Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Процессы гидролиза лигноцеллюлозсодержащего сырья и микробиологическая конверсия продуктов в анаэробных условиях

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Процессы гидролиза лигноцеллюлозсодержащего сырья и микробиологическая конверсия продуктов в анаэробных условиях"

На правах рукощср

-"'С/ л у

/' .у

АБЛАЕВ АЛЕКСЕИ РАВИЛЬЕВИЧ

Процессы тдролиза лнгноцеллюлозсодержащего сырья и микробиологическая конверсия продуктов в анаэробных условиях

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

13 НОЯ 2014

Казань-2014

005554834

005554834

Работа выполнена на кафедре химической кибернетики федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет» (ФГБОУ ВПО «КНИТУ»)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор,

Емельянов Виктор Михайлович

Официальные оппоненты:

Панфилов Виктор Иванович, доктор технических наук, профессор, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Российский химико-технологический университет имени: Д.И. Менделеева», кафедра «Биотехнология», заведующий кафедрой

Минзанова Салима Тахиятулловна, кандидат технических наук, доцент, федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова» КазНЦ РАН, технологическая лаборатория, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северный (Арктический) федеральный университет имени М. В. Ломоносова», г. Архангельск

Защита состоится 24 декабря 2014 г в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 212.080.02 при ФГБОУ ВПО «Казанский национааьный исследовательский технологический университет» (420015, г. Казань, ул. К. Маркса, д.68, Зал заседаний Ученого совета - каб. 330).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» и на сайте www.kstu.ru.

Автореферат диссертации разослан 29 октября 2014 г.

Ученый секретарь i^YUl/? Степанова

диссертационного совета Д 212.080.02 Светлана Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Переработка возобновляемого растительного сырья в промышленно важные химические вещества, в частности органические кислоты, представляет большой практический интерес. Экономически целесообразно использовать углеводы, содержащиеся в дешевом и широко распространенном растительном сырье. Масляная кислота широко применяется в различных отраслях промышленности: для производства пластмасс, пластификаторов, лаков, духов, фармацевтических препаратов и дезинфицирующих средств. Химический синтез масляной кислоты из нефтепродуктов применяется главным образом из-за приемлемой себестоимости производства и доступности исходных материалов. Микробиологический синтез масляной кислоты с использованием маслянокислых бактерий рода Clostridium в настоящее время привлекает Бее больше внимания из-за растущих цен на нефть, истощения ее природных запасов и необходимости защиты окружающей среды от загрязнения продуктами химического синтеза.

Многотоннажной ресурсной базой лигноцеллюлозосодержащего сырья в России являются березовый опил и свекловичный жом. Однако, бактерии не способны эффективно утилизировать полисахариды растительной биомассы без предварительного расщепления последних до моно- и олигосахаридов. Перспективность применения сернистой кислоты для предобработки растительного сырья была продемонстрирована ранее на примере пшеничной соломы и свекловичного жома. Показана более высокая эффективность сернистой кислоты при обработке пшеничной соломы по сравнению с серной и возможность её регенерации за счет тепла, запасенного в гндролизате. Таким образом, разработка технологических основ процессов переработки березового опила и свекловичного жома с применением сернистой кислоты и целлюлолитического ферментного комплекса, а также оценка возможности микробиологической конверсии полученных гидролизатов в анаэробных условиях с использованием бактерий рода Clostridium является актуальной задачей. , . -

Целью настоящей работы являлось исследование и оптимизация процессов гидролиза березового опила и свекловичного жома, а также конверсия продуктов гидролиза в анаэробных условиях бактериями Clostridium butyricum и Clostridium tyrobutyricum.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи:

1. Определить оптимальные условия обработки березового опила разбавленной сернистой кислотой при температурах выше 190 °С и охарактеризовать моносахаридный состав полученных гидролизатов.

2. Определить оптимальные условия ферментативного гидролиза березового опила, предварительно обработанного разбавленной сернистой кислотой.

3. Исследовать гидролиз свекловичного жома при температурах свыше 190 °С и охарактеризовать моносахаридный состав полученных гидролизатов.

4. Разработать математическую модель выхода моносахаридов в процессе предобработки свекловичного жома разбавленной сернистой кислотой.

5. Оценить эффективность биосинтеза масляной, молочной кислот и бутанола Clostridium butyricum ВКПМ В-9617, В-9619 и Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406, В-9615 при использовании в качестве субстратов кислотных и ферментативных гидролизатов березового опила и свекловичного жома.

Научная новнзна:

- впервые исследованы и оптимизированы процессы предобработки березового опила с применением разбавленной сернистой кислоты и изучено её влияние на последующий ферментативный гидролиз;

- впервые экспериментально оценены параметры процессов предобработки свекловичного жома с применением разбавленной сернистой кислоты при температурах свыше 190 °С, определен моносахаридный состав полученных гидролизатов и разработана математическая модель выхода моносахаридов в процессе предобработки;

- впервые исследованы высококонцентрированные гидродлизаты березового опила и свекловичного жома для ферментации бактерий рода Clostridium.

