Проточно-инжекционные биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов и клеток. Закономерности их функционирования

Симонян, Александр Людвигович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Проточно-инжекционные биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов и клеток. Закономерности их функционирования
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Проточно-инжекционные биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов и клеток. Закономерности их функционирования"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСИ® ЛРОЕКТНО-КОНСТРЖГОРСКИИ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ

шохимш

На правах рукописи

Симонян Александр Людвигович

УДК 577.17+543.9

ПРОТОЧНО-ИШЕХ1ШОННЫЕ БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ И КЛЕТОК. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИХ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ.

(03.00.23 - биотехнология)

ДИССЕРТАЦИЯ В ФОРМЕ НАУЧНОГО ДОКЛАДА НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

МОСКВА -- 1992

Работа выполнена в лаборатории Оиосенсоров Ереванского

физического института.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук доктор технически}: наук доктор химических наук

A.Н.Егоров

B.Е.Матвеев А.И.Ярополов

Релушая организация - Московский химико-гехнологшесм институт им. Д.И.Менделеева, кафедра биотехнологии.

Зашита состоится " " 1993 года в 10 часов на заседаю

специализированного Совета Д:093.07.01 Научнс>-исследовагельско1 проектно-конструкторекого института прикладной биохимии по адрес; 125299 . г.Москва, ул. Клары Цеткин, д. 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в Сиблиоте! В(ШИКИ прикладной биохимии.

Диссертация разослана " " !992 г.

Отзывы на диссертацию, заверенные гербовой печатью, прос: направлять на имя ученого секретаря специализированного Совета.

Ученый секретарь специализированного Советл. Д 07.01 ., кандидат бисюгичес лих наук

К Л].Гусева

л -Г, . .. II

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Задача определения концентрации раз-:ичных органических веществ актуальна для многих областей науки и рактики. Особенно трудно решается эта задача при определении кон-.ентрации сложных органических соединений в многокомпонентных раст-орах.

Благодаря успехам, достигнутым в области инженерной энзимоло-т, за последние два десятилетия разработаны подходы в создании но-ых аналитических систем и устройств - ферментных электродов, фер-ентных анализаторов, биосенсоров, - общим для которых является ис-ользование иммобилизованных биокатализаторов - ферментов, клеток икроорганизмов. органелл, рецепторов, и т.д..

Любое аналитическое устройство на основе иммобилизованных иокатализаторов состоит из преобразователя концентрация - физико-имический сигнал и детектора, регистрирующего этот сигнал. Аналити-еские системы на основе иммобилизованных биокатализаторов мтешо азделить на два типа. В первом из них преобразование концентрация -игнал осуществляется в области, непосредственно примыкающей к поверхности датчика. Примером таких устройств являются ферментные лектроды.

Ферментные электрода открыли новую эпоху в решении задач, вязанных с безреагентным определением концентрации различных мета-олитов, однако км присущ и целый ряд недостатков, ограничивающих их ркменение. Презде всего следует отметить часто встречающийся эффект нгпбирования ферментов продуктами реакции. Так. например, перекись одорода, являющаяся продуктом многих оксидазных реакций, окисляет иоловие группы, приводя к потере активности фермента. И поскольку ремл контакта продуктов реакции с ферментом в мембранах большое, ремя жизни таких мембран невелико (по литературном данным не более ОднеЯ). При замене ферментативных мембран они часто повреждаются, ругим недостатком, характерным для ферментных электродов, является рудность их использования для определения концентрации того или иого метаболита в пробах, содержащих клетки микроорганизмов, напри-эр, в кульгуральной зшдкости ферментеров, поскольку такие пробы яв-жтся "потребителями" растворенного кислорода за счет дыхания кле-ок. Исследованигтаких образцов с помощью ферментных электродов, ис-эльзухщих оксидоредуктазы, весьма затруднительно, так как ввиду злого объемл измерительной камеры скорость потребления кислорода

- г -

микроорганизмами сравнима со скоростью развития полезного сигнала Следует также отметить, что существенным фактором в функционирова нии ферментных электродов является массоперенос через мембрану, на кладывающий определенные ограничения на толщину мембраны и ее ката литшескую активность. И, наконец, в некоторых типах непроточны анализаторов проба вводится непосредственно в измерительную ячейку помощью шприца-дозатора. При этом, ввиду малого объема измерительно ячейки (около 1 мл) и быстрого ответа (5-7с) точность измерена становится зависимой от скорости введения пробы.

Вторым типом аналитических систем являются проточнс инфекционные анализаторы на основе колоночных миниреакторов. Впервь такие системы были описаны в работе Хикса и Алдайка (НЮкя аг ирнке, :%6). В отличие от ферментных электродов, в проточнс инфекционных аналититических системах ферментативное превращен» субстрата происходит в объеме, пространственно отделенном от лете* тирующего элемента, благодаря чему такие системы в значительно степени свободны от недостатков, присущих ферментным электродам Однако создание таких систем и реализация их преимуществ связана решением целого ряда научных, конструкторских и технологических вс .тросов, чему и была посвящена данная работа.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы было создание многс целевой проточно-инжекционной системы на основе иммобилизованш Сиокатализаторов для безреагентного определения концентрации разли1 ных метаболитов. Процесс исследования сводился к решению ряда бол* частных задач, включающих в себя:

-выбор класса биокатализаторов (оксидоредуктазы, гидролазы, и т.д и соответствующего ему метода регистрации сигнала; -выявление источников новых биокатализаторов , их получение и изуч( ние свойств, разработка методов их иммобилизации с учетом особенное тей проточных систем:

-исследование и разработал проточно-инжекшгонных систем; -создание методик применения проточно-инжекционных систем в промы ленности и научных исследованиях;

-создание конструкторской документации и организация опытного прои водства анализаторов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.В результате проведеных работ: -сформулированы основные принципы создания многоцелевых проточи кнжекционных биосенсоров на основе ферментов класса оксидоредуктаз

<шых микробных клеток. изучены закономерности их функционирования: гайдены новые микроорганизмы, характеризующиеся высокими активное-тми ферментов уратоксидаза и лизш-2-монооксигеназа и получены нектрофоретические чистые препараты этих ферментов; дзучены кинетические особенности поведения ферментов уратоксидаза и гоин-2-монооксигеназа;

язученно поведение ферментов в различных фазах (лштосомы. обращение мицеллы. тонкие- пленки), предложен новый метод определения эоницаемости лотосом для субстратов, показана принципиальная воз-эжность создания новых механохимических биосенсоров; зыделен новый штамм Pseudomonas put Ida, специфически окисляющий золин и впервые создан биосенсор для определения концентрации эолина:

федложен принцип параллельного расщепления субстрата в аналитичес-эй системе с использованием двух разных ферментов, расщепляющих хт и тот же субстрат, благодаря чему на порядок увеличен диапазон гределяемых концентраций лизина.

. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Создан и выпускается малыми партиями югоцелевой прогочно-игекекционный анализатор "МУЛЬТИФЕРМ", применя-шй в научных исследованиях, клинической практике, микробиологичес-)й промышленности. Разработан многоцелевой анализатор "АРФА" с псропроцессорной системой обработки результатов, создана консгрук->рская документация на него. Разработаны биочувствительные элементы и определения глюкозы, лизина, мочевой кислоты, пролина, гидрохита. пирокатехина, этанола, метанола. Создан Оиочувствительный зле-¡нт с расширенным диапазоном для определения лизина на основе двух :сидоредуктаз - лизин-2-монооксигеназы и лизмн-а-оксидазы. Разрабо-1ны лабораторные регламенты получения ферментов лизин-2->нооксигеназа и уратоксидаза. Созданы методики определения концен-¡ации глюкозы, лизина, мочевой кислоты, этанола, пролина в различ-tx биологических и технологических жидкостях (кровь, сыворотка, льтуральная жидкость ферментеров, кормовой концентрат лизина, но).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации докладывались на 1ГЛ Республиканской учной сессии по вопросам биофизики. Ереван. 1982г.. IY Симпозку-! по медицинской энзимологют, Алма-Ата, 1983г., IY Международном мпозиуме "Использование иммобилизованных ферментов для получения

пищи и б медицине" Таллинн, 1984г., I Республиканской конферен; по проблемам физико-химической биологии и биотехнологии, Ерев; 1984г.. I Всесоюзной конференции "Кинетика и механизмы электрон» переноса в белковых системах и их моделях", Вильнюс. 1985г., У, У УН Всесоюзных симпозиумах по инжененерной энзимологии (Кобуле' 1985г., Каунас, 1988г., Москва. 1991г.). II Республиканской ко» ренции по проблемам физико-химической биологии и биотехнолог: Ереван,1986г., Международном симпозиуме "Ферменты в аналитик1 Ной-Бранденбург (ГДР).. 1986г., Международном симпозиуме по аминок: лотам, Ереван, (НИТИА), 1986г., Международном симпозиуме "ХимиЧ' кая физика ферментативного катализа". Таллинн. 1987г., 1У Всесоюз: конференции "Аминокислоты для сельского хозяйства, пищевой пром ленности, медицины и научных исследований", Ереван, 1988г., Республиканской конференция "Достижения физико-химической биологи биотехнологии и пути их внедрения", Ереван, 1989г., 19-ой конфер цю ФЕЕО, Рим (Италия), 1989г. Международном симпозиум по биохи ческой инженерии, Штуттгарт (ФРГ), 1990г., Международной симпози по биоаналитическим методам, Прага,1990г., Всесоюзной конферен "Новые направления биотехнологии", Пущино, 1990г., Всесоюзной к ференцш "Современные методы выделения, очистки и идентификации м робных метаболитов", Пущино, 1991г., 15-ом Международном конгре по биохимии, Иерусалим, 1991г., 15-м меадународном специализиров ном симпозиуме по дрожжам, Рига. 1991., XIV Международной конфер ции по когерентной и нелинейной оптике ( КиН0'91), Ленингр 1991г., Международном симпозиуме по биосенсорам, Москва, 1992г.

Испытания анализаторов проводились: -на Чаренцаванском, Трипольском и Обольском биохимзаводах. "Армбиотехнология", Институте микробиологии им. А.Кирхенштейна Латвии, Кафедре хим.энзимологии МГУ, Научно-исследовательском инс туте антибиотиков и биотрансформации (НШАБ) (Росток, Чехословага для определения концентрации I-лизина;

-в НПО "Диагностика" Ш Армении, в ЦДЛ I Ленинградского мед. инс туга, кафедре хим.энзимологии МГУ. НШАБ (Росток, Чехословакия для определения концентрации глюкозы.

Анализаторы успешно функционируют в Институте биохимии А.Н.Баха, НПО "Биотехнология", кафедре хим.энзимологии МГУ, Чape^ ванском заводе "Лизин". НИТИА. Железнодорожной больнице г.Еревг Институте медицинской радиологии-г.Еревана.

На базе анализатора "АРФА" на Чаренцаванском заводе "Лизин" {едрен лабораторный регламент определения лизина. Совместно с НПО ¡[тагносгика" МЗ РА разработана методика определения концентрации гасозы в крови и сыворотке.

Анализатор "Мультиферм" выпускается малыми партиями НПК Зиосенсор" Ереванского физического института.

Анализатор "АРФА" в 1988 году награжден серебряной медалью [НХ СССР.

