дезокси-о'Л)-аденозин 19 (Ю50 0,2 мМ).

Таблица 7. Значения Ю50 в реакции поли(АОР-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП-1 для различных дисахаридных нуклеозидов [13,14].

Соединение Структура 1С50 Соединение Структура 1С50

2'ШЬАёо5Ь НО—| - Айв ю нП ч? но он >1 тМ 2'ИЬСуа 5с НО-.0Су1 но он >1 тМ

2'1ШЪ(15е нН но он 0.25 тМ 2'ШЬОио 5'1 НО-,0?и» но] НС он 0.50 тМ

з'шмтъа И но-^и, но он 0.07 тМ З'ИМТМ окисленное производное о о 0.02 тМ

5'ИЪА<1о8 но он но он >1 тМ 3'К:Ь5'К1Ьс1ТЬс1 нй ОН 1 -л ноон 0.20 тМ

3'1ША(1о 18 но он >1 тМ з'шь-а-алао 19 0 но он 0,20 тМ

2'-0-оЯ}-ШЬАс!о29Ь НО-1 л ме й но но но-Ьг >1 тМ АгаАёо ЗОЪ у /Ь но-1 " >1 тМ

♦значения Ю50 определены при концентрации природного субстрата НАДГ 0,3 тМ, равной Км

В ходе исследований влияния различных дисахаридных нуклеозидов на активность рекомбинантной ПАРП-1, в ряду синтезированных соединений обнаружены ингибиторы с ГС50 ~Ю"5 М. Таким образом, разработка методов химического синтеза структурного элемента поли(АДФ-рибозы) и родственных дисахаридных нуклеозидов открывает новые возможности для создания на их основе новых ингибиторов ПАРП-1. В настощее время ПАРП-1 рассматривается как перспективная мишень для создания лекарственных препаратов для лечения ряда таких заболеваний как инсульт, ишемическая болезнь, диабет, травматические повреждения ЦНС, артрит, колиты и другие формы

воспаления. Ингибиторы ПАРП также могут быть использованы как потенциальные противораковые и противовирусные агенты.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован ранее разработанный в лаборатории метод получения дисахаридных нуклеозидов, исследовано влияние температуры, различных катализаторов на протекание реакции гликозилирования, устойчивости Л^-гликозидной связи и используемых защитных групп. Установлено, что триметилсилилтрифторметансульфонат эффективно катализирует изомеризацию 3',5'-(7-(тетраизопропш1дисилоксан-1,3-диил)нуклеозидов с образованием 2',3'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)производных.

2. Впервые осуществлен химический синтез 2'-0-а-В-рибофуранозиладенозина, структурного элемента поли(АОР-рибозы) и его аналогов, что открывает новые возможности для создания ингибиторов поли(АОР-рибозо)полимераз.

3. Разработан метод получения 3'-0-Р-О-рибофуранозил-2'-дезоксиаденозина и его а-аномера с использованием реакции трансгликозилирования. Обнаружено, что в условиях реакции О-рибозилирования Л'в-бензоил-5'-0-/и/гет-бутилдифенилсилил-2'-дезоксиаденозин подвергается эффективной аномеризации. Предложен механизм протекания этого процесса, связанный с неустойчивостью Л^-гликозидной связи в присутствии кислот Льюиса.

4. В ходе работы синтезировано 29 новых соединений, структура которых подтверждена данными масс-спектрометрии, УФ-, КД- и ЯМР-спектроскопии. В ряду синтезированных соединений обнаружены ингибиторы рекомбинантной поли(АОР-рибозо)полимеразы-1 с 1С5о 10"5 М.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

Статьи

1. I.V. Gulyaeva, К. Neuvonen, Н. Lonnberg, А.А. Rodionov, E.V. Shcheveleva, G.V.Bobkov, E.V. Efimtseva, S.N. Mikhailov. Effective anomerisation of 2'-deoxyadenosine derivatives during disaccharide nucleoside synthesis. //Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2004, v. 23, № 12, p. 1849-1864.

2. S.N. Mikhailov, E.V. Efimtseva, A.A. Rodionov, G.V. Bobkov, I.V. Kulikova, P, Herdewijn. Synthesis of 2'-0-b-D-ribofuranosylnucleosides. // Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, 2006, Unit 1.14.1-1.14.19. Supplement 27.

3. E.V. Efimtseva, I.V. Kulikova, S.N. Mikhailov. Disaccharide Nucleosides and their Incorporation into Oligonucleotides. // Current Organic Chemistry, 2007, v. 11, № 4, p. 337-354.

4. S.N. Mikhailov, I.V. Kulikova, K. Nauwelaerts, P. Herdewijn. Synthesis of 2'-0-a-D-ribofuranosyladenosine, monomelic unit of poly(ADP-ribose). II Tetrahedron, 2008, v. 64, № 12, p. 28712876.

5. I.V. Kulikova, D.A.Muradova, S.N.Mikhailov. Effective isomerization of 3',5'-0-(tetraisopropyldisiloxane-l,3-diyl)nucleosides in the presence of trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate. // Arkivoc, 2009, (iii) p. 158-170. Online version published Sep 28 2008.

6. И.В, Куликова, Д.А. Мурадова, C.H. Михайлов. Стабильность 3', S'-O-(тетрашопрогоидисилоксан-1,3-диил)нуклеозидов в присутствии кислот Льюиса. II Вестник МИТХТ, 2008, т. 3, № 5, с. 90-95.