Практическая значимость работы.

Показано, что предобработка березового опила сернистой кислотой позволяет получать гидролизаты с концентрацией редуцирующих веществ до 8,9 %, что будет способствовать снижению энергетических и приведенных затрат при их дальнейшем использовании в микробиологической промышленности.

Разработанная математическая модель позволит выявить основные закономерности предобработки свекловичного жома сернистой кислотой во всем интервате изменений технологических параметров, выбрать оптимальные ргжимы, спрогнозировать параметры, способствующие более высокому выходу и качеству целевого продукта.

Полученные гидролизаты растительного сырья могут быть использованы в качестве источника углерода в составе питательных сред при культивировании бактерий рода Clostridium с получением масляной кислоты.

Кислотные гидролизаты березового опила могут быть использованы для получения фурфурола.

Достоверность полученных результатов обеспечивается метрологическими характеристиками поверенных измерительных приборов, применением стандартных экспериментальных методик, статистических методов обработки результатов, проверкой на воспроизводимость и отсутствием противоречий с ранее известными данными.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на XIII Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2014 г.), на научно-

технической конференции ФГБОУ ВПО «КНИТУ» 2014 г, международной научной конференции: «Рациональное использование природных биологических ресурсов» (Рим, 2014 г.), X Международной научно-практической конференции «Современные достижения в науке» (Прага, 2014 г.), Международной научной конференции «Биотехнологии в химико-лесном комплексе» (Архангельск, 2014 г.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК, 4 доклада на международных конференциях.

Лнчный вклад автора заключается в выполнении основного объема работ, изложенных в диссертации, включая разработку методик, проведение, обработку и интерпретацию экспериментальных и расчетных исследований, анализ и оформление результатов в виде публикаций и научных докладов. Соавторы не возражают против использования результатов исследований в материалах диссертации.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, заключения и списка использованной литературы. Материал изложен на 123 страницах текста и содержит 24 таблицы и 35 рисунков. Список литературы включает 163 источника.

Автор выражает благодарность к.т.н., ассистенту кафедры химической кибернетики ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» Хариной Марии Владимировне за помощь в выполнении экспериментальных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность темы, отмечается научная новизна и практическая значимость исследования, изложены общие сведения о решаемых исследовательских задачах.

В первой главе представлен обзор отечественных и зарубежных научных публикаций, посвященных проблеме использования ли гноцеллюлозосодержащих ресурсов России. Описаны метаболические пути образования продуктов биосинтеза маслянокислых бактерий рода Clostridium.

Вторая глава содержит описание объектов, методов исследования и применяемого оборудования. В работе изучались два вида сырья: опил березы, полученный на ОАО «Зеленодольский лесозавод» и свекловичный жом, полученный на ООО «Буинский сахарный завод». Ферментативный гидролиз объектов исследования проводили препаратом «CellicCTec2» компании «Novozymes». Культивирование проводили с использованием штаммов из коллекции ВКПМ: Clostridium butyricum ВКПМ В-9617, ВКПМ В-9619 и Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406, ВКПМ В-9615. Моносахаридный анализ гидролизатов проводили с помощью метода высокоэффективной жидкостной анионообменной хроматографии на колонке «CarboPac РА-1» (4 х 250 мм, «Dionex», США), используя импульсный амперометрический детектор PAD («Dionex»), а также на хроматографе системы

«Alliance» фирмы WATERS с рефрактометрическим детектором Waters 2414, на колонке Reprosil-Pur NH2 (4 х 250 мм, «Dr. Maisch GmbH», Германия). Содержание бутанола, ацетона, этанола, масляной и молочной кислот в культуральной жидкости определяли методом газохроматографического анализа с использованием хроматографа «Shimadzu» GC-17A (Япония), оснащенного автосамплером A(jC-20i, пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой Agilent (0,32 х 3000 мм, «Supelco», США). Измерения проводили в трех повторностях. Погрешность определения не превышала 10,0 % относительных.

Третья глава посвящена изучению процессов предобработки и ферментативного гидролиза лигноцеллюлозосодержащего сырья, а также построению математической модели кинетики процесса высокотемпературной предобработки свекловичного жома разбавленной сернистой кислотой. Предобработку березового опила проводили в диапазоне температур 190-250 °С при варьировании концентрации сернистой кислоты от 0,6 до 2,5 % масс (рис. 1). Как видно из графиков (рис. 1 а-в), повышение температуры в большей степени, по сравнению с повышением концентрации кислоты, способствовало сокращению продолжительности обработки, необходимой для достижения максимального выхода редуцирующих веществ (F'B).