ПУБЛИКАЦИИ.По теме диссертации опубликовано 53 работы,в том юле 4 авторских свидетельства на изобретение.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА. Автором сформулированы основные идеи и стулаты, в результате которых проведены соответствующие исследова-я и осуществлена разработка анализаторов. Все основные методики следований, планирование и обработка экспериментов, конструктор-ие разработки, а также организация производства анализаторов и очувствительных элементов осуществлены при личном участии автора, совместных работах, представленных в рамках настоящей диссертации, явственная доля принадлежит автору данной работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ • Методология работы. Для выделения ферментов и исследования зико-химических свойств биокагализаторов использовались методы цсостной хроматографии, гель-электрофореза, ультрацентрифугирова-I, амперометрии, оптической и флуоресцентной спектроскопии.

Учитывая сложность исследуемых систем особое внимание уделя-!Ь статистической обработке результатов и представительности ис-;дуешх выборок.

1. ПОЛУЧЕНИЕ БИОКАГАЛИЗАТОРОВ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК.

При создании аналитических систем на основе иммобилизованных катализаторов существенным вопросом является выбор класса приме-мого биокатализатора. От этого выбора зависит тип второго важней-о элемента системы - детектора. В ферментных электродах (биосенах) описано применение многих классов существующих ферментов, лиз литературы, однако, показывает, что наиболее целесообразно, 5енно для проточно-инжекционных аналитических систем, в качестве катализаторов использовать оксидоредуктазы. С одной стороны, это

обусловлено тем, что они стабильны, обладают высокой каталитическо активностью, а с другой - распространенность оксидоредуктаз очен: велика, они высокоепецифично катализируют большое число разнообраз ных реакций, т.е. практически всегда можно найти соответствуйте требуемому субстрату фермент. Кроме того, при использовании оксидо редукгаз не требуется вводить в сисему кофакторы, что делает анали практически безреагентным; В последнее время наметилась тенденция открытию целого ряда новых оксвдоредуктаз, особенно оксидаз амино кислот, что стимулировало создание на их основе новых аналитически систем. Немаловажным является то обстоятельство, что Кларковски кислородный электрод является хорош отработанной стабильной систе мой, удовлетворявшей большинству требований, предъявляемых детектору в проточно-шжекционных сисемах.

1.1. Поиск новых источников биокатализаторов.

Ферменты, и особенно оксидоредуктазы, являются основными ком понентами практически всех биоконверсионных систем в хатой природе Наиболее приемлемыми на сегодняшний день источниками биокатализато ров можно считать микроорганизмы и грибы. Благодаря широкой распрос траненности, сравнительной дешевизне, легкости получения биомасс эти источники являются сегодня преобладающими в биотехнологии.

Анализ литературы, существующей к моменту начала наших иссле дований, показал, что основными субстратами, определяемыми с помощь биосенсоров на основе оксидоредуктаз, являлись глюкоза, лактат, эте нол, сахароза, некоторые аминокислоты. В то же время, из-за отсуа ствия соответствующих оксидоредуктаз не было создано биосенсоров ¡а определения лизина, пролина. Сравнительно труднодоступным был тага фермент уратоксидаза, необходимый для анализа мочевой кислоты.

Лизин-5-ионооксигеназа.(ЛМО)

Индуцибельный фермент £-лизин-2-монооксигеназа, катализируи щий уникальный путь окисления Х-лизина только у бактерий виде Раеийотопаз и открытый более четверти века назад, является весь? привлекательным для использования в аналитических системах в связи его высокой специфичностью по отношению к ¿-лизину. ЛМО окислж лизин согласно следующей схеме: ЛМО ..

Ь-лизин + -;- 6-ашновалерамид + С02 + Н^О

Для выявления штамма-продуцента нами было исследовано Сол'

30 различных потенциальных источников лизин-2-монооксигеназы среди гакроорганизмов рода Pseudomonas. У трех из них была обнаружена шзин-2-монооксигеназная активность, а штамм Pseudomonas putIda ВКМ 458 обладал удельной активностью 30 ед/г биомассы.

Уратоксидаза (УО)

Уратоксидаза является первым ферментом у различных организмов I цепи катаболизма мочевой кислоты. Ее окисление молекулярным кислородом осуществляется согласно схеме:

УО

Мочевая кислота + Og + 2HgO - Аллантоин + HgOg + С02

Отсутствуя в организме человека. УО содержится в организмах ногих животных и ряде микроорганизмов.

Фермент был получен нами из Bacillus fastidiosus путем инду-ирования активности выращиванием на среде, содержащей в качестве аинственного источника углерода и азота мочевую кислоту. Удельная стивность составляла 350 ед/г биомассы.

Клетки Pseudomonas put Ida, специфически окисляющие пролин.

Хотя в литературе имеется немало сообщений о ферменте пролин-юидаза, детальный анализ показал, что в основном речь ша лишь о зсвенных данных, подтверждавших существование этого фермента. По-кдамому именно из-за этого до настоящего времени не существовало госенсора на пролин. В результате сканирования нескольких классов жрооргангомов нами был выявлен штамм Pseudomonas put Ida, с высокой :оростью окислякишй пролин. Штамм был получен в результате культи-грования клеток на среде, содержащей пролин в качестве единственно> источника углерода и азота. Фермента, осуществлявшего специфичес->е окисление пролина. обнаружить не удалось.

1.2.Получение биокатализаторов и изучение их свойств.

1.2.1.Ферменты.

Выделение и очистку JIMO и УО осуществляли с применением обще-инятых методов.

ЛИзин-2-монооксигеназа■ Молекулярная масса фермента по дан-м гельфильтрацш и электрофореза в присутствии DS-Na была равна 8 кДа, причем показано, что ЛМО является тетрамером, состоящим из гырех одинаковых субъединиц с молекулярной массой 67 кДа каждая, еле очистки удалось получить фермент с удельной активностью 14,6 мг. Согласно данным ультрацентрифугированкя ферментный препарат

был гомогенен и шел константу седиментации 9.9 S. Методом гон слойной хроматографа показано, что коферментом ЛМО является Р причем на моль фермента приходилось 4 моля FAD. Спектр поглоще имел пики при 275, 280, 386 и-462 нм. Фермент обладал флуоресценц с пиком при 530 нм при волне возбуждения длиной 460 нм и с пиком 520 нм при волне возбуждения длиной 360 нм. f^ для кислорода б равна 6,5 10~4М, для лизина - 2,3 10~4М. Зависимость скорости ф ментативной реакции от концентрации кислорода хорошо линеаризовал в двойных обратных координатах. Зависимость же скорости от конц трации лизина имела сигмоидный характер и при низких концентрац лизина не линеаризировалась (рис.1). Основываясь на данных элект

V' мкммь-мин o.isi а

1/V, мин ившь

0(161 у

о 0.4 о. в 1.:

СЧмМ

-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 ,12 1/S, ыМ

Рис.1. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентра лизина, а - в прямых координатах, б в двойных обратных координа

фореза в присутствии различных концентраций лизина можно предпо жить, что фермент в ходе каталитического процесса не претерпев значительных структурных изменений. Изменяется лишь конформация тивного центра в результате нейтрализации заряда аллостерическ центра, расположенного вблизи активного центра ЛМО. Введение в ср активаторов ЛМО - лейцина и метионина приводит к исчезновению сиг идностй кинетической кривой (рис.2,а).

Изучение зависимости- активности ЛМО от рН проводилось трех различных концентрациях лизина (рис.2,6). Как видно из рисун скорость ферментативной реакции максимальна в К-фосфатном буфер растворе.

V, мкмоль-лпш"1 0.4 г з

*"' Р о

/ /

о.г

о ^___

/ / 1

V чшоль мин

0.3

0.1

1 ,4-

0.75 1.5

[.\и:шн!, мМ

1__ 7

10 „II 1>П

Рис.2, а - зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации лизина в присутствии активаторов: 1 - без активатора; 2 -

10 М лейцина; 3 - 10 М метионина. б - зависимость активности ЛМО от рН. 1 -20мМ, 2 - 2мМ, 3 - 0.2мМ лизина; * - К-фосфатный буфер, о - глицин-КОН буфер.

Весьма интересной оказалась способность ЛМО трансформировать оксиг'еназную активность в оксидазную под действием химической модификации парахлормеркурибензоатом (ПХМБ). Это, по-видимому, обусловлено связыванием модификатора с БН-группами активного или регуля-торного центров фермента. Оксигеназная актийность восстанавливалась до 80% при обработке меркаптозтанолом, при этом оксидазная активность полностью утрачивалась.

Уратоксидаза- Молекула уратокскдазы является тетрамером, состоящим из одинаковых или попарно одинаковых субъединиц. Молекулярный вес фермента, определенный различными методами, составил 125 кДа. рН оптимум в Трис-НС1 и борко-<5оратном буферах- 9,2. Изучение термостабильности фермента проводили в борно-боратном буферном растворе при температурах 60 и 64°С в буферных растворах с различным рН (рис.3). Процесс термоинактивации при 60°С является процессом первого порядка до глубины превращения 80-90%.

Акт, Е/мг

Акт, К/кг

в 4

I \\ I V 4

60°С

15 20 i, мин

10 15 20 1,МИН

Рис.3. Инактивация УО при 60°С (а) и 64°С (б). а:1 - рН 7.5; 2 - рН 7,7; 3 - рН 8.4; 4 - рН 8.8; 5 - рН 9,3. 0: 1 -рН 8.1: 2 - рН 8,4; 3 - рН 8,8. 0,1 М борно-боратный буфер.

При 60°С при повьшении рН инкубационного раствора константа инакти вацш уменьшается (таОл.1). При температуре же 64°С минимальное зна чение К.^ наблюдается при рН 8,4, увеличиваясь при сдвиге рН в об* стороны.

Таблица 1

Зависимость констант скорости инактивации (К1) УО от рН

Температура, °С

рН раствора

7,5

7,7

8,1 8.4

9,3-

60 64

0,40 0.37 - 0.10 0,07 0,05 0,29 0,13 0,16

1 о

Кинетические характеристики УО изучались в двух сериях эксперименте - при ¡фиксированных концентрациях одного из субстратов определяла зависимости скорости реакции от концентрации другого. Зависимость от в для кислорода не линеаризуется в обратных координатах, тог, как для мочевой кислоты эта зависимость линейна (рис.4). Констан-Михаэлиса для мочевой кислоты и кислорода была равна 2,2x10 М 1,6x10 М соответственно. Нелинейный характер зависимости 1/у <

1/V, МННМКЖМЬ'

го зо l/[Oj, мМ"'

1/v. шш икмоль1

101- ^

--• i

10 ¿0

l/s, MM

Рис.4. Зависимость скорости реакции 70 от концентрации кислорода (а, концентрация мочевой кислоты 2 Ш). и мочевой кислоты (б, концентрация кислорода 0,28 мМ) в обратных координатах.

l/s для кислорода не был обусловлен ингибированием продуктами реакции, что было показано в рядз экспериментов. Поскольку У0 является тетрамером, можно сделать предположение, что отклонение от линейности обусловлено кооперативным характером взаимодействия кислорода с ферментом. Коэффициент Хилла, рассчитанный как графическим методом (рис.5), так и методом Курганова, в котором не требуется значение величины Утах , оказался равным 2,6-2,8. что указывает на наличие в молекуле У0 не менее трех центров связывания кислорода, взаимодействие которых с кислородом приводит к изменению активности фермента или константы связывания кислорода. Исследование кинетического поведения иммобилизованной на силикагеле УО показывает, что в этом случае зависимость 1/v от l/s хорош линеаризуется как для мочевой кислоты, так и для кислорода до глубины превращения, по крайней мере 85-90 %. Это указывает на то, что нелинейность поведения аналогичного графика по кислороду для свободного фермента обусловлена кооперативным характером взаимодействия кислорода с УО, поскольку ограниченность подвганости глобулы фермента после иммобилизации препятствует конформационным изменениям при взаимодействии с кислородом.