7. Е.В. Ефнмцева, И.В. Куликова, С.Н. Михайлов. Дисахаридные нуклеозиды - важная группа природных соединений. // Молекулярная биология, 2009, т. 43, № 2, с. 327-338.

Тезисы

8.1.V.KuIikova, I.S.Varizhuk, G.V.Bobkov, E.V.Efimtseva, S.N.Mikhailov. "Effective Anomerisation of 2'-Deoxyader.osine and Thymidine Derivatives." XIII Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components (Czech Republic, Spindleruv Mlyn, September 3 - 9, 2005) Collection Symposium series, 7, p, 425427 (2005).

9. I.V.Kulikova, D.A.Muradova, I.S.Varizhuk, S.N.Mikhailov. "Stereospecific Synthesis of 2'-0-a-D-ribofuranosyinucleosides." XIV Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components (Czech Republic, Cesky Knanlov. June 8-13,2008) Collection Symposium series, 10, p. 155-158 (2008).

10. И.В. Куликова, C.H. Михайлов. "Синтез 2'-0-а-0-рибофуранозиладенозина, структурного элемента цоли(АОР-рибозы)" XIX Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления в физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 7-9 февраля, 2007) С. 40, сборник тезисов. 11 И.В, Куликова, Д.А. Мурадова, С.Н. Михайлов. "Синтез 2'-0-а-0-рибофуранозиладенозинг, структурного элемента поли(АОР-рибозы)" XV Международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Украина, Гурзуф; 3 \

мая - 10 июня, 2007) С. 320-321, труды XV Международной конференции и дискуссионного научного клуба 1Т+М&Ес'2007.

12. И,С. Варижук, И.В. Куликова, Д.А. Мурадова, С.Н. Михайлов. "Синтез дисахаридных нуклеозидов" XVI Международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Украина, Гурзуф, 31 мая - 9 июня, 2008) С. 223-224, труды XVI Международной конференции и дискуссионного научного клуба 1Т+М&Ес'2008.

13. A.JI. Захаренко, И.В. Куликова, С.Н. Михайлов, М.В. Суханова, О.И. Лаврик. "Ингибирование поли(АОР-рибозо)полимеразы-1 человека дисахаридными нуклеозидами - производными структурного элемента поли(АОР-рибозы)" IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая, 2008) С. 273, сборник тезисов.

14. А.Л. Захаренко, М.В. Суханова, М.М. Кутузов, С.Н. Ходырева, О.И. Лаврик, Г.Г. Чипов, О.В. Строганов, В.К. Швядас, И.В. Куликова, Г.В. Бобков, Е.В. Ефимцева, И.С. Варижук, С.Н. Михайлов, A.C. Ефремова, М.И. Даныпина, К.В. Мартынова, Н.Ф. Мясоедов, С.И. Шрам. "Поиск селективных ингибиторов поли(АОР-рибозо)-полимеразы J человека и определение их биологических и фармакологических свойств" Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 г в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 гг" (Москва, 8-10 декабря, 2008) С. 139-140, сборник тезисов.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, ИНТАС, программы РАН «Молекулярная и клеточная биология», Федерального агентства по науке и инновациям Российской Федерации (гос. контракт № 02.512.11.2247).

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 15.05.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,56 Печать авторефератов: 730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Куликова, Ирина Валерьевна

Список использованных сокращений

Введение

Глава 1. Дисахаридные нуклеозиды. Особенности структуры. Биологическая активность. Методы синтеза. Включение в олигонуклеотиды. (Обзор литературы)

1.1 Природные дисахаридные нуклеозиды

1.1.1. Поли(АОР-рибоза)

1.1.2. Минорные нуклеозиды - компоненты тРНК

1.1.3. Дисахаридные нуклеозиды в составе низкомолекулярных биологически активных соединений

1.2 Методы синтеза дисахаридных нуклеозидов

1.2.1. Конденсация дисахаридов с нуклеиновыми основаниями (N-гликозилирование)

1.2.2. Конденсация моносахаридов с нуклеозидами (О-гликозилирование)

1.3 Дисахаридные нуклеозиды в составе олигонуклеотидов

Глава 2. Пуриновые дисахаридные нуклеозиды. Синтез и свойства. (Обсуждение результатов)

2.1. Проведение реакции гликозилирования

2.2. Изучение стабильности 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-нуклеозидов в условиях реакции гликозилирования

2.3. Синтез 3'-0-Р~В-рибофуранозил-2'-дезоксиаденозина

2.4. Синтез 2'-0-а-0-рибофуранозилнуклеоздов

2.5. Ингибирование поли(АОР-рибозо)полимеразы-1 человека дисахаридными нуклеозидами - производными структурного элемента поли(АОР-рибозы)

Глава 3. Экспериментальная часть 76 Выводы 101 Список литературы

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

В работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и Международного Союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения:

Агр - 2'-0-р-В-рибофуранозиладенозин-5'-фосфат; BSA - N, 0-бис(триметилсилил)ацетамид;

COSY - correlation spectroscopy, методика двумерной гомоядерной корреляции; Grp - 2'-0-р-О-рибофуранозилгуанозин-5'-фосфат;

НМВС - heteronuclear multibond correlation, методика гетероядерной корреляции дальних взаимодействий;

1 1 ^

HSQC - heteronuclear single quantum coherence, методика гетероядерной ( Н- С) одноквантовой кореляции;

IC50 - half maximal inhibitory concentration, концентрация ингибитора, при которой активность фермента составляет 50 % от исходной; Ру - пиридин;

ROESY - Rotating frame Overhause Effect Spectroscopy, методика двумерной протон-протонной корреляция во вращающейся системе координат, основанная на ядерном эффекте Оверхаузера;

ТЮН - трифторметансульфоновая кислота; TIPDS - тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил; TMSOTf - триметилсилилтрифторметансульфонат; ДМСО - диметилсульфоксид; ДМФА — диметилформамид; ДХЭ - 1,2-дихлорэтан;

КССВ — константа спин — спинового взаимодействия;

ПАРП - поли(АБР-рибозо)полимераза;

ТГФ - тетрагидрофуран;

ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера.