Проахлжнтмымстъ гндрмша. мин ►~100*С -X-2IÜ "С -*г220°С -О-ц0«С

а ,

г:

Продолжительность пароли»«, иин -V- 190 "С -Ф-200 °С *2Ю»С -*- 220 "С -О-230 °С

Продолжительность, мин

в г

Рисунок 1 - Изменение концентрации РВ в гидролизатах березового опила: а) гидромодуль 1:3,5, концентрация сернистой кислоты 0,60 % масс; б) гидромодуль 1:3,5, концентрация сернистой кислоты 1,18 % масс; в) гидромодуль 1:3,5, концентрация сернистой кислоты 2,50 % масс % масс; г) концентрация сернистой кислоты 1,77 % масс, температура 250 °С

Время, необходимое для достижения максимальной концентрации РВ в гидролизате при температуре 250 °С составило 4 минуты. С повышением концентрации сернистой кислоты наблюдается увеличение скорости распада Сахаров. Оптимальной является концентрация сернистой кислоты 1,77 % масс. С целью

определения оптимальных условий проведена предобработка березового опила 1,77 % масс, сернистой кислотой при температуре 250 °С при варьировании гидромодуля от 1:3 до 1:5 (рис. 1 г).

Оставшуюся после предобработки твердую фракцию, отделяли центрифугированием и промывали в течение 10 минут четырехкратным объемом дистиллированной воды, нагретой до 90 °С. Данная обработка позволила

дополнительно увеличить выход РВ (рис. 2).

■1«

11 зо _

я а п I

ii -Я. Ml

л " 4Snmv% ШШШШ ШШЯВШШ

1:3 1:3.5 1:5 1:5.8 VV ШШШШ

Гааро модуль г«л«м46,8

С в процесс« гидролиза ■ при обряботыс водой

8 об тай выход

Рисунок 2 - Выход РВ при предобработке Рисунок 3 - Моносахаридный состав березового опила раствором сернистой гидролизата березового опила (концентрация кислоты концентрацией 1,77 % масс при сернистой кислоты 1,77 % масс, 250 °С, температуре 250 °С и разном гидромодуле гидромодуль 1:3,5 продолжительность

обработки 4 минуты)

Наибольший выход РВ достигнут при гидромодуле 1:3,5, 1:5 и 1:5,8 и составил 26,8 %, 27,0 % и 29,2 % соответственно. Моносахаридный состав гидролизатов был представлен преимущественно глюкозой и ксилозой (рис. 3), концентрация которых достигала в гидролизатах 27 г/л и 21 г/л соответственно .Для характеристики углеводов, извлекаемых при предобработке березового опила сернистой кислотой был определен их моносахаридный состав (таблица 1).

Таблица 1 - Моносахаридный состав гидролизатов березового опила при варьировании концентрации сернистой кислоты от 0,6 до 1,77 % масс при гидромодуле 1:3,5 в диапазоне температур от 200 до 250 °С*___

Температура, = 3 с 5 1 О ; s 3 сл 3 5 е-я * Время, мин Содержание моносахаридов Суммарное содержание моносахаридов в гидролизатах, мг/мл

рамноза арабиноза галактоза глюкоза ксилоза

мг/мл Ь мг/мл мг/мл ■X Зй мг/мл & мг/мл * *

200 0,6 10 2,7 4,8 1,1 2,1 3,6 5,7 18,8 29,8 29,8 55,9 56,50

210 1,18 5 2,0 4,1 0,9 2,1 2,9 5,4 143 26,4 26,9 59,4 48,70

230 0,6 5 2,3 4,1 1,1 2,1 3,4 5,4 18,5 29,7 29,6 56,8 56,13

240 0.6 5 1,6 3,9 0,8 2,0 2,4 5,2 11,0 23,8 24,8 64,1 41,16

240 1,18 5 2,3 3,7 0,9 1,6 3,1 4,6 29,8 43,6 26,2 46,0 62,78

250 1,18 4 1,7 3,1 0,7 1,5 2,5 4,1 25,5 42,1 24,1 47,8 55,37

250 1,77 4 1,3 2,4 0,6 1,2 1,9 3,4 27,0 46,8 21,4 44,6 53,21

* погрешность реализации экспериментов при хроматографировании не превышала 10 % относительных % по отношению к другим моносахаридам в гидролизате. моль %

Во всех гидролизатах преобладали глюкоза и ксилоза, содержание которых варьировало от 23,8 до 57,7 моль % и от 14,2 до 29,8 моль % от суммы моносахаридов соответственно.

Полученный после центрифугирования осадок подвергали гидролизу ферментным комплексом «СеШсСТес2». Предварительно была определена активность компонентов ферментного комплекса «СеШсСТ'ес2» (таблица 2). Наибольшую активность в комплексе проявляли р-глюканаза, карбоксиметилцеллюлаза, ксиланаза и целлобиаза. Ферментативный гидролиз сырья проводили в натрий-цитратном буфере рН 5,0 при температуре 50 °С.