У-у

-2 10

10 [02], м

Рис.5. Линеаризация да! ных зависимости СКОрОС! реакции от концентращ мочевой кислоты в коорда натах Хилла.

На рис.6 приведены семейства кривых обратных величин при ря фиксированных концентраций второго субстрата. Для ряда фиксированы

Рис.6. Зависимость скорости реакции УО от концентрации с; стратов в обратных координатах при различных значениях мочевой к: лоты (а) и кислорода (б), а: 1 - 5 мМ, 2-3 ^М, 3 - 1 мМ моче кислоты. 6:1 - 0,23 мМ, 2 - 0,2 мМ, 3 - 0,15 мМ б^.

значений кислорода область пересечения кривых лежит достаточно близ-со к оси l/v, а для ряда мочевой кислоты графики пересекаются в од-юй точке над осью абсцисс. Все эти данные позволяют сделать вывод о гам. что бактериальная уриказа действует по упорядочненному механиз-ту с образованием тройного комплекса, причем первым субстратом, по )сей вероятности, является мочевая кислота.

1.2.2. Ферменты в различных фазах.

Изучение свойств ферментов, включенных в различные фазы, яв-яется одним из подходов к моделированию функционирования ферментов их естественном окружении и может дать дополнительную информацию возможности регулирования степени доступности субстрата при иммо-илизации. Кроме того, изучение свойств ферментов в различных фазах зжет способствовать созданию новых биосенсоров.

Включение в бислойные лецитиновыв лшосомы ферментов дает эзможность изучения барьерных функций липосомальной мембраны для тответствующего субстрата. Обычно для определения проницаемости ли->сомальной мембраны пользуются диализным методом, который связан с сределенными трудностями. Изучение транспортно-каталитических юйств липосом с инкапсулированным ферментом позволяет проще опре-!лять проницаемость для соответствующего субстрата. Лилосомы с льшим объемом захвата получали из яичного фосфатидилхолина с соот-шением детергент/липид Р. = 0.4.

Сравнение кинетических параметров свободного и инкапсулиро-нного ферментов показало, что vm у н:ос совпадает . но К^ для сводного фермента существенно ниже, чем для иммобилизованного (К^> ЛЯ ГО Kj, =0,7мМ И К^ = 36,4мм, ДЛЯ УО К^=0,1мМ И К^ = 14,7мМ) йс.7). Эта разница связана с тем, что концентрация субстрата в липомах отливается от концентрации в наружном растворе из-за барьер-( свойств липосомальной мембраны. Поскольку кинетика Михаэлиса-1тен справедлива как для свободного, так и для инкапсулированного ментов, то из условия равенства скоростей энзиматической реакции шпосомах и в растворе следует: Сл:СН=КП). где Сд- концентрация ¡страта в липос'омах, Сн- концентрация субстрата в наружном раство-С другой стороны, отношение концентрации субстрата в липосомах ) к концентрации субстрата в наружном растворе (Сн) является кцией проницаемости липосомальной мембраны.

1 />', МП н мкмоль1

0.2 (•

0.15 [ .

0.) (-/

0.05

-0.3 -0.2 -0.1

0 0.1 0.2 1/[8], им"

Рис .7 .График. Лайнуивера-Бэрка для свободной (1) и инкапсулированной (2) глккозооксидазы. Следовательно, коэффициент проницаемости можно выразить как:

гК», л л мл

3€н 1

где Р - проницаемость лгатосомальной мембраны для субстрата, I -мл репг.траиш. г - радиус липосом. Если высокое значение к^ для г а "»•■•ул.грок?.иного <5ермента действительно связано с ограниченным ".лом субстрата к ферменту из-за барьерной функции липосомал .мпроиы, то изменение барьерных свойств мембраны должно вести к •'•'¿гч.гсге'утему гоменснгао К^» Действительно, по мере встраивай •«мс.рану возраставших концентре.кий дезоксихолага натрия, увелич! до-го ее проницаемость, наблюдается уменьшение К^ (см. табл.2).

Помимо определения проницаемости лшоссмальной мембраны оуоогратов, липоссми с инкапсулированным ферментом были использс для изучения процессов слияния липосом и воздействия на них ра: иы:-: факторов ■

Таблица 2.

Значения проницаемости лтосотлькой мембраны для субстрата, рассчитанные по формуле (2).

, мМ Р см/с' 10"9

Р. УО ГОД Мочевая кислота Глюкоза

), 4 ),5 ),65 14,7 12,3 11 36,4 24,2 3,5 4.2 4.3 2,8 4,6

Включение ферментов в гидрагированные обращенные мицеллы ПАВ в ор-шических растворителях осуществлено для многих ферментов и позво-¡ет моделировать влияние свойств микросреды на их кинетическое по-гдение. Нами впервые было осуществлено включение уратоксидазы в тстему гидратированных обращенных мицелл, образованных аэрозолем ОТ ЮТ) в октане. УО в обращенных мицеллах сохраняла каталитическую стивность. причем достижение предельной скорости реакции наблюдаюсь при значительно более низких концентрациях субстрата, чем в здной среде. Поэтому в обращенных мицеллах, в отличие от водной эеды, практически при любой выбранной степени гидратации возмолсна згистрация начальной скорости реакции в области насыщавши: концсн-заций субстрата. Для большинства ферментов, включенных в гидрати-званные обращенные мицеллы, зависимость скорости ферментативной pe-сции от степени гидратации u>q, т.е. от размера мицелл, имеет в той щ иной мере выраженный колоколообразный характер . Максимальная сорость реакции при этом достигается при размерах внутренней полос-,1 обращенных мицелл, соответствующих размеру молекулы фермента. На лс.7 представлена зависимость кинетических параметров уратоксидаз-?й реакции V и в гидратированных обращенных мицеллах от "'0. При ;ех исследованных значениях ^ максимальная скорость реакции в ми-зллярной ei..теме была низке, чем в водной среде. В работе Курганова соавторами было предложено эмпирическое соотношение для нахождения зтимального значения

мп= (0,083 £ 0,008) \/ М. (3)

(М - молекулярная масса фермента), согласно которому для УО, имеют молекулярную массу 125 кДа, оптимальное значение ы0=23-3. Завис] мость Ум от не укладывается в описанную закономерность, при эгс наблюдается резкое увеличение максимальной скорости реакции, коп размер внутренней полости обращенной мицеллы становится больше ра; мера молекулы фермента (рис.8,а). Изучение состояния уратоксидазы обращенных мицеллах с помощью седименгационных методов указало к то, что на седиментограммах обращенных мицелл, содержащих фермеш присутствует несколько границ. Это наблюдается при всех исследован них значениях и>0 и указывает на то. что ферментсодерлгащие мицелл представляют собой полидисперсную систему- Таким образом, можн предположить, что необычный характер зависимости скорости уратокси данной реакции от обусловлен образованием в мицеллярной систем агрегированных форм 70, сохраняющих каталитическую активность.

V• 10 , -М.мнн

-I

К1Й10 , м

о.бг

0.1

0.4

0.2

-и

о 10 20 30 40 50 (0П

0*-

0 10 го 30 40 50

(м)о

Рис.8. Кинетические параметры уратоксидазной реакции V (а) и К^ (б) в гидратированных обращенных мицеллах. , о>0 -степень гидратации.

Ферменты в твердой фазе.

Принципиально новые сведения о свойствах и поведении ферментов можно получить путем изучения' модуля Юнга и логарифмического де-

сремента затухания у ферментов в твердой фазе по методике, впервые гредложенной В.Н,Морозовым с соавторами. Метод основан на анализе 1астотных характеристик электрически возбуждаемых поперечных резо-¡ансных колебаний консольно закрепленных пластинок. Этим методом южно исследовать микрообразцы толщиной до 10 мкм, шириной до 100 км и длиной до 1 км. Такие исследования дают возможность. путем гзучения связи "физическое состояние - биологическая активность", годойти к созданию нового типа механохимических биосенсоров.

Нами проводились измерения динамического модуля Юнга (Е) и :огари£мического декремента затухания (в) аморфных пленок уратокси-азы и глюкозосксидазы• Для УО показано, что в борно-боратном буфером растворе (рН 9,2), где наблюдается максимальная активность фер-ента, модуль Юнга меньше, чем в воде (рН 5,8). где активность мини-альна. В то те время, логарифмический декремент затухания в том и ругом случаях практически равны. Различно в модулях может происхоть по двум причинам: либо ферментные пленки, вымоченные в воде и /ферном растворе, имеют разную гидратацию, либо буфер меняет меха-теские свойства фермента. В го же время измерения изотерм гидрата-га показали, что достоверной разницы в значениях гидратации в том другом случаях не наблюдается, т.е. причина отличия модулей не в щратации. Модуль Шга Е для аморфных пленок является суммой двух )Мпоненгов - модуля Е собственно молекул фермента и упругости меж-мтекулярных контактов. Поскольку в пропорцианален внутреннему тре-ю. то равенство его значений для буфера и воды означает, что изме-иие Е в зависимости от рН мошо отнести к изменению механических юйств самих молекул фермента.

Для пленок глюкозооксвдазы также изучены зависимости Е и в от епени гидратации и концентрации глюкозы. Показано, что уменьшение елени гидратации приводит к увеличению Е и уменьшению е (рис.Э.а), ичем эти зависимости для широкого интервала относительной влажное-являются монотонно изменяющимися величинами, не претерпевашими ачкообразных изменений, что очень ванно для создания механохими-:кого биосенсор^. На рис.9.б показано типичное поведение Е и в ;ле нанесения глюкозы. Как видно из рисунка, в течение первых 5 сунд наблюдается быстрое уменьшение Е, после чего величии Е нара-1ет и возвращается к ¡сходному значению. Это означает, что наблю-эмое изменение модуля Юнга во времени может служить мерой наличия жозы в растворе. Многократное нанесение и отмывка глюкозы не ме-

Е, Гн/и2

4 г

а-а— 1

N. й

ж- ^

0.1

Е, IW

0.4 t

0.3

0.2 0.6

0.45

0 20 40 60 80 100 Относительная влажность, %

40 60

I, сек.

Рис.9. а - зависимость модуля Юнга Е и логарифмического декремента затухания 6 от степени гидратации; б. Типичное поведение Е и 6 во времени при нанесении водного раствора глюкозы (1 мМ). Температура 25°С.

няют механических свойств пленок ГО, что дает возможность использования такого подхода для создания новых биосенсоров.

1.2.3.Клетки микроорганизмов.

В настоящее время вопрос о существовании конкретного фермента, ответственного за окисление пролита с участием кислорода, остается открытым. По-видимому, именно этим объясняется отсутствие аналитической системы для определения пролина, аналогичной существуюши системам для детекции других аминокислот. Создание такой системы мо жно осуществить с помощью клеток микроорганизмов.