Нумерация схем, таблиц и рисунков в экспериментальной части соответствует нумерации в обсуждении результатов. В обзоре литературы отдельная нумерация.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пуриновые дисахаридные нуклеозиды. Синтез и свойства"

Дисахаридные нуклеозиды - важная группа природных соединений. Эти соединения являются структурными элементами биополимеров, таких как тРНК и поли(АБР-рибоза), входят в состав антибиотиков и других биологически активных соединений, проявляя широкий спектр биологической активности - антибактериальные, противогрибковые, гербицидные, инсектицидные, противоопухолевые и антивирусные свойства. В этих соединениях имеется дополнительный моносахаридный остаток, присоединенный к одной из гидроксильных групп нуклеозида (3-гликозидной связью. Наличие дисахаридного остатка и гетероциклического основания определяет свойства соединений, родственные свойствам углеводов и нуклеозидов.

Анализ литературных данных показывает, что дисахаридные производные нуклеозидов изучены недостаточно хорошо. Это объясняется отсутствием простых и эффективных методов их синтеза. Возможны два пути получения дисахаридных нуклеозидов. Синтез может быть осуществлен конденсацией соответственно защищенного дисахарида с нуклеиновым основанием или реакцией нуклеозида с моносахаридом. Большинство нуклеозидных антибиотиков были синтезированы по первому пути [1]. Эта схема синтеза многостадийна. Возможность использования природных нуклеозидов существенно упрощает схему синтеза. В литературе известны несколько примеров образования О-гликозидной связи из частично защищенного нуклеозида и моносахарида. Однако выходы подобных реакций не превышали 20-40% из-за образования ряда побочных продуктов [1].

В нашей лаборатории был разработан метод получения 2'-0-p-D-рибофуранозилнуклеозидов [2, 3, 4]. В отличие от предыдущих синтезов выход дисахаридных нуклеозидов на стадии конденсации составлял 70-80% и реакция протекала стереоспецифично с образованием Р-аномеров. Разработанный метод был распространен на получение и других дисахаридных нуклеозидов [5-10].

С использованием этого метода был осуществлен первый химический синтез минорных компонентов тРНК - 2'-(9-(3-0-рибофуранозиладенозин-5'-фосфата (Агр) и 2'-О-Р-0-рибофуранозилгуанозин-5'-фосфата (Grp) [11-13]. Впервые синтезирован фрагмент тРНК, содержащий минорный нуклеотид Агр [14].

Следует отметить, что химические методы синтеза поли(АБР-рибозы) до последнего времени разработаны не были. Поли(АВР-рибоза) вовлечена в процессы модуляции структуры хроматина, репликации, транскрипции, репарации ДНК и дифференцировки клеток [15, 16]. Поли(АВР-рибоз)илирование белков катализируется несколькими полимеразами, которые постоянно и в значительном количестве имеются в клетке. Основным из этих ферментов является поли(АБР-рибозо)полимераза-1 (ПАРП-1). Она отвечает за синтез 90% поли(АОР-рибозы) в клетке [17]. В последние годы ведутся активные поиски ингибиторов полимеразы, которая является ферментом-мишенью для создания лекарственных препаратов. Представляется перспективным создание новых ингибиторов ПАРП-1 на основе дисахаридных нуклеозидов [18,19].

Целью настоящей работы явился синтез новых дисахаридных нуклеозидов для создания на их основе ингибиторов ПАРП-1. В ходе исследования решались следующие задачи: оптимизация ранее разработанного метода гликозилирования (определение оптимальных условий проведения реакции: температуры, катализатора, времени взаимодействия и т.д.), исследование устойчивости в условиях реакции N-гликозидной связи и используемых защитных групп; синтез 2'-(9-а-В-рибофуранозиладенозина -структурного элемента поли(АОР-рибозы) и его аналогов для изучения ингибиторных свойств синтезированных дисахаридных нуклеозидов в реакции, катализируемой ПАРП-1 человека.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Куликова, Ирина Валерьевна

выводы

1. Оптимизирован ранее разработанный в лаборатории метод получения дисахаридных нуклеозидов, исследовано влияние температуры, различных катализаторов на протекание реакции гликозилирования, устойчивости yV-гликозидной связи и используемых защитных групп. Установлено, что триметилсилилтрифторметансульфонат эффективно катализирует изомеризацию 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)нуклеозидов с образованием 2',3'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)производных.

2. Впервые осуществлен химический синтез 2'-0-а-О-рибофуранозиладенозина, структурного элемента поли(АВР-рибозы) и его аналогов, что открывает новые возможности для создания ингибиторов поли(АЕ)Р-рибозо)полимераз.

3. Разработан метод получения 3'-0-р-О-рибофуранозил-2'-дезоксиаденозина и его а-аномера с использованием реакции трансгликозилирования. Обнаружено, что в условиях реакции Орибозилирования А^-бензоил-5 '-О-т/?е/и-бутилдифенилсилил-2'-дезоксиаденозин подвергается эффективной аномеризации. Предложен механизм протекания этого процесса, связанный с неустойчивостью iV-гликозидной связи в присутствии кислот Льюиса.