Белок, мг/мл карбоксиметилцеллюлаза единиц/мл Р-глюканаза, единиц/мл РРА*, единиц/мл авицелаза, единиц/мл целлобиаза, единиц/мл ксиланаза, единиц/мл р-глюкозидаза, единиц/мл Р -ксилозидаза, единиц/мл

220±6,6 3430±68,2 3700+93,0 130+3,1 70±3,5 880+28,1 2490±99,1 1210±42,1 <1

- единиц фильтровальной бумаги/мл ферментного препарата

Дозировка ферментного комплекса варьировала от 4 до сухого вещества (АСВ) березового опила (рис. 4).

6 % от абсолютно

'Афермент» о

'А фермент* о

Продолжительность, > г кассы АСВ березового о;

■ массы АСВ березового 01

■ массы АСВ березового 01 АСВ березового опила. н<

го

«

60

Првлмчтлшосп. ч % ферме«т> ет АСВ (ереиаого осж.о 4ермгаг< сг АСВ 4(ре>»»ого «ал % фермеата п АСВ Ьре»м>го »пал. в( иедмргмт

V. от АСВ С*рт

I I I

15предобработка сернистой кислотой С ферментативный тндролго ■ обшиЛ выход

Рисунок 4 - Изменение концентрации и выход РВ при ферменголизе березового опила, предварительно обработанного сернистой кислотой, при варьировании дозировки ферментного комплекса и гидромодуля: а - гидромодуль 1:30; б - гидромодуль 1:20; в -гидромодуль 1:15; г — выход РВ (дозировка ферментного комплекса 5 % от АСВ березового опила, продолжительность гидролиза 76 ч.)

Из данных, представленных на рисунке 4 (а-в), оптимальной является дозировка ферментного комплекса 5 % от АСВ березового опила, так как её увеличение до 6 % не приводило к существенному увеличению выхода РВ.

Следует также отметить, что предобработка березового опила сернистой кислотой позволила значительно увеличить выход РВ (в 26,7 раз) по сравнению с опилсм, не подвергавшимся предобработке. Изучение влияния гидромодуля при ферментолизе на выход РВ показало, что его снижение от 1:30 до 1:15 приводит к увеличению концентрации РВ в гидролизате от 2,8 до 3,6 %, однако выход РВ при этом снижается от 55,2 до 39,04 % соответственно. Суммарный выход РВ при двухсгадийной обработке березового опила составил 82,0 % от АСВ березового опила.

Оптимальными условиями ферментолиза березового опила являлись: гидромодуль 1:30, дозировка ферментного комплекса 5% от АСВ березового опила, pH 5,0, температура 50 °С.

В настоящей работе впервые была изучена кинетика предобработки свекловичного жома сернистой кислотой в диапазоне температур 200-230 °С и охарактеризован моносахаридный состав полученных гидролизатов (таблицы 3-4). Таблица 3 - Концентрация редуцирующих веществ в гидролизатах свекловичного жома (1 % масс, сернистая кислота, гидромодуль 1:3)

Продолжительность Температура, °С

предобработки, мин 200 220 230

3 5,58

5 6,53 7,50 5,83

1Ü 5,67 3,80 2,93

15 5,15 2,21 1,63

20 4,98 1,77 1,54

...- в данных точках измерения не проводились

Таблица 4 - Моносахаридный состав гидролизатов, полученных при предобработке свекловичного жома*

u ¡ X к 2 к S <и о. И Содержание моносахаридов Суммарное содержание моносахаридов в гидролизатах, мг/мл

Температура. "< Концентрацш H2SOj, % масс 1 рамноза | арабнноза галактоза глюкоза ксилоза галактуро-новая кислота

мг/мл мг/мл мг/мл fe ! мг/мл fe мг/мл %** мг/мл

200 1,0 10 1,4 9,4 5,0 29,7 3,1 18,4 5,0 29,6 1,7 ] 12,3 0,1 0,6 15,5

200 1,0 20 0,6 5,8 2,9 32,7 0,7 6,9 4,8 45,5 0,6 ; 6,8 0,2 2,1 9,8

* погрешность реализации экспериментов при хроматографированин не превышала 10 % относительных ** % по отношению к другим моносахаридам в гидролизате, моль %

На основании полученных данных было проведено моделирование процесса предобработки свекловичного жома с образованием моно- и олигосахаридов с использованием упрощенных формально-кинетических моделей, включающих псевдогомогенные необратимые реакции первого порядка:

1 схема Саймана: Р > С кг > продукты деструкции

2 схема, включающая стадию образования водорастворимого олигомера, (Г. Гонзалес и соавторы): Р —> О —> С ——> продукты деструкции

где Р, О, С - полисахаридах, промежуточные продукты (олигосахариды, декстрины) и моносахариды соответственно; к], к\, к, - константы скорости распада соответствующего полисахарида, промежуточного продукта и деструкции моносахарида соответственно.