Для выявления штаммов, содержащих пролин-утилизирукщую сис тему, нами были исследованы культуры микроорганизмов из различны коллекций, а также культуры, полученные из почвенных вытяжек и воз духа, ^сего было исследовано более 50-ти культур родов Escherichia Pseudomonas, Serratia, Mlcrococcus, а также ряд неиденгифицированны культур. Среди исследованных микроорганизмов 15 штаммов обладал: способностью расти на пролин-содержащей среде. Среди них только оди - Pseudomonas put Ida - обладал специфической пролин-окислякхцей ак тивностью. В табл.3 приведены данные по определению специфичност

исследуемых клеток Pseudoironas put Ida. Как видно из таблицы, клетки не используют в качестве дыхательных субстратов глюкозу, сахарозу и целый ряд аминокислот, что делает принципиально возможным их использование для определения концентрации L-пролина.

Таблица 3

Субстратная специфичность клеток Rseuclomonas put ida

Субстрат, концен- Относительная

трация 20 КМ. активность, %

L-пролин 100

L-аргинкн а

L-лизин 5

L-трилтофан 3

L-сернн 0

L-глицш 0

Ь-треонш 0

L-ф-энилалаш Z1 0

L-оршпш 0

D-r~-'cosa 0

1.2.4.Впокаталктпческно сгсГ.стга клеток мпг.роорганизмоз.

Целый ряд ::сс.г:э-о::Х1:-1 позволит паи лредголо.'лггь, что прог.ул-с;":о::.'1:::"дл сг;сте::а кгегох Рйси^осопаБ риНсза представляет сооо:.

лространст~з:;ко органтзогашнЯ хтульти^зргкаппшЯ комплекс. последовательнее превращение пролина и ахтизлрукез! при зто:; кислород. Пролзш-схдгслпкия способность индушгровалась в клетках только при росте на пролпн-содерканей среде. При этом у клетсх при отсутствии пролила в измерительной ячейке наблюдалось эндогенное дыхание, величина которого, наряду с внутриклеточной концентрацией ЛТ5, характеризует метаболическую активность клеток л га структурную целостность. С учетом этого была изучена зависимость скорости потребления кислорода от концентрации Ь-пролина в среде, поскольку только в случае существования такой зависимости можно было расчитывать на их использование в аналитических системах. Как видно из рз:с. 10, в диапазоне концентраций от 0,05 до 0,1 мМ график этой --■«ости гслеет тактически линейный характер. При более низких

- го -

концентрациях величина полезного сигнала сравнима с величиной сигнала от эндогенного дыхания. Оптимальными условиями определения проли-на являются: рН 6 - 8, температура 29 - 30°С .

Акт, Е/г

2Г

Рис.10. Зависимость скорости потребления кислорода клетками Pseudomonas putIda от концентрации L-пролина в среде.

1.3.Иммобилизация ферментов и клеток микроорганизмов.

Иммобилизация фактически является тем инструментом, благодаря которому оказалось возможным обширное использование биокатализаторов в аналитических целях. Кроме общих требований к методам иммобилизации биокатализаторов для кавдого типа аналитического устройства приходится выполнять специфические требования, вытекающие из природы метода. Отдельные проблемы возникают как в выборе носителя , так и метода иммобилизации.

Требования, • предъявляемые к носителям в проточно-инжекционных системах, в основном сводятся к следующим: носитель должен иметь высокую механическую прочность, достаточно развитую поверхность, хорошие реологические параметры. Диаметр пор должен коррелировать с размерами фермента и быть достаточным для свободногс доступа субстрата. Носитель должен содержать группы, необходимые для модификации поверхности, но не ингибируюшие фермент. Важное значение имеет заряд носителя. К методу иммобилизации предъявляются особенно высокие требования, поскольку сама природа проточно-инжекционного анализа предполагает достаточно прочную пришивку биокатализатора.

Нами исследовалась возможность использования в основном сили-

1тных носителей, поскольку они достаточно полно удовлетворяют приданным выше требованиям. Первоначально мы использовали выпускаемые юмьшленностыэ силохроиы СХ-2,5, СХ-25, и аминосорб. Однако гияро-шамические характеристики этих носителей не позволяли использовать : для анализа крови, культуральной жидкости, и т.д. Наш, совместно ЕРОНЕМ ЙРЕА, были получены несколько силккагелей, имеющих доста-)ЧНо хорошие характеристики: удельная поверхность от 72 до 320 '/г, средний размер пор от 230 до 1000 А, плотность около 22г/см . Такой набор параметров позволил осуществить иммобилизацию ¡рменгов с различными молекулярными массами - 70 (125 кДа), глюко-оксидазы (ГО) (186 кДа), ЛМО (268 кДа), алкогольоксвдазы (АО) 35 кДа). 1Ь;.;обилизащю осуиестзляли путем ковалентной сшивки фер-нтов на экипированной поверхности носителя с помощью глутарового ьдегида. Этот подход позволил получить препараты различных фермен-в с высокой удельной активность» и хорошими гидродинамическими па-метрами. время жизни препаратов составило от 3 до 8 месяцев, в за-зимосги от фермента.

Для оптимизации связывания феркента с носителем и получения ссимальной активности при яннжалъно возкояяых затратах фермента :бходшдо з случае каздого Фермента подбирать соотношение фер-iT/носитель. В качестве примера на рис. 11 показана зависимость ак-п-:ссгп ^.мобилизованной глЕКОзооксвдазы от количества Фермента.

ГОД, мг

Рис.11. Зависимость активности иммобилизованной глюкозооксидазы от количества фермента. Количество силикагеля 100 мг. 1 - активность препарата на 1 г«- носителя. 2 - процент сохранения активности при иммобилизации.

Активность на 1мг носителя достигает максимума при соотноше* 12:100.

Большой интерес представляет изучение влияния различных кете лов на активность как свободных, так и иммобилизованных ферменте поскольку присутствие в реальных образцах ионов металлов может иск зить результаты анализа. На рис.12 показано влияние ионов меди и н келя на активность свободной и иммобилизованной УО. Малые концентр ции ионов меди (10~%), активируют свободный фермент, а с увеличен ем концентрации ои++ активность УО падает. Однако на иммооилизова ный фермент ионы меди не оказывают никакого влияния (рис!2,а). Бол того, при иммобилизации фермейга в присутствии 10~®М меди активное ¡".мобилизованного препарата возрастает. Если лее иммобилизацию пров дать в присутствии высокой концентрации ионов меди

Акт, %

1001

о1

□ - патио, ц - иммоб- Акт, Ел/Г

Д"

Акт,

юн!

50 [

к 10* к)"5 ю"4 кг3 10~2 10"1 [Сч++5. и

□ - натив. иммоб- 1 о б

1 1 к 1

и и

И 1

1 2 3

№ ], м

Рис.12, а,б - влияние различных концентраций ионов меди ■и никеля на активность свободной и иммобилизованной УО. в - зависимость активности иммобилизованных препаратов УО от концентрации ионов меди при иммобилизации- 1 -

контроль'

М . 3 - 10"4М ионов меди.

(lCT^M), го активность иммобилизованного биокатализатора резко пада-эт (рис.12,в). В присутствии ионов никеля активность как иммобилизо-

занного. так и свободного ферментов уменьшается, начиная с концен-

-¡s

гращш 10 М (рис. 12,6). Очень мало влияют на акпвность УО ионы ко-¡альта и магния.

Иммобилизация клеток микроорганизмов да.еет ряд специфических жобенностей. Во-перзых. поскольку размеры клеток существенно больше шмеров ферментов, невозможно использовать те носители, которые кс-юльзуются для ферментов. Во-вторых, очень проблематично осуществле-:ке прочного связывания клетки в пористом носителе с помощью раз-кчннх связей. С другой стороны, включение клеток в различные гели, отя и решет проблему удержания клетки, но создает дополнительные рудности. связанные с диффузией через фазу геля как воды, так п ггро-уктов жизнедеятельности клетки. Для иммобилизации микробных клеток, ;пользуемых в биосенсорах, применяются самые разнообразные методы и Мигели. В тех случаях, когда определяемый продукт образуется глт: этребляется в реакции, катализируемой единичным ферментом, как это. шример. юееег место при определении глюкозы или этилового спирта, "•мобилизованные клетки кспользутяся вместо соответствующих км".об:;-зеванных ферментов: гл:окозо- :: алкоголь- оксядаз, что в значитегъ--Л степени удешевляет и ущюгазт получение бюсжатализаторов. Именно г. гак их, достаточно простых с::сте:л, разработаны и успешга хепель-:сгзя з практике многочисленнее сяоссбы гагюбилизацки. вклтакгяг токсичных для клетск агентов или обработку, пргаодя'лу;^ г:.:;з.т:г клетсх в аелоп. ко не глхккзйе на специфяческуо фэрмента-~:;у.э активность. Для создания ке биокатализаторов на основе наткв-:■:. ::з7Еболглескн активных клеток, выбор способа иммобилизации пред-ззл.тет слок51ую задачу. Наиболее "мягкими" в настоящее время считали включение клеток з ¿с-каррагзианоЕЫЙ и Са-альгкнатный гели.

Результаты прозеденных на.та исследований показали, что бакте-1 р&лк^гкчт put td.i, кезяеннке в вышеупомянутые гехевые матрицы. )cc*H!i уг;п:пз:фо!?агь L-npo^ni практически так же, как и свободные г тки. Однако пслу-1синь:е гранулы при многократном использовании тро терял:! механическую прочность, че:ту отчасти способствовало енскшгсо порекегязокие з измерительной ячейке.

Весьма перспективном. по-видимому, является включение клеток ркогель поливинилового с.птрта (ИБС). Криогель ПВС образуется при сракивании водного раствора ПБС. Образующаяся при этом матрица

обладает высокой пористостью, что обеспечивает ее хорошие реоло ческие характеристики и достаточно высокую механическую прочное Нами был получен иммобилизованный биокатализатор,образуемый вклк нием биомассы Pseudomonas put ida в гранулы (диаметром около 1 криогеля (ПВС) согласно методике, ранее описанной В.И.Лозинеки соавторами. Содержание клеток в полученных гранулах составляло весовых процентов (в расчете на влажную биомассу). Активность био: тализатора сохранялась на протяжении не менее 2 месяцев при хране: в 50 мМ калий-фосфатном буфере рН 8,0 при 4°С, либо при температ 25-30°С в том же буфере, содержащем низкие (около 0,01 М'л) конц трации лролина, с принудительным аэрированием. /

2. ПРИНЦИПЫ СОЗДАНИЯ ПРОТОЧНО-ИНЖЕЕОШОННЫХ ШОСЕЖОРОВ И ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИХ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ

2.1-Проточно-инжекционные аналитические системы

на основе кислородного электрода.

Принцип работы проточно-инжегшионннх аналитических систем основе иммобилизованных биокатализаторов состоит в пространствен] разделении места проведения биохимической реакции и регистрации : раметров этой реакции. При этом проточно-ишкекционный анализ фак' чески является кинетическим методом, поскольку регистрация сиги осуществляется в неравновесных условиях, когда с одной стороны П] исходит непрерывная физическая дисперсия образца в потоке, а с Д] гой - биохимическая реакция 'полностью не завершается. Однако бла; даря строгому контролю постоянства скорости потока, степени разб< ления пробы и постоянной (в течение времени измерения) активно« биокатализатора можно получить высокую воспроизводимость резуль1 тов. Иммобилизованный биокагализатор помещают в мини-колонку, пр< ставляющую собой реактор с вытеснением (рис.13). Субстрат, импулы инжектируемый в поток буфера-носителя, проходя через мини-колом взаимодействует с иммобилизованным ферментом. Этот процесс завис от таких факторов, как активность и объемная доступность биоката; затора, скорость диффузии субстрата и продуктов реакции, длина i лонки, степень ламинарности.потока, и т.д. По мере продвижения в i лонке происходит также частичное размывание границы образца, что : рактеризуется степенью физической дисперсии образца а. Велич] отклика системы и форма пика является функцией дисперсии образ!