4. В ходе работы синтезировано 29 новых соединений, структура которых подтверждена данными масс-спектрометрии, УФ-, КД- и ЯМР-спектроскопии. В ряду синтезированных соединений обнаружены ингибиторы рекомбинантной поли(АОР-рибозо)полимеразы-1 с IC50 Ю"5 М.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Куликова, Ирина Валерьевна, Москва

1. Lerner L.M. Synthesis and properties of various disaccharide nucleosides. // In: Chemistry of Nucleosidesand Nucleotides. Ed. Townsend L.B. N.Y.: Plenum Press. 1991, V. 2, P. 27-79.

2. Mikhailov S.N., De Bruyn A., Herdewijn P. Synthesis and properties of some 2-0-p-D-ribofuranosylnucleosides. II Nucleosides Nucleotides. 1995,14, P.481-484.

3. Mikhailov S.N., Efimtseva E.V., Rodionov A.A., Bobkov G.V., Kulikova I.V., Herdewijn P. Synthesis of 2-O-P-D-ribofuranosylnucleosides. // In: Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. N.Y.: John Wiley & Sons. 2006, Unit 1.14.1-1.14.19. Supplement 27.

4. Mikhailov S.N., De Clercq E., Herdewijn P. Ribosylation of pyrimidine 2'-deoxynucleosides. // Nucleosides Nucleotides 1996,15, P. 1323-1334.

5. Родионов А.А., Ефимцева E.B., Фомичева M.B., Падюкова Н.Ш., Михайлов С.Н. Дисахаридные нуклеозиды. Синтез пиримидиновых 5'-0-Р-Б-рибофуранозилрибо- и 2'-дезоксирибонуклеозидов. II Биоорган, химия. 1999,25, С. 203-210.

6. Efimtseva E.V., Bobkov G.V., Mikhailov S.N., van Aerschot A., Schepers G., Busson R., Rozenski J., Herdewijn P. Oligonucleotides containing disaccharide nucleosides. // Helv. Chim. Acta. 2001, 84, P. 2387-2397.

7. Гурская Г.В., Жухлистова Н.Е., Некрасов Ю.В., Бобков Г.В., Ефимцева Е.В., Михайлов С.Н. Дисахаридные нуклеозиды. Кристаллическая и молекулярная структура 2'-0-p-D-рибопиранозилцитидина. // Кристаллография 2005, 50, С. 440-444.

8. Rodionov А.А., Efimtseva E.V., Mikhailov S.N. Synthesis of 0-p-D-ribofiiranosyl-(l"-2')-adenosine-5"-0-phosphate. II Nucleosides Nucleotides 1999,18, P. 623-624.

9. Rodionov A.A., Efimtseva E.V., Mikhailov S.N., Rozenski J., Luyten I., Herdewijn P. Synthesis and properties of 0-p-D-ribofuranosyl-(l"-2')-adenosine-5"- O-phosphate and its derivatives. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2000,19, P. 1847-1859.

10. Efimtseva E.V., Shelkunova A.A., Mikhailov S.N., Nauwelaerts K., Rozenski J., Lescrinier E., Herdewijn P. Synthesis and properties of <9-P-D-ribofuranosyl-( 1' 2')-guanosine-5"-0-phosphate and its derivatives. // Helv. Chim. Acta 2003,86, P. 504-514.

11. D'Amours D., Desnoyers S., D'Silva I., Poirier G.G. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. // Biochem. J. 1999,342, P. 249-268.

12. Hassa P.O., Haenni S.S., Elser M., Hottiger M.O. Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and where are we going? // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006, 70, P. 789-829.

13. Суханова M.B., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Поли(АОР-рибозо)полимераза-1 -регулятор белково-нуклеиновых взаимодействий в процессах, возникающих при генотоксическом воздействии. // Молекулярная биология 2004,38, С. 834-847.

14. Curtin N.J. PARP inhibitors for cancer therapy. // Expert Rev. Mol. Med. 2005, 7, P. 1-20.

15. Jagtap P., Szabo C. Poly(ADP-ribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors. II Nat. Rev. Drug Discov. 2005, 4, P. 421-440.

16. Dictionary of Natural Products on CD-ROM. Version 9:2, February 2001. Chapman & Hall / CRC.

17. Knapp S. Synthesis of complex nucleoside antibiotics. // С hem. Rev. 1995,95, P. 1859-1876.

18. Nauwelaerts K., Efimtseva E.V., Mikhailov S.N., Herdewijn P. Disaccharide nucleosides, an important group of natural compounds. // In: Frontiers in Nucleosides and Nucleic Acids. Eds Schinazi R.F., Liotta D.C.:IHL Press. Tucker USA. 2004, P. 187-220.

19. Ефимцева E.B., Михайлов C.H. Дисахаридные нуклеозиды. // Успехи химии. 2004, 73, С. 435-448.

20. Efimtseva E.V., Kulikova I.V., Mikhailov S.N. Disaccharide Nucleosides and their Incorporation into Oligonucleotides. // Cur. Org. Chem. 2007,11, P. 337-354.

21. Ефимцева E.B., Куликова И.В., Михайлов C.H. Дисахаридные нуклеозиды важнаягруппа природных соединений. II Молекулярная биология. 2009, 43, С. 327-338.

22. Sugimura Т., Miwa М. Poly(ADP-ribose): historical perspective. // Mol. Cell. Biochem. 1994, 138, P. 5-12.

23. Ferro A.M., Oppenheimer N.J. Structure of a poly(adenosine diphosphoribose) monomer: 2'-(5"-phosphoribosyl)-5'-adenosine monophosphate. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978, 75, P. 809813.