Выход моносахаридов с учетом их распада определялся по формулам: схема

схема 2: ^ц,.*; !>*'•'-»-*'•'

(к,-к,) 1 к,-к, к'.-к[ I

где [Ро] - начальная концентрация соответствующего полисахарида; [Со] - начальная концентрация моносахарида; I - продолжительность процесса предобработки (мин); ц - коэффициент пересчета соответствующего полисахарида в моносахарид. Константы скорости реакций рассчитывались по формуле:

где А - предэкспоиенциальный множитель (мин1); Еа - энергия активации (КДж моль1); Т - температура (К); Сса, - концентрация кислотного катализатора (моль л1); а - показатель степени по катализатору.

Степень достоверности аппроксимации кинетических данных оценивалась с помощью критерия детерминации (Я1). В результате проведенного исследования были установлены кинетические параметры процесса деполимеризации легкогидролизуемых полисахаридов свекловичного жома разбавленной сернистой кислотой. Поскольку константы скорости распада олигомера намного выше, чем константы его образования (к\ » к,), то соответствии с методом стационарных состояний концентрация промежуточных продуктов была принята неизменной во

времени: 40] ,0, что позволило использовать более простую модель Саймана с

л

минимальным числом стадий. В таблице 5 представлены результаты моделирования выхода и деструкции моносахаридов свекловичного жома по модели Саймана (Сса,=0,59-1,66% масс; Т=180 °С-190 °С).

Таблица 5 - Кинетические параметры предобработки свекловичного жома разбавленной сернистой кислотой

Мономер А, (мин'1) Е | (КДжмоль1) Я1 Аг (мин"') ^(КДжмоль1) <*2 л-

глюкоза 2.06 Е+05 53.4 0.83 2.99Е+03 30.3 0.81 0.73

галактоза 4.64Е+08 81.5 1.41 3.34Е+08 75.4 1.13 0.83

арабиноза 4.07Е+11 107.2 1.09 2.67Е+07 64.5 0.90 0.82

Достаточно высокие значения критерия /?' (таблица 5) позволяют сделать вывод, что модель Саймана качественно описывает выход моносахаридов

свекловичного жома во всем интервале изменений технологических параметров. В таблице 6 приведены константы скоростей образования и деструкции моносахаридов свекловичного жома.

Таблица 6 - Константы скорости предобработки свекловичного жома (Сса, = 1 % масс; Т=180°С)

Моносахарид K,.102(min')4 Xi.lCOmn1)

глюкоза 2.477 1.760

галактоза 0. 952 0.623

арабиноза 1. 800 1.468

С помощью модели исследовано влияние температуры процесса и концентрации кислоты на эффективность предобработки (рис. 5). На основе вычислительного эксперимента определены оптимальные области параметров процесса, для которых модель предсказывает существенный относительный рост выхода моносахаридов (таблица 7).

1, МИН 1. мин i мин

Рисунок 5 - Влияние температуры процесса и концентрации катализатора на скорость распада полисахаридов свекловичного жома; ♦ - 170°С; • - 180°С; А- 190°С; ■-200°С; — - model.

Таблица 7 - Оценка эффективности процесса по результатам моделирования*

t.MHH глюкоза ксилоза арабиноза

Т,С Т,С Y,% Т,С У,% |

■ 1 230 63% 230 77% 230 83%

3 220 45% 230 67% 230 63%

5 220 36% 230 53% 220 40%

10 210 12% 220 21% 200 10%

'относительно выхода моносахарида при Т=190 С, Ска1= 1%.

Разработанная математическая модель процесса предобработки свекловичного жома может быть применима при моделировании и описании закономерностей предобработки березового опила сернистой кислотой.

Четвертая глава посвящена сбраживанию гидролизатов свекловичного жома и березового опила штаммами бактерий С. ЬШупсит и С. IугоЬмупсит. Кривые роста С. ЬШупсит и С. (угоЬШупсит, выращенных на средах, содержащих различные типы растительных гидролизатов, а также на глюкозосодержащей среде М55, представлены на рисунке 7.

а 6

Рисунок 6 - Кривые роста штаммов на различных видах субстратов: а) ВКПМ В-9619: ♦ - среда МЭ8; ■ - ферментолизат березового опила 25 об. %; ферментолизат свекловичного жома 25 об. %; • - кислотный гидролизат березового опила 50 об. %; А - кислотный гидролизат свекловичного жома 50 об. %. б) среда МБЗ:»- ВКПМ В-9619, 0 - ВКПМ В-9615; д - ВКПМ В-10406; кислотный гидролизат березового опила 50 об. %: • - ВКПМ В-9619, ♦ - ВКПМ В-9615, ▲ - ВКПМ В-10406. На графике представлены усредненные значения трех экспериментов. Погрешность измерений 5 %.