!рофиль пика зависит также от времени движения образца в мини-)еакторе. и. следовательно, определяется длиной колонки, скоростью ютока, геометрией системы. Нами было показано, что в зависимости от «тивности биокатализатора, степень превращения субстрата в мини-солонке не превышает 12-35 %. При прочих равных условиях степень гревращения является постоянной в линейной области концентраций '.убстрата.

Рис.13. Блок-схема гидравлической части проточно-нжекционной аналитической системы. 1 - насос, 2 - раствор буера, 3 - микрокомпрессор для аэрации буфера, 4 - теплообмен-нк, 5 - устройство полуавтоматического ввода пробы, 6 - мини-олонка, 7 - камера детектирования, 8 - кислородный электрод, ,10 - рубашки термосгатирования, 11.12 - к термостату.

Перистальтический насос создает поток буферного раствора че-эз колонку с иммобилизованным ферментом. Специальная система дознавания и ввода пробы инжектирует определенное количество субстрата 70 микролитров) в поток буфера без его прерывания. Как уже было таечено, при изучении двухсубстратных реакций непременным мовием, позволяющим получить кинетические параметры реакции, ияется постоянство уровня одного из субстратов при изменении кон-

центрации другого. Поэтому для поддержания постоянного уровня кисло рода осуществляется непрерывное аэрирование буферного раствора кислородом воздуха. В ферментных электродах на основе оксидоредукта: очень большое значение имеет содержание кислорода в образцах, поскольку объемы пробы и измерительной ячейки сравнимы. В проточно! системе, благодаря тому, что объемы пробы и мини-реактора существенно отличаются, это влияние меньше.

При детектировании продуктов реакции особое значение придается конструкции измерительной ячейки, от которой в значительной мере зависит скорость ответа, время полного анализа, воспроизводимое^ результатов. На рис.14 приведено устройство камеры детектирования.

Рис.14. Устройство камеры детектирования и кислородного электрода. А - камера: 1 - поступающий из колонки буферный раствор, 2 - слив. В - кислородный электрод: 1 - мембрана, 2,3 - корпус, 4 - электролит, 5 - платиновый катод, 6 - серебряный анод, ? - резиновое кольцо.

Выходящий из колоши поток буфера поступает в камеру детектирования по периферии камеры, и удаляется через центр. Такая конструкция обеспечивает высокую воспроизводимость результатов и малое "мертвое" время камеры. На рис.15 приведен типичный отклик аналитической системы с иммобилизованной ЛМО на импульсное инжектирование различных концентраций Х-лизина. Величина отклика системы зависит от активное-

ги Сиокатализатора и физической дисперсии образца а в мини-колонке. 3 связи с этим геометрические параметры мини-колонки были оптимизированы таким образом, чтобы при функционировании в ней биокатализа-горов с различными кинетическими параметрами величина сигнала была лаксимальной.

Сигнал, мВ

Рис.15. Типичный отклик анализатора при инжектировании

70 мкл Ь-лизина. Скорость потока буфера 8 мл/мин.

2.1.1. Системы с одним ферментом.

Гидравлическая часть сконструированной аналитической системы зляется универсальной и позволяет практически без изменений исполь-эвать целый ряд иммобилизованных оксидоредукгаз. Скорость прокачки ^ферного раствора может изменяться в довольно широком диапазоне, го позволяет выбрать оптимальные величины для каждого биокатализа-зра. От величины скорости потока зависит ряд параметров системы. I рис. 16 приведены зависимости времени отклика , времени полного [ализа и величины сигнала от скорости буфера. Начиная со скорости 6 [/мин. время отклика и время полного анализа практически не меняют-

ся с увеличением скорости потока. Величина сигнала при этом, хотя падает более чем в два раза, остается достаточно высокой для досто верной регистрации.

Сигнал, мВ

200

t, мин

100 -

6 9 12

V, мл/мин.

Рис.16. Зависимость времени отклика (1). времен полного анализа (2) и ве личины сигнала (3) о скорости потока буферно го раствора. Иммобилизо ванная ГОД, 0,1М цитрат ный буфер, рН 5,7.

Для использования анализаторов в практике важно иметь достаточно большой линейный диапазон определяемых концентраций. Линейны! диапазон концентрации глюкозы составляет 0,7-21 мМ (рис.17,а). Длз мочевой кислоты линейный диапазон простирается до 6 мМ (рис.17,6) что является пределом растворимости мочевой кислоты в обычных условиях. Для сравнения, в разработанном нами непроточном ферментно( электроде линейный диапазон по мочевой кислоте не превышает 0,4 мМ. На рис.18 представлены зависимости для этанола (а, алкогольоксидазг из Hansenula anomalía) и фенолов (б, лакказа).

игнм, мВ Сигнал, мВ

Рис.17. Зависимость величины сигнала от концентрации глюкозы I и мочевой кислоты (б). а: 1 - дистиллированная вода, 2 - 0,1 М :ратный буфер, 3 - 0,1 М ацетатный буфер, б - борно-боратный буфер.

Сигнал, мВ Сигнал, мВ

.18.Зависимость величины сигнала от концентрации спиртов (а) и олов (б), а: 1 - метанол, 2 - этанол, 3 - пропанол. б: 1 - пиро-ехин, 2 - гидрохинон.

2.1.2. Системы с двумя ферментами, расщепляющими один и тот же субстрат

В биологических объектах существуют системы последователь! го расщепления субстрата с помощью мультиферменгных комплексов, аналитических системах принцип последовательного расщепления испо: зуется в тех случаях, когда возникают трудности с прямой регистра! ей компонентов, участвующих в реакции. Так. например, при создав ферментных электродов для определения концентрации сахарозы после! вательно используются ферменты, которые превращают сахарозу в ле ко детектируемую глюкозу .

Между тем. в биологических объектах реализуется также прини параллельного расщепления одного и того же субстрата различными фе ментами. Так например, фосфорилирование Д-глюкозы в организме чел века катализ!фуется ферментами гексокиназой и глюкокиназой, различ юшимися как по специфичности в отношении Сахаров, так и по скорос протекания реакций. Такое сочетание в системе двух ферментов, име щих разные К^ и Ушх, существенно расширяет "концентрационный диап зон " системы и позволяет эффективно фосфорилировать глюкозу к при ее нормальной концентрации в крови, так и при различных патол гиях. Если под "расщепляющей функцией" понимать способность Оиок. тализатора расщеплять субстрат, то можно сформулировать ПРИНЦ, ПАРАЛЛЕЛЬНОГО РАСЩЕШЕ2Ш СУБСТРАТА:

-Бели в аналитической системе функционируют одновременно ке< колько биокатализаторов с одной и той же расщепляющей функцией, но различными кинетическими константами (К^ и такая сисги

приобретает расширенный диапазон определяемых концентраций, при эт< каждый биокатализатор функционирует в своей области концентраций.

Этот принцип, с применением двух лизин-окисляицих ферментот лизин-2-монооксигеназы (ЛМО) и лизиноксидазы (ЛО), реализован нами проточно-июкекционной аналитической системе для расширения диапазог определяемых концентраций. Эти ферменты, окисляя один и тот же су С страт, отличаются своими кинетическими характеристиками, и. в час5 ности, константами Михаелиса и На рис. 19,а приведены калибре

вочные графики для ЛМО и ЛО, полученные в проточно-инжекционной ана

ггической системе. Очевидные отличия в кинетических характеристиках :их ферментов позволяют "сконструировать" новый биокатализатор, задающий совокупными характеристиками исходных ферментов. Пусть гнегика ЛО описывается уравнением Михаелиса-Мзнтен, а ЛМО -

Сигни, мВ

о 10 20 30 40 50 60 70

I Лизин] „мМ

Рис.19, а - зависимость величины сигнала от концентрации 1ина для ЛМО и ЛО в проточной аналитической системе. Диапазон оделяемых концентраций отличается на порядок (для ЛО - 0,5-5мМ, : ЛМО - 5-55мМ>.

б - зависимость величины сигнала от концентрации лизина для катализатора, полученного путем "механического" смешивания разных соотношений ЛО и ЛМО. 1 - 1:1; 2 - 1:8; 3 - 1:12. Диапазон еделяемых концентраций перекрывает два порядка (0,5 - 55мМ).

внением Хилла. Если ферменты работают одновременно и независимо г от друга, то уравнение, описывашее суммарную кинетику процес-можно представить следующим образом:

- 32 -

У*«* • У,„0 . Б,-

о1 • °0 ш2 '

V = - + --(4)

суме. И п 4 '

^и! + Б0 Кт2 +

Р некоторых случаях может оказаться, что суммарную скорос! процесса можно с достаточно хорошим приближением описать линейнс функцией, если каждый из членов уравнения (3) будет взят со сво! весовым множителем.Тогда можно написать:

= к . Б п (5)

п " 14 • " О

Ки1 + ^иг + Бо

где к - наклон суммарной прямой, а а является количественным отнс шением 1-го и II ферментов. Решение этого уравнения осуществляла на персональном компьютере методом наименьших квадратов путем по; гонки величин к и а таким образом, чтобы отклонение эе2 было мша мальным. Наилучшему приближению к прямой линии соответствует значс ние а = 0,153, что соответствует соотношению количества ЛО/ЛМО 1:6,6.

На рис.19 б представлена зависимость величины сигнала от коь центрации лизина в прогочно-иншехционной системе с биокатализатороь полученным путем механического смешивания иммобилизованных ЛО и ЛЬ в различных количественных соотношениях. Как видно, наилучшему приС лижению к прямой линии соответствует кривая 2, где полученное нак экспериментально соотношение количества ЛО/ЛМЗ = 1:8 достаточ^ близко рассчитанному значению а. Увеличение на порядок диапазон определяемых концентраций является доказательством того, что предлс женный выше принцип может Сыть реализован при условии правильног подбора количественного соотношения ферментов.

Принцип параллельного расщепления имеет интересное развита« которое существенно расширяет возможности его применения. Извео но, что под влиянием различных факторов (температура, излучение, т.д.), кинетические параметры биокатализатора и, в частности, К^

,тах, могут существенно меняться. Таким образом полно "сконструиро-ать" ряд биокатализаторов, имеющих одинаковую расщепляющую функцию, :о отличающихся по и ^йах" ^ наличие 3 аналитической системе авнозначно наличию в системе соответствующего числа различных био-атализаторов, обладающих необходимыми параметрами, и дает возмож-ость улучшить характеристики аналитических систем, значительно рас-иряя-диапазон определяемых концентраций.

2.2. Системы на основе клеток микроорганизмов

Реализация проточной аналитической системы на основе иммоби-изованных клеток микроорганизмов осуществлена нами на примере сис-емы для определения концентрации Ь-пролина. Разработка такого сен-ора интересна тем, что до настоящего времени не существовало прос-ого и удобного метода детекции пролина, хотя содержание пролина лужит критерием натуральности вина и меда, а динамика изменения шцентрации пролина может служить критерием процесса созревания виноградных вин, поскольку пролин является единственной аминокисло-ой, не утилизируемой дрожжами в процессе брожения.