24. Oppenheimer N.J., Sing M., Sweeley C.C., Sung S.J. Srere P.A. The configuration and location of the ribosidic linkage in the prosthetic group of citrate lyase (Klebsiella aerogenes). // J Biol Chem. 1979, 254, P. 1000-1002.

25. Schneider K., Dimroth P., Bott M. Identification of triphosphoribosyl-dephospho-CoA as precursor of the citrate lyase prosthetic group. // FEBSLett. 2000, 483, P. 165-168.

26. Hoenke S., Wild M.R., Dimroth P. Biosynthesis of triphosphoribosyl-dephospho-coenzyme A, the precursor of the prosthetic group of malonate decarboxylase. // Biochemistry. 2000, 39, P. 13223-13232.

27. Rozenski J., Crain P.F., Mc Closkey J.A. The RNA Modification Database: 1999 update. // Nucleic Acids Res. 1999,27, P. 196-197.

28. Rozenski J., Crain P.F., Mc Closkey J.A. The RNA Modification Database. University of Utah. //Available at: http://medlib.med.utah.edu/RNAmods/.

29. Keith G., Glasser A.-L., Desgres J., Kuo K.C., Gehrke C.W. Identification and strucctural characterization of 0-p-ribosyl-(l"-2')-adenosinc-5"-phosphate in yeast methionone initiator tRNA. // Nucleic Acids Res. 1990,18, P. 5989-5993.

30. Kiesewetter S., Ott G., Sprinzl M. The role of modified purine 64 in initiator/elongator discrimination of tRNAMet from yeast and wheat germ. // Nucleic Acids Res. 1990, 18, P. 46774682.

31. Glasser A.-L., Desgres J., Heitzler J., Gehrke C.W., Keith G. O-Ribosyl-phosphate purine as a constant modified nucleotide located at position 64 in cytoplasmic initiator tRNAsMet of yeasts. // Nucleic Acids Res. 1991,19, P. 5199-5203.

32. Basavappa R., Sigler P.B. The 3 A crystal structure of yeast initiator tRNA: functional implications in initiator/elongator discrimination. // EMBO J. 1991,10, P. 3105-3111.

33. Kiesewetter S., Ott G., Sprinzl M. The role of modified purine 64 in initiator/elongator discrimination of tRNAMet from yeast and wheat germ. // Nucleic Acids Res. 1990, 18, P. 46774682.

34. Forster C., Chakraburtty K., Sprinzl M. Discrimination between initiation and elongation of protein biosynthesis in yeast: identity assured by a nucleotide modification in the initiator tRNA. // Nucl. Acids Res. 1993,21, P. 5679-5683.

35. Isono K. Nucleoside antibiotics: structure, biological activity, and biosynthesis. // J. Antibiot. 1988,41, P. 1711-1739.

36. Isono K. Current progress on nucleoside antibiotics. // Pharmacol. Ther. 1991,52, P. 269-286.

37. Ubukata M., Kimura К., Isono К., Nelson C.C. Gregson J.M., McCloskey J.A. Structure elucidation of liposidomycins, a class of complex lipid nucleoside antibiotics. // J. Org. Chem.1992, 57, P. 6392-6403.

38. Knapp S., Morriello G.M., Doss G.A. Synthesis of the Liposidomycin Diazepanone Nucleoside. // Org. Lett. 2002,4, P. 603-606.

39. Knapp S., Morriello G.M., Nandan S., Emge T.J., Doss G.A., Mosley R.T., Chen L. Assignment of the Liposidomycin Diazepanone Stereochemistry. // J. Org. Chem. 2001, 66, P. 5822-5831.

40. Correa V., Riley A.M., Shuto S., Home G., Nerou E.P., Marwood R.D., Potter B.V., Taylor C.W. Structural determinants of adenophostin A activity at inositol trisphosphate receptors. // Mo I Pharmacol. 2001, 59, P.1206-1215.

41. Borissow C.N., Black S.J., Paul M., Tovey S.C., Dedos S.G., Taylor C.W., Potter B.V. Adenophostin A and analogues modified at the adenine moiety: synthesis, conformational analysis and biological activity. // OrgBiomol Chem. 2005,3, P. 245-252.

42. McCormick J., Li Y., McCormick K., Duynstee H.I., van Engen A.K., van der Marel G.A.,

43. Ganem В., van Boom J.H., Meinwald J. Structure and total synthesis of HF-7, a neuroactive106glyconucleoside disulfate from the funnel-web spider Hololena curta. II J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, P. 5661-5665.

44. Taggi A.E., Meinwald J., Schroeder F.C. A new approach to natural products discovery exemplified by the identification of sulfated nucleosides in spider venom. // J. Am. Chem. Soc. 2004,126, P. 10364-10369.

45. Kobayashi J., Doi Y., Ishibashi M. Shimofuridin A, a nucleoside derivative embracing an acylfucopyranoside unit isolated from the Okinawan marine tunicate Aplidium multiplicatum II J. Org. Chem. 1994, 59, P. 255-257.

46. Doi Y., Ishibashi M., Kobayashi J. Isolation and structure of shimofuridins B-G from the Okinawan marine tunicate Aplidium multiplicatum. II Tetrahedron 1994, 50, P. 8651-8656.