Скорость роста бактерий и уровень накопления биомассы при выращивании на средах, содержащих 50 об. % кислотных гидролизатов, существенно ниже, чем на среде МББ и на ферментолизатах. Это объясняется ингибирующим действием побочных продуктов кислотной предобработки, таких как фурфурол, оксиметилфурфурол, карбоновые кислоты, фураны и фенольные соединения. Ферментативные гидролизаты растительного сырья более пригодны для культивирования клостридий, по сравнению с кислотными. Кривые роста культуры В-9619 на ферментативных гидролизатах и на глюкозосодержащей среде в

первые 18 часов культивирования практически совпадают. Прекращение роста бактерий после 18-20 часов культивирования на ферментативных гидролизатах объясняется более низким содержанием Сахаров по сравнению со средой М55. Кислотные гидролизаты свекловичного жома и березового опила более целесообразно применять для получения таких ценных продуктов как фурфурол. При выращивании С. ЬиГупсит и С. ¡утЬи/упсит на средах, содержащих растительные гидролизаты, основными продуктами ферментации были: масляная, уксусная и молочная кислоты, бутанол и этанол. Состав продуктов метаболизма исследуемых штаммов клостридий на ферментативных гидролизатах растительного сырья приведен в таблице 8. При сбраживании глюкозы, три из четырех исследуемых штаммов бактерий синтезировали бутират. при этом максимальная концентрация бутирата в среде (4,39 г/л) и выход близкий к теоретическому максимуму (47,8 % от утилизованных Сахаров) был зафиксирован для С. (угоЬшуггсит ВКПМ В-9615.

Однако, степень утилизации глюкозы этим штаммом составила всего 21,34 %, что может свидетельствовать о низкой скорости метаболизма. Максимальная концентрация масляной кислоты (1,12 г/л), выход (26,8 % от утилизованных Сахаров) и степень утилизации Сахаров (45,8 %) были достигнуты при сочетании

ферментолизата свекловичного жома, исходно содержащего 9,12 г/л углеводов (с преобладанием глюкозы, ксилозы, сахарозы и арабинозы) и С/£Шпс/ш'т Ьигу/йсит В-9619. При этом соотношение бутират/бутанол в составе продуктов брожения составило 1,24, что более чем в 10 раз превышает таковое при сбраживании сред, содержащих только глюкозу (0,11). Необходимо отметить, что при этом синтез масляной кислоты был сопряжен с утилизацией ацетата из питательной среды. Полученные нами экспериментальные данные позволяют предположить, что при ферментации сложных субстратов С. ЬШугюит ВКПМ В-9619 и С. 1угоЬигупсит ВКПМ В-10406 используют ацетат в качестве субстрата для синтеза масляной кислоты. Наибольшие содержание и выход бутанола наблюдались для С. Ьмугюит ВКПМ В-9619 (7,68 г/л и 20,7 % от утилизованных Сахаров соответственно): степень утилизации глюкозы этим штаммом составила 89,17 %. При выращивании ВКПМ В-9619 на кислотном гидролизате березового опила выход бутанола достигает 48,5 % от утилизируемых культурой углеводов. Соотношение бутанол/бутират в составе продуктов брожения, полученных ВКПМ В-9619 на растительных гидролизатах, составляет 0,8-3,0, а на среде МвЗ оно составляет 8,9.

Таблица 8 - Анализ процессов микробиологической конверсии ферментолизатов

Источник углеводов Штамм Углеводы Состав продуктов брожения

Исходное количество, г/л Утилизировано

г/л % Бутттрат Бутанол, г/л Этанол, г/л Ацетат. г/л*' Лакгат

г/л Выход, %' г/л Выход, %• г/л Выход. %•

Среда МЭБ ВКПМ В-9617 36,89 12,21 33,09 0 0 0 0 0 • 1,99 2,25 18,24

ВКПМ В-9619 41,60 37,10 89,17 0,86 2,3 7,68 20,7 0,14 -1,40 0,33 0,9

БКПМ В-9615 43,02 9,18 21,34 439 47,8 0.02 0,2 0,05 •1,93 0,13 1,4

ВКПМ Н-10406 42.93 24,73 57.60 3,06 12,37 0,02 0,08 0.04 -1,60 0,1 0,4

Ферменголщаг березового опила 50 об. % ВКПМ В-9617 20,39 0,4 5 2,2 0 0 0 0 0,14 0,01 0 0

ВКПМ 11-9619 17,39 14,06 80,9 1,02 7,3 3,11 22,1 0,16 •0,86 0 0

ВКПМ В-9615 22,96 4,5 19,6 0 0 0 0 1,08 0,12 0 0

Ферментолнзат свек-ловнчногожома 50 об % ВКПМ 11-9619 10,48 5,54 52,9 0,90 16,2 1.44 26,0 0,20 •0,40 0 0