При использовании в проточной системе иммобилизованных клеток еобходимо было выявить оптимальные параметры гидравлической части, ¿следование влияния скорости потока показало, что хотя проведение нализа возможно в довольно широком диапазоне скоростей, при скорос-ях выше 6 мл/мин. наблюдается деформация гранул биокатализагора и ымывание клеток из него. При скоростях ниже 2,8 мл/мин. происходит ущественное увеличение времени анализа. Оптимальной является скоте ть от 4 до 6 мл/мин., при этом время анализа не превышает 4-5 ин. (табл.4).

ффективность работы системы зависит от геометрии реактора, посколь-.у, в отличие от плотной упаковки силикагеля в случае использования ммобилизованных ферментов, упаковка гранул ЛВС с диаметром 1-2 мм .овольно "рыхлая". При большом диаметре колонки возникает градиент .онцентрации субстрата от середины колонки к ее стенкам, субстрат еравномерно распределяется по колонке, и пристеночный слой катали-атора не работает. Вследствие нервномерности скорости протока по

Таблица 4.

Влияние скорости протока буфера на величину сигнала, время отклика и время полного анализа пролина.

Скорость протока Величина Время отклика, Время полного

буфера, мл/мин сигнала. мВ мин анализа, мин

1.1 7 9.3 2.2 12

1 .в 60.0 1 .7 10

г.8 45.8 1.1 5.2

4.7 24.8 0.8 4.1

5.8 1 b. 0 0. t:> 3.9

т.о 12.8 0.4 2.2

15.0 8.4 0.3 1 .0

диаметру колонки ухудшается вымываемость субстрата г. продуктов pea; ции, увеличивается время анализа. йееньагж:е дси.гз'гра кояоякк пр: водит к увеличении» пщродананического созротявлзикя колок:?!.'« вызывает слипание биокатализатора :i нарушение раы;сг:ер:-:ого буфера вплоть до его полного прекравениа. Пр:: paSoie с 1_.::со::.т:мзс ванными на силикагеле ферментами опетгоальгажк размерам;; г.слс,::.-;:; г£в ляются 1=110 т и d=4.5MM. Для снтвшзшши конструкция кодосс; пр работе с иммобилизованными в криогеле ПВС клетками исследовали завг. симость величины сигнала, времени отклика и полного анализа от раз меров колонки (табл.5) Как видно из таблицы, уменьшение длины реак тора приводит к сокращению времени анализа ь 2 раза. Оптимально;; являются 1=35 км и d=5 км.

Нл рис.20 приведен калибровочный график для пролина. В участие рабочего буфера использовали 50 мМ К-фосфатный буфер, содержащий I ккМ пролина для стабилизации эндогенного дыхания. Диапазон определяемых концентрации составляет 1 - ЮОкЛ, что существенно вше. чем при использовании свободных клеток. Это. по-видимому, связано q тем. что доступ субстрата к клеткам ограничен диффузией и субстрат Фактически "проскакивает" через колонку.

Таблица 5.

Влияние геометрии колонки на параметры аналитической системы

'азмер Влажный вес Величина Время от- Время пол-

:олонки. катализатора, сигнала, клика, ного анали-

км мг мВ мин за, мин

h = 95 840 25 0.8 3.9

d = 4.5

h = 35 524 15 0.75 2.0

d = 5.0

ti = 20 583 17 1.2 2.2

d = 7.0

ли вместо импульсного введения субстрата прокачивать через систему верный раствор, содержащий различные концентрации пролина, то дата-

Си гнал. мВ 130 г

о L

о 50 r j00

i Пинии], мМ

Рис.20. Зависимость величины сигнала проточной системы от концентрации пролина.

пазон определяемых концентраций полностью совпадает с диапазоном свободных клеток. При этом существенно возрастает время вымыва. субстрата л полный анализ длится более 20 мин.

2.3.Физико-химические характеристики проточно-инжекционних аналитических систем.

Фиьико-химические параметры проточных анализаторов на осн< иммобилизованных Сиокатализаторов определяются как свойствами с< ственно биэкатализаторов, так и режимами их работы (диффузионный ] кинетический). При отсутствии диффузионных затруднений для субст] тов и выс -сой каталитической активности биокатализаторов реализует диффузное, ой ]еяош, в противном случае имеет место кинетический 1 смешанны?, етш.

Не. оис 21 приведены рН-зависимости проточной системы для ре личных фь *лен эв. Для УО и ЛМО рН оптимума лежат в слабощелочной с ласти, г 31 ( профили зависимости их активности от рН. как и г АО. вырази 'л злее резко, чем таковые для ГО и ЛО. Это, по-видимоь связано ег» что системы с ГО к ЛО действуют в д:.ффузиошшх рек мах, в ч ре 1, как с УО, ЛМО И АО - в смешанных.

Сигнал, %

Рис .21. Зависимость вол чины сигнала аналигкче; кой системы от рН для: 1 - уратокекдазы, ; лизинмонооксигеназн, 3 глюкозооксидазы, 4 - г: когольоксидазы, 5 - л: зиноксцдазы.

В таблице 6 показана зависимость величины сигнала от темпера-для различных концентраций лизина. Как видно из таблицы, с по-отем температуры от 20 до 30 градусов величина сигнала, как и эвало ожидать, увеличивается более, чем в два раза. Однако, если ?ь, что время жизни биокатализагора также сильно зависит от ус-1 эксплуатации, и в частности, от температуры, то наиболее опти-юй температурой рабочего буфера является 25° С.

Таблица 6.

Зависимость величины сигнала от температуры для различных концентраций Ь-лизина.

пература (°С> Величина сигнала •

27, 5мМ 44мМ 55мМ

20 25 30 43 138 188 140 342 367 216 369 557

На рис. 22 приведены времена жизни различных биокатализато-£ункционирукщих в аналитической системе при 25°с, Наибольшая шность наблюдается для УО и ГО, наименьшая - у АО.

Субстратная специфичность анализа в основном определяется ичностью биокатализатра. Глюкозооксидаза и уратоксидаза имеют высокую специфичность к глюкозе и мочевой кислоте соответ-о. Алкогольоксидаза проявляет разную субстратную специфичность ичным алифатическим спиртам (рис.18,а). Субстратная специфич-ЛМО к лизину очень высока, -несколько ниже для 310 . При исполь-и в системе одновременно ЛМО и ЛО субстратная специфичность яегся достаточно высокой (табл.7), что дает возможность ис-вать такую систему как в условиях микробиологического синтеза , так и в научных исследованиях.

1 I I

0 L________■---'

0 50 100 150

t, CVTKII

т >j

Ркс.22. Зависимость активности биокатализатора от врем эксплуатации в аналитической системе яри 25°С. 1 - У0, 2 - ГОД, ЛО, 4 - АО, 5 - ЛМО.

Табаиа 7.

Субстратная специфичность при опрэдзляпл л: разлтинпми фзр;:о:-:1г"

СУБСТРАТ*- ОТНОСЕТЕЛЬНАА я Ai:Ti:i.;;:cib

'концентрация амино- ЛМО то ло

кислот 5 г/'л.) (Koine tt)

L-Лизин 100 100 100 100

L-Орнигин 1 33 25 6,4

L-Аргишш 0 15 8.1 4,5

L-Фенилаланин 0 2 11 0

L-Пролин 0 0 - 0

L-Валин 0 0 - 0

L-Метионин 0 0 - 0

1-Серин 0 0 - 0

В таблице 8 приведены основные характеристики аналитических

сем.

Таблица 8.

Характеристики проточной аналитической системы

эделяемый зтрат Биокатализатор Пределы измерения Время функционирования биокатализатора при 20 С, мес.

*:оза Глюкозооксидаза 1 Ю-3 - 2 ю'г 5

евая кислота Уратоксидаза 1 ю-4 - 6 10~3 5

изин Лизин-2-моноок- 5 ю--3 - 6 10~2 3

сигеназа

изин Лизин-а-оксидаза 5 10'4 - 5 10~3 4

изин ЛМО + ЛО 5 ю-4 - 6 10~2 3

ролин Рзеис!. р^Ыа 1 Ю-13 - 1 10~1 2

НОЛ Алкогольоксидаза 1 ю-3 - 5 Ю-2 3

3.УСТРОЙСТВО, ЭКСПЛУАТАЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И ПРИМЕНЕНИЕ АНАЛИЗАТОРОВ "МУЛЬТИФЕРМ" И АРФА".

Анализаторы "Мультиферм" и "АРФА" разработаны на основе точно-инжекционной системы, описанной выше. Анализатор "Мульти-м" имеет отдельный электронный блок регистрации, а в анализаторе ФА" регистрация и обработка результатов осуществляется с помощью пьютера БК0010.

3.1. Анализатор "Мультиферм".

В анализаторе сигнал от кислородного электрода поступает в ¡ктронный блок, оцифровывается, усиливается и подается на цифровой ялей с тремя значащими цифрами, отображающими текущее значение •нала. Специальная система компенсации позволяет, для удобства ¡ратора, устанавливать нулевой уровень начального сигнала. Проба 1ируется и инжектируется в поток буфера-носителя с помощью специ-

ального полуавтоматического устройства без участия оператора. Ра вавдийся в результате ферментативного окисления субстрата си отображается на цифровом табло, его максимальное значение, про циоиальное концентрации субстрата, регистрируется и запоминаете: втором цифровом табло. Сброс памяти осуществляется автомагич> одновременно со вводом новой пробы. Предусмотрено проводить ка, ровку таким образом, чтобы для Сиокатализаторов, имеющих лине! зависимость величины сигнала от концентрации в некотором диапаз( например ГО, ЛО, 70, можно было бы подобрать цифровые значения, с бражаювше сигнал в единицах концентрации - мМЛп, мг%. В случае i менения биокатализаторов с нелинейными характеристиками, напр! ЛМО, необходимо строить калибровочную кривую и по ней отсчитьи величины концентраций.

3.2. Анализатор "АРФА".

Применение компьютера в анализаторе "АРФА" позволяет рас рить возможности ситемы. Логика программы позволяет проводить из рения без предварительного "зануления" начального значения сигна Предварительно программа проверяет стабильность начального значе сигнала и только в случае получения сигнала с заданным разбросом п измерениях со скважностью t (величины nut могут быть устан лены предварительно, обычно п=5, t=3c.) дает разрешение ввода про В режиме калибровки осуществляется нормирование сигнала по соотв ствумцим концентрациям субстрата с любым числом заранее заданных чек. Это позволяет получать калибровку анализатора при работе с б: катализаторами, имеющими сложную зависимость величины сигнала концентрации. На рис.23 приведены калибровочные кривые, получен) по одной и трем точкам в анализаторе при использовании в качес биокатализатора ЛМО, имеющего сигмоидную характеристику. Как видно из рисунка, калибровка по трем точкам резко повышает тс ность определения лизина. В режиме измерения, после завершения щ цесса, на дисплее отображается измеренное значение в заранее выбрг ных единицах. Весь процесс изменения сигнала также отображается дисплее. Компьютер может быть включен в систему управления проце сом, например микробиологического синтеза лизина, одновременно per стрируя целевой продукт и осуществляя контроль за процессом.