47. Stewart J.B., Bornemann V., Chen J.L., Moore R.E., Caplan F.R., Karuso H., Larsen L.K., Patterson G.M. Cytotoxic, fungicidal nucleosides from blue green algae belonging to the Scytonemataceae. И J. Antibiot. 1988, 41, P. 1048-1056.

48. Kim S.H., Yoo S.M., Park I.S., Kim Y.H. A new inosine disaccharide from the. crustacean Ligia exotica: isolation and structure elucidation by total synthesis. // J. Nat. Prod. 2000, 63, P. 1188-1191.

49. Seto H., Otake N., Sato S., Yamaguchi H., Takada K., Itoh M., Lu H.S.M., Clardy J. The structure of a new nucleoside antibiotic, capuramycin. // Tetrahedron Lett. 1988, 29, P. 23432346.

50. Flynn E.H., Hinman J.W., Caron E.L., Woolf Jr. D.O. The chemistry of amicetin, a new antibiotic И J. Am. Chem. Soc. 1953, 75, P. 5867-5871.

51. Shiomi К., Haneda К., Tomoda H., Iwai Y., Omura S. Cytosaminomycins, new anticoccidial agents produced by Streptomyces sp. KO-8119. II. Structure elucidation of cytosaminomycins A, В, С and D. II J. Antibiot. 1994,47, P. 782-786.

52. Shomura Т., Nishizawa N., Iwata M., Yoshida J., Ito M., Amano S., Koyama M., Kojima M., Inouye S. Studies on a new nucleoside antibiotic, dapiramicin. I. Producing organism, assay method and fermentation. H J. Antibiot. 1983,36, P. 1300-1304.

53. Nishizawa N., Kondo Y., Koyama M., Omoto S., Iwata M., Tsuruoka Т., Inouye S. Studies on a new nucleoside antibiotic, dapiramicin. II. Isolation, physico-chemical and biological characterization. II J. Antibiot. 1984,37, P. 1-5.

54. Hamill R.L., Hoehn M.M. Anthelmycin, a new antibiotic with anthelmintic properties. // J. Antibiot. 1964, Ser. A 17, P. 100-103.

55. Uchida K., IchikawaT., Shimauchi Y., Ishikura Т., Ozaki A. Hikizimycin, a new antibiotic. // J. Antibiot. 1971,24, P. 259-262.

56. Gonzalez A., Vazquez D., Jimenez A. Inhibition of translation in bacterial and eukaryotic systems by the antibiotic anthelmycin (hikizimycin) // Biochim. Biophys. Acta (BBA) Nucleic Acids and Protein Synthesis 1979, 561, P. 403-409.

57. Sakata, K., Sakurai Т., Tamura S. Structures of ezomycins B15 B2, CI, C2, D1 and D2. // Agric. Biol. Chem. 1977, 41, P. 2033-2039.

58. Sakata K., Uzawa J., Sakurai A. Application of carbon-13 n.m.r. spectroscopy to the structural investigation of ezomycins.// Org. Magn. Resonance 1977,10, P. 230-234.

59. Suzuki Y., Uchida K. Formation of p-galactosyl compounds of arabinosylcytosine in growing culture of Sporobolomyces singularis. II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994, 58, P. 639-643.

60. Uchida K., SuzukiY. Formation of 3'-(2-p-Galactosyl compounds of 5-bromouridine by Sporobolomyces singularis. И Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67, P. 643-645.

61. Auer C.A., Cohen J. D. Identification of a benzyladenine disaccharide conjugate produced during shoot organogenesis in petunia leaf explants // Plant Physiol. 1993,102, P. 541-545.

62. Grancharov K., Naydenova Z., Lozeva S., Golovinsky E. Natural and synthetic inhibitors of UDP-glucuronosyltransferase // Pharmacol. Ther. 2001, 89, P. 171-186.

63. Veal G.J., Back D.J. Metabolism of Zidovudine. // Gen. Pharmacol. 1995,26, P. 1469-1475.

64. Barbier O., Turgeon D., Girard C., Green M.D., Tephly T.R., Hum D.W., Belanger A 3'!azido-3'-deoxythimidine (AZT) is glucuronidated by human UDPglucuronosyltransferase 2B7 (UGT2B7). II Drug Metab. Dispos. 2000,28, P. 497-502.

65. Rooseboom M., Commandeur J.N.M., Vermeulen N.P.E Enzyme-Catalyzed Activation of Anticancer Prodrugs // Pharmacol. Rev. 2004, 56, P. 53-102.

66. Desmoulin F., Gilard V., Malet-Martino M., Martino R. Metabolism of capecitabine, an oral fluorouracil prodrug: (19)F NMR studies in animal models and human urine. // Drug Metab. Dispos. 2002,30, P. 1221-1229.

67. Watanabe K. A., Hollenberg D. H., Fox J. J. Nucleosides. LXXXV. Mechanisms of nucleoside synthesis by condensation reactions // J. Carbohydr. Nucleosides Nucleotides 1974,1, P. 1-37.

68. Vorbruggen H. Adventures in silicon-organic chemistry // Acc. Chem. Res. 1995, 28, P. 509520.

69. Vorbruggen H., Ruh-Pohlenz C. Handbook of Nucleoside Synthesis. N.Y.: Wiley. 2001.

70. Toshima K., Tatsuta K. Recent progress in O-glycosylation methods and its application to natural products synthesis. // Chem. Rev., 1993,93, P. 1503-1531.

71. Schmidt R.R. Synthsis of Glycosides // In: Comprehensive Organic Synthesis. Eds.: Trost B.M., Fleming I., Winterfeldt E. Oxford: Pergamon Press, 1991, V. 6, P. 33-64.