ВКПМ Н-10406 10,59 3.15 29,8 0,01 0,3 0 0 0,3 0,1 2,85 87,7

Ферменголшат свек-ловичногожома 25 об- % ВКПМ В-9619 9,12 4.1« 45,8 1.12 26,8 0.9 21,5 0,21 -0,37 0 0 1

* - от утилизованных Сахаров; ** «+» количество ацетата произведенного культурой: «-» утилизировано из исходного содержания ацетата в среде (3 г/л)

Штамм С. Ьшупсит ВКПМ В-9617 при выращивании на кислотных гидролизатах свекловичного жома 100 % утилизируемых углеводов конвертировал в лактат (1.7 г/л). Это может быть обусловлено высокой акгивностью у ВКПМ В-9617 фермента лактатдегидрогеназы, а также тем, что образование лактата в бактериальной клетке является кратчайшим путем регенерации и возвращения в клеточный метаболизм НАД+, затраченного при образовании пирувата. Преимущественное образование лактата также наблюдается у С. ¡угоЬшупсит ВКПМ В-10406 при использовании в качестве источника углерода ферментативного гидролизата свекловичного жома.

На основании проведенных исследований может быть предложена следующая принципиальная технологическая схема переработки растительного сырья (рис. 7).

й 11 к *4 J ......-Л9

6 П#<ь К Центрифуге 16 «ормотслимр 6 Обсзлигнянсмюя масс '! 1. исляслоэюв юсса !&. «*'»

г несос 7 0«ис»«э 1?. Кокденсагэр ,2. Диосил серь 7. Лнгьим I? ©срмект 17 Пек WW***»

3. ©ильт^ 8 Gipyfc&fp оммдигею S3 'н/рачкр 1В. ие»<тр«фу(а .3. Оалто» 8. Сарнисый гз:1 13 Гесраь»5

4. Насос 9 Ко>||!««д-ор J4- HdOJC 19. 5«хжйкгор 1. чи-Юн 9. Ccpwcias кислота 11. Ф«рмвиоялзат

S Пдроаои «с«" 10. flen-iwfcfKaToo .15.1"и>ыр- пресс Ь ЬРРРКЛЬ'Й ОЛЮ 10. Гндролиз-зг 15. К»п.г«Ло»эа аддюсть

Рисунок 7 - Принципиальная технологическая схема переработки березового опила и свекловичного жома

ВЫВОДЫ

1. Определены оптимальные режимы предобработки березового опила (температура 250 °С, гидромодуль 1:3,5, концентрация сернистой кислоты 1,77 % масс, продолжительность 5 мин, позволившие в 26,7 раз повысить выход редуцирующих веществ при последующем ферментативном гидролизе. Общий выход редуцирующих веществ при предобработке сернистой кислотой и последующем ферментативном гидролизе березового опила составил 82,0 % от АСВ березового опила.

2. Установлены оптимальные режимы ферментативного гидролиза березового опила, предварительно обработанного сернистой кислотой (гидромодуль 1:30, дозировка ферментного комплекса 5% от АСВ березы, рН 5,0, температура 50 °С). Показано, что в составе ферментолизатов березового опила, получаемых при обработке препг.ратом «CellicCTec2» преобладала глюкоза, содержание которой составило 28,25 г/л.

3. Охарактеризован моносахаридный состав гидролизатов свекловичного жома при температурах свыше 190°С.

4. Разработана математическую модель выхода моносахаридов в процессе предобработки свекловичного жома разбавленной сернистой кислотой.

5. Проведена оценка эффективности биосинтеза масляной, молочной кислот и бутанола штамми Clostridium butyricum и Clostridium tyrobutyricum при использовании в качестве субстратов кислотных и ферментативных гидролизатов березового опила и свекловичного жома. Максимальные концентрация масляной

кислоты (1,12 г/л), выход (26,8 % от утилизованных Сахаров) и степень утилизации Сахаров (45,8 %) были достигнуты при сочетании ферментативного гидролизата свекловичного жома, исходно содержащего 9,12 г/л углеводов (с преобладанием глюкозы, ксилозы, сахарозы и арабинозы), и штамма Clostridium butyricum В-9619. При этом соотношение бутират/бутанол в составе продуктов брожения составило 1,24, что более чем в 10 раз превышает таковое при ферментации сред, содержащих только глюкозу (0,11).

6. Штамм С. butyricum ВКПМ В-9617 при выращивании на кислотных гидролизатах свекловичного жома 100 % утилизируемых углеводов конвертировал в лактат (1,7 г/л).

7. С. butyricum лучше сбраживает растительные гидролизаты, со сложным моносахаридным составом, по сравнению с С. tyrobutyricum, который из углеводов, входящих в состав исследуемых субстратов, утилизирует лишь ксилозу и глюкозу. Количество углеводов, потребленных С. butyricum из ферментативных гидролизатов, варьирует от 45,8 до 80,9 %. Тогда как степень утилизации углеводов для С. tyrobutyricum не превышает 29,8 %. Штамм С. butyricum ВКПМ В-9619 наиболее перспективно использовать для получения масляной кислоты на гидролизатах свекловичного жома и березового опила.