Сигнал, мВ

400

200

/ •

30 40 50 60

[Аизин],мМ

Рис.23. Калибровочный график для фермента с сигмоидной харак-ютикой - ЛМО, полученный по одной и трем точкам в анализаторе с РА" с компьютерной регистрацией результатов.

3.3. Применение анализаторов.

Анализаторы "Мультиферм" и "АРФА", являясь многоцелевыми эойствами, могут применяться в самых различных областях.

При микробиологическом производстве лизина первостепенное 1ение для оптимизации и управления процессом биосинтеза имеет тресс-определение концентрации целевого продукта. При досрочном позднем прекращении цикла ферментации возможны потери до 25% дна. Определение концентрации лизина проводили в условиях Оболь-?о. Трипольского и Чаренцаванского БХЗ. Результаты представлены в лицах 9 и 10.

Таблица 10.

Определение содержания лизина в готовой продукции (ЖКЛ.ККЛ) в условиях Чаренцаванского завода "Лизин"

й пробы Концентрация ь-лизина, г/л Коэффициент _____ корреляции

Мультиферм Электрофорез

12 3 4

1 10.7 10.5

2 11.8 14.1

3 12.5 1? .0

4 9.81 9.0

5 6.0 5.7

6 6.2 6.5

7 9.7 12 .6

8 9. 1 9.0

9 9.9 10.0

10 11.5 1 1 .0

И 11.7 1 1 .5

12 9.6 9.9

13 12.0 1 1 .8

14 11.1 10.9

15 9.6 9.6

16 12. 1 12.1

17 10.2 10.5

18 10.8 10.6

На Чаренцаванском БХЗ внедрена методика определения конц трации Ь-лизина. годовой экономический эффект составил 32,5 тыс: рублей (в ценах 1988 года) при использовании одн( анализатора.

Таблица 9.

Определение I,-лизина в промышленных условиях

МУЛЬТИФЕРМ ХИМИЧЕСКИМ МЕТОД

МЕТОД ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

■1,30 4 ,11 •1. Ьи

7, се 7.21 8,00

6,95 7, 05 7,40

6,61 (■>,55 7,12

4,90 5,12 4,84

10,10 10,40 10,50

10.90 1 1 .00 1 1 ,80

26,90 2 5,80 -

46,82 15,70 -

56,28 54 ,50 5о, 78

68,60 67,50

70,43 67,54 69,31

21 .4-1 20,07 21 ,70

80,66 78,51 79,01

36.00 35,23 -

Испытания анализатора "Мультиферм" проводились в различных медицинских центрах для определения концентрации глюкозы в цельной крови, плазме, сыворотке крови. В таблице 11 приведены данные, получении е с помощью анализаторов "Мультиферм" и 1Т-900 при измерении концентрации глюкозы в крови и контрольных сыворотках. Наблюдается хорошая корреляция между данными.

Таблица 11

Сравнительные данные по определению концентрации глюкозы в различных пробах

Образец

Концентрация глюкозы, мМ/л "Мультиферм" ГР-900

Коэффициент корреляции

4. .80 4. Г 5

4. ,51 4.12

3. ,90 3.70

6. ,33 6.51

Кровь 5. ,40 5.37

1, .06 1.12

12. .50 12.70

11 , .12 10.75

5. .00 4.95

Контрольная 5, .10 5.20

сыворотка ■6. .10 5. 15

"Бегоеог^гб" 5. .15 5.10

Сыворотка 1 1 . .20 11.10

"БепНго!" 1 1. ЛЬ 11.15

На рис.24 показаны сравнительные результаты, полученные п] измерении содержания глюкозы в сыворотке анализаторами "Мультифер! и "Эксан".

При производстве вин и других алкогольных напитков очень ва! но определять концентрацию этанола как в процессе производства, тг и в готовой продукции. Определение концентрации этанола при прои; водстве вша рутинными методами требует перегонки до 5 л виноматер! ала и длительных процедур, поскольку в связи с наличием в вине бол! шого числа различных компонентов воспользоваться ареометром невог можно. Бри использовании "Мультиферма" не требуется применен!' каких-либо реактивов, при этом объем пробы, вводимой в анализатор составляет 70 микролитров, время определения - 2 минуты.

[Глюкоза]

мМ

< 20

п - 96 г --- 0 993

у = 0,996х - 0,002 у

20 30

\ Глюкоза к мМ

МУЛЬТИФЕРМ !

Рис.24. Корреляция между измерниями концентрации глюкозы в воротке, полученными анализаторами "Мультиферм" и "ЭКСАН".

В таблице 12 представлены результаты, полученные.для различ-х напитков.

Таблица 12

Определение концентрации этанола в различных напитках

Наименование

Концентрация этанола (Об.Я»)

Мультиферм

Данные БЭЖХ

рмянские 3 звездочки 41,7 42,0

оньяки: 5 звездочек 41.5 41,9

Ахтамар 41,0 42,0

Наири 41,2 41.0

Отборный 42,5 42.1

рмянские Аштарак 20,2 20,0

ина: Арени 11,4 11,8

Из приведенных данных видно, что разработанные прот инжекционные Оиосенсоры можно применять в самых различных oöj промышленности, медицины, научных исследований, разнообразие ис зованных ферментов дает основание считать, что при наличии д оксидоредуктаз эти системы могут быть адаптированы для анализа ветствующих субстратов. Использование в качестве биокатализг также иммобилизованных клеток микроорганизмов существенно рас и потенцильные возможности применения биосенсоров, как наприм' виде систем для контроля окружающей среды.

ВЫВОДЫ

1.Выделены новые культуры микроорганизмов, харакгеризуз высокой активностью лизин-2-монооксигеназы и уратоксияазы. По. высокоочвденные препараты этих ферментов, изучены их ф! химические свойства.

2.Изучены кинетические параметры реакций, катализируемы: козооксидазой и уратоксидазой в лютосомах и обращенных миц| Предложен новый метод определения коэффициента проницаемости л: для субстратов этих ферментов. Показана возможность регис активности уратоксидазы в органической фазе.

3.Впервые найдена зависимость динамического модуля I логарифмического декремента затухания тонких пленок уратокск глюкозооксидазы от физико-химических параметров среды и прису субстрата. Показана принципиальная возможность использования пленок глюкозооксидазы для создания нового типа биосенсора -нохимического.

4.Впервые показано специфическое окисление пролина кл Pseudomonas put Ida. Оптимизированы условия получения биомассы сокой каталитической активностью. Разработан метод иммобил клеток Pseudomonas put Ida в криогель поливинилового спирта с нением активности мульгиферментного комплекса окисления пр изучены свойства полученного биокатализатора.

5.Разработаны методы иммобилизации ферментов глюкозоокс уратоксидаза, лизинмонооксигеназа, лизиноксидаза, алкогольокс

¿за на специальных макропористых силикагелях, пригодных для ис-ювания в проточных аналитических системах. Изучены характерно-полученных биокатализаторов.

6. Сформулированы основные принципы создания многоцелевых зчно-инжекционных биосенсоров на основе ферментов класса оксидо-стаз и живых микробных клеток. Изучены закономерности функциони-■¡ия и оптимизированы условия использования биокатализаторов в зчных системах.

7. Впервые обоснован и предложен принцип параллельного рас-ения субстрата в биосенсорах ферментами, имеющими различные ки-ческие характеристики. Показано, что в условиях проточно-кционной системы использование этого принципа позволяет регули-ть аналитические характеристики системы, расширив на порядок азон определения концентрации лизина. Это позволяет использовать :е системы как в ггромышенности, так и в научных исследованиях.

8. Разработаны оригинальные технические решения и созданы ■оцелевые проточно-инжекционные анализаторы "Мультиферм" и "АРФА" töopoM биочувствигельных элементов.

9. Разработаны методики безреагентного определения концентра-глюкозы, мочевой кислоты, лизина, пролина, алкоголя, фенолов в

шчных жидкостях (кровь, сыворотка, культуральная жидкость, кор-эй концентрат лизина, вино, и т.д.).

10. Впервые создан биосенсор на основе иммобилизованных кле-Pseudomonas риНйадля определения пролина.

11. Разработана конструкторская документация и освоен выпуск ых партий анализаторов "Мультиферм" и "АРФА".

Основные результаты изложены в следующих публикациях:

1.Симонян А.Л., Хачатрян Г.Э. Применение ферментных электродов аналитической практике.Тезисы III Республиканской научной сессии вопросам биофизики, Ереван, 1982г.,с.35.

2-Симонян А.Л.. Татикян С.Ш.. Хачатрян Г.Э., Авакян Ц.М. Анали-юская система для определения концентрации глюкозы в растворах.

Биологический журнал Армении, т.35, №7, 1983г., с. 575-578,

3.Симонян А.Л., Татикян С.Ш., Хачатрян Г.Э.Гаспарян Т.А., зян Г.И. Иммобилизация глкжозооксидазы на силикагелях. Виол.ж. НИИ, Т.35, №7, 1983г., с.579-582.

4.Сдаонян А.Л., Татикян С.Ш., Хачатрян Г.Э., Сейранян Выделение, очистка и иммобилизация уратоксидазы. Тезисы 1Y сими ма по медицинской энзимологии, Алма-Ата. 1983г., с.47.

5.Симонян А.Л.. Татикян C.I.. Хачатрян Г.Э., Авакян Ц.М. ментные электроды на основе иммобилизованных оксидаз.Тезисы I публик.конференции по проблемам физ.-химической биологии и биот логии, Ереван, 1984г., с.28.

6.Кулис Ю.Ю., Песлякене М.В., Лауринавичюс, Симонян А.Л., кян С.Ш.. Хачатрян Г.Э., Авакян Ц.М. Способ определения мочевой лоты. А\с № 1236378 от 8 февраля 1986г.

7.Авакян Ц.М., Адамян С.Я., Амбарцумян Т.Г., Оганесян Петросян Л.С., Симонян А.Л., Татикян С.Ш., Хачатрян Г.Э..Метод рого определения проницаемости липосом для ß-D-глюкозы. Биолог, мении, том 38, Ш, 1985г., с.83-85.

8.Симонян А.Л., , Хачатрян Г.Э., Татикян С.Ш., Авакян Ц.М. чатрян Т.В..Pseudomonas putIda ВКМ В-1458 - штамм-прод Ь-лизин-2-монооксигеназы. А\С №1310427.

9.Симонян А.Л., Татикян С.Ш., Кулис Ю.Ю..Кинетические свс и термоинактивация бактериальной урмказы. Биохимия, том 50, 1985г.,с.782-785.

10.Татикян С.Ш., Симонян А.Л., Хачатрян Г.Э., Авакян Ц.М. нос электрона в уриказном катализе.Тезисы I Всесоюзной конфер по кинетике и механизму электронного переноса в белковых систе их моделях.Вильнюс, 1985г., с.191.

11.Хачатрян Г.Э., Татикян С.Ш., Мкртчян Н.И., Симонян Выделение, очистка и иммобилизация лизин-2-монооксигеназы из Ps monas putIda. У Всесоюзный симпозиум по инженерной энзимов Кобулети, 1985г., с.26.