72. Kochetkov N.K. Recent developments in the synthesis of polysaccharides and stereospecificity of glycosylation reactions // In: Studies in Natural Products Chemistry. Ed. Atta-ur-Rahman Amsterdam: Elsevier, 1994; V. 14, P. 201-266.

73. Pellissier H. Use of O-glycosylation in total synthesis. // Tetrahedron 2005, 61, P. 2947-2993.

74. Knapp S., Gore V.K. Synthesis of shimofuridin nucleoside disaccharide. // J. Org. Chem. 1996,61, P. 6744-6747.

75. Duynstee H.I., Wijsman E.R., van der Marel G.A., van Boom J.H. Synthesis of 21-0-4"-O sorboyl)-a-L-fucopyranosyl.inosine: a shimofuridin analogue. // Synlett. 1996, P. 313-314.

76. Ning J., Xing Y., Kong F. A new and efficient strategy for the synthesis of shimofuridin analogs: 2'-0-(4-0-stearoyl-a-L-fucopyranosyl)thymidine and -uridine. // Carbohydr. Res. 2003, 338, P. 55-60.

77. Watanabe K.A., Matsuda A., Halat M.J., Hollenberg D.H., Nisselbaum J.S., Fox J.J. Nucleosides. 114. 5-O-Glucuronides of 5-fluorouridine and 5-fluorocytidine. Masked precursors of anticancer nucleosides. II J. Med. Chem., 1981,24, P. 893-897.

78. Suzuki Т., Tanaka S., Yamada I., Koashi Y., Yamada K., Chida N. Total synthesis of spicamycin amino nucleoside. // Org. Lett. 2000,2, P. 1137-1140.

79. Niewczyk A., Krzyzaniak A., Barciszewski J., Markiewicz W.T. Studies on the synthesis of O-ribosyl-adenosine a new minor nucleoside of tRNA // Nucleosides Nucleotides, 1991, 10, P. 635-638.

80. Markiewicz W.T., Niewczyk A., Gdaniec Z., Adamiak D.A., Dauter Z., Rypniewski W., Chmielewski M. Studies on synthesis and structure of O-P-D-ribofuranosyl(l"—>2')ribonucleosides and oligonucleotides. // Nucleosides Nucleotides 1998, 17, P. 411-424

81. Markiewicz W. T, Bartoszuk A. Transformation of rings containing tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl group an equilibrium process enlarging the scope of applications of the group // Bull. Polish Acad. Sci. 1984, N. 32, P. 453-461.

82. Yamaguchi Т., Saneyoshi M. Synthetic nucleosides and nucleotides. XXI. On the synthesis and biological evaluations of 2-deoxy-a-D-ribofuranosyl nucleosides and nucleotides. II Chem. Pharm. Bull 1984,32, P. 1441-1450.

83. Mikhailov S.N., Kulikova I.Y., Nauwelaerts K., Herdewijn P. Synthesis of 2'-0-a-D-ribofuranosyladenosine, monomeric unit of poly(ADP-ribose). // Tetrahedron 2008, 64, P. 28712876.

84. Kulikova I.V., Muradova D.A., Varizhuk I.S., Mikhailov S.N. Stereospecific Synthesis of 2'-O-a-D-ribofuranosylnucleosides. // Collection Symp.series 2008,10, P. 155-158.

85. Nogami I., Arai Y., Yoneda M. Process for the production of purine derivatives. // Japan Kokai Tokkyo Koho 1974, 74-117689. Chem. Abstr. 1973, 78, P. 27900.

86. Munakata Т., Shirahata K., Hayashi T. Process for the production of 5'-(P-D-galactosyl)-inosine. И Japan Kokai Tokkyo Koho 1972, 72-23599. Chem. Abstr. 1975, 82, P. 153800.

87. Suzuki Y., Uchida K. Formation of p-galactosyl compounds of arabinosylcytosine in growing culture of Sporobolomyces singularis. I I Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994, 58, P. 639-643.

88. Suzuki Y., Uchida K., Fujimori S. Formation of adenosine p-galactosides by p-galactosidase. // Nippon Nogeikagaku Kaishi (in Japanese) 1974, 48, P. 605-611. Chem. Abstr. 1975, 82, P. 134727.

89. Suzuki Y., Uchida K. Formation of inosine P-galactosides by p-galactosidase.-// Nippon Nogeikagaku Kaishi (in Japanese) 1976,50, P. 231-236. Chem. Abstr. 1976, 85, P. 74157.

90. Suzuki Y., Uchida K., Formation of uridine p-galactosides by p-galactosidase.-;// Nippon Nogeikagaku Kaishi (in Japanese), 1976 50, P. 237-242. Chem. Abstr. 1976, 85, P. 74158.

91. Binder W. H., Kahlig H., Schmid W. Galactosylation by use of beta-galactosidase: enzymatic syntheses of disaccharide nucleosides. // Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, P. 1703-1710.

92. Huang H., Chopra R., Verdine G.L., Harrison S.C. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance // Science 1998, 282, P. 1669-1675.

93. Ермолинский B.C., Михайлов C.H. Реакция периодатного окисления в химии нуклеиновых кислот. Диальдегидные производные нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов. // Биоорган, химия 2000,26, С. 483-504.

94. Михайлов С.Н., Ефимцева Е.В. Дисахаридные нуклеозиды и олигонуклеотиды на их основе: новые инструменты исследования ферментов метаболизма нуклеиновых кислот. Биохимия. 2002,67, С. 1374-1384.