Основное содержание диссертационной работы изложено в публикациях: в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Шагивалеев И. В. Универсальная установка для исследования процессов гидролиза лигноцеллюлозного сырья / И. В. Шагивалеев , С. Г. Мухачев , В. М. Емельянов, М. В. Харина , А. Р. Аблаев , А. С. Понкратов /У Вестник Казанского технологического университета. 2014. №3. С. 182 - 183.

2. Аблаев А. Р. Оценка эффективности биосинтеза масляной кислоты при культивировании бактерий Clostridium butyricum и Clostridium tyrobutyricum на гидролизатах березового опила и свекловичного жома / А. Р. Аблаев, М. В. Харина, О. В. Березина, С. В. Рыков, С. В. Яроцкий, В. М. Емельянов // Биотехнология. 2014. №4. С. 31-37

3. Харина М. В. Динамика выхода углеводов при высокотемпературном гидролизе пшеничной соломы сернистой кислотой / М. В. Харина. В. М. Емельянов, А. Р. Аблаев, Н. Е. Мокшина, Н. Н. Ибрагимова Т. А. Горшкова // Химия растительного сырья. 2014. №1. С. 53-59.

4. Аблаев А. Р. Перспективы переработки возобновляемого растительного сырья с получением масляной кислоты / А. Р. Аблаев, М.В. Харина, И. В. Логинова В.М. Емельянов // Вестник Казанского технологического университета. 2014. Лв 14. С. 328333

5. Аблаев А. Р. Исследование кинетики гидролиза свекловичного жома сернистой кислотой при температурах свыше 200 °С / А. Р. Аблагв. И. В. Логинова, М.В.

-

Харина, В.М. Емельянов // Вестник Казанского технологического университета. 2014. №14. С. 339-342

6. Аблаев А. Р. Высокотемпературный гидролиз березового опила сернистой кислотой / А. Р. Аблаев, II. А. Храмова, И.З. Гайфуллина, М.В. Харина, В.М. Емельянов // Вестник Казанского технологического университета. 2014. №14. С. 344347

7. Аблаев А. Р. Большая нефть и биотопливо / А. Р. Аблаев // Биотехнология. 2011. №3. С. 8-14.

Прочие публикации и материалы конференций:

8. Мустафина Э. Ф., Аблаев А. Р., Тарасова Е. В., Харина М.В. Перспективы использования биотехнологий в аграрной сфере Единого Экономического Пространства. М.: ООО «Угрешская типография», 2014. 136 с.

9. Аблаев А.Р. Топливо и химия из возобновляемого сырья: перспективы развития в России // Вестник Химической Промышленности. 2012. № 2. С. 37-39

10. Аблаев А.Р. Математическое моделирование выхода моносахаридов в процессе предобработки пшеничной соломы / А.Р. Аблаев, Л.И. Клещевников, И.В. Логинова, М.В. Харина, В.М. Емельянов // Материалы международной научной конференции: «Рациональное использование природных биологических ресурсов», Рим, (12-19 апреля 2014 г.) часть 1. М.: «Академия естествознания». 2014. С. 210-211.

11. Клещевников Л.И. Имитационное моделирование температурных режимов предобработки растительного сырья / Л.И. Клещевников, А.Р. Аблаев, И.В. Логинова, М.В. Харина, В.М. Емельянов // Materiäly X mezinärodni v6decko - prak:ickä konference «Moderni vymozenosti v£dy - 2014». - Dil 31. Chemie a chemicka technologie.Zemipis a geologie.: Praha. Publishing House «Education and Science» s.r.o. 2014. С.64-67.

12. Аблаев А.Р. Определение оптимальных параметров гидролиза березовых опилок сернистой кислотой / А.Р. Аблаев, М. В. Харина, И.А. Храмова, В.М. Емельянов. И.З. Гайфуллина // XIII Международная конференция молодых ученых <:Пищевые технологии и биотехнологии» (15-17 апреля 2014 г.) сб. тез. докладов. Казань: «Отечество». 2014. С. 48.

13. Храмова И.А. Определение оптимальных параметров предобработки березовых опилок сернистой кислотой / H.A. Храмова, А.Р. Аблаев, М. В. Харина. В.М. Емельянов, И.З. Гайфуллина //Международная научная конференция «Биотехнологии в химико-лесном комплексе» (11-12 сентября 2014 г.) сб. тез. докладов. Архангельск: ИДСАФУ. 2014. С. 318-320.

_Заказ /4У _Тираж 100 экз.

ИЗДАТЕЛЬСТВО КАЗАНСКОГО НАЦИОНАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Офсетная лаборатория Казанского национального исследовательского технологического университета. 420015, Казань, К. Маркса, 68