12.Малахова Э.А., ТагикянС.Ш.. Цетлин Л.Г., Чеботарева Оганесян S.A., Курганов Б.И., Симонян А.Л. Использование гидра ванных обращенных мицелл для определения мочевой кислоты фep^

шх мини-реакторов. В коллект. монографии "Биотехника - новое на-зление компьютеризации". М., Серия "Теоретическая и прикладная ¡зизика". Наука, 1990г., гл.II, §3, с.87-95.

31.Симонян А.Л., Акопян Э.М. Ферментные анализаторы в аналитикой практике. Реальность и перспективы. Обзор , серия "Обзорная эрмация ЦБНТИ Минмедбиопрома СССР".М., 1990г.

32 Slmonlan A.L. Metabollt alternative segmentation by dlffe-t enzymes as a way of expansion of functional potentialities of Litloal slsteras. Abstr. II intern, symp. on Biochemical englne-ig. Stuttgart, 1990, p.115.

33.Siraonlan A.L. Column mlnl-reaetore-based enzyme analyser« of ibolits. Abstr. Simp, on bluanalytlcal methods. Prague, 1490, 3-29.

34.Badallan I.E.. Khachatrlan G.E.. Tatlkian S.Sh., Mkrtohlan ,, Ralnlna E.I., Machllls T.A. . Lozlnsky 7.1., Slmonlon A.L. bromet.rlc determination of L-prollne by Immobilized Pseudomonas Ida cells. Abstr. Simp, on bloanalytical methods. Prague, 1990, ).

35.Tatlklan S.Sh., Khachatrlan G.E. , Badallan I.E., Avaklan 1. .Slmonlan A.L. Multipurpose analyzer "APJA" In clinical investi Ion and microbiological industry. Abstr. Simp, on bloanalytlcal tods. Prague, I99i>, p.65.

36.Симонян А.Л. Мониторинг сточных вод промышленных предприятий •очными ферментными анализаторами. Тезисы Всесоюзной конференции ше направления биотехнологии". Бущино, 1990г.. с.78-79.

37.Slmonlan A.L., Khachatrlan G.E., Tatlkian S.SH., Avaklan I., Badallan I.E. A flow-throw enzyme analyzer for determination l-lyslne concentration. Blosesors and Bloelectronles, Vol.6, No 991, p.93-99.

38.Slmonlan A.L., Badallan I.E.. Smlrnova I.P., Berezov T.T. bollt alternative splitting by different enzymes. In "Blochemi-Englneerlng-Stuttgart", Editors M.Reuss, H.Chiniel et all. Gustav 1er , Stuttgart- Mew York. II Inter. Simp, of Blochem.englner. ;amon Press, 1991,p.344 - 347.

лицевой промышленности, медицины и научных исследований ".Ере 1988г., стр.140.

22.Бадалян И.Э., Хачатрян Г.Э., Симонян А.Л. Некоторые cboî иммобилизованной на силикагеле лизин-2-монооксигеназы. Тезисы дс дов IY Всесоюзной конференции "Аминокислоты для сельского хозяйс пищевой промышленности, медицины и научных исследований" Ере 1988г.. с.142.

23.Симонян А.Л. Перспективы использования аналитических си на основе иммобилизованных ферментов в микробиологической промыт ности. Тезисы докладов IY Всесоюзной конференции "Аминокислоты сельского хозяйства, пищевой промышленности, медицины и научных следований Ереван, 198ör., с.9.

24.Хачатрян Г.Э., Симонян А.Л. Выделение, очистка и некот характеристики Ь-лизин-2-монооксигеназы из Pseudomonas put Ida. химия, том 53, J 5, 1988г., с.1256-1263.

25.Симонян А.Л.Ферментные анализаторы метаболитов на основе лоночных мини-реакторов: проблемы и перспективы. Тезисы докладо: Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии. Каунас, 198 с. 153

26.Симонян А.Л., Хачатрян Г.Э., Татикян С.Ш. Авакян Ц.М. П пективы использования анализатора "АРФА" в медицине и микробиол ческой промышленности. Тезисы докладов III Республиканской конфе ции "Достижения физико-химической биологии и биотехнологии и их внедрения. Ереван, 1989г., с.76.

27.Сейранян .В., Африкян Э.Г., Симонян А.Л., Татикян С Мкртчян Н.И., Авакян U.M.. Штамм бактерий Bacillus fastldlosi продуцент уратоксидазн. А/С СССР JE 1482196 от 22 января 1989г.

28.Slmonian A.L. ,Khachatrian G.E. .Tatlklan S.Sh. ,Avai Ts.M. Specific and rapid determination of L-lysine concentratloi flow-through enzyme analyser. Abstr. book, FEBS 19-th meeting. В» 1989, p.TU 482.

29.Татикян С.Ei., Симонян А.Л.Влияние ионов металлов на ури из Bacll.fastidlosus. Биолог.ж.Армении, том 42, Jü 11, 1989г.,е.! 991.

30.СимонянА.Л. Проточные аналитические системы на основе к<

•шм методом.Тезисы докладов Y сесоюзного симпозиума по инженерной ямологии. Кобулети, 1985г., с.185.

13.Кулис Ю.Ю., Песлякене Ы.В.. Лауринавичюс В.А.. Тагикян С.И., >нян А.Л. Определение мочевой кислоты с использованием бифермент-электродов. Журнал аналитической химии, том 40, № И, 1985г., )77-2080.

14;Симонян А.Л., Хачатрян Г.Э, Гатикян C.1I1. Применение иммоби-званной глюкозооксидазы и уратоксидазы в аналитических системах, сладная биохимия и микробиололгия, том 22, №5, 1986г.с.675-678.

15.Симонян А.Л.. Хачатрян Г.Э., Гатикян С. ¡11.. Авакян Ц.М. .Спо-определения Ъ-лизина. А\С № 1387417, 1987г.

16.Симонян А.Л., Хачатрян Г.Э., Татикян С.Ш..Современное состо-; и перспективы количественного определения индивидуальных амино-ют в многокомпонентных растворах.Тезисы докладов II Ресяубликан-t конференции по проблемам физ.химической биологии и биотехноло-

Ереван, 1986г.. с.34.

17.Симонян А.Л., Хачатрян Г.Э., Тагикян С.Ш.Авакян Ц.М.. Неко-ie тенденции в развитии современных методов анализа аминокислот, [.ж.Армении, том 38, 1986г., с.555-563.

18.A.L.Simonian,T.R.Razarían,G.E.Khachatrian.Peculiarities of ítlc behavllour and transformation of catalltlc activity of L-.ne-2-monooxygenase. Abstracts of Intern. S Imp. Chemical pi sicsof ■me catalysis, Tallin, 1987, p.80.

19.Хачатрян Г.Э., Казарян Т.P., Симонян А.Л. Влитие п-меркурибензоата на Ь-лизш-2-монооксигеназу из Pseud. put Ida. [.ж.Армении том 40, № 3, 1987г., с.219-223.

20.Агабабян A.A., Авакян Ц.М.. Буюкян С.П., Дургарьян К.С., .петян A.B., Симонян А.Л., Гатикян С.III.. Хачатрян Г.Э. Автомати-©анная система определения концентрации лизина с помощью фер-ного анализатора "АРФА". Виол.ж.Армении, том 41, № 4, Г., стр.294-297.

21.Казарян Т.Р., Хачатрян Г.Э., Симонян А.Л.Влияние эффекторов «шетическое поведение лизкн-2-монооксигеназы. Тезисы докладов есоюзной конференции "Аминокислоты для сельского хозяйства.

39.Малахова Э.А.. Чеботарева Н.А.. Курганов Б.И., Симонян А. Кинетические свойства бактериалльной уратокскдазы, включенной в гк ратированные обращенные мицеллы. Биологические мембраны, т.8, Ж 1991г.. стр.453-459.

40.Амбарцумян Т.Г., Адамян С.Я.. Петросян Л.С., Симонян А., Инкапсулирование водорастворимых ферментов глюкозооксидазы и ура1 оксидазы в ледатиновые лилосомы. Биологические мембраны, 1991г Г.8, №12, С.1254 - 1259.

41.Амбарцумян Т.Г., Адамян С.Я., Петросян Л.С., Симонян А., Определение проницаемости липосомальной мембраны с помощь инкапсул: рованных ферментов. Биол.ж.Армении, 1991г., с

42. Бадалян И.Э., Арцукевич И.А., Симонян А.Л.-Определение ш центрацш различных спиртов в проточно-инжекционной системе "АРФА В сб. тезисов Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология", М 1991Г-, C.108.

43. Татикян С.Ш., Симонян А.Л. Ионы меди в уриказном катализ* В сб.тезисов Всесоюзного симпозиума "Инженерная знзимология", М 1991г., с.51.

44. Симонян А.Л. Аналитические системы на основе иммобилизова! ных клеток микроорганизмов. В сб.тезисов Всесоюзного симпозиуг "Инженерная знзимология", Ы., 1991г., с.43.

45. Хачатрян Г.Э., Бадалян И.Э., Татикян С.Ш., Райнина Е.И Махлис Т.А., Лозинский В.И., Зубов А.Л., Сшонян А.Л. Микробный се; сор для определения L-пролина. В сб.тезисов Всесоюзного симпозиу! "Инженерная энзимология", М., 1991г., с.107.

46.Slmonian A.I., Badallan I.E., Machlls Т.Д., Arzukevich I.M Rainina E.I.Determination of ethanol concentration emplolng yea; Candida boldlnl Immobilized In Pollvlnil alcohol crlogel. Abstrat book of 15-th Internationale specialized symposium on Yeasts., Rig: sept.30 - oct.6, 1991, p. 130.

47.Stoonlan A.L., Badallan I.E., RalnlnaE.I., Makhlls T.A. Lozlinsky Y.I. Estimation of naturalness of grape wines and honey 1 use of a biosensor to L-prollne. Abstract book of 15th Internatlom Congress of Biochemistry, Jerusaleni,. 1991, p.95.

48.Gevorklan S.G., Tatlkian S.Sh., Slmonlan A.L., Mechanics

-ength of enzyme films as an Index of activity. Preprint YERPI 37 (2) - 91.

49.Арутюнян А.Г., Оганесян В.А.. Саркисян К.А., Симонян А.Л. ;ледование подвижности белков и ароматических аминокислот методом зерного микрофотолиза. Тезисы XIV Международной конференции по лерентной и нелинейной оптике ( КиНО'91), Ленинград, 1991г. с.71-

50.Simonlan A.L., Plow Infection analytic slstem for metabo-les determination. Abstract book of International slposium on bio-isors, f.loscow, 1992., p. 11,

51.Карякин А.А..Старикова А.К., Карякина E.E., Варфоломеев I. .Симонян А. Л. Кинетическое поведение ЛМО из Psendomoonas put Ida эго использование в биосенсоре для определения L-лизина. Прпгслад-I биохимия и микробиология. 1991, 27. № 6, с.825-832.

52. Bainlna E.I., Simonian A.L., Airapetova L.K., Varfolomeev 3. and Lozinsky V.I. Biosensor based on immobilized cells. Abst-2t book of International slposium on biosensors, Moscow, 1992., 18.

53.Simonian A.L., Badalian I.E., lihachatrlaii G.E., Tatlkian Hi., Raintoa E.I., Makhlis T.A., Lozllnsky V.I., Varfolomeew

A biosensor for L-proline determination by use of immobilized ;robial cells. Applied Bioohemisry and Bioteolmology, vol.38, ?2, p.121-134.

Информация о работе

Симонян, Александр Людвигович
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.23

Автореферат

Похожие работы