95. Гриценко О.М., Громова Е.С. Диальдегидсодержащие нуклеиновые кислоты и их компоненты: синтез, свойства, аффинная модификация белков. // Успехи химии 1999, 68, С. 267-278.

96. Tunitskaya V.L., Rusakova E.E., Memelova L.V., Kochetkov S.N., van Aerschot A.,

97. Herdewijn P., Efimtseva E.V., Ermolinsky B.S., Mikhailov S.N. The mapping of T7 RNA113polymerase active site with novel reagents oligonucleotides with reactive dialdehyde groups. // FEBSLett. 1999,442, P. 20-24.

98. Mikhailov S.N., Rozenski J., Efimtseva E.V., Busson R., van Aerschot A., Herdewijn P. Chemical incorporation of 1-methyladenosine into oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 2002. 30, P. 1124-1131.

99. Bobkov G.V., Brilliantov K.V., Mikhailov S.N., Rozenski J., van Aerschot A., Herdewijn P. Synthesis of oligoribonucleotides containing pyrimidine 2'-0-(hydroxyalkoxy)methyl.-ribonucleosides. // Collection Czech. Chem. Comm. 2006, 71, P. 804-819.

100. Bobkov G. V., Mikhailov S. N., van Aerschot A., Herdewijn P. Phosphoramidite building blocks for efficient incorporation of 2'-0-aminoethoxy(and propoxy)methyl-nucleosides intoroligonucleotides. // Tetrahedron 2008, 64, P. 6238-6251.

101. Варижук И.С., Куликова И.В., Мурадова Д.А., Михайлов С.Н. Синтез дисахаридных нуклеозидов. // Труды XVI Международной конференции и дискуссионного научного клуба IT+M& Украина, Гурзуф: 2008, С. 223-224.

102. Куликова И.В., Мурадова Д.А., Михайлов C.H. Стабильность 3', 5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)нуклеозидов в присутствии кислот Льюиса. // Вестник МИТХТ, 2008,3, С. 90-95.

103. Markiewicz W.T. Tetraisopropyldisiloxane-l,3-diyl, a group for simultaneous protection of З'-and 5'-hydroxy functions of nucleosides. И J. Chem. Res. (S) 1979, P. 24-25.

104. Verdegaal C.H.M, Jansse P.L., de Rooij J.F.M., van Boom J.H. Acid-catalysed isomerization of the tetraisopropyldisiloxane-l,3-diyl group. Simultaneous protection of two secondary alcoholic functions. // Tetrahedron Lett. 1980,21, P. 1571-1574.

105. Davies D.B. Conformations of Nucleosides and Nucleotides. // Progress in NMR-Spectroscopy V1978,12, P. 135-225.

106. Kulikova I.V., Varizhuk I.S., Bobkov G.V., Efimtseva E.V., Mikhailov S.N. Effective Anomerisation of 2'-Deoxyadenosine and Thymidine Derivatives. // Collection Symposium series 2005, 7, P. 425-427.

107. Oivanen M., Hovinen J., Lehikoinen P., Lonnberg H. Hydrolysis of the N-glycosidic bond of nucleosides and nucleotides. // Trends Org. Chem. 1993, 4, P. 397-412.

108. Blunden S.J., Gusack P.A., Smith P.J. The use of tin compounds in carbohydrate and nucleoside chemistry. // J. Organomet. Chem. 1987,325, P. 141-152.

109. Vorbruggen H., Ruh-Pohlenz C. Synthesis of nucleosides. // In: Organic Reactions. Ed. Paquette, L.A. N.Y.: Wiley. 2000; V. 55, P. 1-630.

110. Rosemeyer H., Seela F., Toth G. Assignment of anomeric configuration of D-ribo-, arabino-, 2 '-deoxyribo-, and 2 ',3 '-dideoxyribonucleosides by NOE difference spectroscopy. // Nucleosides Nucleotides 1989, 8, P. 587-597.

111. Robins M.J., Robins R.K. The synthesis of 2'-deoxy-9-a- and p-D-ribofuranosylpurines and the correlation of their anomeric structure with proton magnetic resonance spectra. // J. Am. Chem. Soc. 1965, 87, P. 4934-4940.

112. Куликова И.В., Михайлов C.H. Синтез 2'-0-а-0-рибофуранозиладенозина, структурного элемента поли(АОР-рибозы) И XIX Зимняя молодеоюная научная школа "Перспективные направления в физико-химической биологии и биотехнологии" сборник тезисов М: 2007, С. 40.

113. Куликова И.В., Мурадова Д.А., Михайлов С.Н. Синтез 2'-0-a-D-рибофуранозиладенозина, структурного элемента поли(АГ)Р-рибозы) // Труды XV Международной конференции и дискуссионного научного клуба ГГ+М&Ес'2007 Украина, Гурзуф: 2007, С. 320-321.

114. Hansske F., Madej D., Robins M.J. 2' And З'-ketonucleosides and their arabino and xylo reduction products: Convenient access via selective protection and oxidation of ribonucleosides. // Tetrahedron 1984, 40, P.125-135.

115. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М: Мир. 1976, С. 437-444.

116. Ti G.S., Gaffney B.L., Jones R.A. Transient protection efficient one-flask syntheses of protected deoxynucleosides. II J. Am. Chem. Soc. 1982.104. P. 1316-1319.

117. Флетчер Ф. Г. Методы химии углеводов. М: Мир. 1967, С. 126.

118. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, ИНТАС, программы РАН «Молекулярная и клеточная биология», Федерального агентства по науке и инновациям Российской Федерации (гос. контракт № 02.512.11.2247).